JP2023521055A - ニコチアナ・タバカムにおけるニコチンレベルの調整方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、植物（例えば、タバコ植物）若しくはその一部、又はタバコ植物細胞のニコチン含有量を調節する（例えば、減少させる）ための方法であって、前記植物又は細胞を改変し、Ｎｉｃ３遺伝子座における少なくとも１つの変異を提供するステップを含む方法を提供する。本発明は、植物（例えば、タバコ植物）若しくはその一部、又はタバコ植物細胞のニコチン含有量を調節する（例えば、減少させる）ための方法であって、前記植物又は細胞を改変して、少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子の発現又は活性を調節するステップを含む方法を提供する。本発明はまた、植物のアルカロイド含有量を調節するためのＮｉｃ３遺伝子座の使用、加えて、本発明に従って得ることができるタバコ細胞、植物、植物増殖材料、採取された葉、加工されたタバコ、又は送達システムも提供する。
Description
本発明は、タバコ植物若しくはその一部又はタバコ植物細胞のアルカロイド含有量、例えば、ニコチン含有量を調節する（例えば、減少させる）方法に関する。本発明はまた、植物内のアルカロイド含有量を調節する遺伝子によってコードされたポリペプチドの発現及び／又は活性を調節する方法にも及ぶ。或いは、本発明は、植物内のアルカロイド含有量（例えば、ニコチン含有量）を調節するポリペプチドをコードする遺伝子の発現及び／又は活性を調節する方法を提供する。本発明はまた、タバコ植物若しくはその一部又はタバコ植物細胞に変異を導入することによって植物内のアルカロイド含有量を調節する（例えば、減少させる）方法にも及ぶ。本発明は、本明細書に記載の方法のいずれかによって産生された植物に関する。本発明はまた、ポリペプチドを調節するために使用できるコンストラクト、このようなコンストラクトで形質転換されたタバコ植物細胞、及びトランスジェニックタバコ植物それ自体にも及ぶ。本発明はまた、アルカロイド含有量（例えば、ニコチン含有量）が調節された本発明によるタバコ植物から採取された葉、及びこのような葉又はその抽出物を含む送達システム（例えば、可燃性エアロゾル供給システム、非可燃性エアロゾル供給システム又はエアロゾルなしの送達システム）の使用にも関する。本発明はまた、分子農業における低いアルカロイド含有量（例えば、ニコチン含有量）を有する本発明によるタバコ植物の使用にも関する。
アルカロイドは、主に塩基性窒素原子を含有し、細菌、真菌、植物及び動物を含む多種多様な生物によって産生される天然に存在する化合物の群である。アルカロイドは、炭素骨格の類似性に従い、例えば、インドール様、イソキノリン様及びピリジン様に分類できる。ピリジン誘導体は、単量体アルカロイドの１つのクラスであり、このクラスは、ピリジンの簡単な誘導体、多環縮合された及び非縮合ピリジン誘導体及びセスキテルペンピリジン誘導体を含む。例として、ニコチン、ノルニコチン、アナバシン、ミオスミン（myosmine）及びアナタビンがある。アルカロイドの既知の生物学的機能のほとんどは、防御に関する。
ニコチンは、数種類の植物で天然に生じるが、タバコ植物において最高レベルで見られる。ニコチンは、野生及び培養されたタバコ属（Nicotiana）の種において産生され、草食動物及び昆虫に対する植物防御において重要な役割を果たし（参照により本明細書に組み込まれる、Voelckel, C., Krugel, T., Gase, K., Heidrich, N., van Dam, N. M., Winz, R., and Baldwin, I. T. (2001). Anti-sense expression of putrescine N-methyltransferase confirms defensive role of nicotine in Nicotiana sylvestris against Manduca sexta. Chemoecology 11, 121-126）、総アルカロイド含有量の約９０％を占める。アルカロイドプールの残りの１０％は、ほぼノルニコチン、アナタビン、ミオスミン及びアナバシンで構成される。
タバコにおけるアルカロイド含有量の調節は複雑である。遺伝子型、環境、施肥及び農業的慣行（例えば、摘花（topping））を含むいくつかの因子は、タバコ植物におけるアルカロイドレベルに影響を及ぼす。
１９３０年代、特定のキューバのシガータバコ（ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum））タイプが、極めて低いアルカロイド含有量を有するとして同定され、この形質を、米国のタバコ育種系統に導入した（参照により本明細書に組み込まれる、Valleau W. 1949. Breeding low-nicotine tobacco. Journal of Agricultural Research 78: 171-181）。それに続いて、低アルカロイドの形質を、複数世代の戻し交雑を介して栽培品種バーレー２１（Ｂ２１）の遺伝的背景に取り入れた（参照により本明細書に組み込まれる、Legg PD, Collins GB, Litton CC. 1970. Registration of La Burley-21 Tobacco Germplasm. Crop Science 10(2): 212）。
低アルカロイドのバーレー２１（ＬＡ－Ｂ２１）を使用する遺伝学的研究は、２つの連鎖していない遺伝子座を示唆しており、これは、最初は遺伝子座Ａ及びＢと呼ばれていたが（参照により組み込まれる、Legg P, Chaplin J, Collins G. (1969). Inheritance of percent total alkaloids in Nicotiana tabacum L.: populations derived from crosses of low alkaloid lines with burley and flue-cured varieties. Journal of Heredity 60: 213-217）、後にＮｉｃ１及びＮｉｃ２として知られるようになり、ニコチン生合成のための調節遺伝子座としてタバコ葉中のニコチンレベルに寄与する（参照により組み込まれる、Legg P., and G., C. (1971). Inheritance of percent total alkaloids in Nicotiana tabacum L. II. genetic effects of two loci in Burley21 X LA Burley 21 populations. Canadian Journal of Genetics and Cytology 13, 287-291；参照により組み込まれる、Hibi, N., Higashiguchi, S., Hashimoto, T., and Yamada, Y. (1994). Gene-Expression in Tobacco Low-Nicotine Mutants. Plant Cell 6, 723-735）。ＬＡＢ２１は、植物防御におけるアルカロイドの役割と一致して、より虫害を受けやすいと報告された。ＬＡＢ２１はまた、低い総アルカロイド（およそ０．２％）を有する熱気送管乾燥タバコの同質遺伝子型の系統が、より低い収量を有することも報告されている。野生型又は高アルカロイドＢ２１（ＨＡ－Ｂ２１、ＡＡＢＢ）とＬＡ－Ｂ２１（ａａｂｂ）との交雑からのＦ１後代の一倍体の二倍化によって、（Collins, G. B., Legg, P. D., and Kasperba.Mj (1974). Use of Anther-Derived Haploids in Nicotiana .1. Isolation of breeding lines differing in total alkaloid content. Crop Science 14, 77-80、参照により組み込まれる）は、Ｂ２１の別の２つの同質遺伝子型系統（ＮＩＬ）を開発し、これらの一方は、高中アルカロイド（ＨＩ－Ｂ２１、ＡＡｂｂ）であり、他方は低中アルカロイド（ＬＩ－Ｂ２１、ａａＢＢ）であり、これらは後に、１９８８年に変種として登録された（参照により組み込まれる、Nielsen, M. T., Legg, P. D., and Collins, G. B. (1988). Registration of HI and LI burley 21 tobacco germplasms. Crop Science 28, 206-207）。近い同質遺伝子型系統（ＮＩＬ）は、本明細書では、バーレー２１（Ｂ２１、Ｎｉｃ１Ｎｉｃ２）、高中（ＨＩ、Ｎｉｃ１ｎｉｃ２）、低中（ＬＩ、ｎｉｃ１Ｎｉｃ２）及び低アルカロイドＢ２１（ＬＡ、ｎｉｃ１ｎｉｃ２）と呼ばれ、これらは後に、１９８８年に変種として登録された。
ｎｉｃ変異体におけるニコチン生合成遺伝子の下方調節が様々な調査によって確認されており（参照により本明細書に組み込まれる、Hibi, N., Higashiguchi, S., Hashimoto, T., and Yamada, Y. (1994). Gene-Expression in Tobacco Low-Nicotine Mutants. Plant Cell 6, 723-735；Reed, D. G., and Jelesko, J. G. (2004). The A and B loci of Nicotiana tabacum have non-equivalent effects on the mRNA levels of four alkaloid biosynthetic genes. Plant Science 167 1123 - 1130の両方）、Nic１及びNic２が、ニコチン関連構造遺伝子の発現を特異的に制御する調節遺伝子座であることが示唆される。後続の研究は、これらの２つの遺伝子座はまた、ストレス応答遺伝子などのニコチン生合成と関係のない多数の遺伝子の発現も制御することを示した（参照により組み込まれる、Kidd, S. K., Melillo, A. A., Lu, R. H., Reed, D. G., Kuno, N., Uchida, K., Furuya, M., and Jelesko, J. G. (2006). The A and B loci in tobacco regulate a network of stress response genes, few of which are associated with nicotine biosynthesis. Plant Mol Biol 60, 699-716）。
ＨＡ－Ｂ２１及びＬＡ－Ｂ２１のマイクロアレイ解析から、Ｎｉｃ２遺伝子座においてニコチン生合成を調節するＥＲＦ（エチレン応答因子， ethylene response factor）遺伝子のクラスターが同定された（参照により本明細書に組み込まれる、Shoji, T., Kajikawa, M., and Hashimoto, T. (2010). Clustered transcription factor genes regulate nicotine biosynthesis in tobacco. The Plant Cell 22, 3390-3409）。ｎｉｃ２変異体系統、例えば、ＬＡ－Ｂ２１及びＨＩ－Ｂ２１において、これらのＥＲＦ遺伝子は、完全に欠失している。近年の研究は、Ｎｉｃ２領域はＥＲＦ遺伝子のクラスターを含有し、第１９染色体に配置されていることを確認した（参照により本明細書に組み込まれる、Kajikawa, M., Sierro, N., Kawaguchi, H., Bakaher, N., Ivanov, N. I., Hashimoto, T., and Shoji, T. (2017). Genomic insights into the evolution of the nicotine biosynthesis pathway in tobacco. Plant Physiology 174, 999-1011）。
タバコにおけるＮｉｃ１遺伝子座の配置の解明は、アルカロイドレベルなどの定量的な形質の複雑な性質のために難しいことが証明されており、これがマップベースのクローニングアプローチを妨げている。
初めてＨｕｍｐｈｒｙらが、国際公開第２０１８／２３７１０７号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）で、第７染色体に配置されたＮｉｃ１遺伝子座がＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子の多数のホメオログを含有することを実証し、これらのＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子がニコチンレベルを調節することにおいて機能することを示したことから、Ｎｉｃ１が、Ｎｉｃ２と類似した様式でニコチン生合成を調節する可能性があることが示唆される。
植物（例えば、タバコ）におけるアルカロイド含有量を改変することは、数々の商業的な利点を有する可能性がある。例えば、植物における総アルカロイド含有量を減少させることは、前記植物のバイオマス資源としての価値を増加させることができる。例えば、アルカロイド含有量を改変することは、タバコ植物のアルカロイド含有量、例えば、ニコチン含有量を低減させることを含み得る。ニコチンを低減させたタバコ植物及び製品は、「ニコチン上限（nicotine ceiling）」、すなわち送達システムにおけるニコチンの平均上限の将来性のある調節の観点において望ましい可能性がある。或いは、植物、例えばタバコ植物におけるアルカロイド含有量を増加させることは、昆虫や草食動物に対する植物の防御を助けることができる。アルカロイド含有量が調節された、例えば、ニコチン含有量が調節された、改善された商業的に望ましい形質を有する植物及びそれを作製するための方法の必要が未だある。
タバコピリジンアルカロイドは、採取後葉乾燥（curing）の間に形成されるタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ，tobacco-specific nitrosamine）の前駆体である。乾燥タバコ葉に見られる４種の主要なＴＳＮＡとして、Ｎ’－ニトロソノルニコチン（ＮＮＮ，N’-nitrosonornicotine）、Ｎ’ニトロソアナタビン（ＮＡＴ，N’nitrosoanatabine）、Ｎ’－ニトロソアナバシン（ＮＡＢ，N’-nitrosoanabasine）及び４－（メチルニトロソアミノ）－１－（３－ピリジル）－１－ブタノン（ＮＮＫ，4-(methyl nitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone）がある。
ＴＳＮＡは、亜酸化窒素種（例えば、ＮＯ、ＮＯ２、Ｎ２Ｏ３及びＮ２Ｏ４）がタバコアルカロイドと反応すると形成される。ＮＡＴ及びＮＡＢは、それぞれ二次的なアルカロイドであるアナタビン及びアナバシンのニトロソ化を介して形成される。初期の研究は、ＮＮＮがニコチンとノルニコチンの両方に由来すると主張したが、より最近の報告は、乾燥タバコ葉におけるＮＮＮの出現が、ニコチンではなくノルニコチン含有量と相関することを実証した（両方とも参照により本明細書に組み込まれる、Bush et al., Rec. Adv. Tob. Sci. 27; 23-46 (2001); Lewis et al., Plant Biotech J. 6: 346-354 (2008)）。ノルニコチンは、ニコチンの脱メチル化された誘導体であり、総アルカロイド含有量の９０％を占めるタバコにおける主要なアルカロイドである（参照により本明細書に組み込まれる、Saitoh et al., 1985 Phytochemistry, 24 pp. 477-480）。ＮＮＫ形成の前駆体／産物の関係は、あまり明確ではない。一部の研究は、ＮＮＫはニコチンのニトロソ化産物であるが、ニコチンのニトロソ化の遅い反応速度のために、ニコチンそれ自体というよりニコチンの酸化された誘導体がＮＮＫの直接的な前駆体として役立つ可能性があることを述べている（参照により本明細書に組み込まれる、Caldwell et al Ann. N.Y. Acad. Sci. 686, 213-228 (1993)）。ＴＳＮＡ前駆体の産生及び調節に関与する遺伝子を同定することは、高い重要性がある。
ノルニコチンは、典型的には、タバコ植物中の総ピリジンアルカロイド含有量のわずか２～４％を占めるに過ぎないが、高ノルニコチン含有コンバーター植物の自発的な出現につながる遺伝学的不安定は、送達システムにおける慢性的な問題である。低いノルニコチンレベルを維持することは、このアルカロイドに関連する好ましくない香り及び芳香を妨げる可能性があり、加えて、送達システムにおける、ノルニコチンが直接的な前駆体であるＮ－ニトロソノルニコチン（ＮＮＮ）の形成を低減させる可能性がある。
ニコチンからノルニコチンへの変換の大部分に関与する遺伝子は、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼをコードするニコチンデメチラーゼ遺伝子ＣＹＰ８２Ｅ４である（両方とも参照により本明細書に組み込まれる、Siminszky et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102 (2005), pp. 14919-14924; Xu et al., Physiol. Plantarum, 129 (2007), pp. 307-319）。タバコにおけるニコチンデメチラーゼ遺伝子ファミリーは、広範囲にわたり特徴付けられているが、ノルニコチンレベルに影響を与える可能性がある他の細胞プロセスについてはほとんどわかっていない。
それでもなお、タバコ植物及びタバコ植物から産生された製品におけるＴＳＮＡのレベルをさらに低減することができる手法を考え出す大きな必要性がある。
実施例に記載されるように、本発明者らは、植物におけるアルカロイド含有量を調節する、例えば、タバコ植物中のニコチン含有量を減少させる目的で、アルカロイド合成に関与する遺伝子を調査することを試みた。
ｎｉｃ１及びｎｉｃ２を含有する熱気送管乾燥タバコ変種（ＦＣ１０１）は、これらの２つの遺伝子座だけに基づくと、予測より低いニコチンレベルを有することが見出された。この変種において、第３の遺伝子座であるＮｉｃ３が低減したニコチンレベルを制御しているという仮説を立てた。
それらの調査が、本発明者らが、ＦＣ１０１（ｎｉｃ１ ｎｉｃ２ ｎｉｃ３）とＬＡＦＣ５３（ｎｉｃ１ ｎｉｃ２ Ｎｉｃ３）との交雑から生成された、Ｎｉｃ３に関して分離している集団を作出するきっかけとなった。得られたＦ２植物のアルカロイド含有量を分析した。Ｆ２にＳＮＰ遺伝子型解析を行って、さらなる解析のために多型マーカーを同定した。本発明者らは、Ｎｉｃ３遺伝子座と共に分離するマーカーを開発した。アルカロイド合成遺伝子の新しい見込みのあるレギュレーターを同定した。
Voelckel, C., Krugel, T., Gase, K., Heidrich, N., van Dam, N. M., Winz, R., and Baldwin, I. T. (2001). Anti-sense expression of putrescine N-methyltransferase confirms defensive role of nicotine in Nicotiana sylvestris against Manduca sexta. Chemoecology 11, 121-126
Valleau W. 1949. Breeding low-nicotine tobacco. Journal of Agricultural Research 78: 171-181
Legg PD, Collins GB, Litton CC. 1970. Registration of La Burley-21 Tobacco Germplasm. Crop Science 10(2): 212
Legg P, Chaplin J, Collins G. (1969). Inheritance of percent total alkaloids in Nicotiana tabacum L.: populations derived from crosses of low alkaloid lines with burley and flue-cured varieties. Journal of Heredity 60: 213-217
Legg P., and G., C. (1971). Inheritance of percent total alkaloids in Nicotiana tabacum L. II. genetic effects of two loci in Burley21 X LA Burley 21 populations. Canadian Journal of Genetics and Cytology 13, 287-291
Hibi, N., Higashiguchi, S., Hashimoto, T., and Yamada, Y. (1994). Gene-Expression in Tobacco Low-Nicotine Mutants. Plant Cell 6, 723-735
Collins, G. B., Legg, P. D., and Kasperba.Mj (1974). Use of Anther-Derived Haploids in Nicotiana .1. Isolation of breeding lines differing in total alkaloid content. Crop Science 14, 77-80
Nielsen, M. T., Legg, P. D., and Collins, G. B. (1988). Registration of HI and LI burley 21 tobacco germplasms. Crop Science 28, 206-207
Reed, D. G., and Jelesko, J. G. (2004). The A and B loci of Nicotiana tabacum have non-equivalent effects on the mRNA levels of four alkaloid biosynthetic genes. Plant Science 167 1123 - 1130
Kidd, S. K., Melillo, A. A., Lu, R. H., Reed, D. G., Kuno, N., Uchida, K., Furuya, M., and Jelesko, J. G. (2006). The A and B loci in tobacco regulate a network of stress response genes, few of which are associated with nicotine biosynthesis. Plant Mol Biol 60, 699-716
Shoji, T., Kajikawa, M., and Hashimoto, T. (2010). Clustered transcription factor genes regulate nicotine biosynthesis in tobacco. The Plant Cell 22, 3390-3409
Kajikawa, M., Sierro, N., Kawaguchi, H., Bakaher, N., Ivanov, N. I., Hashimoto, T., and Shoji, T. (2017). Genomic insights into the evolution of the nicotine biosynthesis pathway in tobacco. Plant Physiology 174, 999-1011
Bush et al., Rec. Adv. Tob. Sci. 27; 23-46 (2001)
Lewis et al., Plant Biotech J. 6: 346-354 (2008)
Saitoh et al., 1985 Phytochemistry, 24 pp. 477-480
Caldwell et al Ann. N.Y. Acad. Sci. 686, 213-228 (1993)
Siminszky et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102 (2005), pp. 14919-14924
Xu et al., Physiol. Plantarum, 129 (2007), pp. 307-319
驚くべきことに、本明細書で教示された通りＮｉｃ３遺伝子座における遺伝子の活性又は発現を調節することによって、タバコ植物のアルカロイド含有量（例えば、ニコチン含有量）を調節できることが見出された。それによって、送達システムの消費者が望む調節されたアルカロイド含有量及び商業的に望ましい形質を有する送達システムを生産することができる。一部の例では、消費者は、低レベルのアルカロイド含有量、例えば、低レベルのニコチン含有量を有する製品を望む場合がある。
本発明は、植物若しくはその一部又は植物細胞（タバコ及び他のタバコ属の種など）が、タンパク質、ペプチド及び代謝産物の生成のために、例えば、治療薬及び医薬品、例えば、抗生物質、ウイルス様粒子又は栄養補助食品（neutraceuticals）又は小分子の生成のために使用される植物分子農業の分野において特に有用であり得る。タバコは、ＰｈａｒｍＰｌａｎｔと呼ばれるＥＵの出資によるプロジェクトにおいてＨＩＶ中和抗体の開発のために使用されており、またＭｅｄｉｃａｇｏ社、Ｃａｎａｄａは、インフルエンザワクチン製造のためのウイルス様粒子の生成のためのタバコベースのプラットフォームに取り組んできた。
他の例において、例えば、ニコチンを含有する液体を利用するデバイス（例えば、電子タバコ）において、又はタバコ加熱デバイス内で使用するための、ニコチンをタバコ植物から精製して純粋なニコチン製品を生成できるように、高いアルカロイドレベル、例えば、高いレベルのニコチン含有量を有する植物を産生することが望ましい場合がある。例えば、高いレベルのニコチンを含有する葉を有する植物の生産は、電子タバコ用のイーリキッドの生産のためのニコチン抽出のコストを低減することができる。
本発明者らは、タバコ植物におけるニコチン生合成の調節を調査した。本発明者らは、本明細書ではＮｉｃ３遺伝子座と呼ばれる新しい遺伝子座を同定し調査した。調節遺伝子座Ｎｉｃ１及びＮｉｃ２に加えて、Ｎｉｃ３がニコチン関連構造遺伝子（及び場合によっては他の関係のない遺伝子）の発現を制御するという仮説を立てた。本発明者らの１つの目的は、変更されたアルカロイド含有量、特に低減されたニコチン含有量を提供することであった。意外なことに、改変されたタバコ植物において、同じ条件下で成長させたその野生型植物カウンターパートと比較してアルカロイド含有量を調節したＮｉｃ３領域中の遺伝子を同定した。特に、本発明者らは、ｎｉｃ１ ｎｉｃ２バックグラウンドにおいて（すなわちすでに低アルカロイド、例えば、低ニコチンを有する植物において）アルカロイド（alkalkoid）（例えば、ニコチン含有量）及びＴＳＮＡ前駆体含有量をさらに低減させることが可能なＮｉｃ３遺伝子座（及びＮｉｃ３遺伝子）を同定した。
本発明者らは、驚くべきことに、Ｎｉｃ３遺伝子の活性又は発現を調節すること、及び／又はＮｉｃ３遺伝子座に変異を提供することによって、タバコ植物若しくはその一部又は植物細胞のアルカロイド含有量、例えば、ニコチン含有量を調節するための方法を決定した。本発明以前は、第３の遺伝子座、すなわち本明細書において記載される「Ｎｉｃ３」が、単独で、又はＮｉｃ１及び／又はＮｉｃ２遺伝子座と組み合わせてアルカロイド含有量を調節するために使用できるということは知られていなかった。
本発明者らは、Ｎｉｃ３遺伝子座の調節が、改変された植物のアルカロイド含有量（例えば、ニコチン含有量）及び／又はＴＳＮＡ前駆体若しくはＴＳＮＡ含有量を低減できることを決定した。
特に、本発明者らは、Ｎｉｃ１遺伝子座、Ｎｉｃ２遺伝子座及びＮｉｃ３遺伝子座の調節（例えば、前記遺伝子座内の遺伝子の変異）が、驚くほど低いアルカロイド含有量（例えば、低いニコチン含有量）及び／又は低いＴＳＮＡ前駆体若しくは低いＴＳＮＡ含有量を有する植物を提供することを決定した。
一態様では、本発明は、タバコ植物若しくはその一部、又はタバコ植物細胞のアルカロイド含有量（例えば、ニコチン含有量）を調節する（例えば、減少させる）方法であって、表３からの少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子、又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列、又は前記遺伝子の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログの活性又は発現を調節することによって前記植物又は細胞を改変するステップを含む方法を提供する。
適切には、本発明のいずれかの態様では、配列番号７３、配列番号７６、配列番号７９、配列番号８２、配列番号８５、配列番号８８、配列番号９１、配列番号９４、配列番号９７、配列番号１００、配列番号１０３、配列番号１０６、配列番号１０９、配列番号１１２、配列番号１１５、配列番号１１８、配列番号１２１、配列番号１２４、配列番号１２７、配列番号１３０、配列番号１３３、配列番号１３６、配列番号１３９、配列番号１４２、配列番号１４５、配列番号１４８又は配列番号１５１から選択される少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子の活性又は発現が調節され得る。適切には、配列番号７３、１１８、１２４又は１２７から選択される少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子の活性又は発現が調節され得る（例えば、低下又は増大され得る）。
適切には、配列番号７３、配列番号７６又は配列番号７９から選択される少なくとも１つの遺伝子の活性又は発現が調節され得る（例えば、低下又は増大され得る）。
別の態様では、本発明は、タバコ植物若しくはその一部、又はタバコ植物細胞のアルカロイド含有量（例えば、ニコチン含有量）を調節する（例えば、減少させる）方法であって、Ｎｉｃ３遺伝子座（例えば、Ｎｉｃ３遺伝子）に少なくとも１つの変異を導入すること、任意に（optionally）、Ｎｉｃ１遺伝子座（例えば、Ｎｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子）に少なくとも１つの変異及び／又はＮｉｃ２遺伝子座（例えば、Ｎｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子）に少なくとも１つの変異を導入することによって、前記植物若しくはその一部又は細胞を改変するステップを含む方法を提供する。
適切には、本発明のいずれかの態様では、Ｎｉｃ３遺伝子は、配列番号７３、配列番号７６、配列番号７９、配列番号８２、配列番号８５、配列番号８８、配列番号９１、配列番号９４、配列番号９７、配列番号１００、配列番号１０３、配列番号１０６、配列番号１０９、配列番号１１２、配列番号１１５、配列番号１１８、配列番号１２１、配列番号１２４、配列番号１２７、配列番号１３０、配列番号１３３、配列番号１３６、配列番号１３９、配列番号１４２、配列番号１４５、配列番号１４８又は配列番号１５１から選択され得る。
適切には、配列番号７３、１１８、１２４又は１２７から選択される少なくとも１つの遺伝子の活性又は発現が調節され得る（例えば、低下又は増大され得る）。適切には、配列番号７３、配列番号７６又は配列番号７９から選択される少なくとも１つの遺伝子の活性又は発現が調節され得る（例えば、低下又は増大され得る）。
一態様では、本発明は、タバコ植物若しくはその一部、又はタバコ植物細胞のアルカロイド含有量（例えば、ニコチン含有量）を調節する（例えば、減少させる）方法であって、
ａ）少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子；
及び任意に、
ｂ）少なくとも１つのＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子；及び／又は
ｃ）少なくとも１つのＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子
の活性又は発現を調節することによって、前記植物又は細胞を改変するステップを含む方法を提供する。
ａ）少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子；
及び任意に、
ｂ）少なくとも１つのＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子；及び／又は
ｃ）少なくとも１つのＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子
の活性又は発現を調節することによって、前記植物又は細胞を改変するステップを含む方法を提供する。
このような方法では、少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子の活性又は発現が改変され、任意に、加えて、少なくとも１つのＮｉｃ１ ＥＲＦ及び／又はＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現が改変されていてもよい。用語「～してもよい、任意に」は、本明細書で使用される場合、その後に記載される特徴が単に任意であることを必要とし、すなわち、存在していてもよいし、又は存在していなくてもよい。用語「及び／又は」は、本明細書で使用される場合、その用語の前及び後に記載される特徴の一方又は両方の存在を許容する。したがってこれは、この態様において、ｉ）少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子；ii）少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子及び少なくとも１つのＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子；iii）少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子及び少なくとも１つのＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子；並びにiv）少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子、少なくとも１つのＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び少なくとも１つのＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子の改変の代替選択肢を網羅する。適切には、選択肢ｉ）において、Ｎｉｃ１ ＥＲＦ又はＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子には改変がない。このような選択肢は同様に、このような改変が企図される本明細書に記載される他の方法、使用及び製品にも適用される。
別の態様では、本発明は、タバコ植物若しくはその一部、又はタバコ植物細胞のアルカロイド含有量（例えば、ニコチン含有量）を調節する（例えば、減少させる）方法であって、Ｎｉｃ３遺伝子座（例えば、Ｎｉｃ３遺伝子）に少なくとも１つの変異を導入すること、任意に、Ｎｉｃ１遺伝子座（例えば、Ｎｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子）に少なくとも１つの変異及び／又はＮｉｃ２遺伝子座（例えば、Ｎｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子）に少なくとも１つの変異を導入することによって、前記植物若しくはその一部又は細胞を改変するステップを含む方法を提供する。このような方法では、少なくとも１つの変異が、Ｎｉｃ３遺伝子座に導入され、加えて、少なくとも１つの変異が、Ｎｉｃ１遺伝子座及び／又はＮｉｃ２遺伝子座に導入されてもよい。それゆえにこれは、ｉ）Ｎｉｃ３遺伝子座に少なくとも１つの変異；ii）Ｎｉｃ３遺伝子座に少なくとも１つの変異及びＮｉｃ１遺伝子座に少なくとも１つの変異；iii）Ｎｉｃ３遺伝子座に少なくとも１つの変異及びＮｉｃ２遺伝子座に少なくとも１つの変異；並びにiv）Ｎｉｃ３遺伝子座に少なくとも１つの変異、Ｎｉｃ１遺伝子座に少なくとも１つの変異及びＮｉｃ２遺伝子座に少なくとも１つの変異の導入の代替選択肢を網羅する。適切には、選択肢ｉ）において、Ｎｉｃ１遺伝子座又はＮｉｃ２遺伝子座に変異は導入されない。このような選択肢は同様に、このような変異が企図される本明細書に記載される他の方法、使用及び製品にも適用される。
さらなる態様では、本発明は、タバコ植物若しくはその植物の一部、又はタバコ植物細胞におけるタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）前駆体の含有量を調節する（例えば、減少させる）方法であって、
ｉ）
ａ）少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子；任意に、
ｂ）少なくとも１つのＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子；及び／若しくは
ｃ）少なくとも１つのＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子
の活性又は発現を調節すること；又は
ii）Ｎｉｃ３遺伝子座（例えば、Ｎｉｃ３遺伝子）に少なくとも１つの変異を導入すること、任意に、Ｎｉｃ１遺伝子座（例えば、Ｎｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子）に少なくとも１つの変異及び／若しくはＮｉｃ２遺伝子座（例えば、Ｎｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子）に少なくとも１つの変異を導入すること
によって前記植物又は細胞を改変するステップ
を含む方法を提供する。
ｉ）
ａ）少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子；任意に、
ｂ）少なくとも１つのＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子；及び／若しくは
ｃ）少なくとも１つのＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子
の活性又は発現を調節すること；又は
ii）Ｎｉｃ３遺伝子座（例えば、Ｎｉｃ３遺伝子）に少なくとも１つの変異を導入すること、任意に、Ｎｉｃ１遺伝子座（例えば、Ｎｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子）に少なくとも１つの変異及び／若しくはＮｉｃ２遺伝子座（例えば、Ｎｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子）に少なくとも１つの変異を導入すること
によって前記植物又は細胞を改変するステップ
を含む方法を提供する。
さらなる態様では、本発明は、タバコ植物若しくはその一部又はタバコ植物細胞のアルカロイド含有量（例えば、ニコチン含有量）及び／又はＴＳＮＡ前駆体含有量を調節する（例えば、減少させる）ための、
ａ）少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子、任意に、少なくとも１つのＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくは少なくとも１つのＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子；又は
ｂ）Ｎｉｃ３遺伝子座（例えば、Ｎｉｃ３遺伝子）における少なくとも１つの変異、任意に、Ｎｉｃ１遺伝子座（例えば、Ｎｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子）における少なくとも１つの変異及び／若しくはＮｉｃ２遺伝子座（例えば、Ｎｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子）における少なくとも１つの変異
の使用を提供する。
ａ）少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子、任意に、少なくとも１つのＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくは少なくとも１つのＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子；又は
ｂ）Ｎｉｃ３遺伝子座（例えば、Ｎｉｃ３遺伝子）における少なくとも１つの変異、任意に、Ｎｉｃ１遺伝子座（例えば、Ｎｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子）における少なくとも１つの変異及び／若しくはＮｉｃ２遺伝子座（例えば、Ｎｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子）における少なくとも１つの変異
の使用を提供する。
別の態様では、本発明は、調節された（例えば、減少した）アルカロイド含有量（例えば、ニコチン含有量）を有する植物又はその一部、タバコ植物細胞、タバコ植物増殖材料、タバコ葉、切断され採取されたタバコ葉、加工されたタバコ葉又は切断され加工されたタバコ葉を産生するための方法であって、
ｉ）
ａ）少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子；並びに任意に、
ｂ）少なくとも１つのＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子；及び／若しくは
ｃ）少なくとも１つのＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子
の活性又は発現を調節するために；又は
ii）Ｎｉｃ３遺伝子座（例えば、Ｎｉｃ３遺伝子）における少なくとも１つの変異、任意に、Ｎｉｃ１遺伝子座（例えば、Ｎｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子）における少なくとも１つの変異及び／若しくはＮｉｃ２遺伝子座（例えば、Ｎｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子）における少なくとも１つの変異を導入するために、
前記タバコ植物若しくはその一部又はタバコ細胞を改変するステップを含む方法を提供する。
ｉ）
ａ）少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子；並びに任意に、
ｂ）少なくとも１つのＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子；及び／若しくは
ｃ）少なくとも１つのＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子
の活性又は発現を調節するために；又は
ii）Ｎｉｃ３遺伝子座（例えば、Ｎｉｃ３遺伝子）における少なくとも１つの変異、任意に、Ｎｉｃ１遺伝子座（例えば、Ｎｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子）における少なくとも１つの変異及び／若しくはＮｉｃ２遺伝子座（例えば、Ｎｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子）における少なくとも１つの変異を導入するために、
前記タバコ植物若しくはその一部又はタバコ細胞を改変するステップを含む方法を提供する。
適切には、本発明のいずれかの態様では、ニコチン含有量は、Ｎｉｃ３遺伝子座に少なくとも１つの変異、任意に、Ｎｉｃ１遺伝子座に少なくとも１つの変異及び／又はＮｉｃ２遺伝子座に少なくとも１つの変異を導入するために改変されていないタバコ植物若しくはその一部又はタバコ細胞と比較して減少し得る。
別の態様では、本発明は、未改変タバコ植物若しくはその一部又はタバコ細胞と比較したアルカロイド含有量（例えば、ニコチン含有量）の低減を達成するために改変されたタバコ植物若しくはその一部又はタバコ細胞であって、前記改変は、
ｉ）
ａ）少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子；並びに任意に、
ｂ）少なくとも１つのＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子；及び／若しくは
ｃ）少なくとも１つのＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子
の調節された活性若しくは発現；又は
ii）Ｎｉｃ３遺伝子座（例えば、Ｎｉｃ３遺伝子）における少なくとも１つの変異、任意に、Ｎｉｃ１遺伝子座（例えば、Ｎｉｃ１遺伝子）における少なくとも１つの変異及び／若しくはＮｉｃ２遺伝子座（例えば、Ｎｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子）における少なくとも１つの変異
を含む、タバコ植物若しくはその一部又はタバコ細胞を提供する。
ｉ）
ａ）少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子；並びに任意に、
ｂ）少なくとも１つのＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子；及び／若しくは
ｃ）少なくとも１つのＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子
の調節された活性若しくは発現；又は
ii）Ｎｉｃ３遺伝子座（例えば、Ｎｉｃ３遺伝子）における少なくとも１つの変異、任意に、Ｎｉｃ１遺伝子座（例えば、Ｎｉｃ１遺伝子）における少なくとも１つの変異及び／若しくはＮｉｃ２遺伝子座（例えば、Ｎｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子）における少なくとも１つの変異
を含む、タバコ植物若しくはその一部又はタバコ細胞を提供する。
さらなる態様では、本発明は、本発明によるタバコ植物若しくはその一部又はタバコ細胞から、或いは本発明による方法によって産生されたタバコ植物若しくはその一部又はタバコ細胞から得ることができるタバコ植物増殖材料を提供する。
適切には、本発明のいずれかの態様（例えば、本発明による方法又は使用、本発明による植物若しくはその一部又は細胞、或いは本発明による植物増殖材料）において：
ａ）表３に列挙したものから選択されるＮｉｃ３遺伝子、若しくはそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列若しくは前記遺伝子の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログの活性若しくは発現が調節されていてもよいし；又はＮｉｃ３遺伝子座における前記少なくとも１つの変異は、表３に列挙したものから選択されるＮｉｃ３遺伝子、若しくはそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列若しくは前記遺伝子の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログに存在していてもよいし：
ｂ）表１に列挙したものから選択されるＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現が調節されていてもよいし；又はＮｉｃ１遺伝子座における前記少なくとも１つの変異は、配列番号８；若しくは配列番号１２；若しくは配列番号１６；若しくは配列番号２０；若しくは配列番号２４；若しくは配列番号２８；若しくは配列番号３２、又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列から選択されるＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子；、或いは前記遺伝子の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログ；中にあってもよいし；及び／或いは
ｃ）表２に列挙したものから選択されるＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現が調節されていてもよいし；又はＮｉｃ２遺伝子座における前記少なくとも１つの変異は、配列番号６９；配列番号３７；若しくは配列番号４１；若しくは配列番号４５；若しくは配列番号４９；若しくは配列番号５３；若しくは配列番号５７；若しくは配列番号６１；若しくは配列番号６５、又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列から選択されるＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子；、或いは前記遺伝子の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログであり得る。適切には、表３に列挙したものから選択されるＮｉｃ３遺伝子は、配列番号７３、１１８、１２４若しくは１２７、又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列、或いは前記遺伝子の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログから選択され、Ｎｉｃ３遺伝子座における少なくとも１つの変異は、配列番号７３、１１８、１２４若しくは１２７、又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列から選択されるＮｉｃ３遺伝子、或いは前記遺伝子の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログ中にある。
ａ）表３に列挙したものから選択されるＮｉｃ３遺伝子、若しくはそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列若しくは前記遺伝子の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログの活性若しくは発現が調節されていてもよいし；又はＮｉｃ３遺伝子座における前記少なくとも１つの変異は、表３に列挙したものから選択されるＮｉｃ３遺伝子、若しくはそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列若しくは前記遺伝子の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログに存在していてもよいし：
