KR20140049126A

KR20140049126A - 잎, 줄기 또는 이들 모두에 특이적 프로모터, 이를 포함하는 발현 벡터, 이에 의한 형질 전환 식물체 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20140049126A
Application number: KR1020120113572A
Authority: KR
Inventors: 정기홍; 문선옥; 고현정; 유요한; 안진흥
Original assignee: 경희대학교 산학협력단
Priority date: 2012-10-12
Filing date: 2012-10-12
Publication date: 2014-04-25

Abstract

본 발명은 잎, 줄기 또는 이들 모두에 특이적으로 발현하는 프로모터, 이 프로모터를 포함하는 발현 벡터, 이 발현 벡터로 형질 전환된 형질전환체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 프로모터는 벼의 잎, 줄기 또는 이들 모두의 형질 개선에 필요한 유전자 발현을 특이적으로 조절함으로써, 벼를 포함하는 주요 곡물의 잎이나 줄기에 대한 병 저항성이나 환경 스트레스 내성 증진을 위한 연구 및 광합성 효율 증진을 통한 바이오매스 연구 등에 사용될 수 있다.

Description

잎, 줄기 또는 이들 모두에 특이적 프로모터, 이를 포함하는 발현 벡터, 이에 의한 형질 전환 식물체 및 이의 제조방법{Leaf-, stem- or both- specific promoter, expression vector comprising the same, transformed plants thereby and method for preparation thereof}

본 발명은 잎, 줄기 또는 이들 모두에 특이적으로 발현하는 프로모터, 이 프로모터를 포함하는 발현 벡터, 이 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

벼(Oryza sativa)는 세계에서 가장 중요한 식량작물의 하나로 과거 20여년 동안 꾸준히 수량 증대에 힘써왔으나 현재 인구증가 추세로 볼 때 2020년이면 현재의 70%이상에 달하는 수량을 더 생산해야만 될 형편에 놓여있다. 그러나 벼가 재배되는 농지는 세계 각국의 공업화현상으로 갈수록 줄어들고 육종의 소재가 되는 새로운 유전자원은 고갈되어 외래 유용유전자의 도입이 요구되고 있다. 다행히 분자생물학의 발달로 외래 유용유전자의 분리 및 조작이 가능하게 되어 유용 유전자를 벼를 비롯한 많은 식물세포에 형질전환하여 새로운 유전자가 조합된 형질전환체를 얻음으로서 여러 가지 생명현상을 규명하는 유전자발현 연구는 물론 육종의 좋은 소재가 되고 있다. 이러한 형질전환을 이용한 신품종 생산은 앞으로 다가오는 21세기에는 고부가가치 산업으로 대두함은 물론이며 인류의 가장 큰 문제점으로 부각되는 식량문제를 어느 정도는 해결할 수 있으리라 생각된다.

현재까지 알려진 형질전환 방법은 80년대에는 원형질체에 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol(PEG))과 전기충격법(electroporation)으로 많은 형질전환체를 획득하였으며, 90년대 후반에는 유전자총 이용법이 보편화되었으며 최근에는 쌍자엽식물에서 널리 이용되어 왔던 아그로박테리움(Agrobacterium) 이용법도 많이 이용되고있다. 그밖에 화분법(pollen pathway), 미세주사(microinjection) 방법 등이 있다.

프로모터는 외래 유전자의 발현을 식물체의 전신 또는 특별한 조직에만 국한시켜 형질전환 목적을 달성할 수 있으며, 그 기능에 따라서 다음과 같이 분류할 수 있다.

첫째로 전신발현 유도 프로모터를 들 수 있다. 식물 전신발현 유도 프로모터로는 꽃양배추 모자이크 바이러스(CaMV: cauliflower mosaic virus)의 35S RNA 유전자의 프로모터가 대표적인 쌍떡잎식물용 프로모터로 사용되고 있다. 벼 등의 외떡잎식물용 전신발현 유도 프로모터로는 벼 액틴(actin) 및 옥수수 유비퀴틴(ubiquithin) 유전자 프로모터들이 주로 이용되어 왔으며, 최근 벼 시토크롬 C유전자(OsOc1)의 프로모터가 국내 연구진에 의해 개발되어 사용 중에 있다(참조: 등록번호 10-0429335). 이들은 식물형질전환 기본 운반체 내에 선발마커로 이용되는 항생제나 제초제 저항성 유전자 및 리포터 유전자의 발현을 유도하기 위해 이미 내재되어 있으며, 연구적인 측면에서 목적하는 유전자의 식물체내 기능을 밝히고자 시도할 때 우선적으로 고려되는 프로모터들이다. 이러한 프로모터들은 조직-선택성 또는 기관-선택성이 결여되어 있기 때문에 형질전환시킨 선별마커 등이 전체 식물에서 발현됨으로써, 식물체 생장을 지연시키는 결과를 초래한다. 또한 프로모터의 특성상 도입한 유전자의 발현을 목적하는 기관에 국한되어 충분히 발현시키지 못하므로 형질전환체의 경제성이 떨어지게 된다.

둘째로, 종자 특이적 프로모터를 들 수 있다. 대표적인 예로서 벼 주요 저장 단백질 유전자의 프로모터들로서 황금쌀(golden rice) 개발에 사용된 벼 글루테린(glutelin) 프로모터가 현재까지 외떡잎 식물의 종자 특이적 발현을 유도하는 경우에 많이 사용되고 있고, 쌍떡잎 식물의 종자 특이적 발현을 유도하는데 주로 사용되는 프로모터로는 콩 유래 렉틴(lectin) 프로모터, 배추 유래 나핀(napin) 프로모터 및 애기장대의 종자에서 감마 토코페롤 메틸기 전이효소(γ-tocopherol methyl transferase:γ-TMT) 유전자 발현을 유도함으로써 비타민 E 생성을 증진시킨 연구에 사용된 당근 유래 DC-3 프로모터, 들깨 유래 올레오신(oleosin) 프로모터의 종자 특이발현 유도 특허출원(참조: 특허출원번호 10-2006-0000783) 사례가 있다. 상기 종자 특이적 프로모터들은 주로 종자 자체가 식량이나 식품 또는 식품의 원료로 사용되는 주요 작물에서 유용 단백질 축적 및 유용 물질 생성 등을 목적으로 주로 사용되고 있다.

