JP6607616B2 - 植物において組み換えタンパク質の高発現を可能にする5’utrをコードするdna分子 - Google Patents
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Description
項1. 以下の(i)〜(iii)のいずれかに示すポリヌクレオチドからなることを特徴とする、5'UTRをコードするDNA分子:
(i)配列番号1又は2に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(ii)配列番号1又は2に示す塩基配列において、1又は数個の塩基が置換、欠失若しくは付加された塩基配列からなり、且つ配列番号1又は2に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドと同等の5'UTR活性を示すポリヌクレオチド、
(iii)配列番号1又は2に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNA断片とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ配列番号1又は2に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドと同等の5'UTR活性を示すポリヌクレオチド。
項2. 配列番号1〜6のいずれかに示す塩基配列からなるポリヌクレオチドからなる、項1に記載のDNA分子。
項3. 項1又は2に記載のDNA分子が、タンパク質をコードするポリヌクレオチドの5'末端側に連結されている、核酸構築物。
項4. 項3の記載の核酸構築物を含む、ベクター。
項5. 項4に記載のベクターを植物又は植物細胞に導入する、形質転換体の製造方法。
項6. 項4に記載のベクターで、植物又は植物細胞が形質転換されてなる、形質転換体。
項7. 項6に記載の形質転換体を培養又は栽培する、組み換えタンパク質の製造方法。
本発明のDNA分子は、5'UTRをコードするDNA分子であって、以下の(i)〜(iii)のいずれかに示すポリヌクレオチドからなることを特徴とする。
(i)配列番号1又は2に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(ii)配列番号1又は2に示す塩基配列において、1又は数個の塩基が置換、欠失若しくは付加された塩基配列からなり、且つ配列番号1又は2に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドと同等の5'UTR活性を示すポリヌクレオチド、
(iii)配列番号1又は2に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNA断片とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ配列番号1又は2に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドと同等の5'UTR活性を示すポリヌクレオチド。
本発明の核酸構築物は、前記(i)〜(iii)のポリヌクレオチドが、タンパク質をコードするポリヌクレオチドに連結してなることを特徴とする。
本発明のベクター(発現ベクター)は、前記核酸構築物を、ベクター内で発現可能に連結することによって得ることができる。より具体的には、本発明のベクターは、プロモーター配列を備えたベクターに、前記核酸構築物をプロモーターの転写開始点直後に連結することにより得ることができる。
本発明の形質転換体は、本発明のベクターを植物又は植物細胞に導入することによって得ることができる。
以下の検討には、次の植物体及び培養細胞を用いた。
シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana Columbia-0 (Col-0))の種子を5%次亜塩素酸ナトリウム、0.05%Triton-X溶液で10分間滅菌後、滅菌蒸留水で置換し、冷蔵庫(MPR-514, Panasonic, Osaka, Japan)にて2日間4℃暗所で春化処理を行った後、GM培地に蒔き生育条件に移行した日を発芽0日目とした。22℃で、16時間明期/8時間暗期条件のグロースチャンバー(BIOTRON, NK system, Osaka, Japan)で育成した。
