CN103403021A

CN103403021A - 转基因植物

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Publication number: CN103403021A
Application number: CN2011800560262A
Authority: CN
Inventors: S.达文波特; P.勒莱; J.P.桑切斯塔姆布里诺
Original assignee: British American Tobacco Co Ltd
Current assignee: British American Tobacco Investments Ltd
Priority date: 2010-09-22
Filing date: 2011-09-06
Publication date: 2013-11-20
Also published as: US20130206155A1; US9322029B2; AP2013006825A0; BR112013006306A2; JP2013543377A; AR083085A1; EP2619220A1; WO2012038717A1; CA2812380A1; JP5905011B2

Abstract

本发明涉及基因构建体，其可以用于制备转基因植物。该构建体可以具有降低植物中、特别是植物叶中硝酸盐浓度，和用于诱导衰老样表型的能力。本发明扩展至用这种构建体转化的植物细胞，和转基因植物本身。本发明还涉及产生转基因植物的方法，和降低植物中硝酸盐含量的方法。本发明还涉及已经用该基因构建体转化的收获的植物叶，例如烟草叶，和包含这种收获的植物叶的各种烟草制品，如吸烟制品。

Description

转基因植物

本发明涉及可以用于制备转基因植物的基因构建体。构建体可以具有降低植物特别是植物的叶子中硝酸盐浓度和用于诱导衰老样表型的能力。本发明扩展至用这种构建体转化的植物细胞和转基因植物本身。本发明还涉及产生转基因植物的方法和在植物中降低硝酸盐含量的方法。本发明还涉及已用基因构建体转化的收获的植物叶(例如烟草叶)和包含这种收获的植物叶的各种烟草制品(比如吸烟制品)。

氮同化对于植物生长具有根本重要性。在植物所需的所有矿物质营养物中，氮是最大丰度需要的。在田间植物摄取的氮的主要形式是硝酸盐和氨，其是氮肥的主要组分。根据可用性，植物从土壤中摄取硝酸盐或铵离子。硝酸盐在充足氧化的非酸性土壤中更丰富，而铵在酸性或积水土壤中占优势。对烟草生长参数的实验清楚地表明，相对生长速率、叶绿素含量、叶面积和根面积响应于渐增的硝酸盐供应而急剧增加。

根通过特定硝酸盐转运蛋白(NTR)的作用摄取硝酸盐和氨。在植物中，存在对于硝酸盐具有不同的亲和力的不同的转运系统。然后硝酸盐在根部中通过细胞质酶硝酸还原酶(NR)而还原且进入氮同化通路，或者它被转运至木质部的枝条(shoots)。硝酸盐从根部的表皮和皮层细胞转运且进入脉管系统而被转运至枝条。它经由质外体进入叶子且被穿过质膜转运至叶肉细胞。在这里，它被储存在液泡中，或在细胞质中被还原，且进入主要氮同化通路。当硝酸盐过量存在时，它被储存在液泡中。这既充当渗压剂(即补充渗透压)，又充当在硝酸盐摄取最少时待使用的矿物质氮来源。存在于细胞质中的硝酸盐是主要氮同化的起点。

硝酸盐在细胞质中被细胞质酶硝酸还原酶(NR)还原为亚硝酸盐，其本身在叶子的叶绿体或非光合器官的质体中被亚硝酸盐还原酶(NIR)迅速还原。在叶绿体中，然后铵进入谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合酶循环(GS/GOGAT)，在那里它被并入氨基酸合并物中。

硝酸盐转运蛋白、和硝酸盐和亚硝酸盐还原酶的活性调节在整个植物中控制主要氮同化中是关键的，且对于植物的生长和发育具有显著影响。然而，在某些条件下，硝酸盐可能积聚，主要是在绿色光合活跃组织中积聚，在那里它被储存在叶肉细胞的液泡中。当具有较少同化储存的硝酸盐的光合能力时，或作为土壤中高硝酸盐水平的结果，高水平的硝酸盐聚集可以发生在低温和/或太阳辐射(例如，在冬季期间的温室作物中)期间。硝酸盐水平的增加可以具有许多有害后果，不仅在植物生长的方面，而且在消耗植物的人或动物健康以及环境后果的方面。硝酸盐聚集的许多不利后果通过产生亚硝酸盐所介导。

因此，为了防止硝酸盐聚集，一个策略将是增加植物中的氮再动员(nitrogen remobilisation)，例如当它们变得衰老时，这可能在作物生产中具有重要应用。首先，从叶中再动员起来的氮可转运到较幼嫩的叶以及发育中的种子中。因此，氮从衰老叶中离去的效率的提高可潜在地增加植物种子和较幼嫩部分的氮供应，从而提高作物产量和氮利用效率。在世界人口增加但作物产量的增加不足以满足需要时，这显然是有价值的目标。一种潜在的目标作物是欧洲油菜(Brassica napus) (油菜)，其由于营养组织的氮素再动员差而造成氮效率低下。另一种目标作物是小麦，因为增加籽粒蛋白含量的潜在益处较大。籽粒蛋白含量不仅影响小麦的营养价值，而且还决定籽粒使用率，并由此决定市场价值。例如，籽粒蛋白含量增加引起面包体积增加。

同样，在烟草工业中提高氮素再动员的能力可能十分有用，因为如图1所示，已知烟草叶中残留的氮有助于形成亚硝胺类。具体而言，硝酸盐和亚硝酸盐在烤叶中充当烟草特异性亚硝胺(TSNA)形成的前体。此外，亚硝胺在胃中的形成是由于内源性亚硝化作用。口腔细菌将食物和饮料中消耗的硝酸盐化学还原为亚硝酸盐，所述亚硝酸盐在胃的酸性环境中可以形成亚硝基化剂。这些与胺反应产生亚硝胺，且引起DNA链断裂或DNA的交联。与过量的硝酸盐有关的另一个问题是正铁血红蛋白的形成，其产生蓝婴综合症(blue baby syndrome)，其中血红蛋白的携氧能力被亚硝酸盐所封闭，在婴儿中引起化学窒息。

作为这些健康问题的后果，根据收获的时间，许多监管机构对于绿叶蔬菜如菠菜和生菜中允许的硝酸盐的量设置了限制(例如，欧洲委员会法规653/2003)。这些限制已经导致任何高硝酸盐含量的农产品滞销。因此，已经通过管理含氮化肥的或改进的种植业系统的应用而进行降低植物的硝酸盐含量的努力。一些机构也已经对于饮用水中硝酸盐的量设置了限制。

因此，存在对于用于缓解植物中与硝酸盐聚集有关的不利影响的方式的需要。考虑到这一点，本发明人已经开发了一系列基因构建体，其可用于转基因植物的制备中，所述转基因植物表现出令人惊讶的降低的硝酸盐浓度。

因此，根据本发明的第一个方面，提供了基因构建体，其包含与编码具有硝酸盐转运蛋白活性的多肽的编码序列可操作连接的启动子，条件是该启动子不是花椰菜花叶病毒35S启动子。

如实施例中所述，本发明人已经研究了植物中氮的再动员，目的在于开发表现出(特别在叶中)硝酸盐浓度减少的植物。发明人制备了许多基因构建体，其中将编码硝酸盐转运蛋白的基因置于启动子的控制下，所述启动子不是CAMV 35S启动子，如组成型启动子或组织特异性启动子。然后用这些构建体的实施方案转化各种不同烟草物种，且本发明人在温室中生长的硝酸盐转运蛋白过表达系中观察到，当植物发育且开始花起始时，可能当叶从水槽转换至源组织时，主茎产生接近于开花时间产生的褐色/黑色。本发明人先前已经在产生过量尿素的植物中观察到了这种表型。此外，他们还看到，植物上的下部叶也开始产生褪绿斑点(即由于叶绿素不足导致的苍白斑块)，其随后显示具有低得多的硝酸盐含量。

因此，本发明人测量了在转基因植物中烟草特异性亚硝胺类(TSNAs)的浓度，即如图10-20中所示的4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N-亚硝基降烟碱(NNN)和N-亚硝基新烟草碱(NAT)，且惊讶地观察到，经由基因构建体的硝酸盐转运蛋白的过表达导致植物叶中硝酸盐浓度的相当大的减少，且因此TSNA含量的相当大的减少。硝酸盐转运蛋白的先前研究已经表明，它们引起从根部硝酸盐摄取的增加，然后其被转运至植物液泡，其储存在此处。然而，作为他们的实验的结果，本发明人已经令人惊讶地发现，本发明的编码硝酸盐转运蛋白的构建体可以引起内部硝酸盐从液泡的释放，导致远离叶片而非如前所想的朝向叶片的氮再动员的速率增加。本发明人假设氮可以以硝酸盐的形式从叶片中迁移至植物的更幼嫩部分，如植物种子和嫩枝。

启动子能够诱导RNA聚合酶与编码具有硝酸盐转运蛋白活性的多肽的编码序列的结合且开始使其转录。本发明的构建体中的启动子可以是组成型的，非组成型的，组织特异性的，发育调节型或诱导型/阻遏型的启动子。

组成型启动子在植物发育期间连续地引导基因在整个植物的各个部分的表达，尽管基因在所有细胞类型中无法以相同的水平表达。已知组成型启动子的实例包括与水稻肌动蛋白1基因(Zhang等人, 1991, Plant Cell, 3, 1155-65)和玉米泛素1基因(Cornejo等人1993, Plant Molec.Biol., 23, 567-581)相关的那些。在本发明中特别优选组成型启动子，如香石竹蚀环病毒(Carnation Etched Ring Virus, CERV)启动子(Hull等人, 1986, EMBO J., 5, 3083-309)。

组织特异性启动子是引导基因在植物的一个(或几个)部分表达，通常在那些植物部分的整个生命期间的表达的启动子。组织特异性启动子的类别通常还包括其特异性不是绝对的启动子，即，它们也可以在除优选的组织以外的组织中以较低水平的表达。本领域已知的组织特异性启动子的实例包括与马铃薯块茎中表达的马铃薯糖蛋白基因和小麦、大麦或玉米胚乳中表达的高分子量麦谷蛋白基因相关的启动子。

