CN107208109A - 方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于减少烟草中至少一种烟草特有的亚硝胺或其前体的方法，包括通过增加LBD(侧生器官边界结构域)氮响应性转录因子的活性和表达来修饰烟草植物。本发明还提供了根据本发明可获得的烟草细胞、烟草植物、烟草植物繁殖材料、收获的叶、加工的烟草或烟草产品。

Description

方法

技术领域

本发明涉及减少烟草植物中烟草特有的亚硝胺或它们的前体。特别地，本发明涉及侧生边界结构域(lateral bound domain，LBD)氮响应转录因子的方法和应用并且涉及烟草植物及它们的下游产品(例如，繁殖材料、收获的叶、加工过的烟草和烟草产品)。

背景技术

如图1所示，烟草特有的亚硝胺(TSNA)由尼古丁和相关化合物通过发生在烟草的烘烤(curing)和加工期间的亚硝化反应形成。风干烟草中的亚硝化剂通常是衍生自通过烘烤期间微生物的作用的叶片硝酸盐的还原反应的亚硝酸盐。并且已经证明亚硝胺的生产与硝酸盐/亚硝酸盐和一氧化氮的高水平有关(Liang S.,Yang J.,Zhou J.,Yu J.,Ma Y.,Bai R.,Xu F.,Yang C.Application of exogenous substances reduces tobacco-specific nitrosamines content by regulating biosynthesis of nicotine andnitrite in burley tobacco.Acta Physiol.Plant.(2013)35:3027-3036；Shi H.,WangR.,Bush L.P.,Yang H.,Fannin F.F.The relationships between TSNAs and theirprecursors in burley tobacco from regions and varieties.Journal of Food,Agriculture&Environment(2012)10(3&4):1048-1052)。TSNA的减少是烟草行业的理想目标。

氮(N)和硝酸盐(NO₃-)的可用性调节植物代谢、生长和发育的许多方面。植物特有的侧生器官边界结构域(LBD)基因家族对植物侧生器官发育是必不可少的，同时也参与了氮代谢调控。三个N/NO₃-诱导的转录因子的LBD基因家族的成员(LBD37、LBD8和LBD39)作为拟南芥(Arabidopsis thaliana)中花青素生物合成的负调节物(Rubin G.,Tohge T.,Matsuda F.,Saito K.,Scheible W-R.Members of the LBD Family of transcriptionfactors repress anthocyanin synthesis and affect additional nitrogenresponses in Arabidopsis.Plant Cell(2009)21(11):3567-3584)。据认为，LBD37-39信号N可用于植物系统，导致抑制特定N缺乏响应，如花青素合成。LBD基因同样抑制许多其他已知的N应答基因，包括NO₃ ^-摄取和同化(导致改变的NO₃ ^-含量)，硝酸还原酶的活性/活化作用，蛋白质、氨基酸和淀粉的水平，花青素合成和N相关的生长表型所需要的关键基因(Rubin等，2009)。

发明内容

根据第一个方面，本发明提供了一种用于减少烟草植物中至少一种烟草特有的亚硝胺(TSNA)或其前体的方法，包括通过增加LBD(侧生器官边界结构域)氮响应性(nitrogen-responsive)转录因子的活性或表达来修饰植物。

在另一个方面，提供了LBD氮响应性转录因子用于减少烟草植物中至少一种TSNA或其前体的应用。

在进一步的方面，本发明提供了一种用于生产具有至少一种TSNA或其前体的减少的烟草植物、烟草植物繁殖材料、烟叶、切割的收获烟叶、加工的烟叶或切割并加工的烟叶的方法，该方法包括修饰所述烟草植物以增加LBD氮响应性转录因子的活性或表达。

在另一个方面，此处提供了一种构建体或载体，包含与叶片特异性启动子或叶片偏好性启动子可操作地连接的编码LBD氮响应性转录因子的核酸。本发明还提供了一种构建体或载体，包含与衰老特异性启动子可操作地连接的编码LBD氮响应性转录因子的核酸。

在进一步的方面，提供了一种烟草细胞：

i)包含外源性LBD氮响应性转录因子；

ii)包含本发明的构建体或载体；和/或

iii)是由本发明的方法或应用可获得的(例如，获得的)。

在另一个方面，本发明提供了一种烟草植物：

i)它已进行修饰以实现与未修饰的植物相比至少一种TSNA或其前体的减少，其中修饰是在所述修饰的植物中增加LBD氮响应性转录因子的活性或表达；

ii)包含外源性LBD氮响应性转录因子；

iii)是由本发明所描述的方法或应用可获得的；

iv)包含根据本发明的构建体或载体；和/或

v)包含根据本发明的细胞。

在进一步的方面，提供了可获自本发明的烟草植物的烟草植物繁殖材料(例如，植物种子)。

本发明进一步提供：

·本发明的烟草细胞用于生产烟草产品的应用；

·本发明的烟草植物用于繁殖烟草植物的应用；

·本发明的烟草植物用于生产烟草产品的应用；

·本发明的烟草植物用于种植作物的应用；和

·本发明的烟草植物用于生产烟叶(例如，加工的(优选烘烤的)烟叶)。

本发明还提供了本发明的烟草植物的收获的叶，或可获自从本发明的繁殖材料繁殖而来的烟草植物的收获的叶，或可获自通过根据本发明的应用获得的烟草植物的收获的叶。

此外，本发明提供了加工过的烟叶：

i)包含本发明的烟草细胞；

ii)可获自从本发明的应用可获得的烟草植物；

iii)是通过加工本发明的烟草植物可获得的；

iv)可获自从根据本发明的烟草植物繁殖材料繁殖而来的烟草植物；或

v)是通过加工本发明的烟草植物的收获的叶可获得的。

发明进一步提供了由以下制得的烟草产品：

i)根据本发明或其一个部分的烟草植物；

ii)由根据本发明的烟草植物繁殖材料繁殖的烟草植物或其部分；

iii)根据本发明的烟草植物的收获的叶；或

iv)根据本发明的加工过的烟叶。

附图说明

现将仅通过实例的方式参考附图描述本发明的实施方式，其中：

图1示出由前体如尼古丁和降烟碱经由烟草烟雾中亚硝化反应形成烟草特有的亚硝胺(TSNA)。

图2示出024-0147构建体(LBD37，组成型启动子)、024-0148构建体(LBD38，组成型启动子)、0138-0148构建体(LBD38，衰老特异性启动子)和024-0149构建体(组成型启动子)的氨基酸水平。

图3示出由用024-0147((组成型启动子的LBD37)、0138-0148(LBD38在衰老特异性启动子上)和0138-0149(LBD39在衰老特异性启动子上)构建体转化的植物产生的烤烟中NNK和NNN的水平。

图4示出用024-0147(LBD37在组成型启动子上)、0138-0148(LBD38在衰老特异性启动子上)和0138-0149(LBD39衰老特异性启动子上)构建体转化的植物产生的地面烟草中尼古丁的水平。

图5示出用0138-0149(LBD39在衰老特异性启动子上)、0138-0148(LBD38在衰老特异性启动子上)和024-0147(LBD37在组成型启动子上)构建体转化的烟草植物的产量。

图6示出来自拟南芥的LBD37(SEQ ID NO:1和2)、LBD38(SEQ ID NO:3和4)和LBD39(SEQ ID NO:5和6)的核苷酸和氨基酸序列。

图7示出拟南芥LBD37(AtLBD37)、LBD38(AtLBD38)和LBD39(AtLBD39)对来自不同植物物种的同源蛋白质的对齐。

具体实施方式

本发明人首次令人惊奇地示出，通过增加烟草植物中LBD氮响应性转录因子的活性或表达，可以减少至少一种烟草特有的亚硝胺(TSNA)或其前体。

众所周知，通过如图1示出的亚硝化反应，烟叶中的残留氮有助于亚硝胺的形成。特别地，硝酸盐和亚硝酸盐和一氧化氮(NO)在烘干的叶片中作为烟草特有的亚硝胺(TSNA)形成的前体。不希望被理论束缚，通过调节LBD基因表达来修饰硝酸盐同化作用被认为有能力调节亚硝酸盐和一氧化氮(NO)的生产以及因此在烟叶烘烤和加工期间形成的TSNA的水平。然而，本发明的发现是高度出乎意料的。

本发明提供了LBD氮响应性转录因子用于减少烟草植物中至少一种TSNA或其前体的应用。

由具有增加的LBD氮响应性转录因子的活性或表达的烟草植物制得的烟草产品中TSNA含量或浓度的减少是非常有利的技术效果。

在一个实施方式中，提供了生产烟草植物、烟草植物繁殖材料、烟叶、加工的烟叶、切割的烟叶或切割并加工的烟叶的方法，其具有至少一种TSNA或其前体的减少，该方法包括修饰所述烟草植物以增加LBD氮响应性转录因子的活性或表达。

在此使用的术语“烟草特有的亚硝胺”或“TSNA”具有在领域内的一般含义，即，仅在烟草产品或其他含尼古丁的产品中发现的亚硝胺。合适地，至少一种烟草特有的亚硝胺可以是4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N’-亚硝基降烟碱(NNN)、N’-亚硝基去氢新烟碱(NAT)或N-亚硝基新烟碱(NAB)。

更合适地，至少一种烟草特有的亚硝胺可以是NNK或NNN。

当被用于涉及至少一种烟草特有的亚硝胺时，术语“其前体”指的是烟草植物的一种或多种化学品或化合物，其引起形成烟草特有的亚硝胺或涉及引起烟草特有的亚硝胺的产生的亚硝化反应。合适地，术语“其前体”可能指的是硝酸盐、亚硝酸盐或一氧化氮。

在一个实施方式中，当与未被修饰以增加LBD氮响应性转录因子的活性或表达的烟草植物相比时，实施本发明的方法和或应用使得在修饰的烟草植物中至少一种TSNA或其前体的减少。

在此使用的术语“减少至少一种TSNA或其前体”或“至少一种TSNA或其前体的减少”指的是，涉及可比较的产品、方法或应用时，本发明的产品、方法或应用中至少一种TSNA或其前体的浓度和/或总含量较低。例如，可比较的烟草产品将会从根据本发明还未被修饰的、但其中所有其他相关特征相同的烟草植物得到(例如，植物物种、生长条件、烟草加工的方法，等等)。

可以使用领域内已知的任何方法来检测至少一种TSNA或其前体的浓度和/或水平。特别是可以使用如实施例4中详述在此的方法。例如，当检测烟草特有的亚硝胺前体的浓度和/或水平时，可以使用如在WO2009/022183中、在Morot-Gaudry-Talarmain etal.2002.Planta,215:708-715中或在Mur et al Plant Science 181(2011)509-519中详述的一种方法(其通过引用结合于此)。

合适地，通过实施本发明的方法和/或应用可以减少至少一种烟草特有的亚硝胺或其前体的浓度和/或总含量。合适地，当与未被修饰以增加LBD氮响应性转录因子的活性或表达的烟草植物中至少一种烟草特有的亚硝胺或其前体的浓度和/或水平比较时，在本发明的烟草植物中(例如，通过本发明的方法和/或应用可获得的或获得的)至少一种烟草特有的亚硝胺或其前体的浓度和/或水平可以是减少的。

当与从未被修饰以增加LBD氮响应性转录因子的活性或表达的烟草植物中可获得的或获得的烟叶、收获的叶、加工的烟叶、烟草产品或它们的组合比较时，在从本发明的烟草植物中可获得的或获得的烟叶、收获的叶、加工的烟叶、烟草产品或它们的组合中，至少一种烟草特有的亚硝胺或其前体的浓度和/或总含量可以是减少的。

合适地，在加工的烟叶中，至少一种烟草特有的亚硝胺或其前体的浓度和/或总含量可以是减少的。

合适地，在烟草产品中，至少一种烟草特有的亚硝胺或其前体的浓度和/或水平可以是减少的。

在一个实施方式中，至少一种烟草特有的亚硝胺或其前体可以减少至至少约1％、至少约3％、至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％。在一些实施方式中，至少一种烟草特有的亚硝胺或其前体可以减少(reduced by)约5％至约95％、约10％至约90％、约20％至约80％、约30％至约70％或约40％至60％。

关于加工的(例如，烘烤的)烟叶，至少一种烟草特有的亚硝胺或其前体可以减少约5000ng/g至约50ng/g、约4000ng/g至约100ng/g、约3000ng/g至约500ng/g或约2000ng/g至约1000ng/g。在一些实施方式中，至少一种烟草特有的亚硝胺或其前体可以减少至少约5000ng/g、至少约4000ng/g、至少约3000ng/g、至少约2000ng/g、至少约1000ng/g、至少约500ng/g、至少约100ng/g或至少约50ng/g。

LBD氮响应性转录因子

LBD(侧生器官边界结构域)基因，又称为ASYMMETRIC LEAVES2(AS2)样(ASL)，编码植物特有的转录因子家族。LBD蛋白质由特征的N端LOB结构域限定，已知其负责DNA结合和蛋白质-蛋白质相互作用。LOB结构域包含DNA结合所需的C基序，它包含CX₂CX₆CX₃C基序中的四个完全保守的半胱氨酸(C)残基，其中X为不保守的残基。LOB结构域还包含蛋白质-蛋白质相互作用所需的保守的甘氨酸残基和C端亮氨酸拉链样序列(Majer C.,HochholdingerF.Defining the boundaries:structure and function of LOB domainproteins.Trends in Plant Science(2011)16(1):47-52)。示出基础基因(founder gene)LOB被识别6-bp GCGGCG DNA共有基序并在酵母中激活转录(Husbands A.,Bell E.M.,Shuai B.,Smith H.M.S.,Springer P.S.Lateral organ boundaries defines a newfamily of DNA-binding transcription factors and can interact with specificbHLH proteins.Nucleic Acids Research(2007)35(19):6663-6671)。

拟南芥LBD基因家族由43个成员组成，基于在LOB结构域内的氨基酸保守性将成员分为两类。种类I由LOB和LBD1至LBD36组成，种类II由LBD37至LBD43组成。在拟南芥中，已知种类II的三个LBD基因LBD37(ASL39)、LBD38(ASL40)和LBD39(ASL41)被氮或硝酸盐上调，并作为花青素合成的负调节物。LBD基因还抑制了许多其他已知的氮响应性基因，包括NO₃ ^-摄取和同化所需要的关键基因，导致改变的NO₃ ^-的含量、硝酸还原酶的活性/活化作用和其他N相关的生长表型(Rubin等，2009)。

在此使用的术语“侧生器官边界结构域(LBD)氮响应性转录因子””指的是含LOB结构域的蛋白质并且其以可能会受到氮或硝酸盐的可用性影响的方式作为转录因子。

在一个实施方式中，LBD氮响应性转录因子多肽序列包含以下基序中的一个或多个：

i)CX₂CX₆CX₃C，其中X为任何氨基酸

ii)MSCNGCRXLRKGCX(SEQ ID NO:7)

iii)QXXATXFXAKFXGR(SEQ ID NO:8)

iv)FXSLLXEAXG(SEQ ID NO:9)

在进一步的实施方式中，LBD氮响应性转录因子为LBD37、LBD38或LBD39。

术语“增加LBD氮响应性转录因子的活性”指的是当与未被修饰以增加LBD氮响应性转录因子的活性或表达的植物相比时，在修饰的植物中，植物中LBD氮响应性转录因子的活性作为整体增加。

在一个实施方式中，当与未被修饰的植物相比时，修饰的植物中LBD氮响应性转录因子的活性的增加可能超过约5％。合适地，LBD氮响应性转录因子活性的增加可能超过约10％，合适地超过约15％。在一些实施方式中，LBD氮响应性转录因子活性的增加可能超过约20％，更合适地超过约30％。在一些实施方式中，LBD氮响应性转录因子活性的增加可能超过约40％，如约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约100％。