셋째로 뿌리 특이 발현 프로모터이다. 아직 상용화된 사례는 없으나 애기장대 퍼옥시다제(peroxidase, prxEa)가 분리되어 뿌리 특이적 발현을 확인하였고, 최근 고구마 유래의 매즈 유전자(ibMADS)와 당 유도성 에이디피 글루코즈 파이로포스파타제(ADP-glucose pyrophosphatase, AGPase) 유전자가 분리되어 해당 프로모터가 뿌리에서 특이 발현을 유도하며 당근, 무에서 뿌리 특이적 일시적 발현을 유도함을 확인하여 특허 등록(대한민국 등록번호 제10-0604186호, 제10-0604191호)된 바 있다.

넷째로, 잎 등의 기타 조직 특이 프로모터를 들 수 있다. 잎 등의 광합성 조직에서만 강력한 유전자의 발현을 유도하는 벼와 옥수수 유래의 알비씨에스 (rbcS: ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase small subunit) 프로모터, 아그로박테리움 유래의 식물 뿌리 발현을 유도하는 RolD 프로모터, 감자 유래 괴경 특이 발현 유도 파타틴 (patatin) 프로모터, 토마토 유래의 과실 성숙 특이 발현 유도 피디에스 (PDS: phytoene synthase) 프로모터 등이 있다.

그 외에도 현재 개발이 계속 진행 중이지만, 개발자의 의도에 따라 보다 정밀하게 유전자 발현의 장소를 조절할 수 있는 새로운 프로모터, 예컨대 특정한 기관(꽃잎, 뿌리, 잎, 줄기 등)에서만 발현되어야 하는 유전자(예, 화색, 응성 불임, 화형, 특정 대사관련 물질, 방어물질 등)를 형질 전환시킬 경우, 특정 기관이나 시기에만 작동하는 프로모터들이 앞으로도 계속 개발될 필요성이 있다.

KR 10-2009-0029296 KR 10-2008-0007421

본 발명은 외래 유전자의 발현을 식물체의 전신이 아닌 잎과 줄기에만 국한하여 발현시킬 수 있는 프로모터, 이 프로모터를 포함하는 발현 벡터, 이 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체 및 이의 제조방법을 제공하고자 한다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자들은 식물의 조직 또는 기관 특이적인 유전자 발현을 조절할 수 있는 프로모터들을 발굴함으로써, 식물의 특정 조직 또는 기관에 국한시켜 목적 유전자를 특이적으로 발현 또는 저해할 수 있는 시스템을 확립하고자 하였다. 이 과정에서 벼의 LOC_Os12g31460의 프로모터가 꽃잎, 자방, 뿌리, 수술, 암술, 종자 등에서는 발현되지 않고 잎 또는 줄기에서 특이적으로 발현을 유도함을 확인하고, 이에 따라 상기 프로모터를 확보하여 이를 포함하는 발현벡터를 제조한 후 이를 식물에 도입하여 형질전환시킨 형질전환체에서 잎, 줄기 또는 이들 모두에 특이적으로 리포터 유전자가 발현됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

보다 상세하게 본 발명자들은 공개된 벼 에피메트릭스(affymetrix) 자료 983종을 수집하였고, 이들을 17개 기관별로 재분류를 하였다. 에피메트릭스 어레이(affymetrix array)는 한 번의 실험으로 57000 종의 프로브에 의해서 대변되는 유전자 발현을 분석 가능케 하며, 대규모로 수집된 에피메트릭스 어레이(affymetrix array) 자료의 재구성을 통해서 만들어진 기관별 발현 양상은 상당히 높은 재현성을 보여 주었다. 이 자료의 발현 패턴별 분석을 통해서 다양한 기관 및 조직 특이적 유전자들이 분리되었다. 그 중에서 본 발명자들은 잎이나 줄기에서 중요한 형질 발현에 필요한 프로모터 발굴에 관심을 가졌다.

상기 방법을 통해서, 547 종의 유전자가 다른 유전자들와 대비하여 잎과 줄기에서 높은 발현 양상을 보여 주었다.

이러한 유전자에 의해서 조절되는 유전자 발현양상은 이들 프로모터 3' 방향에서 GUS reporter 유전자를 발현시켜 그 활성을 식물체 내에서 측정함으로써 정밀하게 분석되었다. 프로모터 활성 검증을 위한 벡터의 벼 형질전환은 많은 시간이 소요되는 어려움이 있기 때문에, 본 발명자들은 기존에 이용되는 방법과 다른 방법으로 최근에 활달하게 시도되고 있는 융합 오믹스 분석 기법을 활용하였다.

프로모터 탐색용 벡터인 pGA2707, pGA2715, pGA2717, pGA2772의 T-DNA 오른쪽 말단에는 프로모터가 없는 GUS 유전자가 이웃해 있기 때문에, T-DNA가 정방향으로 프로모터 3' 방향에 삽입이 되면 GUS 발현을 통해서 프로모터 활성을 측정할 수 있다. 또한, 이러한 프로모터 trap 계통은 대규모 T-DNA 삽입 위치를 게놈 DNA PCR과 염기서열 분석을 통해 확인할 수 있기 때문에, 데이터베이스에서 유전자 locus id를 색인하여 관련 계통의 탐색이 가능하다.

분리된 547개 잎과 줄기 특이적 유전자는 관련 프로모터 탐색 계통을 통해250 종 유전자에 대한 280여개의 계통으로 선별되었다. 이들 계통의 종자를 살균 후 영양배지에서 7일 동안 벼 유모 전체를 GUS 분석에 사용하였다.

