CN115786337A - 一种来源于杨树的根特异启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物启动子技术领域，公开了一种来源于杨树的根特异启动子及其应用，该根特异性启动子的序列如SEQ ID NO.1所示，基于该特异性启动子构建的重组表达载体、重组菌能够用于在启动目的基因在植物的根部特异表达且在其他组织中不表达，故其在植物新品种培育、植物土壤修复等领域具有巨大的应用潜力。

Description

一种来源于杨树的根特异启动子及其应用

技术领域

本发明属于植物启动子技术领域，具体涉及一种来源于杨树的根特异启动子及其应用。

背景技术

基因表达的调控发生在基因转录水平到翻译后修饰的不同层次阶段及多个阶段，其中RNA转录的开始是最重要的。基因转录起始位点上游包含顺式作用元件的DNA序列被称作为启动子，在转录水平上是一个重要的调控元件。启动子是RNA聚合酶识别、结合的位点，驱动转录的起始，它含有转录起始与RNA聚合酶特异性结合所需的保守序列，多数启动子位于基因转录起始点的上游，其本身不被转录。植物基因的启动子不仅是RNA聚合酶II识别的位点，还存在多种顺式作用元件。因此，植物基因的启动子对下游基因转录水平的调控主要发生在这些顺式元件与反式元件之间的相互作用。随着启动子基本功能顺式元件的确定及相关转录因子的鉴定，重要农作物基因组及表达谱信息的获得大大提高了启动子研究的便利性。随着分子生物学和遗传转化技术不断发展，具有不同特性的启动子相应成为研究热点。

启动子按其作用方式大体分为组成型启动子、诱导型启动子和组织特异性启动子。组成型启动子不受外界因素影响，在多数植物组织中均可表达且在不同组织部位的表达水平没有明显差异，所以组成型启动子会造成植株生长发育过程中能量出现不必要的损耗和浪费。而特异性启动子是会驱动基因只在某些特定的部位或器官中表达，表现出发育调节的特性。从而克服了组成型启动子启动的外源基因在受体植物中非特异、持续、高效表达所造成的浪费，增加转基因的效果。其中，根是植物的营养器官，负责吸收土壤里面的水分、无机盐及可溶性小分子有机物质，并且具有支持、繁殖、贮存有机物质的作用。利用根特异性启动子，可以对重金属污染的土壤进行生物修复，也可对植物根系的整个发展状况进行遗传改良，或者为提高植物的抗旱性、抗病性等。而且生态环境恢复是现在研究的热点，相对于物理修复和化学修复，生物修复在土壤重金属污染中具有成本低、时效长、破化小等优点。故根特异性启动子的研究和开发具有重要的应用价值。

目前，有关杨树启动子的研究也一直在发展，人们选择或人工构建目的启动子，这不仅便于对新基因的功能研究，还可在杨树的特定部位或特定阶段实现对外源基因的精准调控。例如，将启动子的-35区/-10区序列突变为保守序列可以提高启动子的活性，将启动子的转录单元进行串联设计，也可以明显提高基因的转录水平，进而提高蛋白表达量。不过，现有研究主要涉及杨树维管组织特异性启动子等方面。

发明内容

针对现有技术中的问题，本发明的目的在于挖掘并利用杨树中的根系特异启动子，丰富了植物根特异启动子的选择性。

为了实现上述目的，本发明的技术方案具体如下：

本发明以南林895杨(P.deltoids×P.euramericana，南京林业大学从美洲黑杨I-69杨(P.deltoids)×欧美杨I-45杨(P.euramericana)杂交后代群体中选育出的优良无性系)为实验材料。取其生长状态良好、同一时期的野生型组培苗五个不同组织(根、茎段、叶片、顶芽、叶柄)的样品分别提取RNA后，进行高通量转录组测序，分析各基因在五个不同组织中的表达量数据，并计算出每个基因在根组织中表达量的平均值、在其他组织(茎段、叶片、顶芽、叶柄)中表达量平均值，以根组织中表达量的平均值除以其他组织中表达量平均值得到FC(Fold Change)值，再将FC值从大到小进行排列，取对应前100个基因进行差异显著性分析，计算出p值，p<0.05则在根中表达量与在其他组织中表达量的差异显著。