在一些实施方式中，可以使用基因编辑实现对植物的修饰以增加LBD氮响应性转录因子的活性。

可以使用任何领域内已知的方法实现基因编辑。这里给出了一些非限制性实例，包括使用CRISPR-Cas9系统。CRISPR/Cas9基因组编辑工具商业上可获得，如来自Clontech的“Guide-it”(Avenue du President Kennedy78100Saint-Germain-en-Laye,France)。另一种基因编辑的方法包括使用具有商业上可获得的试剂盒的TALEN(转录活化子样效应器核酸酶)技术(例如，来自Addgene,1Kendall Sq.Ste.B7102,Cambridge,MA 02139,USA)。另外的方法包括使用锌指核酸酶如可获自Sigma-Aldrich的 Zinc FingerNuclease Technology。另一种方法包括使用Silva et al Curr Gene Ther.Feb 2011；11(1):11–27(其教导通过引用结合于此)中描述的大范围核酸酶(或进一步的方法)。又其他的方法是寡核苷酸指导的诱变(ODM)如可获自Keygene(Agro Business Park 90,6708PWWageningen,The Netherlands)的

在一个实施方式中，根据本发明使用的LBD氮响应性转录因子可以是烟草植物内源的。

参考于此的“内源的”基因不仅指所讨论的基因在植物中以其天然形式发现(即不存在任何人为干预)，也指该相同基因(或基本上同源的核酸/基因)随后以分离的形式被(重新)引入植物中(转基因)。例如，含有这种转基因的转基因植物可能遇到转基因表达的大量减少和/或内源基因的表达大量减少。分离的基因可以从有机体中分离出来的或可以是合成品，例如，通过化学合成。

在另一个实施方式中，根据本发明使用的LBD氮响应性转录因子可以是烟草植物外源的。

在一个实施方式中，LBD氮响应性转录因子可以可获自由从下列属的一种或多种中选择的植物：拟南芥属(Arabidopsis)、芸苔属(Brassica)、稻属(Oryza)、菜豆属(Phaseolus)、茄属(Solanum)、菠菜属(Spinacia)。

合适地，拟南芥属(Arabidopsis)LBD氮响应性转录因子可能为拟南芥(Arabidopsis thaliana)LBD氮响应性转录因子。

在一个实施方式中，根据本发明使用的LBD氮响应性转录因子可以选自欧洲油菜(Brassica napus)。

在一个实施方式中，根据本发明使用的LBD氮响应性转录因子可以选自芜菁(Brassica rapa)。

在一个实施方式中，根据本发明使用的LBD氮响应性转录因子可以选自辣椒(Capsicum annuum)。

在一个实施方式中，根据本发明使用的LBD氮响应性转录因子可以选自莴苣(Lactuca sativa)。

在一个实施方式中，根据本发明使用的LBD氮响应性转录因子可以选自水稻(Oryza sativa)，适合地是粳稻日本晴(Oryza sativa subsp.japonica)。

在一个实施方式中，根据本发明使用的LBD氮响应性转录因子可以选自菜豆(Phaseolus vulgaris)。

在一个实施方式中，根据本发明使用的LBD氮响应性转录因子可以选自番茄(Solanum lycopersicum)。

在一个实施方式中，根据本发明使用的LBD氮响应性转录因子可以选自马铃薯(Solanum tuberosum)。

在一个实施方式中，根据本发明使用的LBD氮响应性转录因子可以选自菠菜(Spinacia oleracea)。

在一个实施方式中，在本发明中使用的LBD氮响应性转录因子可以来自茄科(family Solanaceae)，更优选是Cestoideae亚科，更优选是烟草属的(genus Nicotiana)，最优选是来自红花烟草(Nicotiana tabacum)或黄花烟草(N.rustica)。

在一个实施方式中，根据本发明使用的LBD氮响应性转录因子来自烟草属。

LBD氮响应性转录因子可以来自烟草属的任何物种，包括黄花烟草(N.rustica)和红花烟草(Nicotiana tabacum)(例如，LA B21、LN KY171、Tl 1406、Basma、Galpao、Perique、Beinhart 1000-1和Petico)。其他物种包括无茎烟草(N.acaulis)、渐尖叶烟草(N.acuminata)、渐尖叶烟草多花型变种(N.acuminata var.multiflora)、非洲烟草(N.africana)、具翼烟草(N.alata)、N.amplexicaulis、阿伦特氏烟草(N.arentsii)、渐狭叶烟草(N.attenuata)、贝纳末特氏烟草(N.benavidesii)、本塞姆氏烟草(N.benthamiana)、N.bigelovii、博内里烟草(N.bonariensis)、洞生烟草(N.cavicola)、克利夫兰氏烟草(N.clevelandii)、心叶烟草(N.cordifolia)、伞床烟草(N.corymbosa)、迪勃纳氏烟草(N.debneyi)、高烟草(N.excelsior)、福尔吉特氏烟草(N.forgetiana)、香烟草(N.fragrans)、粉蓝烟草(N.glauca)、粘烟草(N.glutinosa)、古特斯比氏烟草(N.goodspeedii)、哥西氏烟草(N.gossei)、N.hybrid、因古儿巴烟草(N.ingulba)、卡瓦卡米氏烟草(N.kawakamii)、奈特氏烟草(N.knightiana)、蓝格斯多夫烟草(N.langsdorffii)、狭叶烟草(N.linearis)、长花烟草(N.longiflora)、海滨烟草(N.maritima)、特大管烟草(N.megalosiphon)、摩西氏烟草(N.miersii)、夜花烟草(N.noctiflora)、裸茎烟草(N.nudicaulis)、欧布特斯烟草(N.obtusifolia)、西方烟草(N.occidentalis)、西方烟草Hesperis亚种(N.occidentalis subsp.Hesperis)、耳状烟草(N.otophora)、圆锥烟草(N.paniculata)、少花烟草(N.pauciflora)、渐尖叶烟草(N.petunioides)、蓝茉莉叶烟草(N.plumbaginifolia)、夸德瑞伍氏烟草(N.quadrivalvis)、雷蒙德氏烟草(N.raimondii)、残波烟草(N.repanda)、莲座叶烟草(N.rosulata)、莲座叶烟草因古儿巴亚种(N.rosulata subsp.Ingulba)、圆叶烟草(N.rotundifolia)、赛特氏烟草(N.setchellii)、拟似烟草(N.simulans)、茄叶烟草(N.solanifolia)、斯佩格茨烟草(N.spegazzinii)、斯托克通氏烟草(N.stocktonii)、香甜烟草(N.suaveolens)、林烟草(N.sylvestris)、蓝烟草(N.thyrsiflora)、绒毛烟草(N.tomentosa)、绒毛状烟草(N.tomentosiformis)、三角叶烟草(N.trigonophylla)、荫生烟草(N.umbratica)、波叶烟草(N.undulata)、颤毛烟草(N.velutina)、芹叶烟草(N.wigandioides)和N.x sanderae。

在一个实施方式中，LBD氮响应性转录因子来自LBD基因家族的种类II。合适地，LBD氮响应性转录因子为LBD37、LBD38或LBD39。在一个特定的实施方式中，LBD37、LBD38或LBD39来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)。在另一个实施方式中，LBD37、LBD38或LBD39来自另一个物种，合适地是图7列出蛋白质中的一种(即SlLBD37、ObLBD37、BrLBD37、SlLBD38、BrLBD38或BrLBD39)。

在另一个实施方式中，LBD氮响应性转录因子多肽序列包含下列基序的一种或多种；

i)CX₂CX₆CX₃C，其中X为任何氨基酸

ii)MSCNGCRXLRKGCX(SEQ ID NO:7)

iii)QXXATXFXAKFXGR(SEQ ID NO:8)

iv)FXSLLXEAXG(SEQ ID NO:9)

在进一步的实施方式中，根据本发明使用的LBD氮响应性转录因子可以由包含以下的多核苷酸序列编码，多核苷酸序列：

i)在此示出为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的多核苷酸序列；

ii)在i)中示出的多核苷酸序列的功能性片段，其中，功能性片段编码功能性LBD氮响应性转录因子，或

iii)编码包含在此示出为SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:6的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；或

iv)可以在高严格条件下与上述i)、ii)或iii)中教导的多核苷酸杂交的多核苷酸序列或

v)与上述i)、ii)或iii)中示出的多核苷酸序列具有至少70％(优选85％、更优选90％)同一性的多核苷酸序列，或

vi)由于遗传密码的简并性而与i)、ii)或iii)中示出的多核苷酸不同的多核苷酸序列。

在此使用的术语“功能性片段”指的是多核苷酸的一部分，其能够编码保持其活性的LBD氮响应性转录因子。在一个实施方式中，功能性片段可以是本发明的多核苷酸的一部分，其包含本发明的多核苷酸的至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少150个核苷酸、至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸或至少500个核苷酸。

在此使用的术语“遗传密码的简并性”指的是编码多肽序列的密码子的冗余，表现为指定氨基酸的三密码子组合的多样性。例如，在编码具有异亮氨酸氨基酸的多肽的mRNA分子中，异亮氨酸可以由AUU、AUC或AUA编码。这意味着编码RNA的DNA分子可以具有多种序列，但产生的多肽会具有相同的序列。换句话说，多形态的核苷酸序列可以编码相同的多肽产物。这意味着一个核酸序列可以包含与第二个序列具有非常低序列同一性的序列但却编码相同的多肽序列。

在一个实施方式中，多核苷酸序列可以与SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3或SEQ IDNO.5具有至少80％同一性。

合适地，多核苷酸序列可以与SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5具有至少90％同一性。

合适地，多核苷酸序列可以与SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5具有至少95％同一性(更优选至少99％同一性)。

更合适地，多核苷酸序列可以与SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5具有至少99％同一性。

在另一个实施方式中，根据本发明使用的LBD氮响应性转录因子可以包含在此示出为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6的多肽序列，或包含具有在至少一个氨基酸处的保守替换的SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6的多肽序列，或与SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6具有至少70％同一性的多肽。

合适地，多肽可以与SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6具有至少80％同一性。

更合适地，多肽可以与SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6至少90％同一性。优选地，多肽可以与SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6至少95％同一性。

更优选地，多肽可以与SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6至少99％同一性。

增加表达

本发明的方法和应用包含至少一种LBD氮响应性转录因子表达的增加。可以通过本领域技术人员已知的任何方式实现表达的增加。

在此使用的术语“增加的表达”或“过表达”指的是附加原始野生型表达水平的任何表达形式。

“增加的表达”指的是与相同品种的亲本植物的表达水平相比，植物的mRNA水平或蛋白质水平增加。将表达水平与在相同条件下种植的相同品种的亲本植物中的相应部分进行比较。其中表达水平比亲本植物的表达水平增加至少1.1倍的情况被优选地认为是表达水平增加的情况。在这里，更优选的是，为了认为表达水平存在增加，通过与亲本植物的表达水平相比的t-测试，植物的表达水平具有5％的显著差异。优选的是在相同时间以相同方法测量植物和亲本植物的表达水平。然而，也可以使用作为背景数据存储的数据。

增加基因或基因产物的表达的方法在领域内有很好的记录并且包括，例如，由合适的启动子驱动的过表达、转录增强子或翻译增强子的应用。可以将充当启动子或增强子元件的分离的核酸引入至非异源形式的多核苷酸的合适位置(典型地是上游)以正调节编码目的多肽的核酸的表达。例如，可以通过突变、删除和/或替换(参见US 5,565,350；WO9322443)体内改变内源性启动子或可以以恰当的取向和距本发明的基因一定的距离将分离的启动子引入植物细胞内以控制基因的表达。

如果多肽表达是期望的，通常期望在多核苷酸编码区域的3’-端包含聚腺苷酸化区域。聚腺苷酸化区域可以来源于天然基因，来自多种其他植物基因或来自T-DNA。待添加的3¹端序列可以来源于，例如，胭脂碱合成酶或章鱼碱合成酶基因或可替换地来源于另一种植物基因或较少优选地来自任何其他真核基因。

也可以将内含子序列加入到5’非翻译区(UTR)或的局部编码序列的编码序列以增加在细胞溶质中积累的成熟信使的量。已经示出在植物和动物表达构建体的转录单元中包含可剪接内含子在mRNA和蛋白质水平两方面增加基因表达高达1000倍(Buchman and Berg(1988)MoI.Cell biol.8:4395-4405；Callis et al.(1987)Genes Dev 1:1183-1200)。当放置在转录单元的5’端附近时，基因表达的这种内含子增强通常是最大的。玉米内含子Adh1-S内含子1、2和6、Bronze-1内含子的应用在领域内是已知的。一般信息参见：TheMaize Handbook,Chapter 116,Freeling and Walbot,Eds.,Springer,N.Y.(1994)。

在一个实施方式中，通过使用基因编辑或靶向诱变实现增加的表达可以。

可以使用领域内已知的任何方法实现基因编辑。这里提出的一些非限制性实例包括使用CRISPR-Cas9系统。CRISPR/Cas9基因组编辑工具是商业上可获得的，如来自Clontech的“Guide-it”(Avenue du President Kennedy78100Saint-Germain-en-Laye,France)。另一种基因编辑的方法包括使用具有商业上可获得的试剂盒(例如，来自Addgene,1Kendall Sq.Ste.B7102,Cambridge,MA 02139,USA)的TALEN(转录活化子样效应器核酸酶)技术。另外的方法包括使用锌指核酸酶，如可获自Sigma-Aldrich的Zinc Finger Nuclease Technology。另一种方法包括使用在Silva et al Curr GeneTher.Feb 2011；11(1):11–27(其教学通过引用结合于此)中描述的大范围核酸酶(或另外的方法)。又另外的方法是寡核苷酸指导的诱变(ODM)如可获自Keygene(Agro BusinessPark 90,6708PW Wageningen,The Netherlands)的

合适地，可以使用基因编辑以体内改变LBD氮响应性转录因子启动子的序列。

在本发明的另一个实施方式中，可以通过在植物内的表达多核苷酸(例如，外源性多核苷酸)实现LBD氮响应性转录因子的增加的表达，该多核苷酸包含编码LBD氮响应性转录因子的核酸序列。在一个实施方式中，所述多核苷酸(例如，外源性多核苷酸)包含与在所述植物中指导所述核酸序列转录的异源性启动子可操作地连接的编码LBD氮响应性转录因子的核酸序列。

在一些实施方式中，启动子可以选自由以下各项组成的组：组成型启动子、衰老特异性启动子、组织特异性启动子、发育调控的启动子和诱导型启动子。

在一个实施方式中，启动子可以是组成型启动子。

组成型启动子在植物发育期间持续地指导遍及植物不同部分的基因的表达，尽管这种基因不能在所有细胞类型中以相同的水平表达。已知组成型启动子的实例包括：与花椰菜花叶病毒35S转录本(Odell JT,Nagy F,Chua NH.(1985).Identification of DNAsequences required for activity of the cauliflower mosaic virus 35Spromoter.Nature.313 810-2)、水稻肌动蛋白1基因(Zhang W,McElroy D,Wu R.(1991).Analysis of rice Act1 5'region activity in transgenic rice plants.Plant Cell3 1155-65)和玉米泛素1基因(Cornejo MJ,Luth D,Blankenship KM,Anderson OD,BlechlAE.(1993).Activity of a maize ubiquitin promoter in transgenic rice.PlantMolec.Biol.23567-81)有关的那些。组成型启动子如香石竹蚀环病毒(CERV)启动子(HullR,Sadler J,LongstaffM(1986)The sequence of carnation etched ring virus DNA:comparison with cauliflower mosaic virus and retroviruses.EMBO Journal,5(2):3083-3090)。