ｂ）表１に列挙したものから選択されるＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現が調節されていてもよいし；又はＮｉｃ１遺伝子座における前記少なくとも１つの変異は、配列番号８；若しくは配列番号１２；若しくは配列番号１６；若しくは配列番号２０；若しくは配列番号２４；若しくは配列番号２８；若しくは配列番号３２、又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列から選択されるＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子；、或いは前記遺伝子の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログ；中にあってもよいし；及び／或いは
ｃ）表２に列挙したものから選択されるＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現が調節されていてもよいし；又はＮｉｃ２遺伝子座における前記少なくとも１つの変異は、配列番号６９；配列番号３７；若しくは配列番号４１；若しくは配列番号４５；若しくは配列番号４９；若しくは配列番号５３；若しくは配列番号５７；若しくは配列番号６１；若しくは配列番号６５、又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列から選択されるＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子；、或いは前記遺伝子の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログであり得る。適切には、表３に列挙したものから選択されるＮｉｃ３遺伝子は、配列番号７３、１１８、１２４若しくは１２７、又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列、或いは前記遺伝子の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログから選択され、Ｎｉｃ３遺伝子座における少なくとも１つの変異は、配列番号７３、１１８、１２４若しくは１２７、又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列から選択されるＮｉｃ３遺伝子、或いは前記遺伝子の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログ中にある。
適切には、本発明のいずれかの態様（例えば、本発明による方法若しくは使用、本発明による植物若しくはその一部、又は本発明による植物増殖材料）において、
ｉ）配列番号８の活性又は発現が調節されてもよいし（例えば、低下又は増大されてもよい）；若しくはＮｉｃ１遺伝子座における前記少なくとも１つの変異が、配列番号８中にあってもよいし；及び／又は
ii）配列番号６９の活性又は発現が調節されてもよいし（例えば、低下又は増大されてもよい）；若しくはＮｉｃ２遺伝子座における前記少なくとも１つの変異が、配列番号６９中にあってもよい。
ｉ）配列番号８の活性又は発現が調節されてもよいし（例えば、低下又は増大されてもよい）；若しくはＮｉｃ１遺伝子座における前記少なくとも１つの変異が、配列番号８中にあってもよいし；及び／又は
ii）配列番号６９の活性又は発現が調節されてもよいし（例えば、低下又は増大されてもよい）；若しくはＮｉｃ２遺伝子座における前記少なくとも１つの変異が、配列番号６９中にあってもよい。
適切には、本発明のいずれかの態様（例えば、本発明による方法若しくは使用、本発明による植物若しくはその一部、又は本発明による植物増殖材料）において、Ｎｉｃ３遺伝子座における前記少なくとも１つの変異は、表３から選択されるＮｉｃ３遺伝子、又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列、又は前記遺伝子の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログ中にあってもよい。
適切には、Ｎｉｃ３遺伝子における前記少なくとも１つの変異は、
ｉ）配列番号７５、若しくはそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列、又は前記ポリペプチドの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログのアミノ酸残基７４～２５８又は４８３～５３８における変異をもたらす、Ｎｉｃ３遺伝子である配列番号７３若しくはそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列、又は前記遺伝子の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログにおける変異；
ii）配列番号１２０、若しくはそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列、又は前記ポリペプチドの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログのアミノ酸残基１２０～５８４における変異をもたらす、Ｎｉｃ３遺伝子である配列番号１１８若しくはそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列、又は前記遺伝子の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログにおける変異；
iii）配列番号１２６、若しくはそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列、又は前記ポリペプチドの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログのアミノ酸残基１６６～４０６又は４８３～９７０における変異をもたらす、Ｎｉｃ３遺伝子である配列番号１２４若しくはそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列、又は前記遺伝子の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログにおける変異；及び
iv）配列番号１２９、若しくはそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列、又は前記ポリペプチドの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログのアミノ酸残基１７１～４０６又は５０９～９６７における変異をもたらす、Ｎｉｃ３遺伝子である配列番号１２７若しくはそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列、又は前記遺伝子の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログにおける変異
から選択される。
ｉ）配列番号７５、若しくはそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列、又は前記ポリペプチドの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログのアミノ酸残基７４～２５８又は４８３～５３８における変異をもたらす、Ｎｉｃ３遺伝子である配列番号７３若しくはそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列、又は前記遺伝子の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログにおける変異；
ii）配列番号１２０、若しくはそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列、又は前記ポリペプチドの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログのアミノ酸残基１２０～５８４における変異をもたらす、Ｎｉｃ３遺伝子である配列番号１１８若しくはそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列、又は前記遺伝子の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログにおける変異；
iii）配列番号１２６、若しくはそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列、又は前記ポリペプチドの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログのアミノ酸残基１６６～４０６又は４８３～９７０における変異をもたらす、Ｎｉｃ３遺伝子である配列番号１２４若しくはそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列、又は前記遺伝子の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログにおける変異；及び
iv）配列番号１２９、若しくはそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列、又は前記ポリペプチドの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログのアミノ酸残基１７１～４０６又は５０９～９６７における変異をもたらす、Ｎｉｃ３遺伝子である配列番号１２７若しくはそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列、又は前記遺伝子の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログにおける変異
から選択される。
一態様では、本発明は、植物を育種するための、本発明による植物若しくはその一部又は植物細胞の、又は本発明による方法によって生成された植物の使用を提供する。
一態様では、本発明は、製品の生成のための、本発明による植物若しくはその一部又は植物細胞の、又は本発明による方法によって生成された植物の使用を提供する。
一態様では、本発明は、作物を生育させるための、本発明による植物若しくはその一部又は植物細胞の、又は本発明による方法によって生成された植物の使用を提供する。
一態様では、本発明は、葉を生成するための、本発明による植物若しくはその一部の、又は本発明による方法によって生成された植物の使用を提供する。
さらなる態様では、本発明は、本発明による植物の、又は本発明による増殖材料から増殖させた植物から得ることができる、又は本発明による使用によって得られた植物から得ることができる、又は本発明による方法によって生成された植物から得ることができる採取された葉を提供する。
採取された葉は、緑色の葉、例えば、緑色の新鮮な葉又は乾燥葉であり得る。
適切には、本発明による採取された葉は、切断され採取された葉であり得る。
別の態様では、本発明は、
本発明による使用から得ることができる植物から得ることができる（例えば、得られた）、
本発明に従って植物を加工することによって得ることができる（例えば、得られた）、
本発明による植物増殖材料から増殖させた植物から得ることができる（例えば、得られた）、又は
本発明による植物の採取された葉を加工することによって得ることができる（例えば、得られた）、又は
本発明による方法によって生成された植物から得ることができる（例えば、得られた）、
加工された葉、好ましくは、加工されたタバコの葉、好ましくは、生育不能な加工されたタバコの葉を提供する。
本発明による使用から得ることができる植物から得ることができる（例えば、得られた）、
本発明に従って植物を加工することによって得ることができる（例えば、得られた）、
本発明による植物増殖材料から増殖させた植物から得ることができる（例えば、得られた）、又は
本発明による植物の採取された葉を加工することによって得ることができる（例えば、得られた）、又は
本発明による方法によって生成された植物から得ることができる（例えば、得られた）、
加工された葉、好ましくは、加工されたタバコの葉、好ましくは、生育不能な加工されたタバコの葉を提供する。
適切には、本発明による加工された葉は、乾燥させること、発酵させること、低温殺菌すること又はそれらの組合せによって加工され得、好ましくは、Ｎ’－ニトロソノルニコチン（ＮＮＮ）、４－（メチルニトロソアミノ）－１－（３－ピリジル）－１－ブタノン（ＮＮＫ）、Ｎ’－ニトロソアナタビン（ＮＡＴ）及びＮ－ニトロソアナバシン（ＮＡＢ）から選択される１つ又は２つ以上のＴＳＮＡの含有量が減少し、好ましくは、ＮＮＮ及び／又はＮＮＫの含有量が調節され（例えば、減少し）、より好ましくは、ＮＮＮの含有量が減少する。
適切には、本発明による加工された葉は、切断され加工された葉であり得る。
さらなる態様において、本発明は、
本発明に従う使用から得ることができる植物から得ることができる（例えば、得られた）、
本発明に従って植物を加工することによって得ることができる（例えば、得られた）、
本発明による植物増殖材料から増殖させた植物から得ることができる（例えば、得られた）、又は
本発明による植物の採取された葉を加工することによって得ることができる（例えば、得られた）、又は
本発明による方法によって生成された植物から得ることができる、
植物又はその一部から作製された乾燥タバコ材料を提供する。
本発明に従う使用から得ることができる植物から得ることができる（例えば、得られた）、
本発明に従って植物を加工することによって得ることができる（例えば、得られた）、
本発明による植物増殖材料から増殖させた植物から得ることができる（例えば、得られた）、又は
本発明による植物の採取された葉を加工することによって得ることができる（例えば、得られた）、又は
本発明による方法によって生成された植物から得ることができる、
植物又はその一部から作製された乾燥タバコ材料を提供する。
適切には、乾燥タバコ材料、タバコブレンド又は送達システムは、乾燥重量に基づき、約０．０１％、０．０２％、０．０５％、０．０７５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、１．１％、１．２％、１．３％、１，４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２．０％、２．１％、２．２％、２．３％、２，４％、２，５％、２．６％、２，７％、２．８％、２．９％、３％、４％又は５％の平均アルカロイドレベル又は平均ニコチンレベルを含んでいてもよい。適切には、乾燥タバコ材料は、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．９％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、０．１％未満、０．０７５％未満、０．０５％未満、０．０２％未満又は０．０１％未満の平均アルカロイドレベル又は平均ニコチンレベルを含んでいてもよい。
別の態様では、本発明は、本発明による乾燥タバコ材料を含むタバコブレンドを提供する。
さらなる態様では、本発明は、
本発明によるタバコ植物、若しくはその一部；
本発明によるタバコ植物増殖材料から増殖させたタバコ植物若しくはその一部；
本発明による植物の採取された葉；
本発明による加工された葉；
又は
本発明による方法によって産生された植物
から調製された送達システムを提供する。
本発明によるタバコ植物、若しくはその一部；
本発明によるタバコ植物増殖材料から増殖させたタバコ植物若しくはその一部；
本発明による植物の採取された葉；
本発明による加工された葉；
又は
本発明による方法によって産生された植物
から調製された送達システムを提供する。
適切には、本発明による送達システムは、可燃性喫煙物品であり得る。
適切には、本発明による送達システムは、無煙の送達システムであり得る。
適切には、本発明による送達システムは、非可燃性エアロゾル供給システム、例えば、タバコ加熱デバイス又はエアロゾル生成デバイスであり得る。
さらなる態様では、本発明は、本発明による植物若しくはその一部若しくはそれらの抽出物（例えば、タバコ抽出物）；又は本発明による乾燥タバコ材料；又は本発明によるタバコブレンドを含む、可燃性喫煙物品、非可燃性エアロゾル供給システム、無煙の送達システム又はタバコ加熱デバイスを提供する。
別の態様では、本発明は、低減したアルカロイド含有量（例えば、ニコチン含有量）及び／又は低減したタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）若しくはＴＳＮＡの前駆体の含有量を有する植物を選択するための、Ｎｉｃ３遺伝子座（例えば、表３からの、若しくは配列番号７３、１１８、１２４若しくは１２７、又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を有する遺伝子から選択されるＮｉｃ３遺伝子、或いは前記遺伝子の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログ）、任意に、Ｎｉｃ１遺伝子座（例えば、Ｎｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子）及び／又はＮｉｃ２遺伝子座（例えば、Ｎｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子）のヌクレオチド配列の使用を提供する。適切には、前記ヌクレオチド配列は、変異を含んでいてもよい。
さらなる態様では、本発明は、Ｎｉｃ３遺伝子座における（例えば、表３からの、若しくは配列番号７３、１１８、１２４若しくは１２７、又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を有する遺伝子から選択されるＮｉｃ３遺伝子、或いは前記遺伝子の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログにおける）少なくとも１つの遺伝的変異、任意に、Ｎｉｃ１遺伝子座における（例えば、Ｎｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子における）少なくとも１つの遺伝的変異及び／又はＮｉｃ２遺伝子座における（例えば、Ｎｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子における）少なくとも１つの遺伝的変異を有する植物の変異体であって、前記遺伝的変異は、前記遺伝的変異を有さない比較できる植物と比較して、変異体タバコ植物において、アルカロイド含有量（例えば、ニコチン含有量）を減少させるか、及び／又はタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）若しくはＴＳＮＡの前駆体の含有量を減少させる、変異体を提供する。
さらなる態様では、本発明は、本発明による遺伝的変異を有する変異体植物の後代又は種子を提供する。
別の態様では、本発明は、Ｎｉｃ３遺伝子座における（例えば、表３からの、又は配列番号７３、１１８、１２４若しくは１２７、又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を有する遺伝子から選択されるＮｉｃ３遺伝子、或いは前記遺伝子の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログにおける）少なくとも１つの変異、及び任意に、Ｎｉｃ１遺伝子座（例えば、Ｎｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子）における少なくとも１つの変異及び／又はＮｉｃ２遺伝子座（例えば、Ｎｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子）における少なくとも１つの変異を含む植物から産生され採取された葉、加工された葉又は乾燥タバコ材料であって、前記植物は、Ｎｉｃ３遺伝子座、並びに任意にＮｉｃ１遺伝子座及び／又はＮｉｃ２遺伝子座における前記変異を有さない比較できる植物と比較して、減少したニコチン含有量及び／又はタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）若しくはＴＳＮＡの前駆体の減少した含有量を有する、採取された葉、加工された葉又は乾燥タバコ材料を提供する。
本発明の実施形態を、添付の図面を参照して、以下に単なる一例として記載する。
配列表
本明細書及び対応する配列表の全体を通して使用される配列識別子の概要を以下の通りである。
本明細書及び対応する配列表の全体を通して使用される配列識別子の概要を以下の通りである。
配列番号２９８は、マーカーＮｔ１ＡＧ１７５０に対応する。
配列番号２９９は、マーカーＮｔ１ＡＣ２３０７に対応する。
配列番号３００は、ＳＮＰ３のためのフォワードプライマーである。
配列番号３０１は、ＳＮＰ３のためのリバースプライマーである。
配列番号３０２は、ＳＮＰ５のためのフォワードプライマーである。
配列番号３０３は、ＳＮＰ５のためのリバースプライマーである。
配列番号３０４は、ＳＮＰ１５のためのフォワードプライマーである。
配列番号３０５は、ＳＮＰ１５のためのリバースプライマーである。
配列番号３０６は、ＳＮＰ１８のためのフォワードプライマーである。
配列番号３０７は、ＳＮＰ１８のためのリバースプライマーである。
配列番号３０８は、ＳＮＰ１９のためのフォワードプライマーである。
配列番号３０９は、ＳＮＰ１９のためのリバースプライマーである。
配列番号３１０は、マーカーＮｔ２ＡＧ２０１５に対応する。
配列番号３１１は、マーカーＮｔ１ＡＧ１７５０に対応する。
配列番号３１２は、マーカーＮｔ１ＡＣ２３０７に対応する。
配列番号３１３～５６９は、実施例で同定されたＱＴＬに関連するＳＮＰの配列である。
配列番号５７０は、実施例７で使用されるＴＲＶ ＲＮＡ１である。
配列番号５７１～５７４は、実施例７で使用されるＴＲＶ ＲＮＡ２配列である。
本明細書において開示されている一部の配列は、ヌクレオチド配列中に「Ｎ」を含有する。「Ｎ」は、任意のヌクレオチド、又は１若しくは２以上のヌクレオチドの欠失若しくは挿入であり得る。例えば、一部のケースでは、一続きの「Ｎ」が示されている。「Ｎ」の数は、その位置にあるヌクレオチドの実際の数と必ずしも相関しない。配列中で「Ｎ」として示されているものより多くの又は少ないヌクレオチドが存在し得る。
詳細な説明
本発明者らは、初めて、タバコにおけるニコチン生合成を調節するＮｉｃ３遺伝子座を同定した。
本発明者らは、初めて、タバコにおけるニコチン生合成を調節するＮｉｃ３遺伝子座を同定した。
植物（例えば、タバコ植物）若しくはその一部又はタバコ細胞において少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子の活性又は発現を調節することによって、植物のアルカロイド及び／又はＴＳＮＡ含有量を調節することができる（例えば、低減することができる）。Ｎｉｃ３遺伝子座に変異を導入することによって、植物若しくはその一部又は植物細胞のアルカロイド（例えば、ニコチン）含有量を調節することができる（例えば、低減することができる）。
本明細書で使用される場合、「Ｎｉｃ３」遺伝子座は、Ｎｉｃ３領域内の、又はそれと密接に連鎖しているあらゆる染色体の位置又は配置を指す。
「Ｎｉｃ３領域」は、図３に示される２０６ｃＭ～３９８ｃＭに対応し、低アルカロイド（低ニコチン）特色に関連する対立遺伝子を有する、マーカーＮｔ１ＡＧ１７５０（配列番号２９８）及びＮｔ１ＡＣ２３０７（配列番号２９９）によって範囲を定められた染色体セグメントを指す。
「Ｎｉｃ３変異」は、Ｎｉｃ３遺伝子座における変異を指す。
「Ｎｉｃ３遺伝子」は、本明細書で使用される場合、Ｎｉｃ３遺伝子座にあるか又はそれに近い遺伝子を指し、その例としては、例えば、表３に列挙した遺伝子；又はそれに対して少なくとも８０％の同一性（それに対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性）を有する配列、又は前記遺伝子の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログが挙げられる。
適切には、Ｎｉｃ３遺伝子は、配列番号７３、配列番号７６、配列番号７９、配列番号８２、配列番号８５、配列番号８８、配列番号９１、配列番号９４、配列番号９７、配列番号１００、配列番号１０３、配列番号１０６、配列番号１０９、配列番号１１２、配列番号１１５、配列番号１１８、配列番号１２１、配列番号１２４、配列番号１２７、配列番号１３０、配列番号１３３、配列番号１３６、配列番号１３９、配列番号１４２、配列番号１４５、配列番号１４８若しくは配列番号１５１；又はそれに対して少なくとも８０％の同一性（それに対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性）を有する配列、又は前記遺伝子の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログから選択され得る。
適切には、Ｎｉｃ３遺伝子は、配列番号７３、配列番号７６若しくは配列番号７９；又はそれに対して少なくとも８０％の同一性（それに対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性）を有する配列、又は前記遺伝子の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログから選択され得る。適切には、Ｎｉｃ３遺伝子は、配列番号７３、配列番号１１８、配列番号１２４若しくは配列番号１２７；又はそれに対して少なくとも８０％の同一性（それに対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性）を有する配列、又は前記遺伝子の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログから選択され得る。
別の態様では、Ｎｉｃ３遺伝子座は、配列番号７３、配列番号７６、配列番号７９、配列番号８２、配列番号８５、配列番号８８、配列番号９１、配列番号９４、配列番号９７、配列番号１００、配列番号１０３、配列番号１０６、配列番号１０９、配列番号１１２、配列番号１１５、配列番号１１８、配列番号１２１、配列番号１２４、配列番号１２７、配列番号１３０、配列番号１３３、配列番号１３６、配列番号１３９、配列番号１４２、配列番号１４５、配列番号１４８及び配列番号１５１からなる群から（適切には、配列番号７３、配列番号１１８、配列番号１２４及び配列番号１２７からなる群から）選択される配列の、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６０００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１５０００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、７００００ヌクレオチド以内の配列又は染色体セグメントを含む。
一態様では、Ｎｉｃ３遺伝子は、配列番号７３、配列番号１１８、配列番号１２４若しくは配列番号１２７；又はそれに対して少なくとも８０％の同一性（それに対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性）を有する配列、又は前記遺伝子の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログである。
適切には、Ｎｉｃ３遺伝子は、表３に記載のアミノ酸配列；又はそれに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列（それに対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性）、又は前記ポリペプチドの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含むポリペプチドをコードし得る。
適切には、Ｎｉｃ３遺伝子は、配列番号７５、配列番号７８、配列番号８１、配列番号８４、配列番号８７、配列番号９０、配列番号９３、配列番号９６、配列番号９９、配列番号１０２、配列番号１０５、配列番号１０８、配列番号１１１、配列番号１１４、配列番号１１７、配列番号１２０、配列番号１２３、配列番号１２６、配列番号１２９、配列番号１３２、配列番号１３５、配列番号１３８、配列番号１４１、配列番号１４４、配列番号１４７、配列番号１５０若しくは配列番号１５３；又はそれに対して少なくとも８０％の同一性（それに対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性）を有する配列、又は前記ポリペプチドの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログから選択されるポリペプチドをコードし得る。
適切には、Ｎｉｃ３遺伝子は、配列番号７５、配列番号７８若しくは配列番号８１；又はそれに対して少なくとも８０％の同一性（それに対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性）を有する配列、又は前記ポリペプチドの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログから選択されるポリペプチドをコードし得る。
一態様では、Ｎｉｃ３遺伝子は、配列番号７５、配列番号１２０、配列番号１２６若しくは配列番号１２９；又はそれに対して少なくとも８０％の同一性（それに対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性）を有する配列、又は前記ポリペプチドの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。
一態様では、Ｎｉｃ３遺伝子座は、表３から選択される１つ又は２つ以上の配列を含む。
一態様では、Ｎｉｃ３遺伝子座は、配列番号７３、配列番号７６、配列番号７９、配列番号８２、配列番号８５、配列番号８８、配列番号９１、配列番号９４、配列番号９７、配列番号１００、配列番号１０３、配列番号１０６、配列番号１０９、配列番号１１２、配列番号１１５、配列番号１１８、配列番号１２１、配列番号１２４、配列番号１２７、配列番号１３０、配列番号１３３、配列番号１３６、配列番号１３９、配列番号１４２、配列番号１４５、配列番号１４８及び配列番号１５１、及びそれに対して少なくとも８０％の同一性（それに対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性）を有する配列、並びに前記遺伝子の機能的バリアント及び機能的断片及びオルソログからなる群から選択される１つ又は２つ以上の配列を含む。
適切には、Ｎｉｃ３遺伝子座は、配列番号７３、配列番号７６及び配列番号７９、及びそれに対して少なくとも８０％の同一性（それに対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性）を有する配列、並びに前記遺伝子の機能的バリアント及び機能的断片及びオルソログからなる群から選択される１つ又は２つ以上の配列を含んでいてもよい。
一態様では、Ｎｉｃ３遺伝子座は、配列番号７３、配列番号１１８、配列番号１２４若しくは配列番号１２７、又はそれに対して少なくとも８０％の同一性（それに対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性）を有する配列、又は前記遺伝子の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログの少なくとも１つ又はそれより多くを含む。
「と密接に連鎖している」又は「に関連する」は、本明細書で使用される場合、マーカー又は遺伝子座が、別のマーカー又は遺伝子座の、約２０ｃＭ、１０ｃＭ、５ｃＭ、１ｃＭ、０．５ｃＭ以内であるか又は０．５ｃＭ未満であることを意味する。例えば、１０ｃＭは、約１０％に等しいか又はそれ未満の頻度でのマーカーと遺伝子座との組換えを意味する。
センチモルガン（ｃＭ）は、本明細書で使用される場合、組換え頻度の尺度の単位を指す。ｃＭは、単一世代における交差によって１つの遺伝子座におけるマーカーが第２の遺伝子座におけるマーカーから分離されると予想される事象が１％であることに等しい。コサンビ（Kosambi）の関数を使用して組換え価から遺伝学的距離を計算するための方法は当技術分野において公知であり、例えば、Kosambi（Annals of Eugenics, 12:172-175 (1944)、参照により本明細書に組み入れられる）に記載の通りである。
「Ｎｉｃ１」遺伝子座は、本明細書で使用される場合、Ｎｉｃ１領域内の、又はそれと密接に連鎖しているあらゆる染色体の位置又は配置を指す。
「Ｎｉｃ１領域」は、国際公開第２０１８／２３７１０７号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示された通りの染色体セグメントを指し、例えば、マーカーＳＮＰ３及びＳＮＰ５ Ｎｔ１ＡＢ６５９１及びＮｔ１ＡＡ９７７７）によって範囲を定められた、低アルカロイド（低ニコチン）特色に関連する対立遺伝子を有する染色体セグメントを指す。ＳＮＰ３のためのフォワードプライマーは、配列番号３００であり；ＳＮＰ３のためのリバースプライマーは、配列番号３０１である。ＳＮＰ５のためのフォワードプライマーは、配列番号３０２であり；ＳＮＰ５のためのリバースプライマーは、配列番号３０３である。
「Ｎｉｃ１変異」は、Ｎｉｃ１遺伝子座における変異を指す。
一態様において、Ｎｉｃ１遺伝子座は、表１から選択される１つ又は２つ以上の配列を含む。
一態様において、Ｎｉｃ１遺伝子座は、配列番号５、配列番号１、配列番号９、配列番号１３、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２５、配列番号２９、及び配列番号３３、及びそれに対して少なくとも８０％の同一性（それに対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性）を有する配列、並びに前記遺伝子の機能的バリアント及び機能的断片及びオルソログからなる群から選択される１つ又は２つ以上の配列を含む。
一態様では、Ｎｉｃ１遺伝子座は、少なくとも配列番号８、又はそれに対して少なくとも８０％の同一性（それに対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性）を有する配列、又は前記遺伝子の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含む。
別の態様では、Ｎｉｃ１遺伝子座は、配列番号５、配列番号１、配列番号９、配列番号１３、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２５、配列番号２９、及び配列番号３３からなる群から選択される配列の、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６０００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１５０００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、７００００ヌクレオチド以内の配列又は染色体セグメントを含む。
「Ｎｉｃ１遺伝子」は、本明細書で使用される場合、Ｎｉｃ１遺伝子座にあるか又はそれに近い遺伝子を指し、その例としては、例えば、表１に列挙した遺伝子；又はそれに対して少なくとも８０％の同一性（それに対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性）を有する配列、又は前記遺伝子の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログが挙げられる。
少なくとも１つのＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子は、配列番号８；又は配列番号１２；又は配列番号１６；又は配列番号２０；又は配列番号２４；又は配列番号２８；又は配列番号３２に記載のアミノ酸配列又はそれらの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含むポリペプチドをコードする遺伝子を含む群から選択されてもよいし、或いはＥＲＦ遺伝子は、配列番号５；又は配列番号９；又は配列番号１３；又は配列番号１７；又は配列番号２１；又は配列番号２５；又は配列番号２９に記載のヌクレオチド配列；又はそれらの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含む。
適切には、少なくとも１つのＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子は、配列番号８；又は配列番号１２；又は配列番号１６；又は配列番号２０；又は配列番号２４；又は配列番号２８；又は配列番号３２に記載のアミノ酸配列又はそれらの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含むポリペプチドをコードする遺伝子を含む群から選択される１つ、又は２つ、又は３つ、又は４つ、又は５つ、又は６つ又は７つの遺伝子であってもよいし；或いはＥＲＦ遺伝子は、配列番号５；又は配列番号９；又は配列番号１３；又は配列番号１７；又は配列番号２１；又は配列番号２５；又は配列番号２９に記載のヌクレオチド配列；又はそれらの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含む。
一態様では、少なくとも１つのＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子は、配列番号８に記載のアミノ酸配列又はそれらの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含むポリペプチドをコードするか；或いはＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子は、配列番号５に記載のヌクレオチド配列又はそれらの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含む。
一態様では、少なくとも１つの追加のＮｉｃ１ ＥＲＦの活性又は発現が調節される。適切には、表１から選択される、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ又は少なくとも８つの追加のＮｉｃ１ ＥＲＦも調節されてもよい。
一態様では、少なくとも１つのＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子は、配列番号８に記載のアミノ酸配列又はそれらの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含むポリペプチドをコードするか；或いは少なくとも１つのＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子は、配列番号５に記載のヌクレオチド配列又はそれらの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含み；少なくとも１つの追加のＮｉｃ１ ＥＲＦの活性又は発現が調節される。適切には、少なくとも１つの追加のＮｉｃ１ ＥＲＦは、配列番号４；又は配列番号１２；又は配列番号１６；又は配列番号２０；又は配列番号２４；又は配列番号２８；又は配列番号３２；又は配列番号３６に記載のアミノ酸配列又はそれらの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含むポリペプチドをコードするＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子から選択されてもよいし；或いはＥＲＦ遺伝子は、配列番号１；配列番号３、又は配列番号９；又は配列番号１３；又は配列番号１７；又は配列番号２１；又は配列番号２５；又は配列番号２９；又は配列番号３３に記載のヌクレオチド配列又はそれらの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含む。適切には、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ又は少なくとも８つの追加のＮｉｃ１ ＥＲＦが調節され得る。
「Ｎｉｃ２」遺伝子座は、本明細書で使用される場合、Ｎｉｃ２領域内の、又はそれと密接に連鎖しているあらゆる染色体の位置又は配置を指す。
「Ｎｉｃ２領域」は、国際公開第２０１８／２３７１０７号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示された通りの染色体セグメントを指し、例えば、マーカーＳＮＰ１５及びＳＮＰ１８／１９によって境界を定められ、低アルカロイド（低ニコチン）特色に関連する対立遺伝子を有する染色体セグメントを指す。ＳＮＰ１５のためのフォワードプライマーは、配列番号３０４であり；ＳＮＰ１５のためのリバースプライマーは、配列番号３０５である。ＳＮＰ１８のためのフォワードプライマーは、配列番号３０６であり；ＳＮＰ１８のためのリバースプライマーは、配列番号３０７である。ＳＮＰ１９のためのフォワードプライマーは、配列番号３０８であり；ＳＮＰ１９のためのリバースプライマーは、配列番号３０９である。
「Ｎｉｃ２変異」は、Ｎｉｃ２遺伝子座における変異を指す。
一態様において、Ｎｉｃ１遺伝子座は、表１から選択される１つ又は２つ以上の配列を含む。
一態様において、Ｎｉｃ２遺伝子座は、配列番号６９、配列番号３７、配列番号４１、配列番号４５、配列番号４９、配列番号３、配列番号５７、配列番号６１、及び配列番号６５、及びそれに対して少なくとも８０％の同一性（それに対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性）を有する配列、並びに前記遺伝子の機能的バリアント及び機能的断片及びオルソログからなる群から選択される１つ又は２つ以上の配列を含む。
一態様では、Ｎｉｃ２遺伝子座は、少なくとも配列番号６９又はそれに対して少なくとも８０％の同一性（それに対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性）を有する配列、又は前記遺伝子の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含む。
別の態様では、Ｎｉｃ２遺伝子座は、配列番号６９、配列番号３７、配列番号４１、配列番号４５、配列番号４９、配列番号３、配列番号５７、配列番号６１、及び配列番号６５からなる群から選択される配列の、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６０００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１５０００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、７００００ヌクレオチド以内の配列又は染色体セグメントを含む。
「Ｎｉｃ２遺伝子」は、本明細書で使用される場合、Ｎｉｃ２遺伝子座にあるか又はそれに近い遺伝子を指し、その例としては、例えば、表２に列挙した遺伝子；又はそれに対して少なくとも８０％の同一性（それに対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性）を有する配列、又は前記遺伝子の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログが挙げられる。
少なくとも１つのＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子は、配列番号７２；若しくは配列番号４０；若しくは配列番号４４；若しくは配列番号４８；若しくは配列番号５２；若しくは配列番号５６；若しくは配列番号６０、配列番号６４若しくは配列番号６８に記載のアミノ酸配列又はそれらの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含むポリペプチドをコードする遺伝子を含む群から選択されてもよいし；或いはＥＲＦ遺伝子は、配列番号６９；若しくは配列番号３７；若しくは配列番号４１；若しくは配列番号４５；若しくは配列番号４９；若しくは配列番号５３；若しくは配列番号５７；配列番号６１；配列番号６５に記載のヌクレオチド配列；又はそれらの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含む。
適切には、少なくとも１つのＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子は、表２から選択される、１つ、又は２つ、又は３つ、又は４つ、又は５つ、又は６つ、又は７つ、又は８つ、又は９つの遺伝子であり得る。
一態様では、少なくとも１つのＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子は、配列番号７２に記載のアミノ酸配列又はそれらの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含むポリペプチドをコードするか；或いはＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子は、配列番号５９に記載のヌクレオチド配列又はそれらの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含む。
「調節すること」という用語は増大させること又は低下させることのいずれかを意味するように本明細書において使用される。
「アルカロイド含有量を増加させること」という用語は、本発明の製品（例えば、植物、その一部（例えば、葉）、加工された葉又は植物から作製される製品（例えば、送達システム））中の濃度及び／又は総アルカロイド含有量が、本発明に従って改変されていない比較できる製品と比較して高いことを意味するように本明細書において使用される。
「アルカロイド含有量を減少させること」という用語は、本発明の製品（例えば、植物、その一部（例えば、葉）、加工された葉又は植物から作製される製品（例えば、送達システム））中の濃度及び／又は総アルカロイド含有量が、本発明に従って改変されていない比較できる製品と比較して低いことを意味するように本明細書において使用される。
一態様では、本発明によるタバコ植物若しくはその一部又はタバコ細胞は、３％未満、２．７５％未満、２．５％未満、２．２５％未満、２％未満、１．７５％未満、１．５％未満、１．２５％未満、１％未満、０．９％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、０．１％未満又は０．０５％未満の総アルカロイドレベルを含む。
一態様では、本発明によるタバコ植物若しくはその一部又はタバコ細胞は、３％未満、２．７５％未満、２．５％未満、２．２５％未満、２％未満、１．７５％未満、１．５％未満、１．２５％未満、１％未満、０．９％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、０．１％未満又は０．０５％未満のニコチンレベルを含む。一態様では、本発明によるタバコ植物若しくはその一部又はタバコ細胞は、比較できる植物若しくはその一部又は細胞のアルカロイドレベル又はニコチンレベルの、１％未満、２％未満、５％未満、１０％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、４０％未満、５０％未満、６０％未満、７０％未満、８０％未満のアルカロイドレベル又はニコチンレベルを含む。
一実施形態では、本発明は、植物（例えば、タバコ植物）又はその一部におけるタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）又はＴＳＮＡの前駆体の含有量を調節する（例えば、低減させる）方法であって、少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子の活性又は発現を調節することによって前記植物を改変するステップを含む方法を提供する。適切には、本方法は、少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子、並びに任意に少なくとも１つのＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／又は少なくとも１つのＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現を調節すること（例えば、低下させること）を含んでいてもよい。
一実施形態では、ＴＳＮＡは、Ｎ’－ニトロソノルニコチン（ＮＮＮ）であるか、及び／又は前駆体は、ノルニコチンである。
一実施形態では、ＴＳＮＡは、Ｎ’－ニトロソノルニコチン（ＮＮＮ）、Ｎ’ニトロソアナタビン（ＮＡＴ）、Ｎ’－ニトロソアナバシン（ＮＡＢ）及び４－（メチルニトロソアミノ）－１－（３－ピリジル）－１－ブタノン（ＮＮＫ）から選択される群のうち１つ又は２つ以上であり得る。
好ましい実施形態では、ＴＳＮＡは、Ｎ’－ニトロソノルニコチン（ＮＮＮ）である。
ＴＳＮＡは、加工されたタバコ、例えば、乾燥タバコ又は再構成されたタバコにおいて測定できる。一実施形態では、ＴＳＮＡ含有量は、乾燥タバコ植物又はその一部において（例えば、乾燥タバコ葉において）測定され、及び／又は改変される（例えば、低減される）。
用語「タバコ特異的ニトロソアミン」又は「ＴＳＮＡ」は、本明細書で使用される場合、当技術分野におけるその通常の意味を有し、すなわち、送達システム又は他のニコチン含有製品においてのみ見出されるニトロソアミンである。適切には、少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミンは、Ｎ’－ニトロソノルニコチン（ＮＮＮ）、４－（メチルニトロソアミノ）－１－（３－ピリジル）－１－ブタノン（ＮＮＫ）、Ｎ’－ニトロソアナタビン（ＮＡＴ）又はＮ－ニトロソアナバシン（ＮＡＢ）であり得る。
「その前駆体」という用語は、少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミンと関連して使用される場合、タバコ特異的ニトロソアミンの形成を生じさせるか、又はタバコ特異的ニトロソアミン生成につながるニトロソ化反応に関与している、タバコ植物の１つ又は２つ以上の化学物質又は化合物を指す。
一実施形態では、ＴＳＮＡの前駆体は、ノルニコチン、アナバシン、アナタビン及びニコチンの酸化派生物、例えば、シュードオキシニコチン（ＰＯＮ）から選択される群のうち１つ又は２つ以上である。
好ましい実施形態では、ＴＳＮＡの前駆体は、ノルニコチンである。