经过大量的筛选和验证，本发明得到了一个仅在根部表达且在其他4个组织中均不表达的基因Potri.009G008600，命名为CX03。对其启动子序列进行分析和验证，最终确定了序列如SEQ ID NO.1所示的根特异启动子。

基于上述根特异启动子，本发明提供了一种根特异基因表达盒，其包括权该根特异启动子、由该启动子启动转录的目的基因和终止子。在实际应用过程中，目的基因可根据实际需求进行选定，如目的基因可以富集或转运重金属，将其与该根特异启动子连接并转入植物根中特异表达时，可将土壤中的重金属进行吸附或者转运，从而达到修复土壤重金属污染的效果。

本发明还提供了包含上述根特异启动子的重组表达载体，以及包含该重组表达载体的重组菌。在某些实施例中，可用于接入该根特异启动子的表达载体为pKGWFS7，可用于包含该根特异启动子的细菌为农杆菌或大肠杆菌。

本发明还提供了上述根特异性启动子，或重组表达载体，或重组菌在植物中启动目的基因表达中的应用，具体可包括以下步骤：

S1、克隆权利要求1所述的根特异启动子，并构建包含所述根特异启动子和目的基因的重组表达载体；

S2、将所述重组表达载体转入农杆菌，再侵染植物的外植体，经历诱导愈伤、生芽、芽伸长和生根阶段，筛选得到植物转基因株系。

进一步地，在上述技术方案中，步骤S1中克隆根特异启动子的方法为：以南林895杨的gDNA为模板，利用如SEQ ID NO:2～3所示的引物对进行扩增即得；另外，重组表达载体可通过BP反应和LR反应进行构建。

进一步地，在上述技术方案中，外植体为植物离体叶片。

进一步地，在上述技术方案中，目的基因表达是在植物根部表达。

本发明的有益效果为：本发明通过对杨树根系特异表达基因的筛选，挖掘到了一个根系特异启动子，并对其进一步的深入开发利用，对根系特异启动子在生产上的应用提供了技术支持。

附图说明

图1为部分候选基因在根中表达量平均值与其他组织中表达量平均值的比值；

图2为Actin内参基因(A)与基因CX03(B)在南林895杨五个不同组织中的表达量对比图；

图3为含CX03启动子的PKGWFS7表达载体转化大肠杆菌的菌液PCR检测结果图；

图4为转基因阳性苗的鉴定结果图，其中WT为野生型；

图5为转基因阳性苗的GUS染色图。

具体实施方式

下面将结合实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

下述实施例中，若无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1

本实施例从南林895杨(NL895杨)中筛选并克隆出了一个杨树根系特异启动子。

(1)杨根系特异表达基因的筛选及验证

首先，分别提取南林895杨五个不同组织(根、茎段、叶片、顶芽、叶柄)的RNA，本实验使用的RNA抽提法为改良CTAB法，适用于提取南林895杨各个组织的RNA，具体步骤如下：

①先在研钵内放入研杵并倒入适量酒精，在通风橱内点燃酒精，对研钵和研杵进行高温消毒；在65℃水浴锅中预热加入了2％B-巯基乙醇的适量CTAB提取液；在提取RNA前应戴好口罩以及一次性手套，减小环境中RNA酶对RNA的降解；

②取出新鲜的或于-80℃保存的植物组织样品于消毒后的研钵中，加入液氮后迅速研磨成均匀粉末，称取各0.05～0.1g南林895杨的根、茎段、叶片、顶芽、叶柄组织粉末于装有已预热CTAB提取液的1.5mL离心管中(每个离心管中加入1mLCTAB提取液)，迅速涡旋30～60s，再于65℃水浴4～5min；

③以12000rcf转速离心10min，取≤750μL的上清液并加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)涡旋混匀，10000rcf离心10min；

④将上清液转移到新的离心管，10000rcf离心10min沉淀蛋白；

⑤将上清液转移到新的离心管，并加入等体积的4mol/L LiCl，在-20℃沉淀2h，使RNA变性；

⑥12000rcf、4℃条件下离心10min以沉淀RNA，弃上清液去除DNA；

⑦用500μL 70％乙醇洗涤，12000rcf离心5min，弃去上清液；

⑧用500μL 100％乙醇洗涤，12000rcf离心5min，弃去上清液；瞬时离心，吸干离心管中液体，在超净工作台晾置沉淀10min直至晾干；但是晾干沉淀的时间不宜过长，否则不利于RNA的溶解；