发育调节的启动子引导在植物发育期间的特定的时间，例如在衰老期间，植物的一个或多个部分中基因表达的变化。该基因在其他时间在该植物部分中可以以不同(通常较低)水平表达，且也可以在其他植物部分中表达。

诱导型启动子能够响应于诱导剂而引导基因表达。在诱导剂不存在的情况下，基因将不表达。诱导剂可以对启动子序列直接作用，或者可以通过抵消阻遏分子的效果而起作用。诱导物可以是化学试剂，如代谢物、蛋白、生长调节剂、或毒性元素、生理应激如热、损伤、或渗透压、或病原体或害虫作用的间接后果。发育调节的启动子可以描述为对植物产生的内源性诱导物或对植物的生命周期中的特定点的环境刺激响应的特定类型的诱导型启动子。已知的诱导型启动子的实例包括损伤响应、温度响应、和化学诱导相关的启动子。

启动子可以从不同来源包括动物、植物、真菌、细菌和病毒而获得，且不同启动子可以在不同组织中以不同效率起作用。也可以合成地构建启动子。因此，合适的启动子的实例包括香石竹蚀环病毒(CERV)启动子、豌豆质体蓝素启动子、核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶(rubisco)启动子、胭脂氨酸合成酶启动子、叶绿素a/b结合启动子、高分子量麦谷蛋白启动子、α,β-麦醇溶蛋白启动子、大麦醇溶蛋白启动子、马铃薯糖蛋白启动子、或衰老特异性启动子。例如，合适的衰老特异性启动子可以是源自衰老相关基因(SAG)的启动子，且可以选自SAG12、SAG13、SAG101、SAG21 和SAG18。

优选地，启动子可以是CERV启动子或豌豆质体蓝素启动子。

因此，根据本发明的第二个方面，提供了基因构建体，其包含与编码具有硝酸盐转运蛋白活性的多肽的编码序列可操作连接的香石竹蚀环病毒(CERV)启动子或豌豆质体蓝素启动子。

在一个实施方案中，启动子可以是本领域技术人员已知的香石竹蚀环病毒(CERV)启动子，或其功能变体或片段(Hull等人, EMBO J., 5, 3083-3090)。编码CERV启动子的DNA序列长度为232bp，且在本文中被称为如下SEQ ID No.1：

因此，本发明构建体中的启动子可包含基本上如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列或者其功能变体或功能片段。CERV启动子可以从花椰菜花叶病毒或显示花椰菜花叶病毒迹象的植物物种如香石竹(Dianthus caryophyllus)(即康乃馨)获得。在启动子是CERV启动子的实施方案中，应理解的是，启动子可包含SEQ ID No:1的碱基1-232中的每一个。然而，启动子的功能变体或功能片段也可用于本发明的基因构建体。

“启动子的功能变体或功能片段”可以是启动子的衍生物或部分，其在功能上足以起始与之可操作连接的任何编码区的表达。例如，在启动子是以CERV启动子为基础的实施方案中，技术人员应了解的是可对SEQ ID No:1进行修饰，或者可能只需要CERV启动子的部分，使得其仍可以起始构建体中的基因表达。

可通过评价转录酶是否与推定的启动子区结合，然后引起编码区转录成具有硝酸盐转运蛋白活性的多肽，来容易地鉴定启动子的功能变体和功能片段。或者，可通过在与编码区结合时对启动子进行诱变，并评价基因表达是否发生，来检测这类功能变体和片段。

在另一个实施方案中，启动子可以是技术人员也已知的豌豆质体蓝素启动子，或其功能变体或片段 (Helliwell和Gray, 1995, Plant Mol. Biol. 29(3):621-626). 编码豌豆质体蓝素启动子的DNA序列长度为783bp，且在本文中被称为如下SEQ ID No.2：

因此，本发明的构建体中的启动子可以包含基本上如SEQ ID No.2所述的核苷酸序列，或其功能变体或功能片段。豌豆质体蓝素启动子可以从豌豆属(Pisum spp.)，如豌豆(Pisum sativum)(即豌豆)获得。

第一个或第二个方面的构建体中具有硝酸盐转运蛋白活性的多肽可以源自任何合适的来源，如植物。编码具有硝酸盐转运蛋白活性的多肽的编码序列可以源自合适的植物来源，例如源自拟南芥属(Arabidopsis spp.)、稻属(Oryza spp.)、杨属(Populus spp.)或烟草属(Nicotiana spp.)。编码序列可以源自拟南芥(Arabidopsis thaliana)、稻(Oryza sativa)、欧洲山杨(Populus tremula)或烟草(Nicotiana tabacum)。

构建体中的编码序列可以编码拟南芥硝酸盐转运蛋白，AtNRT 2.7 (如描述于Orsel等人, Plant Physiology, 2002, 129, 886-896)。AtNRT 2.7基因组DNA含有位于外显子1(298nt长)和外显子2(1184nt长)之间的一个内含子(78个核苷酸)。本文如下提供编码拟南芥硝酸盐转运蛋白的一个实施方案的基因组DNA序列(包括内含子和外显子)作为SEQ ID No:3：

本文如下提供编码拟南芥硝酸盐转运蛋白的cDNA序列(仅外显子)作为SEQ ID No:4提供：

因此，编码具有硝酸盐转运蛋白活性的多肽的编码序列可包含基本上如SEQ ID No:3或SEQ ID No.4所示的核酸序列或者其功能变体或片段。本发明人相信，内含子可以增加构建体在体内的稳定性。因此，构建体可以不包含SEQ ID No:4，即编码拟南芥硝酸盐转运蛋白的cDNA序列。

本文如下提供拟南芥硝酸盐转运蛋白的多肽序列作为SEQ ID No:5：

相应地，具有硝酸盐转运蛋白活性的多肽可以包含基本上如SEQ ID No:5所述的氨基酸序列，或其功能变体或片段。

本发明人已经生成了其中CERV启动子或豌豆质体蓝素启动子已经用于驱动来自拟南芥表达硝酸盐转运蛋白(NRT2.7)的构建体。已经表明该蛋白参与硝酸盐转运到液泡中，且所以以前被认为可能参与硝酸盐隔绝。然而，证据不是结论性的。当拟南芥ATNRT2.7基因过表达时，其在转化的植物中显示出强烈的表型，特别是在开花发生期间。本发明人已经发现使用本发明的构建体过表达ATNRT2.7可以大大降低叶硝酸盐含量，且因此可以有利地降低用本发明的构建体转化的植物中的TSNA浓度。

在本发明的构建体转化的植物中，与野生型植物中的硝酸盐浓度(即还没有用本发明的构建体转化的植物) 相比，构建体能够使硝酸盐浓度减少至少5%、10%、15%、18%、20%、32%、35%、38%、40%、50%、60% 或63% (如在图2、6和8中所示)。

在构建体转化的植物中，与野生型植物中的NNK浓度相比，构建体能够使4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)浓度减少至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、61%、62%、65%、69%、71% 或75% (如在图10-15中所示)。

在构建体转化的植物中，与野生型植物中的NNN浓度相比，构建体能够使N-亚硝基降烟碱(NNN)浓度减少至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、71%、75%、78%、80%、82%、84%、85%、88%、90% 或94%(如在图10-15中所示)。

在构建体转化的植物中，与野生型植物中的NAT浓度相比，构建体能够使N-亚硝基新烟草碱(NAT)浓度减少至少5%、6%、10%、20%、23%、24%、30%、40%、46%、45%、48%、50%、60%、70%、80% 或85%(如在图10-15中所示)。

在构建体转化的植物中，与野生型植物中的总TSNA浓度相比，构建体能够使总烟草特异性亚硝胺类(TSNA)的浓度减少至少10%、20%、30%、40%、50%、56%、60%、64%、65%、70% 或75% (如在图18-20中所示)。

优选地，在来自T0、T1和/或T2植物群体的植物的叶或茎中，构建体能够减少选自包括硝酸盐、NNK、NNN、NAT和总TSNA的化合物的任何化合物的浓度。在位于植物上的下部、中部或上部位置的叶中，构建体能够减少任何这些化合物的浓度。“下部位置”可以意味着植物的下部的三分之一，“上部位置”意味着植物的上部的三分之一，“中部位置”意味着植物的下部和上部位置之间的中间三分之一。

如图24中所示，在具有PPC-AtNrt2.7构建体的植物的中部叶中NNK的浓度低于检测水平。相应地，在位于植物上的中部位置的叶中，构建体能够减少NNK的浓度。

本发明的基因构建体可呈表达盒的形式，其可以适合用于在宿主细胞中表达编码硝酸盐转运蛋白的编码序列。本发明的基因构建体无需整合到载体中便可导入宿主细胞。例如，可将可以是核酸分子的基因构建体并入脂质体或病毒颗粒内。或者，可通过合适的方法(例如直接胞吞摄取)将纯化的核酸分子(例如不含组蛋白的DNA或裸DNA)直接插入宿主细胞中。可通过转染、感染、显微注射、细胞融合、原生质体融合或弹道轰击(ballistic bombardment)，将基因构建体直接导入宿主受试者(例如植物)的细胞。或者，可使用粒子枪将本发明的基因构建体直接导入宿主细胞中。或者，可将基因构建体包含在用于在合适的宿主细胞中表达的重组载体内。

因此，在第三个方面，提供包含第一个方面或第二个方面的基因构建体的重组载体。

重组载体可以是质粒、粘粒或噬菌体。这类重组载体高度可用于用本发明的基因构建体转化宿主细胞和复制其中的表达盒。技术人员应了解的是，本发明的基因构建体可与的许多类型的骨架载体组合用于表达目的。骨架载体可以是二元载体(binary vector)，例如可在大肠杆菌(E. coli)和根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)两者中复制的载体。例如，合适的载体可以是pBIN质粒，例如pBIN19 (Bevan M., 1984, Nucleic Acids Research 12:8711-21)。