ＴＳＮＡ（例えば、ＮＮＮ、ＮＮＫ、ＮＡＢ及び／又はＮＡＴ）の前駆体は、例えば、加工の前に、例えば、乾燥の前に緑色のタバコの葉において測定できる。一実施形態では、ＴＳＮＡ（例えば、ＮＮＮ、ＮＮＫ、ＮＡＢ及び／又はＮＡＴ）の前駆体は、例えば、加工の前に、例えば、乾燥の前に緑色のタバコの葉において測定及び／又は低減される。
一実施形態では、本発明の方法を実施すること及び又は本発明の使用は、本発明に従って改変されていないタバコ植物（又はその一部）と比較した場合に、改変されたタバコ植物（又はその一部）又はタバコ細胞における少なくとも１つのＴＳＮＡ又はその前駆体の低減をもたらす。
「少なくとも１つのＴＳＮＡ又はその前駆体を低減すること」又は「少なくとも１つのＴＳＮＡ又はその前駆体の低減」という用語は、本発明の製品、方法又は使用における少なくとも１つのＴＳＮＡ又はその前駆体の濃度及び／又は総含有量が、比較できる製品、方法又は使用との関連で低いことを意味するように本明細書において使用される。例えば、比較できる送達システムは、本発明に従って改変されていないが、全ての他の関連特徴が同一である（例えば、植物種、成長条件、タバコを加工する方法など）タバコ植物に由来するであろう。
少なくとも１つのＴＳＮＡ又はその前駆体の濃度及び／又はレベルを決定するための当技術分野で公知のいかなる方法も使用できる。特に、このような方法は、重水素標識された内部標準の付加、水性抽出及び濾過と、それに続くタンデム質量分析の使用の可能性を備えた逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）を使用する分析を含み得る。タバコ特異的ニトロソアミンの前駆体の濃度及び／又はレベルを決定するための他の例として、参照により全て本明細書に組み込まれる、ＣＯＲＥＳＴＡが推奨する方法ＣＲＭ－７２：ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによるタバコ及び送達システム中のタバコ特異的ニトロソアミンの決定（Determination of Tobacco Specific Nitrosamines in Tobacco and Delivery systems by LC-MS/MS）；ＩＳＯ／ＤＩＳ ２１７６６に開発されているＣＲＭ又はWagner et al. Analytical Chemistry (2005) 77(4), 1001-1006に詳述されるもののような方法が挙げられる。
適切には、少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミン又はその前駆体の濃度及び／又は総含有量を、本発明の方法及び／又は使用を実施することによって低減できる。適切には、本発明のタバコ植物（例えば、本発明の方法及び／又は使用によって得ることができる、又は得られた）において、少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミン又はその前駆体の濃度及び／又はレベルを、本発明に従って改変されていないタバコ植物における少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミン又はその前駆体の濃度及び／又はレベルと比較した場合に低減できる。
本発明のタバコ植物（又はタバコ植物の一部若しくはタバコ細胞培養物）から得ることができる又は得られたタバコ葉、採取された葉、加工されたタバコ葉、送達システム又はそれらの組合せにおいて、少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミン又はその前駆体の濃度及び／又は総含有量を、本発明に従って改変されていないタバコ植物（又はタバコ植物の一部若しくはタバコ細胞培養物）から得ることができる又は得られたタバコ葉、採取された葉、加工されたタバコ葉、送達システム又はそれらの組合せと比較した場合に低減できる。
適切には、加工されたタバコ葉において、少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミン又はその前駆体の濃度及び／又は総含有量を低減できる。
適切には、送達システムにおいて、少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミン又はその前駆体の濃度及び／又はレベルを低減できる。
一実施形態では、少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミン又はその前駆体を、少なくとも約１％、少なくとも約３％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％又は少なくとも約９０％低減できる。一部の実施形態では、少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミン又はその前駆体を、約５％から約９５％の間、約１０％から約９０％の間、２０％から約８０％の間、３０％から約７０％の間、又は約４０％から６０％の間低減できる。
加工された（例えば、乾燥された）タバコの葉（例えば、乾燥された又は再構成された）との関連で、少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミン又はその前駆体を、約５０００ｎｇ／ｇから約５０ｎｇ／ｇの間、約４０００ｎｇ／ｇから約１００ｎｇ／ｇの間、約３０００ｎｇ／ｇから５００ｎｇ／ｇの間又は２０００ｎｇ／ｇから１０００ｎｇ／ｇの間低減できる。一部の実施形態では、少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミン又はその前駆体を、少なくとも約５０００ｎｇ／ｇ、少なくとも約４０００ｎｇ／ｇ、少なくとも約３０００ｎｇ／ｇ、少なくとも約２０００ｎｇ／ｇ、少なくとも約１０００ｎｇ／ｇ、少なくとも約５００ｎｇ／ｇ、少なくとも約１００ｎｇ／ｇ又は少なくとも約５０ｎｇ／ｇ低減できる。
本明細書において定義される「比較できる製品」という用語は、本発明に従って改変されていないが、全ての他の関連特徴（例えば、植物種、成長条件、植物、例えばタバコを加工する方法など）が同一である植物（例えば、タバコ植物）に由来するものであろう。本発明による比較できる製品は、例えば、Ｎｉｃ３遺伝子（又は１つ又は２つ以上のＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子と組み合わせた、１つ又は２つ以上のＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子と組み合わせた、Ｎｉｃ３遺伝子）の活性又は発現を調節するための、本発明に従って改変されていない植物から得ることができる又は得られた、タバコ植物細胞若しくは植物（例えば、タバコ植物）若しくはその一部、例えば、葉（例えば、タバコ葉）、採取された葉（例えば、採取されたタバコ葉）、切断され採取された葉（例えば、切断され採取されたタバコ葉）、加工された葉（例えば、加工されたタバコ葉）若しくは植物増殖材料（例えば、タバコ植物増殖材料）、又は前記植物又はその一部を含む製品、例えば、送達システム又はそれらの組合せを意味し得る。比較できる製品はまた、対照又は野生型としても知られる場合がある。
本明細書において定義される「未改変植物」という用語は、Ｎｉｃ３遺伝子の活性又は発現を調節するために本発明に従って改変されておらず、全ての他の関連特徴（例えば、植物種、成長条件、タバコを加工する方法など）が同一である植物（例えば、タバコ植物）であろう。
Ｎｉｃ３遺伝子（又はＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子又はＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子）の「活性又は発現」は、Ｎｉｃ３遺伝子（又はそれぞれＮｉｃ１ ＥＲＦ又はＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子）の、転写、翻訳、すなわちタンパク質発現のレベル、又はそれによってコードされたタンパク質の活性を指す場合もある。Ｎｉｃ３遺伝子の活性は、アルカロイド生合成、特にニコチン生合成のレギュレーターとして機能するその能力に関する。Ｎｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子（又はＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子）の活性は、アルカロイドの生合成における転写因子として機能するその能力に関する。Ｎｉｃ３遺伝子（又はＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子又はＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子）の活性は、アルカロイド合成の産物を測定することによって、すなわちアルカロイド含有量を測定することによって決定され得る。
本発明の一態様によれば、遺伝子発現は、転写及び／又は翻訳を阻害することによって低下させることができる（又は阻害することができる）。一実施形態では、遺伝子の活性又は発現は、転写のレベル、すなわち産生されたｍＲＮＡの量、又は翻訳、すなわち産生されたタンパク質のレベル又は量を指す場合もある。
一部の実施形態では、アルカロイド含有量の調節は、アルカロイド含有量における増加であって、少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子の活性又は発現が調節されるものを指す。
一部の実施形態では、アルカロイド含有量の調節は、アルカロイド含有量における減少であって、少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子の活性又は発現が調節されるものを指す。
一部の実施形態では、アルカロイド含有量の調節は、アルカロイド含有量における増加であって、少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子の活性又は発現、任意に、少なくとも１つのＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／又はＮｉｃ２ ＥＲＦの活性又は発現が組み合わせて調節されるものを指す。
一部の実施形態では、アルカロイド含有量の調節は、アルカロイド含有量における減少であって、少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子の活性又は発現、任意に、少なくとも１つのＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／又はＮｉｃ２ ＥＲＦの活性又は発現が組み合わせて調節されるものを指す。
さらなる態様において、アルカロイド含有量は、葉から測定される。一態様では、アルカロイド含有量は、緑色葉から測定される。さらなる態様において、アルカロイド含有量は、乾燥葉から、例えば、空気乾燥（air-cured）、熱気送管乾燥（flue-cured）、火力乾燥（fire-cured）又は日光乾燥（sun-cured）葉から測定される。さらなる態様において、アルカロイド含有量は、熱気送管乾燥葉から測定される。さらなる態様において、アルカロイド含有量は、空気乾燥葉から測定される。
「アルカロイド含有量」という用語は、アルカロイドとして分類される化合物の群全体の濃度及び／若しくは総量を意味するように本明細書において使用される。タバコ中に典型的に存在するアルカロイドとしては、ニコチン、アナタビン、アナバシン、ミオスミン及びノルニコチンが挙げられる。一実施形態では、ニコチン、アナタビン、アナバシン、ミオスミン及びノルニコチンから選択される１つ又は２つ以上のアルカロイドの含有量が調節される。一実施形態では、ニコチン、アナタビン、アナバシン、ミオスミン及びノルニコチンから選択される１つ又は２つ以上のアルカロイドの含有量が低減される。一実施形態では、ニコチン、アナタビン、アナバシン及びノルニコチンから選択される１つ又は２つ以上のアルカロイドの含有量が増加する。適切には、ニコチン含有量が調節される。一実施形態では、ニコチン含有量が低減される。
アルカロイドの濃度及び／又は総含有量を決定するための当技術分野で公知のいかなる方法も使用できる。アルカロイド含有量を分析するための１つの好ましい方法には、ガスクロマトグラフィー－水素炎イオン化検出方法（ＧＣ－ＦＩＤ）による分析が含まれる。
一実施形態では、アルカロイド含有量が調節された本発明の植物によって得ることができる、又は得られた、植物（例えば、タバコ植物）若しくはその一部、植物増殖材料（例えば、タバコ植物増殖材料）、細胞（例えば、タバコ細胞）、葉（例えば、タバコ葉）、採取された葉（例えば、採取されたタバコ葉）、切断され採取された葉（例えば、切断され採取されたタバコ葉）、加工された葉（例えば、加工されたタバコ葉）、切断され加工された葉（例えば、切断され加工されたタバコ葉）、前記植物若しくはその一部を含む製品（例えば、送達システム）又はそれらの組合せを生成するための方法であって、Ｎｉｃ３遺伝子、又はＮｉｃ３遺伝子並びに少なくとも１つのＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくは少なくとも１つのＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子の組合せの活性又は発現を調節するために前記タバコを改変するステップを含む方法を提供する。調節されたアルカロイド含有量は、植物（例えば、タバコ植物）又はその一部、植物増殖材料（例えば、タバコ植物増殖材料）、細胞（例えば、タバコ細胞）、葉（例えば、タバコ葉）、採取された葉（例えば、採取されたタバコ葉）、切断され採取された葉（例えば、切断され採取されたタバコ葉）、加工された葉（例えば、加工されたタバコ葉）、切断され加工された葉（例えば、切断され加工されたタバコ葉）、本発明の植物又はその一部を含む製品、例えば、送達システム、又はそれらの組合せ中のアルカロイド含有量を、比較できる製品と比較することによって決定できる。
適切には、植物、例えば、タバコ植物、例えば、改変されたタバコ植物においてアルカロイド含有量を調節できる。適切には、葉（例えば、タバコの葉、例えば、改変されたタバコ植物からのタバコの葉）においてアルカロイド含有量を調節できる。適切には、採取された葉（例えば、改変されたタバコ植物からの採取されたタバコの葉）においてアルカロイド含有量を調節できる。適切には、切断され採取された葉（例えば、改変されたタバコ植物からの、切断され採取されたタバコの葉）においてアルカロイド含有量を調節できる。適切には、加工された葉（例えば、加工されたタバコの葉、例えば、改変されたタバコ植物からの加工されたタバコの葉）においてアルカロイド含有量を調節できる。適切には、切断され加工された葉（例えば、切断され加工されたタバコの葉、例えば、改変されたタバコ植物からの切断され加工されたタバコの葉）においてアルカロイド含有量を調節できる。適切には、乾燥葉（例えば、改変されたタバコ植物からの乾燥タバコ葉）においてアルカロイド含有量を調節できる。適切には、緑色葉（例えば、改変されたタバコ植物からの緑色タバコ葉）の抽出物においてアルカロイド含有量を調節できる。適切には、本発明の植物又はその一部を含む製品（例えば、送達システム、例えば、改変されたタバコ植物又はその一部から生成された送達システム）におけるアルカロイド含有量が調節され得る。適切には、上記の製品のうちのいずれか又はそれらの組合せにおいてアルカロイド含有量を調節できる。適切には、上記のアルカロイド含有量の調節は、アルカロイド含有量の増加であり得る。適切には、上記のアルカロイド含有量の調節は、アルカロイド含有量の減少であり得る。
一実施形態では、ニコチン、アナタビン、アナバシン、ミオスミン及びノルニコチンから選択される１つ又は２つ以上のアルカロイドの含有量が減少する。
適切には、上述したアルカロイド含有量の調節は、ニコチン含有量における減少であり得る。
一実施形態では、改変されたタバコ細胞、又は改変された植物若しくはその一部（例えば、タバコ植物）、植物増殖材料（例えば、タバコ植物増殖材料）、葉（例えば、タバコ葉）、採取された葉（例えば、採取されたタバコ葉）、切断され採取された葉（例えば、切断され採取されたタバコ葉）、加工された葉（例えば、加工されたタバコ葉）、切断され加工された葉（例えば、切断され加工されたタバコ葉）又は改変されたタバコ植物からの送達システムのニコチン含有量が減少する。
一実施形態では、植物（例えば、タバコ植物）又はその一部のアルカロイド含有量は、同様の成長条件下で成長させた少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子（又は少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子と、少なくとも１つのＮｉｃ１ ＥＲＦ及び／又は少なくとも１つのＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子との組合せ）の活性又は発現を調節するために改変されていない植物（例えば、タバコ植物）又はその一部のアルカロイド含有量と比較した場合に、それぞれ、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９又は１０倍調節され得る。適切には、アルカロイド含有量は、約２倍～約１０倍、好ましくは、約３倍～約１０倍、適切には、約３倍～約５倍調節され得る（例えば、低減され得る）。適切には、改変は、アルカロイド含有量における増加又は減少であり得る。適切には、調節（例えば、低減）は、ニコチン、アナタビン、アナバシン、ミオスミン及びノルニコチンから選択される１つ又は２つ以上のアルカロイドの調節（例えば、低減）であり得る。適切には、ニコチン含有量が低減される。
本発明の一実施形態では、タバコ植物細胞若しくは植物（例えば、タバコ植物）又はその一部のアルカロイド含有量は、本発明に従って改変されていない細胞若しくは植物（例えば、タバコ植物）又はその一部と比較して、１％、２％、５％、８％、１０％、１２％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％調節され得る。調節は、未改変植物（例えば、タバコ植物）又はその一部と比較した場合のアルカロイド含有量における増加又は減少であり得る。適切には、調節は、総アルカロイド含有量の調節であり得る。適切には、調節は、ニコチン、アナタビン、アナバシン、ミオスミン及びノルニコチンから選択される１つ又は２つ以上のアルカロイドの調節であり得る。適切には、ニコチン含有量が低減される。
一実施形態では、本方法又は使用は、Ｎｉｃ３遺伝子（又はＮｉｃ３遺伝子とＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくはＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子との組合せ）の活性又は発現を調節するために改変されていない植物（例えば、タバコ植物）若しくはその一部又は細胞と比較して、より特に、導入された改変の非存在下での植物（例えば、タバコ植物）による発現と比較して、又はそれと比べて、調節されたアルカロイド含有量をもたらす。
一実施形態では、本方法又は使用は、Ｎｉｃ３遺伝子（又はＮｉｃ３遺伝子と、Ｎｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくはＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子との組合せ）に変異を導入するために改変されていない植物（例えば、タバコ植物）若しくはその一部又は細胞と比較して、より特に、導入された改変の非存在下での植物（例えば、タバコ植物）若しくはその一部又は細胞と比較して、又はそれと比べて、調節されたアルカロイド含有量をもたらす。
一実施形態では、植物（例えば、タバコ植物）若しくはその一部又は細胞は、少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子（又は少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子並びに少なくとも１つのＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／又は少なくとも１つのＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子）の活性又は発現を調節するために改変されていない植物（例えば、タバコ植物）又はその一部と比較して、それぞれ、アルカロイド含有量における調節を達成するために改変されている。本明細書におけるＮｉｃ３及びＮｉｃ１及び／又はＮｉｃ２への言及（遺伝子座又は遺伝子を指す場合）は、選択肢ｉ）Ｎｉｃ３及びＮｉｃ１、ii）Ｎｉｃ３及びＮｉｃ２、並びにiii）Ｎｉｃ３、Ｎｉｃ１及びＮｉｃ２に関する。
用語「改変する」又は「改変された」は、本明細書で使用される場合、変更された、又は変化した細胞（例えば、タバコ細胞）、植物（例えば、タバコ植物）を意味する。本発明は、植物の遺伝子改変又は植物の非遺伝子改変のための技術を使用する植物の改変を含む。このような方法は、当技術分野で周知であり、遺伝子改変技術の例として、形質転換、トランスジェニック、シスジェニック及び遺伝子編集方法が挙げられる。非遺伝子改変技術の例として、高速中性子突然変異誘発、化学的突然変異誘発、例えば、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）突然変異誘発及び最新の集団分析アプローチが挙げられる。
一実施形態では、改変されたＮｉｃ３遺伝子（又は改変されたＮｉｃ３遺伝子と、少なくとも１つの改変されたＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／又は少なくとも１つの改変されたＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子との組合せ）を有する天然バリアントが選択され、その形質又は遺伝子が、商業的に望ましい形質を有する第２の植物に育種される。
一実施形態では、本発明による細胞又は植物（例えば、タバコ植物）は、トランスジェニック細胞植物であり得る。
別の実施形態では、本発明による細胞植物（例えば、タバコ植物）は、非トランスジェニック細胞又は植物であり得る。
適切には、本発明による少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子における変異は、Ｋ３２６中に存在していなくてもよい。
適切には、本発明による少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子における変異は、グリーン・ブライアー（Green Briar）中に存在していなくてもよい。
適切には、少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子の調節は、バーレー２１中に存在しない。
一部の実施形態では、少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子の活性又は発現を調節し、それによってアルカロイド含有量を調節する改変は、
少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子（又は少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子と、少なくとも１つのＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくは少なくとも１つのＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子との組合せ）の転写、翻訳又は発現を低下させる、妨げる、又は減衰させること；
少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子（又は少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子と、少なくとも１つのＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくは少なくとも１つのＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子との組合せ）によってコードされたポリペプチドの合成、又は細胞内ストアからのその放出を阻害すること；及び
少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子（又は少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子と、少なくとも１つのＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくは少なくとも１つのＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子との組合せ）によってコードされたポリペプチドの分解の速度を増加させること
からなる群から選択される。
少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子（又は少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子と、少なくとも１つのＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくは少なくとも１つのＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子との組合せ）の転写、翻訳又は発現を低下させる、妨げる、又は減衰させること；
少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子（又は少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子と、少なくとも１つのＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくは少なくとも１つのＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子との組合せ）によってコードされたポリペプチドの合成、又は細胞内ストアからのその放出を阻害すること；及び
少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子（又は少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子と、少なくとも１つのＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくは少なくとも１つのＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子との組合せ）によってコードされたポリペプチドの分解の速度を増加させること
からなる群から選択される。
一実施形態では、少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子の活性又は発現を低下させる改変（又は少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子並びに少なくとも１つのＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくは少なくとも１つのＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子の組合せの活性を低下させる１つ若しくは２つ以上の改変）は、１つ又は２つ以上の遺伝子における変異を含む。
一実施形態では、変異は、１つ又は２つ以上のＮｉｃ３遺伝子の全体を欠失させる。適切には、変異は、１つ又は２つ以上のＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子を欠失させ得る。適切には、変異は、１つ又は２つ以上のＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子を欠失させ得る。
一実施形態では、１つ又は２つ以上のＮｉｃ３遺伝子は、遺伝子内に１つ又は２つ以上の変異を含んでいてもよい。適切には、１つ又は２つ以上の変異は、変異した遺伝子における遺伝子活性の低減又は排除をもたらす。一実施形態では、１つ又は２つ以上の変異は、不活性な遺伝子をもたらす。一実施形態では、変異は、アミノ酸置換をもたらす。一実施形態では、変異は、ナンセンス変異である。適切には、変異は、遺伝子、例えば、Ｎｉｃ３遺伝子によってコードされたタンパク質の正常な機能を阻害することができ、例えば、転写因子のケースではＤＮＡ結合を阻害する。
例として、本発明の方法は、
・表３に列挙したタンパク質、又はそれに対して少なくとも７０％（好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９８％）の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列中に変異を提供するステップ；
・表３に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも７０％（好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９８％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列のプロモーター中に変異を提供するステップ；
・表３に列挙したＮｉｃ３遺伝子の核酸配列又はそれに対して少なくとも７０％（好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９８％）の配列同一性を有するヌクレオチド配列中に変異を提供するステップ；
・表３に列挙したＮｉｃ３遺伝子の核酸配列又はそれに対して少なくとも７０％（好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９８％）の配列同一性を有するヌクレオチド配列のプロモーター中に変異を提供するステップ；
・表３に列挙したＮｉｃ３タンパク質をコードする核酸配列又はそれに対して少なくとも７０％（好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９８％）の配列同一性を有するアミノ酸配列のレベルを低減するアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡを提供するステップ；
・表３に列挙した核酸配列、又はそれに対して少なくとも７０％（好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９８％）の配列同一性を有する配列のレベルを低減するアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡを提供するステップ
を含んでいてもよい。適切には、表３に列挙したタンパク質又は表３に示されるアミノ酸配列は、配列番号７５、１２０、１２７及び１２９（又は上記に記載したそれらの関連する配列）から選択される。適切には、表３に列挙した遺伝子又は配列は、配列番号７３、１１８、１２４及び１２７（又は上記に記載したそれらの関連する配列）から選択される。
・表３に列挙したタンパク質、又はそれに対して少なくとも７０％（好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９８％）の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列中に変異を提供するステップ；
・表３に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも７０％（好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９８％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列のプロモーター中に変異を提供するステップ；
・表３に列挙したＮｉｃ３遺伝子の核酸配列又はそれに対して少なくとも７０％（好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９８％）の配列同一性を有するヌクレオチド配列中に変異を提供するステップ；
・表３に列挙したＮｉｃ３遺伝子の核酸配列又はそれに対して少なくとも７０％（好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９８％）の配列同一性を有するヌクレオチド配列のプロモーター中に変異を提供するステップ；
・表３に列挙したＮｉｃ３タンパク質をコードする核酸配列又はそれに対して少なくとも７０％（好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９８％）の配列同一性を有するアミノ酸配列のレベルを低減するアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡを提供するステップ；
・表３に列挙した核酸配列、又はそれに対して少なくとも７０％（好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９８％）の配列同一性を有する配列のレベルを低減するアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡを提供するステップ
を含んでいてもよい。適切には、表３に列挙したタンパク質又は表３に示されるアミノ酸配列は、配列番号７５、１２０、１２７及び１２９（又は上記に記載したそれらの関連する配列）から選択される。適切には、表３に列挙した遺伝子又は配列は、配列番号７３、１１８、１２４及び１２７（又は上記に記載したそれらの関連する配列）から選択される。
一実施形態では、Ｎｉｃ３遺伝子座における少なくとも１つの変異（又は１つ若しくは２つ以上の変異）は、配列番号７３、１１８、１２４若しくは１２７、又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列から選択されるＮｉｃ３遺伝子、或いは前記遺伝子の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログ中にあり、Ｎｉｃ３遺伝子における前記少なくとも１つの変異は、
ｉ）配列番号７５、若しくはそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列、又は前記ポリペプチドの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログのアミノ酸残基７４～２５８又は４８３～５３８における変異をもたらす、Ｎｉｃ３遺伝子である配列番号７３若しくはそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列、又は前記遺伝子の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログにおける変異；
ii）配列番号１２０、若しくはそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列、又は前記ポリペプチドの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログのアミノ酸残基１２０～５８４における変異をもたらす、Ｎｉｃ３遺伝子である配列番号１１８若しくはそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列、又は前記遺伝子の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログにおける変異；
iii）配列番号１２６、若しくはそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列、又は前記ポリペプチドの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログのアミノ酸残基１６６～４０６又は４８３～９７０における変異をもたらす、Ｎｉｃ３遺伝子である配列番号１２４若しくはそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列、又は前記遺伝子の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログにおける変異；及び
iv）配列番号１２９、若しくはそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列、又は前記ポリペプチドの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログのアミノ酸残基１７１～４０６又は５０９～９６７における変異をもたらす、Ｎｉｃ３遺伝子である配列番号１２７若しくはそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列、又は前記遺伝子の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログにおける変異
から選択される。
ｉ）配列番号７５、若しくはそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列、又は前記ポリペプチドの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログのアミノ酸残基７４～２５８又は４８３～５３８における変異をもたらす、Ｎｉｃ３遺伝子である配列番号７３若しくはそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列、又は前記遺伝子の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログにおける変異；
ii）配列番号１２０、若しくはそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列、又は前記ポリペプチドの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログのアミノ酸残基１２０～５８４における変異をもたらす、Ｎｉｃ３遺伝子である配列番号１１８若しくはそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列、又は前記遺伝子の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログにおける変異；
iii）配列番号１２６、若しくはそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列、又は前記ポリペプチドの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログのアミノ酸残基１６６～４０６又は４８３～９７０における変異をもたらす、Ｎｉｃ３遺伝子である配列番号１２４若しくはそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列、又は前記遺伝子の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログにおける変異；及び
iv）配列番号１２９、若しくはそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列、又は前記ポリペプチドの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログのアミノ酸残基１７１～４０６又は５０９～９６７における変異をもたらす、Ｎｉｃ３遺伝子である配列番号１２７若しくはそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列、又は前記遺伝子の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログにおける変異
から選択される。
配列番号７５のアミノ酸残基７４～２５８は、ＭＹＣ転写因子のＮ末端ＭＹＣドメインを提供する。配列番号７５のアミノ酸残基４８３～５３８は、数々のＤＮＡ結合部位（適切には、変異のための部位を提供する）を有する、すなわちアミノ酸残基４８８、４８９、４９２、４９３、５００、５１７及び５１８に、ｂＨＬＨドメインを提供する。配列番号１２０のアミノ酸残基１２０～５８４は、ＬＲＲドメインを提供する。配列番号１２４のアミノ酸残基１６６～４０６は、ＮＢ－ＡＲＣドメインを提供し、アミノ酸残基４８３～９７０は、ＬＲＲドメインを提供する。配列番号１２９のアミノ酸残基１７１～４０６は、ＮＢ－ＡＲＣドメインを提供し、アミノ酸残基５０９～９６７は、ＬＲＲドメインを提供する。変異の部位はまた、コードするヌクレオチドへの参照によって記載することもでき、例えば、配列番号７５のアミノ酸残基７４～２５８は、配列番号７３のヌクレオチド６３１～１１８５によってコードされる。
上述したように、変異は、特定の遺伝子又は関連する配列（本明細書において定義される通り）でなされ、列挙されたアミノ酸又は関連する配列（本明細書において定義される通り）における変異を提供する。関連する配列は、互いに対応する。例えば、変異が、配列番号７５に対して９０％の配列同一性を有する配列でなされる場合、得られた変異体は、その関連する配列に対してなされたものであり、すなわち導入された１つ又は２つ以上の変異を考慮に入れる前の同じ配列同一性を有する配列を提供する。関連する配列が変異している場合、変異は、上記の列挙されたドメインに対応する配列でなされ、すなわち関連する配列の生成の結果生じるアミノ酸の数のあらゆる変化を考慮に入れる。
一実施形態では、変異は、欠失であり得る。例として、上述されるドメインは、部分的に、又はその全体が欠失していてもよい。一実施形態では、変異は、挿入であり得る。一実施形態では、変異は、早期停止コドンを導入することができる。一実施形態では、標的部位は、標的Ｎｉｃ３遺伝子に固有であり、他の遺伝子に存在しない。
一実施形態では、変異体は、低減した総アルカロイド及び／又は低減したニコチンレベルを有する。
一実施形態では、本発明は、表１で示されるアミノ酸配列を含む（又はそれからなる）ポリペプチド、又はそれと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％の同一性を有する配列をコードするＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子における１つ又は２つ以上の変異を提供する。
適切には、本発明は、配列番号８のアミノ酸配列を含む（又はそれからなる）ポリペプチド又はそれと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％の同一性を有する配列をコードするＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子における１つ又は２つ以上の変異を提供し得る。
適切には、本発明は、配列番号５に記載されるヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％の同一性を有する配列を含む（又はそれからなる）Ｎｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子における１つ又は２つ以上の変異を提供し得る。
例として、本発明の方法は、
・配列番号８；若しくは配列番号４；若しくは配列番号１２；若しくは配列番号１６；若しくは配列番号２０；若しくは配列番号２４；若しくは配列番号２８；若しくは配列番号３２；若しくは配列番号３６に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも７０％（好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９８％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列中に変異を提供するステップ；
・配列番号８；若しくは配列番号４；若しくは配列番号１２；若しくは配列番号１６；若しくは配列番号２０；若しくは配列番号２４；若しくは配列番号２８；若しくは配列番号３２；若しくは配列番号３６として示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも７０％（好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９８％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列のプロモーター中に変異を提供するステップ；
・配列番号５；若しくは配列番号１；若しくは配列番号３；若しくは配列番号９；若しくは配列番号１３；若しくは配列番号１７；若しくは配列番号２１；若しくは配列番号２５；若しくは配列番号２９；若しくは配列番号３３又はそれに対して少なくとも７０％（好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９８％）の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むＥＲＦ遺伝子の核酸配列中に変異を提供するステップ；
・配列番号５；若しくは配列番号１；若しくは配列番号３；若しくは配列番号９；若しくは配列番号１３；若しくは配列番号１７；若しくは配列番号２１；若しくは配列番号２５；若しくは配列番号２９；若しくは配列番号３３を含むＥＲＦ遺伝子の核酸配列又はそれに対して少なくとも７０％（好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９８％）の配列同一性を有するヌクレオチド配列のプロモーター中に変異を提供するステップ；
・配列番号８；若しくは配列番号４；若しくは配列番号１２；若しくは配列番号１６；若しくは配列番号２０；若しくは配列番号２４；若しくは配列番号２８；若しくは配列番号３２；若しくは配列番号３６として示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも７０％（好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９８％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列のレベルを低減するアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡを提供するステップ；
・配列番号５；若しくは配列番号１；若しくは配列番号３；若しくは配列番号９；若しくは配列番号１３；若しくは配列番号１７；若しくは配列番号２１；若しくは配列番号２５；若しくは配列番号２９；若しくは配列番号３３の核酸配列又はそれに対して少なくとも７０％（好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９８％）の配列同一性を有するヌクレオチド配列のレベルを低減するアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡを提供するステップ
を含んでいてもよい。
・配列番号８；若しくは配列番号４；若しくは配列番号１２；若しくは配列番号１６；若しくは配列番号２０；若しくは配列番号２４；若しくは配列番号２８；若しくは配列番号３２；若しくは配列番号３６に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも７０％（好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９８％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列中に変異を提供するステップ；
・配列番号８；若しくは配列番号４；若しくは配列番号１２；若しくは配列番号１６；若しくは配列番号２０；若しくは配列番号２４；若しくは配列番号２８；若しくは配列番号３２；若しくは配列番号３６として示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも７０％（好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９８％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列のプロモーター中に変異を提供するステップ；
・配列番号５；若しくは配列番号１；若しくは配列番号３；若しくは配列番号９；若しくは配列番号１３；若しくは配列番号１７；若しくは配列番号２１；若しくは配列番号２５；若しくは配列番号２９；若しくは配列番号３３又はそれに対して少なくとも７０％（好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９８％）の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むＥＲＦ遺伝子の核酸配列中に変異を提供するステップ；
・配列番号５；若しくは配列番号１；若しくは配列番号３；若しくは配列番号９；若しくは配列番号１３；若しくは配列番号１７；若しくは配列番号２１；若しくは配列番号２５；若しくは配列番号２９；若しくは配列番号３３を含むＥＲＦ遺伝子の核酸配列又はそれに対して少なくとも７０％（好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９８％）の配列同一性を有するヌクレオチド配列のプロモーター中に変異を提供するステップ；
・配列番号８；若しくは配列番号４；若しくは配列番号１２；若しくは配列番号１６；若しくは配列番号２０；若しくは配列番号２４；若しくは配列番号２８；若しくは配列番号３２；若しくは配列番号３６として示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも７０％（好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９８％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列のレベルを低減するアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡを提供するステップ；
・配列番号５；若しくは配列番号１；若しくは配列番号３；若しくは配列番号９；若しくは配列番号１３；若しくは配列番号１７；若しくは配列番号２１；若しくは配列番号２５；若しくは配列番号２９；若しくは配列番号３３の核酸配列又はそれに対して少なくとも７０％（好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９８％）の配列同一性を有するヌクレオチド配列のレベルを低減するアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡを提供するステップ