⑨最后加入50μL无酶ddH₂O，在离心管上标注RNA的名称和提取日期，保存于-80℃冰箱备用。

然后选用翌圣生物科技有限公司提供的

Ш1st Strand cDNASynthesisKit逆转录试剂盒(步骤见说明书)将RNA逆转录成cDNA，保存于-80℃。由RNA反转录来的cDNA是个双链稳定的结构，是一段没有内含子而只有外显子的序列。cDNA文库特异地反映了某种组织或细胞中在特定发育阶段表达的蛋白质的编码基因，因此cDNA文库具有组织或细胞特异性，能够比较容易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因。

根据毛果杨参考基因组中基因序列设计RT-PCR引物。以南林895杨五个不同组织的cDNA分别为模板对筛选出的基因以及Actin内参基因进行RT-PCR扩增。设计引物序列的GC含量尽量控制在40％-60％。

通过琼脂糖凝胶电泳观察各个目的基因条带的亮暗程度，即可判断出南林895杨五个不同组织(根、茎段、叶片、顶芽、叶柄)中表达量的差异。在这里需要注意的是，筛选根系特异表达基因的条件是仅在根中表达的，而其他四个组织不表达的基因，这样的基因即是可能在根中特异性表达的候选基因。图1所示即为本发明筛选出的部分候选基因。

将符合筛选要求剩下的扩增产物送往武汉奥科鼎盛生物科技有限公司进行测序，并将序列在BLAST-Search网站上做对比，确定RT-PCR扩增出的基因片段是目的基因的序列。

(2)NL895杨目的基因启动子的克隆

本实施例以经过初步筛选和验证得到的目的基因Potri.009G008600(CX03，如图2所示其仅在根中表达)为例，进一步描述目的基因启动子的克隆过程，具体为：

引物设计：首选在CDS数据库里找到目的基因编码区左端一段紧挨ATG的20bp左右长度序列，并在3kb-pro数据库中查找到该段序列，再选择紧挨着该序列左端的一段20bp的序列作为启动子下游引物，从下游引物最左端开始，选择1.8kb左右长度的序列作为启动子片段，再在启动子片段左端选择一段20bp左右长度的序列作为启动子上游引物。具体的，CX03的启动子片段长度为2005bp且序列如SEQ ID NO.1所示，其引物序列如下所示：

CX03-pro-1F：5’-GATTCTATAGCTGCCAGCTT-3’(SEQ ID NO.2)；

CX03-pro-1R：5’-TTTGTATTTTTCTGAATCTC-3’(SEQ ID NO.3)。

DNA提取：使用的DNA抽提法为CTAB法，适用于提取南林895杨各个组织的DNA，具体步骤如下：

①研钵和研磨棒用无水乙醇消毒，取50～100mg组织至于研钵中，加入液氮迅速研磨至粉末，迅速加入1mL 2％CTAB裂解液，仔细研磨使之形成匀浆状，转移匀浆至1.5mL的离心管中，65℃水浴30～60min，期间每隔10min轻轻上下颠倒混匀；

②12000r/min离心15min，吸取上清于一新的1.5mL离心管中；

③加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1)，涡旋震荡30s(以便萃取液与样品充分接触)，室温静置10min；

④12000r/min离心15min，将上层水相转移到另一新的1.5mL离心管中；

⑤加入预冷的无水乙醇至1mL，-20℃沉淀1～2h；

⑥待DNA成团后，12000r/min离心30s，吸尽乙醇，风干团状DNA，加入50μL ddH₂O溶解DNA，-20℃保存备用(为检测所提取DNA样品的质量，可取2μL样品与4μLLoading Buffer混合进行琼脂糖凝胶电泳)。

