CN116286863B - 多核苷酸在促进兰科植物芽体生长中的应用 - Google Patents

多核苷酸在促进兰科植物芽体生长中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116286863B
CN116286863B CN202310129000.0A CN202310129000A CN116286863B CN 116286863 B CN116286863 B CN 116286863B CN 202310129000 A CN202310129000 A CN 202310129000A CN 116286863 B CN116286863 B CN 116286863B
Authority
CN
China
Prior art keywords
polynucleotide
gif1
agrobacterium
orchid
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202310129000.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN116286863A (zh
Inventor
王志才
王美娜
张晓捷
杨振宇
赵美丽
李健
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
ORCHID CONSERVATION & RESEARCH CENTER OF SHENZHEN
Original Assignee
ORCHID CONSERVATION & RESEARCH CENTER OF SHENZHEN
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ORCHID CONSERVATION & RESEARCH CENTER OF SHENZHEN filed Critical ORCHID CONSERVATION & RESEARCH CENTER OF SHENZHEN
Priority to CN202310129000.0A priority Critical patent/CN116286863B/zh
Publication of CN116286863A publication Critical patent/CN116286863A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN116286863B publication Critical patent/CN116286863B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8262—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield involving plant development
    • C12N15/8267—Seed dormancy, germination or sprouting

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供多核苷酸在促进兰科植物铁皮石斛芽体生长中的应用，多核苷酸包含调控因子miR396的作用靶点，或调控因子miR396的靶标模拟物。本发明提供的多核苷酸有效提高铁皮石斛的出芽率，并大幅提升在体遗传转化效率。实验结果发现，再生植株生长发育等表型正常，与野生型相似，因而本发明在铁皮石斛中建立了简单易行的遗传转化方法，具有广泛的生产应用前景。

Description

多核苷酸在促进兰科植物芽体生长中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及多核苷酸在促进兰科植物芽体生长中的应用。
背景技术
在过去几十年中，植物遗传转化被广泛应用于基因功能解析和育种研究。然而，植物遗传转化具有较强的基因型依赖性，对诸多品种并不敏感，严重制约了相关研究进展。在兰花中，尽管有成功案例报道，农杆菌介导的、组织培养依赖的传统转化方法效率普遍较低、耗时较长、工作量较大、获得的可再生植株较少。其主要原因包括兰花生长周期较长，以及双子叶植物来源的根癌农杆菌并非单子叶兰花的天然宿主。因此，需要开发出较短时间内获取大量转化再生苗的新方法。
高效的遗传转化和植株再生体系是兰科植物功能基因解析及育种应用的前提和基础。然而，兰科植物大都对农杆菌介导的、组织培养依赖的遗传转化不敏感，因而亟需对转化方法进行改良。
发明内容
根据第一方面，在一实施例中，提供多核苷酸在促进兰科植物芽体生长中的应用，所述多核苷酸包含调控因子miR396的作用靶点。
根据第二方面，在一实施例中，提供一种多核苷酸，所述多核苷酸包含调控因子miR396的作用靶点。
根据第三方面，在一实施例中，提供一种构建体，包含第二方面任意一项所述的多核苷酸。
根据第四方面，在一实施例中，提供一种表达系统，所述表达系统含有如第三方面所述的构建体或基因组中整合有外源的第二方面任意一项所述的多核苷酸。
根据第五方面，在一实施例中，提供一种外植体，包含第二方面任意一项所述的多核苷酸，或第三方面任意一项所述的构建体，或第四方面所述的表达系统。
依据上述实施例的多核苷酸在促进兰科植物芽体生长中的应用，本发明提供的多核苷酸包含调控因子miR396的作用靶点，有效提高兰科植物(例如铁皮石斛)的出芽率，大幅提升在体遗传转化效率。
在一实施例中，从实验结果中发现，再生植株生长发育等表型正常，与野生型相似，因而本发明在铁皮石斛中建立了简单易行的遗传转化方法，具有广泛的生产应用前景。
附图说明
图1为T-DNA载体示意图及组织培养介导的遗传转化模式图；
图2为qRT-PCR分析GRF4-GIF1及MIM396基因过表达水平结果图；
图3为EHA105-GRF4-GIF1对铁皮石斛茎段出芽的影响结果图；
图4为GV3101-GRF4-GIF1对铁皮石斛茎段出芽的影响结果图；
图5为GRF4-GIF1嵌合子增强铁皮石斛在体遗传转化及植株再生结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他材料、方法所替代。在某些情况下，本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。
另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。
本文中为部件所编序号本身，例如“第一”、“第二”等，仅用于区分所描述的对象，不具有任何顺序或技术含义，除非有特别说明。
研究表明，过量表达植物生长调节因子Growth-Regulating Factor(GRF)及其互作蛋白GRF-Interacting Factor(GIF)能够显著增强小麦、玉米、水稻等作物遗传转化效率和植株再生效率，且再生植株表型正常，因此无需诱导表达或从再生植株中去除。GRF是一类植物特有的转录因子，在细胞增殖、器官大小、干细胞分化和植物生长发育等诸多方面发挥重要调控作用。在植物体内，每个GRF转录因子与特定的GIF互作形成转录复合体，受多水平调控。例如，microRNA396(miR396)可在转录后水平结合GRF的mRNA并切割降解，进而影响GRF-GIF功能。GRF中miR396靶位点突变导致GRF转录本积累，因而增强了GRF-GIF调控作用。在愈伤诱导和植株再生过程中，miR396-GRF/GIF模块招募染色质重塑复合体Switch/Sucrose Nonfermenting(SWI/SNF)调控与分生组织决定和器官发生相关下游基因表达。例如，杨树PpnGRF-GIF复合体抑制Cytokinin Oxidase/Dehydrogenase 1(PpnCKX1)表达，造成细胞分裂素积累以及分生组织分化诱导。