を含んでいてもよい。
一実施形態では、１つ又は２つ以上のＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／又は１つ又は２つ以上のＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子が調節される（例えば、変異させる）。
適切には、本明細書において教示されるＮｉｃ３遺伝子及び／又はＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子改変（例えば、変異）のいずれか１つは、Ｎｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子の１つ又は２つ以上の改変と組み合わせて使用してもよく、この場合、Ｎｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子は、配列番号７２；若しくは配列番号４０；若しくは配列番号４４；若しくは配列番号４８；若しくは配列番号５２；若しくは配列番号５６；若しくは配列番号６０；若しくは配列番号６４；若しくは配列番号６８に記載のアミノ酸配列；又はそれらの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含むポリペプチドをコードするか；或いはＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子は、配列番号６９；配列番号３７；若しくは配列番号４１；若しくは配列番号４５；若しくは配列番号４９；若しくは配列番号５３；若しくは配列番号５７；若しくは配列番号６１；若しくは配列番号６５に記載のヌクレオチド配列；又はそれらの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含む。
例として、本発明の方法は、
・配列番号７２；若しくは配列番号４０；若しくは配列番号４４；若しくは配列番号４８；若しくは配列番号５２；若しくは配列番号５６；若しくは配列番号６０；若しくは配列番号６４；若しくは配列番号６８として示されるアミノ酸配列；又はそれに対して少なくとも７０％（好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９８％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列中に変異を提供するステップ；
・配列番号７２；若しくは配列番号４０；若しくは配列番号４４；若しくは配列番号４８；若しくは配列番号５２；若しくは配列番号５６；若しくは配列番号６０；若しくは配列番号６４；若しくは配列番号６８として示されるアミノ酸配列；又はそれに対して少なくとも７０％（好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９８％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列のプロモーター中に変異を提供するステップ；
・配列番号６９；若しくは配列番号３７；若しくは配列番号４１；若しくは配列番号４５；若しくは配列番号４９；若しくは配列番号５３；若しくは配列番号５７；若しくは配列番号６１；若しくは配列番号６５を含むＥＲＦ遺伝子の核酸配列；又はそれに対して少なくとも７０％（好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９８％）の配列同一性を有するヌクレオチド配列中に変異を提供するステップ；
・配列番号６９；若しくは配列番号３７；若しくは配列番号４１；若しくは配列番号４５；若しくは配列番号４９；若しくは配列番号５３；若しくは配列番号５７；若しくは配列番号６１；若しくは配列番号６５を含むＥＲＦ遺伝子の核酸配列；又はそれに対して少なくとも７０％（好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９８％）の配列同一性を有するヌクレオチド配列のプロモーター中に変異を提供するステップ；
・配列番号７２；若しくは配列番号４０；若しくは配列番号４４；若しくは配列番号４８；若しくは配列番号５２；若しくは配列番号５６；若しくは配列番号６０；若しくは配列番号６４；若しくは配列番号６８として示されるアミノ酸配列；又はそれに対して少なくとも７０％（好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９８％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列のレベルを低減するアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡを提供するステップ；
・配列番号６９；若しくは配列番号３７；若しくは配列番号４１；若しくは配列番号４５；若しくは配列番号４９；若しくは配列番号５３；若しくは配列番号５７；若しくは配列番号６１；若しくは配列番号６５である核酸配列；又はそれに対して少なくとも７０％（好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９８％）の配列同一性を有するヌクレオチド配列のレベルを低減するアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡを提供するステップ
を含んでいてもよい。
・配列番号７２；若しくは配列番号４０；若しくは配列番号４４；若しくは配列番号４８；若しくは配列番号５２；若しくは配列番号５６；若しくは配列番号６０；若しくは配列番号６４；若しくは配列番号６８として示されるアミノ酸配列；又はそれに対して少なくとも７０％（好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９８％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列中に変異を提供するステップ；
・配列番号７２；若しくは配列番号４０；若しくは配列番号４４；若しくは配列番号４８；若しくは配列番号５２；若しくは配列番号５６；若しくは配列番号６０；若しくは配列番号６４；若しくは配列番号６８として示されるアミノ酸配列；又はそれに対して少なくとも７０％（好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９８％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列のプロモーター中に変異を提供するステップ；
・配列番号６９；若しくは配列番号３７；若しくは配列番号４１；若しくは配列番号４５；若しくは配列番号４９；若しくは配列番号５３；若しくは配列番号５７；若しくは配列番号６１；若しくは配列番号６５を含むＥＲＦ遺伝子の核酸配列；又はそれに対して少なくとも７０％（好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９８％）の配列同一性を有するヌクレオチド配列中に変異を提供するステップ；
・配列番号６９；若しくは配列番号３７；若しくは配列番号４１；若しくは配列番号４５；若しくは配列番号４９；若しくは配列番号５３；若しくは配列番号５７；若しくは配列番号６１；若しくは配列番号６５を含むＥＲＦ遺伝子の核酸配列；又はそれに対して少なくとも７０％（好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９８％）の配列同一性を有するヌクレオチド配列のプロモーター中に変異を提供するステップ；
・配列番号７２；若しくは配列番号４０；若しくは配列番号４４；若しくは配列番号４８；若しくは配列番号５２；若しくは配列番号５６；若しくは配列番号６０；若しくは配列番号６４；若しくは配列番号６８として示されるアミノ酸配列；又はそれに対して少なくとも７０％（好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９８％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列のレベルを低減するアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡを提供するステップ；
・配列番号６９；若しくは配列番号３７；若しくは配列番号４１；若しくは配列番号４５；若しくは配列番号４９；若しくは配列番号５３；若しくは配列番号５７；若しくは配列番号６１；若しくは配列番号６５である核酸配列；又はそれに対して少なくとも７０％（好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９８％）の配列同一性を有するヌクレオチド配列のレベルを低減するアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡを提供するステップ
を含んでいてもよい。
一実施形態では、配列番号４；若しくは配列番号８；若しくは配列番号１２；若しくは配列番号１６；若しくは配列番号２０；若しくは配列番号２４；若しくは配列番号２８；若しくは配列番号３２；若しくは配列番号３６として示されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも７０％（好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９８％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列における１つ若しくは２つ以上の変異、及び配列番号１；若しくは配列番号３；若しくは配列番号５；若しくは配列番号９；若しくは配列番号１３；若しくは配列番号１７；若しくは配列番号２１；若しくは配列番号２５；若しくは配列番号２９；若しくは配列番号３３又はそれに対して少なくとも７０％（好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９８％）の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むＥＲＦ遺伝子の核酸配列における１つ若しくは２つ以上の変異からなる群から選択される少なくとも１つのＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子における変異；及び／或いは少なくとも１つのＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子における変異、特に、配列番号４０、配列番号４４、配列番号４８、配列番号５２若しくは配列番号５６、配列番号６４、配列番号６８若しくは配列番号７２のアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも７０％（好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９８％）の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列における１つ又は２つ以上の変異、又は配列番号３７、配列番号４１、配列番号４５、配列番号４９若しくは配列番号５３、若しくは配列番号５７若しくは配列番号６１若しくは配列番号６５若しくは配列番号６９を含む核酸配列又はそれに対して少なくとも７０％（好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９８％）の配列同一性を有するヌクレオチド配列における１つ若しくは２つ以上の変異と組み合わせて使用され、より特に、Ｎｉｃ２ ＥＲＦ変異は、配列番号７２のアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも７０％（好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９８％）の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、或いは配列番号６９のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも７０％（好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９８％）の配列同一性を有するヌクレオチド配列にある１つ又は２つ以上の変異である。
一実施形態では、配列番号８として示されるアミノ酸配列；又はそれに対して少なくとも７０％（好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９８％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列における１つ若しくは２つ以上の変異、又は配列番号５を含むＥＲＦ遺伝子の核酸配列；又はそれに対して少なくとも７０％（好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９８％）の配列同一性を有するヌクレオチド配列における１つ若しくは２つ以上の変異からなる少なくとも１つのＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子における変異；並びに／或いは少なくとも１つのＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子における変異、特に、配列番号４０、配列番号４４、配列番号４８、配列番号５２、配列番号５６、配列番号６０、配列番号６４、配列番号６８若しくは配列番号７２のアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも７０％（好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９８％）の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列における１つ若しくは２つ以上の変異、又は配列番号３７、配列番号４１、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５３、配列番号５７、配列番号６１、配列番号６５若しくは配列番号６９を含むヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも７０％（好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９８％）の配列同一性を有するヌクレオチド配列における１つ若しくは２つ以上の変異が、組み合わせて使用されてもよい。
一実施形態では、配列番号８として示されるアミノ酸配列；若しくはそれに対して少なくとも７０％（好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９８％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列における１つ若しくは２つ以上の変異、又は配列番号５を含むＥＲＦ遺伝子の核酸配列；若しくはそれに対して少なくとも７０％（好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９８％）の配列同一性を有するヌクレオチド配列における１つ若しくは２つ以上の変異からなる少なくとも１つのＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子における変異；並びに／或いは配列番号７２として示されるアミノ酸配列若しくはそれに対して少なくとも７０％（好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９８％）の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列における１つ若しくは２つ以上の変異、又は配列番号６９として示されるヌクレオチド配列若しくはそれに対して少なくとも７０％（好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９８％）の配列同一性を有するヌクレオチド配列における１つ若しくは２つ以上の変異からなる少なくとも１つのＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子における変異が、組み合わせて使用されてもよい。
１つ又は２つ以上のＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子は、表２から選択される、１つ、又は２つ、又は３つ、又は４つ、又は５つ、又は６つ、又は７つ、又は８つ、又は９つのＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子であり得る。
一部の実施形態では、少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子の（又は少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子並びに少なくとも１つのＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくは少なくとも１つのＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子の組合せの）活性又は発現を低下させ、それによってアルカロイド含有量を減少させる改変は、１つ又は２つ以上の遺伝子における点変異、欠失、挿入、重複、及び逆位からなる群から選択される１つ又は２つ以上である。適切には、改変は、ランダム突然変異誘発及び標的化突然変異誘発から選択される方法によって導入される。適切には、改変は、例えば、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、遺伝子編集及びＣＲＩＳＰＲから選択される標的化突然変異誘発方法によって導入されてもよい。
用語「変異」は、本明細書で使用される場合、天然の遺伝子バリアント又は操作されたバリアントを包含する。
変異は、遺伝子によってコードされた産物の活性又は発現を変更する、植物若しくはその一部又は細胞に導入される遺伝させることができる遺伝子改変を指す。これらの改変は、遺伝子の活性又は発現を制御するあらゆる配列中にあってもよく、例えば、プロモーター、５’ＵＴＲ、エクソン、イントロン、３’ＵＴＲ、又はターミネーター領域中にあってもよい。一態様では、変異は、遺伝子産物の発現又は活性を低減させる、阻害する、又は排除する。別の態様において、変異は、遺伝子産物の活性又は発現を増大させる、上昇させる、又は増強させる。
特に、「変異」という用語は、タンパク質の発現又は機能を低減させる、表１、表２又は表３に示される配列と比較される、アミノ酸配列中の変動を指す。
好ましい実施形態では、植物中に存在する、表１、表２若しくは表３に示される核酸配列又はそれに対して少なくとも８０％（少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）の配列同一性を有する配列の各コピーは、本明細書において定義されるように変異される（例えば、植物中の前記タンパク質をコードする遺伝子の各ゲノムコピーが変異される）。例えば、Ｎ．タバカム（N. tabacum）の異質四倍体ゲノム中の遺伝子の各コピーが変異され得る。
好ましい実施形態では、本発明による植物又は植物細胞は、変異についてホモ接合性である。
一実施形態では、好ましくは、本発明による植物又は植物細胞は、変異された核酸のみを発現する。言い換えれば、一部の実施形態では、本発明による植物中に、内因性の（又は内因性及び機能的の）タンパク質は存在しない。言い換えれば、いかなる内因性タンパク質が存在する場合も不活性な及び／又は短縮化された形態であることが好ましい。
変異は、本明細書で詳述されるタンパク質をコードする核酸配列を中断する場合がある。
中断は、転写及び／又は翻訳されない核酸配列を引き起こし得る。
核酸配列は、例えば、核酸配列のＡＴＧ開始コドンを欠失することによって、又はそうでなければ改変することによって中断される場合があり、その結果、タンパク質の翻訳は低減される、又は妨げられる。
核酸配列は、タンパク質の発現を低減する若しくは妨げる、又はタンパク質輸送に影響を及ぼす１つ又は２つ以上のヌクレオチド変化を含み得る。例えば、タンパク質の発現は、オープンリーディングフレーム中に１つ又は２つ以上の未熟終止コドン、フレームシフト、スプライス変異体又は許容されないアミノ酸置換を導入することによって低減又は妨げることができる。
未熟終止コドンとは、オープンリーディングフレーム中に終止コドンを導入し、全アミノ酸配列の翻訳を妨げる変異を指す。未熟終止コドンは、ＴＡＧ（「アンバー（amber）」）、ＴＡＡ（「オーカー」）、又はＴＧＡ（「オパール」又は「アンバー（umber）」）コドンであり得る。
適切には、未熟終止コドンは、配列番号５～７のいずれかで示されるＮｉｔａｂ４．５＿０００３０９０ｇ００３０．１（ＥＲＦ１９９）に導入されてもよい。
適切には、Ｎｉｔａｂ４．５＿０００３０９０ｇ００３０．１（ＥＲＦ１９９）中の未熟終止コドンは、配列番号５～７のいずれかで示されるように、ＴＧＡ（「オパール」又は「アンバー」）未熟終止コドンであり得る。
フレームシフト変異（フレーミングエラー又はリーディングフレームシフトとも呼ばれる）は、３で割り切れない核酸配列中のいくつかのヌクレオチドの挿入欠失（挿入又は欠失）によって引き起こされる変異である。コドンによる遺伝子発現のトリプレット性のために、挿入又は欠失は、リーディングフレームを変化させ、元とは完全に異なる翻訳をもたらし得る。フレームシフト変異は、変異後のコドンのリーディングが異なるアミノ酸をコードすることを引き起こすことが多い。フレームシフト変異は、一般に未熟終止コドンの導入をもたらす。
スプライス変異体は、前駆体メッセンジャーＲＮＡの成熟メッセンジャーＲＮＡへのプロセシングの際にスプライシングが起こる指定の部位において、いくつかのヌクレオチドを挿入、欠失又は変化させる。スプライシング部位の欠失は、成熟ｍＲＮＡ中に残存する１つ又は２つ以上のイントロンをもたらし、異常タンパク質の生成につながり得る。
許容されないアミノ酸置換とは、タンパク質において非同義アミノ酸置換を引き起こす変異を指し、これは、タンパク質の低減された又は取り除かれた機能をもたらす。
核酸配列中に変異を提供するための当技術分野で公知のいかなる方法も、本発明による方法において使用できる。例えば、関連核酸配列が変異され、植物又は植物細胞を形質転換するために使用されるベクターが作出される相同組換えを使用できる。次いで、変異された配列を発現する組換え植物又は植物細胞が選択され得る。
核酸配列は、全体的又は部分的に欠失され得る。欠失は、連続的である場合も、配列の複数のセクションを含む場合もある。欠失は、好ましくは、核酸配列がもはや機能性タンパク質をコードしないような十分な量のヌクレオチド配列を除去する。欠失は、例えば、核酸配列のコーディング部分の少なくとも５０、６０、７０、８０又は９０％を除去し得る。
欠失は、比較できる未改変植物の対応するゲノムと比較された場合に、核酸配列のコーディング部分の１００％が存在しない場合に完全であり得る。
植物における核酸配列の欠失のための方法は、当技術分野で公知である。例えば、関連核酸配列（複数可）を欠き、植物又は植物細胞を形質転換するために使用されるベクターが作出される相同組換えを使用できる。次いで、配列の新規部分を発現する組換え植物又は植物細胞が選択され得る。
上述したようなベクターで形質転換された植物細胞は、周知の組織培養法に従って、例えば、必要な増殖因子、例えば、アミノ酸、植物ホルモン、ビタミンなどが補給された適切な培養培地で細胞を培養することによって増殖され、維持され得る。
核酸配列の改変は、標的化突然変異誘発法（標的化ヌクレオチド交換（ＴＮＥ；targeted nucleotide exchange）又はオリゴ指示突然変異誘発（ＯＤＭ；oligo-directed mutagenesis）とも呼ばれる）を使用して行うことができる。標的化突然変異誘発法としては、制限されるものではないが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ（国際公開第２０１１／０７２２４６号パンフレット及び国際公開第２０１０／０７９４３０号パンフレットを参照されたい）、Ｃａｓ９様、Ｃａｓ９／ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ又はＣａｓ９／ｇＲＮＡ ＣＲＩＳＰＲシステム（国際公開第２０１４／０７１００６号パンフレット及び国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレットを参照されたい）、メガヌクレアーゼ（国際公開第２００７／０４７８５９号パンフレット及び国際公開第２００９／０５９１９５号パンフレットを参照されたい）を採用するもの、或いは植物プロトプラストへの遺伝子に対する配列相補性を用いて突然変異誘発を増強するための化学的に修飾されたヌクレオチドをおそらくは含有する変異原性のオリゴヌクレオチドを採用する標的化突然変異誘発方法（例えば、ＫｅｙＢａｓｅ（登録商標）又はＴＡＬＥＮ）が挙げられる。
或いは、ＴＩＬＬＩＮＧ（ゲノミクスにおいて誘発された局所病変を標的とする、Targeting Induced Local Lesions IN Genomics；McCallum et al., 2000, Nat Biotech 18:455、及びMcCallum et al. 2000, Plant Physiol. 123, 439-442、両方とも参照により本明細書に組み込まれる）などの突然変異誘発システムを使用して、変異を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む植物株を生成できる。ＴＩＬＬＩＮＧは、伝統的な化学的突然変異誘発（例えば、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ，ethyl methanesulfonate）突然変異誘発）、それに続く変異についてのハイスループットスクリーニングを使用する。このように、所望の変異を有する遺伝子を含む植物、種子及び組織を得ることができる。
方法は、植物種子を突然変異誘発するステップ（例えば、ＥＭＳ突然変異誘発）、植物個体又はＤＮＡをプールするステップ、目的の領域をＰＣＲ増幅、ヘテロ二本鎖形成及びハイスループット検出、変異体植物の同定、変異体ＰＣＲ産物のシーケンシングを含み得る。他の突然変異誘発及び選択方法も同等に使用して、このような改変された植物を生成できるということは理解される。例えば、種子を放射線照射又は化学的処置でき、植物を改変された表現型についてスクリーニングできる。
改変された植物は、改変されていない植物、すなわち野生型植物と、分子的な方法、例えば、ＤＮＡ中に存在する変異（複数可）によって、及び改変された表現型の特性によって区別することができる。改変された植物は、変異についてホモ接合性である場合も、ヘテロ接合性である場合もある。
適切には、方法は、少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子の活性又は発現を阻害することが可能な遺伝子コンストラクト（又は少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子と組み合わせた、少なくとも１つのＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／又は少なくとも１つのＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現を阻害することが可能なコンストラクト）で、植物（例えば、タバコ植物）の細胞を形質転換するステップを含み得る。
一部の実施形態では、少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子（又は少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子並びに少なくとも１つのＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくは少なくとも１つのＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子の組合せ）の活性又は発現を増大させ、それによってアルカロイド含有量を増加させる改変は、少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子（又は少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子、並びに少なくとも１つのＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくは少なくとも１つのＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子の組合せ）の転写、翻訳又は発現を増大させる、促進する、又は増強すること；少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子（又は少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子、並びに少なくとも１つのＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくは少なくとも１つのＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子の組合せ）によってコードされたポリペプチドの合成、又は細胞内ストアからのその放出を増加させること；及び少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子（又は少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子、並びに少なくとも１つのＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくは少なくとも１つのＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子の組合せ）によってコードされたポリペプチドの分解の速度を減少させることからなる群から選択される。
適切には、本方法は、少なくとも１つの外因性Ｎｉｃ３遺伝子をコードするか（又は少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子並びに少なくとも１つのＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくは少なくとも１つのＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子の組合せをコードするか）、或いは少なくとも１つの内因性Ｎｉｃ３遺伝子（又は少なくとも１つの内因性Ｎｉｃ３遺伝子並びに少なくとも１つの内因性Ｎｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくは少なくとも１つの内因性Ｎｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子の組合せ）を促進又は増強可能なタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子コンストラクトで、植物（例えば、タバコ植物）の細胞を形質転換するステップを含み得る。これらの選択肢の各々は、少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子（又は少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子並びに少なくとも１つのＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくは少なくとも１つのＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子の組合せ）によってコードされるポリペプチドの活性及び発現の増大をもたらすであろうということが認められよう。方法は、形質転換された細胞から植物を再生するステップを含み得る。
したがって、コンストラクトで形質転換された植物におけるアルカロイド含有量を増加させるための、少なくとも１つのＮｉｃ３（又は少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子並びに少なくとも１つのＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくは少なくとも１つのＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子の組合せ）によってコードされるポリペプチドの活性及び／又は発現を増大可能である遺伝子コンストラクトの使用が提供される。
遺伝子コンストラクトは、表１、表２及び／若しくは表３に記載されるアミノ酸配列、又はそれらの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログを含むポリペプチドをコードし得る。
一部の実施形態では、本発明による方法又は使用は、Ｎｉｃ３遺伝子の活性若しくは発現、又はＮｉｃ３遺伝子並びにＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくはＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現を増大させることによって植物（例えば、タバコ植物）又は細胞のアルカロイド含有量を増加させるステップを含む。
「阻害すること」（例えば、Ｎｉｃ３遺伝子の活性又は発現を阻害すること）という用語は、本明細書で使用される場合、遺伝子（例えば、Ｎｉｃ３遺伝子）の活性又は発現が、比較できる製品における遺伝子の遺伝子の活性又は発現と比較して低く又は低下していること、又はその遺伝子によって産生されたタンパク質の量又は活性がより低いことを意味する。
一実施形態では、「阻害すること」（例えば、Ｎｉｃ３遺伝子の活性又は発現を阻害すること）という用語は、本明細書で使用される場合、Ｎｉｃ３遺伝子の活性又は発現が、比較できる製品における遺伝子の遺伝子活性又は発現と比較して、より低いことを意味する。
特定のＮｉｃ３遺伝子、Ｎｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子又はＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子の活性は、遺伝子の転写を測定することによって測定できる。転写を測定する方法は当技術分野で周知であり、中でも、ノーザンブロット、ＲＮＡ－Ｓｅｑ、インサイツハイブリダイゼーション、ＤＮＡマイクロアレイ及びＲＴ－ＰＣＲが挙げられる。或いは、遺伝子の活性は、遺伝子産物、例えば、前記遺伝子によってコードされるタンパク質のレベルを測定することによって間接的に測定できる。
一部の実施形態では、Ｎｉｃ３遺伝子、Ｎｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子又はＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現は、調節され得、すなわち、本発明に従って改変されていない植物（例えば、タバコ植物）における前記遺伝子の活性又は発現と比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、又は４０％、適切には、少なくとも約５０％、６０％、７０％、より適切には、少なくとも約８０％、９０％、９５％又は１００％増大又は低下され得る。
適切には、Ｎｉｃ３遺伝子、Ｎｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子又はＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子の発現又は機能は、前記遺伝子のタンパク質発現又は機能が検出可能ではないように、低減され、部分不活化され、阻害され、排除され、ノックアウトされ、又は失われ得る。
一態様では、少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子、Ｎｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子又はＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子は、ノックアウトされる。言い換えれば、遺伝子が完全に無効にされている。
好ましい実施形態では、Ｎｉｃ３遺伝子は、実質的に活性又は発現を有していなくてもよく、これは、好ましくはＮｉｃ３遺伝子の活性又は発現を阻害するために改変されていない植物と比較した場合に、植物が約１％未満（適切には、約０．１％未満）の活性又は発現を含み得ることを意味する。
好ましい実施形態では、Ｎｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子は、実質的に活性又は発現を有していなくてもよく、これは、好ましくはＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現を阻害するために改変されていない植物と比較した場合に、植物が約１％（適切には、約０．１％未満）の活性又は発現を含み得ることを意味する。
好ましい実施形態では、Ｎｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子は、実質的に活性又は発現を有していなくてもよく、これは、好ましくはＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現を阻害するために改変されていない植物と比較した場合に、植物が約１％未満（適切には、約０．１％未満）の活性又は発現を含み得ることを意味する。
「ＥＲＦ遺伝子」は、本明細書で使用される場合、エチレン応答因子（ＥＲＦ）サブファミリーに属する転写因子遺伝子を指す。
「Ｎｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子」は、本明細書で使用される場合、国際公開第２０１８／２３７１０７号パンフレットで本発明者らがＮｉｃ１領域へのマッピングとして同定したＥＲＦ遺伝子を指す。本明細書で使用されるＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子は、表１に、それらの対応するヌクレオチド、ｃＤＮＡ、ｃｄｓ及びアミノ酸配列識別子と共に列挙される。
適切には、本発明で使用するための少なくとも１つのＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子は、表１に列挙したもののいずれか１つである。
上記の表に列挙したＮｉｃ１ ＥＲＦ及びＮｉｃ２ ＥＲＦのそれぞれのゲノム配列は、Ｎｉｃ１ ＥＲＦ ＥＲＦ１７Ｌ３を除いて、それらの対応するコード配列と同一である。ＥＲＦ１７Ｌ３のゲノム配列（配列番号１）は、ＥＲＦ１７Ｌ３のコード配列（配列番号３）と同一ではない。
「Ｎｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子」は、本明細書で使用される場合、Ｎｉｃ２領域にマッピングされるＥＲＦ遺伝子を指す。本明細書で使用されるＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子は、以下の表２に、それらの対応するヌクレオチド、ｃＤＮＡ、ｃｄｓ及びアミノ酸配列識別子と共に列挙される。
適切には、本発明で使用するためのＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子は、表２に列挙したもののいずれか１つである。
一実施形態では、本明細書で言及される少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子は、表３に示されるポリヌクレオチド配列によってコードされ得る。
適切には、本明細書で言及される少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子は、
ｉ）配列番号７３、配列番号７６、配列番号７９、配列番号８２、配列番号８５、配列番号８８、配列番号９１、配列番号９４、配列番号９７、配列番号１００、配列番号１０３、配列番号１０６、配列番号１０９、配列番号１１２、配列番号１１５、配列番号１１８、配列番号１２１、配列番号１２４、配列番号１２７、配列番号１３０、配列番号１３３、配列番号１３６、配列番号１３９、配列番号１４２、配列番号１４５、配列番号１４８若しくは配列番号１５１（適切には配列番号７３、１１８、１２４又は１２７）として本明細書で示されるポリヌクレオチド配列；又はそれに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列；或いは
ii）機能的断片がＮｉｃ３遺伝子をコードするｉ）に示されるポリヌクレオチド配列の機能的断片、或いは
iii）配列番号７５、配列番号７８、配列番号８１、配列番号８４、配列番号８７、配列番号９０、配列番号９３、配列番号９６、配列番号９９、配列番号１０２、配列番号１０５、配列番号１０８、配列番号１１１、配列番号１１４、配列番号１１７、配列番号１２０、配列番号１２３、配列番号１２６、配列番号１２９、配列番号１３２、配列番号１３５、配列番号１３８、配列番号１４１、配列番号１４４、配列番号１４７、配列番号１５０又は配列番号１５３、適切には、配列番号７５、１２０、１２６又は１２９）として本明細書で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、或いは
iv）上記のｉ）、ii）又はiii）に教示されたポリヌクレオチドに高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズできるポリヌクレオチド配列、或いは
ｖ）上記のｉ）、ii）又はiii）に示されるポリヌクレオチドと、少なくとも８０％（好ましくは８５％、好ましくは９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９６％、より好ましくは９７％、より好ましくは９８％）の同一性を有するポリヌクレオチド配列、或いは
vi）遺伝子コードの縮重に起因して、ｉ）、ii）又はiii）に示されるポリヌクレオチドとは異なるポリヌクレオチド配列
を含むポリヌクレオチド配列によってコードされ得る。
ｉ）配列番号７３、配列番号７６、配列番号７９、配列番号８２、配列番号８５、配列番号８８、配列番号９１、配列番号９４、配列番号９７、配列番号１００、配列番号１０３、配列番号１０６、配列番号１０９、配列番号１１２、配列番号１１５、配列番号１１８、配列番号１２１、配列番号１２４、配列番号１２７、配列番号１３０、配列番号１３３、配列番号１３６、配列番号１３９、配列番号１４２、配列番号１４５、配列番号１４８若しくは配列番号１５１（適切には配列番号７３、１１８、１２４又は１２７）として本明細書で示されるポリヌクレオチド配列；又はそれに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列；或いは
ii）機能的断片がＮｉｃ３遺伝子をコードするｉ）に示されるポリヌクレオチド配列の機能的断片、或いは
iii）配列番号７５、配列番号７８、配列番号８１、配列番号８４、配列番号８７、配列番号９０、配列番号９３、配列番号９６、配列番号９９、配列番号１０２、配列番号１０５、配列番号１０８、配列番号１１１、配列番号１１４、配列番号１１７、配列番号１２０、配列番号１２３、配列番号１２６、配列番号１２９、配列番号１３２、配列番号１３５、配列番号１３８、配列番号１４１、配列番号１４４、配列番号１４７、配列番号１５０又は配列番号１５３、適切には、配列番号７５、１２０、１２６又は１２９）として本明細書で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、或いは
iv）上記のｉ）、ii）又はiii）に教示されたポリヌクレオチドに高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズできるポリヌクレオチド配列、或いは
ｖ）上記のｉ）、ii）又はiii）に示されるポリヌクレオチドと、少なくとも８０％（好ましくは８５％、好ましくは９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９６％、より好ましくは９７％、より好ましくは９８％）の同一性を有するポリヌクレオチド配列、或いは
vi）遺伝子コードの縮重に起因して、ｉ）、ii）又はiii）に示されるポリヌクレオチドとは異なるポリヌクレオチド配列
を含むポリヌクレオチド配列によってコードされ得る。
一実施形態では、本明細書で言及される少なくとも１つのＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子は、
ｉ）配列番号１、配列番号３；配列番号５、配列番号９、配列番号１３、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２５、配列番号２９若しくは配列番号３３として本明細書で示されるポリヌクレオチド配列；又は
ii）ｉ）に示されるポリヌクレオチド配列の機能的断片であって、Ｎｉｃ１ ＥＲＦ合成遺伝子をコードする、機能的断片、又は
iii）配列番号４、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２４、配列番号２８、配列番号３２若しくは配列番号３６として本明細書で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は
iv）上記のｉ）、ii）若しくはiii）に教示されたポリヌクレオチドに高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズできるポリヌクレオチド配列、又は
ｖ）上記のｉ）、ii）若しくはiii）に示されるポリヌクレオチドと、少なくとも７０％（好ましくは８０％、好ましくは８５％、好ましくは９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９６％、より好ましくは９７％、より好ましくは９８％）の同一性を有するポリヌクレオチド配列、又は
vi）遺伝子コードの縮重に起因して、ｉ）、ii）又はiii）に示されるポリヌクレオチドとは異なるポリヌクレオチド配列
を含むポリヌクレオチド配列によってコードされ得る。
ｉ）配列番号１、配列番号３；配列番号５、配列番号９、配列番号１３、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２５、配列番号２９若しくは配列番号３３として本明細書で示されるポリヌクレオチド配列；又は
ii）ｉ）に示されるポリヌクレオチド配列の機能的断片であって、Ｎｉｃ１ ＥＲＦ合成遺伝子をコードする、機能的断片、又は
iii）配列番号４、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２４、配列番号２８、配列番号３２若しくは配列番号３６として本明細書で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は
iv）上記のｉ）、ii）若しくはiii）に教示されたポリヌクレオチドに高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズできるポリヌクレオチド配列、又は
ｖ）上記のｉ）、ii）若しくはiii）に示されるポリヌクレオチドと、少なくとも７０％（好ましくは８０％、好ましくは８５％、好ましくは９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９６％、より好ましくは９７％、より好ましくは９８％）の同一性を有するポリヌクレオチド配列、又は
vi）遺伝子コードの縮重に起因して、ｉ）、ii）又はiii）に示されるポリヌクレオチドとは異なるポリヌクレオチド配列
を含むポリヌクレオチド配列によってコードされ得る。
一実施形態では、本明細書で言及される少なくとも１つのＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子は、
ｉ）配列番号３７、配列番号４１、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５３、配列番号５７、配列番号６１、配列番号６５若しくは配列番号６９として本明細書で示されるポリヌクレオチド配列；又は
ii）ｉ）に示されるポリヌクレオチド配列の機能的断片であって、Ｎｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子をコードする、機能的断片、又は
iii）配列番号４０、配列番号４４、配列番号４８、配列番号５２、配列番号５６、配列番号６０、配列番号６４、配列番号６８若しくは配列番号７２として本明細書で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は
iv）上記のｉ）、ii）若しくはiii）に教示されたポリヌクレオチドに高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズできるポリヌクレオチド配列、又は
ｖ）上記のｉ）、ii）若しくはiii）に示されるポリヌクレオチドと、少なくとも７０％（好ましくは８０％、好ましくは８５％、好ましくは９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９６％、より好ましくは９７％、より好ましくは９８％）の同一性を有するポリヌクレオチド配列、又は
vi）遺伝子コードの縮重に起因して、ｉ）、ii）若しくはiii）に示されるポリヌクレオチドとは異なるポリヌクレオチド配列
を含むポリヌクレオチド配列によってコードされ得る。
ｉ）配列番号３７、配列番号４１、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５３、配列番号５７、配列番号６１、配列番号６５若しくは配列番号６９として本明細書で示されるポリヌクレオチド配列；又は
ii）ｉ）に示されるポリヌクレオチド配列の機能的断片であって、Ｎｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子をコードする、機能的断片、又は
iii）配列番号４０、配列番号４４、配列番号４８、配列番号５２、配列番号５６、配列番号６０、配列番号６４、配列番号６８若しくは配列番号７２として本明細書で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は
iv）上記のｉ）、ii）若しくはiii）に教示されたポリヌクレオチドに高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズできるポリヌクレオチド配列、又は