启动子片段扩增：以南林895杨的gDNA为模板，进行20μL体系的高保真酶PCR扩增，其中扩增体系如下表所示：

扩增程序为：98℃预变形3min，98℃变性10min；55℃退火20s，72℃延伸2min，35个循环；最后72℃延伸5min。

通过琼脂糖凝胶电泳观察是否有长度符合要求的条带，并将符合要求的剩下扩增产物送去公司测序，将测序结果导入BLAST-Search网站上进行比对进行验证。

实施例2

本实施例构建了包含实施例1所得启动子的重组表达载体和重组菌。

将实施例1成功扩增出的启动子片段，设计带attb接头的上游/下游引物且其序列具体为：

attb-CX03-pro-1F：

5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGATTCTATAGCTGCCAGCTT-3’(SEQ ID NO.4)；

attb-CX03-pro-1R：

5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTTGTATTTTTCTGAATCTC-3’(SEQ ID NO.5)。

采用上述引物，同样以南林895杨的gDNA为模板进行50μL体系的高保真酶PCR扩增，其中扩增体系如下表所示：

高保真酶PCR扩增的程序如下表所示：

通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，在紫外灯下切下目的条带，用Magen凝胶DNA小量回收试剂盒进行胶回收得到目的片段(步骤见试剂盒说明书)，保存在-20℃冰箱。

利用GatewayBP/LR克隆技术，先经过BP反应将上述目的片段重组到pDONR201入门载体上，再依靠载体上存在的特定重组位点经过LR反应重组到pKGWFS7表达载体上。因为pKGWFS7表达载体上有GUS报告基因，故可以通过GUS染色观察变蓝的部位和程度来确定基因的表达部位。

在上述载体构建过程中，入门载体构建-BP反应的体系如下表所示：

反应的条件为室温1～2h，终止反应时向混合液中加入1μL蛋白酶K，37℃孵育10min即可。待反应结束后，进行大肠杆菌转化，具体步骤如下：

①冰上融化一管50μL DH5α感受态，加入10μL重组反应液至感受态中，轻弹管壁数下，随即置于冰上，静置30min；

②42℃金属浴中热激90s后立即缓慢置于冰上静置5min；

③加入450μL的LB液体培养基，37℃恒温培养箱预培养10min，后置于37℃、200r/min摇床上孵育1h；

④5000r/min离心5min，弃400μL上清，重悬剩余菌体涂布于含有Kan的LB固体培养基，平板吹干，37℃倒置培养12～16h；

⑤挑取8～16个大小正常的菌斑，在含有Kan的LB液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养12～16h；

⑥菌液PCR阳性检测，即以37℃培养的菌液作为PCR检测的模板，利用目的基因特异性引物(即SEQ ID NO.4～5所示的引物对)进行PCR检测。

取测序成功的菌株提取质粒，经LR反应连接到pKGWFS7表达载体上，且该反应的体系如下表所示：

待反应结束后，同样转化大肠杆菌转化且转化方式同上，在含有spec抗性的LB固体培养基挑取单菌落，PCR检测(图3)后并提取质粒备用。

实施例3

本实施例将实施例2构建的重组表达载体经农杆菌遗传转化NL895杨中启动目的基因在根部的特异表达，具体过程如下所示。

(1)农杆菌分为根癌农杆菌和发根农杆菌，本实施例选用的是根癌农杆菌，其可以诱导南林895杨产生冠瘿瘤，引发冠瘿瘤的原因为：Ti质粒上的T-DNA上有8个左右的基因在植物细胞内表达，指导合成一种非常特殊的化合物冠瘿碱，进而引起转化细胞癌变。

将实施例2构建好的载体采用电击转化法转入农杆菌感受态GV3101，步骤如下：

①冰上融化一管50μL GV3101感受态，加入1μL重组质粒至感受态中，吹打混匀，全部转至电转杯中(电转杯需提前预冷)；

②电转仪1800V电击数秒至听到蜂鸣声即电转成功，向电转杯中加入500μLYEB液体培养基，吹打混匀，转移至1.5ml无菌离心管中；

③28℃，200r/min孵育1h；

④5000r/min离心5min，弃400μL上清，重悬剩余菌体后涂布于含有Kan和Rif的YEB固体培养基，待平板吹干，置于28℃恒温培养箱中倒置培养36～48h；