그 결과, 실험군 2A-10470은 기존의 유전자와 상동성이 없는 LOC_Os12g31460의 세 번째 인트론에 T-DNA가 삽입되었으며, GUS 발현 분석과 게놈 DNA PCR를 통해 이 계통에서 GUS 발현이 이 유전자의 프로모터 활성을 나타내는 것을 확인하였다.

염기서열 해독 정보를 참고로 하여 LOC_Os12g31460의 ATG 앞 2kb까지의 프로모터를 게놈 DNA PCR를 통해서 분리하고 pGEM T-이지 벡터에 클로닝하여 염기서열 해독을 하였다.

이렇게 분리된 프로모터를 활용한 식물의 잎과 줄기 특이적 유전자 발현 양상 조절에 큰 영향을 미치는 것을 알 수 있었다.

본 발명은 벼의 LOC_Os12g31460의 프로모터로서, 외래 유전자의 발현이 잎, 줄기 또는 이들 모두에 특이적으로 이루어지도록 유도하는 잎, 줄기 또는 이들 모두에 특이적인 프로모터(이하 '본 발명의 프로모터'라 함)를 제공한다.

LOC_Os12g31460의 게놈 DNA 크기는 2461 bp이며 coding sequence의 크기는 708 bp로 235개의 아미노산으로 번역되어 heat shock protein DnaJ 기능을 하는 것으로 예상 된다. 또한 미시건 주립대학이 주관하는 벼 유전자 기능 할당 과제를 통해서 제공되는 Gene Ontology분석을 통해서 추정된 세포내 소기관에서의 위치 정보는 plastid이다. DnaJ/Hsp40은 J-domain을 가지고 있으며 여러 식물체에서 많은 DnaJ 단백질들이 엽록소의 분화와 기능에 관련한 과정에 참여하는 것으로 알려져 있다. 벼에서 연구된 결과는 찾아볼 수 없으나 heat shock protein으로 구성되는 molecular chaperon의 특성과 잎과 줄기에서 우선적으로 발현되는 이 유전자는 엽록소의 발달 및 엽록소에서 발생한 스트레스 처리와 관련한 기능을 수행할 것으로 예상된다.

애기장대(AT5G21430)나 옥수수(GRMZM2G068316)의 orthologs에서는 엽록소 막에 존재하며 무기인의 흡수와 관련한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. LOC_Os02g38020의 단백질 서열과 비교해서 AT5G21430은 72%, Sorghum에서의 ortholog인 Sb08g015440는 85 %의 상동성을 보였다.

즉, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열인 벼의 LOC_Os12g31460의 프로모터를 포함하는, 외래 유전자의 잎, 줄기 또는 이들 모두에 대한 특이적 발현을 위한 프로모터를 제공한다.

프로모터는 유전자의 환경적, 시기적 및 조직적 발현을 조절하는 필수적인 요소로서, 본 발명에 따른 잎, 줄기 또는 이들 모두에 특이적인 프로모터를 사용하여 식물체 내에서 외래 유용 유전자의 발현을 잎, 줄기 또는 이들 모두에 특이적으로 유도할 수 있다.

또한 본 발명은 상기 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된(Operatively linked) 외래 유전자를 포함하는, 잎, 줄기 또는 이들 모두에 특이적인 발현용 벡터를 제공한다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 의미하며, DNA를 복제하고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 발현 벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유래하거나, 둘 다의 요소를 포함할 수 있다. 따라서 발현 벡터는 재조합 DNA 또는 RNA 구축물, 예컨대, 플라스미드, 파지, 재조합 바이러스 또는 적절한 숙주 세포 내 도입 시 클로닝 된 DNA의 발현을 초래하는 다른 벡터를 의미한다. 적절한 발현 벡터는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 진핵세포 및/또는 원핵세포 내에서 복제가능 한 것들 및 에피솜으로 남는 것들 또는 숙주 세포 게놈 내에 통합되는 것들을 포함한다.

상기 통상의 벡터는 본 발명의 프로모터를 도입할 수 있는 것이면 어떠한 것이든 무방하나, 바람직하게는 pCAMBIA계열 또는 pGA계열의 벡터, 예컨대, pGA3383, pCAMBIA1381, pCAMBIA1391, pGWB3와 같이 Ti-plasmid에서 파생된 벡터로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다. 보다 바람직하게는 pGA3383가 사용될 수 있다.

본 발명의 발현 벡터는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 핵산, 그와 기능적으로 동등한 절편을 포함한다.

"본 발명의 프로모터"와 "기능적으로 동등한 절편"은 본 발명의 프로모터와 실질적으로 동등한 효과를 나타내는, 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 핵산의 조각 또는 일부분을 의미한다. 이러한 핵산 절편은 서열번호 1에 기재된 염기서열과 비교하여 99% 이상의 서열 상동성을 가지며, 이러한 핵산 절편은 당업계에 널리 알려진 분자생물학적 방법에 의하여 용이하게 제작될 수 있다.

본 발명의 발현 벡터는 3' 방향에 목적 단백질에 대한 유전자가 발현되도록 한다.

바람직하게는 상기 발현벡터는 잎 및 줄기에 특이적으로 발현시키고자 하는 유용한 외래 유전자를 포함할 수 있다.