除启动子(例如CERV 或豌豆质体蓝素启动子)以外，重组载体还可包括多种其它功能元件和编码硝酸盐转运蛋白的编码序列。例如，可设计重组载体，使得载体在宿主细胞的细胞溶胶中自主复制。在这种情况下，在重组载体中可能需要诱导或调节DNA复制的元件。或者，可设计重组载体，使得重组载体整合到宿主细胞的基因组中。在这种情况下，设想有利于靶向整合(例如通过同源重组)的DNA序列。

重组载体还可包含编码在克隆方法中可用作选择标记的基因的DNA，即能够选出已被转染或转化的细胞，并且能够选出包含整合异源DNA的载体的细胞。载体还可包含参与调节编码序列的表达或者用于将表达的多肽靶向宿主细胞特定部分(例如叶绿体)的DNA。因此，第三个方面的载体可包含至少一个选自以下的其它元件：选择标记基因(例如抗生素抗性基因)；多肽终止信号；和蛋白质靶向序列(例如叶绿体转运肽)。

合适的标记基因的实例包括抗生素抗性基因，例如赋予卡那霉素、遗传霉素(G418)和潮霉素(npt-II、hyg-B)抗性的基因；除草剂抗性基因，例如赋予草丁膦和磺胺类除草剂抗性的基因(分别为bar和suI；EP-A-242246、EP-A-0249637)；以及筛选标记，例如β-葡糖醛酸糖苷酶(GB2197653)、萤光素酶和绿色荧光蛋白(GFP)。标记基因可受第二启动子控制，所述第二启动子允许在细胞(其可在种子中或不在种子中)中表达，从而允许在植物发育的任何阶段选出含有标记的细胞或组织。合适的第二启动子是土壤杆菌属(Agrobacterium)的胭脂氨酸合成酶基因的启动子和来源于编码35S花椰菜花叶病毒(CaMV)转录物的基因的启动子。然而，可以采用任何其它合适的第二启动子。

可采用实例中描述的克隆方法，制备本发明的基因构建体的各个实施方案，可将该方法概括如下。可使用合适的引物，例如SEQ ID No’s 6 和 7，通过PCR从基因组或cDNA模板扩增编码硝酸盐转运蛋白的基因的基因组形式或cDNA形式。然后可采用琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物。然后，可将PCR产物与合适的载体连接用于克隆目的，例如pCR4 Blunt-TOPO载体(Invitrogen)。可使包含PCR产物的载体在合适的宿主(例如大肠杆菌)中生长。然后使用合适的引物通过PCR筛选大肠杆菌菌落，并用合适的引物对具有正确的限制性内切酶消化谱的质粒中的插入片段进行测序。

可培养携带TOPO-cDNA (AtNRT2.7)或TOPO-基因组DNA (AtNRT2.7)的大肠杆菌菌落以产生适量的各种质粒，然后可对质粒进行纯化。随后可消化质粒释放编码AtNRT2.7的DNA片段，然后可将该片段克隆至包含合适启动子(例如CERV 或豌豆质体蓝素(PPC)启动子)的载体，例如pBNP质粒(van Engelen 等人, 1995, Transgenic Research,4:288-290)。

获得的AtNRT2.7构建体命名为BNP-036AtNRT2.7001(含有豌豆质体蓝素启动子)和CRVAtNRT2.7 (含有CERV启动子)。第三个方面的载体的实施方案基本上可如图5a和5b所示。

鉴于他们的令人惊讶的结果，发明人相信，他们已经首次开发了使用转基因植物中表达外源硝酸盐转运蛋白基因而减少植物叶中硝酸盐浓度的方法。

因此，在第四个方面，提供了使试验植物的叶中硝酸盐浓度减少至低于在相同条件下培养的野生型植物叶中对应的硝酸盐浓度的方法，该方法包括改变试验植物中植物代谢以实现植物叶中硝酸盐转运蛋白水平增加。

在本发明的第五个方面，提供了产生以比在相同条件下培养的对应野生型植物更高的速率将硝酸盐转运出叶的转基因植物的方法，该方法包括以下步骤：

(i) 用第一个或第二个方面的基因构建体或第三个方面的载体转化植物细胞；和

(ii) 从转化的细胞再生植物。

在第六个方面中，提供了用于产生转基因植物的方法，该方法包括将编码硝酸盐转运蛋白的外源基因引入未修饰的植物，其中相对于未修饰的植物的叶中硝酸盐的浓度，外源基因编码的硝酸盐转运蛋白的表达降低了转基因植物的叶中的硝酸盐浓度。

第七个方面，提供了包含第一个或第二个方面的基因构建体或者第三个方面的载体的转基因植物。

在第八个方面，提供了包含编码硝酸盐转运蛋白的外源基因的转基因植物，其中与未修饰的植物叶中的硝酸盐浓度相比，转基因植物叶中的硝酸盐浓度降低。

在第九个方面，提供了编码硝酸盐转运蛋白的外源核酸序列用于通过用外源核酸序列转化植物而降低植物叶中的硝酸盐浓度的用途。

如实施例6中所述，本发明人观察到，在用本发明的构建体转化以及表现出降低的硝酸盐浓度的过表达硝酸盐转运蛋白的系中，该植物还发展褪绿斑点。这些斑点似乎远超过单纯的“变黄”，这将是仅仅通过减少硝酸盐浓度而引起的，且事实上非常类似于叶衰老。因此，本发明人已经表明，在烟草中(使用组成型启动子)AtNRT2.7的转基因表达能够在烟草叶中诱导衰老表型。令人惊讶的是，衰老诱导对于硝酸盐(即10mM NO₃)是特异性的，且没有在铵(10mM NH₄)或更低浓度观察到。因此，这些结果表明，AtNRT2.7不仅能够降低叶中的硝酸盐含量，而且可以触发或加速衰老样表型。尽管不希望被假说所束缚，但是发明人相信，作为降低硝酸盐浓度的后果，液泡可以在衰老的发生(例如，在烟草中)发挥关键作用。因此，本发明人相信，本发明的构建体可以用来过早地诱导植物衰老，或衰老样表型。显然，在某些植物物种如烟草中，诱导或加速衰老是有利的，例如，用于改善抽烟用烟草叶的风味。

因此，在第十个方面，提供了编码硝酸盐转运蛋白的外源核酸序列用于通过用外源核酸序列转化植物而诱导试验植物中的衰老或衰老样表型的用途。

叶衰老是植物发育的一个阶段，期间，细胞在细胞死亡前经历独特的代谢和结构变化。生理学和遗传学研究表明衰老是被高度调节的过程。叶经过衰老的进程因由叶绿体解体所造成的叶绿素丧失并随之变黄而十分明显。例如，可通过溶剂提取和分光光度测定或通过叶绿素含量测定仪，测量这个发育阶段特有的下降的叶叶绿素水平。与对相同植物(优选生长在恒定条件下)所记录的较早的叶叶绿素水平相比，叶叶绿素水平下降表明衰老或衰老样表型。

分子研究表明，衰老与基因表达的改变有关。编码参与光合作用的蛋白质的mRNA水平在衰老期间下降，而编码被认为参与衰老的蛋白质的基因的mRNA水平升高。衰老是极有组织的过程，受称为衰老相关基因(SAG)的基因调节。叶衰老涉及蛋白质、核酸和膜的降解，以及由这种降解所致的营养物随后转运到植物的其它部位，例如发育中的种子、叶或贮藏器官。因此，可以使用常规技术测量任何这些特征来确定已经过早地诱导了衰老或衰老样表型。

术语“未修饰的植物”可以意味着在本发明的外源基因或构建体转化前的植物。因此未修饰的植物可以是野生型植物。

术语“外源基因”可以意味着被转化至未修饰的植物中的基因来自外部来源，即来自与被转化的物种不同的物种。外源基因可以具有与未修饰植物中编码硝酸盐转运蛋白的内源基因基本上相同或不同的核酸序列。外源基因可以源自任何物种的编码硝酸盐转运蛋白的基因组或cDNA序列如拟南芥NRT2.7基因。外源基因可以形成嵌合基因，其可以本身构成第一个或第二个方面的基因构建体。外源基因可以编码具有基本上如SEQ ID No:5所述的氨基酸序列的硝酸盐转运蛋白，或其功能变体或片段。外源基因可以包含基本上如SEQ ID No:3或4所述的核苷酸序列，或其功能变体或片段。

用于确定植物叶中的硝酸盐水平的方法记载于实施例中。本发明的方法和用途可以包括用第一个或第二个方面的基因构建体、第三个方面的载体或本文所述的外源基因转化试验植物细胞或未修饰的植物细胞。

因此，在第十一个方面，提供了包含第一个或第二个方面的基因构建体或者第三个方面的重组载体的宿主细胞。

细胞可以是植物细胞。细胞可采用已知技术用本发明的基因构建体、载体或外源基因转化。用于将基因构建体导入宿主细胞的合适方法可包括通过本领域已知方法(例如EP-A-0116718和EP-A-0270822所述方法)，利用土壤杆菌属所携带的去臂(disamred)Ti-质粒载体。另一种方法可以是转化植物原生质体，这涉及先除去细胞壁并导入核酸，然后重新形成细胞壁。随后可使转化细胞生长成植物。

优选地且有利地，本发明的方法和用途不妥协生成的试验或转基因植物的健康或适用性。发明人已经观察到，在植物宿主细胞中过表达硝酸盐转运蛋白(例如AtNRT2.7)，在诱导硝酸盐转运离开植物叶且优选地转运出植物细胞的液泡是有效的。因此，优选的是，本发明的方法和用途包括用一种或多种本发明的构建体转化试验植物，使得过表达硝酸盐转运蛋白。

本发明的转基因或试验植物可包括十字花科(Brassicaceae family)，例如芸苔属(Brassica spp.)。植物可以是欧洲油菜(Brassica napus)(油菜(oilseed rape))。转基因或试验植物的其它实例包括禾本科(family Poales)，例如Triticeae spp.。植物可以是小麦属(Triticum spp.) (小麦)。提高小麦的籽粒蛋白含量可导致包含小麦的食品(例如面包)的体积增加。