来自小麦、柑橘和葡萄的GRF4-GIF1嵌合蛋白赋予小麦、水稻、柑橘和大麻等植物较强的再生能力，甚至无需额外添加外源细胞分裂素，且再生植株无明显生长发育缺陷。当在GRF中引入miR396结合位点同义突变，进一步增强了GRF4-GIF1对植株再生的促进作用。如在西瓜中过表达ClGRF4-GIF1嵌合子提升了非基因型依赖性的遗传转化效率。这些在单、双子叶植物中的研究结果表明，GRF-GIF嵌合子促进再生和遗传转化、缩短再生周期，因此具有广泛的应用前景。
近年来，生长调节因子GRF-GIF辅助的遗传转化在单子叶植物小麦中取得突破性进展。但兰科植物大都对农杆菌介导的、组织培养依赖的遗传转化不敏感，本发明的空载体对照组不带有GRF或MIM396(相当于传统方法)，出芽率显著低于实验组，进一步证实前述现象。
GRF家族在不同物种中的成员数量以及所起的作用存在巨大差异，例如，有的物种中可能是GRF4对芽体再生起到促进作用，另外的物种中，对芽体再生起促进作用的可能是其他成员，难以预测。
与其他物种不同的是，铁皮石斛中有GRF家族成员的数量，以及GRF中哪些成员具有促芽体生长作用均是未知的，不能根据现有的研究结果推知。本发明首次研究了铁皮石斛DcGRF4-GIF1以及mDcGRF4-GIF1在芽体再生中的作用。前述GRF是否具有芽体再生调控作用，以及能否受到miR396靶向调控均是未知的，根据本发明之前的研究结果无法推知。
在一实施例中，本发明旨在提升兰科植物的遗传转化和植株再生效率，以兰科石斛属铁皮石斛为研究对象，利用重构的GRF-GIF表达载体通过组织培养方式转化铁皮石斛，有效提高出芽率，取得了显著效果。主要结果包括：(1)GRF4-GIF1提升铁皮石斛茎段外植体芽体再生效率2倍以上；(2)突变形式的mGRF4-GIF1对芽体再生促进作用更加明显；(3)上游负控因子miR396的靶标模拟物MIM396显著提升出芽效率；(4)GRF4-GIF1促进铁皮石斛在体遗传转化效率大幅提升至22％。
根据第一方面，在一实施例中，提供一种多核苷酸在促进兰科植物芽体生长中的应用，所述多核苷酸包含调控因子miR396的作用靶点。每种多核苷酸中可以包含1个、2个、3个或者更多的作用靶点。
在一实施例中，所述调控因子miR396的作用靶点包含如下核苷酸序列中的至少一种：
TTGTTCAAGAGCTCAGCTGTGGAA(SEQ ID NO:22)；
ATGTTCAAGAGCGCAGCTGTGGAA(SEQ ID NO:23)；
ATGTTCAAGAGCTTAGCTGTGGAA(SEQ ID NO:24)；
CCGTTCAAGAAAGCCTGTGGAA(SEQ ID NO:25)；
CCGTTCtAGAAAaCCaGTaGAg(SEQ ID NO:26)；
TCGTTCAAGAAAGCATGTGGAA(SEQ ID NO:27)；
TCGTTCtAGAAAaCAaGTaGAg(SEQ ID NO:28)。
在一实施例中，所述调控因子miR396的作用靶点包含SEQ ID NO:22～28所示核苷酸序列所构成的组中的至少一种。
在一实施例中，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:1～5所示核苷酸序列中的至少一种。
在一实施例中，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:1～5所示核苷酸序列所构成的组中的至少一种。
在一实施例中，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:1～5所示核苷酸序列中的任意一种。
在一实施例中，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:1～5所示核苷酸序列所构成的组中的任意一种。
在一实施例中，所述兰科植物包括但不限于石斛属。
在一实施例中，所述石斛属植物包括但不限于铁皮石斛。
在一实施例中，将含有所述多核苷酸的构建体转化至表达系统中，使用所述表达系统促进兰科植物芽体生长，通过组织培养获得芽体再生的外植体。
在一实施例中，将兰科植物外植体浸入所述表达系统中，促进兰科植物芽体生长。
在一实施例中，所述表达系统包括但不限于微生物。
在一实施例中，所述微生物包括但不限于细菌。
在一实施例中，所述细菌包括但不限于农杆菌。
在一实施例中，所述农杆菌包括但不限于农杆菌GV3101、农杆菌EHA105。通过组织培养获得芽体再生的外植体时，所述表达系统优选为农杆菌GV3101。
在一实施例中，通过组织培养获得芽体再生的外植体时，包含SEQ ID NO:1～5所示核苷酸序列的多核苷酸相对于空载体对照组均能有效提高出芽率，平行实验中，出芽率从高到低依次为mTaGRF4-GIF1(SEQ ID NO:3)、mDcGRF4-GIF1(SEQ ID NO:5)、DcGRF4-GIF1(SEQ ID NO:4)、TaGRF4-GIF1(SEQ ID NO:2)介导的外植体。miR396靶标模拟物MIM396(SEQID NO:1)介导的外植体出芽率也显著优于空载体对照组。
在一实施例中，将所述表达系统在体转化至兰科植物外植体中，促进兰科植物芽体生长。
在一实施例中，在体转化的方式包括但不限于注射。
在一实施例中，所述表达系统包括但不限于微生物。
在一实施例中，所述微生物包括但不限于细菌。
在一实施例中，所述细菌包括但不限于农杆菌。
在一实施例中，所述农杆菌包括但不限于农杆菌EHA105、农杆菌GV3101。通过在体转化获得芽体再生的外植体时，所述表达系统优选为农杆菌EHA105。
在一实施例中，通过在体转化获得芽体再生的外植体时，包含SEQ ID NO:1～5所示核苷酸序列的多核苷酸相对于空载体对照组均能有效提高出芽率。使用农杆菌EHA105作为宿主时，转化4周后，出芽率从高到低依次为mDcGRF4-GIF1(SEQ ID NO:5)、miR396靶标模拟物MIM396(SEQ ID NO:1)、mTaGRF4-GIF1(SE Q ID NO:3)、DcGRF4-GIF1(SEQ ID NO:4)、TaGRF4-GIF1(SEQ ID NO:2)。使用农杆菌EHA105作为宿主的4周后出芽率明显优于农杆菌GV3101。
根据第二方面，在一实施例中，提供一种多核苷酸，所述多核苷酸包含调控因子miR396的作用靶点。
在一实施例中，所述调控因子miR396的作用靶点包含SEQ ID NO:22～28所示核苷酸序列中的至少一种。
在一实施例中，所述调控因子miR396的作用靶点包含SEQ ID NO:22～28所示核苷酸序列所构成的组中的至少一种。
在一实施例中，所述多核苷酸用于促进兰科植物的芽体生长。
在一实施例中，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:1～5所示核苷酸序列中的至少一种。
在一实施例中，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:1～5所示核苷酸序列所构成的组中的至少一种。
在一实施例中，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:1～5所示核苷酸序列中的任意一种。
在一实施例中，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:1～5所示核苷酸序列所构成的组中的任意一种。