상기 외래 유전자는 잎 및 줄기의 색깔, 발달, 광합성 등과 같은 잎 및 줄기의 특성과 관련된 것이면 무엇이든 무방하며, 바람직하게는 발달과 관련된 유전자로서 예컨대 애기장대 CONSTANS-LIKE, KNOX, Tic21, Toc33, Tic40 Toc75, CIA2, GLK, Stromal 70-kD Heat Shock Protein, Glutamine Phosphoribosyl Pyrophosphate Amidotransferase, Chloroplastic Adenylate Kinase, Differential development Of Vascular associated cells 1, Phosphoenolpyruvate-Phosphate Translocator, Carbamoyl Phosphate Synthase subunit, 광합성과 관련된 유전자로서 예컨대 PEP carboxylase, Magnesium Chelatase H subunit, Magnesium Chelatase I subunit, Magnesium Chelatase D subunit, Chlide a monooxygenase, glutamyl-tRNA reductase, NADPH:Pchlide oxidoreductase, glutamic acid 1-semialdehyde aminotransferase, Uro-III decarboxylase, Mg-Proto-IX reductase, Pchlide a reductase, Chlide areductase, Chl a reductase, Protogen-IX oxidases, PASA, PSAB 등으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 이용할 수 있다.

상기 발현벡터는 통상의 벡터에 본 발명의 프로모터를 도입한 것일 수 있으며, 이처럼 본 발명의 프로모터를 도입하여 발현벡터를 제조하는 것은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 공지의 방법에 따라 용이하게 실시 가능하다.

또한 본 발명은 상기 벡터에 의해 형질 전환된 형질 전환 세포를 제공한다.

상기한 재조합 벡터는 감염, 형질도입, 트랜스펙션, 전기천공 및 형질전환과 같은 주지된 기술을 이용하여 배양된 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 숙주의 대표적인 예는 박테리아 세포, 예를 들면, 대장균, 스트렙토마이세스 및 살모넬라 티피무리움 세포 및 식물 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 임의의 식물 세포가 이용가능하다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 가능하다. "식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 줄기, 잎, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다.

또한 본 발명은 상기 벡터 또는 상기 형질전환 세포로 형질 전환된 형질전환 단자엽 식물체를 제공한다.

이러한 형질 전환 단자엽 식물체는 도입된 외래 유전자가 잎과 줄기에 특이적으로 발현되는 특성을 나타낸다.

"본 발명의 형질전환 단자엽 식물체"와 "기능적으로 동등한 형질전환 식물체"는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 핵산의 변이체와 비교하여 99% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 이용하여 제조된 형질 전환 단자엽 식물체로써, 잎 및 줄기에서의 특이적 프로모터 효과가 실질적으로 동등한 특징을 가지는 단자엽 형질전환 식물체이다.

본 발명의 식물체의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키기 위한 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및 (또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 예를 들어, 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D.et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen.Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의(DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 매개된 유전자 전이에서(비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316 호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다.

본 발명에서 형질전환되는 식물체는 본 실시예에서 사용된 벼(Oryza sativa L.)를 포함한 단자엽식물에 제한 없이 사용할 수 있다.

바람직하게는 벼(Oryza sativa L.)가 사용된다.

이러한 변이체는 당업계에 널리 알려진 분자생물학적 방법에 의하여 용이하게 제작될 수 있다.

또한 본 발명은 상기 벡터로 식물을 형질 전환시켜 상기 외래 유전자를 식물체의 잎, 줄기 또는 이들 모두에 특이적으로 발현시키는 단계를 포함하는 단자엽 식물의 형질 전환 방법을 제공한다.

바람직하게, 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된(operatively linked) 외래 유전자를 포함하는 벡터를 제조하는 단계; 벼에 상기 발현벡터를 도입하는 단계; 및 상기 발현벡터가 도입되어 벼의 잎 , 줄기 또는 이들 모두에 특이적으로 외래유전자가 발현되는 벼 형질전환체를 선별하는 단계를 포함하는 식물의 형질 전환 방법을 제공한다.

본 발명의 프로모터는 잎, 줄기 또는 이들 모두에 특이적 발현을 유도하는 프로모터로써, 잎 및 줄기의 형질 개선에 필요한 유전자를 잎, 줄기 또는 이들 모두에서 특이적으로 발현시켜 벼를 포함하는 주요 곡물의 잎이나 줄기에 대한 병 저항성이나 환경 스트레스 내성 증진을 위한 연구 및 광합성 효율 증진을 통한 바이오매스 연구 등에 사용될 수 있다.

도 1은 히트맵(heatmap)으로 잎과 줄기에서 우선적 발현을 보이는 분리된 유전자와 그 발현 양상을 나타내는 도이다.
도 2는 본 발명의 프로모터 활성 확인을 위한 T-DNA 삽입 위치를 나타내는 도이다.
도 3은 2A-10470 계통이 LOC_Os12g31460 유전자에 co-segregation 것을 나타내는 GUS 염색 결과와 PCR 결과를 나타내는 도이다.
도 4는 2A-10470 계통의 잎 우선적 발현을 나타내는 도이다.
도 5는 엽육조직(mesophyll) 전반에서의 발현을 나타내는 성숙한 지엽의 단면을 나타내는 도이다.
도 6은 LOC_Os12g31460 유전자의 잎과 줄기에서 우선적 발현을 나타내는 마이크로 어레이 결과를 나타내는 도이다.
도 7은 LOC_Os12g31460 유전자의 ATG앞 2Kb 프로모터를 나타내는 도이다.
도 8은 LOC_Os12g31460 프로모터 GUS 식물체 제조를 위해 사용한 벡터의 다이어그램을 나타낸 도이다.

이하에서는, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 아래의 실시예는 발명의 이해를 돕기 위한 예시일 뿐, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 잎 또는 줄기에 특이적으로 발현되는 벼 유전자 대량 선별

잎 또는 줄기에 특이적으로 발현하는 유전자를 선별하기 위하여, 공개된 마이크로어레이 데이터베이스인 NCBI GEO(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)에서 수집된 983종의 벼 에피메트릭스 마이크로어레이(affymetrix microarray) 자료를 17개 기관별/조직별로 재구성하여 유전자 발현 분석용 데이터베이스를 구축하였다.

이를 표 1에 나타내었다.