本发明的合适转基因或试验植物的其它实例包括茄科(Solanaceae)植物，其包括例如曼陀罗(jimson weed)、茄子、曼德拉草(mandrake)、颠茄(deadly nightshade、belladonna)、辣椒(capsicum、paprika、chilli pepper)、马铃薯和烟草。茄科的合适属的一个实例是烟草属(Nicotiana)。烟草属的合适种可称为烟草植物，简称烟草。

可以如下用本发明的构建体、载体和外源基因转化烟草。

采用基本上按Horsch等人(Science 227：1229-1231，1985)所述的叶圆片共培养方法转化烟草(Nicotiana tabacum)。可从7周大的烟草植物采摘最幼嫩的两片扩展叶，可在8% Domestos?中进行表面灭菌10分钟，用无菌蒸馏水洗涤6次。可用6号木塞钻孔器切取叶圆片，并放于含有合适二元载体(按照本发明)的土壤杆菌悬浮液中持续约2分钟。可在两张无菌滤纸间将叶圆片轻轻吸干。可将10个圆片放在LS 3%蔗糖 + 2μM BAP + 0.2μM NAA平板上，然而将其在生长室中培育2天。可将圆片转移到补充了500 g/l凯福隆和100 g/l卡那霉素的LS + 3%蔗糖 + 2μM BAP + 0.2 μM NAA的平板中。2周后，可将叶盘转移到上述培养基的新平板上。再过2周后，可将圆片转移到含有补充了500 mg/l凯福隆和100 mg/l卡那霉素的LS + 3%蔗糖 + 0.5μM BAP的平板上。每两周可将叶圆片转移到新鲜培养基中。在枝出现时，可切下枝，并将枝转移到补充了500 mg/l凯福隆的LS +3%蔗糖的广口瓶中。大约4周后，可将广口瓶中的枝转移到LS + 3%蔗糖 + 250 mg/l凯福隆中。再过3-4周后，可将植物转移到LS + 3%蔗糖(无抗生素)，并生根。一旦植物生根，便将其转移到温室的土壤中。

在第十二个方面，提供获自第七个或第八个方面的转基因植物的植物繁殖产品(plant propagation product)。

“植物繁殖产品”可以是取自植物中的任何植物物质，自其可产生其它植物。合适地，植物繁殖产品可为种子。植物繁殖产品可以优选地包含本发明的构建体或载体或外源基因。

本发明人已经观察到，已经用本发明的构建体转化的试验植物(即转基因植物)的叶表现出硝酸盐再动员出叶的增加，使得在该叶中硝酸盐和因此的TSNA类如NNK 、NNN和/或NAT的浓度减少。很明显，这样的叶将是特别有利的。

因此，在本发明的第十三个方面，提供与采自培养在相同条件下的野生型植物的收获叶中相应的硝酸盐水平相比含有较低硝酸盐水平的收获叶，其中所述叶自第七个或第八个方面的转基因植物收获，或者由第五个或第六个方面的方法产生。

在本发明的第十四个方面，提供包含获自突变体烟草植物的硝酸盐降低的烟草的烟草产品，所述突变体能够降低其叶中的硝酸盐浓度。

优选的是，烟草产品中的烟草从其衍生的突变体烟草植物包含本发明的构建体、载体或外源基因。

烟草产品可以是无烟烟草产品，如鼻烟。烟草产品可以是通过嘴递送的口服烟草产品。烟草产品可以是潮湿的，且可以是湿鼻烟(snus)。然而，烟草产品也可以是吸烟制品。

因此，在第十五个方面，提供了吸烟制品，其包含获自突变体烟草植物的硝酸盐降低的烟草，所述突变体能够降低其叶中的硝酸盐浓度。

硝酸盐降低的烟草可包括其中硝酸盐浓度小于培养在相同条件下的野生型植物中的相应浓度的烟草。这类吸烟制品可包含获自突变体烟草植物的烟草，所述烟草植物可用本发明第一个或第二个方面的基因构建体或者第三个方面的载体或外源基因转化。优选地，突变体烟草植物包含硝酸盐转运蛋白AtNRT2.7。

术语“吸烟制品”可包括可点燃抽吸的产品，例如不论是基于烟草、烟草衍生物、膨胀烟草、再造烟叶还是基于烟草代用品的卷烟、香烟、雪茄和小雪茄，以及加热无燃烧产品。

应理解的是，本发明扩展至基本上包含本文提及的任何序列的氨基酸序列或核酸序列(包括其功能变体或功能片段)的任何核酸或肽或其变体、衍生物或类似物。术语“基本上的氨基酸/多核苷酸/多肽序列”、“功能变体”和“功能片段”，可以是与本文提及的任一个序列的氨基酸/多核苷酸/多肽序列有至少40%序列同一性的序列，例如与SEQ ID No.3规定的基因(其编码硝酸盐转运蛋白的一个实施方案)有40%同一性，或与SEQ ID No.5规定的多肽(即硝酸盐转运蛋白的一个实施方案)有40%同一性。

还设想了与所提及的任何序列具有以下序列同一性的氨基酸/多核苷酸/多肽序列：大于65%、更优选大于70%、甚至更优选大于75%、还更优选大于80%的序列同一性。优选地，氨基酸/多核苷酸/多肽序列与所提及的任何序列有至少85%同一性，更优选与本文提及的任何序列有至少90%同一性、甚至更优选至少92%同一性、甚至更优选至少95%同一性、甚至更优选至少97%同一性、甚至更优选至少98%同一性和最优选至少99%同一性。

技术人员应了解如何计算2个氨基酸/多核苷酸/多肽序列之间的百分比同一性。为了计算2个氨基酸/多核苷酸/多肽序列间的百分比同一性，首先必须准备好2个序列的比对，接着计算序列同一性值。2个序列的百分比同一性可根据以下方面采用不同的值：(i)用于比对序列的方法，例如ClustalW、BLAST、FASTA、Smith-Waterman (在不同的程序中执行)，或来自3D比较的结构比对；和(ii)比对方法所采用的参数，例如局部与整体比对的比较、所采用配对评分矩阵(例如BLOSUM62、PAM250、Gonnet等)和空位罚分，例如功能型和常数。

如果完成了比对，则有许多不同的计算2个序列之间的百分比同一性的方法。例如，可将相同的数目除以：(i)最短序列的长度；(ii)比对的长度；(iii)序列的平均长度；(iv)非空位位置的数目；或(iv)突出端以外的等同位置的数目。此外，应理解的是，百分比同一性还是强烈地长度依赖性的。因此，序列对越短，可预期偶尔发生的序列同一性越高。

因此，应理解的是，蛋白质或DNA序列的准确比对是一个复杂过程。常用的多重比对程序ClustalW (Thompson等人，1994，Nucleic Acids Research, 22，4673-4680；Thompson等人，1997，Nucleic Acids Research, 24，4876-4882)是用于产生本发明蛋白质或DNA的多重比对的优选方法。ClustalW的合适参数可为如下：对于DNA比对：空位开放罚分= 15.0，空位延伸罚分= 6.66，矩阵=同一性。对于蛋白质比对：空位开放罚分= 10.0，空位延伸罚分= 0.2，矩阵= Gonnet。对于DNA和蛋白质比对：ENDGAP = -1，GAPDIST = 4。本领域技术人员应清楚，对于最佳序列比对可能需要改变这些参数和其它参数。

优选地，然后由比对如(N/T)*100计算出2个氨基酸/多核苷酸/多肽序列之间的百分比同一性计算值，其中N为序列具有相同残基的位置的数目，T为所比较的包括空位但不包括突出端的位置总数。因此，用于计算2个序列之间的百分比同一性的最优选的方法包括(i)应用ClustalW程序，采用一组合适参数(例如上述参数)准备序列比对；和(ii)将N值和T值插入下列公式：序列同一性= (N/T)*100。

用于鉴定相似序列的备选方法为本领域技术人员所知。例如，基本相似的核苷酸序列可由与SEQ ID Nos. 1、2或3所示序列或其互补序列在严格条件下杂交的序列编码。所谓严格条件，意指核苷酸在3x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中于约45℃与滤膜结合的DNA或RNA杂交，接着在0.2x SSC/0.1% SDS中于约20-65℃洗涤至少一次。或者，基本相似的多肽可因至少1个但少于5、10、20、50或100个氨基酸而不同于SEQ ID No. 5所示序列。

由于遗传密码的简并性所致，显然，任何核酸序列可在基本上不影响由其编码的蛋白质的序列的情况下被改变或变动，以提供其功能变体。合适的核苷酸变体是以下核苷酸变体，其具有通过编码相同氨基酸的不同密码子在序列内的取代从而产生沉默改变(silent change)而改变的序列。其它合适的变体是具有同源核苷酸序列但包含通过不同密码子的取代而改变的全部或部分序列的变体，所述不同密码子编码与其取代的氨基酸具有类似生物物理学性质的侧链的氨基酸以产生保守改变。例如小的非极性疏水氨基酸，包括甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸。大的非极性疏水氨基酸包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。极性的中性氨基酸包括丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷的(碱性)氨基酸包括赖氨酸、精氨酸和组氨酸。带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。因此应理解的是，何种氨基酸可被具有相似生物物理学性质的氨基酸置换，技术人员已知编码这些氨基酸的核苷酸序列。

本文所述的全部特征(包括任何随附的权利要求、摘要和附图)和/或如此公开的任何方法或过程的全部步骤都可以任何组合与任何上述方面组合，其中这些特征和/或步骤的至少一些是互为排斥的组合除外。

为了更好地理解本发明，并显示可如何实施本发明的实施方案，现参照附图举例说明，其中：

图1显示各种烟草烟雾亚硝胺4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N-亚硝基降烟碱(NNN)、N-亚硝基新烟碱(NAB)和N-亚硝基新烟草碱(NAT)的化学结构；

图2是显示烟草植物和用生成的PPC-Nrt2.7构建体(即，含有在豌豆质体蓝素启动子控制下的硝酸盐转运蛋白2.7基因的构建体)转化的烟草植物的各种T ₀温室群体的绿叶硝酸盐含量的图。每个群体的个体植物的值显示于图3和4中；