组成型启动子可以选自：香石竹蚀环病毒(CERV)启动子、花椰菜花叶病毒(CaMV35S启动子)、来自水稻肌动蛋白1基因或玉米泛素1基因的启动子。

合适地，启动子可以是CERV启动子。

在一个实施方式中，启动子可以是衰老特异性启动子。

“衰老特异性启动子”(SAG)可以是与控制衰老相关基因的表达相关的启动子。因此，启动子可以将可操作地连接于其的编码序列(即基因)的表达基本上排他地限制在开始衰老的组织中。因此，衰老特异性启动子可以是能够以发育调控方式在植物组织中偏好地促进基因表达的启动子，使得3’蛋白质编码区域的表达基本上仅在植物组织经受衰老时发生。令人高兴的是衰老趋向于发生在植物的较老部分，如较老的叶子，而不是发生在植物的较年轻部分，如种子。

已知表达很多衰老相关基因的植物的一个实例是拟南芥。因此，可以从拟南芥的衰老相关基因中分离衰老特异性启动子。Gepstein et al.(The Plant Journal,2003,36,629-642)使用拟南芥作为模型进行了SAG和其启动子的详细研究。遗传构建体可以包含来自该文献中公开的任何SAG的启动子。例如，合适的启动子可以选自由以下各项组成的组：SAG12、SAG13、SAG101、SAG21和SAG18或它们的功能性变体或功能性片段。

在一个实施方式中，启动子可以是SAG12启动子，其是熟练技师已知的或是其功能性变体或功能性片段(Gan&Amasino,1997,Plant Physiology,113:313-319)。

合适的启动子和它们的序列可见于WO2010/097623，其通过引用结合于此。

在另一个实施方式中，启动子可以是组织特异性启动子。

组织特异性启动子是在植物的一个(或几个)部分中、通常贯穿那些植物部分的生命周期指导基因的表达的启动子。组织特异性启动子的分类通常还包括其特异性不绝对的启动子，即，它们也可以在除优选的组织以外的组织中以较低的水平指导表达。

一些组织特异性启动子在领域内是已知的并且包括与在马铃薯块茎中表达的马铃薯糖蛋白基因和在小麦、大麦或玉米胚乳中表达的高分子量麦谷蛋白基因有关的那些。

合适地，组织特异性启动子可以是叶片特异性启动子。合适的叶片特异性启动子可以包括ASYMMETRIC LEAVES 1(AS1)。

在另一个实施方式中，启动子可以是发育调控启动子。

发育调控启动子在植物发育期间的特定时间、在植物的一个或多个部分中指导基因表达的变化。该基因可以在其他时间、在那个植物部分中以不同的(通常较低的)水平表达，并且也可以在其他植物部分中表达。

在一个实施方式中，启动子可以是诱导型启动子。

诱导型启动子能够响应诱导物而指导基因的表达。在不存在诱导物的情况下，基因不会被表达。诱导物可以直接作用于启动子序列上或可以通过阻碍抑制物分子的效果起作用。诱导物可以是化学试剂如代谢物、蛋白质、生长调节剂或有毒元件，生理应激如热、伤害或渗透压或是病原体或害虫活动的间接结果。发育调控启动子可以被描述为特殊类型的诱导型启动子，其响应于由植物产生的内源性诱导物或响应于在植物的生命周期中特定点的环境刺激。已知的诱导型启动子的实例包括与以下各项有关的那些：伤害响应，如由Warner SA,Scott R,Draper J.(1993)所描述的(Isolation of an asparagusintracellular PR gene(AoPR1)wound-responsive promoter by the inversepolymerase chain reaction and its characterization in transgenictobacco.Plant J.3 191-201.)，温度响应，如由Benfey&Chua(1989)所公开的(Benfey,P.N.,and Chua,N-H.(1989)Regulated genes in transgenic plants.Science 244 174-181)，和化学诱导，如由Gatz(1995)所描述的(Gatz,C.(1995)Novel inducible/repressible gene expression systems.Methods in Cell Biol.50 411-424)。

因此，在一个实施方式中，启动子可以选自由以下各项组成的组：CERV启动子、花椰菜花叶病毒35S启动子(全长或截短的)、二磷酸核酮糖羧化酶启动子、豌豆质体蓝素启动子、胭脂碱合成酶启动子、叶绿素r/b结合启动子、高分子量麦谷蛋白启动子、α,β-醇溶蛋白启动子、大麦醇溶蛋白启动子和马铃薯糖蛋白启动子。

发明进一步提供了包含与叶片特异性启动子可操作地连接的编码LBD氮响应性转录因子的核酸的构建体或载体。

发明还提供了包含与衰老特异性启动子可操作地连接的编码LBD氮响应性转录因子的核酸的构建体或载体。

构建体可以包含在载体中。合适地，载体可以是质粒。

烟草植物

本发明提供了针对烟草植物以及烟草细胞、烟草植物和烟草繁殖材料的方法、应用。

在此使用的术语“烟草植物”指的是用于生产烟草产品的烟草属(genusNicotiana)植物。适合的烟草植物的非限制性实例包括红花烟草(N.tabacum)和黄花烟草(N.rustica)(例如，LA B21、LN KY171、Tl 1406、Basma、Galpao、Perique、Beinhart 1000-1和Petico)。这并不意在将术语“烟草”延伸至对生产烟草产品无用的烟草属物种。

因此，在一个实施方式中，烟草植物确实包括蓝茉莉叶烟草(N.plumbaginifolia)。

烟草材料可获自多种红花烟草(Nicotiana tabacum)物种的变种，通常被称为白肋(Burley)变种、熏制(flue)或鲜亮变种、深色变种和东方/土耳其变种。在一些实施方式中，烟草材料来源于白肋、弗尼吉亚(Virginia)、热风管处理的、风干的、烤干的、东方的或深色的烟草植物。烟草植物可以选自马里兰烟草、稀有烟草、特产(speciality)烟草、膨胀烟草等。

在此还考虑了对烟草栽培品系和精英烟草栽培品系(elite tobacco cultivar)的应用。因此，在此使用的烟草植物可以是烟草变种或精英烟草栽培品系。

特别有用的红花烟草(Nicotiana tabacum)变种包括白肋类型、深色类型、熏制类型和东方类型的烟草。

在一些实施方式中，烟草植物可以例如，选自以下变种中的一种或多种：红花烟草AA 37-1、红花烟草B 13P、红花烟草克桑西(Mitchell-Mor)、红花烟草KT D#3杂交种107、红花烟草Bel-W3、红花烟草79-615、红花烟草Samsun Holmes NN、来自杂交红花烟草BU21×红花烟草Hoja Parado的F4，株系97、红花烟草KTRDC#2杂交种49、红花烟草KTRDC#4杂交种110、红花烟草白肋21、红花烟草PM016、红花烟草KTRDC#5KY 160SI、红花烟草KTRDC#7FCA、红花烟草KTRDC#6TN 86SI、红花烟草PM021、红花烟草K 149、红花烟草K 326、红花烟草K 346、红花烟草K358、红花烟草K 394、红花烟草K 399、红花烟草K 730、红花烟草KY 10、红花烟草KY 14、红花烟草KY 160、红花烟草KY 17、红花烟草KY 8959、红花烟草KY 9、红花烟草KY907、红花烟草MD 609、红花烟草McNair373、红花烟草NC 2000、红花烟草PG 01、红花烟草PG04、红花烟草P01、红花烟草P02、红花烟草P03、红花烟草RG 1 1、红花烟草RG 17、红花烟草RG 8、红花烟草Speight G-28、红花烟草TN 86、红花烟草TN 90、红花烟草VA 509、红花烟草AS44、红花烟草Banket A1、红花烟草Basma Drama B84/31、红花烟草Basma I Zichna ZP4/B,红花烟草Basma Xanthi BX 2A,红花烟草Batek,红花烟草Besuki Jember、红花烟草C104、红花烟草Coker 319、红花烟草Coker 347、红花烟草Criollo Misionero、红花烟草PM092、红花烟草Delcrest、红花烟草Djebel 81、红花烟草DVH 405、红花烟草GalpaoComum、红花烟草HB04P、红花烟草Hicks Broadleaf、红花烟草Kabakulak Elassona、红花烟草PM102、红花烟草Kutsage E1、红花烟草KY 14xL8、红花烟草KY 171、红花烟草LA BU 21、红花烟草McNair 944、红花烟草NC 2326、红花烟草NC 71、红花烟草NC 297、红花烟草NC 3、红花烟草PVH 03、红花烟草PVH 09、红花烟草PVH 19、红花烟草PVH 21 10、红花烟草RedRussian、红花烟草Samsun、红花烟草Saplak、红花烟草Simmaba、红花烟草Talgar 28、红花烟草PM132、红花烟草Wislica、红花烟草Yayaldag、红花烟草NC 4、红花烟草TR Madole、红花烟草Prilep HC-72、红花烟草Prilep P23、红花烟草Prilep PB 156/1、红花烟草PrilepP12-2/1、红花烟草Yaka JK-48、红花烟草Yaka JB 125/3、红花烟草ΤI-1068、红花烟草KDH-960、红花烟草TI-1070、红花烟草TW136、红花烟草PM204、红花烟草PM205、红花烟草Basma、红花烟草TKF 4028、红花烟草L8、红花烟草TKF 2002、红花烟草TN90、红花烟草GR141、红花烟草Basma xanthi、红花烟草GR149、红花烟草GR153和红花烟草Petit Havana。

变种或栽培品系的非限制性实例为：BD 64、CC 101、CC 200、CC 27、CC 301、CC400、CC 500、CC 600、CC 700、CC 800、CC 900、Coker 176、Coker 319、Coker 371Gold、Coker 48、CD 263、DF91 1、DT 538LC Galpao tobacco、GL 26H、GL 350、GL 600、GL 737、GL939、GL 973、HB 04P、HB 04P LC、HB3307PLC、Hybrid 403LC、Hybrid 404LC、Hybrid 501LC、K 149、K 326、K 346、K 358、K394、K 399、K 730、KDH 959、KT 200、KT204LC、KY10、KY14、KY160、KY 17、KY 171、KY 907、KY907LC、KTY14xL8LC、Little Crittenden、McNair 373、McNair 944、msKY 14xL8、Narrow Leaf Madole、Narrow Leaf Madole LC、NBH 98、N-126、N-777LC、N-7371LC、NC 100、NC 102、NC 2000、NC 291、NC 297、NC 299、NC 3、NC 4、NC 5、NC6、NC7、NC 606、NC 71、NC 72、NC 810、NC BH 129、NC 2002、Neal Smith Madole、OXFORD207、PD 7302LC、PD 7309LC、PD 7312LC'Periq'e'tobacco、PVH03、PVH09、PVH19、PVH50、PVH51、R 610、R 630、R 7-1 1、R 7-12、RG 17、RG 81、RG H51、RGH 4、RGH 51、RS 1410、Speight 168、Speight 172、Speight 179、Speight 210、Speight 220、Speight 225、Speight 227、Speight 234、Speight G-28、Speight G-70、Speight H-6、Speight H20、Speight NF3、Tl 1406、Tl 1269、TN 86、TN86LC、TN 90、TN 97、TN97LC、TN D94、TN D950、TR(Tom Rosson)Madole、VA 309、VA359、AA 37-1、B 13P、Xanthi(Mitchell-Mor)、Bel-W3、79-615、Samsun Holmes NN、KTRDC number 2Hybrid 49、Burley 21、KY 8959、KY 9、MD 609、PG01、PG 04、P01、P02、P03、RG 1 1、RG 8、VA 509、AS44、Banket A1、Basma Drama B84/31、Basma I Zichna ZP4/B、Basma Xanthi BX 2A、Batek、Besuki Jember、C104、Coker 347、Criollo Misionero、Delcrest、Djebel 81、DVH 405、Galpao Comum、HB04P、HicksBroadleaf、Kabakulak Elassona、Kutsage E1、LA BU 21、NC 2326、NC 297、PVH 2110、RedRussian、Samsun、Saplak、Simmaba、Talgar 28、Wislica、Yayaldag、Prilep HC-72、PrilepP23、Prilep PB 156/1、Prilep P12-2/1、Yaka JK-48、Yaka JB 125/3、TI-1068、KDH-960、Tl-1070、TW136、Basma、TKF 4028、L8、TKF 2002、GR141、Basma xanthi、GR149、GR153、PetitHavana。即使在此没有明确地指出，也考虑低交换子(low converter)亚变种。

在一个实施方式中，烟草植物为白肋类型烟草植物，适合的是白肋PH2517。

在一个实施方式中，植物繁殖材料可以获自本发明的烟草植物。

在此使用的“植物繁殖材料”指的是取自植物的任何植物物质，从该物质可以生产其他植物。

合适地，植物繁殖材料可以是种子。

在一个实施方式中，本发明的烟草细胞、烟草植物和/或植物繁殖材料可以包含外源性LBD氮响应性转录因子。在另一个实施方式中，烟草细胞、烟草植物和/或植物繁殖材料可以包含根据本发明的构建体或载体。在另一个实施方式中，烟草细胞、烟草植物和/或植物繁殖材料是通过根据本发明的方法可获得的(例如，获得的)。

合适地，当与未修饰的烟草植物相比时，根据本发明的烟草植物可以包含减少量的至少一种烟草特有的亚硝胺，其中修饰是指在所述经修饰的植物中LBD氮响应性转录因子的活性或表达增加。

在一个实施方式中，根据本发明烟草植物包含本发明的烟草细胞。

在另一个实施方式中，植物繁殖材料是从本发明的烟草植物中可获得(例如，获得的)。

在另一个实施方式中，烟草细胞、烟草植物和/或植物繁殖材料可以包括：

i)在此示出为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5的多核苷酸序列或

ii)i)中示出的多核苷酸序列的片段，其功能性片段编码硝酸还原酶，硝酸还原酶通过一种或多种翻译后调控机制从调控中解耦合(decouple)，烟草中的硝酸还原酶通常经受所述机制或

iii)编码包含在此示出为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4或SEQ IDNO.6的氨基酸序列的多肽的多核苷酸或

iv)可以在高严格条件下与上述i)、ii)或iii)中教导的多核苷酸杂交的多核苷酸序列或

v)与上述i)、ii)或iii)中示出的多核苷酸具有至少70％(优选85％，更优选90％)同一性的多核苷酸序列或

vi)由于遗传密码的简并性而与i)、ii)或iii)中示出的多核苷酸不同的多核苷酸序列。

在一个实施方式中，多核苷酸序列可以与SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3或SEQ IDNO.5具有至少80％同一性。

合适地，多核苷酸序列可以与SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5具有至少90％同一性。

合适地，多核苷酸序列可以与SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5具有至少95％同一性(更合适地至少99％同一性)。

在另一个实施方式中，烟草细胞、烟草植物和/或植物繁殖材料可以包含LBD氮响应性转录因子，其包含在此示出为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6的多肽序列或包含具有在至少一个氨基酸处的保守替换的SEQ ID NO.2,SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6的多肽序列或与SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6具有至少70％同一性的多肽。

合适地，多肽可以与SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6具有至少80％同一性。更合适地，多肽可以与SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6具有至少90％同一性。特别地，多肽可以与SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6具有至少95％同一性。