표 1. 기관별/조직별로 재구성된 유전자 발현 분석용 데이터베이스

K-means clustering 분석 방법을 이용하여, 상기 표 1에 제시된 유전자 발현 분석용 데이터베이스 중 잎 및 줄기에서 발현이 높은 유전자 그룹을 분리하였다.

이는 마이크로어레이 자료 분석용 소프트웨어인 MeV의 K-means clustering 분석 방법을 사용하여 수행하였으며, 기관별/조직별 발현 분석용 데이터베이스 중 잎과 줄기에서 발현이 우선적인 547 종의 유전자가 분리되었다.

그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 노란색에 가까울수록 우선적 발현을 보이는 유전자에 해당하며 파란색에 가까울수록 우선성이 낮아지게 된다. 즉, 17개의 재구성된 유전자 데이터베이스 중 잎, 끝잎, 순 및 줄기에서 우선적 발현이 높은 547종의 유전자를 확인할 수 있었다.

< 실시예 2> 잎 및 줄기에 우선적인 유전자에 대한 프로모터 trap 계통의 확인

프로모터 탐색용 vector인 pGA2707, pGA2715, pGA2717, pGA2772의 T-DNA 오른쪽 말단에 프로모터가 없는 GUS 유전자가 이웃해 있기 때문에, T-DNA가 유전자가 발현되는 방향과 정방향으로 프로모터 후미에 삽입이 되면 GUS 발현을 통해서 프로모터 활성을 알 수 있다.

상기 방법을 통하여, T-DNA가 삽입된 벼 계통에 대한 inverse-PCR 및 염기서열 분석을 하여 대규모로 T-DNA 삽입 위치가 벼 염색체 상에서 결정이 되었으며, 본교(경희대학교)에서 보유하고 있는 대략 벼 게놈의 1/2에 해당되는 T-DNA 색인 돌연변이 정보를 통해서 이를 분석하였다.

그 결과, 상기 547종의 잎과 줄기 우선적 유전자로부터 locus id 이름을 가지며 잠재적으로 프로모터가 trap된 계통을 탐색할 수 있었다. 이를 통해서, 250종의 유전자에 대한 280개의 프로모터 trap 계통이 선별되었다.

< 실시예 3> GUS 염색법을 통한 잎 및 줄기 우선적 발현 유전자의 기관 특이적 발현 분석

선별된 유전자의 기관 특이성을 확인하기 위하여, 잎과 줄기에서 우선적으로 발현되는 250개 유전자들에 대한 280여 프로모터 trap 계통들의 종자를 10개씩 28℃에서 7일간 배양한 후 모든 개체를 GUS 염색 처리 하였다.

GUS 용액은 0.5M sodium phosphate buffer 200ml, 12.5mM potassium ferricyanide 100ml, 12.5mM potassium ferrocyanide 100ml, 0.5M EDTA 20ml, 10% Triton X-100 50ml, 10ml 의 DMSO (dimethyl sulfoxide)에 녹인 X-gluc 1g과 Methanol 200ml을 넣고 증류수로 1L의 부피를 맞추어 제조되었다. 각 계통의 식물체를 모두 15ml의 GUS 염색액에 24시간 처리 한 후 70% 에탄올과 100% 에탄올을 순차적으로 이용하여 상온에서 탈색하였다.

그 결과, GUS염색을 실시한 280여개 계통 가운데 36계통에서 GUS 발현이 확인되었다. 그 중, T-DNA의 삽입이 정방향으로 이루어진 25계통을 선별하였다.

< 실시예 4> 잎 및 줄기 우선적 발현을 보이는 계통들의 GUS 발현과 T- DNA 표지의 co - segregation 검증

상기 선별된 25 계통의 벼 종자를 MSO 배지에 28℃에서 7일간 배양하였다. 이렇게 배양한 7일 개체들의 잎 100mg을 채취하여 액체질소에 급냉각한 후 분쇄하고 잎의 일부는 GUS 염색에 사용하였다. 분쇄 된 잎에서 CTAB buffer (CTAB 10g, NaCl 40.91g, 0.5M EDTA(pH8.0) 20ml, PVP 10g과 ascobic acid 0.44g을 넣고 물로 500ml을 맞춰 조제하였다)를 이용하여 DNA를 추출하였다.

선별된 25 계통의 벼 종자에서 DNA를 추출하였으며, 그 중 실험군 2A-10470은 LOC_Os12g31460 유전자의 세 번째 인트론에 GUS reporter 유전자가 결합된 계통으로 T-DNA 삽입 위치 앞뒤에서 만들어진 프라이머(서열번호 2와 3)와 NGUS1 프라이머(서열번호 4)를 이용하여 PCR로 유전형 분석을 하였으며 삽입 위치는 도 2에 나타내었으며 사용된 프라이머는 하기 표 2에 나타내었다.

표 2. 2A-10470의 프라이머

도 2의 1은 서열번호 5의 뉴클레오티드 61번 내지 384번이며, 2는 서열번호 5의 뉴클레오티드 749번 내지 809번이며, 3은 서열번호 5의 뉴클레오티드 1659번 내지 1748번이며, 4는 서열번호 5의 뉴클레오티드 1845 내지 1979이며, T-DNA는 서열번호 5의 1753번 내지 2134번이며, 5는 서열번호 5의 뉴클레오티드 2176 내지 2273번이다. 도2의 1내지 5에 해당하는 이들 각각은 엑손에 해당하는 서열이다.

PCR 반응은 95℃에서 5분 후, 95℃에서 30초, 57℃에서 30초, 72℃에서 1분30초를 37회 반복하고, 마지막으로 72℃에서 5분을 진행하였다. PCR 반응 산물은 4℃에 보관하였으며 이의 일부를 전기영동으로 확인하였다.

그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 실험군 2A-10470의 PCR 결과와 GUS염색 결과가 일치하는 것을 확인할 수 있었다.