根据第三方面，在一实施例中，提供一种构建体，包含第二方面任意一项所述的多核苷酸。所述构建体通常可以通过将所述分离的多核苷酸插入合适的载体中构建获得，本领域技术人员可选择合适的载体，所述载体可以是噬菌体、质粒、病毒载体或人工染色体，诸如细菌或酵母人工染色体。换言之，本发明的实施方案的载体包含能够在宿主细胞或其分离的级分中表达的感兴趣的多核苷酸。载体通常还适合作为克隆载体，即在微生物系统中可复制；克隆载体可以被设计用于在一种宿主中复制，而构建体被设计用于在不同的宿主中表达。包含本发明的实施方案的多核苷酸的载体还可以包含用于在宿主细胞中繁殖或选择的选择标记。载体可以通过常规转化或转染技术引入到原核或真核细胞中。
根据第四方面，在一实施例中，提供一种表达系统，所述表达系统含有如第三方面所述的构建体或基因组中整合有外源的第二方面任意一项所述的多核苷酸。所述表达系统可以是宿主细胞，所述宿主细胞可以表达第二方面所述的多核苷酸。在本发明另一具体实施例中，所述宿主细胞可以是真核细胞和/或原核细胞，更具体可以是微生物细胞，如细菌细胞等。在一实施例中，所述细菌包括但不限于农杆菌。在一实施例中，所述农杆菌包括但不限于农杆菌EHA105、农杆菌GV3101。
根据第五方面，在一实施例中，提供一种外植体，包含第二方面任意一项所述的多核苷酸，或第三方面任意一项所述的构建体，或第四方面所述的表达系统。
在一实施例中，所述转化受体包括但不限于植物。
在一实施例中，所述植物包括但不限于兰科植物。
在一实施例中，所述兰科植物包括但不限于铁皮石斛。
在一实施例中，可以将铁皮石斛幼苗浸入含有第四方面所述的表达系统的液体(如农杆菌菌液)中，或者向铁皮石斛幼苗中注射(如在切口、茎节、节间等多点注射)含有第四方面所述的表达系统(如农杆菌细胞)，然后培养获得再生芽体。
在一实施例中，本发明重构了来自小麦和铁皮石斛的TaGRF4-GIF1、DcGRF4-GIF1嵌合子，过量表达该嵌合子有效提升了单子叶兰科植物铁皮石斛的芽体再生效率和转基因效率。GRF结合位点突变形式的mTaGRF4-GIF1、mDcGRF4-GIF1、和miR396靶标模拟物MIM396对铁皮石斛的芽体再生作用进一步增强。同时，本发明还开发了铁皮石斛在体转化方法，即将GRF4-GIF1嵌合子直接通过农杆菌注射入铁皮石斛幼嫩茎段中，直接诱导重生芽体的产生，有效提升了芽体再生效率，缩短了再生时间，提高了转基因效率，可高达22％。从实验结果中发现，再生植株生长发育等表型正常，与野生型相似，因而本发明在铁皮石斛中建立了简单易行的遗传转化方法，具有广泛的生产应用前景。
根据现有的文献记录，兰科植物有约800个属，28500个野生种，铁皮石斛是兰科石斛属中的一种。因此，本发明的实施例中，以铁皮石斛为例研究了目的序列对其出芽率的影响。本发明也适用于其他兰科植物。
实施例
主要材料方法：
植物材料及生长条件：
铁皮石斛(Dendrobium catenatum)种子由深圳市兰科植物保护研究中心采收及保存。从三年生的铁皮石斛植株上采收3月龄果荚作为种子来源。果荚浸入75％酒精中，然后在酒精灯上点燃。在无菌操作台中用无菌镊子打开果荚进行播种，置于添加30％蔗糖的MS培养基中萌发。培养条件为25℃，16小时光照/8小时黑暗，相对湿度60％，光照强度50μEm-2s-1。
菌株和植物表达载体：
载体构建中所用的大肠杆菌感受态细胞分别为DH5α(CD501-03，北京全式金)和ccdB survivalTM2 DB3.1(BC111-01，北京博迈德)。农杆菌感受态细胞EHA105(BC307-01)和GV3101(BC308-01)均购自北京博迈德。植物表达载体pNC-Cam1304-35S购自海南你行生物技术公司。
载体构建：
本实施例所用质粒均构建至植物表达载体pNC-Cam1304-35S中，该载体T-DNA内含有CaMV 35S启动子(p35S)，潮霉素抗性基因hptII，以及poly A终止子。铁皮石斛DcGRF4(LOC110113908)和DcGIF1(LOC110105545)基因由4×Ala连接在一起形成嵌合子，构建至植物表达载体中。突变形式的mDcGRF4-GIF1通过引物引入突变位点，克隆并连接至植物表达载体中。类似地，小麦TaGRF4-GIF1、突变形式的mTaGRF4-GIF1、miR396靶标模拟物MIM396由公司(北京华大)合成并连接至上述植物表达载体中。所构建的终载体电激转化至EHA105和GV3101农杆菌感受态细胞中。基因克隆所用引物详见表1。
组织培养途径介导的铁皮石斛遗传转化：
以铁皮石斛幼嫩小苗茎段为外植体，切成0.5-1.0cm茎段，在茎节部位用无菌钢针扎1.0-1.5mm深小孔，便于农杆菌菌液浸入。将茎段浸没入OD600＝1.0的农杆菌菌液中10分钟，然后取出茎段置于无菌干燥滤纸上吸干残余菌液，转移至CCM培养基中(MS基础培养基，6-BA 0.5mg/L，NAA 0.1mg/L，2,4-D 1.0mg/L，琼脂7.8g/L，蔗糖30.0g/L)，于暗中共培养3天。采用100mg/L carbenicillin Na2(羧苄青霉素钠)洗涤茎段3次，然后置于无菌滤纸上干燥。转移茎段至SIM培养基上(MS基础培养基，6-BA 0.5mg/L，NAA 0.1mg/L，2,4-D 1.0mg/L，琼脂7.8g/L，蔗糖30.0g/L，美罗培南50.0mg/L)诱导出芽。培养条件为25℃，湿度60％，16小时光照/8小时黑暗循环光照。
铁皮石斛在体转化体系构建：
将含有植物表达载体的农杆菌甘油菌转接至10.0mL新鲜的LB培养基中，加入50.0mg/L卡那霉素和25.0mg/L利福平，于28℃摇床180rpm震荡培养过夜。将菌液按照10％比例转接至40mL新鲜的含对应抗生素的LB培养基中。当菌液浓度达到OD600＝1.0时，6000rpm室温离心10分钟集菌。然后用40mL新鲜液体MS培养基(含有5.0％蔗糖，0.1％Silwett L-77，50mg/L乙酰丁香酮)重悬菌体，静置3小时后用于植物转化。组织培养来源的铁皮石斛9月龄幼苗作为转化受体材料，首先去除幼苗顶端及所有可见芽体，将含有目的质粒的农杆菌菌液(D600＝1.0)在切口、茎节、节间等多点注射。用滤纸吸干残余菌液，合并5株石斛幼苗为一丛回植入树皮基质的育苗杯中，盖上塑料薄膜保湿2天，然后置于光下正常培养，观察统计出芽情况。
基因转化效率分析：
铁皮石斛幼苗在体转化产生的芽体中，随机选取TaGRF4-GIF1等5个质粒及对照空载体注射的幼苗上产生的芽体，分别采用DNA提取试剂盒(DP350-03，北京天根)提取基因组DNA。以5倍稀释后的基因组DNA为模板，以hptII特异的引物(表1)进行PCR扩增(PCR SuperMix，AS111-12，北京全式金)。PCR产物在1.0％(w/v)琼脂糖凝胶上进行电泳。转基因效率＝hptII阳性植株数/检测植株总数×100％。
qRT-PCR基因表达检测分析：
将含有目的质粒及空载体的农杆菌菌液瞬时转化1月龄本氏烟草叶片，6小时后取注射叶片为样提取总RN A(0416-50gk，华越洋)。取用0.5μg RNA进行反转录(PrimeScriptTMRT reagent kit，RR047B，Takara)。采用Real time荧光定量PCR(Thermo FisherScientific)及Green qPCR MasterMix试剂(MT521-03，北京博迈德)进行TaGRF4-GIF1等5个目的基因的表达检测。以烟草Actin7(LOC104111011)为内参基因，按照2–ΔΔCt方法进行相对表达量计算，每个样品3个重复。
数据分析：
所有数据均整理至GraphPadPrism8软件的表格中，并采用该软件进行统计分析和制图(La Jolla，CA，US A)。采用Student’s t-test分析各处理组与对照组的差异显著性，p<0.05视为差异显著。每个构建设置3-10个不同重复。
表1引物