最合适地，多肽可以与SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6具有至少99％同一性。

在一个实施方式中，提供了如在前述用于生产烟草产品的实施方式中，所提供的烟草细胞的应用。

此外，提供了在此描述的烟草植物培育烟草细胞的应用。

本发明还在另一个实施方式中，提供前述实施方式中，的烟草植物用于生产烟草产品的应用。

在另一个实施方式中，提供了本发明的烟草植物种植作物的应用。

氨基酸

在一个实施方式中，与未修饰的植物相比时，根据本发明修饰植物以增加LBD氮响应性转录因子的活性或表达可以获得植物中氨基酸的浓度改变。

在一个实施方式中，修饰植物以增加LBD氮响应性转录因子的活性或表达可以获得选自由以下各项组成的组的一种或多种氨基酸的浓度改变：组氨酸、天冬氨酸盐、天冬酰胺、谷氨酸盐、谷氨酰胺、苏氨酸和脯氨酸。

合适地，修饰植物以增加LBD氮响应性转录因子的活性或表达可以获得选自由以下各项组成的组的一种或多种氨基酸的浓度减少：组氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和苏氨酸。

合适地，修饰植物以增加LBD氮响应性转录因子的活性或表达可以获得选自由以下各项组成的组的一种或多种氨基酸的浓度增加：天冬氨酸盐、谷氨酸盐和脯氨酸。

产品

本发明同样提供了由根据本发明的烟草可获得的或获得的产物。

在一个实施方式中，提供了本发明的烟草植物生产烟叶的应用。

合适地，烟叶可以经受下游应用如加工。因此，在一个实施方式中，前述的实施方式的应用可以提供加工的烟叶。合适地，烟叶可以经受烘烤、发酵、巴氏杀菌或它们的组合。

在另一个实施方式中，烟叶可以被切割。在一些实施方式中，烟叶可以在经受烘烤、发酵、巴氏杀菌或它们的组合之前或之后被切割。

在一个实施方式中，本发明提供了本发明的烟草植物的收获的叶。

在进一步的实施方式中，收获的叶可以是从由本发明的繁殖材料繁殖的烟草植物中可获得的(例如，获得的)。

在另一个实施方式中，提供了从本发明的方法或应用中可获得的收获的叶。

合适地，收获的叶可以是切割的收获的叶。

在一些实施方式中，收获的叶可以包含活的烟草细胞。在其他的实施方式中，收获的叶可以经受进一步的加工。

同样提供了加工的烟叶。

加工的烟叶可以是从本发明的烟草植物可获得的。合适地，加工的烟叶可以是从以根据本发明的任何方法和/或应用中获得的烟草植物中可获得的。

在另一个实施方式中，加工的烟叶可以是从由根据本发明的烟草植物繁殖材料繁殖而来的烟草植物中可获得的。

本发明的加工的烟叶可以是通过加工本发明的收获的叶可获得的。

在此使用的术语“加工的烟叶”指的是已经经受一个或多个烟草在领域内经受的加工步骤的烟叶。“加工的烟叶”不包含或基本上不包含活的细胞。

术语“活的细胞”指的是能够生长和/或新陈代谢活跃的细胞。因此，如果细胞被认为不是活的，也被称为“非活的”，那么细胞就没有展示活细胞的特征。

术语“基本没有活细胞”指的是全部细胞的少于约5％是活的。优选少于约3％，更优选少于约1％，甚至更优选少于约0.1％的全部细胞是活的。

在一个实施方式中，加工的烟叶可以通过以下中的一种或多种来加工：烘烤、发酵和/或巴氏杀菌。

合适地，加工的烟叶可以通过烘烤来加工。

可以通过领域内已知的任何方法烘烤烟叶。在一个实施方式中，可以通过从包含风干、烤干、熏干和晒干的团体中选择的烘烤方法中的一种或多种烘烤烟叶。

合适地，烟叶可以是风干的。

典型地，通过将烟叶悬挂在通风良好的仓房中并使其干燥来实现风干。通常在四至八周的时间内完成。风干特别适合白肋烟草。

合适地，烟叶可以是烤干的。典型地，通过将烟叶悬挂在大仓房中、在其中连续或间歇式低闷烧地保持硬木的火焰实现烤干，并且取决于加工和烟草，通常需要三天至十周。

在另一个实施方式中，烟叶可以是熏干的。熏干可以包括将烟叶捆在烟叶梗上并将它们挂在熏制仓房的层柱(tier-pole)上。仓房通常具有自外部进料火箱运行的烟道。典型地，这使得烟草被熏干而没有暴露在烟雾中。通常整个烘烤进程中温度会慢慢升高，整个过程需要大约一周。

合适地，烟叶可以是晒干的。这种方法典型地包括将无遮盖的烟草暴露于阳光下。

合适地，加工的烟叶可以是通过发酵来加工的。

可以以领域中已知的任何方式进行发酵。典型地，在发酵期间，烟叶被堆成经烘烤的烟叶的堆(大块)，其被覆盖在如粗麻布中以保持水分。叶片里面剩余的水分和烟草的重量结合产生使烟草成熟的天然热量。每天监测大块中心的温度。在一些方法中，每周将整个大块打开。随后移动叶片使其摇动和湿润，翻转大块以便里面的叶片到外面来并将底部的叶片置于大块的顶部。这保证了整个大块中均匀的发酵。叶片上另外的水分，加上叶片自身的实际旋转产生热量，释放出烟草的天然氨并减少了尼古丁，同时还加深颜色并改善烟草的香气。典型地，取决于烟草的品种、柄在叶片上的位置、叶片的厚度和预期用途，发酵过程持续最高达6个月。

合适地，加工的烟叶可以是通过巴氏杀菌来加工的。当烟叶会被用于制作无烟烟草产品、最优选是鼻烟时，巴氏杀菌可以使特别优选的。

可以通过领域内已知的任何方法进行烟叶巴氏灭菌法。例如，可以按J Foulds,LRamstrom,M Burke,K Fagerstrom.Effect of smokeless tobacco(snus)on smoking andpublic health in Sweden.Tobacco Control(2003)12:349–359中所描述的细节进行巴氏灭菌法，其教导通过引用结合于此。

在鼻烟的生产期间，典型地通过用蒸汽热处理烟草24-36小时(达到约100℃的温度)的方法进行巴氏灭菌法。这产生几乎无菌的产品，并且不希望被理论束缚，结果中的一个被认为是对另外的TSNA形成的限制。

在一个实施方式中，巴氏灭菌法可以是蒸汽巴氏灭菌法。

在一些实施方式中，加工的烟叶可以被切割。加工的烟叶可以在加工之前或之后被切割。合适地，加工的烟叶可以在加工之后被切割。

在一些实施方式中，烟草植物、烟草植物的收获的叶和/或加工的烟叶可以用于提取尼古丁。可以通过使用领域内已知的任何方法实现尼古丁的提取。例如，US 2,162,738中教导了由烟草提取尼古丁的方法，其通过引用结合于此。

本发明的另一个方面提供了烟草产品。

在一个实施方式中，烟草产品可以是从本发明的烟草植物或其部分中制得。

合适地，烟草植物或其部分可以从根据本发明的烟草植物繁殖材料繁殖而来。

在烟草植物的背景下，在此使用的术语“其部分”指的是烟草植物的一个部分。优选地，“其部分”为烟草植物的叶片。

在另一个实施方式中，烟草产品可以制备自本发明的收获的叶。

在进一步的实施方式中，烟草产品可以制备自本发明的加工的烟叶。

合适地，烟草产品可以由烘烤、发酵和/或巴氏杀菌中的一种或多种的加工的烟叶制得。

合适地，烟草产品可以包括切割的烟叶，典型地按照前述实施方式可选地进行加工。

在一个实施方式中，烟草产品可以是吸烟物品(smoking article)。

在此使用的术语“吸烟物品”可以包括可吸烟产物，如卷烟、香烟、雪茄烟和小雪茄烟，无论其基于烟草、烟草衍生品、膨胀烟草、复原烟草还是基于烟草替代品。

在另一个实施方式中，烟草产品可以是无烟烟草产品。

在此使用的术语“无烟烟草产品”指的是不意在被吸烟和/或经受燃烧的烟草产品。在一个实施方式中，无烟烟草产品可以包鼻烟(snus)、鼻烟(snuff)、咀嚼烟草或类似物。

在进一步的实施方式中，烟草产品可以是烟草加热装置。

典型地在加热的生烟制品(smoking article)中，通过热量从热源至物理上分隔开的气溶胶生成基底或材料的传递产生气溶胶，其可以位于热源的内部、周围或下游。在吸烟期间，挥发性化合物由从热源传递的热量而从气溶胶生成基底中释放出来并夹带在通过(drawn through)生烟制品的空气中。随着释放的化合物冷却，它们凝结以形成被使用者吸入的气溶胶。

用于消费和吸用烟草加热装置的产生气溶胶的制品和装置领域内已知。例如，它们可以包括电加热的气溶胶生成装置，其中由从该气溶胶生成装置的一个或多个电热元件至烟草加热装置的气溶胶生成基底传输的热量产生气溶胶。

合适地，烟草加热装置可以是气溶胶生成装置。

优选地，烟草加热装置可以是加热但不燃烧(heat-not-burn)装置。加热但不燃烧装置是领域内已知的，并且通过加热而不是燃烧烟草来释放化合物。

合适的加热但不燃烧装置的实例可以是在WO2013/034459或GB2515502中教导的一种，其通过引用结合于此。

在一个实施方式中，烟草加热装置的气溶胶生成基底可以是根据本发明的烟草产品。

多核苷酸/多肽/构建体/方法

在本发明的一些实施方式中，编码目的蛋白(例如，LBD氮响应性转录因子)的嵌合基因可以被转化到植物细胞中，引起目的蛋白在启动子的指导下的受控表达。启动子可以获自包括动物、植物、真菌、细菌和病毒的不同来源。启动子也可以是合成构建的。

可以根据本发明以合适载体(例如，植物转化载体)的方式将外源基因引入植物中。植物转化载体可以包含表达盒，其含有在转录的方向上5’-3’的启动子序列、目的基因(例如，表达失调的(deregulated)硝酸还原酶)编码序列、可选地包括内含子、可选地3’非翻译的终止子序列(包括用于RNA聚合酶的停止信号和用于聚腺苷化酶的多腺苷酸化信号)。启动子序列可以以一个或多个拷贝存在，并且这些拷贝可以是上文描述的启动子序列的相同体或变体。终止子序列可获自植物、细菌或病毒基因。例如，合适的终止子序列为豌豆rbcS E9终止子序列、来源于根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的胭脂碱合成酶(nopaline synthase)基因的nos终止子序列以及来自花椰菜花叶病毒的35S终止子序列。本领域技术人员会很容易知道其他适合的终止子序列。

表达盒也可以包含基因表达增强机制以增加启动子的强度。这种增强子元件的实例是来源于豌豆质体蓝素基因的启动子的一部分，并且这是国际专利申请号WO 97/20056的主题。例如，合适的增强子元件可以是来源于根癌农杆菌的胭脂碱合成酶基因的nos增强子元件以及来自花椰菜花叶病毒的35S增强子元件。这些调控区可以来源于与启动子DNA序列相同的基因或可以来源于不同的基因，来自烟草或其他生物体，例如，来自茄科家族或来自Cestroideae亚族的植物。所有的调控区应当能够在待转化的组织的细胞中操作。

启动子DNA序列可以来源于与在本发明中使用的目的基因(例如，启动子将要指导的基因，例如，编码植物的修饰以增加LBD氮响应性转录因子的活性或表达的基因)编码序列相同的基因或可以来源于不同的基因，来自烟草或另一个有机体，例如，来自茄科家族的植物或来自Cestroideae亚族。当提及“嵌合基因时”，其指的是编码目的基因(例如，编码表达失调的硝酸还原酶的基因)的核酸序列来源于与指导其表达的启动子序列不同的来源(例如，来自不同的基因或来自不同的物种)。

表达盒可以被并入基本植物转化载体如pBIN 19Plus、pBI 101或本领域内已知的其他合适的植物转化载体中。除表达盒外，植物转化载体会包含转化过程所必需的这种序列。这些可以包括农杆菌属vir基因，一种或多种T-DNA边界序列和可选择标志物或其他识别转基因植物细胞的方式。

术语“植物转化载体”指的是能够体内或体外表达的构建体。优选地，表达载体被并入(incorporated)至有机体的基因组中。术语“并入”优选地覆盖稳定并入基因组。

用于转化植物的技术在本领域内是已知的并且包括例如农杆菌介导的转化。构建遗传修饰的植物的基本原则是在植物基因组中插入遗传信息以取得对所插入的遗传物质的稳定保持。一般技术的综述可件于Potrykus(Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol[1991]42:205-225)和Christon(AgroFood-Industry Hi-Tech March/April1994 17-27)的文章中。

典型地，在农杆菌介导的转化中，通过农杆菌与来自靶标植物的外植体的共培养，将携带目的外源DNA即嵌合基因的双元载体(binary vector)由合适的农杆菌属菌株转移至靶标植物。然后在选择培养基中再生转化的植物组织，选择培养基包含可选择标志物和植物生长激素。可代替选项是浸花法(Clough&Bent,1998)，其中，使完整植物的花芽与包含嵌合基因的农杆菌菌株的悬浮液接触，并且在坐果后，通过在选择性培养基上生长来发芽和识别转化的个体。植物组织被农杆菌直接感染是已被广泛采用的简单技术，并且其描述于Butcher D.N.et al.,(1980),Tissue Culture Methods for Plant Pathologists,eds.:D.S.Ingrams and J.P.Helgeson,203-208。

另外的适合的转化方法包括例如，使用聚乙二醇或电穿孔技术、粒子轰击、微量注射和使用碳化硅纤维的直接基因转入原生质体。

使用轰击转化(ballistic transformation)来转化植物，包括Frame B R,Drayton P R,Bagnaall S V,Lewnau C J,Bullock W P,Wilson H M,Dunwell J M,Thompson J A&Wang K(1994)中教导的碳化硅晶须技术。The Plant Journal 6:941-948中教导了通过碳化硅晶须介导的转化生产育性转基因玉米植物，以及例如，在Meyer P,Heidmmm I&Niedenhof I(1992)中教导了病毒转化技术。在Gene 110:213-217中教导了使用木薯花叶病毒作为用于植物的载体系统。关于植物转化的更多教导可以在EP-A-0449375中找到。

在进一步的方面，本发明涉及一种载体系统，其携带编码目的基因(例如，编码表达失调的硝酸还原酶的基因)的核苷酸序列并将它引入有机体如植物的基因组。载体系统可以包含一种载体，但它可以包含两种载体。在两种载体的情况下，载体系统通常被称为双元载体系统。在Gynheung Anetal,(1980),Binary Vectors,Plant Molecular BiologyManual A3,1-19中进一步详细地描述双元载体系统。

用于植物细胞的转化的一种广泛应用的系统使用来自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的Ti质粒或来自发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的Ri质粒，Anetal.,(1986),Plant Physiol.81,301-305and Butcher D.N.et al.,(1980),Tissue Culture Methods for Plant Pathologists,eds.:D.S.Ingrams andJ.P.Helgeson,203-208。在植物中引入根据本发明的所需外源基因的方法后，另外的DNA序列的存在和/或插入可能是必要的。已在EP-A-120516；Hoekema,in:The Binary PlantVector System Offset-drukkerij Kanters B.B.,Amsterdam,1985,Chapter V；Fraley,etal.,Crit.Rev.Plant Sci.,4:1-46；and Anetal.,EMBO J(1985)4:277-284中仔细研究并描述了应用T-DNA用于转化植物细胞。