도 3의 A는 2A-10470의 일주일 된 개체 5개에 대한 GUS염색 결과를 나타내며, 도 3의 B는 도 3의 A 실험에 사용 된 개체의 유전형 분석 결과이다.

도 3의 B에서 상단의 밴드는 LOC_Os12g31460 의 gene specific primer(서열번호 2와 3)의 PCR 산물이며 하단의 밴드는 서열번호 3과 T-DNA의 RB(right border) 상의 NGUS1(서열번호 4)의 PCR 산물이다. 두 산물의 결과를 비교하면 해당 식물체의 유전형분석이 가능하다.

서열번호 2와 3의 산물만 증폭 된 경우는 야생형(wt)이며 서열번호 2와 3의 산물과 서열번호 3과 4의 산물이 모두 증폭 된 경우는 잡종(he)이며 서열번호 3과 4의 산물만 증폭 된 경우는 순종(ho)을 의미한다.

야생형에서는 T-DNA 삽입이 없으므로 GUS 발현이 나타나지 않고 잡종과 순종에서는 T-DNA상의 GUS 발현이 나타나므로 파랗게 염색된 것을 볼 수 있다.

즉, 2A-10470 계통은 LOC_Os12g31460 유전자에 co-segregation 된 것이 확인되었다.

또한, 도 4에 나타낸 바와 같이, 2A-10470 계통의 7일 간 개체 염색 결과에서도 뿌리에서 GUS발현은 보이지 않지만, 잎에서 특이적으로 발현 되는 것을 확인 할 수 있었다.

잎에서의 발현 양상을 확인하기 위해 hand section을 통해 성숙한 지엽(flag leaf)의 단면을 살펴보았다.

논에 전개 된 2A-10470 계통의 성숙한 등숙기 지엽을 1-3cm의 크기로 여러 개 잘라 GUS 염색액에 담가 24시간 염색 후 탈색하였다. 탈색이 완료된 지엽의 염색부분을 양날 면도날을 이용해 손으로 0.5mm 이내로 잘랐으며, 슬라이드 글라스 위에 놓고 커버글라스로 고정한 후 광학현미경에서 20-40배율로 단면을 관찰하였다.

그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 잎 가운데 엽육조직(mesophyll) 전반에서 발현되는 양상을 확인 할 수 있었다.

마지막으로, 마이크로어레이 데이터베이스 분석을 통한 LOC_Os12g31460 유전자의 조직별 발현 양상을 분석하였으며 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 잎과 줄기에서 노란색을 띄는 것을 확인 할 수 있으며 이는 잎과 줄기에서의 발현이 우선적임을 의미한다.

상기 도 3 내지 도 6의 결과를 토대로 LOC_Os12g31460 유전자의 세 번째 인트론에 GUS reporter 유전자가 결합된 계통인 실험군 2A-10470이 잎과 줄기에서 우선적인 발현을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

< 실시예 5> 잎과 줄기 우선적 발현을 위한 프로모터의 클로닝

LOC_Os12g31460 의 프로모터를 클로닝하기 위하여 작성된 프라이머들과 동진 벼 (Oryza sativa L. japonica cultivar-group) 게놈 DNA를 주형으로 PCR을 실시하였다. 주형 DNA는 100 ng을 사용하였고, 각 프라이머는 5 pmol로 사용하였다. PCR 조건은 95℃, 5분 -> (95℃, 30초 -> 55℃, 30초 -> 68℃, 5분00초), 5회 반복 ->(95℃, 30초 -> 62℃, 30초 -> 68℃, 5분00초), 35회 반복 68℃, 10분으로 실시하였다.

프로모터 클로닝용 프라이머는 아래 표 3에 나타내었다.

표 3. LOC_Os12g31460의 프로모터 클로닝용 프라이머

PCR 산물은 전기영동하여 크기를 확인하고, pGEM T-이지 벡터에 클로닝하여 염기서열 해독을 하였다. 클로닝 한 DNA를 BamH1과 Xho1으로 절단한 후, 동일한 제한표소로 절단된 pGA3383 벡터(promoter-GUS cloning 용 벡터)와 라이게이션을 14℃에서 12시간 진행하였다. 라이게이션 산물을 Top10 E.coli 컴피턴트 셀 50㎕와 혼합하여 1.5ml 튜브에 옮긴 다음 얼음에 15분 방치하였다. 이어서 37℃ 오븐에 1분을 다시 방치한 후 1ml의 LB 액체배지를 추가로 튜브에 넣은 다음 3시간 동안 37℃ 셰이킹 인큐베이터에서 방치하였다. 이어서, 테트라사이클린 저항성 LB 고체배지에 도말하고 12시간을 기다려 생성되는 콜로니를 1ml의 LB 액체배지에서 세포 배양 후 미니 프렙하였다. 미니 프렙으로 얻은 DNA를 제한효소 BanmH1과 Xho1을 사용하여 절단 후 전기영동에서 아가로즈 젤로 분리한 후 밴드를 확인 하였다. 이렇게 해서 얻어진 클로닝 DNA를 다시 염기 서열 분석을 하여 에러가 발생하지 않은 DNA를 선택하였다. 이렇게 만들어진 LOC_Os12g31460 프로모터 GUS 식물체 제조를 위해 사용한 벡터의 다이어그램을 도 8에 나타내었다. 3730XL DNA analyzer(AB,USA)와 BigDye v3.1(AB,USA)을 이용하여 염기서열 분석을 수행하였고 NGUS1, RB(right border), 그리고 프로모터 내 서열을 이용한 프라이머들을 사용하였으며 이를 표 4에 나타내었다.

표 4. 염기 서열 분석을 위한 프라이머

상기 분석 결과를 도 7 및 서열목록 1에 나타내었으며, LOC_Os12g31460 유전자의 ATG 앞에 2Kb 프로모터 서열에 해당하는 프로모터가 잎과 줄기에 우선적으로 발현하는 프로모터에 해당한다.