ｖ）上記のｉ）、ii）若しくはiii）に示されるポリヌクレオチドと、少なくとも７０％（好ましくは８０％、好ましくは８５％、好ましくは９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９６％、より好ましくは９７％、より好ましくは９８％）の同一性を有するポリヌクレオチド配列、又は
vi）遺伝子コードの縮重に起因して、ｉ）、ii）若しくはiii）に示されるポリヌクレオチドとは異なるポリヌクレオチド配列
を含むポリヌクレオチド配列によってコードされ得る。
一実施形態では、本発明に従った使用のための少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子は、植物（例えば、タバコ植物）にとって内因性であり得る。
一実施形態では、本発明に従った使用のための少なくとも１つのＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子は、植物（例えば、タバコ植物）にとって内因性であり得る。
一実施形態では、本発明に従った使用のための少なくとも１つのＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子は、植物（例えば、タバコ植物）にとって内因性であり得る。
本明細書における「内因性」遺伝子への言及は、その天然形態で（すなわち、いかなるヒト介入もなく）植物に見出される問題の遺伝子を指すだけでなく、引き続き植物（導入遺伝子）又は植物細胞に（再）導入される単離した形態でのその同じ遺伝子（又は実質的に相同な核酸／遺伝子）も指す。例えば、このような導入遺伝子を含有するトランスジェニック植物は、導入遺伝子発現の実質的な低減及び／又は内因性遺伝子の発現の実質的な低減に遭遇する可能性がある。単離された遺伝子は、生物から単離されてもよいし、又は人工であってもよく、例えば、化学合成による人工であってもよい。
別の実施形態では、本発明に従った使用のための少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子は、植物（例えば、タバコ植物）にとって外因性であり得る。
別の実施形態では、本発明に従った使用のための少なくとも１つのＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子は、植物（例えば、タバコ植物）にとって外因性であり得る。
別の実施形態では、本発明に従った使用のための少なくとも１つのＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子は、植物（例えば、タバコ植物）にとって外因性であり得る。
用語「外因性遺伝子」は、未改変植物に形質転換される遺伝子が、外部源由来である、すなわち形質転換されるものにとって異なる種由来であることを意味する場合がある。外因性遺伝子は、未改変植物における内因性遺伝子と実質的に同じ又は異なる核酸配列を含んでいてもよい。外因性遺伝子は、あらゆる種からのその遺伝子に対応するゲノム又はｃＤＮＡ配列由来であってもよい。外因性遺伝子は、キメラ遺伝子を形成し得る。外因性遺伝子は、表１に記載されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、又はその機能的バリアント若しくは断片若しくはオルソログをコードし得る。外因性遺伝子は、表２に記載されるヌクレオチド配列、又はその機能的バリアント若しくは断片若しくはオルソログを含んでいてもよい。外因性遺伝子は、表３に記載されるヌクレオチド配列、又はその機能的バリアント若しくは断片若しくはオルソログを含んでいてもよい。
本発明はまた、植物のアルカロイド含有量を調節するためのＮｉｃ３遺伝子の使用も提供する。
一実施形態では、本発明はさらに、植物のアルカロイド含有量を調節するための、Ｎｉｃ３遺伝子、及び任意に、Ｎｉｃ１ ＥＲＦ及び／又はＮｉｃ２ ＥＲＦの使用を提供する。
遺伝子の発現又は遺伝子産物を低下させるための方法は、当技術分野において十分に立証されている。Ｎｉｃ３遺伝子の活性又は発現を調節するための本明細書に記載されるあらゆる方法が、Ｎｉｃ３遺伝子、並びに任意に、Ｎｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／又はＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現を改変するために使用できる。
一実施形態では、Ｎｉｃ３遺伝子の活性又は発現、或いはＮｉｃ３遺伝子、並びに任意に、Ｎｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくはＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現は、当技術分野で公知のあらゆる方法によって阻害され得る。
Ｎｉｃ３遺伝子の活性若しくは発現、又はＮｉｃ３遺伝子並びにＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくはＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現を阻害するための方法としては、遺伝子編集、標的化突然変異誘発、ＲＮＡ干渉、アンチセンス又はセンスの同時抑制を挙げることができる（参照により本明細書に組み込まれる、Wang and Wagner 2003, Planta Volume 216, Issue 4, pp 686-691を参照されたい）。一実施形態では、遺伝子の活性又は発現の阻害は、遺伝子編集の使用によって達成することができる。遺伝子編集は、当技術分野で公知のあらゆる方法を使用して行ってもよい。いくつかの非限定的な例を本明細書に提示する。
一実施形態では、Ｎｉｃ３遺伝子の活性若しくは発現、又はＮｉｃ３遺伝子並びにＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくはＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現の阻害は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの使用を含むＣＲＩＳＰＲを含む遺伝子編集方法を使用して達成され得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集ツールは、商業的に入手可能であり、例えば、Clontech社（Avenue du President Kennedy 78100 Saint-Germain-en-Laye、France）からの「Guide-it」である。
適切には、遺伝子編集ベクターｐＲＧＥＢ－Ｍ２４を生成するために、ベクターｐＲＧＥＢ３１におけるコメｓｎｏＲＮＡ Ｕ３プロモーターは、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１８／２３７１０７号パンフレットに記載されたように、HindIII及びBsaIで補助されるインフュージョンクローニングを介して、pSiM24から増幅したＭ２４プロモーターで置換されていてもよい（参照により本明細書に組み込まれる、Sahoo, D. K., Dey, N., and Maiti, I. B. (2014). pSiM24 is a novel versatile gene expression vector for transient assays as well as stable expression of foreign genes in plants. PLoS One 9, e98988）。例えば、１対のオリゴは、候補遺伝子のそれぞれを特異的に標的化するように設計することができる。
オリゴ対をまずアニールして、両方の末端に４－ｎｔの５’オーバーハングを有する二本鎖断片を産生し、次いでBsaIで消化したpRGEB-M24ベクターにライゲーションする。
遺伝子編集の別の方法としては、商業的に入手可能なキット（例えば、Addgene社、１Kendall Sq. Ste. B7102、Cambridge、MA 02139、USAから）を用いたＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）技術の使用が挙げられる。一実施形態では、少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子の活性若しくは発現又は少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子並びに少なくとも１つのＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくは少なくとも１つのＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現の阻害は、ＴＡＬＥＮを使用して達成され得る。
別の実施形態では、本方法は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、例えば、Sigma-Aldrich社より入手可能なCompoZr（登録商標）ジンクフィンガーヌクレアーゼ技術の使用を含んでいてもよい。別の実施形態は、Silva et al. Curr Gene Ther. Feb 2011; 11(1): 11-27（その教示は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるメガヌクレアーゼ（又はさらなる方法）の使用を含んでいてもよい。
一実施形態では、Ｎｉｃ３遺伝子、又はＮｉｃ３遺伝子並びにＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくはＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現を阻害するための方法は、標的化突然変異誘発であり得る。標的化突然変異誘発のあらゆる方法を使用できる。一実施形態では、本方法は、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発（oligonucleotide-directed mutagenesis；ODM）であってもよく、例えば、Keygene社（Agro Business Park 90、6708 PW Wageningen、The Netherlands）より入手可能なKeyBase（登録商標）であってもよい。別の実施形態では、Ｎｉｃ３遺伝子の活性若しくは発現、又はＮｉｃ３遺伝子並びにＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくはＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現の阻害は、コンストラクト又はベクター（例えば、プラスミド）の使用によって達成することができる。
本発明の遺伝子コンストラクトは、発現カセットの形態であってもよく、これは、宿主細胞におけるＮｉｃ３遺伝子の活性若しくは発現、又はＮｉｃ３遺伝子並びにＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくはＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現の阻害、或いは宿主細胞におけるＮｉｃ３遺伝子の活性若しくは発現、又はＮｉｃ３遺伝子並びにＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくはＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現の増大に適したものでもよい。遺伝子コンストラクトは、それをベクターに組み込まれることなく宿主細胞に導入されてもよい。例えば、遺伝子コンストラクトは、核酸分子であってもよく、リポソーム又はウイルス粒子内に組み込まれていてもよい。或いは、精製した核酸分子（例えば、ヒストン非含有のＤＮＡ又は裸のＤＮＡ）は、適切な手段、例えば、直接のエンドサイトーシスによる取り込みによって宿主細胞に直接挿入されてもよい。遺伝子コンストラクトは、トランスフェクション、感染、マイクロインジェクション、細胞融合、プロトプラスト融合又は弾道衝撃によって、宿主対象（例えば、植物）の細胞に直接導入されてもよい。或いは、本発明の遺伝子コンストラクトは、パーティクルガンを使用して宿主細胞に直接導入されてもよい。
或いは、遺伝子コンストラクトは、適切な宿主細胞における発現のために、組換えベクターを含んでいてもよいし、又は組換えベクターに内包されていてもよい。組換えベクターは、プラスミド、コスミド又はファージであり得る。このような組換えベクターは、宿主細胞を本発明の遺伝子コンストラクトで形質転換すること、及びその中の発現カセットを複製することにとって高度に有用である。熟練した専門家は、本発明の遺伝子コンストラクトが、発現目的のために、多くのタイプのバックボーンベクターと組み合わせることができることが認められるであろう。バックボーンベクターは、バイナリーベクターであってもよく、これは、例えば、大腸菌（E. coli）とアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の両方で複製可能なものである。例えば、適切なベクターは、pBINプラスミド、例えば、pBIN19（Bevan M., 1984, Nucleic Acids Research 12:8711-21）であり得る。
組換えベクターは、少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子の活性若しくは発現、又は少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子並びに少なくとも１つのＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくは少なくとも１つのＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現を阻害する配列に加えて、様々な他の機能的なエレメントを含み得る。例えば、ベクターは、プロモーターを含んでいてもよい。加えて、組換えベクターは、宿主細胞のサイトゾルでそれが自律的に複製するように設計することができる。このケースでは、組換えベクターに、ＤＮＡ複製を誘導又は調節するエレメントが必要な場合がある。或いは、組換えベクターは、宿主細胞のゲノムにそれが組み込まれるように設計することができる。このケースでは、標的化された組込み（例えば、相同組換えによる）のほうに適したＤＮＡ配列が想定される。
組換えベクターはまた、クローニングプロセスにおいて選択可能マーカーとして使用することができる遺伝子をコードするＤＮＡ、すなわち、トランスフェクト又は形質転換された細胞の選択を可能にし、さらに、異種ＤＮＡを組み込んだベクターを内包する細胞の選択を可能にするための遺伝子をコードするＤＮＡも含み得る。ベクターはまた、コード配列の発現を調節することに関与する、又は発現されたポリペプチドを、宿主細胞の特定の部分に、例えば、突起様構造又は腺状突起に標的化するためのＤＮＡも含み得る。したがって、ベクターは、選択可能マーカー遺伝子（例えば、抗生物質耐性遺伝子）；ポリペプチド終結シグナル；及びタンパク質標的配列（例えば、輸送ペプチド）からなる群から選択される少なくとも１つの追加のエレメントを含んでいてもよい。
一実施形態では、本方法又は使用は、干渉するオリゴヌクレオチドを使用して、Ｎｉｃ３遺伝子の活性若しくは発現、又はＮｉｃ３遺伝子並びにＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくはＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現を阻害することを含んでいてもよい。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡベースである。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）であり、例えば、ｄｓＲＮＡｉである。一実施形態では、本方法は、Ｎｉｃ３遺伝子の活性若しくは発現、又はＮｉｃ３遺伝子並びにＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくはＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現を阻害するＲＮＡｉ分子、例えば、ｄｓＲＮＡｉで植物（例えば、タバコ植物）の細胞を形質転換することを含んでいてもよい。適切には、ＲＮＡｉ分子は、植物の細胞に導入することができるベクターから提供されてもよく、例えば、関連遺伝子の断片（例えば、１００～３００ヌクレオチドの長さの断片）を有し、ＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシングを誘因するようにｄｓＲＮＡを産生するウイルスに含まれる遺伝子のサイレンシングが使用され得る。
一実施形態では、少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子、Ｎｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／又はＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現は、比較できる植物若しくはその一部又は細胞におけるポリペプチドの活性又は発現と比較して、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又はそれを超えて、又は１００％低下する。
一実施形態では、少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子、少なくとも１つのＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び少なくとも１つのＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現は、野生型植物又は比較できる植物、若しくはその一部又は細胞におけるポリペプチドの活性又は発現と比較して、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又はそれを超えて、又は１００％低下する。
少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子の活性若しくは発現、又は少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子並びに少なくとも１つのＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくは少なくとも１つのＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現は、当技術分野で公知のあらゆる方法によって阻害され得る。前記の実施形態のいずれかにおいて、少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子の活性若しくは発現、又は少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子並びに少なくとも１つのＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくは少なくとも１つのＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムの使用を含むＣＲＩＳＰＲを含む遺伝子編集方法、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、アンチセンス若しくはセンスの同時抑制、遺伝子編集又は標的化突然変異誘発を含むあらゆる方法によって阻害され得る。前記の実施形態のいずれかにおいて、少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子の活性若しくは発現、又は少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子並びに少なくとも１つのＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくは少なくとも１つのＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現は、ＲＮＡｉ方法を使用して、例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを使用して阻害され得る。
一実施形態では、Ｎｉｃ３遺伝子の活性若しくは発現、又は少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子並びに少なくとも１つのＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくは少なくとも１つのＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現を調節するコンストラクトは、ベクターに含まれていてもよい。適切には、ベクターは、プラスミドであり得る。
一実施形態では、本発明で使用するためのベクターは、アグロバクテリウム属ベースのプラスミドである。
したがって、一実施形態では、Ｎｉｃ３遺伝子の発現、又はＮｉｃ３遺伝子並びにＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくはＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現が調節されている、植物（例えば、タバコ植物）及び植物増殖材料（例えば、タバコ植物増殖材料）、葉（例えば、タバコ葉）、切断され採取された葉、加工された葉（例えば、加工されたタバコ葉）又は切断され加工された葉（例えば、切断され加工されたタバコ葉）が提供される。
別の実施形態では、細胞（例えば、タバコ細胞）、植物（例えば、タバコ植物）若しくはその一部、及び／又は植物増殖材料は、Ｎｉｃ３遺伝子の活性若しくは発現、又はＮｉｃ３遺伝子並びにＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくはＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現を調節するコンストラクトを含んでいてもよい。一実施形態では、コンストラクトは、Ｎｉｃ３遺伝子の活性若しくは発現、又はＮｉｃ３遺伝子並びにＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくはＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現を低下させる。別の実施形態では、コンストラクトは、Ｎｉｃ３遺伝子の活性若しくは発現、又はＮｉｃ３遺伝子並びにＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくはＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現を増大させる。
さらなる実施形態では、本発明による細胞（例えば、タバコ細胞）、植物（例えば、タバコ植物）若しくはその一部及び／又は植物増殖材料は、
ｉ）表３に示されるポリヌクレオチド配列；又は
ii）機能的断片がＮｉｃ３遺伝子をコードするｉ）に示されるポリヌクレオチド配列の機能的断片、又は
iii）表３に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は
iv）上記のｉ）、ii）若しくはiii）に教示されたポリヌクレオチドに高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズできるポリヌクレオチド配列、又は
ｖ）上記のｉ）、ii）若しくはiii）に示されるポリヌクレオチドと、少なくとも８０％（好ましくは８５％、好ましくは９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９６％、より好ましくは９７％、より好ましくは９８％）の同一性を有するポリヌクレオチド配列、又は
vi）遺伝子コードの縮重に起因して、ｉ）、ii）若しくはiii）に示されるポリヌクレオチドとは異なるポリヌクレオチド配列
を含んでいてもよい。適切には、表３の配列は、上記で記載した通りである。
ｉ）表３に示されるポリヌクレオチド配列；又は
ii）機能的断片がＮｉｃ３遺伝子をコードするｉ）に示されるポリヌクレオチド配列の機能的断片、又は
iii）表３に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は
iv）上記のｉ）、ii）若しくはiii）に教示されたポリヌクレオチドに高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズできるポリヌクレオチド配列、又は
ｖ）上記のｉ）、ii）若しくはiii）に示されるポリヌクレオチドと、少なくとも８０％（好ましくは８５％、好ましくは９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９６％、より好ましくは９７％、より好ましくは９８％）の同一性を有するポリヌクレオチド配列、又は
vi）遺伝子コードの縮重に起因して、ｉ）、ii）若しくはiii）に示されるポリヌクレオチドとは異なるポリヌクレオチド配列
を含んでいてもよい。適切には、表３の配列は、上記で記載した通りである。
さらなる実施形態では、本発明による細胞（例えば、タバコ細胞）、植物（例えば、タバコ植物）若しくはその一部及び／又は植物増殖材料は、
ｉ）表３から選択されるポリヌクレオチド配列、表１から選択されるポリヌクレオチド配列、及び表２から選択されるポリヌクレオチド配列；又は
ii）機能的断片がＮｉｃ３遺伝子、Ｎｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子若しくはＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子をコードするｉ）に示されるポリヌクレオチド配列の機能的断片；又は
iii）表３、表１及び表２に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；又は
iv）上記のｉ）、ii）若しくはiii）に教示されたポリヌクレオチドに高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズできるポリヌクレオチド配列；又は
ｖ）上記のｉ）、ii）若しくはiii）に示されるポリヌクレオチドと、少なくとも８０％（好ましくは８５％、好ましくは９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９６％、より好ましくは９７％、より好ましくは９８％）の同一性を有するポリヌクレオチド配列；又は
vi）遺伝子コードの縮重に起因して、ｉ）、ii）若しくはiii）に示されるポリヌクレオチドとは異なるポリヌクレオチド配列
を含んでいてもよい。適切には、表１、２又は３の配列は、上記で記載した通りである。
ｉ）表３から選択されるポリヌクレオチド配列、表１から選択されるポリヌクレオチド配列、及び表２から選択されるポリヌクレオチド配列；又は
ii）機能的断片がＮｉｃ３遺伝子、Ｎｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子若しくはＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子をコードするｉ）に示されるポリヌクレオチド配列の機能的断片；又は
iii）表３、表１及び表２に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；又は
iv）上記のｉ）、ii）若しくはiii）に教示されたポリヌクレオチドに高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズできるポリヌクレオチド配列；又は
ｖ）上記のｉ）、ii）若しくはiii）に示されるポリヌクレオチドと、少なくとも８０％（好ましくは８５％、好ましくは９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９６％、より好ましくは９７％、より好ましくは９８％）の同一性を有するポリヌクレオチド配列；又は
vi）遺伝子コードの縮重に起因して、ｉ）、ii）若しくはiii）に示されるポリヌクレオチドとは異なるポリヌクレオチド配列
を含んでいてもよい。適切には、表１、２又は３の配列は、上記で記載した通りである。
一実施形態では、細胞（例えば、タバコ細胞）は、細胞培養中で増殖させる。
一実施形態では、少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子（又は少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子並びに少なくとも１つのＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくは少なくとも１つのＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子）は、細胞又は細胞培養物（例えば、タバコ細胞培養物）におけるアルカロイド含有量（例えば、ニコチン含有量）を調節するために使用される。
有利な実施形態では、少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子の活性若しくは発現、又は少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子並びに少なくとも１つのＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくは少なくとも１つのＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現の阻害は、アルカロイド含有量における減少をもたらすことができる。適切には、少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子の活性若しくは発現、又は少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子並びに少なくとも１つのＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくは少なくとも１つのＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現の阻害は、ニコチン含有量における減少をもたらすことができる。
別の実施形態では、Ｎｉｃ３遺伝子の活性又は発現（又はＮｉｃ３遺伝子並びにＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくはＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現）を増大させることは、アルカロイド含有量における減少をもたらすことができる。適切には、Ｎｉｃ３ ＥＲＦの活性若しくは発現、又はＮｉｃ３遺伝子並びにＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくはＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現を増大させることは、ニコチン含有量における減少をもたらすことができる。
一実施形態では、植物又はその一部は、タバコ植物である。一実施形態では、本発明によるタバコ植物又はその一部は、本発明に従って改変されたバーレー又は熱気送管乾燥された植物である。一実施形態では、本発明は、本発明に従って改変されたバーレー又は熱気送管乾燥植物に関する。一実施形態では、本発明によるタバコ植物（例えば、改変されたタバコ植物）は、オリエンタル又はトルコタバコ植物である。
一実施形態では、タバコ植物又はその一部は、乾燥されている。一実施形態では、タバコ植物又はその一部は、乾燥されており、例えば、空気乾燥、熱気送管乾燥、火力乾燥又は日光乾燥されている。さらなる態様では、タバコ植物又はその一部は、熱気送管乾燥されている。さらなる態様では、タバコ植物又はその一部は、空気乾燥されている。
熱気送管乾燥は、当技術分野で周知であり、火室又はガス供給システムからの供給を受ける送気管でタバコを乾燥させるプロセスを指す。このプロセスは、タバコを煙に曝露させることなく、乾燥期間中にわたりゆっくり温度を上昇させることによりタバコを熱乾燥させる。この方法は、糖分が豊富で中～高ニコチンレベルを有するタバコを産生する。Smithのタバコ乾燥用納屋（Tobacco Barn）は、伝統的な熱気送管乾燥タバコ乾燥用納屋の例である。
空気乾燥タバコとしては、バーレー、メリーランド、及びダークタバコが挙げられる。共通の因子は、乾燥が、主として熱及び湿度の人工供給源なしでなされていることである。バーレータバコは、明るい茶色から暗い茶色であり、油分が豊富であり、糖分が少ない。バーレータバコは、乾燥用納屋で空気乾燥される。主要なバーレー産出国は、アルゼンチン、ブラジル、イタリア、マラウィ、及び米国である。バーレータバコ植物としては、例えば、Ｃｌａｙ ４０２、Ｃｌａｙ ４０３、Ｃｌａｙ ５０２、Ｋｙ １４、Ｋｙ ９０７、Ｋｙ ９１０、Ｋｙ ８９５９、ＮＣ ２、ＮＣ ３、ＮＣ ４、ＮＣ ５、ＮＣ ２０００、ＴＮ ８６、ＴＮ ９０、ＴＮ ９７、Ｒ ６１０、Ｒ ６３０、Ｒ７１１、Ｒ ７１２、ＮＣＢＨ １２９、Ｂｕ ２１ｘＫｙ １０、ＨＢ０４Ｐ、Ｋｙ １４ｘＬ ８、Ｋｔ ２００、Ｎｅｗｔｏｎ ９８、Ｐｅｄｉｇｏ ５６１、Ｐｆ５６１及びＶａ ５０９が挙げられる。
メリーランドタバコは、優れた燃焼特性、低いニコチン及びニュートラルな芳香を有する。主要なメリーランド産出国としては、米国及びイタリアが挙げられる。空気乾燥されたダークタバコは、主として、空気乾燥されたダークタバコにそのミディアムブラウンからダークブラウンの色と明確な芳香を与えるその発酵プロセスによって他のタイプと区別される。それらの葉は、低い糖含有量を有するが、高いニコチン含有量を有する。空気乾燥されたダークタバコは、主として噛みタバコ及び嗅ぎタバコの生産で使用される。火力乾燥ダークタバコの主要な栽培地域は、米国テネシー州、ケンタッキー州、及びバージニア州である。
用語「機能的断片」は、本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドと同じ方法で機能化することが可能なポリヌクレオチドの部分を指す。例えば、ポリヌクレオチドがＥＲＦ遺伝子である場合、機能的断片は、ＥＲＦ遺伝子として機能化することが可能でなければならず、例えば、機能的断片は、ＥＲＦ遺伝子の活性を保持する。機能的断片は、全長ポリヌクレオチドの活性のレベルに等しいか又はそれより大きい活性のレベルを有していてもよい。
一実施形態では、機能的断片は、少なくとも５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００又は１０００個の連続するヌクレオチドを含む、本明細書で論じられるＮｉｃ３遺伝子の部分であり得る。適切には、機能的断片は、上記に記載される配列番号７５、１２０、１２７又は１２９を有するＮｉｃ３遺伝子のドメインを含む。一部の実施形態では、機能的断片は、本明細書で論じられるＮｉｃ１ ＥＲＦの少なくとも１５０ヌクレオチドを含んでいてもよい。
一実施形態では、機能的断片は、少なくとも５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００又は１０００個の連続するヌクレオチドを含む、本明細書で論じられるＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子の部分であり得る。一部の実施形態では、機能的断片は、本明細書で論じられるＮｉｃ１ ＥＲＦの少なくとも１５０ヌクレオチドを含んでいてもよい。
一実施形態では、Ｎｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子の機能的断片は、少なくとも５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００又は１０００個の連続するヌクレオチドを含む、本明細書で論じられるＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子の部分であり得る。一部の実施形態では、機能的断片は、本明細書で論じられるＮｉｃ２ ＥＲＦの少なくとも１５０ヌクレオチドを含んでいてもよい。
用語「機能的バリアント」は、本明細書で使用される場合、遺伝子機能及び／又はタンパク質機能のいずれかにおいて有意な活性の喪失なくゲノム配列中で生じる可能性がある変動を指す。例えば、ポリペプチド中に存在する一部のアミノ酸（又はポリヌクレオチド中に存在する一部のヌクレオチド）は、有意な活性の喪失なく置換されていてもよい。機能的バリアントは、非バリアントポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドの活性のレベルに等しいか又はそれより大きい活性のレベルを有していてもよい。遺伝子コードの縮重を起因とする本明細書で開示される遺伝子とは異なる配列は、機能的バリアントである。バリアントは、目的の配列と、わずか１０、わずか９、わずか８、わずか７、わずか６、わずか５、わずか４、わずか３、わずか２又はわずか１個のアミノ酸で異なっていてもよい。
用語「遺伝子コードの縮重」は、本明細書で使用される場合、アミノ酸を特定する３つのコドンの組合せの多重度として示される、ポリペプチド配列をコードするコドンにおける冗長性を指す。例えばイソロイシンアミノ酸を有するポリペプチドをコードするｍＲＮＡ分子において、イソロイシンは、ＡＵＵ、ＡＵＣ又はＡＵＡによってコードされ得る。これは、ＲＮＡをコードするＤＮＡ分子は複数の配列を有する可能性があるが、得られたポリペプチドは同じ配列を有することになることを意味する。言い換えれば、多型ヌクレオチド配列は、同じポリペプチド産物をコードすることができる。これは、１つの核酸配列が、同じポリペプチド配列をコードしながらも第２の配列と極めて低い配列同一性を有する配列を含み得ることを意味する。
本明細書に記載される特異的な特性を有するポリペプチドのアミノ酸配列とある程度の配列同一性又は配列相同性を有する配列又は本明細書に記載されるあらゆるヌクレオチド配列は、機能的バリアントであり得る。
用語「オルソログ」は、本明細書で使用される場合、共通の祖先遺伝子から誘導され、分種化の結果として異なる種に見出される遺伝子を指す。オルソログは、ヌクレオチド配列及び又はアミノ酸配列レベルで、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれより大きい配列同一性を共有し得る。オルソロガス遺伝子は、同じ又は類似した機能を共有することが多く、すなわち保存された機能を有することが多い。
本発明の一部の実施形態では、プロモーターが提供されていてもよい。本発明で使用するためのプロモーターは、構成的プロモーター、老化特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、発生学的に調節されるプロモーター及び誘導性プロモーターからなる群から選択される１つ又は２つ以上であり得る。一実施形態では、プロモーターは、構成的プロモーターであり得る。
構成的プロモーターは、植物の発生の際に連続的に植物の様々な部分の全体を通して遺伝子の発現を指示するが、遺伝子は、全ての細胞タイプで同一のレベルで発現されなくてもよい。公知の構成的プロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ転写物（Odell JT, Nagy F, Chua NH (1985) Identification of DNA sequences required for activity of the cauliflower mosaic virus 35S promoter, Nature 313 810-2）、コメアクチン１遺伝子（Zhang W, McElroy D, Wu R. (1991) Analysis of rice Act1 5’ region activity in transgenic rice plants（Plant Cell 3 1155-65）、及びトウモロコシユビキチン１遺伝子（Cornejo MJ, Luth D, Blankenship KM, Anderson OD, Blechl AE. (1993). Activity of a maize ubiquitin promoter in transgenic rice. Plant Molec. Biol. 23 567-81）に関連するものが挙げられ、これらは参照により本明細書に組み込まれる。構成的プロモーターとしては、カーネーションエッチドリングウイルス（ＣＥＲＶ）プロモーターが挙げられる。カーネーションエッチドリングウイルスＤＮＡの配列：カリフラワーモザイクウイルス及びレトロウイルスとの比較（参照により本明細書に組み込まれる（Hull R, Sadler J, Longstaff M 1986 EMBO Journal, 5(2):3083-3090））。
構成的プロモーターは、カーネーションエッチドリングウイルス（ＣＥＲＶ）プロモーター、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ、cauliflower mosaic virus）３５Ｓプロモーター、イネアクチン１遺伝子又はトウモロコシユビキチン１遺伝子に由来するプロモーターから選択され得る。適切には、プロモーターは、ＣＥＲＶプロモーターであり得る。
或いは、一部の実施形態では、プロモーターは、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター）でなくてもよい。一実施形態では、プロモーターは、老化特異的プロモーターであり得る。「老化特異的プロモーター」（ＳＡＧ）は、老化関連遺伝子の発現を制御することに関連するプロモーターであり得る。したがって、プロモーターは、老化する組織において実質的に独占的にそれが機能可能に連結したコード配列（すなわち遺伝子）の発現を制限することができる。それゆえに、老化特異的プロモーターは、実質的に植物組織が老化を経るときだけ３’のタンパク質をコードする領域の発現が起こるような発生学的に調節される方式で、植物組織において遺伝子発現を優先的に促進することが可能なプロモーターであり得る。老化は、植物のより古い部分、例えば、より古い葉で起こり、植物のより若い部分、例えば、種子で起こらない傾向があることが認められよう。
多数の老化関連遺伝子を発現することが公知の植物の一例は、シロイヌナズナ（Arabidopsis）である。したがって、プロモーターは、シロイヌナズナにおける老化関連遺伝子から単離されてもよい。参照により本明細書に組み込まれるGepstein et al．（The Plant Journal, 2003, 36, 629-642）は、モデルとしてシロイヌナズナを使用したＳＡＧ及びそれらのプロモーターの詳細な研究を実行した。遺伝子コンストラクトは、この論文で開示されたＳＡＧのいずれかからのプロモーターを含んでいてもよい。例えば、適切なプロモーターは、ＳＡＧ１２、ＳＡＧ１３、ＳＡＧ１０１、ＳＡＧ２１及びＳＡＧ１８、並びにそれらの機能的バリアント及び機能的断片からなる群から選択されてもよい。
一実施形態では、プロモーターは、ＳＡＧ１２又はＳＡＧ１３プロモーターであり得る。一実施形態では、プロモーターは、熟練した専門家に公知であると予想されるＳＡＧ１２プロモーター、又はそれらの機能的バリアント若しくは機能的断片であってよい（参照により本明細書に組み込まれる、Gan & Amasino, 1997, Plant Physiology, 113: 313-319）。適切なプロモーター及びその配列は、国際公開第２０１０／０９７６２３号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）に見出すことができる。
別の実施形態では、プロモーターは、組織特異的プロモーターであり得る。組織特異的なプロモーターは、植物の一部分（又はわずかな部分）における遺伝子の発現を、通常はこれら植物部分の生涯を通して、指示するものである。組織特異的プロモーターのカテゴリーとしては、その特異性が絶対的ではないプロモーターも一般に含まれ、すなわち、これらプロモーターは、好ましい組織以外の組織で、より低いレベルでの発現も指示し得る。いくつかの組織特異的プロモーターが当技術分野で公知であり、その例としては、ジャガイモ塊茎で発現されるパタチン遺伝子、及びコムギ、オオムギ又はトウモロコシ胚乳で発現される高分子量グルテニン遺伝子に関連するものが挙げられる。これらのプロモーターのいずれも本発明で使用することができる。
適切には、組織特異的プロモーターは、葉特異的プロモーターであり得る。適切には、葉特異的プロモーターとしては、ＡＳＹＭＭＥＴＲＩＣ ＬＥＡＶＥＳ １（ＡＳ１）を挙げることができる。
特に好ましい実施形態では、組織特異的プロモーターは、根特異的プロモーターである。
別の実施形態では、プロモーターは、発生学的に調節されるプロモーターであり得る。発生学的に調節されるプロモーターは、植物の発生の間の特定の時点で植物の１又は２以上の部分における遺伝子の発現における変化を指示する。遺伝子は、その植物部分において、他の時点で、異なる（通常はより低い）レベルで発現し得、他の植物部分においても発現し得る。
一実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーターであり得る。誘導性プロモーターは、誘導因子に応答して遺伝子の発現を指示し得る。誘導因子が非存在であると、遺伝子は発現しない。誘導因子は、プロモーター配列に直接作用し得るか、又はリプレッサー分子の影響に反作用することによって作用し得る。誘導因子は、代謝産物、タンパク質、増殖調節因子、又は毒性要素などの化学物質、熱、傷、若しくは浸透圧などの生理学的なストレス、又は病原体若しくは害虫の作用の間接的な結果であり得る。発生学的に調節されるプロモーターは、植物によって産生される内因性誘導因子又は植物のライフサイクルの特定のポイントでの環境刺激に応答する特定のタイプの誘導性プロモーターとして記載され得る。公知の誘導性プロモーターの例としては、参照により本明細書に組み込まれる、Warner SA, Scott R, Draper J. (1993) (Isolation of an asparagus intracellular PR gene (AoPR1) wound-responsive promoter by the inverse polymerase chain reaction and its characterization in transgenic tobacco. Plant J. 3 191-201.)によって記載されるものなどの傷応答に関連するもの、参照により本明細書に組み込まれる、Benfey & Chua (1989) (Benfey, P.N., and Chua, N-H. (1989) Regulated genes in transgenic plants. Science 244 174-181)によって開示されるような温度応答に関連するもの、及び参照により本明細書に組み込まれる、Gatz (1995) (Gatz, C. (1995) Novel inducible/repressible gene expression systems. Methods in Cell Biol. 50 411-424)によって記載されるような化学的に誘発されるものが挙げられる。
したがって、一実施形態では、プロモーターは、ＣＥＲＶプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（完全又は短縮化）、ルビスコプロモーター、エンドウマメプラストシアニンプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、クロロフィルｒ／ｂ結合プロモーター、高分子量グルテニンプロモーター、α，β－グリアジンプロモーター、ホルデインプロモーター及びパタチンプロモーターからなる群から選択され得る。
一実施形態では、プロモーターは、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター、又は重複したエンハンサー領域又は２倍のエンハンサー領域を有する改変された３５Ｓプロモーターであり得る（参照により本明細書に組み込まれる、R. Kay et al. Science. 1987 Jun 5;236(4806):1299-302）。
一実施形態では、プロモーターは、ネイティブなプロモーターであり得る。
「ネイティブなプロモーター」は、本明細書で使用される場合、遺伝子にとって内因性である、すなわち天然に遺伝子に機能可能に連結されているプロモーターを指す。
組換えベクターはまた、クローニングプロセスにおいて選択可能マーカーとして使用することができる遺伝子をコードするＤＮＡ、すなわち、トランスフェクト又は形質転換された細胞の選択を可能にし、さらに、異種ＤＮＡを組み込んだベクターを内包する細胞の選択を可能にするための、遺伝子をコードするＤＮＡも含み得る。ベクターはまた、コード配列の発現を調節することに関与する、又は発現されたポリペプチドを、宿主細胞の特定の部分、例えば、葉緑体に標的化するためのＤＮＡも含み得る。したがって、ベクターは、選択可能マーカー遺伝子（例えば、抗生物質耐性遺伝子）；ポリペプチド終結シグナル；及びタンパク質標的配列（例えば、葉緑体輸送ペプチド）からなる群から選択される少なくとも１つの追加のエレメントを含んでいてもよい。
適切なマーカー遺伝子の例としては、抗生物質耐性遺伝子、例えば、カナマイシン、ゲネチシン（Ｇ４１８）及びハイグロマイシンへの耐性を付与するもの（ｎｐｔ－II、ｈｙｇ－Ｂ）；除草剤耐性遺伝子、例えば、ホスフィノトリシン及びスルホンアミドベースの除草剤への耐性を付与するもの（それぞれｂａｒ及びｓｕＩ；参照により本明細書に組み込まれる、欧州特許出願第２４２２４６号公報、欧州特許出願第０２４９６３７号公報）；並びにスクリーニング可能なマーカー、例えば、ベータ－グルクロニダーゼ（参照により本明細書に組み込まれる、ＧＢ２１９７６５３）、ルシフェラーゼ及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ，green fluorescent protein）が挙げられる。マーカー遺伝子は、細胞中での発現を可能にする第２のプロモーターによって制御することができ、このような細胞は、種子中であってもよいし又はそうでなくてもよく、それによって植物のあらゆる発育段階におけるマーカーを含有する細胞又は組織の選択を可能にする。適切な第２のプロモーターは、アグロバクテリウム属（Agrobacterium）のノパリンシンターゼ遺伝子のプロモーター、及び３５Ｓカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）転写物をコードする遺伝子由来のプロモーターである。しかし、他のあらゆる適切な第２のプロモーターを使用できる。