用编码目标蛋白(例如，LBD氮响应性转录因子)的外源基因转化的植物细胞可以根据已知的组织培养方法生长和维持，如通过将细胞培养在补充有必须的生长因子如氨基酸、植物激素、维生素等的合适的培养介质中培养细胞。

涉及本发明的术语“转基因植物”包括包含编码目标基因(例如，根据本发明的编码LBD氮响应性转录因子的基因)的外源基因的任何植物。优选地，外源基因被结合至植物的基因组中。

术语“转基因植物”和“嵌合基因”不包括当在其天然启动子(也在其自然环境中)的控制下时、在其自然环境中编码序列的天然核苷酸。

在一个方面，根据本发明的核酸序列、嵌合基因、植物转化载体或植物细胞处于分离的形式。术语“分离的”指的是序列至少基本上没有至少一种其他组分，该序列本质上与该组分天然地相关并且是如在自然界中发现的那样。

在一个方面，根据本发明的核酸序列、嵌合基因、植物转化载体或植物细胞处于纯净的状态。术语“纯净的”指的是在一个相对纯净的状态，例如，至少约90％纯净或至少约85％纯净。

在此使用的术语“核苷酸序列”指的是寡核苷酸序列或多核苷酸序列，以及它们的变体、类似物、片段和衍生物(如它们的部分)。核苷酸序列可以是基因组的或合成的或重组体的起源的，其可以是双链的或单链的而无论代表有义链还是无义链。

本发明涉及的术语“核苷酸序列”包含基因组DNA、cDNA、合成DNA和RNA。优选其表示DNA，更优选其表示为本发明编码的cDNA序列。

在一种优选的实施方式中，当涉及并包括本发明本身的范围时，核苷酸序列不包括根据本发明的天然核苷酸序列，当在其自然环境中时和当与其自然相关的序列(也在其自然环境中)相关时。为了便于参考，我们应当将这种优选的实施方式称为“非天然核酸序列”。在此方面，术语“天然核苷酸序列”指的是在其天然环境中并且当与整个启动子(其是该序列天然相关的)可操作地连接时的整个核苷酸序列，启动子也在其天然环境中。然而，本发明的范围所覆盖的氨基酸序列可以在其天然有机体中在核苷酸序列的表达后被分离和/或纯化。然而，优选地，本发明的范围所覆盖的氨基酸序列可以在其天然有机体中由核苷酸序列表达，但其中该核苷酸序列不受再处于在该有机体内与该序列自然相关的启动子的控制下。

典型地，本发明的范围所覆盖的核苷酸序列是使用重组DNA技术(例如，重组DNA)制备的。然而，在本发明的可替代的实施方式中，核苷酸序列可以是使用领域内已知的化学方法以其整体或局部合成的(参见Caruthers MH et al.,(1980)Nuc Acids Res Symp Ser215-23and Horn T et al.,(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 225-232)。

编码具有在此定义的具体性质的蛋白质或是适用于修饰的蛋白质的核苷酸序列可以识别自和/或分离自和/或纯化自产生所述蛋白质的任何细胞或有机体。领域内已知多种用于识别和/或分离和/或纯化方法核苷酸序列的方法。举例来说，在合适的序列已被识别和/或分离和/或纯化后，可以使用PCR扩增技术来制备更多序列。

进一步举例来说，可以利用来自产生酶的有机体的染色体DNA或信使RNA来构建基因组DNA和/或cDNA文库。如果已知酶的氨基酸序列，可以合成标记的寡核苷酸探针并用于从制备自有机体的基因组库中识别编码酶的克隆。可替代地，包含与另一种已知的酶基因同源的序列的标记的寡核苷酸探针可以被用于识别编码酶的克隆。在后一种情况下，使用较低严格的杂交和洗涤条件。

在进一步的可选替换方式中，编码酶的核苷酸序列可以是通过已建立的标准化方法合成制备的，方法例如由Beucage S.L.et al.,(1981)Tetrahedron Letters 22,p1859-1869描述的亚磷酰胺方法(phosphoroamidite method)或由Matthes et al.,(1984)EMBO J.3,p 801-805描述的方法。在亚磷酰胺方法中，在例如自动DNA合成器中合成寡核苷酸，纯化、退火、切割和克隆在合适的载体中。

核苷酸序列可以是混合的基因组和合成的来源、混合的合成和cDNA的来源或混合的基因组和cDNA的来源，它们是按照标准技术通过连接合成的、基因组的或cDNA的来源(视情况而定)的片段而制备的。每个被连接的片段对应于整个核苷酸序列的各种部分。还可以通过使用特定引物的聚合酶链反应(PCR)制备DNA序列，例如，在US 4,683,202或Saiki R Ket al.(Science(1988)239,pp 487-491)中所描述的。

本发明的范围还包括具有在此定义的具体性质的酶的氨基酸序列。

在此使用的术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“肽”同义。在某些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。在某些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“酶”同义。

氨基酸序列可以制备自和/或分离自合适的来源，或者它可以是合成制备的，或者它可以是通过使用DNA重组技术制备的。

优选地，当涉及并由本发明本身的范围覆盖时，氨基酸序列不是天然的酶。在此方面，术语“天然的酶”指的是在其天然环境中并且当其已被其天然核苷酸序列表达时的整个酶。

本发明还覆盖与多肽的氨基酸序列具有一定程度的序列同一性或序列同源性的序列的应用，该多肽具有在此限定的具体性质或是编码这种多肽(以下简称“同源序列”)的任何核苷酸序列。这里，术语“同源物”指的是与主题氨基酸序列和主体核苷酸序列具有一定同源性的实体。这里，术语“同源”可以等同于“同一性”。

同源氨基酸序列和/或核苷酸序列和/或片段应当提供和/或编码保持酶的功能活性和/或提高酶的活性的多肽。

典型地，同源序列会例如包含与受试者氨基酸序列相同的活性位点等等，或者会将编码相同的活性位点。尽管同源也可以在相似性方面进行考虑(即，具有相似化学性质/功能的氨基酸残基)，但在本发明的背景下，优选在序列同一性方面表达同源性。

在一个实施方式中，同源序列被包含在氨基酸序列或核苷酸序列中，与受试者序列相比，其有一个或几个添加、删除和/或替换。

在一个实施方式中，本发明涉及其氨基酸序列是在此示出的蛋白质，或是通过替换、删除或添加一个或几个氨基酸(如在亲本蛋白质的氨基酸序列中的2、3、4、5、6、7、8、9个氨基酸或更多氨基酸，如10个或多于10个氨基酸)而来源于该(亲本)蛋白质并具有亲本蛋白活性的蛋白质。

在一个实施方式中，本发明涉及这样的核酸序列(或基因)：编码其氨基酸序列是在此示出的蛋白质，或编码通过替换、删除或添加一个或几个氨基酸(如在亲本蛋白的氨基酸序列中的2、3、4、5、6、7、8、9个氨基酸或更多氨基酸，如10个或多于10个氨基酸)而来源于该(亲本)蛋白质并具有亲本蛋白活性的蛋白质。

同源性或同一性比较可以通过眼睛进行或者更常见的是，在的可用的序列比较程序的帮助下进行。这些商业上可获得的计算机程序可以计算出两个或更多序列之间的％同源性。

可以计算连续序列的％同源性或％同一性，即一个程序与另一个程序对齐，并且一个序列中的每个氨基酸与另一个序列中的相应氨基酸直接比较，每次一个残基。这就是所谓的“无空位”对齐。典型地，这样的无空位对齐仅在相对短数目的残基上执行。

虽然是一种非常简单和一致的方法，但这种方法没有考虑，例如，在一对完全相同的序列中，一个插入或删除将会引起随后的氨基酸残基无法对齐，这样有可能导致在执行全局对比时在％同源性方面的大的降低。因此，大多数的序列比较方法被设计以产生最优的对齐，它们考虑可能的插入和删除而对整体同源性分数进行过度罚分。这是通过在序列对齐中插入“空位”以尝试使局部同源性最大化而实现的。

然而，这些更复杂的方法将“空位罚分”分配给在对齐中的发生的每个空位，使得对于相同数目的同一氨基酸而言，以尽可能少的空位进行序列对齐(反映出两个进行对比的序列之间更高的关联性)会获得比具有多个空位的序列对比更高的分数。通常使用“仿射空位成本(affine gap costs)”，其对空位的存在收取(charge)较高成本而对空位中每个随后的残基收取较小罚分。这是最常用的空位评分系统。高空位罚分当然会产生具有较少空位的优化的对齐。大多数对齐程序允许修改空位罚分。但是，在使用这样的软件用于序列比较时，优选使用默认值。

考虑到空位罚分，最大的％同源性的计算首先需要产生最优的对齐。用于实施这种对齐的合适的电脑程序为Vector NTI(Invitrogen Corp.)。可以执行序列比较的软件的实施例包括，但不限于例如，BLAST软件包(参见Ausubel et al 1999Short Protocols inMolecular Biology,4th Ed-Chapter 18)、BLAST 2(参见FEMS Microbiol Lett 1999 174(2):247-50；FEMS Microbiol Lett 1999 177(1):187-8和tatiana@ncbi.nlm.nih.gov)、FASTA(Altschul et al 1990J.Mol.Biol.403-410)和AlignX。至少BLAST、BLAST 2和FASTA可以用于离线和在线搜索(参见Ausubel et al 1999,pages 7-58to 7-60)。

尽管可以以同一性测量最终的％同源性，但对齐方法本身通常不是基于全或无的配对比较。相反地，通常使用比例相似性得分矩阵，其基于化学相似性或进化距离将分数分配至每个成对的比较。通常使用的这种矩阵的实例是LOSUM62矩阵-用于程序的BLAST套件的默认矩阵。Vector NTI程序通常使用公共默认值或自定义符号对照表，如果提供的话(更多细节参见用户手册)。对于某些应用，优选使用用于Vector NTI包的默认值。

可替代地，使用Vector NTI(Invitrogen Corp)中的多重对比特征，可以计算百分比同源性，它基于一种算法，类似于CLUSTAL(Higgins DG&Sharp PM(1988),Gene 73(1),237-244)。

一旦软件产生了最优对齐方式，就可能计算％同源性，优选％序列同一性。软件典型地将这作为序列比较的一部分并产生数值结果。

在确定序列同一性时，应当使用空位罚分，然后优选地使用以下参数用于配对比较：

对于BLAST
		空位打开	0
空位延伸	0

对于CLUSTAL	DNA	蛋白质
				字长	2	1	K三倍
空位罚分	15	10
				空位延伸	6.66	0.1

在一个实施方式中，可以连同上面定义的空位罚分和空位延伸设置使用CLUSTAL。

在一些实施方式中，用于BLAST或CLUSTAL对齐的空位罚分可以不同于以上详述的那些。技术人员会意识到可以定期改变用于执行BLAST和CLUSTAL对齐的标准参数，并且在那个时候能够基于针对BLAST或CLUSTAL对齐算法详述的标准参数选择合适的参数。

合适地，在至少20个连续的核苷酸上、优选在至少30个连续的核苷酸上、优选在至少40个连续的核苷酸上、优选在至少50个连续的核苷酸上、优选在至少60个连续的核苷酸上、优选在至少100个连续的核苷酸上确定关于核苷酸序列的同一性的程度。

合适地，有关于核苷酸序列的同一性程度可以在整个序列上决定。

序列也可能具有氨基酸残基的删除、插入或替换，这产生沉默(silent)的变化并产生功能上等价的物质。可以基于残基在极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性质方面的相似性进行仔细考虑的氨基酸替换，只要保留物质的二级结合活性即可。例如，带负电的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；并且具有相似亲水性值的带有不带电极性头基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。

例如，可以根据下表进行保守替换。第二列中相同单元格并且优选在第三列的相同行中的氨基酸可以互相替换：

本发明也涵盖了可以出现的同源替换(在此使用的替换(substitution)和代替(replacement)都指的是已存在的氨基酸残基与可替换的残基的互相交换)，即，相似的替换相似的(like-for-like substitution)，如碱性的替换碱性的、酸性的替换酸性的、极性的替换极性的，等等。同样也可能发生非同源替换，即，由一类残基至另一类，或可替代地，涉及包含非天然的氨基酸如鸟氨酸(以下简称Z)、二氨基丁酸鸟氨酸(以下简称B)、正亮氨酸鸟氨酸(以下简称O)、吡啶基丙氨酸(pyriylalanine)、噻吩基丙氨酸(thienylalanine)、萘基丙氨酸(naphthylalanine)和苯基甘氨酸。

也可以是由非天然氨基酸进行代替，包含；α*和α-双取代的*氨基酸、N-烷基氨基酸*、乳酸*，天然氨基酸的卤化衍生物如三氟酪氨酸*、p-Cl-苯基丙氨酸*、p-Br-苯基丙氨酸*、p-I-苯基丙氨酸*、L-烯丙基-甘氨酸*、β-丙氨酸*、L-α-氨基丁酸*、L-γ-氨基丁酸*、L-α-氨基异丁酸*、L-ε-氨基己酸#、7-氨基庚酸*、L-甲硫氨酸砜#*、L-正亮氨酸*、L-正缬氨酸*、p-硝基-L-苯基丙氨酸*、L-羟基脯氨酸#、L-硫代脯氨酸*、苯基丙氨酸(Phe)的甲基衍生物如4-甲基-Phe*、五甲基-Phe*、L-Phe(4-氨基)#、L-Tyr(甲基)*、L-Phe(4-异丙基)*、L-Tic(1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸)*、L-二氨基丙酸#和L-Phe(4-苄基)*。为了如上讨论的目的(涉及同源或非同源替换)，使用符号*表示衍生物的疏水性而使用#表示衍生物的亲水性，#*表示两亲的特性。

变体氨基酸序列可以包括合适的间隔子基团，其可以插在任意两个氨基酸残基之间，除氨基酸间隔子之外，氨基酸残基的序列包含烷基如甲基、乙基或丙基基团，如甘氨酸或β-丙氨酸残基。本领域技术人员会很好理解变体的另外的形式，包括在类肽形式中存在一种或多种氨基酸残基。为了避免疑惑，使用的“类肽形式”指的是这样的变体氨基酸残基，其中α-碳取代基在残基的氮原子上，而不是在α-碳上。以类肽形式制备多肽的方法是本领域内已知的，例如，Simon RJ et al.,PNAS(1992)89(20),9367-9371and Horwell DC,Trends Biotechnol.(1995)13(4),132-134。

用于本发明中的核苷酸序列可以包括在其中的合成的或修饰的核苷酸。对寡核苷酸的许多不同类型的修饰是领域内已知的。这些包括甲基磷酸酯和硫代磷酸酯骨架和/或在分子的3’端或5’端添加吖啶或聚赖氨酸链。对于本发明的目的，需要理解的是可以通过领域内任何可用的方法修饰在此描述的核苷酸序列。可以实施这种修饰以提高本发明的核苷酸序列的体内活性和寿命。