LOC_Os12g31460 유전자의 잎에서 우선적 발현을 나타내는 RNA-seq 발현분석 결과를 표 5에 나타내었다.

표5. LOC_Os12g31460의 잎에서 우선적 발현을 보이는 RNA-seq 발현 분석 결과

상기 자료는 미시건 주립대학, Rice Genome Annotation Project 팀에서 제공하는 유전자 발현 분석 서비스 (http://rice.plantbiology.msu.edu/expression.shtml)를 이용한 것으로 발현분석에 사용된 자료는 차세대염기서열 분석 기술에 기반을 둔 RNA 염기서열 (RNA-seq) 분석 결과이다. 표5에 나열된 library 별로 확인된 RNA-seq의 빈도로 조사한 유전자의 발현 정도를 나타낸다. RNA-seq 분석 결과에 의한 이 유전자는 20일 된 잎이나 4엽 단계(four leaf stage)의 유묘 (seedling)에서 가장 높은 수준의 발현을 보였다. 다른 기관과의 발현 비교에서도 잎 조직에서발현이 높게 확인되었다. 이는 마이크로어레이에서 확인한 발현양상을 다시 확인시켜 준다.

< 실시예 6> 형질전환 세포의 제작

상기 실시예 5에서 제작한 식물 발현용 벡터를 추출하였다.

아그로박테리움 컴피턴트 셀(Agrobacterium tumefaciens LB4404) 50㎕와 2㎍의 식물발현용 벡터를 혼합하여 얼음에 15분 방치하였다. 이어서, 액체질소에 75초 넣은 후, 37도 오븐에 5분을 다시 방치한 후 1 ml의 LB 액체 배지를 넣은 다음 3시간 동안 28도 셰이킹 인큐베이터에서 방치하였다. 이어서, 테트라사이클린 저항성 LB 고체 배지에 도말하고 36시간을 기다려 생성되는 콜로니를 1mL의 LB 액체 배지에서 세포 배양 후 미니 프렙 한 후, Xba1과 Xho1을 사용하여 효소 절단 후 사이즈를 확인 하였다.

상기 생성된 형질전환 된 아그로박테리움을 이용하여 벼의 형질 전환 실험에서 사용하였다.

< 실시예 7> 형질전환 식물체의 제작

N6D 고체 배지에서 동진벼 종자를 7일 정도 28℃ 생장실에서 키워서 벼의 캘러스를 생성하였다. 생성된 캘러스를 상기 실시예 6에서 얻은 식물발현용벡터로 형질 전환된 아그로박테리움을 72시간 키운 세포와 혼합하여 N6D-Acetosyringone 을 포함한 배지에서 22℃ 암처리 생장실에 방치하였다.

아그로박테리움에 오염된 캘러스를 3차 증류수로 깨끗이 5번 정도 헹구어 낸 다음 N6D 고체 배지에서 hygromycin 선발을 1차(hygromycin 30 mg/L), 2차 (hygromycin 40 mg/L)에 걸쳐서 계대 배양을 통해 진행하였다. 선발은 28℃ 생장실에서 각각 2주 씩 합해서 4 주 동안 이루어졌다. 분열된 캘러스를 재분화 배지인 MSR (hygromycin 40 mg/L) 고체배지에 옮겨 4주 28℃ 광조건 생장실에서 재분화를 유도한 후, 식물체를 MS 고체 배지로 옮기고 7일 28℃ 광조건 생장실에서 키우고 온실로 옮겨서 재분화 식물체를 키웠다.

< 실시예 8> 형질전환 식물체를 이용한 잎과 줄기 우선적 발현 검증

재분화된 식물체의 기관 특이적 GUS 발현을 확인하기 위하여, 수확한 종자를 10개씩 28℃에서 7일간 배양한 후 모든 개체를 GUS 염색 처리하였다.