图3显示具有叶特异性启动子PPC::NRT2.7构建体的烟草c.v. Burley群体(T₀)的绿叶中硝酸盐浓度(野生型Burley系充当对照)；

图4是显示含有PPC启动子::NRT2.7构建体的烟草c.v. Virginia群体(T₀)的绿叶中硝酸盐浓度的图；

图5a是本发明被称为BNP036AtNRT2.7001的构建体的一个实施方案的质粒图谱。该构建体包括在豌豆质体蓝素(PPC)启动子控制下的AtNRT2.7硝酸盐转运蛋白基因；

图5b是本发明被称为CRVAtNRT2.7的构建体的另一个实施方案的质粒图谱。该构建体包括在CERV启动子控制下的AtNRT2.7硝酸盐转运蛋白基因；

图6显示具有CRV::NRT2.7构建体(即，含有在组成型CRV启动子控制下的硝酸盐转运蛋白2.7基因的构建体)的烟草c.v. Burley群体(T₀)的叶中硝酸盐的平均浓度。野生型Burley系充当对照。每个群体的个体植物的值显示于图7；

图7显示具有组成型启动子CRV::NRT2.7构建体的烟草c.v. Burley群体(T₀)的叶中硝酸盐浓度(野生型Burley系充当对照；

图8显示具有组成型启动子CRV::NRT2.7构建体的烟草c.v. Burley群体(T₁)的叶中硝酸盐浓度(野生型Burley系充当对照)。每个群体的个体植物的值显示于图9；

图9是显示含有组成型CRV启动子::Nrt2.7构建体的烟草c.v. Burley群体(T₁)的绿叶中硝酸盐浓度。野生型植物充当对照；

图10显示含有组成型启动子CERV::AtNrt2.7构建体的烟草c.v. Burley群体(T₂)的上部叶中混合TSNA的浓度。这些群体在低硝酸盐方案上生长。野生型植物充当对照。图注“NAT、NNK、NNN”是指个别亚硝胺水平；

图11显示含有组成型启动子CERV::AtNrt2.7构建体的烟草c.v. Burley群体(T₂)的上部叶中混合TSNA的浓度。这些群体在高硝酸盐方案上生长。野生型植物充当对照；

图12显示含有组成型启动子CERV::AtNrt2.7构建体的烟草c.v. Burley群体(T₂)的中部叶中混合TSNA的浓度。这些群体在低硝酸盐方案上生长。野生型植物充当对照；

图13显示含有组成型启动子CERV::AtNrt2.7构建体的烟草c.v. Burley群体(T₂)的中部叶中混合TSNA的浓度。这些群体在高硝酸盐方案上生长。野生型植物充当对照；

图14显示含有组成型启动子CERV::AtNrt2.7构建体的烟草c.v. Burley群体(T₂)的下部叶中混合TSNA的浓度。这些群体在低硝酸盐方案上生长。野生型植物充当对照；

图15显示含有组成型启动子CERV::AtNrt2.7构建体的烟草c.v. Burley群体(T₂)的下部叶中混合TSNA的浓度。这些群体在高硝酸盐方案上生长。野生型植物充当对照；

图16显示在田间生长的烟草c.v. Burley群体的烤叶中N-亚硝基降烟碱(NNN)的浓度。收获的叶取自植物的三个位置，即，如图注中显示的上部叶、中部叶和下部叶；

图17显示在田间生长的烟草c.v. Burley群体的烤叶中N-亚硝基降烟碱(NNN)的浓度。收获的叶取自植物的三个位置，即，上部叶、中部叶和下部叶；

图18显示在如图注中显示的10g/l硝酸盐“高硝酸盐”和4g/l“低硝酸盐”上生长的烟草c.v. Burley群体(T₂，CRV-AtNrt2.7)的下部烤叶中总混合TSNA的浓度。野生型充当对照；

图19显示在10g/l硝酸盐“高硝酸盐”和4g/l“低硝酸盐”上生长的烟草c.v. Burley群体(T₂，CRV-AtNrt2.7)的中部烤叶中总混合TSNA的浓度。野生型充当对照；

图20显示在10g/l硝酸盐“高硝酸盐”和4g/l“低硝酸盐”上生长的烟草c.v. Burley群体(T₂，CRV-AtNrt2.7)的下部烤叶中总混合TSNA的浓度。野生型充当对照；

图21显示来自PPC-AtNrt2.7和CRV-AtNrt2.7的Burley群体的RTPCR结果的凝胶图像。样品是在每个转化体的同级群体上进行的部分屏。图21a是当在RTPCR阶段已经完成(使用SupercriptIII)且总RNA已经转化为cDNA后将样品进行PCR时的结果。因此，在泳道中存在条带表明这些样品中AtNrt2.7的表达。图21b显示了当没有RTPCR步骤的情况下对总RNA进行PCR时的结果。这验证了，没有任何可以导致样品中假阳性的DNA污染；

图22显示CRV启动子与CamV35s启动子的核苷酸序列的比对；

图23显示在源自田间生长的具有PPC-AtNrt2.7构建体的Virginia烟草的烟雾中N-亚硝基降烟碱(NNN)的浓度；

图24显示在源自田间生长的具有PPC-AtNrt2.7构建体的Virginia烟草的烟雾中4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK) (NNK)的浓度。只有显示上部和下部叶，因为中间叶中的NNK水平检测不到；

图25显示来自已经在10mM硝酸盐上生长的具有CRV-AtNrt2.7构建体的Burley烟草植物的NNN的浓度；和

图26显示来自已经在10mM氨上生长的具有CRV-AtNrt2.7构建体的Burley烟草植物的NNN的浓度。

实施例

本发明人已经开发了构建体和转基因植物，其中在下述控制下的硝酸盐转运蛋白基因(拟南芥NRT2.7)表达后，硝酸盐和各种TSNA类的浓度显著下降： (a) 组成型启动子，香石竹蚀环病毒(CERV)启动子(Hull等人, 1986, EMBO J., 5, 3083-3090)；或(b) 叶特异性启动子，豌豆质体蓝素(PPC)。

实施例1 - 拟南芥硝酸盐转运蛋白基因的分离

在这些实验中使用的拟南芥硝酸盐转运蛋白基因是AtNRT2.7。

引物设计

鉴定了编码来自拟南芥的硝酸盐转运蛋白2.7的全长基因组序列(序列的登录号为：T15N1-60)。设计在PCR中用于分离基因组序列的引物，其在5’末端为具有4 bp间隔区和合适的限制性位点的尾部。在片段的5’末端生成SacI和BamHI限制性位点，且在片段的3’末端生成KpnI和SacI限制性位点，以帮助片段克隆到适当的载体中。这些引物的序列如下所示：

技术人员将理解的是，可以设计并入引物的所需特征和可替代的限制性酶位点的其他PCR引物。

编码NRT2.7的拟南芥基因组DNA的分离

使用Qiagen DNA Easy小量制备提取试剂盒从3周大植物的莲座叶提取拟南芥var.Columbia基因组DNA。简而言之，根据制造商的说明使用QIAGEN DNeasy植物DNA提取试剂盒(#69106) (QIAGEN Ltd., Crawley, UK)从叶样品提取基因组DNA。这种方法提供了大量非常干净的适于基因分离和克隆策略的DNA。该试剂盒的原理利用DNA在高盐条件下特异性吸附至基于二氧化硅的膜，而污染物如蛋白、碳水化合物、多酚类化合物和其他植物代谢物则被洗走。

硝酸盐转运蛋白DNA片段的分离

拟南芥NRT2.7的基因组序列是1893bp长(登录号T15N1-60)。用引物对T15F (SEQ ID No.6)和T15R (SEQ ID No.7)扩增基因组拟南芥NRT2.7，其在片段的5’末端生成SacI和BamHI限制性位点且在片段的3’末端生成KpnI和SacI限制性位点。

PCR条件：

在25 μl反应体积中，添加0.5 μl校对TAQ聚合酶；0.5 μl TAQ增量剂；0.5 μl拟南芥基因组DNA；0.25 μl正向引物；0.25 μl反向引物；2.5 μl TAQ增量剂缓冲液；2.5 μl dNTP；18 μl水；在55°C退火，72℃延伸2分钟，30个循环。

然后通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR反应的等分试样。沉淀反应物，然后储存。然后如下所述将硝酸盐转运蛋白DNA片段克隆到pTOPO载体中(购自Invitrogen)。

连接反应：

取1 μl TOPO与1 μl盐溶液和4 μl PCR反应物。混合物在室温下放置30 min。取2 μl连接反应混合物与TOP10大肠杆菌细胞，然后在冰上放置30 min。在42℃下对细胞进行热休克30 s，然后在冰上放置5分钟。然后将细胞在37℃下在250 μl SOC培养基中孵育30 min。然后将细胞铺板在含有卡那霉素的琼脂平板上，且在37℃下放置过夜。含有质粒的细胞生长成菌落，且对于每种基因序列观察约50个菌落。菌落PCR用于选择单独的含有成功插入基因组DNA片段的pTOPO载体的克隆。

将菌落挑进50 μl 2YT +卡那霉素中，且允许在37℃下生长1小时。在10 μl PCR反应中，1 μl dNTP，1 μl缓冲液，0.1 μl正向引物(M13F)，0.1 μl反向引物(M13R)，0.3 μl TAQ，和7.5 μl水。对于每种序列挑取含有预期大小的PCR片段的三个菌落。然后单个菌落生长，且提取质粒DNA用于序列分析。

序列分析

对多个独立pTOPO克隆中存在的硝酸盐转运蛋白DNA片段进行测序。序列分析显示该克隆含有硝酸盐转运蛋白2.7基因。

实施例2 –用于烟草转化的载体的构建

编码AtNRT 2.7的基因组DNA克隆进二元载体

用Kpn1和BamHI消化含有NRT 2.7基因的pTOPO质粒以分离NRT2.7基因片段，然后将其克隆到也已经用Kpn1和BamHI消化的pBNP二元载体(pBNP-PPC-nosT)中，且随后转化至大肠杆菌电感受态细胞。pBNP载体是从pBNP二元载体生成的自制载体(van Engelen等人, 1995, Transgenic Research,4:288-290)，其含有PPC启动子和胭脂氨酸合成酶终止子。在卡那霉素板上选择含有该质粒的细胞。然后将分离克隆且提取DNA，并通过限制性消化和随后的测序进行分析。