商業的に望ましい形質
一実施形態では、本発明の植物は、香りの特性及び／又は他の商業的に望ましい形質は少なくとも維持されながら、低減した総アルカロイド含有量、及び／又はニコチン、ノルニコチン、アナバシン、ミオスミン及びアナタビンから選択される１つ又は２つ以上のアルカロイドの低減した含有量、及び／又は低減したニコチンを有する。一実施形態では、本発明の植物は、本発明に従って改変されていない植物と同様の等級及び／又は品質の葉を産生する。
一実施形態では、本発明の植物は、香りの特性及び／又は他の商業的に望ましい形質は少なくとも維持されながら、低減した総アルカロイド含有量、及び／又はニコチン、ノルニコチン、アナバシン、ミオスミン及びアナタビンから選択される１つ又は２つ以上のアルカロイドの低減した含有量、及び／又は低減したニコチンを有する。一実施形態では、本発明の植物は、本発明に従って改変されていない植物と同様の等級及び／又は品質の葉を産生する。
一実施形態では、本発明の植物は、植物の香りの特性における大幅な変化を伴わず（例えば、本発明に従って改変されていない同じ植物と比較して）、低減したニコチン含有量を有する。
一実施形態では、本発明の植物は、植物の他の商業的に望ましい形質における大幅な変化（例えば、減少）なく（例えば、本発明に従って改変されていない同じ植物と比較して）、低減したニコチン含有量を有する。特に、改変された植物の収量は、好ましくは、本発明に従って改変されていない同じ植物と比較して低減されない。
それゆえに、一実施形態では、本発明の方法及び使用は、香りの特性及び／又は他の商業的に望ましい形質（例えば、収量）を維持しながら、総アルカロイド含有量を低減させること、及び／又はニコチン、ノルニコチン、アナバシン及びアナタビンから選択される１つ又は２つ以上のアルカロイドを低減させること、及び／又はニコチンを低減させることに関する。
「商業的に望ましい形質」という用語は、収量、成熟植物高、採取可能な葉の数、平均節長、カッター葉の長さ、カッター葉の幅、品質、非生物的（例えば、干ばつ）ストレス耐性、除草剤耐性及び／又は生物的（例えば、昆虫、細菌又は真菌）ストレス耐性などの形質を含む。
「商業的に望ましい形質」という用語は、本明細書で教示された通り、同様の圃場条件で生育された場合の比較できる植物の熱気送管乾燥した原種における前記形質と比較できる、干ばつ耐性、害虫耐性、成熟植物高、採取可能な葉の数、平均節長、カッター葉の長さ、カッター葉の幅、及び収量などの形質を含む。
特に指定されない限り、本明細書において使用される、タバコ収量は、標準の農業及び乾燥慣行に従い標準圃場条件下でのエーカーあたりの乾燥タバコ葉の重量に基づいて計算される乾燥葉収量を指す。
一態様では、本発明の植物（例えば、タバコ植物）は、同様の圃場条件で生育された比較できる植物の収量の５０％から１５０％の間、５５％から１４５％の間、６０％から１４０％の間、６５％から１３５％の間、７０％から１３０％の間、７５％から１２５％の間、８０％から１２０％の間、８５％から１１５％の間、９０％から１１０％の間、９５％から１０５％の間、５０％から１００％の間、５５％から１００％の間、６０％から１００％の間、６５％から１００％の間、７０％から１００％の間、７５％から１００％の間、８０％から１００％の間、８５％から１００％の間、９０％から１００％の間、９５％から１００％の間、１００％から１５０％の間、１０５％から１５０％の間、１１０％から１５０％の間、１１５％から１５０％の間、１２０％から１５０％の間、１２５％から１５０％の間、１３０％から１５０％の間、１３５％から１５０％の間、１４０％から１５０％の間又は１４５％から１５０％の間の収量を有する。
別の態様では、本発明の植物（例えば、タバコ植物）の収量は、同様の圃場条件で生育された比較できる植物の収量のおよそ１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９又は３．０倍である。
別の態様では、本発明のタバコ植物の収量は、同様の圃場条件で生育された場合の比較できる植物の収量に匹敵する。
別の態様では、本発明のタバコ植物の収量は、同様の圃場条件で生育された場合の熱気送管乾燥された比較できる植物の収量に匹敵する。
一態様では、本発明のタバコ植物は、約１２００から３５００の間、１３００から３４００の間、１４００から３３００の間、１５００から３２００の間、１６００から３１００の間、１７００から３０００の間、１８００から２９００の間、１９００から２８００の間、２０００から２７００の間、２１００から２６００の間、２２００から２５００の間及び２３００から２４００ポンド／エーカーの間からなる群から選択される収量を提供する。
別の態様では、本発明のタバコ植物は、約１２００から３５００の間、１３００から３５００の間、１４００から３５００の間、１５００から３５００の間、１６００から３５００の間、１７００から３５００の間、１８００から３５００の間、１９００から３５００の間、２０００から３５００の間、２１００から３５００の間、２２００から３５００の間、２３００から３５００の間、２４００から３５００の間、２５００から３５００の間、２６００から３５００の間、２７００から３５００の間、２８００から３５００の間、２９００から３５００の間、３０００から３５００の間及び３１００から３５００ポンド／エーカーの間からなる群から選択される収量を提供する。
さらなる態様において、本発明のタバコ植物は、約１２００から３５００の間、１２００から３４００の間、１２００から３３００の間、１２００から３２００の間、１２００から３１００の間、１２００から３０００の間、１２００から２９００の間、１２００から２８００の間、１２００から２７００の間、１２００から２６００の間、１２００から２５００の間、１２００から２４００の間、１２００から２３００の間、１２００から２２００の間、１２００から２１００の間、１２００から２０００の間、１２００から１９００の間、１２００から１８００の間、１２００から１７００の間、１２００から１６００の間、１２００から１５００の間及び１２００から１４００ポンド／エーカーの間からなる群から選択される収量を提供する。
タバコ植物
本発明は、植物（例えば、タバコ植物）を対象とした方法、使用、加えて、細胞（例えば、タバコ細胞）、植物（例えば、タバコ植物）及び植物増殖材料を提供する。
本発明は、植物（例えば、タバコ植物）を対象とした方法、使用、加えて、細胞（例えば、タバコ細胞）、植物（例えば、タバコ植物）及び植物増殖材料を提供する。
用語「タバコ」は、本明細書で使用される場合、送達システムの生産で使用されるタバコ属の植物を指す。適切な「タバコ」植物の非限定的な例としては、Ｎ．タバカム及びＮ．ルスティカ（N. rustica）（例えば、Ｎ．タバカムＬ．、ＬＡ Ｂ２１、ＬＮ ＫＹ１７１、Ｔｌ １４０６、Ｂａｓｍａ、Ｇａｌｐａｏ、Ｐｅｒｉｑｕｅ、Ｂｅｉｎｈａｒｔ１０００－１、及びＰｅｔｉｃｏ）が挙げられる。
一実施形態では、適切なタバコ植物は、あらゆるＮ．タバカムの生殖質、株又は変種であり得る。
別の実施形態では、適切なタバコ植物は、非タバカム種であり得る。
タバコ材料は、バーレー種、フルー（flue）又はブライト種、及びダーク種として一般に知られている、様々なニコチアナ・タバカムタイプに由来し得るか又はこれらから得ることができる。一部の実施形態では、タバコ材料は、バーレー、バージニア、又はダークタバコ植物に由来する。タバコ植物は、バーレータバコ、レア（rare）タバコ、スペシャリティータバコ、膨張型（expanded）タバコ、又はそれに類するものから選択され得る。
タバコ栽培品種及び優良タバコ栽培品種の使用もまた、本明細書において企図される。本明細書において使用するためのタバコ植物はしたがって、タバコ種又は優良タバコ栽培品種であり得る。特に有用なニコチアナ・タバカム種としては、黄色種バージニアタイプ、バーレータイプ、及びオリエンタルタイプが挙げられる。
一部の実施形態では、タバコ植物は、例えば、以下の種の１又は２以上から選択され得る：Ｌ．栽培品種Ｔ．Ｉ．１０６８、ＡＡ３７－１、Ｂ １３Ｐ、Ｘａｎｔｈｉ（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ－Ｍｏｒ）、ＫＴ Ｄ＃３ハイブリッド１０７、Ｂｅｌ－Ｗ３、７９－６１５、Ｓａｍｓｕｎ Ｈｏｌｍｅｓ ＮＮ、ＢＵ２１×Ｈｏｊａ Ｐａｒａｄｏの交配に由来するＦ４、系統９７、ＫＴＲＤＣ＃２ハイブリッド４９、ＫＴＲＤＣ＃４ハイブリッド１ １０、バーレー２１、ＰＭ０１６、ＫＴＲＤＣ＃５ ＫＹ １６０ ＳＩ、ＫＴＲＤＣ＃７ ＦＣＡ、ＫＴＲＤＣ＃６ ＴＮ ８６ ＳＩ、ＰＭ０２１、Ｋ １４９、Ｋ ３２６、Ｋ ３４６、Ｋ ３５８、Ｋ ３９４、Ｋ ３９９、Ｋ ７３０、ＫＹ １０、ＫＹ １４、ＫＹ １６０、ＫＹ １７、ＫＹ ８９５９、ＫＹ ９、ＫＹ ９０７、ＭＤ ６０９、ＭｃＮａｉｒ ３７３、ＮＣ ２０００、ＰＧ ０１、ＰＧ ０４、Ｐ０１、Ｐ０２、Ｐ０３、ＲＧ １１、ＲＧ １７、ＲＧ ８、Ｓｐｅｉｇｈｔ Ｇ－２８、ＴＮ ８６、ＴＮ ９０、ＶＡ ５０９、ＡＳ４４、Ｂａｎｋｅｔ Ａ１、Ｂａｓｍａ Ｄｒａｍａ Ｂ８４／３１、Ｂａｓｍａ Ｉ Ｚｉｃｈｎａ ＺＰ４／Ｂ、Ｂａｓｍａ Ｘａｎｔｈｉ ＢＸ ２Ａ、Ｂａｔｅｋ、Ｂｅｓｕｋｉ Ｊｅｍｂｅｒ、Ｃ１０４、Ｃｏｋｅｒ ３１９、Ｃｏｋｅｒ ３４７、Ｃｒｉｏｌｌｏ Ｍｉｓｉｏｎｅｒｏ、ＰＭ０９２、Ｄｅｌｃｒｅｓｔ、Ｄｊｅｂｅｌ ８１、ＤＶＨ ４０５、Ｇａｌｐａｏ Ｃｏｍｕｍ、ＨＢ０４Ｐ、Ｈｉｃｋｓ Ｂｒｏａｄｌｅａｆ、Ｋａｂａｋｕｌａｋ Ｅｌａｓｓｏｎａ、ＰＭ１０２、Ｋｕｔｓａｇｅ Ｅ１、ＫＹ １４×Ｌ８、ＫＹ １７１、ＬＡ ＢＵ ２１、ＭｃＮａｉｒ ９４４、ＮＣ ２３２６、ＮＣ ７１、ＮＣ ２９７、ＮＣ ３、ＰＶＨ ０３、ＰＶＨ ０９、ＰＶＨ １９、ＰＶＨ ２１ １０、Ｒｅｄ Ｒｕｓｓｉａｎ、Ｓａｍｓｕｎ、Ｓａｐｌａｋ、Ｓｉｍｍａｂａ、Ｔａｌｇａｒ ２８、ＰＭ１３２、Ｗｉｓｌｉｃａ、Ｙａｙａｌｄａｇ、ＮＣ ４、ＴＲ Ｍａｄｏｌｅ、Ｐｒｉｌｅｐ ＨＣ－７２、Ｐｒｉｌｅｐ Ｐ２３、Ｐｒｉｌｅｐ ＰＢ １５６／１、Ｐｒｉｌｅｐ Ｐ１２－２／１、Ｙａｋａ ＪＫ－４８、Ｙａｋａ ＪＢ １２５／３、ΤΙ－１０６８、ＫＤＨ－９６０、ＴＩ－１０７０、ＴＷ１３６、ＰＭ２０４、ＰＭ２０５、Ｂａｓｍａ、ＴＫＦ ４０２８、Ｌ８、ＴＫＦ ２００２、ＴＮ ９０、ＧＲ１４１、Ｂａｓｍａ ｘａｎｔｈｉ、ＧＲ１４９、ＧＲ１５３、及びＰｅｔｉｔ Ｈａｖａｎａ。
種又は栽培品種の非限定的な例は、以下の通りである：ＢＤ ６４、ＣＣ １０１、ＣＣ ２００、ＣＣ ２７、ＣＣ ３０１、ＣＣ ４００、ＣＣ ５００、ＣＣ ６００、ＣＣ ７００、ＣＣ ８００、ＣＣ ９００、Ｃｏｋｅｒ １７６、Ｃｏｋｅｒ ３１９、Ｃｏｋｅｒ ３７１ Ｇｏｌｄ、Ｃｏｋｅｒ ４８、ＣＤ ２６３、ＤＦ９１ １、ＤＴ ５３８ ＬＣ、Ｇａｌｐａｏタバコ、ＧＬ ２６Ｈ、ＧＬ ３５０、ＧＬ ６００、ＧＬ ７３７、ＧＬ ９３９、ＧＬ ９７３、ＨＢ ０４Ｐ、ＨＢ ０４Ｐ ＬＣ、ＨＢ３３０７ＰＬＣ、ハイブリッド ４０３ＬＣ、ハイブリッド ４０４ＬＣ、ハイブリッド ５０１ ＬＣ、Ｋ １４９、Ｋ ３２６、Ｋ ３４６、Ｋ ３５８、Ｋ３９４、Ｋ ３９９、Ｋ ７３０、ＫＤＨ ９５９、ＫＴ ２００、ＫＴ２０４ＬＣ、ＫＹ１０、ＫＹ１４、ＫＹ １６０、ＫＹ １７、ＫＹ １７１、ＫＹ ９０７、ＫＹ９０７ＬＣ、ＫＴＹ１４ｘＬ８ ＬＣ、Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｒｉｔｔｅｎｄｅｎ、ＭｃＮａｉｒ ３７３、ＭｃＮａｉｒ ９４４、ｍｓＫＹ １４ｘＬ８、Ｎａｒｒｏｗ Ｌｅａｆ Ｍａｄｏｌｅ、Ｎａｒｒｏｗ Ｌｅａｆ Ｍａｄｏｌｅ ＬＣ、ＮＢＨ ９８、Ｎ－１２６、Ｎ－７７７ＬＣ、Ｎ－７３７１ ＬＣ、ＮＣ １００、ＮＣ １０２、ＮＣ ２０００、ＮＣ ２９１、ＮＣ ２９７、ＮＣ ２９９、ＮＣ ３、ＮＣ ４、ＮＣ ５、ＮＣ ６、ＮＣ７、ＮＣ ６０６、ＮＣ ７１、ＮＣ ７２、ＮＣ ８１０、ＮＣ ＢＨ １２９、ＮＣ ２００２、Ｎｅａｌ Ｓｍｉｔｈ Ｍａｄｏｌｅ、ＯＸＦＯＲＤ ２０７、ＰＤ ７３０２ ＬＣ、ＰＤ ７３０９ ＬＣ、ＰＤ ７３１２ ＬＣ「Ｐｅｒｉｑ’ｅ」タバコ、ＰＶＨ０３、ＰＶＨ０９、ＰＶＨ１９、ＰＶＨ５０、ＰＶＨ５１、Ｒ ６１０、Ｒ ６３０、Ｒ ７－１ １、Ｒ ７－１２、ＲＧ １７、ＲＧ ８１、ＲＧ Ｈ５１、ＲＧＨ ４、ＲＧＨ ５１、ＲＳ １４１０、Ｓｐｅｉｇｈｔ １６８、Ｓｐｅｉｇｈｔ １７２、Ｓｐｅｉｇｈｔ １７９、Ｓｐｅｉｇｈｔ ２１０、Ｓｐｅｉｇｈｔ ２２０、Ｓｐｅｉｇｈｔ ２２５、Ｓｐｅｉｇｈｔ ２２７、Ｓｐｅｉｇｈｔ ２３４、Ｓｐｅｉｇｈｔ Ｇ－２８、Ｓｐｅｉｇｈｔ Ｇ－７０、Ｓｐｅｉｇｈｔ Ｈ－６、Ｓｐｅｉｇｈｔ Ｈ２０、Ｓｐｅｉｇｈｔ ＮＦ３、Ｔｌ １４０６、Ｔｌ １２６９、ＴＮ ８６、ＴＮ８６ＬＣ、ＴＮ ９０、ＴＮ ９７、ＴＮ９７ＬＣ、ＴＮ Ｄ９４、ＴＮ Ｄ９５０、ＴＲ（Ｔｏｍ Ｒｏｓｓｏｎ）Ｍａｄｏｌｅ、ＶＡ ３０９、ＶＡ３５９、ＡＡ ３７－１、Ｂ １３Ｐ、Ｘａｎｔｈｉ（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ－Ｍｏｒ）、Ｂｅｌ－Ｗ３、７９－６１５、Ｓａｍｓｕｎ Ｈｏｌｍｅｓ ＮＮ、ＫＴＲＤＣ ｎｕｍｂｅｒ ２ハイブリッド４９、バーレー ２１、ＫＹ ８９５９、ＫＹ ９、ＭＤ ６０９、ＰＧ ０１、ＰＧ ０４、Ｐ０１、Ｐ０２、Ｐ０３、ＲＧ １ １、ＲＧ ８、ＶＡ ５０９、ＡＳ４４、Ｂａｎｋｅｔ Ａ１、Ｂａｓｍａ Ｄｒａｍａ Ｂ８４／３１、Ｂａｓｍａ Ｉ Ｚｉｃｈｎａ ＺＰ４／Ｂ、Ｂａｓｍａ Ｘａｎｔｈｉ ＢＸ ２Ａ、Ｂａｔｅｋ、Ｂｅｓｕｋｉ Ｊｅｍｂｅｒ、Ｃ１０４、Ｃｏｋｅｒ ３４７、Ｃｒｉｏｌｌｏ Ｍｉｓｉｏｎｅｒｏ、Ｄｅｌｃｒｅｓｔ、Ｄｊｅｂｅｌ ８１、ＤＶＨ ４０５、Ｇａｌｐａｏ Ｃｏｍｕｍ、ＨＢ０４Ｐ、Ｈｉｃｋｓ Ｂｒｏａｄｌｅａｆ、Ｋａｂａｋｕｌａｋ Ｅｌａｓｓｏｎａ、Ｋｕｔｓａｇｅ Ｅ１、ＬＡ ＢＵ ２１、ＮＣ ２３２６、ＮＣ ２９７、ＰＶＨ ２１ １０、Ｒｅｄ Ｒｕｓｓｉａｎ、Ｓａｍｓｕｎ、Ｓａｐｌａｋ、Ｓｉｍｍａｂａ、Ｔａｌｇａｒ ２８、Ｗｉｓｌｉｃａ、Ｙａｙａｌｄａｇ、Ｐｒｉｌｅｐ ＨＣ－７２、Ｐｒｉｌｅｐ Ｐ２３、Ｐｒｉｌｅｐ ＰＢ １５６／１、Ｐｒｉｌｅｐ Ｐ１２－２／１、Ｙａｋａ ＪＫ－４８、Ｙａｋａ ＪＢ １２５／３、ＴＩ－１０６８、ＫＤＨ－９６０、Ｔｌ－１０７０、ＴＷ１３６、Ｂａｓｍａ、ＴＫＦ ４０２８、Ｌ８、ＴＫＦ ２００２、ＧＲ１４１、Ｂａｓｍａ ｘａｎｔｈｉ、ＧＲ１４９、ＧＲ１５３、Ｐｅｔｉｔ Ｈａｖａｎａ。上記のものの、変換の少ない亜種もまた、本明細書において具体的に同定されていなくても、企図される。
植物は、本明細書で開示されるいずれかの変種を交雑することによって生成されたハイブリッドであり得る。
タバコ植物は、バーレー、黄色種バージニア、又はオリエンタルであり得る。
一実施形態では、植物増殖材料は、本発明の植物（例えばタバコ植物）から得ることができる。本明細書において使用される「植物増殖材料」は、さらなる植物がそこから生成され得る植物から得られる、任意の植物体を指す。適切には、植物増殖材料は種子であり得る。適切には、植物増殖材料は花粉であり得る。
一実施形態では、本発明の細胞（例えば、タバコ細胞）、植物（例えば、タバコ植物）若しくはその一部及び／又は植物増殖材料は、Ｎｉｃ３遺伝子（又はＮｉｃ３遺伝子並びにＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくはＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子）の調節された活性又は発現を含んでいてもよい。別の実施形態では、細胞（例えば、タバコ細胞）、植物（例えば、タバコ植物）及び／又は植物増殖材料は、本発明によるコンストラクト又はベクターを含んでいてもよい。別の実施形態では、細胞（例えば、タバコ細胞）、植物（例えば、タバコ植物）及び／又は植物増殖材料は、本発明による方法によって得ることができる（例えば、得られた）。
適切には、本発明による植物（例えば、タバコ植物）又はその一部は、Ｎｉｃ３遺伝子（又はＮｉｃ３遺伝子並びにＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくはＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子）の活性又は発現を調節するために改変されていない植物（例えば、タバコ植物）又はその一部と比較した場合に、Ｎｉｃ３ ＥＲＦ遺伝子（又はＮｉｃ３遺伝子並びにＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくはＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子）の調節された活性又は発現を含んでいてもよい。
一実施形態では、本発明に従った植物（例えば、タバコ植物）又はその一部は、本発明の細胞（例えば、タバコ細胞）を含む。別の実施形態では、植物増殖材料は、本発明の植物（例えば、タバコ植物）から得ることができる（例えば、得られた）。
一実施形態では、前述の実施形態で製品（例えば、送達システム）の生産のために提供されるような細胞（例えば、タバコ細胞）の使用を提供する。加えて、植物（例えば、タバコ植物）を繁殖させるための本明細書に記載される植物（例えば、タバコ植物）の使用を提供する。
本発明はまた、別の実施形態では、製品（例えば、送達システム）の生産のための前述の実施形態の植物（例えば、タバコ植物）の使用も提供する。別の実施形態では、穀物を成長させるための本発明の植物（例えば、タバコ植物）の使用を提供する。一実施形態では、本発明によるＮｉｃ３遺伝子（又はＮｉｃ３遺伝子並びにＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくはＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子）の使用は、植物（例えば、タバコ植物）のアルカロイド含有量の調節をもたらす。
一実施形態では、本発明によるＮｉｃ３遺伝子（又はＮｉｃ３遺伝子並びにＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくはＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子）の方法又は使用は、アルカロイド含有量の調節をもたらすことができる。別の実施形態では、Ｎｉｃ３遺伝子（又はＮｉｃ３遺伝子並びにＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくはＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子）（例えば、それらの低下した活性又は発現）の使用は、１つ又は２つ以上のアルカロイドの含有量における減少をもたらすことができる。適切には、アナタビン、アナバシン、ミオスミン、ノルニコチン又はニコチンの１つ又は２つ以上の含有量を低減できる。適切には、ニコチン含有量が低減される。適切には、これは、Ｎｉｃ３遺伝子の活性又は発現（又はＮｉｃ３遺伝子並びにＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくはＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子の活性）が野生型植物と比較して低下する場合、観察することができる。
別の実施形態では、Ｎｉｃ３遺伝子（又はＮｉｃ３遺伝子並びにＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくはＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子）（例えば、それらの増大した活性又は発現）の方法又は使用は、１つ又は２つ以上のアルカロイドの含有量における増加をもたらすことができる。適切には、アナタビン、アナバシン、ノルニコチン又はニコチンの１つ又は２つ以上の含有量が増加され得る。適切には、ニコチン含有量が低減される。
一実施形態では、植物（例えば、タバコ植物）又はその一部、例えば、葉、又は採取された葉若しくは採取された加工された葉、又は細胞若しくは製品（例えば、送達システム）は、本発明の改変された（例えば、変異した又は欠失した）Ｎｉｃ３遺伝子（又は改変された（例えば、変異した又は欠失した）Ｎｉｃ３遺伝子と、本発明に従って改変された（例えば、変異した又は欠失した）Ｎｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくは改変された（例えば、変異した又は欠失した）Ｎｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子との組合せ）を含む。
一実施形態では、本発明は、タバコ細胞培養物（例えば、インビトロでの培養物の形態で）を提供する。タバコ細胞培養物は、タバコ細胞懸濁培養物であり得る。これらのインビトロで培養されたタバコ細胞は、例えば、従来のタバコの小片、シュレッド、ファインカット又はロングカットのタバコ薄片の代替物として、添加剤成分として、又は代替物と添加剤の両方として、送達システムに組み込むことができる。
一実施形態では、送達システムの生産のための、本発明による、タバコ細胞培養物、例えば、採取された及び／若しくは加工されたタバコ細胞培養物、又はそれからの抽出物の使用を提供する。
インビトロ培養物から採取されたタバコ細胞は、例えば粉末を生成するために、乾燥、例えば凍結乾燥させることができる。
当業者には、タバコ細胞のインビトロ培養物を確立するための公知の方法が認識されよう。ほんの一例として、以下の方法が使用され得る：所望のタバコ植物から種子を回収し、これら種子の外側を滅菌して望ましくない生物を排除すること、前記種子を植え付けて、所望のタバコ植物を成長させること、タバコ植物から（例えばタバコの茎から）組織を取り出して、外植片として使用すること、タバコ外植片からカルス培養物を確立すること、カルス培養物から細胞懸濁液培養物を確立すること、及び培養材料（例えばタバコ細胞を含む）を採取して、タバコ細胞培養物を生成すること。
タバコ細胞は、濾過、例えば真空濾過を含む、様々な方法によって採取することができる。試料は、水を添加することによってフィルター中で洗浄され得、残っている液体は、濾過、例えば真空濾過によって除去される。
採取されたタバコ細胞培養物は、さらに処理することができ、例えば乾燥、例えば空気乾燥及び／又は凍結乾燥することができる。採取されたタバコ細胞培養物若しくは乾燥され採取されたタバコ細胞培養物又はこれらの抽出物は、本発明に従った送達システムに組み込むことができる。
一実施形態では、本発明は、分子農業において使用するためのタバコ植物又はその一部分を提供する。適切には、本発明に従って改変された植物又はその一部分は、治療物質などのタンパク質、例えば、抗生物質、ウイルス様粒子、ニュートラシューティカルズ、又は低分子の製造において使用することができる。
一実施形態では、本発明は、タンパク質（例えば、治療用タンパク質）を産生するための方法であって、本明細書に記載される、少なくとも１つのＮｉｃ３ ＥＲＦ遺伝子；又は少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子、並びに少なくとも１つのＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくは少なくとも１つのＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現を調節することによって、前記タンパク質（例えば、治療用タンパク質）を産生することが可能な植物又はその一部を改変するステップ、並びに前記タンパク質（例えば、治療用タンパク質）の産生を可能にするのに十分な条件下で植物を培養するステップを含む方法を提供する。
一態様では、本発明は、低いニコチン形質をタバコ変種に遺伝子移入する方法であって、
ａ）低ニコチン形質を含む第１のタバコ変種を、低ニコチン形質を有さない第２のタバコ変種と交雑して、１つ又は２つ以上の後代タバコ植物を産生するステップ；
ｂ）低ニコチン形質と連鎖する多型マーカーに関して１つ又は２つ以上の後代タバコ植物を遺伝子型解析するステップであって、多型マーカーが、Ｎｉｃ３遺伝子座の２０ｃＭ以内、１０ｃＭ以内、５ｃＭ以内、４ｃＭ以内、３ｃＭ以内、２ｃＭ以内、１ｃＭ以内、０．５ｃＭ以内又は０．５ｃＭ未満以内である、ステップ；及び
ｃ）低ニコチン形質を含む後代タバコ植物を選択するステップ
を含む方法を提供する。
ａ）低ニコチン形質を含む第１のタバコ変種を、低ニコチン形質を有さない第２のタバコ変種と交雑して、１つ又は２つ以上の後代タバコ植物を産生するステップ；
ｂ）低ニコチン形質と連鎖する多型マーカーに関して１つ又は２つ以上の後代タバコ植物を遺伝子型解析するステップであって、多型マーカーが、Ｎｉｃ３遺伝子座の２０ｃＭ以内、１０ｃＭ以内、５ｃＭ以内、４ｃＭ以内、３ｃＭ以内、２ｃＭ以内、１ｃＭ以内、０．５ｃＭ以内又は０．５ｃＭ未満以内である、ステップ；及び
ｃ）低ニコチン形質を含む後代タバコ植物を選択するステップ
を含む方法を提供する。
一態様では、この方法は、Ｎｉｃ１遺伝子座に関連するか又は密接に連鎖する１つ又は２つ以上の分子マーカー、及び／又はＮｉｃ２遺伝子座に関連するか又は密接に連鎖する１つ又は２つ以上の分子マーカーに関して同時に又は並行して選択することを含んでいてもよい。
製品
本発明はまた、本発明によるタバコから得ることができる又は得られた製品も提供する。Ｎｉｃ３遺伝子の活性又は発現（又はＮｉｃ３遺伝子並びにＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくはＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現）が調節されており、調節されたアルカロイド含有量（例えば、低減したニコチン含有量）を含むタバコ植物から得ることができる又は得られた製品が提供される。
本発明はまた、本発明によるタバコから得ることができる又は得られた製品も提供する。Ｎｉｃ３遺伝子の活性又は発現（又はＮｉｃ３遺伝子並びにＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくはＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現）が調節されており、調節されたアルカロイド含有量（例えば、低減したニコチン含有量）を含むタバコ植物から得ることができる又は得られた製品が提供される。
一態様では、本発明は、本発明によるタバコ植物若しくはその一部又は植物細胞；
本発明によるタバコ植物増殖材料から増殖させたタバコ植物若しくはその一部；本発明による植物の採取された葉；本発明による加工された葉；或いは本発明による方法によって生成された植物
を含む送達システムを含む。
本発明によるタバコ植物増殖材料から増殖させたタバコ植物若しくはその一部；本発明による植物の採取された葉；本発明による加工された葉；或いは本発明による方法によって生成された植物
を含む送達システムを含む。
本明細書において使用される場合、用語「送達システム」は、少なくとも１つの物質をユーザーに送達するシステムを包含するものであり、これとしては、
紙巻タバコ、シガリロ、葉巻タバコ、及びパイプ用又は手巻き紙巻タバコ用又は手作り紙巻タバコ用のタバコなどの、可燃性エアロゾル供給システム（タバコ、タバコ派生物、膨張型タバコ、再構成タバコ、タバコ代替物、又は他の喫煙可能材料に基づくかにかかわらず）、
電子紙巻タバコ、タバコ加熱製品、及びエアロゾル生成材料の組合せを使用してエアロゾルを生成させるためのハイブリッドシステムなどの、エアロゾル生成材料を燃焼させることなくエアロゾル生成材料から化合物を放出する非可燃性エアロゾル供給システム、並びに
限定はしないが、薬用キャンディー剤、ガム、パッチ、吸入可能な粉末を含む用品、及びスヌース又はモイストスナッフを含む経口タバコなどの経口製品を含む、エアロゾルを形成することなく、ニコチンを含んでいてもいなくてもよい少なくとも１つの物質をユーザーに経口的に、経鼻的に、経皮的に、又は別の方法で送達する、エアロゾルフリーの送達システム
が含まれる。
紙巻タバコ、シガリロ、葉巻タバコ、及びパイプ用又は手巻き紙巻タバコ用又は手作り紙巻タバコ用のタバコなどの、可燃性エアロゾル供給システム（タバコ、タバコ派生物、膨張型タバコ、再構成タバコ、タバコ代替物、又は他の喫煙可能材料に基づくかにかかわらず）、
電子紙巻タバコ、タバコ加熱製品、及びエアロゾル生成材料の組合せを使用してエアロゾルを生成させるためのハイブリッドシステムなどの、エアロゾル生成材料を燃焼させることなくエアロゾル生成材料から化合物を放出する非可燃性エアロゾル供給システム、並びに
限定はしないが、薬用キャンディー剤、ガム、パッチ、吸入可能な粉末を含む用品、及びスヌース又はモイストスナッフを含む経口タバコなどの経口製品を含む、エアロゾルを形成することなく、ニコチンを含んでいてもいなくてもよい少なくとも１つの物質をユーザーに経口的に、経鼻的に、経皮的に、又は別の方法で送達する、エアロゾルフリーの送達システム
が含まれる。
本開示に従うと、「可燃性」エアロゾル供給システムは、ユーザーへの少なくとも１つの物質の送達を促進するために、使用の際にエアロゾル供給システムの構成要素であるエアロゾル生成材料（又はその構成成分）が燃焼する又は燃えるシステムである。
一部の実施形態では、送達システムは、紙巻タバコ、シガリロ、及び葉巻タバコからなる群から選択されるシステムなどの、可燃性エアロゾル供給システムである。
一部の実施形態では、本開示は、フィルター、フィルターロッド、フィルターセグメント、タバコロッド、付け木、エアロゾル変性剤放出部品、例えばカプセル、糸、若しくはビーズ、又は紙、例えば、プラグラップ、チップペーパー、若しくは紙巻タバコ用の紙などの、可燃性エアロゾル供給システムで使用するための部品に関する。
本開示に従うと、「非可燃性」エアロゾル供給システムは、ユーザーへの少なくとも１つの物質の送達を促進するために、エアロゾル供給システムの構成要素であるエアロゾル生成材料（又はその構成成分）が燃焼も燃えもしないシステムである。
一部の実施形態では、送達システムは、動力付きの非可燃性エアロゾル供給システムなどの、非可燃性エアロゾル供給システムである。
一部の実施形態では、非可燃性エアロゾル供給システムは、ベイピングデバイス又は電子ニコチン送達システム（ＥＮＤ、electronic nicotine delivery system）としても知られている電子紙巻タバコであるが、エアロゾル生成材料中のニコチンの存在は必須ではないことに留意されたい。
一部の実施形態では、非可燃性エアロゾル供給システムは、加熱式システムとしても知られているエアロゾル生成材料加熱システムである。このようなシステムの例は、タバコ加熱システムである。
一部の実施形態では、非可燃性エアロゾル供給システムは、その１又は複数が加熱され得るエアロゾル生成材料の組合せを使用する、エアロゾルを生成させるためのハイブリッドシステムである。エアロゾル生成材料の各々は、例えば固体、液体、又はゲルの形態であり得、ニコチンを含有していてもしていなくてもよい。一部の実施形態では、ハイブリッドシステムは、液体又はゲル状のエアロゾル生成材料及び固体のエアロゾル生成材料を含む。固体のエアロゾル生成材料は、例えばタバコ製品又は非タバコ製品を含み得る。
典型的には、非可燃性エアロゾル供給システムは、非可燃性エアロゾル供給デバイス、及び非可燃性エアロゾル供給デバイスと共に使用するための消耗品を含み得る。
一部の実施形態では、本開示は、エアロゾル生成材料を含み、非可燃性エアロゾル供給デバイスと共に使用するように構成された、消耗品に関する。これらの消耗品は、本開示の全体を通して、用品と呼ばれることもある。
一部の実施形態では、非可燃性エアロゾル供給システム、例えば、その非可燃性エアロゾル供給デバイスは、動力源及びコントローラーを含み得る。動力源は、例えば電力源又は発熱動力源であり得る。一部の実施形態では、発熱動力源は、エネルギーを受けて熱形態の動力を発熱動力源の近傍にあるエアロゾル生成材料又は伝熱材料に分配し得る、炭素基質を含む。
一部の実施形態では、非可燃性エアロゾル供給システムは、消耗品を入れるための区域、エアロゾル生成器、エアロゾル生成区域、格納箱、マウスピース、フィルター、及び／又はエアロゾル変性剤を含み得る。
一部の実施形態では、非可燃性エアロゾル供給デバイスと共に使用するための消耗品は、エアロゾル生成材料、エアロゾル生成材料保存区域、エアロゾル生成材料移送部品、エアロゾル生成器、エアロゾル生成区域、格納箱、上包み、フィルター、マウスピース，及び／又はエアロゾル変性剤を含み得る。
適切には、送達システムは、本発明に従ったタバコ植物又はその一部分から調製することができる（例えば、これを含み得る）。
適切には、送達システムは、本発明に従ったタバコ細胞培養物から調製することができる。
適切には、送達システムは、本発明に従ったタバコ植物増殖材料から増殖させたタバコ植物又はその一部分からから調製することができる（例えば、これを含み得る）。
適切には、送達システムは、本発明に従ったタバコ植物の採取された葉から調製することができる（例えば、これを含み得る）。
適切には、送達システムは、本発明に従った処理済のタバコ葉から調製することができる（例えば、これを含み得る）。
適切には、送達システムは、本発明に従った乾燥タバコ材料から調製することができる（例えば、これを含み得る）。
適切には、送達システムは、本発明に従ったタバコブレンドから調製することができる（例えば、これを含み得る）。
一実施形態では、送達システムは、紙巻タバコ、シガリロ、及び葉巻タバコからなる群から選択される可燃性喫煙用品である。
一実施形態では、送達システムは、フィルター、フィルターロッド、フィルターロッドセグメント、タバコ、タバコロッド、タバコロッドセグメント、付け木、添加物放出部品、例えばカプセル、糸、ビーズ、紙、例えば、プラグラップ、チップペーパー、又は紙巻タバコ用の紙などの、可燃性喫煙用品の１又は２以上の部品を含む。
一実施形態では、送達システムは、非可燃性エアロゾル供給システムである。
一実施形態では、送達システムは、ヒーター及びエアロゾル化可能な基質などの、非可燃性エアロゾル供給システムの１又は２以上の部品を含む。
一実施形態では、エアロゾル供給システムは、ベイピングデバイスとしても知られている電子紙巻タバコである。
一実施形態では、電子紙巻タバコは、ヒーター、動力をヒーターに供給し得る動力供給源、液体又はゲルなどのエアロゾル化可能な基質、格納箱を含み、マウスピースを含んでいてもよい。
一実施形態では、エアロゾル化可能な基質は、基質容器に入っている。一実施形態では、基質容器は、ヒーターと組み合わされているか又はヒーターを含む。
一実施形態では、送達システムは、基質材料を燃やすことなく加熱することによって１又は２以上の化合物を放出する、加熱製品である。基質材料は、例えば、ニコチンを含有していてもしていなくてもよいタバコ又は他の非送達システムであり得る、エアロゾル化可能な材料である。一実施形態では、加熱製品は、タバコ加熱製品である。
一実施形態では、加熱製品は電子デバイスである。
一実施形態では、タバコ加熱製品は、ヒーター、動力をヒーターに供給し得る動力供給源、固体又はゲル状の材料などのエアロゾル化可能な基質を含む。
一実施形態では、加熱製品は非電子用品である。
一実施形態では、加熱製品は、固体又はゲル状の材料などのエアロゾル化可能な基質、及び、木炭などの燃焼材料を例えば燃やすことによって、いかなる電子的手段も用いずに熱エネルギーをエアロゾル化可能な基質に供給し得る熱源を含む。
一実施形態では、加熱製品はまた、エアロゾル化可能な基質を加熱することによって生じるエアロゾルを濾過し得るフィルターも含む。
一部の実施形態では、エアロゾル化可能な基質材料は、ベイパー若しくはエアロゾル生成剤、又はグリセロール、プロピレングリコール、トリアセチン、若しくはジエチレングリコールなどの保湿剤を含み得る。
一実施形態では、送達システムは、基質材料の組合せを燃やすことなく加熱することによってエアロゾルを生成させるためのハイブリッドシステムである。基質材料は、例えば、ニコチンを含有していてもしていなくてもよい固体、液体、又はゲルを含み得る。一実施形態では、ハイブリッドシステムは、液体又はゲル状の基質及び固体基質を含む。固体基質は、例えば、ニコチンを含有していてもしていなくてもよいタバコ又は他の非送達システムであり得る。一実施形態では、ハイブリッドシステムは、液体又はゲル状の基質及びタバコを含む。
別の実施形態では、製品は、植物（例えば、タバコ植物）で発現されたら、少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子の活性又は発現を調節し、それによってアルカロイド含有量（例えば、ニコチン含有量）を減少させる本発明のコンストラクトを含んでいてもよい。
別の実施形態では、製品は、Ｎｉｃ３遺伝子の活性又は発現（又はＮｉｃ３遺伝子の活性又は発現並びにＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現及び／若しくはＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現）を調節する１つ又は２つ以上の本発明のコンストラクトを含んでいてもよく、前記製品は、調節されたアルカロイド含有量（例えば、低減したニコチン含有量）を有する。
一実施形態では、葉（例えば、タバコ葉）を産生するための本発明の植物（例えば、タバコ植物）の使用を提供する。適切には、葉（例えば、タバコ葉）は、加工などの下流の用途に供されてもよい。したがって、一実施形態では、前述の実施形態の使用は、加工された葉（例えば、加工されたタバコ葉）を提供し得る。適切には、タバコ葉は、乾燥させること、発酵させること、低温殺菌すること又はそれらの組合せに供されてもよい。
別の実施形態では、葉（例えば、タバコ葉）は、切断されていてもよい。一部の実施形態では、葉（例えば、タバコ葉）は、乾燥させること、発酵させること、低温殺菌すること又はそれらの組合せに供される前又は後に切断されていてもよい。
一実施形態では、本発明は、本発明の植物（例えば、タバコ植物）の採取された葉を提供する。一実施形態では、採取された葉は、調節されたＮｉｃ３遺伝子の活性又は発現（又は調節されたＮｉｃ３並びにＮｉｃ１ ＥＲＦ及び／若しくはＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子の活性又は発現）を有する植物（例えば、タバコ植物）から得ることができる。適切には、採取された葉は、調節されたアルカロイド含有量を有する。さらなる実施形態では、採取された葉は、本発明の増殖材料から増殖させた植物（例えば、タバコ植物）から得ることができる（例えば、得られた）。別の実施形態では、本発明の方法又は使用から得ることができる採取された葉が提供される。適切には、採取された葉は、切断され採取された葉であってもよい。一部の実施形態では、採取された葉は、生存細胞（例えば、生存しているタバコ細胞）を含んでいてもよい。一部の実施形態では、採取された葉は、生存細胞（例えば、生存しているタバコ細胞）を含まない。他の実施形態では、採取された葉は、さらなる加工に供されてもよい。
一部のタバコ植物は、茎を切断すること、及び同時に葉の全てを採取することによって採取することができる（例えば、バーレータバコと同様に）。他のタバコ植物（例えば、熱気送管乾燥されたタバコ）は、プロセス中のプライミングなどの段階で採取してもよく、この場合、個々の葉は、それらが熟成したときに茎から除去される。
「プライミング」は、本明細書で使用される場合、タバコ植物からの葉の除去を指す。これは、熱気送管乾燥された植物の成熟した、又は熟成した葉の除去を指す場合もある。
加工された葉（例えば、加工されたタバコ葉）も提供される。加工された葉（例えば、加工されたタバコ葉）は、本発明の植物（例えば、タバコ植物）から得ることができる。適切には、加工された葉は、本発明の方法及び／又は使用のいずれかに従って得られた植物から得ることができる。一実施形態では、加工された葉（例えば、加工されたタバコ葉）は、好ましくはコントロールの葉と比較した場合に、すなわち本発明に従って改変されていない植物（例えば、タバコ植物）からの葉と比較して、調節されたＮｉｃ３遺伝子の活性又は発現（又はＮｉｃ３並びにＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくはＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現）及び調節されたアルカロイド含有量を有する植物（例えば、タバコ植物）から得ることができる。加工された葉（例えば、加工されたタバコ葉）は、Ｎｉｃ３遺伝子の活性又は発現（又はＮｉｃ３並びにＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくはＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現）及び調節されたアルカロイド含有量における調節を含んでいてもよい。
別の実施形態では、加工された葉（例えば、加工されたタバコ葉）は、本発明による植物（例えば、タバコ植物）増殖材料から増殖させた植物（例えば、タバコ植物）から得ることができる。本発明の加工された葉（例えば、加工されたタバコ葉）は、本発明の採取された葉を加工することによって得ることができる。
用語「加工された葉」は、本明細書で使用される場合、当技術分野において葉が供される１つ又は２つ以上の加工ステップを受けた葉を指す。「加工された葉」は、生存細胞を含まないか又は実質的に含まない。
本明細書において使用される用語「処理済のタバコ葉」は、当技術分野においてタバコが受ける１又は２以上の処理ステップを受けているタバコ葉を指す。「処理済のタバコ葉」は、生存細胞を含まないか又は実質的に含まない。
用語「生存細胞」は、増殖することができる及び／又は代謝的に活性な細胞を指す。したがって、細胞が生存していないと言われる場合、「非生存」とも呼ばれるが、細胞は生存細胞の特徴を示さない。
用語「生存細胞が実質的にない」は、全細胞の約５％未満が生存していることを意味する。好ましくは、全細胞の約３％未満、さらに好ましくは約１％未満、またさらに好ましくは約０．１％未満が生存している。
一実施形態では、処理済のタバコ葉は、乾燥、発酵、及び／又は低温殺菌の１又は２以上によって処理され得る。適切には、加工されたタバコ葉は、乾燥させることによって加工されてもよい。タバコ葉は、当技術分野で公知のあらゆる方法によって乾燥することができる。一実施形態では、タバコ葉は、空気乾燥、火炎乾燥、熱気送管乾燥及び日光乾燥からなる群から選択される乾燥方法の１つ又は２つ以上によって乾燥することができる。適切には、タバコ葉は、空気乾燥されていてもよい。適切には、タバコ葉は、熱気送管乾燥されていてもよい。
典型的には、空気乾燥は、良く通気された納屋にタバコ葉を吊るし、乾燥させることによって行われる。これは通常、４～８週間の期間にわたり行われる。空気乾燥は、バーレータバコに特に適している。
適切には、タバコ葉は、火力乾燥され得る。火力乾燥は、タバコ葉を大きな納屋に吊るし、ここで堅木を連続的な又は断続的な弱い燻煙で燃やし続けることによって典型的には行われ、通常は、処理及びタバコに応じて、３日間～１０週間かかる。
別の実施形態では、タバコ葉は、熱気送管乾燥され得る。熱気送管乾燥は、タバコ葉をタバコスティックに巻き付けること、及びこれを乾燥用納屋内の階段状のポールから吊るすことを含み得る。納屋は通常、外部で燃料を供給される火室から続いている、送気管を有する。典型的には、これによって、煙に曝露させることなく熱乾燥タバコが得られる。通常、温度は乾燥の過程でゆっくりと上昇し、処理全体はおよそ１週間かかる。
適切には、タバコ葉は、日光乾燥され得る。この方法は、典型的には、被覆されていないタバコを日光に曝露させることを伴う。
適切には、処理済のタバコ葉は、発酵によって処理され得る。発酵は、当技術分野において公知の任意の様式で行うことができる。典型的には、発酵の間、タバコ葉は積み重ねられて、水分を保持するために例えばバーラップで被覆されている、乾燥タバコの山（バルク）にされる。葉の内部の残留水分とタバコの重量との組合せによって自然熱が生じ、これがタバコを円熟させる。バルクの中心の温度を、１日に１回モニタリングする。一部の方法においては、毎週、バルク全体を開く。次いで葉を取り出して振とうし、湿らせ、そしてバルクを回転させて、バルクの内側の葉と外側の葉を入れ替え、底の葉を上部にもってくる。これによって、バルク全体での均等な発酵が確実に行われる。葉の上のさらなる水分と、葉自体の実際の回転とによって熱が生じ、タバコの天然アンモニアが放出され、ニコチンが低減し、その一方でまた、色が濃くなり、タバコの香りが向上する。典型的には、発酵処理は、タバコの種、葉における葉柄の位置、厚さ、及び葉の目的の使用に応じて、最長６カ月間継続する。
適切には、加工されたタバコ葉は、低温殺菌によって加工されてもよい。低温殺菌は、無煙の送達システム、最も好ましくはスヌースを作製するためにタバコ葉を使用する場合に、特に好ましい場合がある。タバコ葉の低温殺菌は、当技術分野で公知のあらゆる方法によって行うことができる。例えば、低温殺菌は、その教示が参照により本明細書に組み込まれる、J Foulds, L Ramstrom, M Burke, K Fagerstrom. Effect of smokeless tobacco (snus) on smoking and public health in Sweden. Tobacco Control (2003) 12: 349-359において詳述されるように行うことができる。
スヌースの生成の際に、低温殺菌は、タバコを蒸気で２４～３６時間熱処理する（およそ１００℃の温度に達する）処理によって典型的には行われる。これによって、ほとんど無菌の製品が得られ、理論に拘束されることは望まないが、この結果の１つは、さらなるＴＳＮＡ形成を制限するものであると考えられる。
一実施形態では、低温殺菌は、蒸気低温殺菌であり得る。
一部の実施形態では、処理済のタバコ葉は切断され得る。処理済のタバコ葉は、処理の前又は後に切断され得る。適切には、処理済のタバコ葉は、処理の後に切断され得る。
一部の実施形態では、タバコ植物、タバコ植物の採取された葉、及び／又は処理済のタバコ葉は、ニコチンを抽出するために使用することができる。ニコチンの抽出は、当技術分野において公知のあらゆる方法を使用して行うことができる。例えば、タバコからニコチンを抽出するための方法は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第２，１６２，７３８号明細書で教示される。
一態様では、本発明は、本発明によるタバコ植物又はその一部から作製される乾燥タバコ材料を提供する。
別の態様では、本発明は、本発明によるタバコ植物又はその一部から作製されるタバコ材料を含むタバコブレンドを提供する。一態様において、本発明は、本発明に従った乾燥タバコ材料を含むタバコブレンドを提供する。
適切には、本発明に従ったタバコブレンドは、およそ１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％の、本発明に従ったタバコ植物若しくはその一部分又は本発明に従ったタバコ細胞培養物に由来するタバコを含み得る。適切には、タバコブレンドは、およそ１０％の、本発明に従ったタバコ植物又はその一部に由来するタバコを含んでいてもよい。適切には、タバコブレンドは、およそ２０％の、本発明に従ったタバコ植物又はその一部に由来するタバコを含んでいてもよい。適切には、タバコブレンドは、およそ３０％の、本発明に従ったタバコ植物又はその一部に由来するタバコを含んでいてもよい。適切には、タバコブレンドは、およそ４０％の、本発明に従ったタバコ植物又はその一部に由来するタバコを含んでいてもよい。適切には、タバコブレンドは、およそ５０％の、本発明に従ったタバコ植物又はその一部に由来するタバコを含んでいてもよい。適切には、タバコブレンドは、およそ６０％の、本発明に従ったタバコ植物又はその一部に由来するタバコを含んでいてもよい。適切には、タバコブレンドは、およそ７０％の、本発明に従ったタバコ植物又はその一部に由来するタバコを含んでいてもよい。適切には、タバコブレンドは、およそ８０％の、本発明に従ったタバコ植物又はその一部に由来するタバコを含んでいてもよい。適切には、タバコブレンドは、およそ９０％の、本発明に従ったタバコ植物又はその一部に由来するタバコを含んでいてもよい。
一態様では、本発明のタバコブレンド製品は、少なくとも約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は９５乾燥重量パーセントの、本発明によるタバコ植物又はその一部から乾燥したタバコを含む。
適切には、乾燥タバコ材料は、空気乾燥され得る。適切には、乾燥タバコ材料は、熱気送管乾燥され得る。適切には、乾燥タバコ材料は、日光乾燥され得る。
本発明による送達システム又は喫煙物品は、本発明によるタバコ材料（例えば、乾燥タバコ材料）を含んでいてもよい。
別の態様において、本発明は、送達システムを提供する。適切には、送達システムは、ブレンドされた送達システムであり得る。一実施形態では、送達システムは、本発明のタバコ植物又はその一部から調製してもよい。一実施形態では、送達システムは、調節されたＮｉｃ３遺伝子の活性若しくは発現又はＮｉｃ３遺伝子並びにＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／又はＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現を有するタバコ植物から調製してもよい。送達システムは、Ｎｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子の活性における低下又は発現及び低減したアルカロイド含有量を含んでいてもよい。適切には、タバコ植物又はその一部は、本発明によるタバコ植物増殖材料から増殖させることができる。
用語「その一部」は、本明細書で使用される場合、植物（例えば、タバコ植物）の文脈において、植物（例えば、タバコ植物）の部分を指す。好ましくは、「その一部」は、植物（例えば、タバコ植物）の葉である。
別の実施形態では、送達システムは、本発明の採取された葉から調製してもよい。さらなる実施形態では、送達システムは、本発明の加工されたタバコ葉から調製してもよい。適切には、送達システムは、乾燥させること、発酵させること及び／又は低温殺菌することの１つ又は２つ以上によって加工されたタバコ葉から調製してもよい。適切には、送達システムは、前述の実施形態の通りに加工されていてもよい切断されたタバコ葉を含んでいてもよい。
一実施形態では、送達システムは、喫煙用品であり得る。本明細書において使用される場合、用語「喫煙用品」としては、タバコ、タバコ派生物、膨張型タバコ、再構成タバコ、又はタバコ代替物に基づくかにかかわらず、巻きタバコ、紙巻タバコ、葉巻、及びシガリロなどの喫煙可能製品が含まれ得る。
