CN116096902A - 用于调节烟草中尼古丁水平的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于调节(例如降低)植物(例如烟草植物)或其部分或烟草植物细胞的尼古丁含量的方法，所述方法包括修饰所述植物或细胞，提供在Nic3基因座中的至少一种突变。本发明提供了用于调节(例如降低)植物(例如烟草植物)或其部分或烟草植物细胞的尼古丁含量的方法，所述方法包括修饰所述植物或细胞，以调节至少一种Nic3基因的表达或活性。本发明还提供了Nic3基因座用于调节植物的生物碱含量的用途，以及可根据本发明获得的烟草细胞、植物、植物繁殖材料、收获的叶片、加工烟草或递送系统。

Description

用于调节烟草中尼古丁水平的方法
技术领域
本发明涉及调节(例如降低)烟草植物或其部分或烟草植物细胞的生物碱含量，例如尼古丁含量的方法。本发明还扩展到调节由基因编码的多肽表达和/或活性的方法，所述基因调节植物内的生物碱含量。可替代地，本发明提供了调节基因表达和/或活性的方法，所述基因编码调节植物内的生物碱含量(例如尼古丁含量)的多肽。本发明还扩展到通过将突变引入烟草植物或其部分或烟草植物细胞，来调节(例如降低)植物内的生物碱含量的方法。本发明涉及通过本文的任何方法产生的植物。本发明还扩展到可以用于调节多肽的构建体，用此类构建体转化的烟草植物细胞以及转基因烟草植物本身。本发明还涉及从根据本发明具有调节的生物碱含量(例如尼古丁含量)的烟草植物收获的叶片的用途，以及包含此类叶片或其提取物的递送系统(例如可燃气雾剂供应系统、非可燃气雾剂供应系统或无气雾剂递送系统)。本发明还涉及根据本发明具有低生物碱含量(例如尼古丁含量)的烟草植物在分子农业中的用途。
背景技术
生物碱是一组天然存在的化合物，其主要含有碱性氮原子，并且由包括细菌、真菌、植物和动物在内的大量各种生物产生。生物碱可以根据碳骨架例如吲哚、异喹啉和吡啶样的相似性进行分类。吡啶衍生物是一类单体生物碱；这个类别包括简单的吡啶衍生物、多环稠合和非稠合吡啶衍生物以及倍半萜吡啶衍生物。实例是尼古丁、降烟碱、新烟碱、米喔斯明和新烟草碱。生物碱的大多数已知的生物学功能都与保护相关。
尼古丁天然存在于几个植物变种中，但在烟草植物中以最高水平发现。它在野生和栽培烟草属(Nicotiana)物种中产生，并且它在针对食草动物和昆虫的植物防御中起重要作用(Voelckel等人2001，通过引用并入本文)，占总生物碱含量的~90%。剩余10%的生物碱库主要由降烟碱、新烟草碱、肌胺和新烟碱构成。
烟草中生物碱含量的调节是复杂的。包括基因型、环境、施肥和农学实践(例如打顶)在内的几种因素影响烟草植物中的生物碱水平。
在20世纪30年代，某些古巴雪茄烟草(Nicotiana tabacum)类型被鉴定为具有极低的生物碱含量，并且将这种性状引入美国烟草育种系(通过引用并入本文的Valleau1949)。随后通过多代回交将低生物碱性状引入栽培变种白肋烟(Burley) 21 (B21)的遗传背景内(通过引用并入本文的Legg等人，1970)。
使用低生物碱白肋烟21 (LA-B21)的遗传研究提示了，两个不连锁的基因座，最初被称为基因座A和B (通过引用并入的Legg等人，1969)，但后来称为Nic1和Nic2，作为尼古丁生物合成的调控基因座促成烟草叶片中的尼古丁水平(通过引用并入的Legg和Collins1971；通过引用并入的Hibi等人，1994)。据报道LA B21对昆虫损害更敏感，这与生物碱在植物防御中的作用一致。还已报道了，具有低总生物碱(0.2%左右)的烤烟的等基因系具有较低的产量。借助于来自野生型或高生物碱B21 (HA-B21，AABB) x LA-B21 (aabb)之间的杂交的F1后代的单倍体加倍，Collins等人，(1974，通过引用并入)开发了具有高中间生物碱(HI-B21，AAbb)和低中间(LI-B21，aaBB)的B21的另外两个等基因系(NIL)，其后来在1988年注册为变种(通过引用并入的Nielsen等人，1988)。近等基因系(NIL)在本文中被称为白肋烟21 (B21，Nic1Nic2)、高中间(HI，Nic1nic2)、低中间(LI，nic1Nic2)和低生物碱B21 (LA，nic1nic2)后来在1988年注册为变种。
nic突变体中的尼古丁生物合成基因的下调已通过各种研究得到确认(两者均通过引用并入本文的Hibi等人，1994；Reed和Jelesko 2004)，并且提示了Nic1和Nic2是特异性控制尼古丁相关结构基因的表达的调控基因座。后续研究已显示了，这两个基因座还控制与尼古丁生物合成无关的众多基因例如应激应答基因的表达(通过引用并入的Kidd等人，2006)。
HA-B21和LA-B21的微阵列分析导致在Nic2基因座处调控尼古丁生物合成的ERF(乙烯应答因子)基因簇的鉴定(通过引用并入本文的Shoji等人，2010)。在nic2突变系例如LA-B21和HI-B21中，这些ERF基因完全缺失。最近的研究已确认了，Nic2区域含有ERF基因簇，并且定位于19号染色体上(通过引用并入本文的Kajikawa等人2017)。
由于数量性状例如生物碱水平的复杂性质抑制了基于图谱的克隆方法，因此烟草中Nic1基因座的定位说明已证明是困难的。
Humphry等人首次在WO2018/237107 (通过引用并入本文)中证实了，定位于7号染色体上的Nic1基因座含有Nic2 ERF基因的许多同源物，并且显示了这些Nic1 ERF基因在调控尼古丁中发挥功能，提示了Nic1可能以与Nic2类似的方式调控尼古丁生物合成。
改变植物(例如烟草)中的生物碱含量可以具有几个商业优点。例如，降低植物中的总生物碱含量可以增加所述植物作为生物量资源的价值。例如，改变生物碱含量可以包括减少烟草植物中的生物碱含量，例如尼古丁含量。鉴于 “尼古丁最高限度(nicotineceiling)”，即递送系统中的平均尼古丁上限的潜在调控，具有减少的尼古丁的烟草植物和产品可能是期望的。可替代地，增加植物例如烟草植物中的生物碱含量，可以帮助保护植物以抗昆虫和食草动物。仍然需要植物及其制备方法，所述植物在具有改善的商业上期望的性状的情况下具有调节的生物碱含量，例如具有调节的尼古丁含量。
烟草吡啶生物碱是烟草特有亚硝胺(TSNA)的前体，后者在收获后的叶片调制(curing)过程中形成。调制后的烟草叶片中发现的四种主要TSNA是N'-亚硝基降烟碱(NNN)、N'亚硝基新烟草碱(NAT)、N'-亚硝基新烟碱(NAB)和4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)。
当氧化亚氮种类(例如NO、NO2、N2O3和N2O4)与烟草生物碱反应时，形成TSNA。NAT和NAB分别经由次级生物碱新烟草碱和新烟碱的亚硝化作用形成。尽管早期研究声称NNN源于尼古丁和降烟碱两者，但最近的报道已证实了，调制后的烟草叶片中NNN的出现与降烟碱含量而不是尼古丁相关联(两者均通过引用并入本文的Bush等人，Rec. Adv. Tob. Sci. 27；23-46 (2001)；Lewis等人，Plant Biotech J. 6: 346-354 (2008))。降烟碱是尼古丁的去甲基化衍生物，尼古丁是烟草中的主要生物碱，占总生物碱含量的90% (通过引用并入本文的Saitoh等人，1985 Phytochemistry，24第477-480页)。NNK形成的前体/产物关系不太清楚。一些研究陈述，NNK是尼古丁的亚硝化产物，但由于尼古丁亚硝化的缓慢反应速率，很可能尼古丁的一种或多种氧化衍生物，而不是尼古丁本身充当NNK的直接前体(通过引用并入本文的Caldwell等人Ann. N.Y. Acad. Sci. 686，213-228 (1993))。鉴定负责TSNA前体的产生和调控的基因具有高度重要性。
虽然降烟碱通常仅占烟草植物中的总吡啶类生物碱含量的2-4%，但导致含有高降烟碱的转化植物的自发出现的遗传不稳定性是递送系统中的长期问题。维持低降烟碱水平可以防止与这种生物碱相关的令人反感的风味和香气，以及减少递送系统中降烟碱是其直接前体的N-亚硝基降烟碱(NNN)的形成。
负责大部分尼古丁至降烟碱转换的基因是尼古丁去甲基化酶基因CYP82E4，其编码细胞色素P450单加氧酶(两者均通过引用并入本文的Siminszky等人，Proc. Natl.Acad. Sci. USA，102 (2005)，第14919-14924页；Xu等人，Physiol. Plantarum，129(2007)，第307-319页)。烟草中的尼古丁去甲基化酶基因家族是广泛表征的，但关于可以影响降烟碱水平的其它细胞过程知之甚少。
仍然非常需要设计可以进一步减少烟草植物以及由烟草植物生产的产品中的TSNA水平的方法。
如实施例中所述的，发明人设法调查负责生物碱合成的基因，目的是调节植物中的生物碱含量，例如降低烟草植物中的尼古丁含量。
基于单独的这两个基因座，发现含有nic1和nic2的烤烟变种(FC101)具有低于预计的尼古丁水平。假设第三个基因座Nic3正在控制该变种中减少的尼古丁水平。
他们的研究促使本发明人创建了对于Nic3分离的种群，所述种群由FC101 (nic1 nic2 nic3)和LAFC53 (nic1 nic2 Nic3)之间的杂交生成。分析所得到的F2植物的生物碱含量。对F2执行SNP基因分型，以鉴定用于进一步分析的多态性标记物。发明人开发了与Nic3基因座分离的标记物。鉴定了生物碱合成基因的新的潜在调节剂。
发明内容
已令人惊讶地发现，通过调节如本文教导的Nic3基因座中的基因活性或表达，可以调节烟草植物的生物碱含量(例如尼古丁含量)。由此，可以生产具有调节的生物碱含量以及由递送系统的消费者所追求的商业上期望性状的递送系统。在一些情况下，消费者可能期望具有低水平的生物碱含量，例如低水平的尼古丁含量的产品。
本发明可能在植物分子农业领域中特别有用，其中植物或其部分或植物细胞(例如烟草和其它烟草属物种)用于生产蛋白质、肽和代谢物，例如用于生产治疗剂和药物如抗生素、病毒样颗粒、或营养药(neutraceuticals)或小分子。在EU提供资金的名为PharmPlant的项目中，烟草已用于开发HIV-中和抗体，并且加拿大的Medicago Inc.已参与基于烟草的平台，用于生产用于流感疫苗制造的病毒样颗粒。
在其它情况下，可能期望生产具有高生物碱水平如高水平的尼古丁含量的植物，从而使得可以从烟草植物中纯化尼古丁，以生产纯尼古丁产品例如用于利用含有尼古丁的液体的设备(例如电子烟(e-cigarettes))或烟草加热设备内。例如，具有含有高水平的尼古丁的叶片的植物的生产可以减少用于生产用于电子烟的电子烟液(e-liquids)的尼古丁提取成本。
本发明人调查了烟草植物中的尼古丁生物合成的调控。他们鉴定并调查了一个新的基因座，在本文中被称为Nic3基因座。除调控基因座Nic1和Nic2之外，假设Nic3控制尼古丁相关结构基因(以及可能地其它无关基因)的表达。发明人的一个目的是提供改变的生物碱含量，且特别是减少的尼古丁含量。与其在相同条件下生长的野生型植物配对物相比，在Nic3区域中鉴定了出乎意料地调节修饰的烟草植物中的生物碱含量的基因。特别地，本发明人已鉴定了Nic3基因座(和Nic3基因)，其能够在nic1 nic2背景下(即，在已经具有低生物碱例如低尼古丁的植物中)进一步减少生物碱(例如尼古丁含量)和TSNA前体含量。
本发明人已令人惊讶地确定了，通过调节Nic3基因的活性或表达和/或提供在Nic3基因座中的突变，用于调节烟草植物或其部分或植物细胞的生物碱含量例如尼古丁含量的方法。在本发明之前，尚不知道第三个基因座 – 如本文所述的“Nic3”可以单独或者与Nic1和/或Nic2基因座组合用于调节生物碱含量。
本发明人已确定了，Nic3基因座的调节可以减少修饰的植物的生物碱含量(例如尼古丁含量)和/或TSNA前体或TSNA含量。
特别地，本发明人已确定了，Nic1基因座、Nic2基因座和Nic3基因座的调节(例如在所述基因座内的基因突变)提供了具有令人惊讶地低生物碱含量(例如低尼古丁含量)和/或低TSNA前体或低TSNA含量的植物。
在一个方面，本发明提供了调节(例如降低)烟草植物或其部分或烟草植物细胞的生物碱含量(例如尼古丁含量)的方法，所述方法包括通过调节来自表3的至少一种Nic3基因、或者与其具有至少90%同一性的序列、或者所述基因的功能变体或功能片段或直向同源物的活性或表达，来修饰所述植物或细胞。
适当地，在本发明的任何方面，可以调节选自以下的至少一种Nic3基因的活性或表达：SEQ ID No. 73、SEQ ID No. 76、SEQ ID No. 79、SEQ ID No. 82、SEQ ID No. 85、SEQ ID No. 88、SEQ ID No. 91、SEQ ID No. 94、SEQ ID No. 97、SEQ ID No. 100、SEQ IDNo. 103、SEQ ID No. 106、SEQ ID No. 109、SEQ ID No. 112、SEQ ID No. 115、SEQ IDNo. 118、SEQ ID No. 121、SEQ ID No. 124、SEQ ID No. 127、SEQ ID No. 130、SEQ IDNo. 133、SEQ ID No. 136、SEQ ID No. 139、SEQ ID No. 142、SEQ ID No. 145、SEQ IDNo. 148或SEQ ID No. 151。适当地，可以调节(例如降低或增加)选自SEQ ID No. 73、118、124或127的至少一种Nic3基因的活性或表达。
适当地，可以调节(例如降低或增加)选自SEQ ID No. 73、SEQ ID No. 76或SEQID No. 79的至少一种基因的活性或表达。
在另一个方面，本发明提供了调节(例如降低)烟草植物或其部分或烟草植物细胞的生物碱含量(例如尼古丁含量)的方法，所述方法包括通过以下修饰所述植物或其部分或细胞：对Nic3基因座(例如在Nic3基因中)引入至少一种突变，并且任选地对Nic1基因座(例如在Nic1 ERF基因中)引入至少一种突变和/或对Nic2基因座(例如在Nic2 ERF基因中)引入至少一种突变。