CERV是植物病毒的花椰菜花叶病毒组的组成型启动子。其在1986年由Hull等人分离且表征，是CaMV 的特征(Hull等人, 1986)，但与CaMV 35S启动子具有很小的序列相似性(参见图23)。

豌豆质体蓝素启动子由Helliwell和Gray分离(1995, Plant Molecular Biology 29(3):621-626)，且已经通过表达研究表明，其对于叶是特异性的。

产生了下列二元载体：

(i) pBNP036AtNRT2.7001(参见图5a)：豌豆质体蓝素启动子：Nrt2.7 cDNA: Nos终止子；和

(ii) pBNPCRVAtNRT2.7 (参见图5b)：香石竹蚀环病毒(CERV)启动子：Nrt2.7 cDNA: Nos终止子。

然后通过电穿孔将这两种二元载体转化到根癌土壤杆菌LBA 4404中。这通过将40 μl根癌土壤杆菌电感受态细胞和0.5μg质粒DNA混合且置于预冷的小杯中而进行。然后在1.5伏特、600欧姆和25 μFD将细胞电穿孔。将1 ml 2YT培养基添加至小杯，将混合物倾入30 ml通用容器且在摇床中在28℃下培养2小时。然后将100 μl细胞铺板在卡那霉素(50 μg/ml)和链霉素(100 μg/ml)LB琼脂平板上。放置板以在28℃下孵育2天。

实施例3 - 烟草转化

如Horsch等人所述，使用叶圆片共培养的方法用pBNP036AtNRT2.7001或pBNPCRVAtNRT2.7转化烟草c.v. Vir40和烟草c.v. Burley 52 (Science 227: 1229-1231, 1985). 从7周大的烟草植物取最嫩的两片展开的叶，且在8% Domestos中进行表面消毒10分钟，且用无菌蒸馏水洗涤6次。然后使用6号木塞钻孔器切割叶圆片，且放置在土壤杆菌悬浮液中约两分钟。然后将圆片在两片无菌滤纸之间轻轻地吸干。将10片圆片置于LS 3％蔗糖+2μM BAP + 0.2μM NAA平板上，然后将其在生长室中培养2天。然后将圆片转移至补充500 g/l凯福隆和100 g/l卡那霉素的LS + 3%蔗糖+ 2μM BAP + 0.2 μM NAA的平板上。

2周后将圆片转移至上述培养基的新鲜板上。再两周后，将叶圆片转移到含有补充500 mg/l凯福隆和100 mg/l卡那霉素的LS +3%蔗糖+ 0.5μM BAP的平板上。每隔2周将叶圆片转移至新鲜培养基上。当枝出现时，将它们切除，且转移到补充500 mg/l凯福隆的LS +3%蔗糖的广口瓶中。约4周后，将广口瓶中的枝转移至LS + 3%蔗糖+ 250 mg/l凯福隆。再3-4周后，最终将植物转移至LS + 3%蔗糖(无抗生素)中且生根。一旦植物生根，将它们转移至温室中的土壤。

实施例4 - 分析转化植物中AfNRT2.7构建体的存在

再生的烟草转化体的分析

从再生的烟草植物获取叶材料，且分离基因组DNA。从体外生长的植物中切割一片大的烟草叶(约30 mg)，且置于1.5ml Eppendorf管中。使用微杵将组织均质化，且添加400μl提取缓冲液(200mM Tris HCL pH 8.0; 250mM NaCl; 25mM EDTA; 0.5% SDS; 40μg/ml Rnase A)，且再次仔细研磨以确保彻底混合。将样品旋涡混合约5秒，且然后以10,000rpm离心5分钟。将获得的上清液的350μl等分试样置于新的Eppendorf管中，且添加350μl氯仿。混合后，允许样品静置5分钟。然后将其以10,000rpm离心5分钟。将上清液的300μl等分试样移入新的Eppendorf管中。为此，添加300μl丙-2-醇，且通过反转几次Eppendorf而混合。允许样品静置10分钟。通过以10,000rpm离心10分钟而收集沉淀的DNA。弃去上清液，且沉淀在空气中干燥。将DNA沉淀再悬浮于50μl蒸馏水中，且在Q PCR中用作模板。通过QPCR 分析每种构建体/种类类型的30种植物以检查转基因事件。

结果(T₀)：

pBNP036AtNRT2.7001: Virginia 9个单拷贝

pBNP036AtNRT2.7001: Burley 7个单拷贝

pBNPCRVAtNRT2.7: Burley 10个单拷贝。

实施例5 - 分析转化植物中的硝酸盐转运蛋白表达

通过RTPCR测定的mRNA水平

使用Ambion RNAqueous试剂盒(Ambion Inc., Canada)从烟草叶圆片分离总RNA。使用组织研磨机将所有冷冻样品在液氮中研磨成粉末状。通过在4℃下以13,000 rpm离心5分钟而沉淀胞外膜、多糖和高高分子量DNA。将上清液转移到与试剂盒一起提供的过滤筒，且使用离心以洗涤和纯化RNA，然后用洗脱缓冲液洗脱RNA。RNA样品在-80℃保存，直至进一步使用。

使用Invitrogen 1步RTPCR superscript III对总RNA进行RTPCR(参见图21a)。然后使用对于AtNrt2.7特异性的引物(SEQ ID No:8和9)扩增获得的cDNA以确立基因表达。

GCGCCGGTATCTCTCAGCTCCTTA = RTPCR引物序列RTP0068F2 [SEQ ID No.8]

ATATCATCCCTCCCGCCGGT = RTPCR引物序列RTP0068R2 [SEQ ID No.9]

在没有RT反应的情况下使用RNA进行对照以确认没有任何DNA污染，如在图21b中所示。运行野生型对照连同转基因株系和质粒对照以给出正确的条带大小。

实施例6 - 烟草表型

当植物约12周大时，AtNRT2.7 (pBNP036AtNRT2.7001:Burley)的T₀表型显示出在最老叶上的褪绿斑点。这些斑点在植物上的叶子中逐渐增加，与叶衰老一致。还观察到沿植物主茎的褐色。在70%的转化体中观察到该表型。在T₁群体和T₂群体中也观察到这种表型。

实施例7 - 分析烟草叶中的硝酸盐含量

确定植物组织中的硝酸盐

这种用于确定植物组织中的硝酸盐浓度的方法描述于数篇论文中，包括Masclaux论文(Planta (2000) 211,第510-518页)。它依赖于在高酸性条件下植物提取物中硝酸盐对水杨酸的硝化，且形成的复合物在410nm处吸收最大。形成的发色团是5-硝基水杨酸。这种方法已经显示是灵敏的，且很少有来自氯化物、亚硝酸盐和铵离子的干扰(Cataldo D.A., Community Soil Science and Plant Analysis, 6 (1), 第71-80页, 1975)。

材料是：

提取缓冲液：50mM磷酸盐缓冲液pH7.5；测定溶液：在硫酸中5％水杨酸(浓度)；还需要： 2N氢氧化钠

方法：首先，100mg组织在液氮中研磨，且然后添加300μl提取缓冲液，并且匀浆。在4℃下将匀浆物以30g离心15分钟，然后取出上清液用于分析。在1 ml测定板中将10μl上清液与40μl测定溶液混合(同时设置空白对照)。反应物在室温下孵育20分钟，且缓慢添加950 μl 2N氢氧化钠以将pH升高至高于12。将样品冷却至室温，且测定410nm处的吸光度 (将250 μl倾入titretek板以读数)。还测量100mM、50、40、30、20、10、5 和1硝酸钾的标准品。

因为提取物有颜色，需要新鲜组织样品(即未冻干或烘干的)和单独的空白。这由提取物、40 μl硫酸(无水杨酸)和1950μl 2N氢氧化钠组成。在4℃储存硝酸盐标准品。

图2至9中显示的硝酸盐结果显示，用本发明的CRV-AtNrt2.7和PPC-AtNrt2.7构建体转化的植物中叶硝酸盐浓度降低。尽管他们不希望被理论所束缚，但是发明人假设，AtNrt2.7蛋白充当氮再动员物且使植物中硝酸盐穿梭出液泡而到达槽区(sink areas)如种子发育。这导致叶耗竭硝酸盐，且导致如表型所示的褪绿。

实施例8 - 分析烤叶中的TSNA含量

图10至27中显示的TSNA结果显示由AtNrt2.7构建体导致的总TSNA浓度(即NAT、NNK和NNN)的相当大的降低。假设这与收获时更少的剩余叶硝酸盐相关。硝酸盐是烤烟叶中TSNA产生的主要前体之一 (Staaf等人, 2005, Contributions to Tobacco Research, 21:321-330; de Roton等人, 2005, Contributions to Tobacco Research, 21:305-320)。因此，T0和T1群体中看到的叶中硝酸盐的更低水平将导致烤叶中TSNA的更低水平。Burley尤其具有高水平的NNN，且当这些植物在田间生长时，NNN水平显示出下降。

图23和24显示，在具有PPC-AtNrt2.7构建体的田间生长植物的上部、中部和下部叶中，NNN和NNK水平分别下降。此外，如图24中所示，PPC-AtNrt2.7细胞系的中部叶NNK浓度均低于检测水平，所以没有显示在该图中。

图25和26显示，当在l0mM硝酸盐(图25)或l0mM氨(图26)上生长时，来自具有CRV-AtNrt2.7构建体的温室生长的Burley植物的混合NNN水平。这些数据表明，NNN浓度的降低对于由硝酸盐转运蛋白AtNrt2.7的过表达引起的硝酸盐转运是特异性的。这是因为，如图25中所示，两种试验植物(标记为‘43’和‘45’)都显示由于在硝酸盐上生长而导致的浓度降低，而，如图26中所示，当在氨上生长时任一种试验植物都没有显示出NNN的降低，这将不会受硝酸盐转运蛋白AtNrt2.7的过表达的影响。