本发明还涵盖与本发明的核酸序列互补的序列或能够与本发明的序列或其互补的序列杂交的序列。

在此使用的术语“杂交”将包括“通过其使核酸的一个链经碱基配对与互补链结合的方法”，以及如在聚合酶链反应(PCR)技术中进行的扩增方法。

本发明还涉及与本发明的核苷酸序列杂交的核苷酸序列(包括在此提出的那些的互补序列)。

优选地，在严格的条件下检测杂交(例如，50℃和0.2xSSC{1xSSC＝0.15M NaCl,0.015M Na₃柠檬酸盐pH 7.0})。

更优选地，在高严格条件下检测杂交(例如，65℃和0.1xSSC{1xSSC＝0.15M NaCl,0.015M Na3citrate pH 7.0})。

一个方面，本发明使用的序列是合成序列-即通过体外的化学或酶的合成制备的序列。它包括但不限于使用针对宿主有机体的最优化密码子制成的序列。

术语“表达载体”指的是能够体内或体外表达的构建体。

优选地，表达载体被结合至合适宿主有机体的基因组中。术语“结合”优选地包括稳定结合在基因组中。

本发明的核苷酸序列可以存在于载体中，在其中核苷酸序列可操作地连接至调控序列，能够由合适宿主有机体提供核苷酸序列的表达。

本发明中使用的载体可以转化至在此描述的合适宿主细胞中以提供本发明的多肽的表达。

载体的选择例如质粒、粘粒或噬菌体载体经常取决于待引入载体的宿主细胞。

载体可以体外使用，例如，用于生产RNA或用于转染、转化、转导或感染宿主细胞。

因此，在进一步的实施方式中，发明提供了通过将本发明的核苷酸序列引入可复制载体中、将载体引入相容的宿主细胞中以及使宿主细胞在引起载体复制的条件下生长来制备本发明的核苷酸序列的方法。

载体可以进一步包含使得载体能够在讨论的宿主细胞中复制的核苷酸序列。这些序列的实例为质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1和pIJ702的复制起点。

在一些应用中，用于在本发明中使用的核苷酸序列可操作地连接至调控序列，其能够提供用于核苷酸序列的表达，如通过选定的宿主细胞。举例来说，本发明涵盖含有可操作地连接至这种调控序列的本发明的核苷酸序列的载体，即，该载体为表达载体。

术语“可操作地连接”指的是这样的并置(juxtaposition)：在其中，所记载的组分处于允许它们以其预期的方式行使功能的关系中。调控序列“可操作地连接”至编码序列是连接(ligated)，以这种方式在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。

术语“调控序列”包含启动子和增强子以及其他表达调控信号。

术语“启动子”以领域内的通常意义使用，例如，RNA聚合酶结合位点。

也可以通过选择异源调节区例如启动子、分泌前导和终止子区来实现编码本发明的酶的核苷酸序列的增强的表达。

优选地，根据本发明的核苷酸序列至少与启动子可操作地连接。

术语“构建体”-与术语如“结合物”、“盒”和“杂交体”同义-包括用于根据本发明使用的核苷酸序列，其直接或间接附着于启动子。

间接附着的实例为提供合适的间隔子基团如内含子序列，如Sh1-内含子或ADH内含子，在本发明的启动子和核苷酸序列之间起媒介作用。同样的道理，本发明涉及的术语“融合”包含直接或间接地附着。在一些情况下，这些术语不涵盖通常与野生型基因启动子相关的编码蛋白质的核苷酸序列的天然组合(并且当它们均在其自然环境中时)。

这种构建体甚至可以包含或表达允许对基因构建体进行选择的标志物。

可以在Potrykus(Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol[1991]42:205-225)和Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 199417-27)的文章中找到用于转化植物的常用技术的综述。关于植物转化的进一步教导可以在EP-A-0449375中找到。

除非另有定义，在此使用的所有技术和科学术语都具有与本公开所属技术领域内普通技术人员的通常理解相同的含义。Singleton,et al.,DICTIONARY OF MICROBIOLOGYAND MOLECULAR BIOLOGY,20ED.,John Wiley and Sons,New York(1994)和Hale&Marham,THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY,Harper Perennial,NY(1991)想本领域技术人员提供了许多在本公开中使用的术语的综合词典。

本公开并不限于在此公开的示例性方法和材料，在实践或测试本公开的实施方式中，可以使用与在此描述的那些相似或等价的任何方法和材料。数值的范围包括限定该范围的数值。除非另有指出，所有核酸序列均以5’至3’取向由左至右书写；氨基酸序列以氨基至羧基方向取向由左至右书写。

在此提供的标题不限制本公开的很多方面或实施方式，可以通过以整体参考说明书来具有它们。因此，通过以整体参考说明书来更完整地限定下面定义的术语。

在此使用氨基酸名字、三字母缩写或单字母缩写提及氨基酸。

在此使用的术语“蛋白质”，包括蛋白质、多肽和肽类。

如在此所使用的，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”同义。在某些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。在某些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“酶”同义。

术语“蛋白质”和术语“多肽”在此可以互换使用。在本公开和权利要求中，可以使用氨基酸残基的惯例的单字母和三字母代码。所定义的用于氨基酸3字母代码符合IUPACIUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature(JCBN)。也可以了解的是，由于遗传密码的简并性，多肽可以由多于一个的核苷酸序列编码。

术语的其他定义可以出现在整个说明书中。在更详细地描述示例性实施方式之前，需要了解的是本公开不限于所描述的特定实施方式，当然，这样可以是不同的。还要了解的是，在此使用的术语仅是为了描述特定的实施方式，而不是意在限制，因为本公开的范围将只受随附的权利要求的限制。

对于所提供的数值的范围，除非上下文另有明确规定，否则理解的是，还公开了在该范围的上限和下线之间的每个中间值、至下限单元的十分之一。在任何记载的至之间的每个小范围、或在记载的范围中的中间值、以及在记载的范围中的任何记载的或中间的值均涵盖在本公开中。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在范围内或从中排除，并且其中两者(上限和下限)任一个、两者都不或两者都是被包括在较小范围内的每个范围也包含在本公开中，服从规定范围内的任何明确排除限制。在所记载的范围包括一个或两个极限值时，排除了那些包括的极限值中的任一个或两者的范围的同样包含在本公开中。

必须注意的是，除非上下文另有明确规定，否则在此和在附加的权利要求中使用的，单数形式的“一种(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数的指代词。因此，例如，提及“一种酶”或“一种硝酸还原酶”包括本领域技术人员已知的多个这类候选试剂和其等价物，等等。

提供在此讨论的出版物仅因为它们的公开早于本应用的申请日期。在此的任何公开内容都不被解释为承认该出版物构成随附的权利要求的现有技术。

优势

与本发明相关的关键优势为减少制备自未被修饰以增加LBD氮响应性转录因子的活性或表达的烟草植物的烟草产品中烟草特有的亚硝胺浓度(例如，NNK)。

现在，将参考下面的附图和实施例、仅以实例的方式描述本发明。

实施例

实施例1

LBD克隆

从A.拟南芥cDNA分离LBD基因LBD37(At5g67420.1)、LBD38(At3g49940.1)和LBD39(At4g37540.1)。它们被初步克隆到穿梭载体(可购自Life Technologies)中，随后被转化到包含组成型香石竹蚀环病毒(CERV)启动子、SAG12衰老特异性启动子和胭脂碱合成酶(nos)终止子的pBNP双元载体中。在所有的序列分析都已认定构建体正确之后，它随后被转化到农杆菌LBA4404中(可购自Clontech Laboratories,Inc.)并转化到白肋PH2517中。

实施例2

烟草的转化

如由Horsch et al.(Science 227:1229-1231,1985)所描述的，使用叶盘共培养方法转化白肋PH2517植物。

在50mL的LB肉汤加1g/L葡萄糖连同相关抗生素中建立经转化的农杆菌的过夜培养物。在27℃下生长，直到达到0.6至0.99之间的OD₆₀₀。

从7周的烟草植物中获取最年轻的两个完全展开的叶片并在8％的Domestos^TM中进行表面杀菌10分钟，然后用无菌蒸馏水清洗4次。使用11mm的木塞穿孔器切叶盘，然后接种在农杆菌悬浮液中两分钟。盘被在无菌滤纸片之间吸干(blotted)，并且在MS 3％蔗糖+2.2μM BAP+0.27μM NAA板上放置10盘/板。这些板被随后培养2天。然后将盘转移至补充有500g/l头孢噻肟和100g/l卡那霉素的相同的MS BN培养基的板。每两周将盘被转移到上述培养基的新鲜板上，直到小苗(shoot)开始形成。随着小苗的出现，它们被切除并转移到补充有500mg/l头孢噻肟和100mg/l卡那霉素的含LS培养基+3％蔗糖+0.5μM BAP的板。在足够大以后(～2周)，将这些转移到补充有500mg/l头孢噻肟的LS培养基+3％蔗糖+0.5μM BAP的广口瓶中。大约3周后，小苗被转移至LS培养基+3％蔗糖+250mg/l头孢噻肟的广口瓶中。再过3-4周以后，植物最终被转移至LS培养基+3％蔗糖(无抗生素)使其生根。一旦植物扎根，将它们转移至温室的泥土中。组织培养的生长条件为24℃+/-1℃，16小时的日光。

实施例3

TSNA水平检测

TSNA分析转包给 International ULC(62Manitou Drive,Kitchener,Ontario,N2C 1L3)。Labstat使用的方法基于以下文献：

·Wu,W.；Ashley,D.L.；Watson,C.H.Anal.Chem.(2003)75:4827-4832.

·Wagner,K.A.；Finkel,N.H.；Fossett,J.E.；Gillman,I.G.Anal.Chem.(2005)77:1001-1006.

·Lee,J-M.；Shin J-W.；Oh,I_H.；Lee U-C.；Rhee M-S.(2004)Coresta CongressKyoto.Paper SS20；参见http://www.coresta.org/Past_abstracts/Kyoto2004-SmokeTech.pdf

·Chwojdak,C.A.；Self,D.A.；Wheeler,H.R.A collaborative,Harmonized LC-MS/MS Method for the determination of Tobacco Specific Nitrosamines(TSNA)inTobacco and Tobacco Related Materials.61st Tobacco Science ResearchConference,Charlotte,NC.USA.September 24,2007.

方法简介：

测试需要100g烤烟的最小取样量。研磨和筛分烟草产品以确保颗粒尺寸<4mm，其中分析要在制备实验室组合物后尽快进行。

将一定量的包含四个氘标记的TSNA类似物(即NNN-d₄、NAT-d₄、NAB-d₄、NNK-d₄)的内部标准溶液标准加入烟草产品(0.75g)，然后在手腕动作振动器上将TSNA化合物萃取至醋酸铵水溶液中。然后过滤萃取物并使其经受利用正电喷雾电离(ESI)的LC-MSMS分析。对于每种分析物，可以使用两个质量迁移对来辅助进行分析物确认和定量。最强的一对用于定量；强度相对弱的迁移对被用作用于进一步化合物确认的限定符(qualifier)。

结果：

图3示出与野生型植物相比，生产自表达LBD37在组成型启动子(024-0147)上的构建体的植物的烤烟中的NNK和NNN水平显著降低。生产自表达LBD38在衰老特异性启动子(138-0148)上的构建体的植物的烤烟同样示出NNK的明显减少。

由于LBD38和LBD39的过表达意味着对植物的适度代价，LBD38和39在衰老特异性启动子的控制下表达。然而，转基因的影响被减弱，同样，对TSNA的减少的影响也减弱了。

对于以衰老启动子(0138-0148和0138-0149)表达的基因而言，与组成型启动子(024-0147)相比，转基因植物中NNK含量与对照相比减少的程度明显较低。然而，由LBD37对NNK水平产生的影响对于80％的株系是显著的，示出平均减少3至6倍。对携带LBD37基因的植物来说，NNN的减少也是统计上显著的。与野生型对照相比，观察到2至4倍较少的NNN的减少。

实施例4

烟叶氨基酸含量的分析(T1)

使用由Phenomenex提供的EZ:Faast LC/MS试剂盒测定野生型和转基因白肋PH2517植物的氨基酸含量。所有试剂和供应品，包括HPLC色谱柱，均为试剂盒的组成部分。该过程的所有步骤均提供于用户手册KH0-7338中，将其用作实验方案。

该方法涉及待分析样品的固相萃取，然后是衍生化和液/液萃取。通过液相色谱-质谱法(LC-MS)对衍生化的样品进行快速分析。

通过吸附剂包装的尖端进行固相萃取，该尖端结合氨基酸同时允许干扰化合物流过。结合到吸附剂上的氨基酸被挤出到样品小瓶中并在室温下的水溶液中迅速用试剂衍生化。衍生化的氨基酸同时迁移至有机层用于使其与干扰化合物另外分离。然后将移走有机层，蒸发并在重溶在水性流动相中并在LC-MS系统上分析。

在温室中生长来自每个构建体的4个独立的植物。当采集10号叶片(中间位置)并速冻在液氮中时，植物已生长了14周。下面呈现的结果获自主要氨基酸含量的平均值。12株野生型植物生长在相同条件下并且对照呈现的结果代表12个中间叶片的平均氨基酸含量。

结果与讨论

众所周知的是，烤烟中的TSNA含量与收获时存在于叶片中的含氮物质有关。衰老期的氮同化、氮运输、中枢氮代谢和循环都是涉及植物的氮状态的事件。虽然非常复杂，但也认识到氨基酸含量是植物氮状态的反映并且潜在地是TSNA前体水平的指征。

图2所示结果示出了氨基酸的分布，并且因此植物的氮状态受构建体影响。谷氨酸盐/酯(glutamate)、谷氨酰胺(glutamine)和天冬酰胺显然在野生型和转基因植物中都是最丰富的3种氨基酸。

然而，对于携带基因LBD37、LBD38或LBD39的许多转基因株系而言，与野生型相比，总氨基酸的丰富度增加。此外，在转基因植物中，示出与其他氨基酸相比，谷氨酸盐/酯和脯氨酸占氨基酸总量的比例增加。这证明在携带3个LBD基因的过表达的植物中氮物质分布的改变。

实施例5

烟草尼古丁水平的分析

尼古丁分析转包给Labstat。Labstat使用的方法基于以下文献：

·Imperial Tobacco Canada Limited,Procedures analytical Services,Procedure 11；“Simultaneous Determination of Sugars and Total Alkaloids inTobacco”.

·Bran&Luebbe,Auto Analyser 3(AA3)Reference Manual.