适当地，在本发明的任何方面，Nic3基因可以选自SEQ ID No. 73、SEQ ID No.76、SEQ ID No. 79、SEQ ID No. 82、SEQ ID No. 85、SEQ ID No. 88、SEQ ID No. 91、SEQID No. 94、SEQ ID No. 97、SEQ ID No. 100、SEQ ID No. 103、SEQ ID No. 106、SEQ IDNo. 109、SEQ ID No. 112、SEQ ID No. 115、SEQ ID No. 118、SEQ ID No. 121、SEQ IDNo. 124、SEQ ID No. 127、SEQ ID No. 130、SEQ ID No. 133、SEQ ID No. 136、SEQ IDNo. 139、SEQ ID No. 142、SEQ ID No. 145、SEQ ID No. 148或SEQ ID No. 151。
适当地，可以调节(例如降低或增加)选自SEQ ID No. 73、118、124或127的至少一种基因的活性或表达。适当地，可以调节(例如降低或增加)选自SEQ ID No. 73、SEQ IDNo. 76或SEQ ID No. 79的至少一种基因的活性或表达。
在一个方面，本发明提供了调节(例如降低)烟草植物或其部分或烟草植物细胞的生物碱含量(例如尼古丁含量)的方法，所述方法包括通过调节以下的活性或表达来修饰所述植物或细胞：
a)至少一种Nic3基因；
以及任选地
b)至少一种Nic1 ERF基因；和/或
c)至少一种Nic2 ERF基因。
在此类方法中，修饰至少一种Nic3基因的活性或表达，并且任选地，另外，可以修饰至少一种Nic1 ERF和/或Nic2 ERF基因的活性或表达。如本文使用的，术语“任选地”要求随后的特征仅是任选的，即可能存在或可能不存在。如本文使用的，术语“和/或”允许该术语之前和之后的特征之一或两者的存在。因此，在这方面，这涵盖了修饰以下的替代方案：i)至少一种Nic3基因；ii)至少一种Nic3基因和至少一种Nic1 ERF基因；iii)至少一种Nic3基因和至少一种Nic2 ERF基因；以及iv)至少一种Nic3基因、至少一种Nic1 ERF基因和至少一种Nic2 ERF基因。适当地，在选项i)中，不存在Nic1 ERF或Nic2 ERF基因中的修饰。此类选项类似地适用于其中考虑了此类修饰的在本文中所述的其它方法、用途和产品。
在另一个方面，本发明提供了调节(例如降低)烟草植物或其部分或烟草植物细胞的生物碱含量(例如尼古丁含量)的方法，所述方法包括通过以下修饰所述植物或其部分或细胞：对Nic3基因座(例如在Nic3基因中)引入至少一种突变，并且任选地对Nic1基因座(例如在Nic1 ERF基因中)引入至少一种突变和/或对Nic2基因座(例如在Nic2 ERF基因中)引入至少一种突变。在此类方法中，对Nic3基因座引入至少一种突变，并且任选地，另外，对Nic1基因座和/或Nic2基因座引入至少一种突变。因此，这涵盖了以下替代方案：i)对Nic3基因座引入至少一种突变；ii)对Nic3基因座引入至少一种突变，并且对Nic1基因座引入至少一种突变；iii)对Nic3基因座引入至少一种突变，并且对Nic2基因座引入至少一种突变；以及iv)对Nic3基因座引入至少一种突变，对Nic1基因座引入至少一种突变，并且对Nic2基因座引入至少一种突变。适当地，在选项i)中，并不对Nic1基因座或Nic2基因座引入突变。此类选项类似地适用于其中考虑了此类突变的在本文中所述的其它方法、用途和产品。
在一个进一步方面，本发明提供了调节(例如降低)烟草植物或其植物部分或烟草植物细胞中的烟草特有亚硝胺(TSNA)前体含量的方法，所述方法包括通过以下修饰所述植物或细胞：
i)调节以下的活性或表达：
a)至少一种Nic3基因；以及任选地
b)至少一种Nic1 ERF基因；和/或
c)至少一种Nic2 ERF基因；或
ii)对Nic3基因座(例如在Nic3基因中)引入至少一种突变，并且任选地对Nic1基因座(例如在Nic1 ERF基因中)引入至少一种突变和/或对Nic2基因座(例如在Nic2 ERF基因中)引入至少一种突变。
在一个进一步方面，本发明提供了以下用于调节(例如降低)烟草植物或其部分或烟草植物细胞的生物碱含量(例如尼古丁含量)和或TSNA前体含量的用途：
a)至少一种Nic3基因，以及任选地至少一种Nic1 ERF基因和/或至少一种Nic2 ERF基因；或
b)在Nic3基因座中(例如在Nic3基因中)的至少一种突变，以及任选地在Nic1基因座中(例如在Nic1 ERF基因中)的至少一种突变和/或在Nic2基因座中(例如在Nic2 ERF基因中)的至少一种突变。
在另一个方面，本发明提供了用于生产具有调节的(例如降低的)生物碱含量(例如尼古丁含量)的植物或其部分、烟草植物细胞、烟草植物繁殖材料、烟草叶片、切割的收获的烟草叶片、加工烟草叶片或切割且加工的烟草叶片的方法，所述方法包括修饰所述烟草植物或其部分或烟草细胞，以：
i)调节以下的活性或表达：
a)至少一种Nic3基因；以及任选地
b)至少一种Nic1 ERF基因；和/或
c)至少一种Nic2 ERF基因；或
ii)在Nic3基因座中(例如在Nic3基因中)引入至少一种突变，并且任选地在Nic1基因座中(例如在Nic1 ERF基因中)引入至少一种突变和/或在Nic2基因座中(例如在Nic2 ERF基因中)引入至少一种突变。
适当地，在本发明的任何方面，与未进行修饰以对Nic3基因座引入至少一种突变，并且任选地对Nic1基因座引入至少一种突变和/或对Nic2基因座引入至少一种突变的烟草植物或其部分或烟草细胞相比，尼古丁含量可以是降低的。
在另一个方面，本发明提供了烟草植物或其部分或烟草细胞，其已进行修饰，以实现与未修饰的烟草植物或其部分或烟草细胞相比，生物碱含量(例如尼古丁含量)的减少，其中所述修饰包含：
i)调节以下的活性或表达：
a)至少一种Nic3基因；以及任选地
b)至少一种Nic1 ERF基因；和/或
c)至少一种Nic2 ERF基因；或
ii)在Nic3基因座中(例如在Nic3基因中)的至少一种突变，以及任选地在Nic1基因座中(例如在Nic1基因中)的至少一种突变和/或在Nic2基因座中(例如在Nic2 ERF基因中)的至少一种突变。
在一个进一步方面，本发明提供了可从根据本发明的烟草植物或其部分或烟草细胞、或者通过根据本发明的方法生产的烟草植物或其部分或烟草细胞中获得的烟草植物繁殖材料。
适当地，在本发明的任何方面(例如根据本发明的方法或用途、根据本发明的植物或其部分或细胞、或者根据本发明的植物繁殖材料)：
a)可以调节选自表3中列出的Nic3基因、或者与其具有至少90%同一性的序列、或者所述基因的功能变体或功能片段或直向同源物的活性或表达；或者所述Nic3基因座中的至少一种突变可以在选自表3中列出的Nic3基因、或者与其具有至少90%同一性的序列、或者所述基因的功能变体或功能片段或直向同源物中：
b)可以调节选自表1中列出的Nic1 ERF基因的活性或表达；或者所述Nic1基因座中的至少一种突变可以在选自以下的Nic1 ERF基因中：
SEQ ID No. 8；或SEQ ID No. 12；或SEQ ID No. 16；或SEQ ID No. 20；或SEQ IDNo. 24；或SEQ ID No. 28；或SEQ ID No. 32；或者与其具有至少90%同一性的序列、或者所述基因的功能变体或功能片段或直向同源物；和/或
c)可以调节选自表2中列出的Nic2 ERF基因的活性或表达；或者所述Nic2基因座中的至少一种突变可以是选自以下的Nic2 ERF基因：SEQ ID No. 69；SEQ ID No. 37；或SEQ ID No. 41；或SEQ ID No. 45；或SEQ ID No. 49；或SEQ ID No. 53；或SEQ ID No.57；或SEQ ID No. 61；或SEQ ID No. 65；或者与其具有至少90%同一性的序列、或者所述基因的功能变体或功能片段或直向同源物。适当地，选自表3中列出的Nic3基因选自SEQ IDNo. 73、118、124或127，或者与其具有至少90%同一性的序列，或者所述基因的功能变体或功能片段或直向同源物，并且Nic3基因座中的至少一种突变在选自SEQ ID No. 73、118、124或127的Nic3基因，或者与其具有至少90%同一性的序列，或者所述基因的功能变体或功能片段或直向同源物中。
适当地，在本发明的任何方面(例如根据本发明的方法或用途、根据本发明的植物或其部分、或者根据本发明的植物繁殖材料)：
i)可以调节(例如降低或增加) SEQ ID No. 8的活性或表达；或所述Nic1基因座中的至少一种突变可以在SEQ ID No. 8中；和/或
ii)可以调节(例如降低或增加) SEQ ID No. 69的活性或表达；或所述Nic2基因座中的至少一种突变可以在SEQ ID No. 69中。
适当地，在本发明的任何方面(例如根据本发明的方法或用途、根据本发明的植物或其部分、或者根据本发明的植物繁殖材料)中，所述Nic3基因座中的至少一种突变可以在选自表3的Nic3基因、或者与其具有至少90%同一性的序列、或者所述基因的功能变体或功能片段或直向同源物中。
适当地，所述Nic3基因中的至少一种突变选自：
i) Nic3基因SEQ ID No. 73、或者与其具有至少90%同一性的序列、或者所述基因的功能变体或功能片段或直向同源物中的突变，其导致SEQ ID No. 75的氨基酸残基74至258或483-538、或者与其具有至少90%同一性的序列、或者所述多肽的功能变体或功能片段或直向同源物中的突变；
ii) Nic3基因SEQ ID No. 118、或者与其具有至少90%同一性的序列、或者所述基因的功能变体或功能片段或直向同源物中的突变，其导致SEQ ID No. 120的氨基酸残基120-584、或者与其具有至少90%同一性的序列、或者所述多肽的功能变体或功能片段或直向同源物中的突变；
iii) Nic3基因SEQ ID No. 124、或者与其具有至少90%同一性的序列、或者所述基因的功能变体或功能片段或直向同源物中的突变，其导致SEQ ID No. 126的氨基酸残基166-406或483-970、或者与其具有至少90%同一性的序列、或者所述多肽的功能变体或功能片段或直向同源物中的突变；和
iv) Nic3基因SEQ ID No. 127、或者与其具有至少90%同一性的序列、或者所述基因的功能变体或功能片段或直向同源物中的突变，其导致SEQ ID No. 129的氨基酸残基171-406或509-967、或者与其具有至少90%同一性的序列、或者所述多肽的功能变体或功能片段或直向同源物中的突变。
在一个方面，本发明提供了根据本发明的植物或其部分或植物细胞、或者通过根据本发明的方法生产的植物培育植物的用途。
在一个方面，本发明提供了根据本发明的植物或其部分或植物细胞、或者通过根据本发明的方法生产的植物用于生产产品的用途。
在一个方面，本发明提供了根据本发明的植物或其部分或植物细胞、或者通过根据本发明的方法生产的植物种植作物的用途。
在一个方面，本发明提供了根据本发明的植物或其部分、或者通过根据本发明的方法生产的植物生产叶片的用途。
在一个进一步方面，本发明提供了收获的叶片，其是根据本发明的植物的、或者可得自从根据本发明的繁殖材料繁殖的植物、或者可得自通过根据本发明的用途获得的植物、或者可得自通过根据本发明的方法生产的植物。收获的叶片可以是绿色叶片，例如新鲜的绿色叶片，或干燥的叶片。
适当地，根据本发明的收获的叶片可以是切割的收获的叶片。
在另一个方面，本发明提供了加工叶片，优选加工烟草叶片，优选不能存活的加工烟草叶片，其：
可得自(例如得自)从根据本发明的用途可获得的植物；
通过加工根据本发明的植物可获得(例如获得)；
可得自(例如得自)从根据本发明的植物繁殖材料繁殖的植物；或
通过加工根据本发明的植物的收获的叶片可获得(例如获得)；或
可得自(例如得自)通过根据本发明的方法生产的植物。
适当地，根据本发明的加工叶片可以通过调制、发酵、巴氏灭菌或其组合进行加工，优选地其中选自N'-亚硝基降烟碱(NNN)、4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N'-亚硝基新烟草碱(NAT)和N-亚硝基新烟碱(NAB)的一种或多种TSNA的含量是降低的，其中优选地调节(例如降低) NNN和/或NNK的含量，其中更优选地降低NNN的含量。
适当地，根据本发明的加工叶片可以是切割的加工叶片。
在一个进一步方面，本发明提供了由植物或其部分制成的调制后的烟草材料，所述植物或其部分：
可得自(例如得自)从根据本发明的用途可获得的植物；
通过加工根据本发明的植物可获得(例如获得)；
可得自(例如得自)从根据本发明的植物繁殖材料繁殖的植物；或
通过加工根据本发明的植物的收获的叶片可获得(例如获得)；或
可得自通过根据本发明的方法生产的植物。
适当地，调制后的烟草材料、烟草掺合物或递送系统可以包含在干重基础上约0.01%、0.02%、0.05%、0.0.75%. 0.1%、0.2%、0.3%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、1.1%、1.2%、1.3%、1,4%、1.5%、1.6%、1.7%、1.8%、1.9%、2.0%、2.1%、2.2%、2.3%、2,4%、2,5%、2.6%、2,7%、2.8%、2.9%、3%、4%或5%的平均生物碱水平或平均尼古丁水平。适当地，调制后的烟草材料可以包含小于5%、小于4%、小于3%、小于2%、小于1%、小于0.9%、小于0.8%、小于0.7%、小于0.6%、小于0.5%、小于0.4%、小于0.3%、小于0.2%、小于0.1%、小于0.075%、小于0.05%、小于0.02%或小于0.01%的平均生物碱水平或平均尼古丁水平。
在另一个方面，本发明提供了烟草掺合物，其包含根据本发明的调制后的烟草材料。
在一个进一步方面，本发明提供了由以下进行制备的递送系统：
根据本发明的烟草植物或其部分；
从根据本发明的烟草植物繁殖材料繁殖的烟草植物或其部分；
根据本发明植物的收获的叶片；
根据本发明的加工叶片；
或
通过根据本发明的方法生产的植物。
适当地，根据本发明的递送系统可以是可燃吸烟制品。
适当地，根据本发明的递送系统可以是无烟递送系统。
适当地，根据本发明的递送系统可以是非可燃气雾剂供应系统，例如烟草加热设备或气雾剂生成设备。
在一个进一步方面，本发明提供了可燃吸烟制品、非可燃气雾剂供应系统、无烟递送系统或烟草加热设备，其包含根据本发明的植物或其部分或其提取物(例如烟草提取物)；或者根据本发明的调制后的烟草材料；或者根据本发明的烟草掺合物。