AtMIM396序列:
GGTACCGGATCCGCCGTAGCCGGCAGGTCTTCTCCCTCTAGAAATTGTTCAAGAGCTCAGCTGTGGAAAGCTTCGGTTTTTCTCTTTGGAATGTTCAAGAGCGCAGCTGTGGAATTTTTCAATTTTTTTGGTTGGAATGT TCA AGAGCTTAGCTGTGGAATTTTGATGGAAGATCTGCCGTAGCCGGCGTCGAC(SEQ ID NO:1)上述序列是人工设计合成序列，在植物基因组中不存在。下划直线标示的3段序列为重复的靶标模拟序列，重复是为了提高体内miR396与该靶标模拟物的结合效率。
“AtMIM396”中的“At”代表拟南芥(Arabidopsis thaliana)。
TaGRF4-GIF1序列：
ATGGCGATGCCGTATGCCTCTCTTTCCCCGGCAGGCGACCGCCGCTCCTCCCCGGCCGCCACCGCCACCGCCTCCCTCCTCCCCTTCTGCCGCTCCTCCCCCTTCTCCGCCGGCGGCAATGGCGGCATGGGGGAGGAGGCGCGGATGGACGGGAGGTGGATGGCGAGGCCGGTGCCCTTCACGGCGGCGCAGTACGAGGAGCTGGAGCACCAGGCGCTCATATACAAGTACCTGGTGGCCGGCGTGTCCGTCCCGCCGGATCTCGTGCTCCCCATCCGCCGCGGCATCGAGTCCCTCGCCGCCCGCTTCTACCACAACCCCCTCGCCATCGGGTACGGATCGTACCTGGGCAAGAAGGTGGATCCGGAGCCGGGCCGGTGCCGGCGCACGGACGGCAAGAAGTGGCGGTGCGCCAAGGAGGCCGCCTCCGACTCCAAGTATTGCGAGCGCCACATGCACCGCGGCCGCAACCGTTCAAGAAAGCCTGTGGAAACGCAGCTCGTCTCGCACTCCCAGCCGCCGGCCGCCTCCGTCGTGCCGCCCCTCGCCACCGGCTTCCACAACCACTCCCTCTACCCCGCCATCGGCGGCACCAACGGTGGTGGAGGCGGGGGGAACAACGGCATGTCCATGCCCGGCACGTTCTCCTCCGCGCTGGGGCCGCCTCAGCAGCACATGGGCAACAATGCCGCCTCTCCCTACGCGGCTCTCGGCGGCGCCGGAACATGCAAAGATTTCAGGTATACCGCATATGGAATAAGATCTTTGGCAGACGAGCAGAGTCAGCTCATGACAGAAGCCATGAACACCTCCGTGGAGAACCCATGGCGCCTGCCGCCATCTTCTCAAACGACTACATTCCCGCTCTCAAGCTACTCTCCTCAGCTTGGAGCAACGAGTGACCTGGGTCAGAACAACAGCAGCAACAACAACAGCGGCGTCAAGGCCGAGGGACAGCAGCAGCAGCAGCCGCTCTCCTTCCCGGGGTGCGGCGACTTCGGCAGCGGCGACTCCGCGAAGCAGGAGAACCAGACGCTGCGGCCGTTCTTCGACGAGTGGCCGAAGACGAGGGACTCGTGGTCGGACCTGACCGACGACAACTCGAACGTCGCCTCCTTCTCGGCCACCCAGCTGTCGATCTCGATACCCATGACGTCCTCCGACTTCTCCGCCGCCAGCTCCCAGTCGCCCAACGGCATGCTGTTCGCCGGCGAAATGTACGCGGCCGCTGCCATGCAGCAGCAACACCTGATGCAGATGAACCAGAGCATGATGGGGGGCTACGCTTCCTCTACCACTGCCACCACTGATCTCATTCAGCAGTACCTGGATGAGAACAAGCAGCTGATCCTGGCCATCCTCGACAACCAGAACAACGGCAAGGTGGAGGAGTGCGCACGGAACCAAGCTAAGCTCCAGCAGAACCTCATGTACCTCGCCGCCATCGCCGACAGCCAGCCTCCGCAGACGGCATCGCTGTCTCAGTACCCGTCCAACCTGATGATGCAGTCCGGGCCGCGGTACATGCAGCAGCAGTCGGCGCAGATGATGTCGCCGCAGTCGCTGATGGCGGCGCGGTCGTCGATGATGTACGCGCAGCAGGCCATGTCGCCGCTCCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCACCAGGCGGCCGCGCACGGCCAGCTGGGGATGTCCTCCGGCGCGACCACCGGGTTCAACCTCCTGCACGGTGAGGCCAGCATGGGCGGCGGCGGCGGCGCCACTGGCAACAGCATGATGAACGCCAGCGTCTTCTCGGACTATGGCCGCGGCGGCAGCGGCGCCAAGGAGGGGTCGACCTCGCTGTCGGCCGACGCTCGCGGCGCCAACTCTGGCGCGCACAGCGGCGACGGGGAGTACCTCAAGGGCACCGAGGAGGAAGGAAGCTAG(SEQ ID NO:2)
下划单直线标示的是miR396靶位点序列。
突变形式的mTaGRF4-GIF1序列：
ATGGCGATGCCGTATGCCTCTCTTTCCCCGGCAGGCGACCGCCGCTCCTCCCCGGCCGCCACCGCCACCGCCTCCCTCCTCCCCTTCTGCCGCTCCTCCCCCTTCTCCGCCGGCGGCAATGGCGGCATGGGGGAGGAGGCGCGGATGGACGGGAGGTGGATGGCGAGGCCGGTGCCCTTCACGGCGGCGCAGTACGAGGAGCTGGAGCACCAGGCGCTCATATACAAGTACCTGGTGGCCGGCGTGTCCGTCCCGCCGGATCTCGTGCTCCCCATCCGCCGCGGCATCGAGTCCCTCGCCGCCCGCTTCTACCACAACCCCCTCGCCATCGGGTACGGATCGTACCTGGGC AAGAAGGTGGATCCGGAGCCGGGCCGGTGCCGGCGCACGGACGGCAAGAAGTGGCGGTGCGCCAAGGAGGCCGCCTCCGACTCCAAGTATTGCGAGCGCCACATGCACCGCGGCCGCAACCGTTCtAGAAAaCCaGTaGAgACGCAGCTCGTCTCGCACTCCCAGCCGCCGGCCGCCTCCGTCGTGCCGCCCCTCGCCACCGGCTTCCACAACCACTCCCTCTACCCCGCCATCGGCGGCACCAACGGTGGTGGAGGCGGGGGGAACAACGGCATGTCCATGCCCGGCACGTTCTCCTCCGCGCTGGGGCCGCCTCAGCAGCACATGGGCAACAATGCCGCCTCTCCCTACGCGGCTCTCGGCGGCGCCGGAACATGCAAAGATTTCAGGTATACCGCATATGGAATAAGATCTTTGGCAGACGAGCAGAGTCAGCTCATGACAGAAGCCATGAACACCTCCGTGGAGAACCCATGGCGCCTGCCGCCATCTTCTCAAACGACTACATTCCCGCTCTCAAGCTACTCTCCTCAGCTTGGAGCAACGAGTGACCTGGGTCAGAACAACAGCAGCAACAACAACAGCGGCGTCAAGGCCGAGGGACAGCAGCAGCAGCAGCCGCTCTCCTTCCCGGGGTGCGGCGACTTCGGCAGCGGCGACTCCGCGAAGCAGGAGAACCAGACGCTGCGGCCGTTCTTCGACGAGTGGCCGAAGACGAGGGACTCGTGGTCGGACCTGACCGACGACAACTCGAACGTCGCCTCCTTCTCGGCCACCCAGCTGTCGATCTCGATACCCATGACGTCCTCCGACTTCTCCGCCGCCAGCTCCCAGTCGCCCAACGGCATGCTGTTCGCCGGCGAAATGTACGCGGCCGCTGCCATGCAGCAGCAACACCTGATGCAGATGAACCAGAGCATGATGGGGGGCTACGCTTCCTCTACCACTGCCACCACTGATCTCATTCAGCAGTACCTGGATGAGAACAAGCAGCTGATCCTGGCCATCCTCGACAACCAGAACAACGGCAAGGTGGAGGAGTGCGCACGGAACCAAGCTAAGCTCCAGCAGAACCTCATGTACCTCGCCGCCATCGCCGACAGCCAGCCTCCGCAGACGGCATCGCTGTCTCAGTACCCGTCCAACCTGATGATGCAGTCCGGGCCGCGGTACATGCAGCAGCAGTCGGCGCAGATGATGTCGCCGCAGTCGCTGATGGCGGCGCGGTCGTCGATGATGTACGCGCAGCAGGCCATGTCGCCGCTCCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCACCAGGCGGCCGCGCACGGCCAGCTGGGGATGTCCTCCGGCGCGACCACCGGGTTCAACCTCCTGCACGGTGAGGCCAGCATGGGCGGCGGCGGCGGCGCCACTGGCAACAGCATGATGAACGCCAGCGTCTTCTCGGACTATGGCCGCGGCGGCAGCGGCGCCAAGGAGGGGTCGACCTCGCTGTCGGCCGACGCTCGCGGCGCCAACTCTGGCGCGCACAGCGGCGACGGGGAGTACCTCAAGGGCACCGAGGAGGAAGGAAGCTAG(SEQ ID NO:3)
下划单直线标示的是突变形式的miR396结合位点，小写字母代表突变位点。
DcGRF4-GIF1序列：
ATGAACAGTACGGCGGCAGCGGTGGGGGTAGGATGCAGACCACCGTTCACGGCGTCGCAGTGGGAGGAGCTGGAGCACCAAGCCCTCATTTTTAAGTACCTGATAGCTGGGATTCCCGTTCCGCCCGAGTTGCTTCTCCCGATTCGAAGGGGCTATGAGACCATGGCCGCCCGCTTCTACCATCATCCAGCCCTGGGTTACTGCTCCTACTACGGGAAGAAACTTGACCCAGAACCTGGCCGTTGCCGGAGGACCGATGGCAAGAAATGGCGGTGCTCAAAAGACGCGTACCCTGACTCCAAGTACTGTGAGCGGCACATGCACCGCGGCCGCAATCGTTCAAGAAAGCATGTGGAAACGCCGCAAGCCCTCTCCCAGTCGCAGTCGTCTTGCTCGACGGTGACTTCCCTAGCTCCCACCTCTCTGGGGAGTTCCGGGAGCGGCAGTGGAAGCGGCGCTACCGCCTCCATTGGCGGAGGTAGTTGCAGCGGCGGGAGCTTCCACTCCCTTCCTCTTCACTCGATCCCTTCAATGCATCATCAAGTCTCTGGCATTGGCGCTGCAACTTCCTCTCATCTCAGCATTGACCCATCTTCATACGGAAACGTCATCTCCAAAGATTTCAGGTATGTTCATGGATCAAAATCTGGGCTAGATGAGCGTGGCTTCTATTCTGAAGCTCCTGGAAGTGCGAGAGTTCTTGGCATGGACTCTGCATTGGATAGTTCATGGCGCCTGTTGTCATCGCCCGTCTCTACATTTCCTCTGTCAAAGGAGAGAGAGAACTCTTTTCTCCATGGCAGTTACCCTCAACTTCAGCCTCTGCAAGAACTTGGTCAGGTGACTATCAGTTCTTTGCCAAAGCAGCATCAGCAGCATCAACACTCCTTCTTTGGAACCGATTATGGATCGACAGAGCCTCCCATCAAGACTGAGCAACCACTACGACCATTTTTCGATGAATGGCCTGGGACAAGAGATTCATGGTCGGATCTCGAGGATGAGAGAACCAATCGTAACTCTTTCTCTACCACACAGCTCTCCATGTCCATACCAATGTCGTCATCTGATTTCTCAACAACAAGTTCTCGATCCCCAAATGATGATATGCAGCAGCATCTGATGCAGATGCAGCCCATGATGGCAGCTTACGCTTCTCCGAACCAGGTCACCACCGATATCATTCAGCAGTATTTGGATGAAAACAAGCAGTTAATTCTGGCAATTCTTGACAACCAAAATTCTGGAAAAACAGATGAATGTGCTGAAAACCAGGCTAAACTTCAGCGCAATCTAATGTACCTGGCTGCCATTGCTGATAGCCAACCCCAAATGACCACCATGGCCCAGTATCCTTCCAATGCGGTCATGCAATCAGACGCGCGATACATGCAACATCAGCAAGCTCCTCAAATGACTCCACAATCTCTCTTAGCCGCCCGGTCCTCAATGCTATACCCTCAGTCGCCAATGTCTGCATTGCAGCAACAGCAGCAGCTTGCACTCCACAGCCAGCTGAGCATGAGCTCTGGCACGTCCGCAGGCTTCAATGTGTTTCACGGCGACACCAATATGGGCGGCAACGGGACGCTCGGATCTGGAGTGTTCCCCGACTTTGGGCGTAGCGGCGGTGGAG CTTTGAAGCAGGGAATGGCAAGCGAAGGACGAACGGGCAACTCAGGAGGGCAGAATGGTGATGGAACTGAACCTTTGTACCTGAAAGGTTCAGAAGCAGAAGGTAACTGA(SEQ ID NO:4)
下划单直线标示的是miR396靶位点序列。
突变形式的mDcGRF4-GIF1序列：