方法简介：

用1型水萃取陆地烟(ground tobacco)然后过滤。随后在Bran&Luebbe AutoAnalyser 3(AA3)上分析萃取物。每个样品经历用缓冲的氢氧化钠溶液的在线稀释并透析到磺胺酸的流中。洗脱液与氯化氰反应以形成黄绿色染料并且在比色计上在460nm处读取吸光度。

结果：

图4示出的尼古丁水平分析的结果表明，植物中LBD37、LBD38和LBD39基因的表达引起所得到的烟草的尼古丁含量与野生型相比略有增加。由于尼古丁是富含氮的代谢物，这一结果是转基因植物中氮分布/代谢改变的另一个指征。图5表明，对于用衰老启动子(0138-0148和0138-0149)表达LBD38和LBD39的植物而言，产量与野生型基本相同，但是对于用组成型启动子(024-0147)表达LBD37的植物的产量却略有减少。

以上说明书中提到的所有出版物通过引用结合于此。对所描述的方法和本发明的系统的多种修饰和改变对本领域技术人员而言是明显的，只要不背离本发明的范围和精神即可。尽管已经与具体优选的实施方式相关地描述了本发明，应当理解的是所要求保护的发明不应当被过度限制于这些具体的实施方式。事实上，意在将对生物化学和生物技术或相关领域的技术人员而言是显而易见的用于实现本发明的描述模式的多种修改包括在以下权利要求的范围之内。

序列表

<110> 英美烟草(投资)有限公司(British American Tobacco (Investments)Limited)

<120> 方法

<130> P106424CN

<140> PCT/GB2016/050260

<141> 2016-02-04

<150> GB 1501941.7

<151> 2015-02-05

<160> 27

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 753

<212> DNA

<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）

<400> 1

atgagctgca atggttgccg tgttctccgg aaaggttgca gcgagaattg tatcctccgg 60

ccatgtattc aatggattga aaccgccgat gctcaaggcc acgccaccgt cttcgtcgct 120

aaattcttcg gccgtgctgg tctcatgtcc tttatctccg ctgttccgga ttctcaacgt 180

cctgctttgt ttcagtcgtt gctctacgaa gcttgtggaa gaactgtcaa tccagttaac 240

ggagcaatcg gaatgttatg gactggaaac tggaatatct gtcaagcggc tgttgaaaca 300

gtgcttcgcg gcggttcttt aagaccgatc ccggagcttc tcactcacgg cggcggtttc 360

gctggctttc cttcgcctac atctgaagaa gcatctgaga tctgcaccga aatgttgaat 420

ctccagcaaa atgattccac cgatcgtaac atctatcatc attcacgatt ctcaagctct 480

agatctagat ctactatgga ttcttcttct ccgacgaaac gtaagagatt atcatcggaa 540

gaccaaccat cttcggagct tgatctatct ctcatcccta attttcccat taagcaagca 600

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acgacgacga ctacgacggc gttttgtgac aagggtgatg tgtacggtaa cggaggagga 720

gaaacgacca agttgcttaa cctttttgtt taa 753

<210> 2

<211> 250

<212> PRT

<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）

<400> 2

Met Ser Cys Asn Gly Cys Arg Val Leu Arg Lys Gly Cys Ser Glu Asn

1 5 10 15

Cys Ile Leu Arg Pro Cys Ile Gln Trp Ile Glu Thr Ala Asp Ala Gln

20 25 30

Gly His Ala Thr Val Phe Val Ala Lys Phe Phe Gly Arg Ala Gly Leu

35 40 45

Met Ser Phe Ile Ser Ala Val Pro Asp Ser Gln Arg Pro Ala Leu Phe

50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

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145 150 155 160

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165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

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225 230 235 240

Glu Thr Thr Lys Leu Leu Asn Leu Phe Val

245 250

<210> 3

<211> 744

<212> DNA

<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）

<400> 3

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<210> 4

<211> 247

<212> PRT

<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）

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Cys Ile Leu Arg Pro Cys Ile Gln Trp Ile Glu Ser Pro Glu Ala Gln

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35 40 45

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65 70 75 80

Gly Ala Val Gly Leu Leu Trp Thr Gly Asn Trp Asn Val Cys Gln Ala

85 90 95

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100 105 110

Leu Leu Asn Gly Gly Gly Phe Ala Gly Phe Pro Ser Pro Thr Ser Asp

115 120 125

Glu Ala Ser Glu Ile Cys Thr Glu Met Leu Asn Leu Arg Lys Ala Asp

130 135 140

Asp Ser Gly Asp Arg Asn Ile Tyr His His Cys Arg Phe Ser Ser Ser

145 150 155 160

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165 170 175

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180 185 190

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245

<210> 5

<211> 723

<212> DNA

<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）

<400> 5

atgagttgca atggatgtag agttcttcga aaaggttgca gtgaaacatg catccttcgt 60

ccttgccttc aatggatcga atccgccgag tcacaaggcc acgccaccgt cttcgtcgct 120

aaattctttg gtcgtgctgg tctcatgtct ttcatctcct ccgtacctga actccaacgt 180

cctgctttgt ttcagtcgtt gttgtttgaa gcgtgtggga gaacggtgaa tccggttaac 240

ggagcggttg gtatgttgtg gaccaggaac tggcacgtat gccaagcggc ggttgagact 300

gttcttcgcg gcggaacttt acgaccgata tcagatcttc ttgaatctcc gtcgttgatg 360

atctcctgtg atgagtcttc agagatttgg catcaagacg tttcaagaaa ccaaacccac 420

cattgtcgct tctccacctc cagatccacg acggagatga aagactctct ggttaaccga 480

aaacgattga agtccgattc ggatcttgat ctccaagtga accacggttt aaccctaacc 540

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taa 723

<210> 6

<211> 240

<212> PRT

<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）

<400> 6

Met Ser Cys Asn Gly Cys Arg Val Leu Arg Lys Gly Cys Ser Glu Thr

1 5 10 15

Cys Ile Leu Arg Pro Cys Leu Gln Trp Ile Glu Ser Ala Glu Ser Gln

20 25 30

Gly His Ala Thr Val Phe Val Ala Lys Phe Phe Gly Arg Ala Gly Leu

35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 序列基序

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(8)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (14)..(14)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 7

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1 5 10

<210> 8

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 序列基序

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(3)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(8)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 8

Gln Xaa Xaa Ala Thr Xaa Phe Xaa Ala Lys Phe Xaa Gly Arg

1 5 10

<210> 9

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 序列基序

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(9)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 9

Phe Xaa Ser Leu Leu Xaa Glu Ala Xaa Gly

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<210> 10

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C基序

<220>

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<222> (2)..(3)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(10)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(14)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 10

Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Cys

1 5 10 15

<210> 11

<211> 250

<212> PRT

<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）

<400> 11

Met Ser Cys Asn Gly Cys Arg Val Leu Arg Lys Gly Cys Ser Glu Asn

1 5 10 15

Cys Ile Leu Arg Pro Cys Ile Gln Trp Ile Glu Thr Ala Asp Ala Gln

20 25 30

Gly His Ala Thr Val Phe Val Ala Lys Phe Phe Gly Arg Ala Gly Leu

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Met Ser Phe Ile Ser Ala Val Pro Asp Ser Gln Arg Pro Ala Leu Phe

50 55 60

Gln Ser Leu Leu Tyr Glu Ala Cys Gly Arg Thr Val Asn Pro Val Asn

65 70 75 80

Gly Ala Ile Gly Met Leu Trp Thr Gly Asn Trp Asn Ile Cys Gln Ala

85 90 95

Ala Val Glu Thr Val Leu Arg Gly Gly Ser Leu Arg Pro Ile Pro Glu

100 105 110

Leu Leu Thr His Gly Gly Gly Phe Ala Gly Phe Pro Ser Pro Thr Ser

115 120 125

Glu Glu Ala Ser Glu Ile Cys Thr Glu Met Leu Asn Leu Gln Gln Asn

130 135 140

Asp Ser Thr Asp Arg Asn Ile Tyr His His Ser Arg Phe Ser Ser Ser

145 150 155 160

Arg Ser Arg Ser Thr Met Asp Ser Ser Ser Pro Thr Lys Arg Lys Arg

165 170 175

Leu Ser Ser Glu Asp Gln Pro Ser Ser Glu Leu Asp Leu Ser Leu Ile

180 185 190

Pro Asn Phe Pro Ile Lys Gln Ala Thr Pro Ser Ser Thr Arg Arg Arg

195 200 205

Ser Val Thr Pro Ser Met Asn Ser Glu Asp Ser Gly Thr Thr Thr Thr

210 215 220

Thr Thr Ala Phe Cys Asp Lys Gly Asp Val Tyr Gly Asn Gly Gly Gly

225 230 235 240

Glu Thr Thr Lys Leu Leu Asn Leu Phe Val

245 250

<210> 12

<211> 217

<212> PRT

<213> 番茄（Solanum lycopersicum）

<400> 12

Met Ser Cys Asn Gly Cys Arg Val Leu Arg Lys Gly Cys Ser Asp Asn

1 5 10 15

Cys Ile Leu Arg Pro Cys Leu Gln Trp Ile Glu Thr Pro Glu Ala Gln

20 25 30

Gly His Ala Thr Val Phe Val Ala Lys Phe Phe Gly Arg Ala Gly Leu

35 40 45

Met Ser Phe Ile Ser Ala Val Pro Glu Asn Gln Arg Pro Ala Leu Phe

50 55 60

Gln Ser Leu Leu Tyr Glu Ala Ala Gly Arg Thr Val Asn Pro Val Asn

65 70 75 80

Gly Ala Val Gly Leu Leu Trp Thr Gly Asn Trp His Val Cys Gln Ala

85 90 95

Ala Val Glu Thr Val Leu Arg Gly Gly Ala Leu Arg Pro Ile Ser Glu

100 105 110

Phe Leu Gly Ala Ser Val Glu Ile Asp Glu Val Ser Asp Cys Thr Asp

115 120 125

Val Phe Lys Leu Gln Asp Pro Ser Leu Asn Met Arg Pro Lys Met Gln

130 135 140

Lys Arg Arg Arg Ser Pro Glu Glu Thr Ser Met Leu Asp Leu Ser Leu

145 150 155 160

Thr Pro Gly Phe Asn Gln Lys Val Tyr Asn Ser His Pro Leu Pro Glu

165 170 175

His Arg Arg Pro Gly Thr Pro Ser Met Asn Ser Glu Glu Ser Gly Thr

180 185 190

Thr Thr Cys Phe Glu Ser Ser Ala Val Ile Gly Asp His Gln Gly Lys

195 200 205

Glu Pro Lys Leu Leu Ser Leu Phe Asn

210 215

<210> 13

<211> 205

<212> PRT

<213> 短花药野生稻（Oryza brachyantha）

<400> 13

Met Ser Cys Asn Gly Cys Arg Val Leu Arg Lys Gly Cys Ser Asp Ala

1 5 10 15

Cys Val Leu Arg Pro Ser Ile Glu Trp Ile Asp Gly Ala Gln Pro Gln

20 25 30

Ala Asn Ala Thr Val Phe Val Ala Lys Phe Phe Gly Arg Ala Gly Leu

35 40 45

Val Ala Ser Leu Ala Ala Val Pro Leu His His Arg Pro Ala Leu Phe

50 55 60

Gln Ser Leu Leu Tyr Glu Ala Cys Gly Arg Thr Ile Asn Pro Val Ser

65 70 75 80

Gly Ala Ile Gly Leu Met Trp Thr Gly Asn Trp Asp Leu Cys Gln Ala

85 90 95

Ala Ala Asp Ala Val Leu Arg Gly Asp Ser Leu Ser Ala Leu Ser Ala

100 105 110

Val Pro Ala Ala Phe Thr Asp Arg Asp Met Ala Gly Leu Tyr Gly Asn

115 120 125

Val Gly Gly Ala Ser Ser Ser Ser Ser Pro Ala Ala Glu Asn Ser Ser

130 135 140

Ala Ser Ala Pro Gly Gly Pro Arg Arg Lys Arg Ala Arg Asn Asn Gly

145 150 155 160

Ala Gly Glu Arg Gly His Gln Gln Gln Leu Ala Ala Gly Gly Ala Gly

165 170 175

Ala Ser Asp Glu His Ser Thr Thr Thr Cys Glu Glu Ala Ser Gly Asp

180 185 190

Ala Asp Ala Gly Ala Pro Thr Leu Leu Asn Leu Phe Ser

195 200 205

<210> 14

<211> 236

<212> PRT

<213> 芜菁（Brassica rapa）

<400> 14

Met Ser Cys Asn Gly Cys Arg Val Leu Arg Lys Gly Cys Ser Glu Asn

1 5 10 15

Cys Ile Leu Arg Pro Cys Ile Gln Trp Ile Glu Thr Ala Asp Ala Gln

20 25 30

Gly His Ala Thr Val Phe Val Ala Lys Phe Phe Gly Arg Ala Gly Leu

35 40 45

Met Ser Phe Ile Ser Ala Val Pro Glu Ser Gln Arg Pro Ala Leu Phe

50 55 60

Gln Ser Leu Leu Tyr Glu Ala Cys Gly Arg Thr Val Asn Pro Val Asn

65 70 75 80

Gly Ala Ile Gly Met Leu Trp Thr Gly Asn Trp Lys Val Cys Gln Ala

85 90 95

Ala Val Glu Thr Val Leu Arg Gly Gly Ser Leu Arg Pro Ile Pro Glu

100 105 110

Leu Leu Thr His Gly Gly Gly Phe Pro Ser Ala Thr Ser Glu Glu Ala

115 120 125

Ser Glu Ile Cys Thr Glu Met Leu Lys Leu Gln Gln Asn Asp Gly Ser

130 135 140

Ser Asp Arg Asn Ile Tyr His His Ser Arg Phe Ser Ser Ser Arg Ser

145 150 155 160

Arg Ser Thr Leu Asp Ser Ser Pro Arg Lys Arg Lys Leu Glu Ile Ser

165 170 175

Leu Asn Pro Ser Leu Pro Met Lys Ala Val Pro Ser Ser Thr Arg Gln

180 185 190

Arg Ser Arg Thr Pro Ser Met Asn Ser Glu Glu Ser Val Thr Thr Thr

195 200 205

Thr Thr Phe Trp Asp Asn Phe Ala Ser Gly Ala Gln His Gly Asn Gly

210 215 220

Gly Gly Glu Thr Ser Arg Leu Leu Asn Leu Phe Val

225 230 235

<210> 15

<211> 247

<212> PRT

<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）

<400> 15

Met Ser Cys Asn Gly Cys Arg Val Leu Arg Lys Gly Cys Ser Glu Asn

1 5 10 15

Cys Ile Leu Arg Pro Cys Ile Gln Trp Ile Glu Ser Pro Glu Ala Gln

20 25 30

Gly His Ala Thr Val Phe Val Ala Lys Phe Phe Gly Arg Ala Gly Leu

35 40 45

Met Ser Phe Ile Ser Ala Val Pro Glu Ser Gln Cys Pro Ala Leu Phe

50 55 60

Gln Ser Leu Leu Tyr Glu Ala Cys Gly Arg Thr Val Asn Pro Val Asn

65 70 75 80

Gly Ala Val Gly Leu Leu Trp Thr Gly Asn Trp Asn Val Cys Gln Ala

85 90 95

Ala Val Glu Thr Val Leu Arg Gly Gly Ser Leu Lys Pro Ile Pro Glu

100 105 110

Leu Leu Asn Gly Gly Gly Phe Ala Gly Phe Pro Ser Pro Thr Ser Asp

115 120 125

Glu Ala Ser Glu Ile Cys Thr Glu Met Leu Asn Leu Arg Lys Ala Asp

130 135 140

Asp Ser Gly Asp Arg Asn Ile Tyr His His Cys Arg Phe Ser Ser Ser

145 150 155 160

Arg Ser Arg Ser Arg Ser Thr Ala Ser Pro Pro Lys Arg Lys Arg Leu

165 170 175

Ser Ser Glu Gln Gln Pro Ser Ser Glu Leu Asp Leu Ser Leu Ile Pro

180 185 190

Ile Tyr Pro Ile Lys Thr Leu Pro Phe Lys Glu Asp Thr Pro Ser Met

195 200 205

Tyr Ser Glu Glu Ser Val Thr Thr Val Ser Phe Gln Asn Asn Asn Ala

210 215 220

Gly Asp Arg Tyr Val Arg Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Thr Thr