シロイヌナズナ培養細胞(Arabidopsis thaliana T87)は理化学研究所ジーンバンク室植物開発銀行より分与していただいたものを使用した。培養は22℃で、24時間明期、振とう速度80rpm(SLK-3-FS, NK system)の条件で行い、95mLの改変LS培地(Nagata, T., Nemoto, Y., Hasezawa, S. (1992). Tobacco BY-2 cell line as the HeLa cell in the cell biology of higher plants. Int. Rev. Cytol. 132, 1-30.)を300mL容の三角フラスコに入れ使用した。一週間ごとに定常期に達した細胞8mLを新しい培地95mLに移植し継代培養を行った。
タバコ(Nicotiana benthamiana)は、北海道産業技術総合研究所から供与して頂いたものを使用した。滅菌はシロイヌナズナ植物体と同様の方法で行い、滅菌時間のみ30分にした。春化処理の方法もシロイヌナズナ植物体と同じである。春化処理後、土(園芸培土, 日本肥糧株式会社, Tokyo, Japan)を入れたポットに種を撒き発芽させ、温室にて育成し、発芽14日目に1植物体ごとを新たなポットに植え替え生育させた。
3−1.mRNAの翻訳状態の評価法としてのポリソーム/マイクロアレイ解析
一般的にmRNAの翻訳状態は、mRNAに多数のリボソームが結合していれば翻訳が活発に行われており(ポリソーム)、リボソームが結合していなければ翻訳が行われていない(ノンポリソーム)というように、mRNAに結合するリボソームの数を指標として判断されている(Bailey-Serres, J., Sorenson, R., Juntawong, O. (2009). Getting the message across: cytoplasmic ribonucleoprotein complex. Trends Plant Sci. 14:443-453)。このような手法はポリソーム解析と呼ばれており、DNAマイクロアレイ解析と組み合わせることでmRNAの翻訳状態をゲノムスケールで評価することができる。
PR(Polysome Ratio)値とは、それぞれのmRNAの全mRNA量に対してのポリソーム画分に存在する量の比を数値化した値であり、翻訳状態を表す指標の一つである。mRNAのPR値が高い程、活発に翻訳されていると推測される。そこで、成長段階及び発達段階が異なるシロイヌナズナ植物体から試料を調製し、ポリソーム/マイクロアレイ解析を行い、各試料における全mRNA種のPR値を算出した。その概念図を図1に示す。
ショ糖密度勾配遠心を利用したポリソーム解析は、若干の改変を加えた以外は基本的にDaviesらの方法に従って行った(Davies, E., and Abe, S. (1995). Methods for isolation and analysis of polyribosomes. Methods Cell Biol. 50, 209-222.)。成長段階の異なる試料として、発芽2日目(幼植物体)と21日目(成長した植物体)の全植物体を、発達段階の異なる試料としては、発芽21日目の最も若い葉を第1葉とし、第1〜3葉を未展開葉、第6〜8葉を展開葉としてハサミで切りとり、液体窒素を入れた乳鉢に入れ、破砕を行い−80℃で保存した。サンプル破砕粉末におおよそ2倍量(w/v)のExtraction Buffer(200 mM Tris-HCl, pH8.5, 50 mM KCl, 25 mM MgCl2, 2 mM EGTA, 100 μg/mL heparin, 100 μg/mL cycloheximide, 2% polyoxyethylene 10-tridecyl ether, and 1% sodium deoxycholate)を加え、緩やかに懸濁した。遠心(14,000×g, 15 min, 4℃)により細胞残さを除き、更に遠心(14,000×g, 10 min, 4℃)し、その上清をRNA粗抽出液とした。この粗抽出液をExtraction BufferによりRNA濃度200ng/μL〜800ng/μLに調整し、予め作製した26.25〜71.25%ショ糖密度勾配液(ショ糖, 200 mM Tris-HCl, 200 mM KCl, 200 mM MgCl2)4.85mL上に300μL重層し、超遠心を行った(SW55Ti rotor, 55,000 rpm, 50 min, 4℃, brake-off)(Optima, Beckman Coulter, California, USA)。ピストン・グラジェント・フラクショネーター(BioComp, Churchill Row, Canada)によってショ糖密度勾配の上部より約1mL/minの速さで吸引すると同時に、BIO-MINI UV MONITOR AC-5200(ATTO, Tokyo, Japan)を用いて254nmの吸光度を記録した。