ATGAACAGTACGGCGGCAGCGGTGGGGGTAGGATGCAGACCACCGTTCACGGCGTCGCAGTGGGAGGAGCTGGAGCACCAAGCCCTCATTTTTAAGTACCTGATAGCTGGGATTCCCGTTCCGCCCGAGTTGCTTCTCCCGATTCGAAGGGGCTATGAGACCATGGCCGCCCGCTTCTACCATCATCCAGCCCTGGGTTACTGCTCCTACTACGGGAAGAAACTTGACCCAGAACCTGGCCGTTGCCGGAGGACCGATGGCAAGAAATGGCGGTGCTCAAAAGACGCGTACCCTGACTCCAAGTACTGTGAGCGGCACATGCACCGCGGCCGCAATCGTTCtAGAAAaCAaGTaGAgACGCCGCAAGCCCTCTCCCAGTCGCAGTCGTCTTGCTCGACGGTGACTTCCCTAGCTCCCACCTCTCTGGGGAGTTCCGGGAGCGGCAGTGGAAGCGGCGCTACCGCCTCCATTGGCGGAGGTAGTTGCAGCGGCGGGAGCTTCCACTCCCTTCCTCTTCACTCGATCCCTTCAATGCATCATCAAGTCTCTGGCATTGGCGCTGCAACTTCCTCTCATCTCAGCATTGACCCATCTTCATACGGAAACGTCATCTCCAAAGATTTCAGGTATGTTCATGGATCAAAATCTGGGCTAGATGAGCGTGGCTTCTATTCTGAAGCTCCTGGAAGTGCGAGAGTTCTTGGCATGGACTCTGCATTGGATAGTTCATGGCGCCTGTTGTCATCGCCCGTCTCTACATTTCCTCTGTCAAAGGAGAGAGAGAACTCTTTTCTCCATGGCAGTTACCCTCAACTTCAGCCTCTGCAAGAACTTGGTCAGGTGACTATCAGTTCTTTGCCAAAGCAGCATCAGCAGCATCAACACTCCTTCTTTGGAACCGATTATGGATCGACAGAGCCTCCCATCAAGACTGAGCAACCACTACGACCATTTTTCGATGAATGGCCTGGGACAAGAGATTCATGGTCGGATCTCGAGGATGAGAGAACCAATCGTAACTCTTTCTCTACCACACAGCTCTCCATGTCCATACCAATGTCGTCATCTGATTTCTCAACAACAAGTTCTCGATCCCCAAATGATGATATGCAGCAGCATCTGATGCAGATGCAGCCCATGATGGCAGCTTACGCTTCTCCGAACCAGGTCACCACCGATATCATTCAGCAGTATTTGGATGAAAACAAGCAGTTAATTCTGGCAATTCTTGACAACCAAAATTCTGGAAAAACAGATGAATGTGCTGAAAACCAGGCTAAACTTCAGCGCAATCTAATGTACCTGGCTGCCATTGCTGATAGCCAACCCCAAATGACCACCATGGCCCAGTATCCTTCCAATGCGGTCATGCAATCAGACGCGCGATACATGCAACATCAGCAAGCTCCTCAAATGACTCCACAATCTCTCTTAGCCGCCCGGTCCTCAATGCTATACCCTCAGTCGCCAATGTCTGCATTGCAGCAACAGCAGCAGCTTGCACTCCACAGCCAGCTGAGCATGAGCTCTGGCACGTCCGCAGGCTTCAATGTGTTTCACGGCGACACCAATATGGGCGGCAACGGGACGCTCGGATCTGGAGTGTTCCCCGACTTTGGGCGTAGCGGCGGTGGAGCTTTGAAGCAGGGAATGGCAAGCGAAGGACGAACGGGCAACTCAGGAGGGCAGAATGGTGATGGAACTGAACCTTTGTACCTGAAAGGTTCAGAAGCAGAAGGTAACTGA(SEQ ID NO:5)
下划单直线标示的是突变形式的miR396结合位点，小写字母代表突变位点。
结果：
本实施例首先重构了来自小麦和铁皮石斛的GRF4-GIF1嵌合子(TaGRF4-GIF1和DcGRF4-GIF1)、突变形式的GRF4-GIF1嵌合子(mTaGRF4-GIF1和mDcGRF4-GIF1)以及miR396靶标模拟物MIM396共5个构建(图1A)，以空载体为对照。然后以幼嫩铁皮石斛组培苗茎段为外植体，切取长度为0.5-1.0cm茎段，浸入含有GR F4-GIF1等上述5个质粒及对照空载体的农杆菌(EHA105和GV3101)菌液(OD600＝1.0)中10分钟。在暗中共培养3天后的外植体转移至SIM培养基中诱导芽体产生(图1B)。铁皮石斛含节的茎段外植体在出芽培养基上直接产生芽体，不经过愈伤组织阶段，因此极大缩短了再生时间。
图1为本实施例所用T-DNA载体示意简图及组织培养介导的遗传转化模式图。图1A为本实施例所用T-D NA示意图。LB，左边界。Poly A，poly A终止子。HPT，潮霉素磷酸转移酶。pCaMV，35S CaMV启动子。T aGRF4，小麦GRF4。mTaGRF4，miR396靶位点突变的小麦GRF4。DcGRF4，铁皮石斛GRF4。mDcGRF4，mi R396靶位点突变的铁皮石斛GRF4。TaGIF1，小麦GIF1。DcGIF1，铁皮石斛GIF1。图1B为基于组织培养途径的GRF4-GIF1嵌合子再生增强技术工作模式图。以铁皮石斛幼嫩茎段为外植体，切成约0.5-1.0cm长度，与含有GRF4-GIF1质粒的农杆菌浸染10分钟后，于暗中共培养3天。外植体在SIM芽体诱导培养基上诱导出芽。生长健壮的芽体转移至RIM培养基中诱导生根。
为了验证所构建的质粒能够高水平表达TaGRF4-GIF1等目的基因，将含有对应质粒的农杆菌菌液(OD600＝1.0)注射1月龄烟草叶片，检测浸染6小时后目的基因的表达情况。qRT-PCR结果表明，TaGRF4-GIF1等5个构建相较于对照空载体转化叶片样本均有不同程度上调表达(图2)。其中，DcGRF4-GIF1和mDcGRF4-GIF1表达水平最高，达到600倍左右；MIM396表达水平次之，约是对照空载体转化材料的120倍；TaGRF4-GIF1是对照的15倍，而mTaGRF4-GIF1表达水平相对较低，约是对照的3倍(图2)。该结果表明所构建的质粒能够在植物体内高水平表达TaGRF4-GIF1等5个目的基因，可以用于后续对铁皮石斛的遗传转化研究。
图2为qRT-PCR分析GRF4-GIF1及MIM396基因过表达水平。在一月龄本氏烟草叶片中注射含有目的质粒的农杆菌菌液，于6小时后取注射叶片为样提取RNA。以烟草Actin7基因为内参基因。表达值表示为平均值±标准差(n≥3)。星号“*”代表显著性水平，P<0.05*,P<0.01**,P<0.001***,P<0.0001****。
EHA105-mTaGRF4-GIF1转化的铁皮石斛茎段外植体芽体再生效率为51.92％，比空载体对照芽体再生效率36.80％明显升高(图3A)。进一步地，本实施例测试了铁皮石斛同源基因DcGRF4-GIF1及mDcGRF4-GIF1过量表达对茎段出芽的影响。EHA105-Dc/mDcGRF4-GIF1转化的茎段外植体出芽率相较于对照有上升趋势，尽管统计分析无显著性差异(图3A)。从实验结果中还发现，EHA105-MIM396转化的铁皮石斛茎段外植体出芽率显著高于空载体对照，分别为81.48％和68.90％(图3B)。这些结果表明，GRF4-GIF1等5个构建体能够不同程度提升铁皮石斛茎段外植体出芽率，但提升水平不高，推测可能跟菌株的侵染力不同有关。因此，本实施例进一步利用GV3101菌株替代EHA105进行上述转化实验。出芽对比分析结果表明，GV3101-mTaGRF4-GIF1对铁皮石斛茎段外植体出芽确实有明显促进作用，其提升水平与EHA105递送体系相当(图4A)。值得注意的是，GV3101-DcGRF4-GIF1及GV3101-mDcGRF4-GIF1对铁皮石斛茎段外植体出芽率都有显著提升作用，且后者提升作用更大，达到2倍左右(图4B)。GV3101农杆菌介导的芽体再生效率明显高于在EHA105中观察到的作用，据此推断对于组织培养途径介导的芽体再生过程，GV3101农杆菌优于EHA105。
图3为EHA105-GRF4-GIF1对铁皮石斛茎段出芽的影响。图3A为农杆菌液接种后第4周，EHA105-Ta/m TaGRF4-GIF1和EHA105-Dc/mDcGRF4-GIF1对铁皮石斛茎段出芽的影响。未转化对照Ctrl及空载体EV转化材料作为对照。图3B为农杆菌液接种后第8周，EHA105-MIM396对铁皮石斛茎段出芽的影响。铁皮石斛茎段出芽率＝出芽茎段数/接种茎段总数×100％。星号“*”代表显著性水平，P<0.05*。