在另一个方面，本发明提供了Nic3基因座(例如来自表3或者选自具有SEQ ID No.73、118、124或127的基因的Nic3基因，或者与其具有至少90%同一性的序列，或者所述基因的功能变体或功能片段或直向同源物)、以及任选地Nic1基因座(例如Nic1 ERF基因)和/或Nic2基因座(例如Nic2 ERF基因)的核苷酸序列，来选择具有减少的生物碱含量(例如尼古丁含量)和/或减少的烟草特有亚硝胺(TSNA)或TSNA前体含量的植物的用途。适当地，所述核苷酸序列可以包含突变。
在一个进一步方面，本发明提供了植物的突变体，其携带在Nic3基因座中(例如在来自表3或者选自具有SEQ ID No. 73、118、124或127的基因的Nic3基因，或者与其具有至少90%同一性的序列，或者所述基因的功能变体或功能片段或直向同源物中)的至少一种可遗传突变，以及任选地在Nic1基因座中(例如在Nic1 ERF基因中)的至少一种可遗传突变和/或在至少Nic2基因座中(例如在Nic2 ERF基因中)的至少一种可遗传突变；其中相对于并不携带所述可遗传突变的可比较植物，所述可遗传突变降低突变烟草植物中的生物碱含量(例如尼古丁含量)，和/或降低烟草特有亚硝胺(TSNA)或TSNA前体的含量。
在一个进一步方面，本发明提供了根据本发明携带可遗传突变的突变植物的后代或种子。
在另一个方面，本发明提供了由植物产生的收获的叶片、加工叶片或调制后的烟草材料，所述植物包含在Nic3基因座中(例如在来自表3或者选自具有SEQ ID No. 73、118、124或127的基因的Nic3基因，或者与其具有至少90%同一性的序列，或者所述基因的功能变体或功能片段或直向同源物中)的至少一种突变，以及任选地在Nic1基因座中(例如在Nic1 ERF基因中)的至少一种突变和/或在至少Nic2基因座中(例如在Nic2 ERF基因中)的至少一种突变，并且其中相对于并不携带在Nic3基因座中以及任选地Nic1基因座和/或Nic2基因座中的所述突变的可比较植物，所述植物具有降低的尼古丁含量和/或降低的烟草特有亚硝胺(TSNA)或TSNA前体含量。
附图说明
现在将参考附图仅通过示例的方式描述本发明的实施方案，其中：
图1显示了FC101和LAFC53的尼古丁和降烟碱含量。星号指示与FC101的显著差异(p值< 0.01)
图2显示了FC101和LAFC53之间的F2种群的尼古丁和降烟碱含量。(A)尼古丁含量，(B)降烟碱含量。
图3显示了来自FC101 x LAFC53的F2种群中的5号染色体的尼古丁数量性状基因座(QTL)分析结果。
图4显示了对于标记物Nt2AG2015隔离的来自FC101 x LAFC53的F2种群中的尼古丁和降烟碱含量。
图5至8显示了SEQ ID No. 571至SEQ ID No. 574，其提供了用于基因沉默具有SEQ ID No：73、118、124和127的基因的TRV2序列，其中基因特异性序列以粗体且加下划线的显示。
图9显示了，与nic1nic2相比，病毒诱导的Nic3基因座中的基因的基因沉默导致尼古丁含量的减少。
序列表
提供了在主题说明书自始至终使用的序列标识符的概括和相应的序列表，其中：
表1：Nic1基因座/ Nic1 ERF基因包含：
标识符 基因 基因组序列 cDNA CDS 氨基酸序列
Nitab4.5_0003090g0020.1 ERF17L3ΔN SEQ ID No. 1 SEQ ID No. 2 SEQ ID No. 3 SEQ ID No. 4
Nitab4.5_0003090g0030.1 ERF199 SEQ ID No. 5 SEQ ID No. 6 SEQ ID No. 7 SEQ ID No. 8
Nitab4.5_0003665g0040.1 JRE5L2 SEQ ID No. 9 SEQ ID No. 10 SEQ ID No. 11 SEQ ID No. 12
Nitab4.5_0004620g0010.1 ERF210 SEQ ID No. 13 SEQ ID No. 14 SEQ ID No. 15 SEQ ID No. 16
Nitab4.5_0004620g0030.1 ERF91 SEQ ID No. 17 SEQ ID No. 18 SEQ ID No. 19 SEQ ID No. 20
Nitab4.5_0004620g0080.1 ERF29 SEQ ID No. 21 SEQ ID No. 22 SEQ ID No. 23 SEQ ID No. 24
Nitab4.5_0004620g0090.3 ERF130 SEQ ID No. 25 SEQ ID No. 26 SEQ ID No. 27 SEQ ID No. 28
Nitab4.5_0004620g0095.1 ERF16 SEQ ID No. 29 SEQ ID No. 30 SEQ ID No. 31 SEQ ID No. 32
Nitab4.5_0006382g0040.1 ERF110 SEQ ID No. 33 SEQ ID No. 34 SEQ ID No. 35 SEQ ID No. 36
表2：Nic2基因座/ Nic2 ERF包含：
标识符 基因 基因组序列 cDNA CDS 氨基酸序列
Nitab4.5_0002924g0010.1 ERF17LI SEQ ID No. 37 SEQ ID No. 38 SEQ ID No. 39 SEQ ID No. 40
Nitab4.5_0002924g0020.2 ERF179 SEQ ID No. 41 SEQ ID No. 42 SEQ ID No. 43 SEQ ID No. 44
Nitab4.5_0002924g0040.2 ERF17 SEQ ID No. 45 SEQ ID No. 46 SEQ ID No. 47 SEQ ID No. 48
Nitab4.5_0002924g0045.1 ERF168 SEQ ID No. 49 SEQ ID No. 50 SEQ ID No. 51 SEQ ID No. 52
Nitab4.5_0002924g0050.2 ERF115 SEQ ID No. 53 SEQ ID No. 54 SEQ ID No. 55 SEQ ID No. 56
Nitab4.5_0006499g0010.1 ERF104 SEQ ID No. 57 SEQ ID No. 58 SEQ ID No. 59 SEQ ID No. 60
Nitab4.5_0006499g0020.2 ERF221 SEQ ID No. 61 SEQ ID No. 62 SEQ ID No. 63 SEQ ID No. 64
Nitab4.5_0012667g0020.2 ERF91L1 SEQ ID No. 65 SEQ ID No. 66 SEQ ID No. 67 SEQ ID No. 68
Nitab4.5_0015055g0010.2 ERF189 SEQ ID No. 69 SEQ ID No. 70 SEQ ID No. 71 SEQ ID No. 72
表3：Nic3基因座/ Nic3基因序列包含：
标识符 预测的功能 基因组序列 CDS 氨基酸序列
Nitab4.5_0002539g0040.2 Myc类型，碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)结构域，转录因子MYC/MYB N末端(MYC2a) SEQ ID No. 73 SEQ ID No. 74 SEQ ID No. 75
Nitab4.5_0002683g0020.2 ERF SEQ ID No. 76 SEQ ID No. 77 SEQ ID No. 78
Nitab4.5_0002778g0050.2 质体-脂质相关蛋白 PAP/原纤维蛋白家族蛋白 SEQ ID No. 79 SEQ ID No. 80 SEQ ID No. 81
Nitab4.5_0004551g0030.2 Myb TF SEQ ID No. 82 SEQ ID No. 83 SEQ ID No. 84
Nitab4.5_0000535g0120.2 NAC结构域蛋白：涉及植物激素控制和防御。DNA结合结构域(DBD)和二聚化结构域 SEQ ID No. 85 SEQ ID No. 86 SEQ ID No. 87
Nitab4.5_0005226g0010.2 细胞色素P450 SEQ ID No. 88 SEQ ID No. 89 SEQ ID No. 90
Nitab4.5_0009200g0010.2 细胞色素P450 SEQ ID No. 91 SEQ ID No. 92 SEQ ID No. 93
Nitab4.5_0004528g0040.2 BZIP转录因子家族蛋白 SEQ ID No. 94 SEQ ID No. 95 SEQ ID No. 96
Nitab4.5_0000556g0220.2 Myb家族转录因子家族蛋白 SEQ ID No. 97 SEQ ID No. 98 SEQ ID No. 99
Nitab4.5_0006594g0090.2 Myb转录因子 SEQ ID No. 100 SEQ ID No. 101 SEQ ID No. 102
Nitab4.5_0006594g0030.2 GATA转录因子 SEQ ID No. 103 SEQ ID No.104 SEQ ID No. 105
Nitab4.5_0006594g0020.2 转移酶 SEQ ID No. 106 SEQ ID No. 107 SEQ ID No. 108
Nitab4.5_0006594g0050.2 核RNA结合蛋白样 SEQ ID No. 109 SEQ ID No. 110 SEQ ID No. 111
Nitab4.5_0002683g0040.2 NB-ARC结构域，疾病抗性蛋白质 SEQ ID No. 112 SEQ ID No. 113 SEQ ID No. 114
Nitab4.5_0002683g0070.2/Nitab05g026600.2.2 氨基转移酶 SEQ ID No. 115 SEQ ID No. 116 SEQ ID No. 117
Nitab4.5_0002683g0080.2 LRR，疾病抗性蛋白质 SEQ ID No. 118 SEQ ID No. 119 SEQ ID No. 120
Nitab4.5_0006415g0030.2 LRR，疾病抗性蛋白质 SEQ ID No. 121 SEQ ID No. 122 SEQ ID No. 123
Nitab4.5_0005412g0010.2 NB-ARC，疾病抗性蛋白质 SEQ ID No. 124 SEQ ID No. 125 SEQ ID No. 126
Nitab4.5_0005412g0020.2 NB-ARC，疾病抗性蛋白质 SEQ ID No. 127 SEQ ID No. 128 SEQ ID No. 129
Nitab4.5_0000712g0030.2 转录调控，同源框-亮氨酸拉链家族蛋白 SEQ ID No. 130 SEQ ID No. 131 SEQ ID No. 132
Nitab4.5_0000712g0010.2 Myb家族转录因子家族蛋白 SEQ ID No. 133 SEQ ID No. 134 SEQ ID No. 135
Nitab4.5_0000712g0020.2 Myb SEQ ID No. 136 SEQ ID No. 137 SEQ ID No. 138
Nitab4.5_0000712g0040.2 Myb家族转录因子家族蛋白 SEQ ID No. 139 SEQ ID No. 140 SEQ ID No. 141
Nitab4.5_0022887g0010.2 代谢物输出蛋白，WAT1相关蛋白 SEQ ID No. 142 SEQ ID No. 143 SEQ ID No. 144
Nitab4.5_0000712g0270.2 硝酸盐转运蛋白 SEQ ID No. 145 SEQ ID No. 146 SEQ ID No. 147
Nitab4.5_0008372g0010.2 硝酸盐转运蛋白 SEQ ID No. 148 SEQ ID No. 149 SEQ ID No. 150
Nitab4.5_0012102g0010.2 硝酸盐转运蛋白 SEQ ID No. 151 SEQ ID No. 152 SEQ ID No. 153
Nitab4.5_0007629g0040.2 Arf gtp酶激活蛋白 SEQ ID No. 154 SEQ ID No. 155 SEQ ID No. 156
Nitab4.5_0007629g0030.2 泛素羧基末端水解酶样蛋白 SEQ ID No. 157 SEQ ID No. 158 SEQ ID No. 159
Nitab4.5_0008566g0040.2 含锚蛋白重复蛋白 SEQ ID No. 160 SEQ ID No. 161 SEQ ID No. 162
Nitab4.5_0002539g0020.2 CAAX蛋白酶自身免疫蛋白 SEQ ID No. 163 SEQ ID No. 164 SEQ ID No. 165
Nitab4.5_0008566g0030.2 MLH1 SEQ ID No. 166 SEQ ID No. 167 SEQ ID No. 168
Nitab4.5_0008650g0030.2 AT钩基序DNA结合家族蛋白 SEQ ID No. 169 SEQ ID No. 170 SEQ ID No. 171
Nitab4.5_0008566g0080.2 PLATZ转录因子家族蛋白 SEQ ID No. 172 SEQ ID No. 173 SEQ ID No. 174
Nitab4.5_0008650g0010.2 AT钩基序DNA结合家族蛋白 SEQ ID No. 175 SEQ ID No. 176 SEQ ID No. 177
Nitab05g026010.1.2 F-box蛋白相互作用结构域蛋白 SEQ ID No. 178 SEQ ID No. 179 SEQ ID No. 180
Nitab4.5_0008650g0020.2 AP-2复合亚基μ SEQ ID No. 181 SEQ ID No. 182 SEQ ID No. 183
Nitab4.5_0004551g0020.2 锌指，RING型结构域 SEQ ID No. 184 SEQ ID No. 185 SEQ ID No. 186
Nitab4.5_0000535g0050.2 富含亮氨酸重复的蛋白质 SEQ ID No. 187 SEQ ID No. 188 SEQ ID No. 189
Nitab4.5_0004551g0010.2 肉桂酰辅酶A还原酶 SEQ ID No. 190 SEQ ID No. 191 SEQ ID No. 192
Nitab4.5_0000535g0020.2 RING/U-box超家族蛋白同种型1 SEQ ID No. 193 SEQ ID No. 194 SEQ ID No. 195
Nitab4.5_0000535g0030.2 铝激活苹果酸转运蛋白家族蛋白 SEQ ID No. 196 SEQ ID No. 197 SEQ ID No. 198
Nitab4.5_0000535g0010.2 ABC转运蛋白家族蛋白 SEQ ID No. 199 SEQ ID No. 200 SEQ ID No. 201
Nitab4.5_0010737g0010.2 肌醇-四磷酸1-激酶 SEQ ID No. 202 SEQ ID No. 203 SEQ ID No. 204
Nitab4.5_0000535g0040.2 蛋白磷酸酶2c SEQ ID No. 205 SEQ ID No. 206 SEQ ID No. 207
Nitab4.5_0010978g0020.2 E3泛素蛋白连接酶RNF14 SEQ ID No. 208 SEQ ID No. 209 SEQ ID No. 210
Nitab4.5_0000535g0100.2 磷酸酶2C家族蛋白 SEQ ID No. 211 SEQ ID No. 212 SEQ ID No. 213
Nitab4.5_0010978g0010.2 三角状五肽重复蛋白 SEQ ID No. 214 SEQ ID No. 215 SEQ ID No. 216
Nitab4.5_0000535g0110.2 蛋白磷酸酶2c SEQ ID No. 217 SEQ ID No. 218 SEQ ID No. 219
Nitab4.5_0002778g0010.2 热休克转录因子 SEQ ID No. 220 SEQ ID No. 221 SEQ ID No. 222
Nitab4.5_0002778g0020.2 前mRNA剪接因子CWC22 SEQ ID No. 223 SEQ ID No. 224 SEQ ID No. 225
Nitab4.5_0002778g0030.2 突触融合蛋白(Syntaxin)样蛋白 SEQ ID No. 226 SEQ ID No. 227 SEQ ID No. 228
Nitab4.5_0006398g0040.2 甘氨酸切割系统h蛋白 SEQ ID No. 229 SEQ ID No. 230 SEQ ID No. 231
Nitab05g025900.1.2 复制因子-A羧基末端结构域蛋白 SEQ ID No. 232 SEQ ID No. 233 SEQ ID No. 234
Nitab4.5_0006398g0030.2 肽转运蛋白 SEQ ID No. 235 SEQ ID No. 236 SEQ ID No. 237
Nitab4.5_0002778g0070.2 多萜醇磷酸-甘露糖生物合成调节蛋白 SEQ ID No. 238 SEQ ID No. 239 SEQ ID No. 240
Nitab4.5_0006398g0030.1/Nitab05g026330.2.2 肽转运蛋白 SEQ ID No. 241 SEQ ID No. 242 SEQ ID No. 243
Nitab4.5_0006398g0010.2 I型肌醇-1 SEQ ID No. 244 SEQ ID No. 245 SEQ ID No. 246
Nitab4.5_0002778g0040.2 GRIP/卷曲螺旋蛋白，推定的(DUF1664) SEQ ID No. 247 SEQ ID No. 248 SEQ ID No. 249
Nitab4.5_0010461g0020.2 扩展蛋白样蛋白 SEQ ID No. 250 SEQ ID No. 251 SEQ ID No. 252
Nitab4.5_0002778g0080.2 赖氨酸特异性去甲基化酶 SEQ ID No. 253 SEQ ID No. 254 SEQ ID No. 255
Nitab4.5_0010461g0010.2 卤酸脱卤酶样水解酶家族蛋白 SEQ ID No. 256 SEQ ID No. 257 SEQ ID No. 258
Nitab4.5_0005487g0030.2/Nitab05g026390.1.2 无义转录物1样蛋白的调节剂 SEQ ID No. 259 SEQ ID No. 260 SEQ ID No. 261
Nitab4.5_0008709g0020.2 无义转录物1的调节剂 SEQ ID No. 262 SEQ ID No. 263 SEQ ID No. 264
Nitab4.5_0008709g0030.2 SBP (S-核糖核酸酶结合蛋白)家族蛋白 SEQ ID No. 265 SEQ ID No. 266 SEQ ID No. 267
Nitab4.5_0008709g0010.2 β-淀粉酶 SEQ ID No. 268 SEQ ID No. 269 SEQ ID No. 270
Nitab4.5_0008425g0020.2 60S核糖体蛋白L37a SEQ ID No. 271 SEQ ID No. 272 SEQ ID No. 273
Nitab4.5_0004528g0020.2 纤维素合酶 SEQ ID No. 274 SEQ ID No. 275 SEQ ID No. 276
Nitab4.5_0008425g0040.2 钙调磷酸酶B样蛋白 SEQ ID No. 277 SEQ ID No. 278 SEQ ID No. 279
Nitab4.5_0004528g0030.2 多萜醇二磷酸寡糖--蛋白质糖基转移酶亚基DAD1 SEQ ID No. 280 SEQ ID No. 281 SEQ ID No. 282
Nitab4.5_0008425g0010.2 AUGMIN亚基2 SEQ ID No. 283 SEQ ID No. 284 SEQ ID No. 285
Nitab4.5_0004528g0010.2 生物素/硫辛酸A/B蛋白连接酶家族 SEQ ID No. 286 SEQ ID No. 287 SEQ ID No. 288
Nitab4.5_0008425g0030.2 蛋白激酶 SEQ ID No. 289 SEQ ID No. 290 SEQ ID No. 291
Nitab05g026480.2.2 双功能抑制剂/脂质转移蛋白/种子贮藏2S白蛋白超家族蛋白 SEQ ID No. 292 SEQ ID No. 293 SEQ ID No. 294
Nitab4.5_0000556g0260.2 聚[ADP-核糖]聚合酶 SEQ ID No. 295 SEQ ID No. 296 SEQ ID No. 297
SEQ ID No. 298对应于标记物Nt1AG1750。
SEQ ID No. 299对应于标记物Nt1AC2307。
SEQ ID No. 300是SNP3的正向引物。
SEQ ID No. 301是SNP3的反向引物。
SEQ ID No. 302是SNP5的正向引物。
SEQ ID No. 303是SNP5的反向引物。
SEQ ID No. 304是SNP15的正向引物。
SEQ ID No. 305是SNP15的反向引物。
SEQ ID No. 306是SNP18的正向引物。
SEQ ID No. 307是SNP18的反向引物。
SEQ ID No. 308是SNP19的正向引物。
SEQ ID No. 309是SNP19的反向引物。
SEQ ID No. 310对应于标记物Nt2AG2015。
SEQ ID No. 311对应于标记物Nt1AG1750。
SEQ ID No. 312对应于标记物Nt1AC2307。
SEQ ID No. 313-569是与实施例中鉴定的QTL相关的SNP的序列。
SEQ ID No. 570是实施例7中使用的TRV RNA1。
SEQ ID No. 571-574是实施例7中使用的TRV RNA2序列。
本文公开的一些序列在核苷酸序列中含有“N”。 “N”可以是任何核苷酸或者一种或多种核苷酸的缺失或插入。例如，在一些情况下，显示了一串“N”。 “N”的数目不一定与在该位置处的实际核苷酸数目相关联。可能存在比序列中显示为“N”更多或更少的核苷酸。
具体实施方式
本发明人首次鉴定了调控烟草中的尼古丁生物合成的Nic3基因座。
通过调节植物(例如烟草植物)或其部分或烟草细胞中的至少一种Nic3基因的活性或表达，可以调节(例如减少)植物的生物碱和/或TSNA含量。可以通过对Nic3基因座引入突变来调节(例如减少)植物或其部分或植物细胞的生物碱(例如尼古丁)含量。
如本文使用的，“Nic3”基因座指在Nic3区域内或与Nic3区域紧密连锁的任何染色体位置或定位。
“Nic3区域”指由标记物Nt1AG1750 (SEQ ID No. 298)和Nt1AC2307 (SEQ ID No.299)所对的染色体区段，其对应于图3中所示的206 cM至398 cM，并且具有与低生物碱(低尼古丁)性状相关的等位基因。
“Nic3突变”指Nic3基因座中的突变。
如本文使用的，“Nic3基因”指在Nic3基因座处或附近的基因，并且包括例如表3中列出的基因；或者与其具有至少80%同一性(与其至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%同一性)的序列，或者所述基因的功能变体或功能片段或直向同源物。
适当地，Nic3基因可以选自：SEQ ID No. 73、SEQ ID No. 76、SEQ ID No. 79、SEQID No. 82、SEQ ID No. 85、SEQ ID No. 88、SEQ ID No. 91、SEQ ID No. 94、SEQ ID No.97、SEQ ID No. 100、SEQ ID No. 103、SEQ ID No. 106、SEQ ID No. 109、SEQ ID No.112、SEQ ID No. 115、SEQ ID No. 118、SEQ ID No. 121、SEQ ID No. 124、SEQ ID No.127、SEQ ID No. 130、SEQ ID No. 133、SEQ ID No. 136、SEQ ID No. 139、SEQ ID No.142、SEQ ID No. 145、SEQ ID No. 148或SEQ ID No. 151；或者与其具有至少80%同一性(与其至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%同一性)的序列，或者所述基因的功能变体或功能片段或直向同源物。
适当地，Nic3基因可以选自SEQ ID No. 73、SEQ ID No. 76或SEQ ID No. 79；或者与其具有至少80%同一性(与其至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%同一性)的序列，或者所述基因的功能变体或功能片段或直向同源物。适当地，Nic3基因可以选自SEQ ID No. 73、SEQ ID No. 118、SEQ ID No. 124或SEQ ID No. 127；或者与其具有至少80%同一性(与其至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%同一性)的序列，或者所述基因的功能变体或功能片段或直向同源物。
在另一个方面，Nic3基因座包含选自以下的序列或在选自以下的序列的50、100、200、300、400、500、6000、700、800、900、1000、1500、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、15000、20000、30000 40000、50000、60000、70000个核苷酸内的染色体区段：SEQ ID No. 73、SEQ ID No. 76、SEQ ID No. 79、SEQ ID No. 82、SEQ ID No. 85、SEQID No. 88、SEQ ID No. 91、SEQ ID No. 94、SEQ ID No. 97、SEQ ID No. 100、SEQ ID No.103、SEQ ID No. 106、SEQ ID No. 109、SEQ ID No. 112、SEQ ID No. 115、SEQ ID No.118、SEQ ID No. 121、SEQ ID No. 124、SEQ ID No. 127、SEQ ID No. 130、SEQ ID No.133、SEQ ID No. 136、SEQ ID No. 139、SEQ ID No. 142、SEQ ID No. 145、SEQ ID No.148和SEQ ID No. 151 (适当地选自SEQ ID No. 73、SEQ ID No. 118、SEQ ID No. 124和SEQ ID No. 127)。
在一个方面，Nic3基因是SEQ ID No. 73、SEQ ID No. 118、SEQ ID No. 124或SEQID No. 127；或者与其具有至少80%同一性(与其至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%同一性)的序列，或者所述基因的功能变体或功能片段或直向同源物。
适当地，Nic3基因可以编码包含表3中所示的氨基酸序列的多肽；或者与其具有至少80%同一性(与其至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%同一性)的序列，或者所述多肽的功能变体或功能片段或直向同源物。
适当地，Nic3基因可以编码选自以下的多肽：SEQ ID No. 75、SEQ ID No. 78、SEQID No. 81、SEQ ID No. 84、SEQ ID No. 87、SEQ ID No. 90、SEQ ID No. 93、SEQ ID No.96、SEQ ID No. 99、SEQ ID No. 102、SEQ ID No. 105、SEQ ID No. 108、SEQ ID No. 111、SEQ ID No. 114、SEQ ID No. 117、SEQ ID No. 120、SEQ ID No. 123、SEQ ID No. 126、SEQ ID No. 129、SEQ ID No. 132、SEQ ID No. 135、SEQ ID No. 138、SEQ ID No. 141、SEQ ID No. 144、SEQ ID No. 147、SEQ ID No. 150或SEQ ID No. 153；或者与其具有至少80%同一性(与其至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%同一性)的序列，或者所述多肽的功能变体或功能片段或直向同源物。
适当地，Nic3基因可以编码选自以下的多肽：SEQ ID No. 75、SEQ ID No. 78或SEQ ID No. 81；或者与其具有至少80%同一性(与其至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%同一性)的序列，或者所述多肽的功能变体或功能片段或直向同源物。
在一个方面，Nic3基因编码包含氨基酸序列SEQ ID No. 75、SEQ ID No. 120、SEQID No. 126或SEQ ID No. 129的多肽；或者与其具有至少80%同一性(与其至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%同一性)的序列，或者所述多肽的功能变体或功能片段或直向同源物。
在一个方面，Nic3基因座包含选自表3的一种或多种序列。
在一个方面，Nic3基因座包含选自以下的一种或多种序列：SEQ ID No. 73、SEQID No. 76、SEQ ID No. 79、SEQ ID No. 82、SEQ ID No. 85、SEQ ID No. 88、SEQ ID No.91、SEQ ID No. 94、SEQ ID No. 97、SEQ ID No. 100、SEQ ID No. 103、SEQ ID No. 106、SEQ ID No. 109、SEQ ID No. 112、SEQ ID No. 115、SEQ ID No. 118、SEQ ID No. 121、SEQ ID No. 124、SEQ ID No. 127、SEQ ID No. 130、SEQ ID No. 133、SEQ ID No. 136、SEQ ID No. 139、SEQ ID No. 142、SEQ ID No. 145、SEQ ID No. 148或SEQ ID No. 151；或者与其具有至少80%同一性(与其至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%同一性)的序列，或者所述基因的功能变体或功能片段或直向同源物。
适当地，Nic3基因座可以包含选自SEQ ID No. 73、SEQ ID No. 76和SEQ ID No.79的一种或多种序列，或者与其具有至少80%同一性(与其至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%同一性)的序列，或者所述基因的功能变体或功能片段或直向同源物。
在一个方面，Nic3基因座包含SEQ ID No. 73、SEQ ID No. 118、SEQ ID No. 124或SEQ ID No. 127中的至少一种或多种，或者与其具有至少80%同一性(与其至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%同一性)的序列，或者所述基因的功能变体或功能片段或直向同源物。
如本文使用的，“与……紧密连锁”或“与……相关”意指标记物或基因座在另一种标记物或基因座的约20cM、1ocM、5cM、1cM、0.5cM或小于0.5 cM内。例如，10cM意指标记物与基因座之间的重组频率等于或小于约10%。
如本文使用的，厘摩(cM)指重组频率的度量单位。一个cM等价于在一个遗传基因座处的标记物由于在单代中的交换与在第二个基因座处的标记物分开的1%机会。使用例如在Kosambi，(Annals of Eugenics，12:172-175 (1944)，其通过引用并入本文)中的Kosambi函数，用于从重组值计算遗传距离的方法是本领域已知的。
如本文使用的，“Nic1”基因座指在Nic1区域内或与Nic1区域紧密连锁的任何染色体位置或定位。
“Nic1区域”指如WO2018/237107 (通过引用并入本文)中公开的染色体区段，例如，标记物SNP3和SNP5 Nt1AB6591和Nt1AA9777)所对，并且具有与低生物碱(低尼古丁)性状相关的等位基因的染色体区段。SNP3的正向引物是SEQ ID No. 300；SNP3的反向引物是SEQ ID No. 301。SNP5的正向引物是SEQ ID No. 302；SNP5的反向引物是SEQ ID No. 303。
“Nic1突变”指Nic1基因座中的突变。
在一个方面，Nic1基因座包含选自表1的一种或多种序列。
在一个方面，Nic1基因座包含选自以下的一种或多种序列：SEQ ID No. 5、SEQ IDNo. 1、SEQ ID No. 9、SEQ ID No. 13、SEQ ID No. 17、SEQ ID No. 21、SEQ ID No. 25、SEQ ID No. 29或SEQ ID No. 33，或者与其具有至少80%同一性(与其至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%同一性)的序列，或者所述基因的功能变体或功能片段或直向同源物。
在一个方面，Nic1基因座包含至少SEQ ID No. 8，或者与其具有至少80%同一性(与其至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%同一性)的序列，或者所述基因的功能变体或功能片段或直向同源物。
在另一个方面，Nic1基因座包含选自以下的序列或在选自以下的序列的50、100、200、300、400、500、6000、700、800、900、1000、1500、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、15000、20000、30000 40000、50000、60000、70000个核苷酸内的染色体区段：SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 9、SEQ ID No. 13、SEQ ID No. 17、SEQ IDNo. 21、SEQ ID No. 25、SEQ ID No. 29和SEQ ID No. 33。
如本文使用的，“Nic1基因”指在Nic1基因座处或附近的基因，并且包括例如表1中列出的基因；或者与其具有至少80%同一性(与其至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%同一性)的序列，或者所述基因的功能变体或功能片段或直向同源物。
至少一种Nic1 ERF基因可以选自：编码多肽的基因，所述多肽包含如以下中所示的氨基酸序列：SEQ ID No. 8；或SEQ ID No. 12；或SEQ ID No. 16；或SEQ ID No. 20；或SEQ ID No. 24；或SEQ ID No. 28；或SEQ ID No. 32，或者其功能变体或功能片段或直向同源物；或其中所述ERF基因包含如以下中所示的核苷酸序列：SEQ ID No. 5；或SEQ IDNo. 9；或SEQ ID No. 13；或SEQ ID No. 17；或SEQ ID No. 21；或SEQ ID No. 25；或SEQID No. 29；或者其功能变体或功能片段或直向同源物。
适当地，至少一种Nic1 ERF基因可以是选自以下的一种、或两种、或三种、或四种、或五种、或六种或七种基因：编码多肽的基因，所述多肽包含如以下中所示的氨基酸序列：SEQ ID No. 8；或SEQ ID No. 12；或SEQ ID No. 16；或SEQ ID No. 20；或SEQ ID No. 24；或SEQ ID No. 28；或SEQ ID No. 32，或者其功能变体或功能片段或直向同源物；或其中所述ERF基因包含如以下中所示的核苷酸序列：SEQ ID No. 5；或SEQ ID No. 9；或SEQ IDNo. 13；或SEQ ID No. 17；或SEQ ID No. 21；或SEQ ID No. 25；或SEQ ID No. 29；或者其功能变体或功能片段或直向同源物。
在一个方面，至少一种Nic1 ERF基因编码包含如以下中所示的氨基酸序列的多肽：SEQ ID No. 8，或者其功能变体或功能片段或直向同源物；或其中所述Nic1 ERF基因包含如SEQ ID No. 5中所示的核苷酸序列、或者其功能变体或功能片段或直向同源物。
在一个方面，调节至少一种另外的Nic1 ERF的活性或表达。适当地，还可以调节选自表1的至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种或至少八种另外的Nic1 ERF。
在一个方面，调节至少一种Nic1 ERF基因编码包含如以下中所示的氨基酸序列的多肽：SEQ ID No. 8，或者其功能变体或功能片段或直向同源物；或至少一种Nic1 ERF基因包含如SEQ ID No. 5中所示的核苷酸序列、或者其功能变体或功能片段或直向同源物；并且调节至少一种另外的Nic1 ERF的活性或表达。适当地，至少一种另外的Nic1 ERF可以选自：Nic1 ERF基因，其编码包含如以下中所示的氨基酸序列的多肽：SEQ ID No. 4；或SEQID No. 12；或SEQ ID No. 16；或SEQ ID No. 20；或SEQ ID No. 24；或SEQ ID No. 28；或SEQ ID No. 32；或SEQ ID No. 36，或者其功能变体或功能片段或直向同源物；或其中所述ERF基因包含如以下中所示的核苷酸序列：SEQ ID No. 1；SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 9；或SEQ ID No. 13；或SEQ ID No. 17；或SEQ ID No. 21；或SEQ ID No. 25；或SEQ ID No.29；或SEQ ID No. 33，或者其功能变体或功能片段或直向同源物。适当地，可以调节至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种或至少八种另外的Nic1 ERF。
如本文使用的，“Nic2”基因座指在Nic2区域内或与Nic2区域紧密连锁的任何染色体位置或定位。
“Nic2区域”指如WO2018/237107 (通过引用并入本文)中公开的染色体区段，例如，由标记物SNP15和SNP18/19界定，并且具有与低生物碱(低尼古丁)性状相关的等位基因的染色体区段。SNP15的正向引物是SEQ ID No. 304；SNP15的反向引物是SEQ ID No. 305。SNP18的正向引物是SEQ ID No. 306；SNP18的反向引物是SEQ ID No. 307。SNP19的正向引物是SEQ ID No. 308；SNP19的反向引物是SEQ ID No. 309。
“Nic2突变”指Nic2基因座中的突变。
在一个方面，Nic1基因座包含选自表1的一种或多种序列。
在一个方面，Nic2基因座包含选自以下的一种或多种序列：SEQ ID No. 69、SEQID No. 37、SEQ ID No. 41、SEQ ID No. 45、SEQ ID No. 49、SEQ ID No. 3、SEQ ID No.57、SEQ ID No. 61或SEQ ID No. 65，或者与其具有至少80%同一性(与其至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%同一性)的序列，或者所述基因的功能变体或功能片段或直向同源物。
在一个方面，Nic2基因座包含至少SEQ ID No. 69，或者与其具有至少80%同一性(与其至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%同一性)的序列，或者所述基因的功能变体或功能片段或直向同源物。
在另一个方面，Nic2基因座包含选自以下的序列或在选自以下的序列的50、100、200、300、400、500、6000、700、800、900、1000、1500、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、15000、20000、30000 40000、50000、60000、70000个核苷酸内的染色体区段：SEQ ID No. 69、SEQ ID No. 37、SEQ ID No. 41、SEQ ID No. 45、SEQ ID No. 49、SEQID No. 3、SEQ ID No. 57、SEQ ID No. 61和SEQ ID No. 65。
如本文使用的，“Nic2基因”指在Nic2基因座处或附近的基因，并且包括例如表2中列出的基因；或者与其具有至少80%同一性(与其至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%同一性)的序列，或者所述基因的功能变体或功能片段或直向同源物。
至少一种Nic2 ERF基因可以选自：编码多肽的基因，所述多肽包含如以下中所示的氨基酸序列：SEQ ID No. 72；或SEQ ID No. 40；或SEQ ID No. 44；或SEQ ID No. 48；或SEQ ID No. 52；或SEQ ID No. 56；或SEQ ID No. 60、SEQ ID No. 64或SEQ ID No. 68，或者其功能变体或功能片段或直向同源物；或其中所述ERF基因包含如以下中所示的核苷酸序列：SEQ ID No. 69；或SEQ ID No. 37；或SEQ ID No. 41；或SEQ ID No. 45；或SEQ IDNo. 49；或SEQ ID No. 53；或SEQ ID No. 57；SEQ ID No. 61；SEQ ID No. 65；或者其功能变体或功能片段或直向同源物。
适当地，至少一种Nic2 ERF基因可以是选自表2的一种、或两种、或三种、或四种、或五种、或六种或七种、或八种(either)或九种基因。