225 230 235 240

Lys Leu Leu Asn Leu Phe Ala

245

<210> 16

<211> 204

<212> PRT

<213> 番茄（Solanum lycopersicum）

<400> 16

Met Ser Cys Asn Gly Cys Arg Val Leu Arg Arg Arg Cys Ser Asp Asn

1 5 10 15

Cys Thr Leu Arg Thr Cys Leu Asp Gly Ile Asp Asp Pro Gln Ala Gln

20 25 30

Gly Asn Ala Thr Leu Phe Val Ser Lys Phe Phe Gly Arg Ser Asp Leu

35 40 45

Met Ser Leu Ile Ala Ala Val Pro Gln Asn Arg Arg Pro Ala Leu Phe

50 55 60

Lys Ser Leu Leu Phe Glu Ala Cys Gly Arg Thr Val Asn Pro Val Thr

65 70 75 80

Gly Ala Val Gly Leu Leu Ser Thr Gly Asn Trp His Val Cys Gln Lys

85 90 95

Ala Val Gln Thr Val Leu Ala Gly Gly Asn Leu Arg Pro Val Leu Ala

100 105 110

Gly Ile Leu Thr Pro Pro Tyr Phe Asp Asn Ser Phe Arg Cys Gly Gly

115 120 125

Ala Trp Asp Met Pro Asn Gln Phe Cys Asn Lys Ser Asp Ser Met Phe

130 135 140

Ile Asp Gly Ser Glu Gln Ile Glu Gly Met Glu Trp Ile Ser Ser Glu

145 150 155 160

Lys Arg Trp Asn Thr Ser Ser Cys Phe Gly Ser Glu Thr Glu Leu Ser

165 170 175

Asp Val Ser Leu Gly Leu Asp Ser Gly Tyr Gly Tyr Ala Glu Cys Val

180 185 190

Lys Gly Glu Glu Pro Lys Leu Leu Asn Leu Phe Val

195 200

<210> 17

<211> 161

<212> PRT

<213> 芜菁（Brassica rapa）

<400> 17

Ile Leu Arg Pro Cys Ile Gln Trp Ile Glu Ser Ala Glu Ala Gln Gly

1 5 10 15

His Ala Thr Val Phe Val Ala Lys Phe Phe Gly Arg Ala Gly Leu Met

20 25 30

Ser Phe Ile Ser Ser Val Pro Glu Ser Gln Ser Pro Ala Leu Phe Gln

35 40 45

Ser Leu Leu Tyr Glu Ala Cys Gly Arg Thr Val Asn Pro Val Asn Gly

50 55 60

Ala Val Gly Leu Leu Trp Thr Gly Asn Trp Ser Ile Cys Gln Ala Ala

65 70 75 80

Val Glu Thr Val Leu Arg Gly Gly Ser Leu Arg Pro Met Pro Glu Leu

85 90 95

Leu Thr Arg Asp Gly Gly Phe Gly Gly Phe Pro Ser Thr Thr Ser Asp

100 105 110

Glu Ala Ser Glu Ile Cys Thr Glu Met Leu Asn Asp Cys Gly Asp Arg

115 120 125

Ser Ala Tyr His His Cys Arg Phe Ser Ser Ser Arg Thr Ser Arg Pro

130 135 140

Thr Ala Ser Pro Pro Asn Arg Lys Arg Leu Ala Ser Glu Gln Gln Gln

145 150 155 160

Arg

<210> 18

<211> 240

<212> PRT

<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）

<400> 18

Met Ser Cys Asn Gly Cys Arg Val Leu Arg Lys Gly Cys Ser Glu Thr

1 5 10 15

Cys Ile Leu Arg Pro Cys Leu Gln Trp Ile Glu Ser Ala Glu Ser Gln

20 25 30

Gly His Ala Thr Val Phe Val Ala Lys Phe Phe Gly Arg Ala Gly Leu

35 40 45

Met Ser Phe Ile Ser Ser Val Pro Glu Leu Gln Arg Pro Ala Leu Phe

50 55 60

Gln Ser Leu Leu Phe Glu Ala Cys Gly Arg Thr Val Asn Pro Val Asn

65 70 75 80

Gly Ala Val Gly Met Leu Trp Thr Arg Asn Trp His Val Cys Gln Ala

85 90 95

Ala Val Glu Thr Val Leu Arg Gly Gly Thr Leu Arg Pro Ile Ser Asp

100 105 110

Leu Leu Glu Ser Pro Ser Leu Met Ile Ser Cys Asp Glu Ser Ser Glu

115 120 125

Ile Trp His Gln Asp Val Ser Arg Asn Gln Thr His His Cys Arg Phe

130 135 140

Ser Thr Ser Arg Ser Thr Thr Glu Met Lys Asp Ser Leu Val Asn Arg

145 150 155 160

Lys Arg Leu Lys Ser Asp Ser Asp Leu Asp Leu Gln Val Asn His Gly

165 170 175

Leu Thr Leu Thr Ala Pro Ala Val Pro Val Pro Phe Leu Pro Pro Ser

180 185 190

Ser Phe Cys Lys Val Val Lys Gly Asp Arg Pro Gly Ser Pro Ser Glu

195 200 205

Glu Ser Val Thr Thr Ser Cys Trp Glu Asn Gly Met Arg Gly Asp Asn

210 215 220

Lys Gln Lys Arg Asn Lys Gly Glu Lys Lys Leu Leu Asn Leu Phe Val

225 230 235 240

<210> 19

<211> 161

<212> PRT

<213> 芜菁（Brassica rapa）

<400> 19

Ile Leu Arg Pro Cys Ile Gln Trp Ile Glu Ser Ala Glu Ala Gln Gly

1 5 10 15

His Ala Thr Val Phe Val Ala Lys Phe Phe Gly Arg Ala Gly Leu Met

20 25 30

Ser Phe Ile Ser Ser Val Pro Glu Ser Gln Ser Pro Ala Leu Phe Gln

35 40 45

Ser Leu Leu Tyr Glu Ala Cys Gly Arg Thr Val Asn Pro Val Asn Gly

50 55 60

Ala Val Gly Leu Leu Trp Thr Gly Asn Trp Ser Ile Cys Gln Ala Ala

65 70 75 80

Val Glu Thr Val Leu Arg Gly Gly Ser Leu Arg Pro Met Pro Glu Leu

85 90 95

Leu Thr Arg Asp Gly Gly Phe Gly Gly Phe Pro Ser Thr Thr Ser Asp

100 105 110

Glu Ala Ser Glu Ile Cys Thr Glu Met Leu Asn Asp Cys Gly Asp Arg

115 120 125

Ser Ala Tyr His His Cys Arg Phe Ser Ser Ser Arg Thr Ser Arg Pro

130 135 140

Thr Ala Ser Pro Pro Asn Arg Lys Arg Leu Ala Ser Glu Gln Gln Gln

145 150 155 160

Arg

<210> 20

<211> 91

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 共有序列

<400> 20

Met Ser Cys Asn Gly Cys Arg Val Leu Arg Lys Gly Cys Ser Glu Asn

1 5 10 15

Cys Ile Leu Arg Pro Cys Ile Gln Trp Ile Glu Ser Ala Glu Ala Gln

20 25 30

Gly His Ala Thr Val Phe Val Ala Lys Phe Phe Gly Arg Ala Gly Leu

35 40 45

Met Ser Phe Ile Ser Ala Val Pro Glu Ser Gln Arg Pro Ala Leu Phe

50 55 60

Gln Ser Leu Leu Tyr Glu Ala Cys Gly Arg Thr Val Asn Pro Val Asn

65 70 75 80

Gly Ala Val Gly Leu Leu Trp Thr Gly Asn Trp

85 90

<210> 21

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 共有序列

<400> 21

Val Cys Gln Ala Ala Val Glu Thr Val Leu Arg Gly Gly Ser Leu Arg

1 5 10 15

Pro Ile Pro Glu Leu Leu

20

<210> 22

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 共有序列

<400> 22

Gly Phe Pro Ser

1

<210> 23

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 共有序列

<400> 23

Thr Ser Asp Glu Ala Ser Glu Ile Cys Thr Glu Met Leu Asn Leu

1 5 10 15

<210> 24

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 共有序列

<400> 24

Arg Phe Ser Ser Ser Arg Ser

1 5

<210> 25

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 共有序列

<400> 25

Thr Ala Ser Pro

1

<210> 26

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 共有序列

<400> 26

Ser Glu Glu Ser

1

<210> 27

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 共有序列

<400> 27

Lys Leu Leu Asn Leu Phe

1 5

Claims (35)

1.一种减少烟草植物中至少一种烟草特有的亚硝胺(TSNA)或其前体的方法，包括通过在所述烟草植物中增加LBD(侧生器官边界结构域)氮响应性转录因子的活性或表达来修饰所述植物。

2.LBD氮响应性转录因子用于减少烟草植物中至少一种TSNA或其前体的应用。

3.一种用于生产具有至少一种TSNA或其前体的减少的烟草植物、烟草植物繁殖材料、烟叶、切割的收获烟叶、加工的烟叶或切割并加工的烟叶的方法，所述方法包括修饰所述烟草植物以增加LBD氮响应性转录因子的活性或表达。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法或应用，其中，当与未被修饰以增加LBD氮响应性转录因子的活性或表达的烟草植物相比时，至少一种TSNA或其前体减少。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述TSNA是尼古丁衍生的亚硝胺酮(NNK)、亚硝基降烟碱(NNN)、亚硝基去氢新烟碱(NAT)或N-亚硝基新烟碱(NAB)。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法或应用，包括在所述植物内表达包含编码LBD氮响应性转录因子的核酸序列的多核苷酸(例如，外源性多核苷酸)。

7.根据权利要求6所述的方法或应用，其中所述多核苷酸(例如，外源性多核苷酸)包含与用于在所述植物中指导所述核酸序列的转录的异源性启动子可操作地连接的编码LBD氮响应性转录因子的核酸序列。

8.根据权利要求7所述的方法或应用，其中所述启动子是叶片特异性启动子。

9.根据权利要求7或8所述的方法或应用，其中所述启动子是组成型启动子或衰老启动子。

10.一种构建体或载体，包含与叶片特异性启动子或叶片偏好性启动子可操作地连接的编码LBD氮响应性转录因子的核酸。

11.一种构建体或载体，包含与衰老特异性启动子可操作地连接的编码LBD氮响应性转录因子的核酸。

12.一种烟草细胞：

i)包含外源性LBD氮响应性转录因子；

ii)包含根据权利要求10或11所述的构建体或载体；和/或

iii)是由根据权利要求1-9中任一项所述的方法或应用可获得的(例如，获得的)。

13.一种烟草植物：

i)其已被修饰以实现与未修饰的植物相比至少一种TSNA或其前体的减少，其中所述修饰是在所述修饰的植物中增加LBD氮响应性转录因子的活性或表达；

ii)包含外源性LBD氮响应性转录因子；

iii)是由根据权利要求1-9中任一项所述的方法或应用可获得的；

iv)包含根据权利要求10或11所述的构建体或载体；和/或

v)包含根据权利要求12所述的细胞。

14.一种可获自根据权利要求13所述的烟草植物的烟草植物繁殖材料(例如，植物种子)。

15.根据权利要求1-9中任一项所述的方法或应用、根据权利要求12所述的烟草细胞、根据权利要求13所述的烟草植物或根据权利要求14所述的烟草植物繁殖材料，其中所述LBD氮响应性转录因子多肽序列包含以下基序中的一个或多个：

i)CX₂CX₆CX₃C，其中X为任意氨基酸

ii)MSCNGCRXLRKGCX(SEQ ID NO:7)

iii)QXXATXFXAKFXGR(SEQ ID NO:8)

iv)FXSLLXEAXG(SEQ ID NO:9)。

16.根据权利要求1-9中任一项所述的方法或应用、根据权利要求12所述的烟草细胞、根据权利要求13所述的烟草植物或根据权利要求14所述的烟草植物繁殖材料，其中，所述LBD氮响应性转录因子是LBD37、LBD38或LBD39。

17.根据权利要求1-9中任一项所述的方法或应用、根据权利要求12所述的烟草细胞、根据权利要求13所述的烟草植物或根据权利要求14所述的烟草植物繁殖材料，其中所述LBD氮响应性转录因子来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)。

18.根据权利要求1-9中任一项所述的方法或应用、根据权利要求12所述的烟草细胞、根据权利要求13所述的烟草植物或根据权利要求14所述的烟草植物繁殖材料，其中，编码所述LBD氮响应性转录因子的核酸序列包含：

i)在此示出为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的多核苷酸序列，或

ii)在i)中示出的所述多核苷酸序列的功能性片段，其中，功能性片段编码功能性LBD氮响应性转录因子，或

iii)编码包含在此示出为SEQ ID NO 2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，或

iv)可以在高严格条件下与上述i)、ii)或iii)中教导的多核苷酸杂交的多核苷酸序列，或

v)与上述i)、ii)或iii)中示出的多核苷酸具有至少70％(优选85％、更优选90％)同一性的多核苷酸序列，或

vi)由于遗传密码的简并性而与i)、ii)或iii)中示出的多核苷酸不同的多核苷酸序列。

19.根据权利要求1-9中任一项所述的方法或应用、根据权利要求12所述的烟草细胞、根据权利要求13所述的烟草植物或根据权利要求14所述的烟草植物繁殖材料，其中所述LBD氮响应性转录因子包含在此示出为SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的多肽序列，或包含具有在至少一个氨基酸处的保守替换的SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:6的多肽序列，或与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6具有至少70％(优选85％、更优选90％)同一性的多肽。

20.根据权利要求1-9中任一项所述的方法或应用、根据权利要求12所述的烟草细胞、根据权利要求13所述的烟草植物或根据权利要求14所述的烟草植物繁殖材料，其中所述烟草为红花烟草(Nicotiana tabacum)或黄花烟草(Nicotiana rustica)。

21.根据权利要求12或15-20中任一项所述的烟草细胞用于生产烟草产品的应用。

22.根据权利要求13或15-20中任一项所述的烟草植物用于繁殖烟草植物的应用。

23.根据权利要求13或15-20中任一项所述的烟草植物用于生产烟草产品的应用。

24.根据权利要求13或15-20中任一项所述的烟草植物用于种植作物的应用。

25.根据权利要求13或15-20中任一项所述的烟草植物用于生产烟叶(例如，加工的(优选烘烤的)烟叶)。

26.根据权利要求13或15-20中任一项所述的烟草植物的收获的叶，或可获自从根据权利要求14-20中任一项所述的繁殖材料繁殖而来的烟草植物的收获的叶，或可获自通过根据权利要求21-24中任一项所述的应用获得的烟草植物的收获的叶。

27.根据权利要求26所述的烟草植物的收获的叶，其中所述烟草植物的收获的叶是切割的收获的叶。

28.一种加工的烟叶(优选是无活性的加工的烟叶)：

i)包含权利要求12或15-20中任一项所述的烟草细胞；

ii)可获自从根据权利要求21-24中任一项所述的应用可获得的烟草植物；

iii)是通过加工根据权利要求13或15-20中任一项所述的烟草植物可获得的；

iv)可获自从根据权利要求14-20中任一项所述的烟草植物繁殖材料繁殖而来的烟草植物；或

v)是通过加工根据权利要求26或27所述的烟草植物的收获的叶可获得的。

29.根据权利要求28所述的加工的烟叶，其中通过烘烤、发酵、巴氏杀菌或它们的组合加工烟草。

30.根据权利要求28或29所述的加工的烟叶，其中所述加工的烟叶是切割的加工的烟叶。

31.一种烟草产品，制备自：

i)根据权利要求13或15-20中任一项所述的烟草植物或其部分；

ii)从根据权利要求14-20中任一项所述的烟草植物繁殖材料繁殖而来的烟草植物或其部分；

iii)根据权利要求25或26所述的烟草植物的收获的叶；

iv)根据权利要求28-30中任一项所述的加工的烟叶。

32.根据权利要求31所述的烟草产品，其中，所述烟草产品为吸烟物品。

33.根据权利要求31所述的烟草产品，其中，所述烟草产品为无烟烟草产品。

34.根据权利要求31所述的烟草产品，其中，所述烟草产品为烟草加热装置如气溶胶生成装置。

35.通过参考说明和附图充分描述于此的一种方法、一种烟叶、一种烟草植物、一种烟草植物繁殖材料、一种收获的叶、一种加工的烟草、一种烟草产品、一种应用或它们的组合。