图4为GV3101-GRF4-GIF1对铁皮石斛茎段出芽的影响。图4A为农杆菌液接种后第8周，GV3101-Ta/mT aGRF4-GIF1对铁皮石斛茎段出芽的影响。空载体EV转化材料作为对照。图4B为农杆菌液接种后第4周，GV3101-Dc/mDcGRF4-GIF1对铁皮石斛茎段出芽的影响。铁皮石斛茎段出芽率＝出芽茎段数/接种茎段总数×100％。星号“*”代表显著性水平，P<0.05*,P<0.01**,P<0.0001****。
为进一步缩短出芽时间、提升遗传转化效率、简化操作步骤，本实施例在确定GRF4-GIF1可通过组织培养途径大幅提升铁皮石斛芽体再生效率基础之上，进一步开发了石斛幼苗在体转化技术。以9月龄铁皮石斛组培幼苗为受体材料，首先去除幼苗顶端和所有可见芽体，然后将携带TaGRF4-GIF1等5个质粒及对照空载体的农杆菌(EHA105和GV3101)多点注射切口、茎节、节间等部位。将5株注射后的植株合并为一丛，植回树皮育苗杯中，塑料薄膜覆盖2天保湿，然后置于16小时光照/8小时黑暗条件下25℃正常培养(图5A)。在接种转化4周后，GRF4-GIF1嵌合子不同程度提升了芽体再生效率。具体而言，TaGRF4-GIF1提升了1.5倍，mTaGR F4-GIF1提升了2.3倍，DcGRF4-GIF1提升了1.5倍，mDcGRF4-GIF1提升了2.9倍，MIM396提升了2.6倍(图5B)。此外，GRF4-GIF1转化植物出芽更早，第二周即已开始出芽，空载体对照则在第四周才开始出芽。本实施例还发现铁皮石斛在体转化用菌EHA105优于GV3101，与组织培养途径刚好相反。具体表现为，转化4周后，EHA105携带的TaGRF4-GIF1等5个质粒实现了出芽率的有效提升，TaGRF4-GIF1为75％，mTaGRF4-GI F1为116.7％，DcGRF4-GIF1为76.5％，mDcGRF4-GIF1为142.5％，MIM396为128.6％；而GV3101携带的5个质粒对应的芽体再生效率则相对较低，分别为15.4％、15.0％、40.0％、43.8％和12.5％(图5B)。
图5为GRF4-GIF1嵌合子增强铁皮石斛在体遗传转化及植株再生。图5A为铁皮石斛在体遗传转化体系示意图。以组织培养来源的9月龄铁皮石斛幼苗为转化材料，去除顶端及可见芽体，在切口、茎节及节间部位注射含TaGRF4-GIF1等表达质粒及空载体的农杆菌菌液。将5株幼苗合并回植入树皮育苗杯中，盖上塑料薄膜保湿两天后于光照培养架上正常培养。图5B为EHA105-GRF4-GIF1对铁皮石斛在体转化结果。图5C为GV3101-GRF4-GIF1对铁皮石斛在体转化结果。铁皮石斛茎段总出芽率＝出芽总数/接种茎段数×100％。
由于本实施例所重构的5个质粒及空载体上均具有潮霉素抗性基因hptII，因此选取该基因进行PCR扩增分析基因转化效率。选取单个再生芽体作为独立样本，分别提取基因组DNA，PCR扩增hptII基因。总体而言，所检测的62个GRF4-GIF1再生芽体中，有9个芽体为hptII阳性转化子，转化效率高达14.5％(表2)。具体地，mDcGRF4-GIF1的转化效率最高(22.22％)，TaGRF4-GIF1(20％)次之，而空载体对照转化子再生的芽体中则未检测到hptII基因整合(表2)。这些结果表明，本实施例开发的基于GRF4-GIF1的铁皮石斛幼嫩植株在体转化方法有效提升了芽体再生效率和遗传转化效率，简化了操作步骤，缩短了芽体再生时间，是一种简单实用的全新方法，在生产实践中推广应用前景较好。
表2铁皮石斛在体遗传转化效率
构建 测试植株数量(个) hptII阳性植株数量(个) hptII阳性率(％)
TaGRF4-GIF1 10 2 20.00
mTaGRF4-GIF1 22 2 9.09
DcGRF4-GIF1 10 0 0.00
mDcGRF4-GIF1 18 4 22.22
MIM396 12 1 8.33
EV 17 0 0.00
注：hptII阳性率(％)＝hptII阳性植株数/测试植株总数×100％。
再生的芽体不一定都是转基因阳性(hptII阳性)，因此再生效率提高与转化效率低是独立事件，并不矛盾。表2的数据提供了另外一个证据，即GRF除了提高芽体再生效率外，对基因遗传转化效率也大幅提升。
以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。

Claims (14)

1.多核苷酸在促进兰科植物芽体生长中的应用，所述多核苷酸包含调控因子miR396的作用靶点，所述兰科植物为铁皮石斛，所述多核苷酸的序列为SEQ ID NO:1~5所示序列中的至少一种。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述调控因子miR396的作用靶点包含SEQ IDNO:22~28所示核苷酸序列中的至少一种。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，将含有所述多核苷酸的构建体转化至表达系统中，使用所述表达系统促进兰科植物芽体生长，通过组织培养获得芽体再生的外植体。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，将兰科植物外植体浸入所述表达系统中，促进兰科植物芽体生长。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，将所述表达系统在体转化至兰科植物外植体中，促进兰科植物芽体生长。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述表达系统包括微生物。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述微生物包括细菌。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述细菌包括农杆菌。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述农杆菌包括农杆菌GV3101、农杆菌EHA105。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，通过组织培养获得芽体再生的外植体时，所述表达系统为农杆菌GV3101。
11.如权利要求9所述的应用，其特征在于，通过在体转化获得芽体再生的外植体时，所述表达系统为农杆菌EHA105。
12.一种多核苷酸，所述多核苷酸包含调控因子miR396的作用靶点，所述多核苷酸用于促进兰科植物的芽体生长；
所述调控因子miR396的作用靶点包含SEQ ID NO:22~24、26和28所示核苷酸序列中的至少一种；
所述多核苷酸的序列为SEQ ID NO:1、3和5所示序列中的至少一种。
13.一种构建体，其特征在于，包含如权利要求12所述的多核苷酸。
14.一种表达系统，其特征在于，所述表达系统含有如权利要求13所述的构建体或基因组中整合有外源的如权利要求12所述的多核苷酸。
CN202310129000.0A 2023-02-07 2023-02-07 多核苷酸在促进兰科植物芽体生长中的应用 Active CN116286863B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310129000.0A CN116286863B (zh) 2023-02-07 2023-02-07 多核苷酸在促进兰科植物芽体生长中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310129000.0A CN116286863B (zh) 2023-02-07 2023-02-07 多核苷酸在促进兰科植物芽体生长中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN116286863A CN116286863A (zh) 2023-06-23