別の実施形態では、送達システムは、無煙送達システムであり得る。本明細書において使用される用語「無煙送達システム」は、煙を出さない及び／又は燃焼されないようにした送達システムを指す。一実施形態では、無煙送達システムとしては、スヌース、スナッフ、噛みタバコ、又はそれに類するものが含まれ得る。
さらなる実施形態では、送達システムは、タバコ加熱デバイス又はハイブリッドデバイス又は電子紙巻タバコ又はそれに類するものであり得る。典型的には、加熱デバイス又はハイブリッドデバイスにおいて、エアロゾルは、熱源から、熱源の中、周り、又は下流に位置し得る物理的に離れたエアロゾル形成基質又は材料への熱の伝導によって生じる。喫煙の間、熱源からの熱伝導によって揮発性化合物がエアロゾル形成基質から放出され、喫煙用品を介して吸い込まれた空気と共に運ばれる。放出された化合物が冷却されるにつれ、これら化合物は凝縮してエアロゾルを形成し、これがユーザーによって吸入される。
タバコ加熱デバイスを消費又は喫煙するためのエアロゾル生成用品及びデバイスは、当技術分野において公知である。これらとしては、例えば、電気的に加熱されるエアロゾル生成デバイスが含まれ得、この場合、エアロゾル生成デバイスの１又は２以上の電気的加熱体からタバコ加熱デバイスのエアロゾル形成基質への熱の伝導によって、エアロゾルが生成される。
適切には、タバコ加熱デバイスは、エアロゾル生成デバイスであり得る。
好ましくは、タバコ加熱デバイスは、加熱式デバイスであり得る。加熱式デバイスは当技術分野において公知であり、タバコを燃やすことなく加熱することによって化合物を放出する。適切な加熱式デバイスの例は、参照によって本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１３／０３４４５９号パンフレット又は英国特許第２５１５５０２号明細書において教示されているものであり得る。
一実施形態では、タバコ加熱デバイスのエアロゾル形成基質は、本発明に従った送達システムであり得る。
一実施形態では、タバコ加熱デバイスは、ハイブリッドデバイスであり得る。
分子農業
本発明は、植物若しくはその一部又は植物細胞（例えば、タバコ及び他のタバコ属の種）が、タンパク質、ペプチド、及び代謝産物の生成のために、例えば、治療薬及び医薬品、例えば、抗生物質、ウイルス様粒子、又は栄養補助食品又は小分子の生成のために使用される植物分子農業の分野において特に有用であり得る。
本発明は、植物若しくはその一部又は植物細胞（例えば、タバコ及び他のタバコ属の種）が、タンパク質、ペプチド、及び代謝産物の生成のために、例えば、治療薬及び医薬品、例えば、抗生物質、ウイルス様粒子、又は栄養補助食品又は小分子の生成のために使用される植物分子農業の分野において特に有用であり得る。
「分子農業」は、本明細書で使用される場合、植物、若しくはその一部又は植物細胞における、組換えタンパク質及び／又は他の二次代謝産物の産生に関する。
適切には、分子農業（又はバイオファーミング（biopharming））は、組換えタンパク質をコードする核酸配列を導入することによって植物若しくはその一部又は植物細胞を改変すること、及び前記組換えタンパク質の発現を可能にする条件下で核酸配列を含む前記植物若しくはその一部又は植物細胞を培養することを含んでいてもよい。適切には、本方法は、植物若しくはその一部又は植物細胞からの組換えタンパク質の抽出、及び任意にその精製をさらに含んでいてもよい。適切には、分子農業（又はバイオファーミング）は、組換えタンパク質をコードする核酸配列を導入することによって植物若しくはその一部又は植物細胞を改変すること、前記組換えタンパク質の発現を可能にする条件下で核酸配列を含む前記植物若しくはその一部又は植物細胞を培養すること、並びに植物若しくはその一部又は植物細胞から組換えタンパク質を抽出及び精製することを含んでいてもよい。
適切には、分子農業（又はバイオファーミング）は、二次代謝産物の発現を可能にする条件下で植物若しくはその一部又は植物細胞を培養することを含んでいてもよい。適切には、本方法は、植物若しくはその一部又は植物細胞からの二次代謝産物の抽出、及び任意にその精製をさらに含んでいてもよい。適切には、分子農業（又はバイオファーミング）は、二次代謝産物の発現を可能にする条件下で植物若しくはその一部又は植物細胞を培養すること、並びに植物若しくはその一部又は植物細胞から組換えタンパク質を抽出及び精製することを含んでいてもよい。
植物若しくはその一部又は植物細胞から組換えタンパク質及び／又は二次代謝産物を抽出及び精製するための方法は当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第９２２０２９５号明細書；米国特許第９２８９０１１号明細書；米国特許第９１７５０５２号明細書及び米国特許出願第２０１６／００２９６６３号明細書である。
したがって、本発明による植物若しくはその一部又は植物細胞は、分子農業のために使用できる。本発明による植物若しくはその一部又は植物細胞は、植物若しくはその一部又は植物細胞におけるニコチン及び／又は他のニコチン性アルカロイドの存在を低減又は排除するために使用できる。本発明による植物若しくはその一部又は植物細胞は、植物若しくはその一部又は植物細胞から抽出及び／又は精製された産物におけるニコチン及び／又は他のニコチン性アルカロイドの存在を低減又は排除するために使用できる。
有利には、分子農業における低ニコチン植物又は台木（rootsock）の使用は、植物若しくはその一部又は植物細胞からの産物の精製に関連する下流の加工コストを低減するであろう。タバコ植物は、その大規模で低コストの産生の可能性に起因して組換えタンパク質の産生のための魅力的なバイオリアクターである。
分子農業における使用に適切な植物若しくはその一部又は植物細胞としては、これらに限定されないが、タバコ属の種が挙げられる。適切には、分子農業における使用のための植物若しくはその一部又は植物細胞は、ニコチアナ・ベンサミアナ（Nicotiana benthamiana）であり得る。適切には、分子農業における使用のための植物若しくはその一部又は植物細胞は、ニコチアナ・タバカムであり得る。
一態様では、分子農業における使用のためのタバコ植物を提供する。例えば、本発明によるタバコ植物は、組換えタンパク質の産生のために使用できる。タバコ植物において産生され得る組換えタンパク質としては、例えば、ワクチン産生のための抗原、抗体、酵素、ワクチン、増殖因子が挙げられる。
モノクローナル抗体及びその断片、例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）及び免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）、ＩｇＡ及びＩｇＧに類似した分子（shimmer molecule）、ＩｇＧ及びＩｇＡによって分泌された分子、単鎖可変断片、断片抗原結合、並びに重鎖及び軽鎖の可変などは、本発明による植物若しくはその一部又は植物細胞を使用する分子農業によって産生することができる。
医薬タンパク質は、本発明による植物若しくはその一部又は植物細胞を使用する分子農業によって産生することができ、例えば、植物で発現された医薬タンパク質としては、エリスロポイエチン、インターフェロン、ヒルジン、アプロチニン、Ｌｅｕ－エンケファリン、ヒト成長ホルモンのソマトトロピンが挙げられる。
非医薬タンパク質は、本発明による植物若しくはその一部又は植物細胞を使用する分子農業（molecular faming）によって産生することができ、例えば植物由来の非医薬タンパク質としては、アビジン、トリプシン、アプロチニン、β－グルコセレブロシダーゼ、ペルオキシダーゼ及びセルロースが挙げられる。
適切には、本発明による分子農業における使用のための植物若しくはその一部又は植物細胞は、乾燥重量に基づき、約０．０１％、０．０２％、０．０５％、０．０．７５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、１．１％、１．２％、１．３％、１，４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２．０％、２．１％、２．２％、２．３％、２，４％、２，５％、２．６％、２，７％、２．８％、２．９％、３％、４％又は５％の平均アルカロイドレベル又は平均ニコチンレベルを含み得る。適切には、本発明による分子農業における使用のための植物若しくはその一部又は植物細胞は、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．９％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、０．１％未満、０．０７５％未満、０．０５％未満、０．０２％未満又は０．０１％未満の平均アルカロイドレベル又は平均ニコチンレベルを含み得る。
適切には、本発明による分子農業は、乾燥重量に基づき、約０．０１％、０．０２％、０．０５％、０．０．７５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、１．１％、１．２％、１．３％、１，４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２．０％、２．１％、２．２％、２．３％、２，４％、２，５％、２．６％、２，７％、２．８％、２．９％、３％、４％又は５％の平均アルカロイドレベル又は平均ニコチンレベルを含む産物、抽出物又は精製した産物（例えば、組換えタンパク質）を産生することができる。適切には、本発明による分子農業は、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．９％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、０．１％未満、０．０７５％未満、０．０５％未満、０．０２％未満又は０．０１％未満の平均アルカロイドレベル又は平均ニコチンレベルを含む産物、抽出物又は精製した産物（例えば組換えタンパク質）を産生することができる。
ポリヌクレオチド／ポリペプチド／コンストラクト
本発明の特定の実施形態では、少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子（又は少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子並びに少なくとも１つのＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくは少なくとも１つのＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子）の活性又は発現を調節するコンストラクトが、適切にはプロモーターの指示下で植物細胞に形質転換されてもよい。
本発明の特定の実施形態では、少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子（又は少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子並びに少なくとも１つのＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくは少なくとも１つのＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子）の活性又は発現を調節するコンストラクトが、適切にはプロモーターの指示下で植物細胞に形質転換されてもよい。
本発明の特定の実施形態では、Ｎｉｃ３遺伝子（又はＮｉｃ３遺伝子並びにＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくはＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子）の活性又は発現を低下させる（すなわち阻害する）コンストラクトが、プロモーターの指示下で植物細胞に形質転換されてもよい。遺伝子コンストラクトは、遺伝子編集コンストラクトであり得るか、又は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ、small interfering RNA）分子若しくは短鎖ヘアピンループ（ｓｈＲＮＡ）分子を含み得るＲＮＡｉ分子を含み得る。
本発明の特定の実施形態では、Ｎｉｃ３遺伝子（又はＮｉｃ３遺伝子並びにＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくはＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子）の活性又は発現を増大させるコンストラクト、例えば、等価な内因性遺伝子をコードするコンストラクトが、プロモーターの指示下で植物細胞に形質転換されてもよい。
コンストラクトは、適切なベクター、例えば、植物形質転換ベクターによって本発明による植物に導入されてもよい。植物形質転換ベクターは、５’から３’の転写方向で、プロモーター配列、Ｎｉｃ３遺伝子を標的化する（又はＮｉｃ３遺伝子並びにＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくはＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子を標的化する）コンストラクト配列を含み、ＲＮＡポリメラーゼのための終止シグナル及びポリアデニラーゼのためのポリアデニル化シグナルを含む３’非翻訳ターミネーター配列を含んでいてもよい発現カセットを含んでいてもよい。プロモーター配列は、１又は２以上のコピー内に存在し得、このようなコピーは、上記のようなプロモーター配列と同一であるか又はそのバリアントであり得る。ターミネーター配列は、植物、細菌、又はウイルスの遺伝子から得ることができる。適切なターミネーター配列は、例えば、エンドウｒｂｃＳ Ｅ９ターミネーター配列、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のノパリン合成酵素遺伝子に由来するｎｏｓターミネーター配列、及びカリフラワーモザイクウイルスに由来する３５Ｓターミネーター配列である。当業者には、他の適切なターミネーター配列が容易に認識されよう。
本発明のコンストラクトはまた、プロモーターの強度を増大させるための遺伝子発現増強メカニズムを含み得る。このようなエンハンサーエレメントの例は、参照によって本明細書に組み込まれる、国際特許出願の国際公開第９７／２００５６号パンフレットの主題である、エンドウプラストシアニン遺伝子のプロモーターの一部に由来するものである。適切なエンハンサーエレメントは、例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのノパリン合成酵素遺伝子に由来するｎｏｓエンハンサーエレメント、及びカリフラワーモザイクウイルスに由来する３５Ｓエンハンサーエレメントであり得る。
これらの調節領域は、プロモーターＤＮＡ配列と同一の遺伝子に由来し得るか、或いは、ニコチアナ・タバカム又は他の生物、例えばナス科植物若しくはヤコウカ亜科（Cestroideae）由来の、異なる遺伝子に由来し得る。全ての調節領域は、形質転換対象の組織の細胞において操作可能であるべきである。
プロモーターＤＮＡ配列は、所望の遺伝子、例えば、プロモーターが指示しようとしている遺伝子、例えば、本発明のＮｉｃ３遺伝子をコードする遺伝子、本発明において使用されるコード配列と同一の遺伝子に由来し得るか、或いは、ニコチアナ・タバカム又は別の生物、例えばナス科植物若しくはヤコウカ亜科由来の、異なる遺伝子に由来し得る。
発現カセットは、ｐＢＩＮ １９ Ｐｌｕｓ、ｐＢＩ １０１、ｐＫＹＬＸ７１：３５Ｓ２、ｐＣＡＭＢＩＡ２３００などの基本的な植物形質転換ベクター、又は当技術分野において公知の他の適切な植物形質転換ベクターに組み込むことができる。このような配列が形質転換処理に必要であるため、植物形質転換ベクターは、発現カセットに加えて、このような配列を含有することになる。これら配列としては、アグロバクテリウムｖｉｒ遺伝子、１又は２以上のＴ－ＤＮＡ境界配列、及び選択可能マーカー、又はトランスジェニック植物細胞を同定する他の手段が含まれ得る。
用語「植物形質転換ベクター」は、インビボ又はインビトロでの発現が可能なコンストラクトを意味する。好ましくは、発現ベクターは、生物のゲノムに組み込まれている。用語「組み込まれる」は、好ましくは、ゲノム内への安定な組込みを網羅する。
植物を形質転換するための技術は当技術分野において周知であり、これとしては、例えばアグロバクテリウム媒介性の形質転換が含まれる。遺伝子改変された植物のコンストラクションにおける基本的な原理は、植物ゲノムに遺伝情報を挿入して、挿入された遺伝物質の安定な維持を得ることである。一般的な技術の概要は、参照によって本明細書に組み込まれる、Potrykus（Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205-225）及びChriston（AgroFood-Industry Hi-Tech March/April1994 17-27）による記事において見ることができる。
典型的には、アグロバクテリウム媒介性の形質転換において、所望の外来ＤＮＡ、すなわちＮｉｃ３コンストラクトを有するバイナリーベクターが、アグロバクテリウムと標的植物由来の外植片とを共培養することによって、適切なアグロバクテリウム株から標的植物に移入される。形質転換植物の組織は次いで、選択可能マーカー及び植物成長ホルモンを含んでいる選択培地で再生される。代替方法は、インタクトな植物の花芽を、キメラ遺伝子を含有するアグロバクテリウム株の懸濁液と接触させ、そして、種ができた後、形質転換された個体を発芽させ、選択培地での成長によって同定する、フローラルディップ法（参照によって本明細書に組み込まれる、Clough & Bent, 1998 Plant J. 1998 Dec;16(6):735-43）である。アグロバクテリウムによる植物組織の直接感染は広く利用されている単純な技術であり、これは、参照によって本明細書に組み込まれる、Butcher D. N. et al. (1980), Tissue Culture Methods for Plant Pathologists, eds.: D. S. Ingrams and J.P. Helgeson, 203-208において記載されている。
さらなる適切な形質転換方法としては、例えば、ポリエチレングリコール又はエレクトロポレーション技術、パーティクルガン、マイクロインジェクション、及び炭化ケイ素ファイバーの使用を使用する、プロトプラストへの直接的な遺伝子移入が含まれる。炭化ケイ素ウィスカー技術などのバリスティック形質転換を使用する植物の形質転換は、参照により本明細書に組み込まれる、Frame B R, Drayton P R, Bagnaall S V, Lewnau C J, Bullock W P, Wilson H M, Dunwell J M, Thompson J A & Wang K (1994)で教示されている。炭化ケイ素ウィスカー媒介性の形質転換による繁殖力のあるトランスジェニックトウモロコシ植物の生成が、参照により本明細書に組み込まれる、The Plant Journal 6: 941-948で教示されており、ウイルス形質転換技術が、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Meyer P, Heidmann I & Niedenhof I (1992)で教示されている。植物のためのベクターシステムとしてのキャッサバモザイクウイルスの使用が、参照により本明細書に組み込まれる、Gene 110: 213-217で教示されている。植物の形質転換についてのさらなる教示は、参照によって本明細書に組み込まれる、欧州特許出願公開第０４４９３７５号公報で見ることができる。
さらなる態様において、本発明は、コンストラクトを有し、植物などの生物、適切にはタバコ植物のゲノムにこれを導入する、ベクターシステムに関する。ベクターシステムは１つのベクターを含み得るが、２つのベクターを含んでいてもよい。２つのベクターのケースでは、ベクターシステムは、バイナリーベクターシステムと通常呼ばれる。バイナリーベクターシステムは、参照によって本明細書に組み込まれる、Gynheung Anetal, (1980) Binary Vectors, Plant Molecular Biology Manual A3, 1-19において、より詳細に記載されている。
１つの広く利用されている植物細胞形質転換システムは、参照によって本明細書に組み込まれる、An et al., (1986), Plant Physiol. 81, 301-305、及びButcher D. N. et al., (1980), Tissue Culture Methods for Plant Pathologists, eds.: D. S. Ingrams and J.P. Helgeson, 203-208によって記載されている、アグロバクテリウム・ツメファシエンス由来のＴｉプラスミド又はアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）由来のＲｉプラスミドを使用する。植物における本発明に従った所望の外因性遺伝子の各導入方法の後に、さらなるＤＮＡ配列の存在及び／又は挿入が必要であり得る。植物細胞の形質転換のためのＴ－ＤＮＡの使用は集中的に研究されており、参照によって本明細書に組み込まれる、欧州特許出願公開第１２０５１６号公報、Hoekema, in: The Binary Plant Vector System Offset-drukkerij Kanters B. B., Amsterdam, 1985, Chapter V、Fraley et al., Crit. Rev. Plant Sci., 4:1-46、及びAnetal. EMBO J (1985) 4: 277-284において記載されている。
Ｎｉｃ３遺伝子（又はＮｉｃ３遺伝子並びにＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくはＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子）の活性又は発現を調節するコンストラクトを形質転換された植物細胞は、周知の組織培養方法に従って、例えば、例えばアミノ酸、植物ホルモン、ビタミンなどの必須の増殖因子を添加した適切な培養培地において細胞を培養することによって、増殖させ、維持することができる。
本発明に関連する用語「トランスジェニック植物」は、本発明によるＮｉｃ３遺伝子の（又はＮｉｃ３遺伝子並びにＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくはＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子の組合せの）活性又は発現を調節するコンストラクトを含むあらゆる植物を含む。したがって、トランスジェニック植物は、本発明によるコンストラクトで形質転換された植物である。好ましくは、トランスジェニック植物は、本発明による、調節されたＮｉｃ３遺伝子の活性又は発現（又はＮｉｃ３遺伝子並びにＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくはＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現）及び調節されたアルカロイド含有量を呈する。用語「トランスジェニック植物」は、その天然の環境にある、すなわち、そのネイティブなプロモーター（これも同様にその天然の環境にある）の制御下にある、ネイティブなヌクレオチドコード配列は意味しない。
一態様において、本発明に従ったＮｉｃ３遺伝子、Ｎｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子、Ｎｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子、コンストラクト、植物形質転換ベクター、又は植物細胞は、単離された形態である。用語「単離された」は、配列が、当該配列が天然の状態において天然において付随している、及び天然で見られる、少なくとも１つの他の構成成分を、少なくとも実質的に有さないことを意味する。
一態様において、本発明に従ったＮｉｃ３遺伝子、Ｎｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子、Ｎｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子、コンストラクト、植物形質転換ベクター、又は植物細胞は、精製された形態である。用語「精製された」は、比較的純粋な状態、例えば、少なくとも約９０％の純度、又は少なくとも約９５％の純度、又は少なくとも約９８％の純度であることを意味する。
本明細書において使用される用語「ヌクレオチド配列」は、オリゴヌクレオチド配列又はポリヌクレオチド配列、並びにこれらのバリアント、ホモログ、断片、及び誘導体（その部分など）を指す。ヌクレオチド配列は、ゲノム由来又は合成由来又は組換え由来のものであり得、これらは、二本鎖、又はセンス鎖若しくはアンチセンス鎖のいずれかに相当する一本鎖であり得る。
本発明に関連する用語「ヌクレオチド配列」としては、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、及びＲＮＡが含まれる。好ましくは、ヌクレオチド配列は、本発明をコードするＤＮＡ配列、さらに好ましくはｃＤＮＡ配列を意味する。
好ましい実施形態では、本発明の範囲に関する場合、及びそれ自体が本発明の範囲に包含される場合のヌクレオチド配列、すなわち、Ｎｉｃ３遺伝子、Ｎｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子又はＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子としては、その天然の環境にある、及びその天然において付随している配列（これも同様にその天然の環境にある）に連結している、ネイティブなヌクレオチド配列が含まれる。参照を容易にするために、本発明者らは、この好ましい実施形態を「ネイティブなヌクレオチド配列」と呼ぶ。この点に関して、用語「ネイティブなヌクレオチド配列」は、そのネイティブな環境にあり、及びそれが天然において付随しているプロモーター（当該プロモーターも同様にそのネイティブな環境にある）全体に機能可能に連結している、ヌクレオチド配列全体を意味する。
本明細書において定義されるＮｉｃ３遺伝子、Ｎｉｃ１ ＥＲＦ又はＮｉｃ２ ＥＲＦとしての特異的特性を有するタンパク質又は改変に適したタンパク質のいずれかをコードするヌクレオチド配列は、前記タンパク質を産生する任意の細胞又は生物から同定及び／又は単離及び／又は精製することができる。ヌクレオチド配列を同定及び／又は単離及び／又は精製するための様々な方法が、当技術分野において周知である。例として、適切な配列が同定及び／又は単離及び／又は精製されると、２以上の配列を調製するためのＰＣＲ増幅技術を使用することができる。
またさらなる代替において、Ｎｉｃ３遺伝子又はＮｉｃ１ ＥＲＦ又はＮｉｃ２ ＥＲＦをコードするヌクレオチド配列は、確立された標準的な方法、例えば、参照によって本明細書に組み込まれる、Beucage S. L. et al., (1981) Tetrahedron Letters 22, p 1859-1869によって記載されているホスホロアミダイト法、又は参照によって本明細書に組み込まれる、Matthes et al., (1984) EMBO J. 3, p 801-805によって記載されている方法によって、合成的に調製することができる。ホスホロアミダイト法において、オリゴヌクレオチドは、例えば自動ＤＮＡ合成機において合成され、精製され、アニーリングされ、ライゲーションされ、そして適切なベクターにクローニングされる。
本明細書において使用される場合、用語「アミノ酸配列」は、用語「ポリペプチド」及び／又は用語「タンパク質」と同義である。一部の場合において、用語「アミノ酸配列」は、用語「ペプチド」と同義である。一部の場合において、用語「アミノ酸配列」は、用語「酵素」と同義である。
本発明はまた、本明細書において定義される具体的な特性を有するポリペプチドのアミノ酸配列又は任意のヌクレオチド配列、すなわち、そのようなポリペプチドをコードするＮｉｃ３遺伝子、Ｎｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子、Ｎｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子と、ある程度の配列同一性又は配列相同性を有する配列（以下、「相同配列」と呼ぶ）の使用も包含する。ここで、用語「ホモログ」は、対象アミノ酸配列及び対象ヌクレオチド配列とある程度の相同性を有する実体を意味する。ここで、用語「相同性」は、「同一性」と同等とみなすことができる。
相同なアミノ酸配列及び／又はヌクレオチド配列及び／又は断片は、Ｎｉｃ３又はＮｉｃ１ ＥＲＦ又はＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子の機能的活性を保持する及び／又は活性を増強させるポリペプチドを提供及び／又はコードするべきである。典型的には、相同配列は、例えば対象アミノ酸配列と同一の活性部位などを含むか、又は同一の活性部位をコードする。相同性は類似性（すなわち、類似の化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）の点で考慮され得るが、本発明の文脈において、相同性を配列同一性の点で表すことが好ましい。相同配列は、典型的には、機能的なドメイン又はモチーフを保持する。
一実施形態では、相同配列は、対象配列と比較して１、２、又は複数の付加、欠失、及び／又は置換を有するアミノ酸配列又はヌクレオチド配列を含むものである。
相同性又は同一性の比較は、肉眼によって、又はより一般的には、入手が容易な配列比較プログラムを利用して行うことができる。これらの市販されているコンピュータプログラムは、２又は３以上の配列の間の相同性％を計算することができる。相同性％又は同一性％は、連続する配列にわたって計算され得、すなわち、一方の配列が他方の配列とアラインされ、一方の配列における各アミノ酸が、一度に１残基ずつ、他方の配列における対応するアミノ酸と直接比較される。これは、「アンギャップ（ungapped）」アラインメントと呼ばれる。典型的には、このようなアンギャップアラインメントは、比較的少ない数の残基にわたってのみ行われる。
これは非常に単純で一貫性のある方法であるが、この方法は、例えば、その他の点では同一の配列対において、１つの挿入又は欠失がその後のアミノ酸残基で生じてアラインメントに狂いが生じることを考慮することができず、したがって、全アラインメントが行われた場合に相同性％を大きく低減させる可能性がある。その結果として、ほとんどの配列比較方法は、考えられる挿入及び欠失を、全相同性スコアに不当なペナルティーを与えることなく考慮する、最適なアラインメントをもたらすように設計されている。これは、配列アラインメントに「ギャップ」を挿入して局所的相同性を最大にするようにすることによって達成される。
しかし、これらのより複雑な方法は、「ギャップペナルティー」を、アラインメントにおいて生じる各ギャップに割り当て、こうして、同一のアミノ酸が同数の場合では、できる限り少ないギャップを有する（これは、２つの比較される配列の間の関連性がより高いことを反映する）配列アラインメントが、多くのギャップを有するものよりも高いスコアを達成する。比較的高いコストをギャップの存在に対して課し、より小さなペナルティーをギャップ内のそれぞれの次の残基に課す、「アフィンギャップコスト」が、典型的には使用される。これは、最も一般的に使用されるギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティーは当然、よりギャップが少ない最適化アラインメントを生じさせる。ほとんどのアラインメントプログラムでは、ギャップペナルティーを修正することができる。しかし、このようなソフトウェアを配列比較に使用する場合には、デフォルトの値を使用することが好ましい。
最大相同性％の計算は、したがって、ギャップペナルティーを考慮した最適なアラインメントの提供をまず必要とする。このようなアラインメントを行うための適切なコンピュータプログラムは、Vector NTI（Invitrogen Corp.社）である。配列比較を行うことができるソフトウェアの例としては、限定はしないが、例えば、BLASTパッケージ（Ausubel et al. (1999) Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed - Chapter 18を参照されたい）、BLAST2（FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50、FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8、及びtatiana@ncbi.nlm.nih.govを参照されたい）、FASTA（Altschul et al. 1990 J. Mol. Biol. 403-410）、及びAlignXが挙げられる。少なくともBLAST、BLAST2、及びFASTAは、オフライン及びオンライン検索で利用可能である（Ausubel et al. 1999、pages 7-58 to 7-60を参照されたい）。
最終相同性％を同一性の点で測定することができるが、アラインメント処理自体は典型的には、全か無かの対比較に基づくものではない。逆に、化学的類似性又は進化距離に基づいてスコアを各ペアワイズ比較に割り当てる、スケーリングされた類似性スコアマトリクスが、一般に使用される。一般的に使用されるこのようなマトリクスの例は、BLASTプログラム一式のデフォルトマトリクスである、BLOSUM62マトリクスである。Vector NTIプログラムは通常、公開されているデフォルト値、又は提供される場合には特注のシンボル比較テーブル（さらなる詳細については、ユーザーマニュアルを参照されたい）のいずれかを使用する。一部の適用では、Vector NTIパッケージのデフォルト値を使用することが好ましい。
或いは、相同性パーセンテージを、CLUSTAL（Higgins DG & Sharp PM (1988), Gene 73(1), 237-244）に類似のアルゴリズムに基づいて、Vector NTI（Invitrogen Corp.社）における複数のアラインメント特徴を使用して計算することができる。ソフトウェアによって最適なアラインメントがもたらされれば、相同性％、好ましくは配列同一性％を計算することが可能である。ソフトウェアは、典型的には、配列比較の一部としてこれを行い、数値的結果を生成する。
配列同一性の決定の際にギャップペナルティーが使用される場合には、好ましくは、以下のパラメータがペアワイズアラインメントに使用される。
一実施形態では、CLUSTALは、上記に定義したギャップペナルティー及びギャップ伸長のセットと共に使用することができる。一部の実施形態では、BLAST又はCLUSTALアラインメントに使用されるギャップペナルティーは、上記で詳述したものと異なり得る。当業者には、BLAST及びCLUSTALアラインメントを行うための標準的なパラメータが定期的に変化し得ること、並びに、その時に、BLAST又はCLUSTALアラインメントアルゴリズムのための詳細な標準的パラメータに基づいて適切なパラメータを選択することが可能であることが理解されよう。
適切には、ヌクレオチド配列に関する同一性の程度は、少なくとも５０の連続するヌクレオチドにわたり、好ましくは少なくとも６０の連続するヌクレオチドにわたり、好ましくは少なくとも７０の連続するヌクレオチドにわたり、好ましくは少なくとも８０の連続するヌクレオチドにわたり、好ましくは少なくとも９０の連続するヌクレオチドにわたり、好ましくは少なくとも１００の連続するヌクレオチドにわたり、好ましくは少なくとも１５０の連続するヌクレオチドにわたり、好ましくは少なくとも２００の連続するヌクレオチドにわたり、好ましくは少なくとも２５０の連続するヌクレオチドにわたり、好ましくは少なくとも３００の連続するヌクレオチドにわたり、好ましくは少なくとも３５０の連続するヌクレオチドにわたり、好ましくは少なくとも４００の連続するヌクレオチドにわたり、好ましくは少なくとも４５０の連続するヌクレオチドにわたり、好ましくは少なくとも５００の連続するヌクレオチドにわたり、好ましくは少なくとも５５０の連続するヌクレオチドにわたり、好ましくは少なくとも６００の連続するヌクレオチドにわたり、好ましくは少なくとも６５０の連続するヌクレオチドにわたり、又は好ましくは少なくとも７００の連続するヌクレオチドにわたり決定され得る。
適切には、ヌクレオチド、ｃＤＮＡ、ｃｄｓ、又はアミノ酸配列に関する同一性の程度は、配列全体にわたり決定され得る。
配列はまた、サイレントな変化をもたらすアミノ酸残基の欠失、挿入、又は置換も有し得、機能的に同等な物質を生じさせ得る。意図的なアミノ酸置換は、物質の副次的結合活性が保持される限り、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性，及び／又は両親媒性の類似性に基づいて行われ得る。例えば、負に荷電したアミノ酸としてはアスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれ、正に荷電したアミノ酸としてはリジン及びアルギニンが含まれ、そして、類似の親水性値を有する非荷電極性頭基を有するアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、及びチロシンが含まれる。
保存的置換は、例えば、以下の表４に従って行うことができる。第２列の同じブロック内の、また好ましくは第３列の同じ行のアミノ酸は、互いに置換され得る。
本発明はまた、生じ得る相同置換（置換及び置き換えはいずれも、代わりの残基での既存のアミノ酸残基の交換を意味するために、本明細書において使用される）、すなわち、塩基性から塩基性、酸性から酸性、極性から極性などの同種交換の置換も包含する。非相同置換、すなわち、あるクラスの残基から別のクラスの残基への置換、又は、その代わりに、オルニチン（以下、Ｚと呼ぶ）、ジアミノ酪酸オルニチン（以下、Ｂと呼ぶ）、ノルロイシンオルニチン（以下、Ｏと呼ぶ）、ピリジルアラニン（pyriylalanine）、チエニルアラニン、ナフチルアラニン、及びフェニルグリシンなどの非天然アミノ酸を含めることを伴う置換もまた生じ得る。
置き換えはまた、アルファ＊及びアルファ二置換＊アミノ酸、Ｎ－アルキルアミノ酸＊、乳酸＊、天然のアミノ酸のハロゲン化物誘導体、例えば、トリフルオロチロシン＊、ｐ－Ｃｌ－フェニルアラニン＊、ｐ－Ｂｒ－フェニルアラニン＊、ｐ－Ｉ－フェニルアラニン＊、Ｌ－アリル－グリシン＊、β－アラニン＊、Ｌ－α－アミノ酪酸＊、Ｌ－γ－アミノ酪酸＊、Ｌ－α－アミノイソ酪酸＊、Ｌ－ε－アミノカプロン酸＃、７－アミノヘプタン酸＊、Ｌ－メチオニンスルホン＃＊、Ｌ－ノルロイシン＊、Ｌ－ノルバリン＊、ｐ－ニトロ－Ｌ－フェニルアラニン＊、Ｌ－ヒドロキシプロリン＃、Ｌ－チオプロリン＊、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）のメチル誘導体、例えば、４－メチル－Ｐｈｅ＊、ペンタメチル－Ｐｈｅ＊、Ｌ－Ｐｈｅ（４－アミノ）＃、Ｌ－Ｔｙｒ（メチル）＊、Ｌ－Ｐｈｅ（４－イソプロピル）＊、Ｌ－Ｔｉｃ（１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－３－カルボン酸）＊、Ｌ－ジアミノプロピオン酸＃、及びＬ－Ｐｈｅ（４－ベンジル）＊を含む非天然アミノ酸によって行うことができる。注釈＊は、誘導体の疎水性を示すために上記の議論を目的として（相同置換又は非相同置換に関する）利用されており、一方、＃は誘導体の親水性を示すために利用されており、＃＊は両親媒性の特徴を示している。
バリアントアミノ酸配列は、グリシン残基又はβ－アラニン残基などのアミノ酸スペーサーに加えて、配列の任意の２つのアミノ酸残基の間に挿入され得る、メチル、エチル、又はプロピル基などのアルキル基を含む適切なスペーサー基を含み得る。さらなるバリエーション形態は、ペプトイド形態の１又は２以上のアミノ酸残基の存在を伴い、これは当業者に良く理解されるであろう。疑義を避けるために記載すると、「ペプトイド形態」は、残基の窒素原子上にα－炭素ではなくα－炭素置換基があるバリアントアミノ酸残基を指すために使用される。ペプトイド形態のペプチドを調製するための方法は、当技術分野において公知であり、例えば、Simon RJ et al., PNAS (1992) 89(20), 9367-9371、及びHorwell DC Trends Biotechnol. (1995) 13(4), 132-134である。
本発明において使用するためのヌクレオチド配列は、その中に、合成の又は修飾されたヌクレオチドを含み得る。オリゴヌクレオチドに対するいくつかの異なるタイプの修飾が、当技術分野において公知である。これらとしては、メチルホスホネート骨格及びホスホロチオエート骨格、並びに／又は分子の３’及び／若しくは５’末端でのアクリジン鎖若しくはポリリジン鎖の付加が含まれる。本発明の目的では、本明細書において記載されるヌクレオチド配列は、当技術分野において利用可能な任意の方法によって修飾され得ることが理解される。このような修飾は、本発明のヌクレオチド配列のインビボ活性又は寿命を増強させるために行うことができる。
本発明はまた、本発明の核酸配列に相補的な配列、又は、本発明の配列若しくはこの配列に相補的な配列のいずれかにハイブリダイズし得る配列も包含する。本明細書において使用される用語「ハイブリダイゼーション」は、「核酸の鎖が塩基対合を介して相補鎖と結合するプロセス」及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、polymerase chain reaction）技術で行われる増幅プロセスを含む。
本発明はまた、本発明のヌクレオチド配列（本明細書において提示される配列の相補配列を含む）にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列にも関する。好ましくは、ハイブリダイゼーションは、ストリンジェンシーな条件下（例えば、５０℃及び０．２×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸Ｎａ３、ｐＨ７．０｝）で決定される。さらに好ましくは、ハイブリダイゼーションは、高いストリンジェンシー条件下（例えば、６５℃及び０．１×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸Ｎａ３、ｐＨ７．０｝）で決定される。
一態様において、本発明で使用するための配列は、合成配列、すなわちインビトロの化学的又は酵素的合成によって調製された配列である。その例としては、これらに限定されないが、宿主生物にとって最適なコドン出現頻度を用いて作製された配列が挙げられる。
用語「発現ベクター」は、インビボ又はインビトロでの発現が可能なコンストラクトを意味する。一実施形態では、本発明のベクターは、本明細書に記載されるＮｉｃ３遺伝子を発現する。一実施形態では、本発明のベクターは、本明細書に記載されるＮｉｃ１ ＥＲＦ及び／又はＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子をさらに発現する。好ましくは、発現ベクターは、適切な宿主生物のゲノムに組み込まれる。用語「組み込まれる」は、好ましくは、ゲノム内への安定な組込みを網羅する。
本発明において使用するためのヌクレオチド配列は、適切な宿主生物によるヌクレオチド配列の発現を提供し得る調節配列にヌクレオチド配列が機能可能に連結しているベクター内に存在し得る。本発明において使用するためのコンストラクトは、本発明のポリペプチドの発現を提供するために、本明細書において記載される適切な宿主細胞に形質転換することができる。ベクター、例えばプラスミド、コスミド、又はファージベクターの選択は、それが導入される宿主細胞に依存することが多い。ベクターは、インビトロで、例えばＲＮＡの生成のために使用することができるか、又は宿主細胞にトランスフェクトする、形質転換する、形質導入する、若しくは感染させるために使用することができる。
一部の適用において、本発明において使用するためのヌクレオチド配列は、例えば選択された宿主細胞によるヌクレオチド配列の発現を提供し得る調節配列に機能可能に連結している。例として、本発明は、このような調節配列に機能可能に連結した本明細書に記載されるＮｉｃ３遺伝子のヌクレオチド配列を含むベクターを網羅し、すなわちこのベクターは、発現ベクターである。適切には、ベクターは、本明細書に記載されるＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／又はＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子のヌクレオチド配列を加えて含んでいてもよく、これは、調節配列に機能可能に連結されている。
用語「機能可能に連結している」は、記載される構成成分が、それらの目的の様式で機能することを可能にする関係にある、並置を指す。コード配列に「機能可能に連結している」調節配列は、制御配列に適合する条件下でコード配列の発現が行われるように、ライゲーションされている。
用語「調節配列」としては、プロモーター及びエンハンサー並びに他の発現調節シグナルが含まれる。用語「プロモーター」は、当技術分野の通常の意味で使用され、例えばＲＮＡポリメラーゼ結合部位である。Ｎｉｃ３遺伝子、又はＮｉｃ３遺伝子とＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくはＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子との組合せをコードするコンストラクト内のヌクレオチド配列は、少なくともプロモーターに機能可能に連結されていてもよい。
用語「コンストラクト」は、「カセット」又は「ベクター」などの用語と同義であるが、これとしては、プロモーターに直接的に又は間接的に結合した、本発明に従って使用するためのヌクレオチド配列が含まれる。
間接的な結合の例は、プロモーターと本発明のヌクレオチド配列との間にある、Ｓｈ１－イントロン又はＡＤＨイントロンなどのイントロン配列などの適切なスペーサー基の提供である。直接的な又は間接的な結合を含む、本発明に関連する「融合した」という用語でも、同様のことが当てはまる。一部のケースにおいて、この用語は、野生型遺伝子プロモーターと通常結び付いているタンパク質をコードするヌクレオチド配列の天然の組合せ（これらが共に、その天然の環境にある場合）は意味しない。コンストラクトはさらに、マーカーを含有又は発現することもでき、このことによって、遺伝子コンストラクトの選択が可能となる。
植物の形質転換に使用される一般的な技術の概説は、参照によって本明細書に組み込まれる、Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205-225)、及びChristou (Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)の記事で見ることができる。植物の形質転換についてのさらなる教示は、参照によって本明細書に組み込まれる、欧州特許出願公開第０４４９３７５号公報で見ることができる。
一実施形態では、低アルカロイド（例えば、低ニコチン）形質を有する植物（例えば、タバコ植物）を遺伝子型解析することにおける使用のためのＳＮＰが本明細書に提供される。適切には、ＳＮＰは、以下の表５～９から選択され得る。適切には、少なくとも２つのＳＮＰが選択でき、第１のＳＮＰは、表５～７のいずれかから選択でき、第２のＳＮＰは、表５～７のいずれかから選択できる。適切には、少なくとも２つのＳＮＰが選択でき、第１のＳＮＰは、表５から選択でき、第２のＳＮＰは、表５から選択できる。適切には、少なくとも２つのＳＮＰが選択でき、第１のＳＮＰは、表６から選択でき、第２のＳＮＰは、表６から選択できる。適切には、少なくとも２つのＳＮＰが選択でき、第１のＳＮＰは、表７から選択でき、第２のＳＮＰは、表７から選択できる。
一実施形態では、低アルカロイド（例えば、低ニコチン形質）を有する植物（例えば、タバコ植物）を遺伝子型解析することにおける使用のためのマーカーが本明細書に提供される。
一実施形態では、植物（例えば、タバコ植物）におけるＮｉｃ３遺伝子座を遺伝子型解析することにおける使用のためのＳＮＰが本明細書に提供される。適切には、ＳＮＰは、以下の表５～７から選択できる。
一実施形態では、植物（例えば、タバコ植物）におけるＮｉｃ３遺伝子座を遺伝子型解析することにおける使用のためのマーカーが本明細書に提供される。
一実施形態では、低いニコチンレベルを有する植物を同定することにおける使用のためのマーカーが本明細書に提供される。
Ｎｉｃ１及び／又はＮｉｃ２遺伝子座を遺伝子型解析することにおける使用のためのＳＮＰ又はマーカーは、参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１８２３７１０７号パンフレットにおいて入手可能である。
「ＳＮＰ」又は「単一ヌクレオチド多型」は、本明細書で使用される場合、ゲノム配列中の単一のヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｃ又はＧ）が参照配列と比べて変更されているか又は可変である場合に起こる配列のバリエーションを意味する。ＳＮＰがゲノム上の部位にマッピングされる場合、「ＳＮＰマーカー」が存在する。
「マーカー」又は「ＳＮＰマーカー」は、本明細書で使用される場合、ゲノム上の特異的な遺伝子座を特徴付けるのに十分固有な核酸配列又はアミノ酸配列を意味する。多型形質は、それが示差的に遺伝し、目的の表現型形質との連鎖不平衡を呈する場合、マーカーとして使用することができる。形質が所与のマーカーに連鎖すると述べられる場合、その配列が形質に影響を与える実際のＤＮＡセグメントは通常、マーカーと共に分離することが理解されるであろう。
別段の規定がない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 20 ED., John Wiley and Sons, New York (1994)、及びHale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991)は、本開示において使用される用語の多くについての一般的な辞書を当業者に提供している。
本開示は、本明細書において開示されている典型的な方法及び材料によって限定されず、また、本明細書において記載されるものに類似の又は同等のあらゆる方法及び材料を、本開示の実施形態の実施又は試験において使用することができる。数値範囲は、その範囲を規定する数値を含む。別段の指示がない限り、全ての核酸配列は左から右へ向かって５’から３’の方向で、アミノ酸配列は左から右へ向かってアミノからカルボキシの方向で、それぞれ記載されている。