超遠心後のショ糖密度勾配液を8つの画分に分画し、1〜3番目の画分(底側が1番)を混合したポリソーム画分と1〜8番目を混合したトータル画分から、それぞれポリソームRNA、トータルRNAを抽出した。それぞれの画分には終濃度5.5Mになるように8Mグアニジン塩酸塩を予め加えたチューブに回収した。この時、Two-Color RNA Spike-In Kit(Agilent Technologies, USA)に含まれるspike mix Aをポリソーム画分に、spike mix Bをトータル画分にそれぞれ加えた。それぞれのspike mixには、in vitro合成されたポリA配列をもつ10種類の転写産物が、200倍のダイナミックレンジでかつ既知の量比で混合されている。また、それらの転写産物に対応するスポットが本研究で使用したAgilent oligoarray(Arabidopsis 3 oligo microarray 44K; Agilent Technologies)に存在する。RNA spike-inはショ糖密度勾配遠心液を回収すると同時に加えているため、その後のRNA精製やラベリング、ハイブリダイゼーション(後述)などの過程を経ることになる。従って、RNA spike-inに対応するスポットのシグナル値を用いた補正を行うことにより、ショ糖密度勾配における実際のRNA比率(ポリソームRNA vs. トータルRNA)を試算することが可能となる(Melamed, D., and Arava, Y. (2007). Genome-wide analysis of mRNA polysomal profiles with spotted DNA microarrays. Methods Enzymol. 431: 177-201.)。ショ糖溶液及びグアニジン塩酸塩の混合液に対し等量の100%エタノールを加え、−20℃にて一晩冷却した後、遠心操作(20,000 × g, 45 min, 4℃)を行った。得られたペレットを85%エタノールにて一度洗浄した後、RNeasy kit(Qiagen, Germany)に含まれるbuffer RLTにてペレットを溶解し、以降は付属のプロトコールに従いRNeasy kitを用いてRNA精製を行った。その後、更にLiCl沈殿による精製を行った。RNAの品質は、Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent Technologies)を用いたオンチップ電気泳動法により検定した。
同一のショ糖密度勾配由来のポリソームRNA及びトータルRNAから、それぞれcyanine3(Cy3)、cyanine5(Cy5)で蛍光標識したcomplementary RNA(cRNA)を調製した。その後、調製したcRNAをAgilent oligoarray (Arabidopsis 3 oligo microarray 44K)を用いた競合ハイブリダイゼーション実験に供した。Arabidopsis 3 oligo microarrayには、シロイヌナズナ由来の転写産物や前述のRNA spike-in等の塩基配列から選択された、60merのオリゴDNAが44000スポットプリントされている。RNAの増幅及び蛍光標識には、Low RNA Input Fluorescent Liner Amplification Kit(Agilent Technologies)を使用した。まず、500ngのRNAを鋳型に、リンカー配列としてT7プロモーター配列を含むオリゴdTプライマー及びMMLV−RTを用いた逆転写反応を行った。合成されたcDNAを鋳型に、T7 RNA polymerase in vitro転写反応により、Cy3(ポリソームRNA)又はCy5(トータルRNA)で標識されたCTPを取り込んだcRNAを合成した。合成されたcRNAの精製はRNeasy kitを用いて行った。cRNAをそれぞれ750ngずつ混合し、65℃で17時間のハイブリダイゼーション反応に供した。スライドを洗浄した後、Agilent Technologies Microarray Scanner(Agilent Technologies)を用いてスキャニングを行い、Cy3及びCy5のシグナルを検出した。
スキャニング画像からのデータの抽出には、Feature extraction software(Agilent Technologies)を用いて行った。Feature extraction softwareの設定基準に従って立てられたフラグを基に、Cy3、Cy5いずれかについてシグナル値が飽和しているスポット(glsSaturated, rlsSaturated)、スポット内のシグナルが不均一なスポット(glsFeatNonUnifOL, rlsFeatNonUnifOL)、複数スポットされている遺伝子についてはずれ値であるスポット(glsFeatPopnOL, rlsFeatPopnOL)、シグナルとバックグラウンドに優位さがないスポット(glsPosAndSignif, rlsPosAndSignif)(glsWellAboveBG, rlsWellAboveBG)を、以降の解析から除いた。正規化には、RNA spike-inに対応するスポットを基に行う方法、若しくはFeature extraction softwareにおける標準的な正規化方法であるLiner&LOWESS法(Locally Weighted Liner Regression)を用いた。解析対象として残ったスポットに関して、翻訳状態の指標としてPR値: Polysome Ratio = Cy3(polysome RNA)シグナル値/Cy5(total RNA)シグナル値を算出した。
発芽2日目(幼植物体)、21日目(成長した植物体)及び発芽21日目の未展開葉と展開葉から調製したポリソームRNAとトータルRNAを用いて、16348種のmRNAのPR値を算出し、すべての試料で高いPR値を示した以下の4種を候補mRNAとして選抜した(括弧内がそれぞれのPR値;全RNAの中で活発に翻訳されているポリソームRNAの占める割合)。
(I) At1g06760 (Histone H1:H1):2日目(0.62)、21日目(0.55)、未展開葉(0.56)、展開葉(0.58)
(II) At1g34000 (One-Helix Protein 2:OHP2):2日目(0.73)、21日目(0.66)、未展開葉(0.64)、展開葉(0.67)
(III) At1g20440 (Cold-Regulated 47:COR47): 2日目(0.79)、21日目(0.69)、未展開葉(0.69)、展開葉(0.76)
(IV) At5g13420 (Transaldolase 2:TRA2): 2日目(0.71)、21日目(0.67)、未展開葉(0.65)、展開葉(0.67)。
翻訳効率には5'UTRが重要であり、候補mRNAの5'UTRは高い翻訳効率に寄与することが期待される。しかし、mRNA種によっては複数の転写開始点が存在(5'UTRが異なる複数のmRNA)している。そこで、候補mRNAの5'UTRの配列を決定するため、ゲノムワイドに転写開始点を決定できるCAGE解析法を用いたデータからの情報の抽出を行った。CAGEライブラリーの作製は、Kodziusらが開発した手法に従った(Kodzius, R., Kojima, M., Nishiyori, H., Nakamura, M., Fukuda, S., Tagami, M., Sasaki, D., Imamura, K., Kai C., Harbers, M., Hayashizaki, Y., Carninci, P. (2006). CAGE: cap analysis of gene expression. Nat. Methods 3: 211-22.)。先ず、シロイヌナズナ植物体からTRIzol(Invitrogen)を用いて調製したトータルRNA 5μgを鋳型に、N15ランダムプライマーとPrimer Script Reverse Transcriptase (TAKARA)を用いた逆転写反応を行い、cDNAを合成した。合成されたRNA/cDNA複合体に対してAgencourt RNAClean XP (Beckman)を用いてcDNAの精製を行った。次に、cDNAに対してCAGE linkerを結合させた。CAGE linkerは既知のssDNAであり、MmeI及びXmaJI制限酵素サイトを含む。またssDNAの5'末端にはBiotinが付加されている。結合後、CAGE linkerをプライマーとしてssDNAからdsDNAを合成した。合成されたdsDNAに対して、MmeI制限酵素処理を施した。MmeIはクラスI制限酵素であり、認識部位の5'末端から20塩基下流を切断する。本実験系においては、CAGE linkerに結合させたcDNA由来領域が切断部位に相当する。MmeI切断部位に対して、更に既知のリンカーを結合させた。この段階で、両末端に既知の配列が付加された、mRNAの5'末端20塩基に対応する配列を含むdsDNA(CAGEタク?)が得られた。更に、制限酵素XmaJI処理で余分なリンカー領域を取り除き、CAGEタグをつなぎ合わせることで、CAGEライブラリーを得た。シーケンス解析は、illumina(R) HiSeq 2000を用い、付属のプロトコールに従って行った。得られたrawデータからCAGE linker配列を除去し、エラーリード及びリポソーマルRNAに対応するタグを除去した。次にTAIR10(http://www.arabidopsis.org)の情報を基にマッピングを行った。各タグの5'末端の染色体上の位置を転写開始点とし、各転写開始点におけるタグの数がカウントされているが、マッピングされたタグ配列の5'末端にはcap由来のGが付加されているため、実際の転写開始点はGを除去後の位置とした。その後、解析された2反復のデータ間において共にタグが存在している転写開始点のみを選抜し、タグの数をTag per million(TPM)値に変換した。各転写開始点のアノテーションは、TAIR10の情報をもとに行い、各遺伝子についてTAIR10に記載されている転写開始点の上流500からCDS領域までの範囲に含まれている転写開始点についてアノテーションをつけた。その後、遺伝子ごとに発現量としてTPM値の合計値と各転写開始点の分布率を算出した。
得られた候補5'UTR(計6種)の翻訳能力を評価するため、DNA一過性発現実験をシロイヌナズナ培養細胞から調製したプロトプラストを用いて行った。試験する5'UTRは、5'端にCla1サイト、3'端にはAatIIサイトを持つ各5'UTR特異的プライマーにより、シロイヌナズナゲノムDNAを鋳型としてPCRにより増幅し、pUC118ベクターのHincIIサイトに挿入した。その後、Cla1、AatIIで切り出し、35Sプロモーターの支配下にF-luc遺伝子とHSPターミネーターを持つプラスミドpBluescriptIIKS+のCla1/AatIIサイトに挿入し、試験プラスミドDNAとした(図3、矢印は転写開始点及び翻訳開始点を示す)。補正用のR-luc遺伝子については、35Sプロモーター、R-luc遺伝子、HSPターミネーターよりなる発現カセットを持つpBluescriptIIKS+を用いた(図4)。DNA(F-luc 0.4 μg, R-luc 0.04 μg, total volume 5 μl前後)をシロイヌナズナT87培養細胞から調製したプロトプラストにpolyethlen glycol (PEG)法(Kovtun, Y., Chiu, W. L., Tena, G., Sheen, J. (2000). Functional analysis of oxidative stress-activated mitogen-activated protein kinase cascade in plants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 6: 2940-2945.)により導入し、22℃で6時間静置した後、遠心操作を行い、上清を除いた。その後、液体窒素で凍結して-80℃にて保存した。その後、passive lysis buffer (Promega Wisconsin, USA)を用い細胞を溶解させ、Dual-luciferase reporter assay system (Promega)とルミノメータ(Lumat LB 9501; Berthold, Northern Black Forest, Germany)によって溶解液中のF-luc、R-luc活性を測定し、相対活性値(F-luc活性値/R-luc活性値)を求めた。また、既に高い翻訳能力を持つとして知られているAt1g77120(Alcohol dehydrogenase:ADH)の5'UTR(Sugio, T., Satoh, J., Matsuura, H., Shinmyo, A., Kato, K. (2008). The 5'-untranslated region of the Oryza sativa alcohol dehydrogenase gene functions as a translational enhancer in monocotyledonous plant cells. J. Biosci. Bioeng. 105: 300-302.)(表1)についても同様に評価し、それぞれの候補5'UTRの相対活性値をADHの5'UTRに対する相対活性値(候補5'UTR相対活性値/ADHの5'UTRの相対活性値)として算出した(図5)。
候補5'UTRの発現能力を植物体で評価するために、タバコ(Nicotiana benthamiana)を用いたアグロインフィルトレーション法を行った。DNA一過性発現実験に用いたプラスミドDNA(H1-1、COR47-2、ADH)を制限酵素HindIII/EcoRI/PvuIIで処理し、p35S::5'UTR::F-luc::tHSPの部分を切り出した。バイナリーベクターpRI909(TaKaRa)のHindIII/EcoRIサイトに上記断片を挿入し、バイナリーベクターを構築した(図6)。また、一般的に用いられる市販の発現カセット(p35S::ベクター由来の5'UTR::F-luc::tNOS)についても同様にバイナリーベクターを構築した(図6)。表1に、ベクター由来の5'UTRの塩基配列を示す。補正用のR-luc遺伝子を持つ発現カセットについても同様にバイナリーベクターを構築した(図7)。これらバイナリーベクターを保持するアグロバクテリウムを5mlの2×YT培地にて28℃で30時間培養した後、遠心操作を 5000rpm(MX-300,トミー精工, Tokyo, Japan) で行い、50 ml容ファルコンチューブに集菌した。ペレットをインフィルトレーションバッファー(10 mM MgCl2, 10 mM MES-KOH pH5.8, 100 μM Acetosyringone)で懸濁し、分光光度計で各々O.D.600の値が1になるように調整した。F-lucを導入したバイナリーベクターを保有するアグロバクテリウムとR-lucを導入したバイナリーベクターを保有するアグロバクテリウムを9:1の比で混合し、3時間室温で静置した。温室で40日育成したタバコNicotiana benthamiana)に1ml中口シリンジ(TERUMO, Tokyo, Japan)を用いて、最も若い葉を第1葉とした時の第3、5、及び7葉に各50μlずつ注入した。その後、2ml容チューブにジルコニアビーズ(bms, Tokyo, Japan)を一つずつ入れ、そのチューブにアグロバクテリウム導入3日後の第3、5、及び7葉からBIOPSY PUNCH (kai industries, Gifu, Japan) を用いて3パンチずつ葉の断片をサンプリングし、液体窒素で凍結した。その後、TissueLyserII (QIAGEN)でFrequency 20/s, 30secで破砕し、passive lysis buffer加え室温にて10分間ミキサーで溶解させた後、ルシフェラーゼ活性を測定し、相対活性値(F-luc活性値/R-luc活性値)を算出した(図8)。
5'UTRはmRNAの翻訳効率を規定する非常に重要な要因であるが、加えて5'UTR内の開始コドン近傍配列も翻訳効率に影響を与えることが知られている(Sugio, T., Matsuura, H., Matsui, T., Matsunaga, M., Nosho, T., Kanaya, S., Shinmyo, A., Kato, K. (2010). Effect of the Sequence Context of the AUG Initiation Codon on the Rate of Translation in Dicotyledonous and Monocotyledonous Plant Cells. J. Biosci. Bioeng. 109: 170-173.)。そこで、H1-1とCOR47-2の開始コドン近傍配列をより効率の良いと考えられる塩基に置換した上で図3と同様な試験プラスミドを作製し、DNA一過性発現実験をシロイヌナズナ培養細胞から調整したプロトプラストを用いて行った。それぞれ改変した5'UTRをH1-1modとCOR47-2modとし、その塩基配列を表2に示す。先の実験と同様の方法で、F-luc、R-luc活性を測定し、相対活性値(F-luc活性値/R-luc活性値)を求め、それぞれ改変前の5'UTRの相対活性値を1とした時の改変5'UTRの相対活性値を算出した。
植物体で候補5’UTR(COR47-2)の能力を評価するために安定形質転換体の作出を行った。本試験では、前記「3−10.アグロインフィルトレーションによる候補5'UTRの翻訳能力の評価」で構築したバイナリーベクター(図6:5'UTRとしてCOR47-2を使用)を使用した。更に、比較のために、当該バイナリーベクターにおいて、5’UTRのCOR47-2をAt3g47610 mRNAの5’UTR(表3に示す塩基配列)に置き換えたものを構築し、使用した。なお、At3g47610 mRNAの5’UTRは、前記「3−7.各試料でPR値の高い候補mRNAの選抜」において、成長・発達した組織では低いPR値を示し、翻訳効率が低いことが確認されている。
Claims (6)
- 配列番号1、3、4又は5に示すポリヌクレオチドからなることを特徴とする、5’UTRをコードするDNA分子。
- 請求項1に記載のDNA分子が、外来タンパク質をコードするポリヌクレオチドの5’末端側に連結されている、核酸構築物。
- 請求項2の記載の核酸構築物を含む、ベクター。
- 請求項3に記載のベクターを植物又は植物細胞に導入する、形質転換体の製造方法。
- 請求項3に記載のベクターで、植物又は植物細胞が形質転換されてなる、形質転換体。
- 請求項5に記載の形質転換体を培養又は栽培する、組み換えタンパク質の製造方法。
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