<110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University <120> Leaf-, stem- or both- specific promoter, expression vector comprising the same, transformed plants thereby and method for preparation thereof <130> p12-074-khu <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 2042 <212> DNA <213> Oryza sativa <220> <221> promoter <222> (1)..(2042) <223> Promoter of LOC Os12g31460 <400> 1 gaaggtattc atcctcattg ccctttcttg gctaaaatca tacggtcaac tatcgacgac 60 ttgggtgcgt tctcaggcct tttatccaaa acgacttggg tgcgtttggt ttgatgacaa 120 gtttgaacag cacaatccca tgactcttat tggtatgcaa caaagaaaaa agaagcaatg 180 attctttagc aaaccaaatg cactaaaatt ctcatgaata tagtccaaaa tctccaacag 240 caccaattta tccccactaa atccctaaca aacccatata tttgaaccgt ctagcttcac 300 tataagtcta ctactacaac tcagcaaatg catcacaaga aattccccca aaatttccct 360 agtaagtgtg cacgaccagg caattgaact ttcgatatat gagatcacct gtcgaagcat 420 gcgacgttgc tgaggtcgca gccggagatc aggagcacgg ccggctgtaa tccctgtaac 480 ccgagcaccg gcacggcacc cgcggcgcga gcactgacga gcaccagatc gggtcaagcc 540 caagcgcccc caagcagccg ctaaaacgat gcgaggcgcg gggacgcggc ggagttacgg 600 catgggtcgg cggcggcggc ggcggcggcg gtggggctgg agaggaggag gcagaggagg 660 gggggaggag cgaggcggag gtgtcggagg aggggggaga gggccagggg ccagcgagag 720 ggaggcggcg gcgggcccga gcccggcgac gccggcgagc ggcgaggcca tgggtgggtg 780 agtgagtgag gccggcggcg gagggagtcg ctgagagtgg ggccggttgg tcggacatgt 840 tctcttcaac aaagtcatcg aagcacctac tactccgtcc aggctttccc gaaccgccgg 900 ggccggggtt accgcgcccc gtggtaagca cggttaccgc acggtaatcg cgataaccgt 960 gaaaaaccgt acgaaaccgt gcaaaattta tcaaaaattt aaattatttt ttaaatttat 1020 ttgaatttaa ggaggttacc gcggtattta tattactgta ccccgcggta accgcgcggt 1080 taccggcggt aagtcgaacc ctgctccgtc ccaaaaaaaa caagctatga atctaacacg 1140 catatgtcta agttcataac tagaatttga ttttttttta acggagaggt acatatcgtc 1200 cgccccattt ttgttgtaaa aaaatggacg atgtttcagc aaaatgtttc accactagct 1260 taacacgtgt aagaaaaatg tttcaccaca aacttaacat atgttttaaa tttaaatgat 1320 gaaacaaagt tgaatcatag agtgaaacaa tttgttatga aacatggaac 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Reverse primer of 2A-10470 <400> 3 catgccagga aaaagtagcc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer of NGUS1 <400> 4 aacgctgatc aattccacag 20 <210> 5 <211> 2461 <212> DNA <213> Oryza sativa <220> <221> gene <222> (1)..(2461) <223> LOC_Os12g31460 <400> 5 acttttattt ccatccccac ctcccttatc tcccgcgctc cacactctcc actccccgcc 60 atggctgccg ttggcgtcgt ctccccgccg gcgccgcccg ccgtggccgc cgcctccacc 120 tcgtccccgc gccgccgcgt ccgcctcccc ctcggccgtg tctcctcctc cgcggcgtcg 180 ttccgcgccc ggtgcgccgc cgccgcggaa gacggcggcg ccacggccgc ccccgaggac 240 gccgcggcgg cggcggcggt ggcggaagcc gtggaggggg accccgaggc cgggacggac 300 gtcgccggcg gcgccgcgac gtcgacgcgg ccgccgtact cgctcatctc cgccgacaac 360 gtgcagaagg cgatgcgcgg cctcggtacg tgcgcgtttc ttggttgacg ccattgctta 420 gcaatcagtt aattttgggt tctgtatttt tttatcatgc taagagtatt agttgtacaa 480 ctttgcagat attctaatta taccattata tttaccaatg tttatctgtg cgcctcttat 540 aatttgtaga aaatatagca taataatgaa ccgaggccgc agagtagtgt agttaaattt 600 ccctatttgc 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gcttagattt gcagttagat cttaatttac caacacaatt 1500 ttctgtagta tacttcaaga atgaacctag tttcatattc agtgtgtcat cgatgtcctt 1560 atttggtaat tagctagcta gccagtatgc tttcaattgt acttctggtg ctctgctagt 1620 actgtcactc tagaataccg gacttcaatc cttaaatcag gttaaagccg cctacgagaa 1680 gaagtgcgaa gaactgaata gcaaaggatt ggaagaagag gaaatcaaca aggagcatga 1740 cctcctaaag gttcagatgc aaaatcagtc aataaccttt tcttcagtct tcacccattc 1800 aattccagtg cctcctaaac aaaacattac tgcatcatgg caggaatctt ttaccatact 1860 atggaccgag gaagagagaa gattatacga ttggagtttg gcaagaagtg gaaagcctga 1920 gcgatatgtc tggcctttcg aagtcgatcc catggagcta gcaccagatc ctccaaaggt 1980 attgcaccta tttagaacag tcatttttaa gataatctgt ccataagcaa attcatcagt 2040 gtcttctcca aacagctcat ttctttcatt caaaaaattt caaataaaat ggtttacggt 2100 tctccgaaaa tatctgttat cttctctcat caaagcatat gaataatcag aatgatgttt 2160 gattatatga gcaggaacca gaagatgagt tcccaacaaa gctggttggc tactttttcc 2220 tggcatggtt catactatct gttgccttgt cagtaaccct caacagatga tgagtagctg 2280 tagttgtaat ccagcactcc tttcggcgtc accatgaatg ctctgcatga ctacatgtat 2340 actgattatg gtaactaaag taaagcgcgt aaaaatcgct gaatgcgtat gtacagatca 2400 tgtttatatg tctctaaatc tttcaaggaa tcgatgagcc attttatacc aatgcaaatg 2460 a 2461 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forword primer of LOC_Os12g31460 pro Bamh 1 <400> 6 ggatccggtc aactatcgac gacttg 26 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of LOC_Os12g31460 pro Xho 1 <400> 7 ctcgaggagt ggagagtgtg gagcg 25 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer of RB_backbone_F2 <400> 8 tcgcacggaa tgccaagca 19 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer of Os12g31460_seq_1 <400> 9 gagaggagga ggcagaggag 20 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer of Os12g31460_seq_2 <400> 10 ttgtctttga ttcgttgtgg a 21

Claims

서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 잎, 줄기 또는 이들 모두에 특이적으로 발현되는 프로모터.
제1항의 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된(Operatively linked) 외래 유전자를 포함하는 벡터.
제2항의 벡터에 의해 형질 전환된 형질전환세포.
제2항에 따른 벡터 또는 제3항에 따른 형질전환세포로 형질 전환된 단자엽 형질전환 식물체.
제4항에 있어서, 상기 형질전환 단자엽 식물체는 벼(Oryza sativa)인 형질전환 식물체.
제2항의 벡터로 단자엽 식물을 형질 전환시켜 상기 외래 유전자를 단자엽 식물체에서 발현시키는 단계를 포함하는 단자엽 식물의 형질 전환 방법.
하기의 단계들을 포함하는 벼의 잎, 줄기 또는 이들 모두에 특이적으로 발현되는 벼 형질전환체의 제조방법:
서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된(operatively linked) 외래 유전자를 포함하는 벡터를 제조하는 단계;
벼에 상기 벡터를 도입하는 단계; 및
상기 벡터가 도입되어 벼의 잎, 줄기 또는 이들 모두에 특이적으로 유전자가 발현되는 벼 형질전환체를 선별하는 단계.