本明細書において提供される見出しは、参照によって全体として明細書に含まれ得る本開示の様々な態様又は実施形態を限定するものではない。したがって、次に定義する用語は、明細書を全体として参照することによって、さらに完全に規定される。
アミノ酸は、アミノ酸の名称、３文字略語、又は１文字略語を使用して、本明細書において記載される。用語「タンパク質」は、本明細書において使用される場合、タンパク質、ポリペプチド、及びペプチドを含む。本明細書において使用される場合、用語「アミノ酸配列」は、用語「ポリペプチド」及び／又は用語「タンパク質」と同義である。一部の場合において、用語「アミノ酸配列」は、用語「ペプチド」と同義である。一部の場合において、用語「アミノ酸配列」は、用語「酵素」と同義である。
本開示及び特許請求の範囲において、アミノ酸残基の従来の１文字コード及び３文字コードが使用され得る。アミノ酸の３文字コードは、IUPACIUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature（ＪＣＢＮ）に従って定義されている通りである。遺伝子コードの縮重に起因してポリペプチドが２以上のヌクレオチド配列によってコードされ得ることも理解される。
用語の他の定義は、明細書全体を通して見ることができる。典型的な実施形態をより詳細に記載する前に、本開示が、記載される特定の実施形態に限定されず、したがって、当然のことながら変化し得ることが理解されるべきである。本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書において使用される専門用語は特定の実施形態のみを記載する目的のものであり、限定することを意図したものではないことも理解される。
本明細書に記載される様々な実施形態は、特許請求された特徴の理解及び教示を助けるためにのみ提示される。これらの実施形態は、単なる実施形態の代表的な試料として提供され、全てを網羅したわけではなく、及び／又はこれらに限定されない。本明細書に記載される利点、実施形態、実施例、機能、特徴、構造、及び／又は他の態様は、特許請求の範囲で定義される本発明の範囲への限定又は特許請求の範囲の均等物への限定とみなされないものとし、特許請求された発明の範囲から逸脱することなく他の実施形態を利用でき、改変をなすことができることが理解されるであろう。様々な本発明の実施形態は、適切には、本明細書で具体的に記載されたもの以外の、開示された要素、成分、特徴、部分、ステップ、手段などの適切な組合せを含んでいてもよいし、それからなっていてもよいし、又はそれから本質的になっていてもよい。加えて、この開示は、ここで特許請求されていないが将来的に特許請求され得る他の発明を含み得る。
値の範囲が提供される場合、文脈から別段のことが明らかに示されない限り、その範囲の上限と下限との間の、下限の単位の１０分の１までの、それぞれの介在している値もまた、具体的に開示される。言及された範囲内の任意の言及された値又は介在する値と、その言及された範囲内の任意の他の言及された値又は介在する値との間の、それぞれのより小さな範囲は、本開示に包含される。これらのより小さな範囲の上限及び下限は、独立してその範囲に含まれ得るか又はその範囲から除外され得、言及された範囲における任意の具体的に除外される限界に従って、そのより小さな範囲内のいずれかの限界が含まれる、いずれの限界も含まれない、又は両限界が含まれる各範囲もまた、本開示に包含される。言及された範囲が限界の一方又は両方を含む場合、含まれる限界のいずれか又は両方を除外している範囲もまた、本開示に含まれる。
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形態「ａ（１つの）」、「ａｎ（１つの）」、及び「ｔｈｅ（その）」は、文脈から別段のことが明らかに示されない限り、複数形の参照を含むことが留意されなくてはならない。したがって、例えば、「酵素」又は「硝酸レダクターゼ」への言及は、当業者に公知の複数のこのような候補物質及びこれらの同等物などを含む。
利点
驚くべきことに、本明細書で教示されるＮｉｃ３遺伝子の活性又は発現を調節することによって、例えば、Ｎｉｃ３遺伝子座に変異を提供することによって、タバコ細胞及びタバコ植物又はその一部のアルカロイド含有量（例えば、ニコチン含有量）及び／又はＴＳＮＡ前駆体含有量を調節できることが見出された。それによって、送達システムの消費者が求める調節されたアルカロイド（例えば、低減したニコチン）及び／又は低減したＴＳＮＡ前駆体含有量並びに商業的に望ましい形質を有する送達システムを生成することができる。特に、低減したニコチン含有量を有するタバコ細胞及びタバコ植物又はその一部は、Ｎｉｃ３遺伝子座における少なくとも１つの変異、並びに任意に、Ｎｉｃ１遺伝子座における少なくとも１つの変異及び／又はＮｉｃ２遺伝子座における少なくとも１つの変異を提供することによって産生することができる。
驚くべきことに、本明細書で教示されるＮｉｃ３遺伝子の活性又は発現を調節することによって、例えば、Ｎｉｃ３遺伝子座に変異を提供することによって、タバコ細胞及びタバコ植物又はその一部のアルカロイド含有量（例えば、ニコチン含有量）及び／又はＴＳＮＡ前駆体含有量を調節できることが見出された。それによって、送達システムの消費者が求める調節されたアルカロイド（例えば、低減したニコチン）及び／又は低減したＴＳＮＡ前駆体含有量並びに商業的に望ましい形質を有する送達システムを生成することができる。特に、低減したニコチン含有量を有するタバコ細胞及びタバコ植物又はその一部は、Ｎｉｃ３遺伝子座における少なくとも１つの変異、並びに任意に、Ｎｉｃ１遺伝子座における少なくとも１つの変異及び／又はＮｉｃ２遺伝子座における少なくとも１つの変異を提供することによって産生することができる。
本発明者らは、超低ニコチン表現型をもたらすことが可能な新しい遺伝子座を初めて同定した。本発明の前に、本明細書に記載されるＮｉｃ３遺伝子の活性又は発現の調節がアルカロイド及び／又はＴＳＮＡ含有量を調節するのに使用できることは公知ではなかった。
本発明者らは、本明細書ではＮｉｃ３遺伝子座と呼ばれる新しい遺伝子座の調節が、改変された植物のアルカロイド含有量（例えば、ニコチン含有量）を驚くほど低いレベルに低減できることを決定した。特に、本発明者らは、Ｎｉｃ３遺伝子座における少なくとも１つの変異、並びに任意に、Ｎｉｃ１遺伝子座における少なくとも１つの変異及び／又はＮｉｃ２遺伝子座における少なくとも１つの変異を提供することによって、アルカロイド含有量（例えば、ニコチン含有量）を驚くほど低いレベルに低減できることを決定した。
本明細書において論じられる刊行物は、本願の出願日前のそれらの開示についてのみ提供されている。本明細書において、このような刊行物が本明細書に添付の特許請求の範囲に対する先行技術を構成するということの承認として、解釈されるものはない。
［実施例］
［実施例］
Ｎｉｃ３に関して分離している集団の開発
ｎｉｃ１及びｎｉｃ２を含有する熱気送管乾燥タバコ変種（ＦＣ１０１）は、これらの２つの遺伝子座の単独に基づき予測されたものより低いニコチンレベルを有することが見出された。
ｎｉｃ１及びｎｉｃ２を含有する熱気送管乾燥タバコ変種（ＦＣ１０１）は、これらの２つの遺伝子座の単独に基づき予測されたものより低いニコチンレベルを有することが見出された。
本発明者らは、この変種において、第３の遺伝子座であるＮｉｃ３が低減したニコチンレベルを制御しているという仮説を立てた。ここで本発明者らは、この遺伝子座を制御する基礎となる遺伝子の同定に関する研究を提示する。
植物材料
Ｎｉｃ３に関して分離している集団を開発するために、２６２個の個体のＦ２集団を、ＦＣ１０１（ｎｉｃ１ ｎｉｃ２ ｎｉｃ３）とＬＡＦＣ５３（ｎｉｃ１ ｎｉｃ２ Ｎｉｃ３）との交雑から生成した。
Ｎｉｃ３に関して分離している集団を開発するために、２６２個の個体のＦ２集団を、ＦＣ１０１（ｎｉｃ１ ｎｉｃ２ ｎｉｃ３）とＬＡＦＣ５３（ｎｉｃ１ ｎｉｃ２ Ｎｉｃ３）との交雑から生成した。
全ての個体を、２つの親の５つの複製と共に温室で種をまき、次いで通常の米国の成長期の間にノースカロライナ州カーナーズビルの畑に植え付けた。
採取前の植え付け後１４０日まで植物を成長させた。下、中央及び上の茎の葉の位置を、それらが成熟したときに採取した。次いで、上の葉（トップの５～７枚の葉）を、標準的な熱気送管乾燥の実施の通りに、６つのラックの熱気送管乾燥用納屋中で乾燥させた。
ＦＣ１０１（ｎｉｃ１ ｎｉｃ２ ｎｉｃ３）とＬＡＦＣ５３（ｎｉｃ１ ｎｉｃ２ Ｎｉｃ３）との交雑から得られた親及びＦ２ｓの表現型解析
親に加えてＦ２集団からの２１８個体の両方について、３つの技術的複製でニコチン及びノルニコチンを測定した。
親に加えてＦ２集団からの２１８個体の両方について、３つの技術的複製でニコチン及びノルニコチンを測定した。
本発明者らは、標準的なガスクロマトグラフ法を介してアルカロイドを測定した。
結果
２つの親のニコチン及びノルニコチン含有量の分析は、ＦＣ１０１が、ＬＡＦＣ５３と比較して両方のアルカロイドのレベルより有意に低いレベルを含有していたことを示した（図１）。
２つの親のニコチン及びノルニコチン含有量の分析は、ＦＣ１０１が、ＬＡＦＣ５３と比較して両方のアルカロイドのレベルより有意に低いレベルを含有していたことを示した（図１）。
ＦＣ１０１×ＬＡＦＣ５３から得られたＦ２植物のニコチンレベルは、連続的に分布していることが見出され（図２Ａ）、したがってＮｉｃ３の遺伝子型は、表現型の値に基づいて明確に推論することはできなかった。
Ｆ２ｓにおけるノルニコチン含有量は、大部分が一様であることが見出され、いくつかの個体が自然に高いレベルのノルニコチンを示した（図２Ｂ）。
マーカーの開発及び連鎖解析
ＤＮＡを、ＣＴＡＢ方法を使用して、全てのＦ２株及びそれらそれぞれの親の葉試料から抽出した。カスタムタバコ50K Infinium iSelect HD BeadChip（Illumina Inc.社、San Diego、CA）を用いたＳＮＰ遺伝子型解析のために、全てのＦ２株及び親ＤＮＡ試料を選択した。ＳＮＰクラスターを、GenomeStudioバージョン２．０（Illumina Inc.社、San Diego、CA）を使用して作成し、同定された全ての多型マーカーをさらなる解析のために使用した。デフォルト設定で回帰マッピング機能を使用したソフトウェアJoinmapバージョン４．０（Stam社、1993）を使用して、集団ごとの遺伝子連鎖マップを構築した。
ＤＮＡを、ＣＴＡＢ方法を使用して、全てのＦ２株及びそれらそれぞれの親の葉試料から抽出した。カスタムタバコ50K Infinium iSelect HD BeadChip（Illumina Inc.社、San Diego、CA）を用いたＳＮＰ遺伝子型解析のために、全てのＦ２株及び親ＤＮＡ試料を選択した。ＳＮＰクラスターを、GenomeStudioバージョン２．０（Illumina Inc.社、San Diego、CA）を使用して作成し、同定された全ての多型マーカーをさらなる解析のために使用した。デフォルト設定で回帰マッピング機能を使用したソフトウェアJoinmapバージョン４．０（Stam社、1993）を使用して、集団ごとの遺伝子連鎖マップを構築した。
ｎｉｃ３遺伝子座を大まかにマッピングするために、Ｒ／ＱＴＬのstepwiseqtl機能（Broman & Sen, 2009; Manichaikul et al. 2009）を使用して、Haley-Knott回帰方法を使用して、１ｃＭの最大距離で計算された遺伝子型の確率及び１０００の順列を用いて２つの集団に対して複数のＱＴＬマッピングを行い、実験あたりα＝０．０１での相加的なＱＴＬ及びエピスタティック相互作用の両方を組み込むための有意な閾値であるオッズの対数（ＬＯＤ）を決定した。
結果
ＦＣ１０１×ＬＡＦＣ５３から得られたＦ２個体のiSelect HD BeadChip遺伝子型解析
ＱＴＬ解析を介してＮｉｃ３遺伝子座を同定するために、本発明者らは次いで、カスタム50K Infinium iSelect HD BeadChipを用いてＦ２個体を遺伝子型解析した。iSelect HD BeadChipを使用して、本発明者らは、ＦＣ１０１とＬＡＦＣ５３との間で多型であるおよそ４，４００種のＳＮＰマーカーを同定した。
ＦＣ１０１×ＬＡＦＣ５３から得られたＦ２個体のiSelect HD BeadChip遺伝子型解析
ＱＴＬ解析を介してＮｉｃ３遺伝子座を同定するために、本発明者らは次いで、カスタム50K Infinium iSelect HD BeadChipを用いてＦ２個体を遺伝子型解析した。iSelect HD BeadChipを使用して、本発明者らは、ＦＣ１０１とＬＡＦＣ５３との間で多型であるおよそ４，４００種のＳＮＰマーカーを同定した。
これらのマーカーは、Ｆ２集団における２９９２個の固有な遺伝子座にマッピングすることができた。
Ｆ２集団のＱＴＬ解析は、総ニコチン含有量と有意に関連する多数のマーカーを含有する連鎖群（２２．１７の最大ＬＯＤスコア）を同定し、この形質における分散の３７．４％を説明した（図３）。
これらのマーカーは、Ｎ．タバカムの30k Infinium HDコンセンサスマップ２０１５の連鎖群５上にマーカーと共に配置された（Edwards, K. D., Fernandez-Pozo, N., Drake-Stowe, K., Humphry M., Evans, A. D., Bombarely, A., Allen, F., Hurst, R., White, B., Kernodle, S. P., Bromley, J. R., Sanchez-Tamburrino, J. P., Lewis, R. S., and Mueller, L.A. (2017) A reference genome for Nicotiana tabacum enables map-based cloning of homeologous loci implicated in nitrogen utilization efficiency. BMC Genomics 18, 448のゲノムの偽性第５染色体）。
結果
ニコチン含有量のＱＴＬのピークと密接に連鎖しているとして同定されたマーカーを使用して、本発明者らは、マーカーＮｔ１ＡＧ１７５０（配列番号３１１）及びＮｔ１ＡＣ２３０７（配列番号３１２）（図３において２０６ｃＭ～３９８ｃＭ）によって範囲を定められたＮｉｃ３遺伝子座を包含するゲノム領域を同定した。
ニコチン含有量のＱＴＬのピークと密接に連鎖しているとして同定されたマーカーを使用して、本発明者らは、マーカーＮｔ１ＡＧ１７５０（配列番号３１１）及びＮｔ１ＡＣ２３０７（配列番号３１２）（図３において２０６ｃＭ～３９８ｃＭ）によって範囲を定められたＮｉｃ３遺伝子座を包含するゲノム領域を同定した。
（Edwards, K. D., Fernandez-Pozo, N., Drake-Stowe, K., Humphry M., Evans, A. D., Bombarely, A., Allen, F., Hurst, R., White, B., Kernodle, S. P., Bromley, J. R., Sanchez-Tamburrino, J. P., Lewis, R. S., and Mueller, L.A. (2017) A reference genome for Nicotiana tabacum enables map-based cloning of homeologous loci implicated in nitrogen utilization efficiency. BMC Genomics 18, 448）のBioNanoハイブリッドアセンブリを利用して、本発明者らは、この領域の大部分をカバーする偽性染色体にマッピングされた足場を同定することができた。偽性染色体中に位置させることができなかったが、（Edwards, K. D., Fernandez-Pozo, N., Drake-Stowe, K., Humphry M., Evans, A. D., Bombarely, A., Allen, F., Hurst, R., White, B., Kernodle, S. P., Bromley, J. R., Sanchez-Tamburrino, J. P., Lewis, R. S., and Mueller, L.A. (2017) A reference genome for Nicotiana tabacum enables map-based cloning of homeologous loci implicated in nitrogen utilization efficiency. BMC Genomics 18, 448）のゲノムにおける足場に固有にマッピングすることができたマーカーを、遺伝子マップ上のそれらの位置に基づいて統合した。本発明者らは次いで、この同定された領域内の遺伝子の遺伝子モデルを改善するために、（Edwards, K. D., Fernandez-Pozo, N., Drake-Stowe, K., Humphry M., Evans, A. D., Bombarely, A., Allen, F., Hurst, R., White, B., Kernodle, S. P., Bromley, J. R., Sanchez-Tamburrino, J. P., Lewis, R. S., and Mueller, L.A. (2017) A reference genome for Nicotiana tabacum enables map-based cloning of homeologous loci implicated in nitrogen utilization efficiency. BMC Genomics 18, 448）からのＲＮＡ－ｓｅｑ情報を利用した。
次いで予測された機能に基づいて候補遺伝子を選択した。
アミノ酸の変化（Ｋ８７Ｅであり、Ｋは野生型である）及びＧ８４Ｖをもたらす、そのコード領域（マーカーＩＤ Ｎｔ２ＡＧ２０１５）にＳＮＰを含有するＭＹＣ転写因子（Ｎｉｔａｂ４．５＿０００２５３９ｇ００４０．１）を同定した。このマーカーにおいてＦＣ１０１又はＬＡＦＣ５３対立遺伝子を含有するとして分類されたＦ２個体は、ニコチン及びノルニコチン含有量に関して明確な分離を呈したことから（図４）、この変更が、低ニコチン表現型の原因となり得ることが示される。
物理的マッピング及び候補遺伝子の同定
厳密にＮｉｃ３遺伝子座に遺伝学的に連鎖していることが見出されたＳＮＰマーカーを、１．５のＬＯＤ低下を使用してR/QTLのlodint機能（Broman & Sen、2009）を使用することによって同定して、領域を定義した。改善されたタバコゲノムアセンブリ（Edwards, K. D., Fernandez-Pozo, N., Drake-Stowe, K., Humphry M., Evans, A. D., Bombarely, A., Allen, F., Hurst, R., White, B., Kernodle, S. P., Bromley, J. R., Sanchez-Tamburrino, J. P., Lewis, R. S., and Mueller, L.A. (2017) A reference genome for Nicotiana tabacum enables map-based cloning of homeologous loci implicated in nitrogen utilization efficiency. BMC Genomics 18, 448）に固有に固定することができるＮｉｃ３遺伝子座を取り囲む目的の領域内のマーカーを使用して、領域の範囲を定めるBioNanoハイブリッド足場（すなわち偽性染色体領域）を同定し、それゆえに、Ｎｉｃ３が存在する染色体を同定した。偽性染色体配列中のギャップは、遺伝子マップにおけるそれらの相対的な配置に基づいて、ゲノム足場に固有にマッピングすることができるがBioNanoハイブリッド足場に存在しないマーカーで充填されていた。
厳密にＮｉｃ３遺伝子座に遺伝学的に連鎖していることが見出されたＳＮＰマーカーを、１．５のＬＯＤ低下を使用してR/QTLのlodint機能（Broman & Sen、2009）を使用することによって同定して、領域を定義した。改善されたタバコゲノムアセンブリ（Edwards, K. D., Fernandez-Pozo, N., Drake-Stowe, K., Humphry M., Evans, A. D., Bombarely, A., Allen, F., Hurst, R., White, B., Kernodle, S. P., Bromley, J. R., Sanchez-Tamburrino, J. P., Lewis, R. S., and Mueller, L.A. (2017) A reference genome for Nicotiana tabacum enables map-based cloning of homeologous loci implicated in nitrogen utilization efficiency. BMC Genomics 18, 448）に固有に固定することができるＮｉｃ３遺伝子座を取り囲む目的の領域内のマーカーを使用して、領域の範囲を定めるBioNanoハイブリッド足場（すなわち偽性染色体領域）を同定し、それゆえに、Ｎｉｃ３が存在する染色体を同定した。偽性染色体配列中のギャップは、遺伝子マップにおけるそれらの相対的な配置に基づいて、ゲノム足場に固有にマッピングすることができるがBioNanoハイブリッド足場に存在しないマーカーで充填されていた。
次いで、アップデートされた領域における遺伝子モデル候補を、ＲＮＡ－ｓｅｑデータ（Edwards, K. D., Fernandez-Pozo, N., Drake-Stowe, K., Humphry M., Evans, A. D., Bombarely, A., Allen, F., Hurst, R., White, B., Kernodle, S. P., Bromley, J. R., Sanchez-Tamburrino, J. P., Lewis, R. S., and Mueller, L.A. (2017) A reference genome for Nicotiana tabacum enables map-based cloning of homeologous loci implicated in nitrogen utilization efficiency. BMC Genomics 18, 448）に対して比較し、必要に応じて補正した。
候補遺伝子の同定
ＦＣ１０１で観察されたニコチン調節に関与するＮｉｃ３遺伝子座内の遺伝子を同定するために、各遺伝子を、例えば、国際公開第２０２０／０２５９６３号パンフレットに記載されたようにウイルス誘導性遺伝子サイレンシング（ＶＩＧＳ）によって、低ニコチンバックグラウンド（すなわちｎｉｃ１ｎｉｃ２バックグラウンド）で個々にサイレンシングし、アルカロイド含有量を測定する。
ＦＣ１０１で観察されたニコチン調節に関与するＮｉｃ３遺伝子座内の遺伝子を同定するために、各遺伝子を、例えば、国際公開第２０２０／０２５９６３号パンフレットに記載されたようにウイルス誘導性遺伝子サイレンシング（ＶＩＧＳ）によって、低ニコチンバックグラウンド（すなわちｎｉｃ１ｎｉｃ２バックグラウンド）で個々にサイレンシングし、アルカロイド含有量を測定する。
候補遺伝子の活性の調節
目的のアミノ酸がタンパク質の機能に必要であることを確認するために、２つのアプローチが使用される：
１．低ニコチンバックグラウンド（すなわちｎｉｃ１ｎｉｃ２バックグラウンド）で目的の残基を変異させるための遺伝子編集（例えば、ＭＹＣ２の場合、Ｇ８４Ｖ及び／又はＫ８７Ｅ）
２．変異していない遺伝子に加えて遺伝子編集されたバリアント（例えば、全長ＭＹＣ２、ＭＹＣ２ Ｇ８４Ｖ、ＭＹＣ２ Ｋ８７Ｅ及びＭＹＣ２ Ｇ８４Ｖ Ｋ８７Ｅ）の過剰発現。
目的のアミノ酸がタンパク質の機能に必要であることを確認するために、２つのアプローチが使用される：
１．低ニコチンバックグラウンド（すなわちｎｉｃ１ｎｉｃ２バックグラウンド）で目的の残基を変異させるための遺伝子編集（例えば、ＭＹＣ２の場合、Ｇ８４Ｖ及び／又はＫ８７Ｅ）
２．変異していない遺伝子に加えて遺伝子編集されたバリアント（例えば、全長ＭＹＣ２、ＭＹＣ２ Ｇ８４Ｖ、ＭＹＣ２ Ｋ８７Ｅ及びＭＹＣ２ Ｇ８４Ｖ Ｋ８７Ｅ）の過剰発現。
機能性ドメイン：
超低ニコチン表現型を本発明者らの目的の遺伝子の機能と相関させるために、２つのアプローチが使用される：
１．機能性ドメイン（例えば、ＭＹＣ２の場合、ＤＮＡ結合部位）を欠失させるための遺伝子編集
２．全長タンパク質に加えて機能性ドメイン（例えば、全長ＭＹＣ２及びＭＹＣ２デルタＤＮＡ結合ドメイン）における欠失を含むバージョンの過剰発現。
超低ニコチン表現型を本発明者らの目的の遺伝子の機能と相関させるために、２つのアプローチが使用される：
１．機能性ドメイン（例えば、ＭＹＣ２の場合、ＤＮＡ結合部位）を欠失させるための遺伝子編集
２．全長タンパク質に加えて機能性ドメイン（例えば、全長ＭＹＣ２及びＭＹＣ２デルタＤＮＡ結合ドメイン）における欠失を含むバージョンの過剰発現。
アルカロイド含有量が測定される。
Ｎｉｃ３遺伝子座における遺伝子のウイルス誘導性遺伝子サイレンシング
標的化されたヌクレオチド配列（配列番号７３（Ｎｉｔａｂ４．５＿０００２５３９ｇ００４０．２）、１１８（Ｎｉｔａｂ４．５＿０００２６８３ｇ００８０．２）、１２４（Ｎｉｔａｂ４．５＿０００５４１２ｇ００１０．２）及び１２７（Ｎｉｔａｂ４．５＿０００５４１２ｇ００２０．２）からの）を含む（ＴＲＶ ＲＮＡ１、配列番号５７０）及び（ＴＲＶ ＲＮＡ２、配列番号５７１～５７４から選択される）の両方を含むＴＲＶベクターを、別々にＡ．ツメファシエンスで増殖させた。これらの培養物を混合し（１：１）、ｎｉｃ１ｎｉｃ２バックグラウンドを有する２週齢のＬａＢＹ２１植物（国際公開第２０１８／２３７１０７号パンフレットで開示された通り、それぞれＮｉｃ１及びＮｉｃ２遺伝子におけるＥＲＦ１９９及びＥＲＦ１８９変異を有する）にシリンジで浸透させた。サイレンシングの作用を、ウイルス感染の５週間後に、標的遺伝子の発現レベルを評価することによって評価した（データ示さず）。
標的化されたヌクレオチド配列（配列番号７３（Ｎｉｔａｂ４．５＿０００２５３９ｇ００４０．２）、１１８（Ｎｉｔａｂ４．５＿０００２６８３ｇ００８０．２）、１２４（Ｎｉｔａｂ４．５＿０００５４１２ｇ００１０．２）及び１２７（Ｎｉｔａｂ４．５＿０００５４１２ｇ００２０．２）からの）を含む（ＴＲＶ ＲＮＡ１、配列番号５７０）及び（ＴＲＶ ＲＮＡ２、配列番号５７１～５７４から選択される）の両方を含むＴＲＶベクターを、別々にＡ．ツメファシエンスで増殖させた。これらの培養物を混合し（１：１）、ｎｉｃ１ｎｉｃ２バックグラウンドを有する２週齢のＬａＢＹ２１植物（国際公開第２０１８／２３７１０７号パンフレットで開示された通り、それぞれＮｉｃ１及びＮｉｃ２遺伝子におけるＥＲＦ１９９及びＥＲＦ１８９変異を有する）にシリンジで浸透させた。サイレンシングの作用を、ウイルス感染の５週間後に、標的遺伝子の発現レベルを評価することによって評価した（データ示さず）。
ＴＲＶ ＲＮＡ２配列は、図５～８に示され、遺伝子特異的な配列は、太字と下線で示される。
結果
図９に、指定された遺伝子に関してサイレンシングされたコンストラクトを発現する６週齢のＬａＢＹ２１（ｎｉｃ１ｎｉｃ２）葉のニコチン含有量を示す。含有量は、コントロールと比べて表され、一元配置ＡＮＯＶＡによって分析された３つの生物学的複製を含んでいる。値は、平均±ＳＥＭとして示される。アスタリスクは、Ｐ値≦０．００１の統計上の有意性を示している。
図９に、指定された遺伝子に関してサイレンシングされたコンストラクトを発現する６週齢のＬａＢＹ２１（ｎｉｃ１ｎｉｃ２）葉のニコチン含有量を示す。含有量は、コントロールと比べて表され、一元配置ＡＮＯＶＡによって分析された３つの生物学的複製を含んでいる。値は、平均±ＳＥＭとして示される。アスタリスクは、Ｐ値≦０．００１の統計上の有意性を示している。
Ｎｉｃ３遺伝子座における遺伝子のサイレンシングは、ｎｉｃ１ ｎｉｃ２と比較してニコチン含有量における減少につながる。
上記の明細書で述べられた全ての刊行物は参照により本明細書に組み込まれる。記載された本発明の方法及びシステムの様々な改変及びバリエーションが、本発明の範囲及び本質から逸脱することなく、当業者には明らかであろう。本発明は、具体的な好ましい実施形態に関連して記載されているが、特許請求された発明は、このような具体的な実施形態に過度に限定されるべきではないことが理解されるものとする。実際に、生化学的及び生物工学又は関連分野における当業者にとって明白な本発明を実施するための記載された様式の様々な改変は、以下の特許請求の範囲内であることが意図される。
（参考文献）
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Claims (31)
- タバコ植物若しくはその一部、又はタバコ植物細胞のアルカロイド含有量（例えば、ニコチン含有量）を調節する（例えば、減少させる）方法であって、
ａ）少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子；
並びに任意に、
ｂ）少なくとも１つのＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子；及び／又は
ｃ）少なくとも１つのＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子；
の活性又は発現を調節することによって、前記植物又は細胞を改変するステップを含む、前記方法。 - タバコ植物若しくはその一部、又はタバコ植物細胞のアルカロイド含有量（例えば、ニコチン含有量）を調節する（例えば、減少させる）方法であって、
Ｎｉｃ３遺伝子座（例えば、Ｎｉｃ３遺伝子）に少なくとも１つの変異を導入すること、任意に、Ｎｉｃ１遺伝子座（例えば、Ｎｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子）に少なくとも１つの変異及び／又はＮｉｃ２遺伝子座（例えば、Ｎｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子）に少なくとも１つの変異を導入することによって、前記植物若しくはその一部又は細胞を改変するステップを含む、前記方法。 - タバコ植物若しくはその一部、又はタバコ植物細胞におけるタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）前駆体の含有量を調節する（例えば、減少させる）方法であって、
ｉ）
ａ）少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子；並びに任意に、
ｂ）少なくとも１つのＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子；及び／若しくは
ｃ）少なくとも１つのＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子
の活性又は発現を調節すること；或いは
ii）Ｎｉｃ３遺伝子座（例えば、Ｎｉｃ３遺伝子）に少なくとも１つの変異を導入すること、任意に、Ｎｉｃ１遺伝子座（例えば、Ｎｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子）に少なくとも１つの変異及び／若しくはＮｉｃ２遺伝子座（例えば、Ｎｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子）に少なくとも１つの変異を導入すること；
によって前記植物又は細胞を改変するステップを含む、前記方法。 - ａ）少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子と、任意に、少なくとも１つのＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子及び／若しくは少なくとも１つのＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子；又は
ｂ）Ｎｉｃ３遺伝子座（例えば、Ｎｉｃ３遺伝子）における少なくとも１つの変異と、任意に、Ｎｉｃ１遺伝子座（例えば、Ｎｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子）における少なくとも１つの変異及び／若しくはＮｉｃ２遺伝子座（例えば、Ｎｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子）における少なくとも１つの変異；
の使用であって、タバコ植物若しくはその一部又はタバコ植物細胞のアルカロイド含有量（例えば、ニコチン含有量）及び／又はＴＳＮＡ前駆体含有量を調節する（例えば、減少させる）ための、前記使用。 - 調節された（例えば、減少した）アルカロイド含有量（例えば、ニコチン含有量）を有する、植物又はその一部、タバコ植物細胞、タバコ植物増殖材料、タバコ葉、切断され採取されたタバコ葉、加工されたタバコ葉又は切断され加工されたタバコ葉を産生するための方法であって、
ｉ）
ａ）少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子；並びに任意に、
ｂ）少なくとも１つのＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子；及び／若しくは
ｃ）少なくとも１つのＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子
の活性若しくは発現を調節するために；又は
ii）Ｎｉｃ３遺伝子座（例えば、Ｎｉｃ３遺伝子）における少なくとも１つの変異と、任意に、Ｎｉｃ１遺伝子座（例えば、Ｎｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子）における少なくとも１つの変異及び／又はＮｉｃ２遺伝子座（例えば、Ｎｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子）における少なくとも１つの変異とを導入するために；
前記タバコ植物若しくはその一部又はタバコ細胞を改変するステップを含む、前記方法。 - ニコチン含有量が、Ｎｉｃ３遺伝子座に少なくとも１つの変異と、任意に、Ｎｉｃ１遺伝子座に少なくとも１つの変異及び／又はＮｉｃ２遺伝子座に少なくとも１つの変異とを導入するために改変されていないタバコ植物若しくはその一部又はタバコ細胞と比較して減少している、請求項１～５のいずれかに記載の方法又は使用。
- 未改変タバコ植物若しくはその一部又はタバコ細胞と比較したアルカロイド含有量（例えば、ニコチン含有量）の低減を達成するために改変されたタバコ植物若しくはその一部又はタバコ細胞であって、前記改変が、
ｉ）
ａ）少なくとも１つのＮｉｃ３遺伝子；並びに任意に、
ｂ）少なくとも１つのＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子；及び／若しくは
ｃ）少なくとも１つのＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子
の調節された活性若しくは発現；又は
ii）Ｎｉｃ３遺伝子座（例えば、Ｎｉｃ３遺伝子）における少なくとも１つの変異と、任意に、Ｎｉｃ１遺伝子座（例えば、Ｎｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子）における少なくとも１つの変異及び／又はＮｉｃ２遺伝子座（例えば、Ｎｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子）における少なくとも１つの変異；
を含む、前記タバコ植物若しくはその一部又はタバコ細胞。 - 請求項７に記載のタバコ植物若しくはその一部若しくはタバコ細胞から、或いは請求項５又は６のいずれかに記載の方法によって生成されたタバコ植物若しくはその一部若しくはタバコ細胞から得ることができるタバコ植物増殖材料。
- ａ）配列番号７３、１１８、１２４若しくは１２７、又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列から選択されるＮｉｃ３遺伝子、或いは前記遺伝子の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログの活性若しくは発現が調節されるか；又は、Ｎｉｃ３遺伝子座における前記少なくとも１つの変異が、配列番号７３、１１８、１２４若しくは１２７、又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列から選択されるＮｉｃ３遺伝子、、或いは前記遺伝子の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログ中にあり：
ｂ）表１に列挙したものから選択されるＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現が調節されるか；又はＮｉｃ１遺伝子座における前記少なくとも１つの変異が、配列番号８；若しくは配列番号１２；若しくは配列番号１６；若しくは配列番号２０；若しくは配列番号２４；若しくは配列番号２８；若しくは配列番号３２；又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列から選択されるＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子；、或いは前記遺伝子の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログ；中にあるか；及び／又は
ｃ）表２に列挙したものから選択されるＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子の活性若しくは発現が調節されるか；又はＮｉｃ２遺伝子座における前記少なくとも１つの変異が、配列番号６９；配列番号３７；若しくは配列番号４１；若しくは配列番号４５；若しくは配列番号４９；若しくは配列番号５３；若しくは配列番号５７；若しくは配列番号６１；若しくは配列番号６５；又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列から選択されるＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子；、或いは前記遺伝子の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログ中にある；
請求項１～６のいずれかに記載の方法又は使用、請求項７に記載の植物若しくはその一部又は細胞、又は請求項８に記載の植物増殖材料。 - ｉ）配列番号８の活性若しくは発現が調節されるか；又はＮｉｃ１遺伝子座における前記少なくとも１つの変異が配列番号８中にあり；及び／或いは
ii）配列番号６９の活性若しくは発現が調節されるか；又はＮｉｃ２遺伝子座における前記少なくとも１つの変異が配列番号６９中にある；
請求項１～６及び９のいずれかに記載の方法若しくは使用、請求項７若しくは９に記載の植物若しくはその一部、又は請求項８若しくは９に記載の植物増殖材料。 - Ｎｉｃ３遺伝子座における前記少なくとも１つの変異が、配列番号７３、１１８、１２４若しくは１２７、又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列から選択されるＮｉｃ３遺伝子、或いは前記遺伝子の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログ中にあり、Ｎｉｃ３遺伝子における前記少なくとも１つの変異が、
ｉ）配列番号７５、若しくはそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列、又は前記ポリペプチドの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログのアミノ酸残基７４～２５８又は４８３～５３８における変異をもたらす、Ｎｉｃ３遺伝子である配列番号７３若しくはそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列、又は前記遺伝子の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログにおける変異；
ii）配列番号１２０、若しくはそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列、又は前記ポリペプチドの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログのアミノ酸残基１２０～５８４における変異をもたらす、Ｎｉｃ３遺伝子である配列番号１１８若しくはそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列、又は前記遺伝子の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログにおける変異；
iii）配列番号１２６、若しくはそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列、又は前記ポリペプチドの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログのアミノ酸残基１６６～４０６又は４８３～９７０における変異をもたらす、Ｎｉｃ３遺伝子である配列番号１２４若しくはそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列、又は前記遺伝子の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログにおける変異；及び
iv）配列番号１２９、若しくはそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列、又は前記ポリペプチドの機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログのアミノ酸残基１７１～４０６又は５０９～９６７における変異をもたらす、Ｎｉｃ３遺伝子である配列番号１２７若しくはそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列、又は前記遺伝子の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログにおける変異；
から選択される、請求項１～６及び９及び１０のいずれかに記載の方法若しくは使用、請求項７若しくは９に記載の植物若しくはその一部、又は請求項８～１０に記載の植物増殖材料。 - 植物を育種するための、請求項７及び９～１１のいずれかに記載の植物若しくはその一部、又は請求項５若しくは６、若しくは９～１１のいずれかに記載の方法によって生成された植物の使用。
- 製品の生産のための、請求項７及び９～１１のいずれかに記載の植物若しくはその一部、又は請求項５若しくは６、若しくは９～１１のいずれかに記載の方法によって生成された植物の使用。
- 穀物を成長させるための、請求項７及び９～１１のいずれかに記載の植物若しくはその一部、又は請求項５若しくは６、若しくは９～１１のいずれかに記載の方法によって生成された植物の使用。
- 葉を生成するための、請求項７及び９～１１のいずれかに記載の植物若しくはその一部の、又は請求項５及び６及び９～１１のいずれかに記載の方法によって生成された植物の使用。
- 請求項７及び９～１１のいずれかに記載の植物から採取された葉、又は請求項７～１１のいずれかに記載の増殖材料から増殖させた植物から得ることができる、又は請求項４、６及び９～１５のいずれかに記載の使用によって得られた植物から得ることができる、又は請求項５及び６及び９～１５のいずれかに記載の方法によって生成された植物から得ることができる採取された葉。
- 切断され採取された葉である、請求項１６に記載の植物の採取された葉。
- 請求項４、６及び９～１５のいずれかに記載の使用から得ることができる植物から得ることができる（例えば、得られた）、
請求項７及び９～１１のいずれかに記載の植物を加工することによって得ることができる（例えば、得られた）、
請求項８～１１のいずれかに記載の植物増殖材料から増殖させた植物から得ることができる（例えば、得られた）、又は
請求項１６又は１７に記載の植物の採取された葉を加工することによって得ることができる（例えば、得られた）、又は
請求項５及び６及び９～１１のいずれかに記載の方法によって生成された植物から得ることができる（例えば、得られた）、
加工された葉、好ましくは、加工されたタバコの葉、好ましくは、生育不能な加工されたタバコの葉。 - 葉が、乾燥させること、発酵させること、低温殺菌すること又はそれらの組合せによって加工され、好ましくは、Ｎ’－ニトロソノルニコチン（ＮＮＮ）、４－（メチルニトロソアミノ）－１－（３－ピリジル）－１－ブタノン（ＮＮＫ）、Ｎ’－ニトロソアナタビン（ＮＡＴ）及びＮ－ニトロソアナバシン（ＮＡＢ）から選択される１つ又は２つ以上のＴＳＮＡの含有量が減少し、好ましくは、ＮＮＮ及び／又はＮＮＫの含有量が調節され（例えば、減少し）、より好ましくは、ＮＮＮの含有量が減少している、請求項１８に記載の加工された葉。
- 切断され加工された葉である、請求項１８又は１９に記載の加工された葉。
- 請求項４、６及び９～１５のいずれかに記載の使用から得ることができる植物から得ることができる（例えば、得られた）、
請求項７及び９～１１のいずれかに記載の植物を加工することによって得ることができる（例えば、得られた）、
請求項８～１１のいずれかに記載の植物増殖材料から増殖させた植物から得ることができる（例えば、得られた）、又は
請求項１６又は１７に記載の植物の採取された葉を加工することによって得ることができる（例えば、得られた）、又は
請求項５及び６及び９～１１のいずれかに記載の方法によって生成された植物から得ることができる、
植物又はその一部から作製された乾燥タバコ材料。 - 請求項２１に記載の乾燥タバコ材料を含むタバコブレンド。
- 請求項７及び９～１１のいずれかに記載のタバコ植物若しくは請求項７及び９～１１に記載のその一部、
請求項８～１１のいずれかに記載のタバコ植物増殖材料から増殖させたタバコ植物若しくはその一部、
請求項１６又は１７に記載の植物の採取された葉、
請求項１８又は１９に記載の加工された葉、
又は
請求項５及び６及び９～１１のいずれかに記載の方法によって生成された植物
から調製された送達システム。 - 可燃性喫煙物品である、請求項２３に記載の送達システム。
- 無煙の送達システムである、請求項２３に記載の送達システム。
- 非可燃性エアロゾル供給システム、例えば、タバコ加熱デバイス又はエアロゾル生成デバイスである、請求項２５に記載の送達システム。
- 請求項７～１１のいずれかに記載の植物若しくはその一部若しくはその抽出物（例えば、タバコ抽出物）又は請求項２１に記載の乾燥タバコ材料又は請求項２２に記載のタバコブレンドを含む、可燃性喫煙物品、非可燃性エアロゾル供給システム、無煙送達システム又はタバコ加熱デバイス。
- 低減したアルカロイド含有量（例えば、ニコチン含有量）及び／又は低減したタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）若しくはＴＳＮＡの前駆体の含有量を有する植物を選択するための、Ｎｉｃ３遺伝子座（例えば、配列番号７３、１１８、１２４若しくは１２７、又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を有する遺伝子から選択されるＮｉｃ３遺伝子、或いは前記遺伝子の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログ）と、任意に、Ｎｉｃ１遺伝子座（例えばＮｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子）及び／又はＮｉｃ２遺伝子座（例えば、Ｎｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子）とのヌクレオチド配列の使用。
- Ｎｉｃ３遺伝子座における（例えば、配列番号７３、１１８、１２４若しくは１２７、又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を有する遺伝子から選択されるＮｉｃ３遺伝子、或いは前記遺伝子の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログにおける）少なくとも１つの遺伝的変異と、任意に、Ｎｉｃ１遺伝子座における（例えば、Ｎｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子における）少なくとも１つの遺伝的変異及び／又はＮｉｃ２遺伝子座における（例えば、Ｎｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子における）少なくとも１つの遺伝的変異とを有する、植物の変異体であって、前記遺伝的変異が、前記遺伝的変異を有さない比較できる植物と比べて、変異体タバコ植物において、アルカロイド含有量（例えば、ニコチン含有量）を減少させるか、及び／又はタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）又はＴＳＮＡの前駆体の含有量を減少させる、前記変異体。
- 請求項２９に記載の遺伝的変異を有する変異体植物の後代又は種子。
- Ｎｉｃ３遺伝子座における（例えば、配列番号７３、１１８、１２４若しくは１２７、又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を有する遺伝子から選択されるＮｉｃ３ ＥＲＦ遺伝子、或いは前記遺伝子の機能的バリアント若しくは機能的断片若しくはオルソログにおける）少なくとも１つの変異と、任意に、Ｎｉｃ１遺伝子座（例えば、Ｎｉｃ１ ＥＲＦ遺伝子）における少なくとも１つの変異及び／又はＮｉｃ２遺伝子座（例えば、Ｎｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子）における少なくとも１つの変異とを含む、植物から生成され採取された葉、加工された葉又は乾燥タバコ材料であって、前記植物は、Ｎｉｃ３遺伝子座、並びに任意にＮｉｃ１遺伝子座及び／又はＮｉｃ２遺伝子座における前記変異を有さない比較できる植物と比べて、減少したニコチン含有量及び／又はタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）若しくはＴＳＮＡの前駆体の減少した含有量を有する、前記採取された葉、加工された葉又は乾燥タバコ材料。
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2021
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