序列表

<110> Advanced Technologies (Cambridge) Limited

<120> 转基因植物

<130> 61210PCT1

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 232

<212> DNA

<213> 香石竹蚀环病毒

<400> 1

agcttgcatg cctgcaggtc gagcttttag gattccatag tgataagata tgttcttatc 60

taaacaaaaa agcagcgtcg gcaaaccata cagctgtcca caaaaaggaa aggctgtaat 120

aacaagcgga cccagcttct cagtggaaga tactttatca gacactgaat aatggatgga 180

ccctaccacg attaaagagg agcgtctgtc taaagtaaag tagagcgtct tt 232

<210> 2

<211> 783

<212> DNA

<213> 豌豆

<400> 2

tatgcaactt acaacgtgca ctcgcggagg attggacgtg tgcaacttac aacgtacgca 60

ttgttcgttc atacaatagt gtagaattgg acatgtgcaa cttacaacat gtgcaactta 120

caacgtgcgc tcgcggagga atgtgaagtt gaacacgtac aacttacgtc atttgtgcat 180

gcagaagcat agagctgagc acacaattca taatttgaag gacacatgat ttgctataaa 240

gaactcttta gaagtaccac aactttgact gagtttgata tagctaataa agatggagct 300

cattataatt tgaatggcat aatcaagcta aacgaacaag cttagttaat catgttaaac 360

aacaattctt tgtaataata aattgtcttt caactagtcc aagtttatga gttgattctt 420

cggaataaat tagaaaatat cttagatttt atacttcatt gattatttca tagagcaagt 480

aggagaaata aaaatatact agtattattt actaaaaaaa atctaagcca cgtcggagga 540

taacatccaa cccagccaat cacagcaatg ttcatcagat aacccacttt aagcccacgc 600

actctgtggc acatctacat tatctaaatc acatattctt ccacacatct tagccacaca 660

aaaacccaat ccacatcttt atcatccatt ctataaaaaa tcaccttctg tgtgtctctc 720

tttcgattcc cttcaaacac atacaaattc agtagagaag aaactcatta ctcttgagaa 780

aaa 783

<210> 3

<211> 1560

<212> DNA

<213> 拟南芥

<400> 3

atggagccat ctcaacgcaa caccaaaccg ccgtcgtttt cagattccac tatcccggtt 60

gattccgatg gtcgagccac cgtcttccga ccattctctc tctcctcgcc acactcacga 120

gcctttcacc tagcttggct ctcactcttc tcatgcttct tctccacctt ctccatccct 180

cctctggtcc ccgtcatctc ctccgacctc aacctctctg cctccaccgt atccgccgcc 240

ggaatcgctt ccttcgctgg ctccatcttc tctcgcctcg ctatgggacc actctgtgat 300

ctcatcggac cacgtacttc ctcagcgatt ctctcttttc tcaccgctcc tgtaatcctc 360

tccgcctcac tcgtctcctc tccgacgtcc ttcatcctcg tccgtttctt cgtcggcttc 420

tcgctcgcta atttcgtagc caatcaatac tggatgtcct ccatgttctc cggtaacgtc 480

attggtctcg ctaacggtgt ctcagccggt tgggctaacg tcggcgccgg tatctctcag 540

ctccttatgc ctctcatata ctccaccata gccgaattcc ttccacgcgc cgtcgcctgg 600

cgcgtgtcct tcgtatttcc cgccattttt caggttacaa cggccgtcct cgttctcctc 660

tacggccaag atactcccca cggtaacaga aaaaactcga accagaacaa actcacaatt 720

cctgaagaag aagaagtact agtagttgaa gaagacgaac gttccagttt cgtcgagatc 780

ctaatcggcg gacttggaaa ttacagagcg tggatcttag cgctgctcta cggatactcg 840

tacggcgtcg agctaacgac ggacaacgtg atcgccggat atttctacga gagatttgga 900

gtgaatctgg aggcggcggg gacgatcgcg gcgagtttcg ggatatcgaa cattgcgtcg 960

cgaccggcgg gagggatgat atcggatgcg ctggggaaga gattcggtat gagagggagg 1020

ctgtgggggc tatggatcgt gcaatcggtg gctgggttgt tgtgcgtgtt actcggacga 1080

gtcaactcgc tctggggatc aatcctcgtc atgtgggtct tctctgtttt cgttcaagct 1140

gcttctggcc ttgtatttgg cgtggtccct ttcgtctcca cgcggttagt ttaaagtcta 1200

ccaatccggt ttttgctaat aatttcggtt tggttttaat ttggttttgt ttataatgac 1260

agatcgttag gagtggtggc gggaattacg ggaagcggcg gtacggttgg tgcggtggtg 1320

acgcagtttc tgttgttttc cggtgatgat gttcgaaaac agagaagcat ttcacttatg 1380

ggtttgatga cttttgtgtt tgctctttct gttacatcaa tttactttcc acaatggggt 1440

ggaatgtgtt gtgggccttc gtcatcttcc gaagaagaag atatttctcg gggactcctt 1500

gtagaagacg aagatgaaga aggtaaagtg gttagtggta gtctacgtcc cgtttgttga 1560

<210> 4

<211> 1482

<212> DNA

<213> 拟南芥

<400> 4

atggagccat ctcaacgcaa caccaaaccg ccgtcgtttt cagattccac tatcccggtt 60

gattccgatg gtcgagccac cgtcttccga ccattctctc tctcctcgcc acactcacga 120

gcctttcacc tagcttggct ctcactcttc tcatgcttct tctccacctt ctccatccct 180

cctctggtcc ccgtcatctc ctccgacctc aacctctctg cctccaccgt atccgccgcc 240

ggaatcgctt ccttcgctgg ctccatcttc tctcgcctcg ctatgggacc actctgtgat 300

ctcatcggac cacgtacttc ctcagcgatt ctctcttttc tcaccgctcc tgtaatcctc 360

tccgcctcac tcgtctcctc tccgacgtcc ttcatcctcg tccgtttctt cgtcggcttc 420

tcgctcgcta atttcgtagc caatcaatac tggatgtcct ccatgttctc cggtaacgtc 480

attggtctcg ctaacggtgt ctcagccggt tgggctaacg tcggcgccgg tatctctcag 540

ctccttatgc ctctcatata ctccaccata gccgaattcc ttccacgcgc cgtcgcctgg 600

cgcgtgtcct tcgtatttcc cgccattttt caggttacaa cggccgtcct cgttctcctc 660

tacggccaag atactcccca cggtaacaga aaaaactcga accagaacaa actcacaatt 720

cctgaagaag aagaagtact agtagttgaa gaagacgaac gttccagttt cgtcgagatc 780

ctaatcggcg gacttggaaa ttacagagcg tggatcttag cgctgctcta cggatactcg 840

tacggcgtcg agctaacgac ggacaacgtg atcgccggat atttctacga gagatttgga 900

gtgaatctgg aggcggcggg gacgatcgcg gcgagtttcg ggatatcgaa cattgcgtcg 960

cgaccggcgg gagggatgat atcggatgcg ctggggaaga gattcggtat gagagggagg 1020

ctgtgggggc tatggatcgt gcaatcggtg gctgggttgt tgtgcgtgtt actcggacga 1080

gtcaactcgc tctggggatc aatcctcgtc atgtgggtct tctctgtttt cgttcaagct 1140

gcttctggcc ttgtatttgg cgtggtccct ttcgtctcca cgcggtcgtt aggagtggtg 1200

gcgggaatta cgggaagcgg cggtacggtt ggtgcggtgg tgacgcagtt tctgttgttt 1260

tccggtgatg atgttcgaaa acagagaagc atttcactta tgggtttgat gacttttgtg 1320

tttgctcttt ctgttacatc aatttacttt ccacaatggg gtggaatgtg ttgtgggcct 1380

tcgtcatctt ccgaagaaga agatatttct cggggactcc ttgtagaaga cgaagatgaa 1440

gaaggtaaag tggttagtgg tagtctacgt cccgtttgtt ga 1482

<210> 5

<211> 493

<212> PRT

<213> 拟南芥

<400> 5

Met Glu Pro Ser Gln Arg Asn Thr Lys Pro Pro Ser Phe Ser Asp Ser

1 5 10 15

Thr Ile Pro Val Asp Ser Asp Gly Arg Ala Thr Val Phe Arg Pro Phe

20 25 30

Ser Leu Ser Ser Pro His Ser Arg Ala Phe His Leu Ala Trp Leu Ser

35 40 45

Leu Phe Ser Cys Phe Phe Ser Thr Phe Ser Ile Pro Pro Leu Val Pro

50 55 60

Val Ile Ser Ser Asp Leu Asn Leu Ser Ala Ser Thr Val Ser Ala Ala

65 70 75 80

Gly Ile Ala Ser Phe Ala Gly Ser Ile Phe Ser Arg Leu Ala Met Gly