CN116286863B true CN116286863B (zh) 2023-11-28

Family

ID=86789809

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310129000.0A Active CN116286863B (zh) 2023-02-07 2023-02-07 多核苷酸在促进兰科植物芽体生长中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116286863B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106676106A (zh) * 2015-11-05 2017-05-17 中国科学院上海生命科学研究院 调控植物的种子粒形、抗虫性和耐盐性的miRNA及其应用
CN113943744A (zh) * 2021-11-02 2022-01-18 云南农业大学 叶斑艺兰花rca基因的应用及其载体构建方法
CN114667292A (zh) * 2019-07-11 2022-06-24 加利福尼亚大学董事会 用生长调节因子(grf)、grf相互作用因子(gif)或嵌合grf-gif改进植物再生的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106676106A (zh) * 2015-11-05 2017-05-17 中国科学院上海生命科学研究院 调控植物的种子粒形、抗虫性和耐盐性的miRNA及其应用
CN114667292A (zh) * 2019-07-11 2022-06-24 加利福尼亚大学董事会 用生长调节因子(grf)、grf相互作用因子(gif)或嵌合grf-gif改进植物再生的方法
CN113943744A (zh) * 2021-11-02 2022-01-18 云南农业大学 叶斑艺兰花rca基因的应用及其载体构建方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Molecular Manipulation of the MiR396/GRF Expression Module Alters the Salt Stress Response of Arabidopsis thaliana;Pegler JL等;《Agronomy》;第11卷(第9期);1751 *
Organ-Specific Gene Expression Reveals the Role of the Cymbidium ensifolium-miR396/Growth-Regulating Factors Module in Flower Development of the Orchid Plant Cymbidium ensifolium;Yang F等;《Front Plant Sci》(第12期);799778 *
植物MicroRNA的研究进展;李瑞雪;赵卫国;章玉萍;汪和臣;汪泰初;;蚕业科学(第02期);123-134 *
药用植物miRNA与次生代谢;卢宝伟;安凤霞;杨永建;葛跃;;植物生理学报(第05期);50-66 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN116286863A (zh) 2023-06-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6990653B2 (ja) 迅速な植物形質転換のための方法および組成物
JP5329412B2 (ja) 選択を含まない植物形質転換
Crane et al. Transgenic Medicago truncatula plants obtained from Agrobacterium tumefaciens-transformed roots and Agrobacterium rhizogenes-transformed hairy roots
JP4932719B2 (ja) 非病害性アグロバクテリウム株、Ｒｉプラスミド、およびそれらに基づく形質転換方法
JP6530887B2 (ja) 植物形質転換率を高めるように改変されたアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株
US20140363561A1 (en) Tal-mediated transfer dna insertion
US20080229447A1 (en) Transformation of immature soybean seeds through organogenesis
WO2020221029A1 (zh) 玉米类受体激酶基因ZmRLK7及其应用
Cui et al. A rapid Agrobacterium-mediated transformation of Antirrhinum majus L. by using direct shoot regeneration from hypocotyl explants
CN115851823B (zh) 一种春兰CgARF18基因及其应用
Conner et al. Transformation and regeneration of Petunia
CN116286863B (zh) 多核苷酸在促进兰科植物芽体生长中的应用
JP5804420B2 (ja) 植物の生育促進およびバイオマス量の増加に関与する遺伝子ならびにその利用方法
CN107475174B (zh) 转化油菜的方法
CN110951771A (zh) 春兰miR390a在控制植物根系发育中的应用
Xu et al. High-efficiency agrobacterium-mediated transformation of chrysanthemum via vacuum infiltration of internode
CN112143737B (zh) OsbZIP62-VP64融合表达改良水稻农艺性状的应用
CN116515853B (zh) 一种黑麦草耐盐基因LpNAC022及其应用
CN114958866B (zh) 调控大豆分枝数的基因及其用途
CN112553224B (zh) 组蛋白去乙酰化酶基因OsHDT701在延长植物种子寿命中的应用
CN109486815B (zh) 一种人工嵌合启动子及其构建方法
Arokiaraj Genetic transformation of Hevea brasiliensis (rubber tree) and its applications towards crop improvement and production of recombinant proteins of commercial value
KR100363122B1 (ko) 유전자 조작을 통한 마늘 식물체의 형질전환 방법 및 형질전환 마늘
CN117448342A (zh) SlPUT3基因在抑制番茄侧枝萌发中的应用
CN117603326A (zh) 毛果杨生长素内运因子PtrAUX6及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant