KR20020096559A - 알코올에 의해 특이적으로 그 전사발현이 유도되거나저해되는 알코올 민감성 유전자 발굴 - Google Patents

알코올에 의해 특이적으로 그 전사발현이 유도되거나저해되는 알코올 민감성 유전자 발굴 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생물체가 알코올에 노출된 후 그 생물체의 유전자 중에서 전사발현의 변화를 보이는 유전자를 발굴하는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 방법을 알코올 작용 표적의 발굴 및 알코올 관련 질환의 진단, 예방, 치료 신약의 개발에 응용할 수 있다.

Description

알코올에 의해 특이적으로 그 전사발현이 유도되거나 저해되는 알코올 민감성 유전자 발굴 {DISCOVERY OF GENES SPECIFICALLY REGULATED BY ALCOHOL}
본 발명은 도 1, 도 2와 도 8로 대표되는 마이크로어레이 실험의 결과 알코올에 의해 특이적으로 전사발현의 변화를 보이는 유전자들의 발굴과, 각 유전자들이 알코올에 의해 특이한 양상으로 전사발현의 변화를 보이는 현상의 발견에 관한 것이다.
생명체의 행동 양식은 여러 복잡한 경로로 외부 환경이 인지되어 결국 중추신경계에서 모든 정보를 종합, 판단하여 운동 신경을 제어하게 됨으로서 완결된다. 감각 및 판단 기능은 외부 환경의 영향을 많이 받게 되는데, 예를 들면 알코올에 과다 노출되면 비정상적인 행동 양태가 나타나기도 하고, 심지어는 전혀 외부 자극에 반응하지 못하게 되기도 한다. 알코올은 인체에 여러 가지 영향을 미친다. 알코올은 적정농도를 넘어서면 취함 (intoxication)의 상태로 되었다가, 더 높은 농도에서는 마취의 상태를 유발하게 된다. 또한 알코올에 노출된 모체로부터 기형이 출산될 수도 있다. 현재로서는 어떤 기전으로 알코올이 이러한 작용들을 하는지 잘 알려져 있지 않다.
알코올에 의한 intoxication의 경우 자극에의 반응 시간이 늦어지고 정밀한 운동 기능이 저해를 받게 된다. 이러한 현상을 보이는 이유 중의 하나는 신경 세포의 glutamate receptor의 기능이 저해를 받기 때문인데, 그 이외의 원인은 아직 잘 이해되지 않고 있다. 한편, 마취 상태의 정의는 어느 정도 주관적이지만 일반적으로 통증을 유발하는 자극에 대한 운동 반응을 전혀 하지 않을 때를 일컫는다. 특히, 탄소의 수가 적은 (C9 이하) 알코올은 고농도에서 휘발성 전신 마취제와 비슷한 기능을 하는데, 마취제의 분자적 기작 또한 거의 알려져 있지 않다. 이러한 두 가지 다른 반응들의 공통점은 이 반응들이 일정 시간 동안은 반드시 가역적이고, 따라서 비가역적인 구조의 변화가 아니라 신경세포 내의 가역적인 변화에 의한 기전일 것이라고 예상해 볼 수 있다는 점이다. 알코올의 마취제로서의 기능과 intoxication에서의 기전은 서로 다른 것으로 추정되고 있으며 아직은 신경세포 내의 이들의 작용 타겟(target)이 무엇인지 정확히 알지 못한다. 아직은 알코올의주 표적을 알지 못하기 때문에 알코올에 의해 영향을 받는 유전자의 발견이 중요한 의미를 가지게 된다. 알코올이 영향을 미치는 이러한 과정에서 신경세포 내에서의 유전자 활성 및 생리적인 변화에 대한 단편적인 연구가 적지 않게 수행되어 왔다. 예를 들면, 초파리 시스템에서 알코올의 intoxication에 연관된 변이를 동정, 클로닝한 결과 cAMP 경로를 활성화시키는 신경전달 펩타이드 유전자를 발견한 것이 대표적이다. 하지만 대부분의 연구는 신경세포주 또는 특정 뇌 부위에 대한 특정 유전자를 대상으로 한 연구들이었다. 예를 들어 GABA (A) receptor와 glycine receptor 작용부위의 조사 (Mihic et al., 1997), NMDA receptor의 transcription 및 posttranscription 수준에서의 발현 조절 양상의 조사 (Kumari and Ticku, 1998), muscarinic acetylcholine receptor에 의한 신호전달계 활성변화 조사(Cebers et al., 1999) 등이 단편적으로 이루어져 왔으며 조직적이고 총체적인 연구는 전무한 상황이다. 이상과 같이 아주 중요한 문제임에도 불구하고 이 분야의 연구가 성숙되지 못한 이유 중의 하나는 알코올에 영향을 직접적으로 받는 유전자의 분자유전학적 연구를 할 수 있는 모델이 가용하지 않았다는 점이다. 알코올이 태아의 발생에 미치는 영향의 하나인 알코올 중독 기형 (FAS)은 최근까지 구체적인 기전이 밝혀져 있지 않았지만, 2000년 2월 Science 학술지에 보고된 바에 의하면 배 발생 과정 중 신경계의 형성이 일어나는 시기에 세포사멸에 의한 신경퇴화가 광범위하게 일어나며, 이는 신경전달물질 수용체들의 이상에 의한 것이라고 밝혀졌다 (Ikonomidou et al., 2000). 하지만 이러한 과정에서 이들 수용체들의 기능이 어떻게 신경퇴화로 연결되는지는 전혀 밝혀져 있지 않다. FAS의 연구를 위해 위에서 사용된 실험모델은 쥐로서, 사람과 가장 유사한 시스템이라는 장점은 있지만 실험적 조작이 불가능하다는 한계가 있다. 따라서 실험적 조작이 용이한 적절한 모델시스템(꼬마선충)으로 유전자 전체의 수준에서 연구할 수 있게 된다면 단편적인 기전의 규명을 넘어 총체적인 규명이 가능할 것이다.
본 발명에서는 간단한 실험동물 중 꼬마 선충C. elegans를 이용하여 알코올의 주 표적이 되는 유전자를 발견하는 방법을 확립하고자 하였다. 이 동물은 비교적 간단한 신경계를 가지는 반면 알코올에 대한 반응의 양상은 고등 동물의 경우와 흡사하기 때문이다. 이에 본 발명자들은 개체 전체의 수준에서 게놈 전체의 발현 변화를 조사함으로써 알코올의 영향을 총체적으로 분석할 수 있을 것으로 믿고 15분에서 6시간 동안 선충을 알코올에 노출시킨 후 전사발현의 변화를 특징적으로 보이는 유전자를 발굴하게 되어 본 발명을 완성하였다. 본 발명의 방법은 선충 유전자에서 발견한 것이지만 이러한 성질이 포유류의 유전자에도 그대로 적용될 수 있다.
본 발명의 목적은, 알코올에 의한 영향을 분자유전학적으로 규명하고 알코올 연관 질병 예방 및 치료를 위한 신약을 창출하는 기반을 제공하기 위하여, 동물 개체의 수준에서 게놈 내의 모든 유전자들의 전사양상을 조사하여 그 중에서 알코올에 의해 전사의 수준에서 영향을 받는 유전자를 발견하고 이러한 유전자들의 응용의 기반을 제공하는 것이다.
도 1은 6 시간동안 알코올에 노출된 선충에서 전사수준이 감소하는 유전자들을 찾아 분석한 마이크로어레이(microarray) 결과를 나타낸 것이고,
도 2는 6 시간동안 알코올에 노출된 선충에서 전사수준이 증가되는 유전자들을 찾아 분석한 마이크로어레이(microarray) 결과를 나타낸 것이고,
도 3은 도 1에서 나타난 6시간 동안 알코올에 노출된 선충에 대한 마이크어레이의 결과 전사수준이 감소하는 것으로 발견한 유전자들을 대상으로 수행한 northern 실험의 결과 중 일부로 마이크로어레이 실험의 신빙성이 확인됨을 보여주는 것이고,
도 4는 도 1에서 나타난 6시간 동안 알코올에 노출된 선충에 대한 마이크어레이의 결과 전사수준이 감소하는 것으로 발견한 유전자들을 대상으로 수행한 northern 실험의 결과를 정량적으로 나타낸 것이고,
도 5는 도 2에서 나타난 6시간 동안 알코올에 노출된 선충에 대한 마이크어레이의 결과 전사수준이 증가되는 것으로 발견한 유전자들을 대상으로 수행한 northern 실험의 결과 중 일부로 마이크로어레이 실험의 신빙성이 확인됨을 보여주는 것이고,
도 6은 도 2에서 나타난 6시간 동안 알코올에 노출된 선충에 대한 마이크어레이의 결과 전사수준이 증가되는 것으로 발견한 유전자들을 대상으로 수행한 northern 실험의 결과를 정량적으로 나타낸 것이고,
도 7은 알코올에 의해 전사가 변화되는 유전자들이 열충격과 같은 다른 스트레스에 의해 변화되는 양상과는 차이가 있음을 보여주는 것이고,
도 8은 15분에서 6시간에 이르기까지의 서로 다른 시간 동안 알코올에 노출된 선충에 대한 마이크로어레이 결과 변화를 보이는 유전자들이 4가지의 발현변화 양상 중 한가지를 보이고 있음을 보여주는 것이고,
도 9는 시간대별 northern 실험을 통해 실제로 알코올에 의해 시간에 따라 전사체의 양이 변화하고 있음을 보여주는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해 본 발명은 마이크로어레이 (microarray) 방법으로 알코올에 의해 전사가 변화되는 유전자들을 발굴하고, 이들을 Northern 혼성화 반응을 통해 확인하여 확실하게 알코올에 민감성을 보이는 유전자들을 제공하는 방법을 확립하였다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에서 발견한 방법은 알코올 민감성 유전자들로 발굴된 표1, 표2, 표3의 고유번호를 가지는 선충의 유전자들을 포함한다.
본 발명자들은 마이크로어레이 (microarray) 분석방법으로 알코올 (ethanol, 7%)에 노출된 선충에서 전사발현이 변화되는 유전자들을 찾았다. 즉, 15분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간 동안 알코올에 노출된 선충들에서 mRNA를 추출하고 알코올에 노출되지 않은 개체들에서 mRNA를 추출한 후 마이크로어레이 실험 및 northern 혼성화 방법을 통해 통계적으로 유의적인 수준에서 반복적으로 전사의 차이를 보이는 유전자들을 발굴하였다.
본 발명자들은 우선 선충이 알코올에 의해 마취상태에 빠진 후 약 6시간이 지난 후의 개체들의 mRNA를 이용하여 대조군과의 마이크로어레이 실험을 수행하였다. 이 실험은 5회 반복되었고, 5회의 실험의 결과에서 최소한 3번 이상의 실험에서 유의적으로 전사가 감소하거나 증가한 것으로 관찰된 유전자들을 선택하였다 (도 1, 도 2 참조). 이들 유전자에 해당하는 오픈 리딩 프레임을 PCR로 증폭해 낸후 대조군과 알코올에 6시간 노출한 실험군의 mRNA와 northern 실험을 수행하여 마이크로 어레이에서 나타난 결과와 northern의 결과를 비교하였다. 총 108개의 유전자를 대상으로 northern을 수행하였는데, 그 중 104개의 유전자가 일치하는 결과를 보였다. 전사수준이 감소하는 유전자들은 51개 중 49개의 유전자(96%)가(도 3, 도 4 참조), 전사수준이 증가된 유전자들의 경우에는 57개 중에 55개의 유전자들(96%)이(도 5, 도 6 참조) 마이크로어레이의 결과와 유사함을 확인하였다. 도 3과 도 5에서 northern 실험의 예를 네 개씩 제시하였고, 도 4과 도 6에서 각각 알코올에 노출된 후 전사수준이 감소되고 증가하는 유전자들의 상대적 변화량을 정량화하여 나타내었다. 이 때, a-tubulin은 항시 일정하게 발현되는 대조구로 사용하였다. 이들 유전자들의 오픈 리딩 프레임에 해당하는 DNA는 표1, 표2에 PCR에 사용한 primer 서열 목록과 함께 제시하였다. 이러한 northern 실험을 통하여 마이크로어레이 결과의 신빙성을 보다 명확히 확인하였다. 또한, 본 발명의 유전자들이 불특정적인 스트레스에 의해 전사의 변화가 생기는 것이 아니라 알코올 특이적이라는 것을 확인하기 위하여 스트레스 중 가장 연구가 잘 되어 있는 열충격에 의한 유전자 발현의 변화와 비교하여 본 결과, 스트레스 관련 유전자, 예를 들어 열충격 단백질 (HEAT SHOCK PROTEIN)는 그 전사 변화 양상이 일정 부분 중복되어 있으나 대부분의 유전자들은 두 경우에 상이하게 변화됨을 확인하였다 (도 7 참조). 도 7에서 열충격에 의해 전사수준이 변화하는 유전자들의 발현양상을 제시하였는데, 이는 Stanford 대학의 Stuart Kim 교수에 의해 수행된 것으로 오픈 리딩 프레임의 왼쪽 그림이 열충격 실험의 결과이고, 오른쪽은 알코올에 의한 발현 변화이다. 그림에서붉은 색은 열충격 혹은 알코올에 의해 그 유전자의 발현이 감소했음을 나타내고, 초록색은 그 반대의 경우이다. 도 7에서 보이듯이 열충격에 의해 발현이 증가하더라도 알코올에 의해서는 감소하기도 하고 그 반대의 경우도 있다. 이것은 전체 유전자의 발현 양상이 열충격에 의한 것과 알코올에 의한 것이 다르다는 것이다. 따라서, 본 발명으로 발굴한 알코올 민감성 유전자들은 알코올 특이적임을 확인하였다.
본 발명자들은 다음 실험에서 15분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간 동안 알코올에 노출된 개체들에서 시간대별 마이크로어레이 실험을 수행하였다. 이 실험의 결과를 분석하기 위하여 본 발명자들은 첫째, 30분 이내에 유의적인 전사의 변화를 보이는 유전자들을 분석 대상으로 선택하였고, 둘째, 6시간 후에도 발현의 변화를 보인 유전자들을 대상으로 하였다. 30분 이내에 발현의 변화를 보이는 유전자들의 발현 양상의 변화를 시간대 별로 조사한 결과 하기와 같은 부류로 구분할 수 있었다 (도 8).
알코올 민감성 유전자 제 1 군: 아주 빠른 시간 (15분 이내)에 전사의 증가가 일어나고 계속적으로 증가된 상태로 유지되는 유전자군
알코올 민감성 유전자 제 2 군: 지속적으로 천천히 전사의 증가가 일어나는 유전자 군
알코올 민감성 유전자 제 3 군: 초기에 전사가 증가되었다가 다시 전사의 수준이 낮아지는 유전자군
알코올 민감성 유전자 제 4 군: 전사가 감소되었다가 다시 원상태의 수준으로 전사가 일어나는 유전자 군
각각의 군에 속하는 유전자들은 표 3에 제시되어 있다.
각 군에 해당하는 유전자들 중 대표적인 유전자들을 대상으로 시간 대 별 (15분, 30분, 1시간, 2시간, 6시간)로 알코올에 노출된 개체들에서 추출한 mRNA로 northern 실험을 수행하여 확인한 결과 마이크로어레이 실험의 결과와 일치하는 결과를 얻을 수 있었다 (도 9 참조)
본 발명에서 제시하는 알코올 민감성 유전자 군에 속하는 유전자들의 알코올에 의한 전사 변화 양상은 본 발명에 의해 최초로 규명된 것이며, 이들 유전자가 선충의 유전자이지만 이들 유전자의 사람, 생쥐, 초파리 등의 상동유전자들도 같은 방법으로 발굴할 수 있다.
이하 본 발명을 실시 예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시 예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.
<실시 예 1> 6시간 알코올에 노출된 선충의 마이크로어레이 분석실험
본 발명자들은 마이크로어레이 (microarray) 분석방법으로 알코올 (ethanol, 7%)에 노출된 선충에게서 전사발현이 변화되는 유전자들을 찾았다. 우선, 알코올에 노출된 선충에게서 전사발현이 변화되는 유전자를 선별하기 위한 마이크로어레이 분석실험은 하기와 같이 수행하였다.
지름이 100 ㎜인 petri-dish 배지 80장 가량에 선충을 배양하여 S 기준 완충용액 (S basal buffer)으로 수확한 후 이를 반으로 나누어 각각 완충용액 자체(200 ㎖, 대조군)와 여기에 최종 7% (v/v)로 알코올이 첨가된 S 완충용액 (200 ㎖, 실험군)을 혼합하여 1 ℓ 플라스크에서 20℃, 250 rpm 조건으로 액체 배양하였다. 알코올에 노출되는 실험군은 15번의 독립된 실험에서 서로 다른 시간 동안, 즉 15분 동안 2번씩, 30분 동안 2번씩, 1시간 동안 2번씩, 2시간 동안 2번씩, 4시간 동안 2번씩 또한 6시간 동안 5번씩 알코올에 노출시켰다. 이 때, 플라스크의 입구는 파라필름 (parafilm)으로 밀봉하여 알코올의 기화를 최소화하였다. 이로부터 얻은 각각의 배양액을 원심분리하여 선충을 수확한 후 즉시 트리졸 시약 (trizol reagents, GIBCO BRL, 15596-018)을 최종 부피 40 ㎖이 되도록 첨가하여 동결 및 해동을 7번 이상 반복하여 세포를 파쇄하였다. 이를 다시 원심분리하여 RNA가 포함되어 있는 상등액만을 취한 후, 여기에 이소프로판올 (isopropanol)을 상등액과 동량으로 첨가하고 원심분리하여 RNA를 침전시켰다. 침전물을 알코올로 세척한 후 10 mM Tris-Cl 완충용액 (pH 7.4) 4 ㎖에 용해시켜 실험군과 대조군 선충의 전체 RNA를 얻었다.