85 90 95

Pro Leu Cys Asp Leu Ile Gly Pro Arg Thr Ser Ser Ala Ile Leu Ser

100 105 110

Phe Leu Thr Ala Pro Val Ile Leu Ser Ala Ser Leu Val Ser Ser Pro

115 120 125

Thr Ser Phe Ile Leu Val Arg Phe Phe Val Gly Phe Ser Leu Ala Asn

130 135 140

Phe Val Ala Asn Gln Tyr Trp Met Ser Ser Met Phe Ser Gly Asn Val

145 150 155 160

Ile Gly Leu Ala Asn Gly Val Ser Ala Gly Trp Ala Asn Val Gly Ala

165 170 175

Gly Ile Ser Gln Leu Leu Met Pro Leu Ile Tyr Ser Thr Ile Ala Glu

180 185 190

Phe Leu Pro Arg Ala Val Ala Trp Arg Val Ser Phe Val Phe Pro Ala

195 200 205

Ile Phe Gln Val Thr Thr Ala Val Leu Val Leu Leu Tyr Gly Gln Asp

210 215 220

Thr Pro His Gly Asn Arg Lys Asn Ser Asn Gln Asn Lys Leu Thr Ile

225 230 235 240

Pro Glu Glu Glu Glu Val Leu Val Val Glu Glu Asp Glu Arg Ser Ser

245 250 255

Phe Val Glu Ile Leu Ile Gly Gly Leu Gly Asn Tyr Arg Ala Trp Ile

260 265 270

Leu Ala Leu Leu Tyr Gly Tyr Ser Tyr Gly Val Glu Leu Thr Thr Asp

275 280 285

Asn Val Ile Ala Gly Tyr Phe Tyr Glu Arg Phe Gly Val Asn Leu Glu

290 295 300

Ala Ala Gly Thr Ile Ala Ala Ser Phe Gly Ile Ser Asn Ile Ala Ser

305 310 315 320

Arg Pro Ala Gly Gly Met Ile Ser Asp Ala Leu Gly Lys Arg Phe Gly

325 330 335

Met Arg Gly Arg Leu Trp Gly Leu Trp Ile Val Gln Ser Val Ala Gly

340 345 350

Leu Leu Cys Val Leu Leu Gly Arg Val Asn Ser Leu Trp Gly Ser Ile

355 360 365

Leu Val Met Trp Val Phe Ser Val Phe Val Gln Ala Ala Ser Gly Leu

370 375 380

Val Phe Gly Val Val Pro Phe Val Ser Thr Arg Ser Leu Gly Val Val

385 390 395 400

Ala Gly Ile Thr Gly Ser Gly Gly Thr Val Gly Ala Val Val Thr Gln

405 410 415

Phe Leu Leu Phe Ser Gly Asp Asp Val Arg Lys Gln Arg Ser Ile Ser

420 425 430

Leu Met Gly Leu Met Thr Phe Val Phe Ala Leu Ser Val Thr Ser Ile

435 440 445

Tyr Phe Pro Gln Trp Gly Gly Met Cys Cys Gly Pro Ser Ser Ser Ser

450 455 460

Glu Glu Glu Asp Ile Ser Arg Gly Leu Leu Val Glu Asp Glu Asp Glu

465 470 475 480

Glu Gly Lys Val Val Ser Gly Ser Leu Arg Pro Val Cys

485 490

<210> 6

<211> 39

<212> DNA

<213> 拟南芥

<400> 6

atcgagctcg gatccatgga gccatctcaa cgcaacacc 39

<210> 7

<211> 36

<212> DNA

<213> 拟南芥

<400> 7

atcgagctcg gtaccacaaa cgggacgtag actacc 36

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 拟南芥

<400> 8

gcgccggtat ctctcagctc ctta 24

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 拟南芥

<400> 9

atatcatccc tcccgccggt 20

Claims

1.基因构建体，其包含与编码具有硝酸盐转运蛋白活性的多肽的编码序列可操作连接的启动子，条件是所述启动子不是花椰菜花叶病毒35S启动子。

2.根据权利要求1所述的基因构建体，其中所述启动子是组成型的、非组成型的、组织特异性的、发育调节型或诱导型/阻遏型的启动子。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的基因构建体，其中所述启动子是香石竹蚀环病毒(CERV)启动子、豌豆质体蓝素启动子、核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶启动子、胭脂氨酸合成酶启动子、叶绿素a/b结合启动子、高分子量麦谷蛋白启动子、α,β-麦醇溶蛋白启动子、大麦醇溶蛋白启动子、马铃薯糖蛋白启动子、或衰老特异性启动子。

4.根据权利要求3所述的基因构建体，其中所述启动子是CERV启动子或豌豆质体蓝素启动子。

5.基因构建体，其包含与编码具有硝酸盐转运蛋白活性的多肽的编码序列可操作连接的香石竹蚀环病毒(CERV)启动子或豌豆质体蓝素启动子。

6.根据前述权利要求所述的基因构建体，其中所述启动子包含基本上如SEQ ID No.1所述的核苷酸序列，或其功能变体或功能片段。

7.根据权利要求1-5中任一项所述的基因构建体，其中所述构建体包含基本上如SEQ ID No.2所述的核苷酸序列，或其功能变体或功能片段。

8.根据前述权利要求所述的基因构建体，其中所述编码具有硝酸盐转运蛋白活性的多肽的编码序列源自拟南芥属(Arabidopsis spp.)、稻属(Oryza spp.)、杨属(Populus spp.)或烟草属(Nicotiana spp.)。

9.根据前述权利要求所述的基因构建体，其中所述编码序列源自拟南芥(Arabidopsis thaliana)、烟草(Nicotiana tabacum)、稻(Oryza sativa)或欧洲山杨(Populus tremula)，优选烟草(Nicotiana tabacum)。

10.根据前述权利要求所述的基因构建体，其中所述编码具有硝酸盐转运蛋白活性的多肽的编码序列包含基本上如SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所述的核酸序列，或其功能变体或片段。

11.根据前述权利要求所述的基因构建体，其中所述具有硝酸盐转运蛋白活性的多肽包含基本上如SEQ ID No:5所述的氨基酸序列，或其功能变体或片段。

12.重组载体，其包含根据任一项前述权利要求所述的基因构建体。

13.根据权利要求12所述的载体，基本上如图5a和5b中所示。

14.使试验植物的叶中硝酸盐浓度减少至低于在相同条件下培养的野生型植物叶中对应的硝酸盐浓度的方法，所述方法包括改变所述试验植物中的植物代谢以实现植物叶中硝酸盐转运蛋白水平增加。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述方法包括用根据权利要求1-11中任一项所述的基因构建体或根据权利要求12或权利要求13所述的载体转化所述试验植物细胞。

16.产生转基因植物的方法，所述转基因植物以比在相同条件下培养的对应野生型植物更高的速率将硝酸盐转运出叶，所述方法包括以下步骤：

(i) 用根据权利要求1-11中任一项所述的基因构建体或根据权利要求12或权利要求13所述的载体转化植物细胞；和

(ii) 从所述转化的细胞再生植物。

17.用于产生转基因植物的方法，所述方法包括将编码硝酸盐转运蛋白的外源基因引入未修饰的植物，其中相对于所述未修饰的植物的叶中的硝酸盐浓度，所述外源基因编码的所述硝酸盐转运蛋白的表达降低了所述转基因植物的叶中的硝酸盐浓度。

18.转基因植物，其包含根据权利要求1-11中任一项所述的基因构建体或根据权利要求12或权利要求13所述的载体。

19.转基因植物，其包含编码硝酸盐转运蛋白的外源基因，其中与未修饰的植物叶中的硝酸盐浓度相比，所述转基因植物叶中的硝酸盐浓度降低。

20.编码硝酸盐转运蛋白的外源核酸序列用于通过用所述外源核酸序列转化植物而降低植物叶中的硝酸盐浓度的用途。

21.编码硝酸盐转运蛋白的外源核酸序列用于通过用所述外源核酸序列转化植物而诱导试验植物中的衰老或衰老样表型的用途。

22.根据权利要求17所述的方法，根据权利要求18或19所述的转基因植物，或根据权利要求20或21所述的用途，其中所述外源基因包含基本上如SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 4所述的核苷酸序列，或其功能变体或片段，或编码包含基本上如SEQ ID No.5所述的氨基酸序列的硝酸盐转运蛋白，或其功能变体或片段。

23.宿主细胞，其包含根据权利要求1-11中任一项所述的基因构建体或根据权利要求12或权利要求13所述的载体。

24.根据权利要求23所述的宿主细胞，其中所述细胞是植物细胞。

25.根据权利要求14-17中任一项所述的方法，根据权利要求18或权利要求19所述的转基因植物，或根据权利要求20或21所述的用途，其中所述植物来自十字花科，如芸苔属(Brassica spp.)，且优选为欧洲油菜(Brassica napus) (油菜)。

26.根据权利要求14-17中任一项所述的方法，根据权利要求18或权利要求19所述的转基因植物，或根据权利要求20或21所述的用途，其中所述植物来自禾本科，如Triticeae spp.，优选为小麦属(Triticum spp.)(小麦)。

27.根据权利要求14-17中任一项所述的方法，根据权利要求18或权利要求19所述的转基因植物，或根据权利要求20或21所述的用途，其中所述植物来自茄科，如曼陀罗、茄子、曼德拉草(mandrake)、颠茄(deadly nightshade、belladonna)、辣椒(capsicum、paprika、chilli pepper)、马铃薯或烟草。

28.根据权利要求14-17中任一项所述的方法，根据权利要求18或权利要求19所述的转基因植物，或根据权利要求20或21所述的用途，其中所述植物来自烟草属，优选烟草。

29.从根据权利要求17、18或权利要求25-28中任一项所述的转基因植物获得的植物繁殖产物。

30.根据权利要求29所述的植物繁殖产物，其中所述繁殖产物包含根据权利要求1-11中任一项所述的基因构建体，根据权利要求12或权利要求13所述的载体，或如权利要求22中定义的外源基因。

31.收获叶，其含有比从在相同条件下培养的野生型植物采集的收获叶中对应的硝酸盐水平更低水平的硝酸盐，其中所述叶是从根据权利要求18、19或25-28中任一项所述的或通过根据权利要求16或权利要求17所述的方法产生的转基因植物收获的。

32.烟草产品，其包含从突变体烟草植物获得的硝酸盐降低的烟草，所述突变体能够降低其叶中的硝酸盐浓度。

33.根据权利要求32所述的烟草产品，其中衍生所述烟草产品中的烟草的所述突变体烟草植物包含根据权利要求1-11中任一项所述的基因构建体，根据权利要求12或权利要求13所述的载体，或如权利要求22中定义的外源基因。

34.根据权利要求32或权利要求33所述的烟草产品，其中所述烟草产品是无烟烟草产品，如鼻烟，或通过嘴递送的口服烟草产品，如湿鼻烟，或吸烟制品。

35.吸烟制品，其包含从突变体烟草植物获得的硝酸盐降低的烟草，所述突变体能够降低其叶中的硝酸盐浓度。

36.根据权利要求35所述的吸烟制品，其中衍生烟草产品中的烟草的所述突变体烟草植物包含根据权利要求1-11中任一项所述的基因构建体，根据权利要求12或权利要求13所述的载体，或如权利要求22中定义的外源基因。