⑤挑取10～20个大小适宜的菌斑，在含有spec和Rif的YEB液体培养基中，28℃，200r/min振荡培养12～16h；

⑥菌液PCR检测同实施例2中的大肠杆菌，保存阳性菌液(50％甘油：菌液＝1:1)于-80℃冰箱。

(2)根癌农杆菌介导的叶盘转化法转化南林895杨：

农杆菌体内有Ti质粒，由于植物的受伤组织会产生一些糖类和酚类物质能吸引根癌农杆菌向受伤组织集中，把自己Ti质粒上的T-DNA转移并整合到植物的DNA上去，从而完成了植物侵染过程。

本实施例使用的是继代后25～35d的生长健壮、叶片肥厚且叶片平整的野生型南林895杨组培叶片。准备南林895外植体：取生长28～30d的南林895杨健壮平整叶片，切去叶边缘，划伤主脉，放在DM(固体WPM+AS)培养基上备用。将步骤(1)中转入成功的农杆菌重新复活摇菌至OD值为0.6～0.8，4℃，000rpm离心10min，WPM(液体)+AS重悬菌体，200rpm，28℃摇菌1h。

使用所得菌液侵染准备好的南林895外植体，在DM(固体WPM+AS)培养基上暗培养2天，转到KC(固体WPM+2,4-D+KT+TMT+Kan+cef)培养基诱导愈伤组织；当愈伤组织长出后，切下放到KS(固体WPM+TDZ+TMT+Kan+cef)培养基诱导丛芽生长；将每一个丛芽单独切下作为一个株系，做好标记放到KE培养基(固体WPM+Kan)进行芽伸长。

(3)转基因苗的阳性鉴定：

在KE培养基上筛选出可以长出根系的株系进行阳性鉴定。取株系的混样通过CTAB法提取DNA(提取方法参考实施例1)，并以该DNA为模板，用PKGWFS7-F(5’-CTCATGTATAATTCGAGC-3’，SEQ ID NO.6)和attb-CX03-pro-1R组合进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测出现正确的条带位置(在2000bp左右)即视为DNA水平验证成功。

利用PKGWFS7载体中的GUS报告基因，可以通过GUS染色来观察基因的表达位置，从而可以进一步确定是否具有根特异性的特征。在通过DNA水平阳性鉴定后的株系中，取整株进行GUS组织化学染色。用X-Gluc作为反应底物，将植株材料放在含有底物的溶液中浸泡，植株中具有GUS活性的位置即被染成蓝色斑点或呈现蓝色。GUS染色的具体步骤为：90％的丙酮4℃固定20min，GUS洗液洗两遍，GUS染液没过叶片，37℃培养箱过夜，待染出颜色后，酒精脱色。肉眼或者显微镜下观察，被染上蓝色的部位即为GUS表达部位。

结果显示：只在南林895杨根中观察到蓝色，而南林895杨其他四个组织(茎段、叶片、顶芽、叶柄)中均未观察到蓝色，说明本发明筛选出的CX03基因启动子具有根特异性。

综上所述，本发明开发的来自于杨树的CX03启动子能够仅在根中表达而在其他组织中不表达，故其在植物新品种培育、植物土壤修复等领域具有巨大的应用潜力。

以上所述是本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明之权利范围，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种来源于杨树的根特异启动子，其特征在于，所述根特异启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种根特异基因表达盒，其特征在于，包括权利要求1所述的根特异启动子、由该启动子启动转录的目的基因和终止子。

3.一种重组表达载体，其特征在于，包括权利要求1所述的根特异启动子或权利要求2所述的根特异基因表达盒。

4.一种重组菌，其特征在于，包括权利要求3所述的重组表达载体。

5.如权利要求1所述的根特异性启动子或权利要求2所述的重组载体或权利要求4所述的重组菌在植物中启动目的基因表达中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

S1、克隆权利要求1所述的根特异启动子，并构建包含所述根特异启动子和目的基因的重组表达载体；

S2、将所述重组表达载体转入农杆菌，再侵染植物的外植体，经历诱导愈伤、生芽、芽伸长和生根阶段，筛选得到植物转基因株系。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤S1中克隆根特异启动子的方法为：以南林895杨的gDNA为模板，利用如SEQ ID NO:2～3所示的引物对进行扩增。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述外植体为植物离体叶片。

9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述目的基因表达是在植物根部表达。

10.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述植物为杨树。

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