상기 전체 RNA로부터 mRNA만을 순수분리하기 위하여 oligo(dT)-Cellulose Type 7 (Amersham Pharmacia Biotech, 27-5543-02) 레진 (resin)을 사용하였는데, 상기 레진에 전체 RNA를 혼합하여 mRNA를 레진에 결합시킨 후 10 ㎖ Poly-Prep Column (biorad, 731-1550)을 이용하여 1*NETS (100 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl [pH 7.4], 10 mM EDTA, 0.2% SDS)로 세척하고, 10 mM Tris-Cl (pH 7.4 heated to 70℃)로 용출하였다. 여기에 이소프로판올과 NaOAC를 첨가하여 잘 혼합한 후 원심분리하고 이로부터 얻은 침전물을 10 mM Tris-Cl (pH 7.4)에 용해시켜 실험군과 대조군각각의 mRNA를 얻었다.
상기에서 실험군과 대조군으로부터 분리한 mRNA로 마이크로어레이 분석을 수행하기 위하여, 각각의 mRNA에 서로 다른 형광을 띠도록 표지한 후 선충이 지니고 있을 것으로 예상되는 약 2만개의 유전자 조각이 찍혀있는 마이크로어레이에 혼성화 (hybridization)시켰다 (Stanford university, Stuart K. Kim). 이 때, 실험군 mRNA는 Cye3-dUTP, 대조군 mRNA는 Cye5-dUTP으로 표지되도록 역전사하고, 스캔 작업 과정에서 Cye3을 초록색으로 Cye5를 붉은색으로 전환시켜 이미지를 만들어 두 이미지가 겹쳐지도록 하였다. 상대적으로 실험군에서 발현정도가 높은 유전자는 상기 이미지 상에서 강한 초록색의 반점 (spot)을 보이게 된다.
그 결과, 본 발명자들은 알코올에 6시간 동안 노출되면서 전사수준이 변화하는 유전자를 발굴하였다 (도 1, 도 2). 도 1에서, 붉은 색으로 나타나는 반점은 전사가 감소되었음을 보여주는 것이고, 도 2에서 초록색으로 나타나는 반점은 알코올에 노출되었을 때, 상대적으로 전사가 증가하는 것을 나타내며, 회색으로 나타나는 반점은 데이타가 없음을 의미하는 것이다. 본 발명자들은 5회의 마이크로어레이 실험 중에서 최소한 3번의 독립적 실험에서 유의적인 발현 변화를 보인 오픈 리딩 프레임들을 발견하였다 (표 1, 표 2).
<실시 예 2> 6시간 알코올에 노출된 선충의 마이크로어레이 분석실험 결과 발견한 유전자들의 northern 실험
상기의 실시 예에서 발견한 유전자들이 알코올에 의해 실질적으로 그 전사가 조절되는 지를 확인하는 또 다른 방법으로 northern 실험을 수행하였다.
실시 예 1에서 실험군과 대조군으로부터 분리한 mRNA를 아가로스 겔(agarose gel)에 전기영동한 후, 나일론 멤브레인(Schleicher & Schuell, order no. 73210)에 진공 펌프(vacuum pump, Amersham Pharmacia Biotech)와 진공 블로터(trans-Vac TE 80, Hoefer)를 이용하여 옮기고, 자외선(UV)을 주사하여 고정시켰다. 표 1과 표 2에 기재한 바와 같은 각각의 오픈 리딩 프레임을 증폭할 수 있는 서열번호 1에서 서열번호 216까지의 프라이머 쌍을 사용하여 선충의 게놈 DNA를 주형으로 해서 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, 이하 PCR)으로 증폭하였다. 증폭된 DNA를 아가로스 겔에 전기영동하고, 단편들을 잘라내어 용출한 후, 용출된 DNA와 방사성 동위원소로 표지된 CTP, 그리고 Redi prime II kit(Amersham Pharmacia)에서 제공하는 중합효소 등을 섞고 37℃에서 6시간 이상 반응시켜 탐침(probe)을 제작하였다. mRNA가 고정되어 있는 멤브레인과 탐침을 혼성화 반응용액(0.1 % SDS, 50 % formamide, 5 X SSC, 0.05 M NaPO4, 5 X denhart solution)속에서 12시간 이상 반응시키고, 0.1 % SDS가 함유된 2 X, 1 X, 0.2 X SSC 용액을 각각 30분 가하여 비특이적으로 결합되어 있는 탐침을 제거하여 노던 혼성화(Northern hybridization)를 수행하고, 멤브레인을 이미지 플레이트(Fuji)에 12시간 이상 노출하여 감광하였다. 감광된 이미지는 BAS2500(Fuji)으로 읽고, 정량화를 위해서 Image gauge 1.0 program을 사용하였다.
상기와 같이, 마이크로어레이와 northern실험 모두에서 알코올에 전사조절을 받는 유전자들이 존재함을 확인하였으며, 그 유전자들을 도 4과 도 6에 기재하였다.
알코올에 의해 전사 수준이 감소하는 오픈 리딩 프레임
일련 번호 오픈 리딩 프레임 GenBank/EMBL GenPep 서열 번호 쌍 일련 번호 오픈 리딩 프레임 GenBank/EMBL GenPep 서열 번호 쌍
1 B0035.13 Z73102 CAA97415 1/2 26 F40A3.4 AF016423 AAB65323 51/52
2 C06G3.3 U61947 AAB03133 3/4 27 F40H3.2 AF098987 AAC67431 53/54
3 C08F11.12 Z83216 CAB62779 5/6 28 F41E6.5 AF016448 AAB65955 55/56
4 C15A11.5 Z79694 CAB01961 7/8 29 F49E10.3 U53341 AAC69107 57/58
5 C16H3.2 U67955 AAB07585 9/10 30 F56F3.6 Z32681 CAA83603 59/60
6 C17F4.2 AF016655 AAB66032 11/12 31 F56G4.2 Z81552 CAB04484 61/62
7 C23G10.11 U39851 AAA81075 13/14 32 F56G4.3 Z81552 CAB04485 63/64
8 C24B9.9 AF068709 AAC19247 15/16 33 F58E6.7 Z70754 CAA94777 65/66
9 C25H3.10 U29535 AAA68788 17/18 34 H16D19.1 AL031624 CAA20940 67/68
10 C45G7.3 AF067611 AAC19179 19/20 35 K01A2.2 AF099925 69/70
11 C49F5.7 Z81485 CAB03980 21/22 36 K06G5.1 Z81565 CAB04581 71/72
12 C52D10.8 AC006622 23/24 37 K07A1.6 Z81097 CAB03176 73/74
13 C52D10.9 AC006622 25/26 38 K08B4.6 AF100663 AAC68983 75/76
14 C55A6.4 Z81051 CAB02864 27/28 39 K12G11.3 Z81570 CAB04604 77/78
15 E04F6.9 U28943 AAA68364 29/30 40 R09B5.6 AF039046 AAB94215 79/80
16 F07C4.6 U80023 AAC48011 31/32 41 T06E4.8 Z70756 CAA94794 81/82
17 F09F7.6 U00050 AAA50698 33/34 42 T07H3.6 AF077540 AAC26307 83/84
18 F21C10.10 U55364 35/36 43 T22A3.2 Z81125 CAB03380 85/86
19 F22B7.9 L12018 37/38 44 T22F3.11 U64844 AAD56301 87/88
20 F25B4.9 U64842 AAB37085 39/40 45 W08D2.4 Z70271 CAA94233 89/90
21 F28A12.4 U64851 AAC47989 41/42 46 Y43C5A.3 AL023838 CAA19503 91/92
22 F28D1.5 Z70684 CAA94600 43/44 47 Y73F4A.3 AL032661 CAA21756 93/94
23 F31F7.1 U97011 AAB52323 45/46 48 ZC395.5 U13642 AAB53885 95/96
24 F32A5.5 U20864 AAC46664 47/48 49 ZK813.3 U40954 AAB52655 97/98
25 F36D1.7 Z81530 CAB04304 49/50
표 1, 표 2, 표 3 에 기재된 오픈 리딩 프레임은 게놈 프로젝트를 통하여 선충의 게놈에서 예상되는 오픈 리딩 프레임을 찾아 일정한 규칙에 따라 이름을 달아 놓은 것으로, http://www.wormbase.org/ 의 주소를 갖는 web page 에서 오픈 리딩 프레임을 이루는 전체 DNA 염기서열을 비롯하여 아미노산 서열, 실험적으로 확인된 발현 위치, 단백질 특성 등 많은 정보를 얻을 수 있다. GenBank/EMBL 은 NCBI와 연결되는데, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 주소를 통하여 오픈 리딩 프레임을 담고 있는 cosmid에 대한 정보에 연결되고, GenPep은 마찬가지로 NCBI에 연결된 단백질고유번호로 실험적으로 확인된, 또는 예상되는 아미노산 서열과 단백질의 특성에 대한 설명으로 연결된다.
알코올에 의해 전사 수준이 증가하는 오픈 리딩 프레임
일련 번호 오픈 리딩 프레임 GenBank/EMBL GenPep 서열 번호 쌍 일련 번호 오픈 리딩 프레임 GenBank/EMBL GenPep 서열 번호 쌍
50 B0303.15 M77697 99/100 78 F53F4.3 Z77663 CAB01212 155/156
51 C01F6.8 CAA92573 101/102 79 F58E10.4 Z81555 CAB04515 157/158
52 C06B3.6 Z77652 CAB01116 103/104 80 F58G1.7 Z81556 CAB04519 159/160
53 C08F8.1 Z73103 CAA97424 105/106 81 F59C6.6 Z79600 CAB01877 161/162
54 C12C8.1 Z81467 CAB03871 107/108 82 H06H21.6 AF099920 AAC69496 163/164
55 C12D8.1 Z73969 CAA98232 109/110 83 K01D12.11 Z75543 CAA99876 165/166
56 C12D8.11 CAA98241 111/112 84 K05C4.7 Z81564 CAB04573 167/168
57 C18A11.7 U39667 113/114 85 M03E7.5 U58764 AAB00726 169/170
58 C18H9.6 U23147 AAC46690 115/116 86 R03G5.1 U51994 AAA96068 171/172
59 C24G6.5 AF067936 AAC19208 117/118 87 R09B5.2 AF039046 AAB94211 173/174
60 C35A5.2 Z71185 CAA94904 119/120 88 R09B5.3 AF039046 AAB94212 175/176
61 C36A4.1 Z66495 CAA91268 121/122 89 T04A8.8 Z35663 CAA84734 177/178
62 C36E8.5 Z35597 CAA84648 123/124 90 T12G3.1 Z68752 CAA92982 179/180
63 C37C3.2 U64857 AAC25859 125/126 91 T22B7.2 U64608 AAB04595 181/182
64 C39E9.12 Z70307 CAA94338 127/128 92 T27E4.2 U64837 AAB04839 183/184
65 F08H9.3 Z77657 CAB01146 129/130 93 T27E4.8 U64837 AAB04839 185/186
66 F09E5.8 U37429 AAA79348 131/132 94 T27E4.9 U64837 AAB04841 187/188
67 F13B10.2 CAA90183 133/134 95 T27F2.4 Z74045 CAA98551 189/190
68 F19B2.5 AL021447 CAA16269 135/136 96 T28C12.4 AF016679 AAB66159 191/192
69 F26G1.2 U23519 AAC46802 137/138 97 T28C12.5 AF016679 AAB66162 193/194
70 F26H11.3a Z81515 CAB04198 139/140 98 W02A2.7 Z82286 CAB05310 195/196
71 F31D4.3 Z92832 CAB07371 141/142 99 W02D9.10 Z81137 CAB03466 197/198
72 F33D4.5 AF036702 AAB88377 143/144 100 W09C5.1 CAB04941 199/200
73 F42A6.7 AF038613 AAB92051 145/146 101 Y18D10A.11 AL034393 CAA22314 201/202
74 F42D1.2 Z81081 CAB03090 147/148 102 Y75B8A.23 AL033514 CAA22107 203/204
75 F43G6.8 Z50070 CAA90397 149/150 103 ZK637.14 Z11115 CAA77447 205/206
76 F45D3.5 Z78063 CAB01505 151/152 104 ZK970.7 Z49073 CAA88891 207/208
77 F53A9.7 U23523 AAC46562 153/154
<실시 예 3> 시간대별로 알코올에 노출된 선충의 마이크로어레이 분석실험
실시 예 1에서와 같은 마이크로어레이 실험을 알코올에 15분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 그리고 6시간 동안 노출시킨 개체들을 대상으로 실시하였다. mRNA의 추출과hybridization 등의 방법은 상기에 기술한 바와 동일하다.
<실시 예 4> 시간대 별 northern 실험
실시 예 2에서와 같은 northern 실험을 알코올에 15분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 그리고 6시간 동안 노출시킨 개체들을 대상으로 실시하였다. 방법은 상기에 기술한 바와 동일하다.
알코올에 의해 시간에 따라 전사 수준이 변화하는 오픈 리딩 프레임
분류군 일련 번호 오픈 리딩 프레임 GenBank/EMBL GenPep 서열번호 쌍
1 군 54 C12C8.1 Z81467 CAB03871
68 F19B2.5 AL021447 CAA16269 135/136
105 F38E1.8 U41996 AAA83471
106 F38E11.2 Z68342 CAA92771
107 F44E5.4 Z83108 CAB05507
108 F44E5.5 Z83108 CAB05508
109 H41C03.3 AF077545 AAC26306
92 T27E4.2 U64837 AAB04839
93 T27E4.8 U64837 AAB04839
94 T27E4.9 U64837 AAB04841
96 T28C12.4 AF016679 AAB66159 191/192
110 Y46H3A.4 AC006774 AAF60618
111 Y73C8C.10 AF101318 AAC69350
2 군 112 B0280.12 U10438 AAA19090 209/210
65 F08H9.3 Z77657 CAB01146
69 F26G1.2 U23519 AAC46802
113 F39F10.1 U58743 AAB00616
88 R09B5.3 AF039046 AAB94211
114 R09B5.9 AF039046 AAB94216
3 군 115 C23G10.6 U39851 AAA81065
116 F23F1.2 AF024493 AAB70321
117 R11A5.3 Z83122 CAB05599 211/212
118 ZC47.7 Z81141 CAB03495
4군 119 F31F4.5 AF024503 AAB70392
120 F52F10.4 AF101316 AAC69230
121 T03D3.6 AF022980 AAB69920
122 T11F1.6 AF098996 AAC68711
대조구 123 C47B2.3a (a-tubulin) Z99709 CAB16856 213/214
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 의해 발굴한 알코올 민감성 유전자들은 알코올에 의해 전사 발현의 변화를 보이는 유전자들로서, 알코올 작용의 경로에서 중요한 역할을 수행할 가능성이 있는 유전자들이다. 본 발명에서 제시한 방법을 기반으로 알코올 작용의 표적을 발굴하고 나아가 알코올 연관 질환의 예방 및 진단을 위한 신약 개발을 할 수 있다.

Claims (9)

  1. 생물체를 알코올에 시간대 별로 노출시킨 후 mRNA를 추출하여 표 1, 표 2, 표 3에 기재되어 있는 유전자 오픈 리딩 프레임 (Open reading frame)을 하나 이상 포함하는 마이크로어레이의 혼성화 방법으로 알코올 민감성 유전자를 발굴하는 방법
  2. 생물체를 알코올에 시간대 별로 노출시킨 후 mRNA를 추출하여 표 1, 표 2, 표 3에 기재되어 있는 유전자 오픈 리딩 프레임 (Open reading frame)을 하나 이상 포함하는 DNA를 probe로 하여 nothern 혼성화 반응으로 알코올 민감성 유전자를 발굴 또는 확인하는 방법
  3. 표 1, 표 2, 표 3에 기재되어 있는 유전자 오픈 리딩 프레임 (Open reading frame)을 하나 이상 포함하는 마이크로어레이의 혼성화 방법으로 생물체의 알코올에 노출된 상태와 정도를 확인하는 방법
  4. 표 1, 표 2, 표 3에 기재되어 있는 유전자 오픈 리딩 프레임 (Open reading frame)을 하나 이상 포함하는 DNA를 probe로 하여 nothern 혼성화 반응으로 생물체의 알코올에 노출된 상태와 정도를 확인하는 방법
  5. 표 1, 표 2, 표 3에 기재되어 있는 유전자 오픈 리딩 프레임 (Open reading frame)의 하나 이상의 유전자들을 이용하여 발현 또는 reporter 벡터를 제조하거나 항체를 제작하여 생물체 내에서 직접 알코올에 대한 민감성과 알코올에 노출된 상태와 정도를 조사하는 방법
  6. 제 1항, 2항 3항 중 한 가지 방법으로 발굴된 유전자를 알코올 연관 질환의 진단, 예방 및 치료를 위한 신약 개발에 사용하는 것
  7. 제 1항, 2항, 3항의 어느 한 항에 있어서, 생물체가 꼬마선충, 초파리, 또는 포유동물일 경우.
  8. 제 1항, 2항의 어느 한 항에 있어서 알코올 노출 시간이 15분을 초과한 경우
  9. 제 1항, 2항, 3항의 어느 한 항에 있어서, 알코올이 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 펜탄올, 헵타놀, 헥사놀 중 하나일 경우.
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