在一个方面，至少一种Nic2 ERF基因编码包含如以下中所示的氨基酸序列的多肽：SEQ ID No. 72，或者其功能变体或功能片段或直向同源物；或其中所述Nic1 ERF基因包含如SEQ ID No. 59中所示的核苷酸序列、或者其功能变体或功能片段或直向同源物。
术语“调节”在本文中用于意指增加或降低。
术语“增加生物碱含量”在本文中用于意指，与尚未根据本发明进行修饰的可比较产物相比，在本发明的产物(例如植物、其部分(例如叶片)、加工叶片或由植物制备的产物(例如递送系统))中的浓度和/或总生物碱含量更高。
术语“降低生物碱含量”在本文中用于意指，与尚未根据本发明进行修饰的可比较产物相比，在本发明的产物(例如植物、其部分(例如叶片)、加工叶片或由植物制备的产物(例如递送系统))中的浓度和/或总生物碱含量更低。
在一个方面，根据本发明的烟草植物或其部分或烟草细胞包含小于3%、小于2.75%、小于2.5%、小于2.25%、小于2%、小于1.75%、小于1.5%、小于1.25%、小于1%、小于0.9%、小于0.8%、小于0.7%、小于0.6%、小于0.5%、小于0.4%、小于0.3%、小于0.2%、小于0.1%或小于0.05%的总生物碱水平。
在一个方面，根据本发明的烟草植物或其部分或烟草细胞包含小于3%、小于2.75%、小于2.5%、小于2.25%、小于2%、小于1.75%、小于1.5%、小于1.25%、小于1%、小于0.9%、小于0.8%、小于0.7%、小于0.6%、小于0.5%、小于0.4%、小于0.3%、小于0.2%、小于0.1%或小于0.05%的尼古丁水平。在一个方面，根据本发明的烟草植物或其部分或烟草细胞包含可比较植物或其部分或细胞的生物碱水平或尼古丁水平的小于1%、小于2%、小于5%、小于10%、小于15%、小于20%、小于25%、小于30%、小于40%、小于50%、小于60%、小于70%、小于80%的生物碱水平或尼古丁水平。
在一个实施方案中，本发明提供了调节(例如减少)植物(例如烟草植物)或其部分中的烟草特有亚硝胺(TSNA)或TSNA前体含量的方法，所述方法包括通过调节至少一种Nic3基因的活性或表达来修饰所述植物。适当地，该方法可以包括调节(例如降低)至少一种Nic3基因、以及任选地至少一种Nic1 ERF基因和/或至少一种Nic2 ERF基因的活性或表达。
在一个实施方案中，TSNA是N'亚硝基降烟碱(NNN)和/或前体是降烟碱。
在一个实施方案中，TSNA可以是选自以下的组中的一种或多种：N'-亚硝基降烟碱(NNN)、N'亚硝基新烟草碱(NAT)、N'-亚硝基新烟碱(NAB)和4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)。
在一个优选的实施方案中，TSNA是N'-亚硝基降烟碱(NNN)。
TSNA可以在加工烟草例如调制后的烟草或再造烟草中进行测量。在一个实施方案中，TSNA含量在调制后的烟草植物或其部分(例如调制后的烟草叶片)中进行测量和/或改变(例如减少)。
如本文使用的，术语“烟草特有亚硝胺”或“TSNA”具有其在本领域中的通常含义，即仅在递送系统或其它含尼古丁的产物中发现的亚硝胺。适当地，至少一种烟草特有亚硝胺可以是N'-亚硝基降烟碱(NNN)、4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N'-亚硝基新烟草碱(NAT)或N'-亚硝基新烟碱(NAB)。
当关于至少一种烟草特有亚硝胺使用时，术语“其前体”指烟草植物的一种或多种化学药品或化合物，其引起烟草特有亚硝胺的形成或与导致烟草特有亚硝胺产生的亚硝化反应有关。
在一个实施方案中，TSNA的前体是选自降烟碱、新烟碱、新烟草碱和尼古丁的氧化衍生物如假氧化尼古丁(PON)的组中的一种或多种。
在一个优选的实施方案中，TSNA的前体是降烟碱。
TSNA (例如NNN、NNK、NAB和/或NAT)的前体可以在绿色烟草叶片中，例如在加工之前，例如在调制之前进行测量。在一个实施方案中，TSNA (例如NNN、NNK、NAB和/或NAT)的前体在绿色烟草叶片中，例如在加工之前，例如在调制之前进行测量和/或减少。
在一个实施方案中，当与尚未根据本发明进行修饰的烟草植物(或其部分)相比较时，实施本发明的方法和或用途导致修饰的烟草植物(或其部分)或烟草细胞中的至少一种TSNA或其前体的减少。
术语“减少至少一种TSNA或其前体”或“至少一种TSNA或其前体的减少”在本文中用于意指，相对于可比较的产物、方法或用途，本发明的产物、方法或用途中的至少一种TSNA或其前体的浓度和/或总含量较低。例如，可比较的递送系统将衍生自这样的烟草植物，其尚未根据本发明进行修饰，但其中所有其它有关特征都是相同的(例如植物物种、生长条件、加工烟草的方法等)。
可以使用本领域已知的用于确定至少一种TSNA或其前体的浓度和/或水平的任何方法。特别地，可以使用这种方法，其可以包括添加氘标记的内标、水提取和过滤，随后为使用具有串联质谱分析法的反相高效液相层析(LC-MS/MS)的分析。用于确定烟草特有亚硝胺前体的浓度和/或水平的其它实例包括方法，例如CORESTA推荐的方法CRM-72：通过LC-MS/MS确定烟草和烟草产物中的烟草特有亚硝胺(CORESTA recommended method CRM-72:Determination of Tobacco Specific Nitrosamines in Tobacco and Deliverysystems by LC-MS/MS)；正被开发为ISO/DIS 21766的CRM或Wagner等人AnalyticalChemistry(2005)，77 (4)，1001-1006中详述的方法，其全部通过引用并入本文。
适当地，可以通过实施本发明的方法和/或用途来减少至少一种烟草特有亚硝胺或其前体的浓度和/或总含量。适当地，当与尚未根据本发明进行修饰的烟草植物中的至少一种烟草特有亚硝胺或其前体的浓度和/或水平相比较时，至少一种烟草特有亚硝胺或其前体的浓度和/或水平在本发明(例如，通过本发明的方法和/或用途可获得或获得)的烟草植物中可以是减少的。
当与可得自或得自尚未根据本发明进行修饰的烟草植物(或烟草植物的部分或烟草细胞培养物)的烟草叶片、收获的叶片、加工烟草叶片、递送系统或其组合相比较时，至少一种烟草特有亚硝胺或其前体的浓度和/或总含量在可得自或得自本发明的烟草植物(或烟草植物的部分或烟草细胞培养物)的烟草叶片、收获的叶片、加工烟草叶片、递送系统或其组合中可以是减少的。
适当地，至少一种烟草特有亚硝胺或其前体的浓度和/或总含量在加工烟草叶片中可以是减少的。
适当地，至少一种烟草特有亚硝胺或其前体的浓度和/或水平在递送系统中可以是减少的。
在一个实施方案中，至少一种烟草特有亚硝胺或其前体可以减少至少约1%、至少约3%、至少约5%、至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%或至少约90%。在一些实施方案中，至少一种烟草特有亚硝胺或其前体可以减少约5%至约95%、约10%至约90%、20%至约80%、30%至约70%或约40%至60%。
关于加工(例如调制后的)烟草叶片(例如调制后的或再造的)，至少一种烟草特有亚硝胺或其前体可以减少约5000 ng/g至约50 ng/g、约4000 ng/g至约100 ng/g、约3000ng/g至500 ng/g、或2000 ng/g至1000 ng/g。在一些实施方案中，至少一种烟草特有亚硝胺或其前体可以减少至少约5000 ng/g、至少约4000 ng/g、至少约3000 ng/g、至少约2000ng/g、至少约1000 ng/g、至少约500 ng/g、至少约100 ng/g或至少约50 ng/g。
如本文定义的术语“可比较产物”将是衍生自植物(例如烟草植物)的产物，所述植物尚未根据本发明进行修饰，但其中所有其它有关特征是相同的(例如植物物种、生长条件、加工植物如烟草的方法等)。根据本发明的可比较产物可以意指可得自或得自尚未根据本发明进行修饰，例如，以调节Nic3基因(或者与一种或多种Nic2 ERF基因组合的一种或多种Nic1 ERF基因组合的Nic3基因)的活性或表达的植物的烟草植物细胞或植物(例如烟草植物)或其部分，例如叶片(例如烟草叶片)、收获的叶片(例如收获的烟草叶片)、切割的收获的叶片(例如切割的收获的烟草叶片)、加工叶片(例如加工烟草叶片)、或植物繁殖材料(例如烟草植物繁殖材料)、或包含所述植物或其部分的产物，例如递送系统或其组合。可比较产物也可以称为对照或野生型。
如本文定义的术语“未修饰的植物”将是这样的植物(例如烟草植物)，其尚未根据本发明进行修饰，以调节Nic3基因的活性或表达，并且其中所有其它有关特征是相同的(例如植物物种、生长条件、加工烟草的方法等)。
Nic3基因(或Nic1 ERF基因或Nic2 ERF基因)的“活性或表达”可以指转录、翻译即蛋白质表达、或由Nic3基因(或分别地Nic1 ERF或Nic2 ERF基因)编码的蛋白质的活性水平。Nic3基因的活性涉及其充当生物碱生物合成且特别是尼古丁生物合成的调节剂的能力。Nic1 ERF基因(或Nic2 ERF基因)的活性涉及其在生物碱的生物合成中充当转录因子的能力。Nic3基因(或Nic1 ERF基因或Nic2 ERF基因)的活性可以通过测量生物碱合成的产物，即通过测量生物碱含量来确定。
根据本发明的一个方面，可以通过抑制转录和/或翻译来降低(或抑制)基因表达。在一个实施方案中，基因的活性或表达可以指转录水平，即产生的mRNA的量，或翻译水平，即产生的蛋白质的水平或量。
在一些实施方案中，生物碱含量的调节指生物碱含量的增加，其中至少一种Nic3基因的活性或表达是调节的。
在一些实施方案中，生物碱含量的调节指生物碱含量的降低，其中至少一种Nic3基因的活性或表达是调节的。
在一些实施方案中，生物碱含量的调节指生物碱含量的增加，其中至少一种Nic3基因的活性或表达、以及任选地至少一种Nic1 ERF基因和/或Nic2 ERF的活性或表达以组合进行调节。
在一些实施方案中，生物碱含量的调节指生物碱含量的降低，其中至少一种Nic3基因的活性或表达、以及任选地至少一种Nic1 ERF基因和/或Nic2 ERF的活性或表达以组合进行调节。
在一个进一步方面，从叶片测量生物碱的含量。在一个方面，从绿色叶片测量生物碱含量。在一个进一步方面，从调制后的叶片，例如晾制(air-cured)、火管烘烤(flue-cured)、明火烘烤(fire-cured)或晒制(sun-cured)叶片测量生物碱含量。在一个进一步方面，从火管烘烤的叶片测量生物碱含量。在一个进一步方面，从晾制叶片测量生物碱含量。
术语“生物碱含量”在本文中用于意指分类为生物碱的整组化合物的浓度和/或总量。烟草中一般存在的生物碱包括尼古丁、新烟草碱、新烟碱、米喔斯明和降烟碱。在一个实施方案中，选自尼古丁、新烟草碱、新烟碱、米喔斯明和降烟碱的一种或多种生物碱的含量是调节的。在一个实施方案中，选自尼古丁、新烟草碱、新烟碱、米喔斯明和降烟碱的一种或多种生物碱的含量是减少的。在一个实施方案中，选自尼古丁、新烟草碱、新烟碱、米喔斯明和降烟碱的一种或多种生物碱的含量是增加的。适当地，尼古丁含量是调节的。在一个实施方案中，尼古丁含量是减少的。
可以使用本领域已知的用于确定生物碱的浓度和/或总量的任何方法。用于分析生物碱含量的一种优选方法涉及通过气相层析-火焰电离检测方法(GC-FID)的分析。
在一个实施方案中，提供了用于生产以下的方法：通过本发明的植物可获得或获得的植物(例如烟草植物)或其部分、植物繁殖材料(例如烟草植物繁殖材料)、细胞(例如烟草细胞)、叶片(例如烟草叶片)、收获的叶片(例如收获的烟草叶片)、切割的收获的叶片(例如切割的收获的烟草叶片)、加工叶片(例如加工烟草叶片)、切割且加工的叶片(例如切割且加工的烟草叶片)、包含所述植物或其部分的产物(例如递送系统)或其组合，所述本发明的植物具有调节的生物碱含量，所述方法包括修饰所述烟草，以调节Nic3基因或Nic3基因与至少一种Nic1 ERF基因和/或至少一种Nic2 ERF基因的组合的活性或表达。调节的生物碱含量可以通过将以下中的生物碱含量与可比较产物进行比较来确定：植物(例如烟草植物)或其部分、植物繁殖材料(例如烟草植物繁殖材料)、细胞(例如烟草细胞)、叶片(例如烟草叶片)、收获的叶片(例如收获的烟草叶片)、切割的收获的叶片(例如切割的收获的烟草叶片)、加工叶片(例如加工烟草叶片)、切割且加工的叶片(例如切割且加工的烟草叶片)、包含本发明的植物或其部分的产物例如递送系统或其组合。
适当地，生物碱含量可以在植物，例如烟草植物，例如修饰的烟草植物中进行调节。适当地，生物碱含量可以在叶片(例如烟草叶片，例如来自修饰的烟草植物的烟草叶片)中进行调节。适当地，生物碱含量可以在收获的叶片(例如来自修饰的烟草植物的收获的烟草叶片)中进行调节。适当地，生物碱含量可以在切割的收获的叶片(例如来自修饰的烟草植物的切割的收获的烟草叶片)中进行调节。适当地，生物碱含量可以在加工叶片(例如加工烟草叶片，例如来自修饰的烟草植物的加工烟草叶片)中进行调节。适当地，生物碱含量可以在切割且加工的叶片(例如切割且加工的烟草叶片，例如来自修饰的烟草植物的切割且加工的烟草叶片)中进行调节。适当地，生物碱含量可以在调制后的叶片(例如来自修饰的烟草植物的调制后的烟草叶片)中进行调节。适当地，生物碱含量可以在绿色叶片(例如来自修饰的烟草植物的绿色烟草叶片)的提取物中进行调节。适当地，生物碱含量可以在包含本发明植物或其部分的产物(例如递送系统，例如由修饰的烟草植物或其部分生产的递送系统)中进行调节。适当地，生物碱含量可以在任何一种上述产物或其组合中进行调节。适当地，上述生物碱含量的调节可以是生物碱含量的增加。适当地，上述生物碱含量的调节可以是生物碱含量的降低。
在一个实施方案中，选自尼古丁、新烟草碱、新烟碱、米喔斯明和降烟碱的一种或多种生物碱的含量是降低的。
适当地，上述生物碱含量的调节可以是尼古丁含量的降低。
在一个实施方案中，修饰的烟草细胞、或修饰的植物或其部分(例如烟草植物)、植物繁殖材料(例如烟草植物繁殖材料)、叶片(例如烟草叶片)、收获的叶片(例如收获的烟草叶片)、切割的收获的叶片(例如切割的收获的烟草叶片)、加工叶片(例如加工烟草叶片)、切割且加工的叶片(例如切割且加工的烟草叶片)、或来自修饰的烟草植物的递送系统的尼古丁含量是降低的。
在一个实施方案中，当分别与已在相似的生长条件下生长，尚未进行修饰以调节至少一种Nic3基因(或者与至少一种Nic1 ERF和/或至少一种Nic2 ERF基因组合的至少一种Nic3基因)的活性或表达的植物(例如烟草植物)或其部分的生物碱含量相比较时，植物(例如烟草植物)或其部分的生物碱含量可以被调节到至少2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。适当地，生物碱含量可以被调节(例如减少)到约2倍至约10倍，优选约3倍至约10倍，适当地约3倍至约5倍。适当地，修饰可以是生物碱含量的增加或降低。适当地，调节(例如减少)可以是选自尼古丁、新烟草碱、新烟碱、米喔斯明和降烟碱的一种或多种生物碱的调节。适当地，尼古丁含量是减少的。
在本发明的一个实施方案中，与尚未根据本发明进行修饰的细胞或植物(例如烟草植物)或其部分相比，烟草植物细胞或植物(例如烟草植物)或其部分的生物碱含量可以被调节1%、2%、5%、8%、10%、12%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。当与未修饰的植物(例如烟草植物)或其部分相比较时，调节可以是生物碱含量的增加或降低。适当地，调节可以是总生物碱含量的调节。适当地，调节可以是选自尼古丁、新烟草碱、新烟碱、米喔斯明和降烟碱的一种或多种生物碱的调节。适当地，尼古丁含量是减少的。
在一个实施方案中，与尚未进行修饰以调节Nic3基因(或者Nic3基因和Nic1 ERF基因和/或Nic2 ERF基因的组合)的活性或表达的植物(例如烟草植物)或其部分或细胞相比，并且更特别地，与在所引入修饰的不存在下植物(例如烟草植物)的表达相比较或相对比，该方法或用途导致调节的生物碱含量。
在一个实施方案中，与尚未进行修饰以对Nic3基因(或者Nic3基因和Nic1 ERF基因和/或Nic2 ERF基因的组合)引入突变的植物(例如烟草植物)或其部分或细胞相比，并且更特别地，与在所引入修饰的不存在下的植物(例如烟草植物)或其部分或细胞相比较或相对比，该方法或用途导致调节的生物碱含量。
在一个实施方案中，植物(例如烟草植物)或其部分或细胞已进行修饰，以实现分别与尚未进行修饰以调节至少一种Nic3基因(或者至少一种Nic3基因和至少一种Nic1 ERF基因和/或至少一种Nic2 ERF基因)的活性或表达的植物(例如烟草植物)或其部分相比，生物碱含量的调节。本文提及Nic3和Nic1和/或Nic2 (当提及基因座或基因时)涉及选项i)Nic3和Nic1，ii) Nic3和Nic 2，以及iii) Nic3、Nic1和Nic 2。
如本文使用的，术语“修饰”或“修饰的”意指已改变或变化的细胞(例如烟草细胞)、植物(例如烟草植物)。本发明包含使用用于植物的遗传修饰或植物的非遗传修饰的技术的植物修饰。这种方法是本领域众所周知的，并且遗传修饰技术的实例包括转化、转基因、同源转基因(cisgenics)和基因编辑方法。非遗传修饰技术的实例包括快中子诱变、化学诱变例如甲基磺酸乙酯(EMS)诱变和现代种群分析方法。
在一个实施方案中，选择具有修饰的Nic3基因(或者与至少一种修饰的Nic1 ERF基因和/或至少一种修饰的Nic2 ERF基因组合的修饰的Nic3基因)的天然变体，并且将该性状或基因培育到具有商业上期望的性状的第二植物内。
在一个实施方案中，根据本发明的细胞或植物(例如烟草植物)可以是转基因细胞植物。
在另一个实施方案中，根据本发明的细胞植物(例如烟草植物)可以是非转基因细胞或植物。
适当地，根据本发明的至少一种Nic3基因中的突变可能不存在于K326中。
适当地，根据本发明的至少一种Nic3基因中的突变可能不存在于Green Briar中。
适当地，至少一种Nic3基因的调节不存在于白肋烟21中。
在一些实施方案中，调节至少一种Nic3基因的活性或表达，且从而调节生物碱含量的修饰选自：降低、阻止或减弱至少一种Nic3基因(或者至少一种Nic3基因和至少一种Nic1 ERF基因和/或至少一种Nic2 ERF基因的组合)的转录、翻译或表达；
抑制由至少一种Nic3基因(或者至少一种Nic3基因和至少一种Nic1 ERF基因和/或至少一种Nic2 ERF基因的组合)编码的多肽的合成，或其从细胞内储库(intracellularstore)的释放；或
增加由至少一种Nic3基因(或者以组合的至少一种Nic3基因和至少一种Nic1 ERF基因和/或至少一种Nic2 ERF基因的组合)编码的多肽的降解率。
在一个实施方案中，降低至少一种Nic3基因的活性或表达的修饰(或者降低以组合的至少一种Nic3基因和至少一种Nic1 ERF基因和/或至少一种Nic2 ERF基因的活性的一种或多种修饰)包含一种或多种基因中的突变。
在一个实施方案中，突变缺失整体的一种或多种Nic3基因。适当地，突变可以缺失一种或多种Nic1 ERF基因。适当地，突变可以缺失一种或多种Nic2 ERF基因。
在一个实施方案中，一种或多种Nic3基因可以包含在基因内的一种或多种突变。适当地，一种或多种突变导致突变基因的基因活性减少或消除。在一个实施方案中，一种或多种突变导致无活性基因。在一个实施方案中，突变导致氨基酸取代。在一个实施方案中，突变是无义突变。适当地，突变可以抑制由基因例如Nic3基因编码的蛋白质的正常功能，例如在转录因子的情况下抑制DNA结合。
例如，本方法可以包括：
• 提供核酸序列中的突变，所述核酸序列编码表3中列出的蛋白质、或与其具有至少70% (优选至少80%、优选至少90%、优选至少96%、优选至少98%)序列同一性的氨基酸序列；
• 提供编码蛋白质的核酸序列的启动子中的突变，所述蛋白质包含表3中所示的氨基酸序列、或与其具有至少70% (优选至少80%、优选至少90%、优选至少96%、优选至少98%)序列同一性的氨基酸序列
• 提供以下中的突变：表3中列出的Nic3基因的核酸序列、或与其具有至少70%(优选至少80%、优选至少90%、优选至少96%、优选至少98%)序列同一性的核苷酸序列；
• 提供以下的启动子中的突变：表3中列出的Nic3基因的核酸序列、或与其具有至少70% (优选至少80%、优选至少90%、优选至少96%、优选至少98%)序列同一性的核苷酸序列；
• 提供减少核酸序列水平的反义RNA、siRNA或miRNA，所述核酸序列编码表3中列出的Nic3蛋白、或与其具有至少70% (优选至少80%、优选至少90%、优选至少96%、优选至少98%)序列同一性的氨基酸序列；
• 提供减少以下的水平的反义RNA、siRNA或miRNA：表3中列出的核酸序列、或与其具有至少70% (优选至少80%、优选至少90%、优选至少96%、优选至少98%)序列同一性的序列。适当地，表3中列出的蛋白质或表3中所示的氨基酸序列选自SEQ ID No. 75、120、127和129 (或其如上文所述的相关序列)。适当地，表3中列出的基因或序列选自SEQ ID No. 73、118、124和127 (或其如上文所述的相关序列)。
在一个实施方案中，Nic3基因座中的至少一种突变(或者一种或多种突变)在选自SEQ ID No. 73、118、124或127的Nic3基因，或者与其具有至少90%同一性的序列，或者所述基因的功能变体或功能片段或直向同源物中，并且所述Nic3基因中的至少一种突变选自：
i) Nic3基因SEQ ID No. 73、或者与其具有至少90%同一性的序列、或者所述基因的功能变体或功能片段或直向同源物中的突变，其导致SEQ ID No. 75的氨基酸残基74至258或483-538、或者与其具有至少90%同一性的序列、或者所述多肽的功能变体或功能片段或直向同源物中的突变；
ii) Nic3基因SEQ ID No. 118、或者与其具有至少90%同一性的序列、或者所述基因的功能变体或功能片段或直向同源物中的突变，其导致SEQ ID No. 120的氨基酸残基120-584、或者与其具有至少90%同一性的序列、或者所述多肽的功能变体或功能片段或直向同源物中的突变；
iii) Nic3基因SEQ ID No. 124、或者与其具有至少90%同一性的序列、或者所述基因的功能变体或功能片段或直向同源物中的突变，其导致SEQ ID No. 126的氨基酸残基166-406或483-970、或者与其具有至少90%同一性的序列、或者所述多肽的功能变体或功能片段或直向同源物中的突变；和
iv) Nic3基因SEQ ID No. 127、或者与其具有至少90%同一性的序列、或者所述基因的功能变体或功能片段或直向同源物中的突变，其导致SEQ ID No. 129的氨基酸残基171-406或509-967、或者与其具有至少90%同一性的序列、或者所述多肽的功能变体或功能片段或直向同源物中的突变。
SEQ ID No. 75的氨基酸残基74至258提供了MYC转录因子的N末端MYC结构域。SEQID No. 75的氨基酸残基483-538提供了具有几个DNA结合位点((其适当地提供了用于突变的位点)，即在氨基酸残基488、489、492、493、500、517和518处)的bHLH结构域。SEQ ID No.120的氨基酸残基120至584提供了LRR结构域。SEQ ID No. 124的氨基酸残基166至406提供了NB-ARC结构域，并且氨基酸残基483-970提供了LRR结构域。SEQ ID No. 129的氨基酸残基171-406提供了NB-ARC结构域，并且氨基酸残基509-967提供了LRR结构域。突变的位点也可以通过参考编码核苷酸进行描述，例如SEQ ID No. 75的氨基酸残基74至258由SEQ IDNo. 73的核苷酸631-1185编码。
如上所述，在特定基因或相关序列(如本文定义的)中制备突变，并且提供了在所述氨基酸或相关序列(如本文定义的)中的突变。相关序列彼此相对应。例如，如果在其中与SEQ ID No. 75具有90%序列同一性的序列中制备突变，则在该相关序列的背景下制备所得到的突变体，即在考虑已引入的一种或多种突变之前提供具有相同序列同一性的序列。当相关序列进行突变时，在对应于上述结构域的序列中制备突变，即考虑到起因于相关序列的生成的氨基酸数目的任何变化。
在一个实施方案中，突变可以是缺失。例如，上述结构域可以是部分或其整体的缺失。在一个实施方案中，突变可以是插入。在一个实施方案中，突变可以引入早期终止密码子。在一个实施方案中，靶位点对于靶Nic3基因是唯一的并且不存在于其它基因中。
在一个实施方案中，突变体具有减少的总生物碱和/或减少的尼古丁水平。
在一个实施方案中，本发明提供了编码多肽的Nic1 ERF基因中的一种或多种突变，所述多肽包含如表1中所示的氨基酸序列，或与其具有至少90%，优选至少96%同一性的序列(或由其组成)。
适当地，本发明可以提供编码多肽的Nic1 ERF基因中的一种或多种突变，所述多肽包含氨基酸序列SEQ ID No. 8，或与其具有至少90%，优选至少96%同一性的序列(或由其组成)。
适当地，本发明可以提供Nic1 ERF基因中的一种或多种突变，所述Nic1 ERF基因包含如SEQ ID No. 5中所示的核苷酸序列，或与其具有至少90%，优选至少96%同一性的序列(或由其组成)。
例如，本方法可以包括：
• 提供编码蛋白质的核酸序列中的突变，所述蛋白质包含显示为以下的氨基酸序列：SEQ ID No. 8；或SEQ ID No. 4；或SEQ ID No. 12；或SEQ ID No. 16；或SEQ ID No.20；或SEQ ID No. 24；或SEQ ID No. 28；或SEQ ID No. 32；或SEQ ID No. 36，或与其具有至少70% (优选至少80%、优选至少90%、优选至少96%、优选至少98%)序列同一性的氨基酸序列；
• 提供编码蛋白质的核酸序列的启动子中的突变，所述蛋白质包含显示为以下的氨基酸序列：SEQ ID No. 8；或SEQ ID No. 4；或SEQ ID No. 12；或SEQ ID No. 16；或SEQID No. 20；或SEQ ID No. 24；或SEQ ID No. 28；或SEQ ID No. 32；或SEQ ID No. 36，或与其具有至少70% (优选至少80%、优选至少90%、优选至少96%、优选至少98%)序列同一性的氨基酸序列；
• 提供ERF基因的核酸序列中的突变，所述核酸序列包含SEQ ID No. 5；或SEQ IDNo. 1；或SEQ ID No. 3；或SEQ ID No. 9；或SEQ ID No. 13；或SEQ ID No. 17；或SEQ IDNo. 21；或SEQ ID No. 25；或SEQ ID No. 29；或SEQ ID No. 33，或与其具有至少70% (优选至少80%、优选至少90%、优选至少96%、优选至少98%)序列同一性的核苷酸序列；
• 提供ERF基因的核酸序列的启动子中的突变，所述核酸序列包含SEQ ID No. 5；或SEQ ID No. 1；或SEQ ID No. 3；或SEQ ID No. 9；或SEQ ID No. 13；或SEQ ID No. 17；或SEQ ID No. 21；或SEQ ID No. 25；或SEQ ID No. 29；或SEQ ID No. 33，或与其具有至少70% (优选至少80%、优选至少90%、优选至少96%、优选至少98%)序列同一性的核苷酸序列；
• 提供减少编码蛋白质的核酸序列水平的反义RNA、siRNA或miRNA；所述蛋白质包含显示为以下的氨基酸序列：SEQ ID No. 8；或SEQ ID No. 4；或SEQ ID No. 12；或SEQ IDNo. 16；或SEQ ID No. 20；或SEQ ID No. 24；或SEQ ID No. 28；或SEQ ID No. 32；或SEQID No. 36，或与其具有至少70% (优选至少80%、优选至少90%、优选至少96%、优选至少98%)序列同一性的氨基酸序列；
• 提供减少以下的水平的反义RNA、siRNA或miRNA：核酸序列SEQ ID No. 5；或SEQID No. 1；或SEQ ID No. 3；或SEQ ID No. 9；或SEQ ID No. 13；或SEQ ID No. 17；或SEQID No. 21；或SEQ ID No. 25；或SEQ ID No. 29；或SEQ ID No. 33，或与其具有至少70%(优选至少80%、优选至少90%、优选至少96%、优选至少98%)序列同一性的核苷酸序列。
在一个实施方案中，一种或多种Nic1 ERF基因和/或一种或多种Nic2 ERF基因是调节的(例如突变的)。
适当地，本文教导的任何一种Nic3基因和/或Nic1 ERF基因修饰(例如突变)可以与Nic2 ERF基因的一种或多种修饰组合使用，其中所述Nic2 ERF基因编码包含如以下中所示的氨基酸序列的多肽：SEQ ID No. 72；或SEQ ID No. 40；或SEQ ID No. 44；或SEQ IDNo. 48；或SEQ ID No. 52；或SEQ ID No. 56；或SEQ ID No. 60；或SEQ ID No. 64；或SEQID No. 68；或者其功能变体或功能片段或直向同源物；或者所述Nic2 ERF基因包含如以下中所示的核苷酸序列：SEQ ID No. 69；SEQ ID No. 37；或SEQ ID No. 41；或SEQ ID No.45；或SEQ ID No. 49；或SEQ ID No. 53；或SEQ ID No. 57；或SEQ ID No. 61；或SEQ IDNo. 65；或者其功能变体或功能片段或直向同源物。
例如，本方法可以包括：
• 提供编码蛋白质的核酸序列中的突变，所述蛋白质包含显示为以下的氨基酸序列：SEQ ID No. 72；或SEQ ID No. 40；或SEQ ID No. 44；或SEQ ID No. 48；或SEQ ID No.52；或SEQ ID No. 56；或SEQ ID No. 60；或SEQ ID No. 64；或SEQ ID No. 68，或与其具有至少70% (优选至少80%、优选至少90%、优选至少96%、优选至少98%)序列同一性的氨基酸序列；
• 提供编码蛋白质的核酸序列的启动子中的突变，所述蛋白质包含显示为以下的氨基酸序列：SEQ ID No. 72；或SEQ ID No. 40；或SEQ ID No. 44；或SEQ ID No. 48；或SEQ ID No. 52；或SEQ ID No. 56；或SEQ ID No. 60；或SEQ ID No. 64；或SEQ ID No.68，或与其具有至少70% (优选至少80%、优选至少90%、优选至少96%、优选至少98%)序列同一性的氨基酸序列；
• 提供ERF基因的核酸序列中的突变，所述核酸序列包含SEQ ID No. 69；或 SEQID No. 37；或SEQ ID No. 41；或SEQ ID No. 45；或SEQ ID No. 49；或SEQ ID No. 53；或SEQ ID No. 57；或SEQ ID No. 61；或SEQ ID No. 65，或与其具有至少70% (优选至少80%、优选至少90%、优选至少96%、优选至少98%)序列同一性的核苷酸序列；
• 提供ERF基因的核酸序列的启动子中的突变，所述核酸序列包含SEQ ID No.69；或 SEQ ID No. 37；或SEQ ID No. 41；或SEQ ID No. 45；或SEQ ID No. 49；或SEQ IDNo. 53；或SEQ ID No. 57；或SEQ ID No. 61；或SEQ ID No. 65，或与其具有至少70% (优选至少80%、优选至少90%、优选至少96%、优选至少98%)序列同一性的核苷酸序列；
• 提供减少编码蛋白质的核酸序列水平的反义RNA、siRNA或miRNA；所述蛋白质包含显示为以下的氨基酸序列：SEQ ID No. 72；或SEQ ID No. 40；或SEQ ID No. 44；或SEQID No. 48；或SEQ ID No. 52；或SEQ ID No. 56；或SEQ ID No. 60；或SEQ ID No. 64；或SEQ ID No. 68，或与其具有至少70% (优选至少80%、优选至少90%、优选至少96%、优选至少98%)序列同一性的氨基酸序列；
• 提供减少以下的水平的反义RNA、siRNA或miRNA：核酸序列SEQ ID No. 69；或SEQ ID No. 37；或SEQ ID No. 41；或SEQ ID No. 45；或SEQ ID No. 49；或SEQ ID No.53；或SEQ ID No. 57；或SEQ ID No. 61；或SEQ ID No. 65；或SEQ ID No. 33，或与其具有至少70% (优选至少80%、优选至少90%、优选至少96%、优选至少98%)序列同一性的核苷酸序列。
在一个实施方案中，存在至少一种Nic1 ERF基因中的突变和/或至少一种Nic2 ERF基因中的突变的组合使用，所述至少一种Nic1 ERF基因中的突变选自以下：编码蛋白质的核酸序列中的一种或多种突变，所述蛋白质包含显示为SEQ ID No. 4；或SEQ ID No. 8；或SEQ ID No. 12；或SEQ ID No. 16；或SEQ ID No. 20；或SEQ ID No. 24；或SEQ ID No.28；或SEQ ID No. 32；或SEQ ID No. 36的氨基酸序列，或与其具有至少70% (优选至少80%、优选至少90%、优选至少96%、优选至少98%)序列同一性的氨基酸序列，或者ERF基因的核酸序列中的一种或多种突变，所述核酸序列包含SEQ ID No. 1；或SEQ ID No. 3；或SEQID No. 5；或SEQ ID No. 9；或SEQ ID No. 13；或SEQ ID No. 17；或SEQ ID No. 21；或SEQID No. 25；或SEQ ID No. 29；或SEQ ID No. 33，或与其具有至少70% (优选至少80%、优选至少90%、优选至少96%、优选至少98%)序列同一性的核苷酸序列，所述至少一种Nic2 ERF基因中的突变特别是核苷酸序列中的一种或多种突变，所述核苷酸序列编码氨基酸序列SEQID No. 40、SEQ ID No. 44、SEQ ID No. 48、SEQ ID No. 52或SEQ ID No. 56、SEQ ID No.64、SEQ ID No. 68或SEQ ID No. 72，或与其具有至少70% (优选至少80%、优选至少90%、优选至少96%、优选至少98%)序列同一性的氨基酸序列，或者包含SEQ ID No. 37、SEQ ID No.41、SEQ ID No. 45、SEQ ID No. 49或SEQ ID No. 53、或SEQ ID No. 57或SEQ ID No. 61或SEQ ID No. 65或SEQ ID No. 69的核酸序列，或与其具有至少70% (优选至少80%、优选至少90%、优选至少96%、优选至少98%)序列同一性的核苷酸序列中的一种或多种突变，更特别地，Nic2 ERF突变是核苷酸序列中的一种或多种突变，所述核苷酸序列编码氨基酸序列SEQ ID No. 72、或与其具有至少70% (优选至少80%、优选至少90%、优选至少96%、优选至少98%)序列同一性的氨基酸序列，或者核苷酸序列SEQ ID No. 69、或与其具有至少70% (优选至少80%、优选至少90%、优选至少96%、优选至少98%)序列同一性的核苷酸序列中的一种或多种突变。
在一个实施方案中，存在至少一种Nic1 ERF基因中的突变和/或至少一种Nic2 ERF基因中的突变的任选地组合使用，所述至少一种Nic1 ERF基因中的突变由以下组成：编码蛋白质的核酸序列中的一种或多种突变，所述蛋白质包含显示为SEQ ID No. 8的氨基酸序列；或与其具有至少70% (优选至少80%、优选至少90%、优选至少96%、优选至少98%)序列同一性的氨基酸序列，或者ERF基因的核酸序列中的一种或多种突变，所述核酸序列包含SEQ ID No. 5；或与其具有至少70% (优选至少80%、优选至少90%、优选至少96%、优选至少98%)序列同一性的核苷酸序列，所述至少一种Nic2 ERF基因中的突变特别是核苷酸序列中的一种或多种突变，所述核苷酸序列编码氨基酸序列SEQ ID No. 40、SEQ ID No. 44、SEQID No. 48、SEQ ID No. 52、SEQ ID No. 56、SEQ ID No. 60、SEQ ID No. 64、SEQ ID No.68或SEQ ID No. 72，或与其具有至少70% (优选至少80%、优选至少90%、优选至少96%、优选至少98%)序列同一性的氨基酸序列，或者包含SEQ ID No. 37、SEQ ID No. 41、SEQ ID No.45、SEQ ID No. 49、SEQ ID No. 53、SEQ ID No. 57、SEQ ID No. 61、SEQ ID No. 65或SEQID No. 69的核苷酸序列，或与其具有至少70% (优选至少80%、优选至少90%、优选至少96%、优选至少98%)序列同一性的核苷酸序列中的一种或多种突变。
在一个实施方案中，存在至少一种Nic1 ERF基因中的突变和/或至少一种Nic2 ERF基因中的突变的任选地组合使用，所述至少一种Nic1 ERF基因中的突变由以下组成：编码蛋白质的核酸序列中的一种或多种突变，所述蛋白质包含显示为SEQ ID No. 8的氨基酸序列；或与其具有至少70% (优选至少80%、优选至少90%、优选至少96%、优选至少98%)序列同一性的氨基酸序列，或者ERF基因的核酸序列中的一种或多种突变，所述核酸序列包含SEQ ID No. 5；或与其具有至少70% (优选至少80%、优选至少90%、优选至少96%、优选至少98%)序列同一性的核苷酸序列，所述至少一种Nic2 ERF基因中的突变由以下组成：核苷酸序列中的一种或多种突变，所述核苷酸序列编码显示为SEQ ID No. 72的氨基酸序列、或与其具有至少70% (优选至少80%、优选至少90%、优选至少96%、优选至少98%)序列同一性的氨基酸序列，或者显示为SEQ ID No. 69的核苷酸序列、或与其具有至少70% (优选至少80%、优选至少90%、优选至少96%、优选至少98%)序列同一性的核苷酸序列中的一种或多种突变。
一种或多种Nic2 ERF基因可以是选自表2的一种、或两种、或三种、或四种、或五种、或六种、或七种或八种或九种Nic2 ERF基因。
在一些实施方案中，降低至少一种Nic3基因(或组合的至少一种Nic3基因和至少一种Nic1 ERF基因和/或至少一种Nic2 ERF基因)的活性或表达，并且从而降低生物碱含量的修饰是选自一种或多种基因中的点突变、缺失、插入、重复和倒位的一种或多种。适当地，通过选自随机诱变和靶向诱变的方法引入修饰。适当地，可以通过选自例如大范围核酸酶、锌指核酸酶、TALEN、基因编辑和CRISPR的靶向诱变方法引入修饰。
如本文使用的，术语“突变”包括天然遗传变体或改造变体。
突变指引入植物或其部分或细胞的可遗传的遗传修饰，其改变由基因编码的产物的活性或表达。这些修饰可以在控制基因活性或表达的任何序列中，例如在启动子、5'UTR、外显子、内含子、3'UTR或终止子区域中。在一个方面，突变减少、抑制或消除基因产物的表达或活性。在另一个方面，突变增加、升高或增进基因产物的活性或表达。
特别地，术语“突变”指与表1、表2或表3中所示的序列相比的氨基酸序列变化，其减少了蛋白质的表达或功能。
在一个优选的实施方案中，表1、表2或表3中所示的核酸序列，或存在于如本文定义的突变的(例如，植物中编码所述蛋白质的基因的每个基因组拷贝是突变的)植物中、与其具有至少80% (至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%)序列同一性的序列的每个拷贝。例如，烟草的异源四倍体基因组中的基因的每个拷贝都可能是突变的。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的植物或植物细胞对于突变是纯合的。
在一个实施方案中，优选地，根据本发明的植物或植物细胞仅表达突变的核酸。换言之，在一些实施方案中，在根据本发明的植物中不存在内源性(或内源性和功能性)蛋白质。换言之，如果存在任何内源性蛋白质，则它优选为无活性和/或截短形式。
突变可以中断编码如本文详述的蛋白质的核酸序列。
中断可以导致核酸序列不被转录和/或翻译。
可以例如通过缺失或以其它方式修饰核酸序列的ATG起始密码子来中断核酸序列，从而使得蛋白质的翻译被减少或阻止。
核酸序列可以包含减少或阻止蛋白质表达或者影响蛋白质运输的一种或多种核苷酸变化。例如，可以通过在可读框中引入一个或多个提前终止密码子、移码、剪接突变体或非耐受的氨基酸取代，来减少或阻止蛋白质的表达。
提前终止密码子指这样的突变，其将终止密码子引入可读框内，并且阻止整个氨基酸序列的翻译。提前终止密码子可以是TAG (“琥珀”)、TAA (“赭石”)或TGA (“乳白”或“棕土”)密码子。
适当地，可以将提前终止密码子引入Nitab4.5_0003090g0030.1 (ERF199)中；如SEQ ID No. 5-7的任一个中所示。
适当地，如SEQ ID No. 5-7的任一个中所示，Nitab4.5_0003090g0030.1(ERF199)中的提前终止密码子可以是TGA (“乳白”或“棕土”)提前终止密码子。
移码突变(也称为读框错误(framing error)或读框移位)是由核酸序列中不能被三除尽的多个核苷酸的插入/缺失(插入或缺失)引起的突变。由于通过密码子的基因表达的三联体特性，插入或缺失可以改变读码框，从而导致与原始完全不同的翻译。移码突变将经常引起突变后的密码子读取，以编码不同的氨基酸。移码突变将通常导致提前终止密码子的引入。
剪接突变体在特异性位点处插入、缺失或改变许多核苷酸，在前体信使RNA加工为成熟信使RNA的过程中，在所述特异性位点处发生剪接。剪接位点的缺失导致一个或多个内含子保留在成熟mRNA中，并且可能导致异常蛋白质的产生。
非耐受的氨基酸取代指引起蛋白质中的非同义氨基酸取代的突变，其导致蛋白质的降低或除去的功能。
本领域已知的用于提供核酸序列中的突变的任何方法都可以用于本方法中。例如，可以使用同源重组，其中产生其中一种或多种有关的核酸序列突变的载体，并且用于转化植物或植物细胞。然后可以选择表达突变的序列的重组植物或植物细胞。
核酸序列可以被完全或部分缺失。缺失可以是连续的，或者可以包含序列的多个段。缺失优选去除足够量的核苷酸序列，从而使得核酸序列不再编码功能蛋白。缺失可以例如去除核酸序列的编码部分的至少50、60、70、80或90%。
当与可比较的未修饰植物的对应基因组相比较时，缺失可以是全部的，在所述情况下核酸序列的编码部分的100%不存在。
用于缺失植物中的核酸序列的方法是本领域已知的。例如，可以使用同源重组，其中产生其中一种或多种有关的核酸序列失去的载体，并且用于转化植物或植物细胞。然后可以选择表达新序列部分的重组植物或植物细胞。
根据众所周知的组织培养方法，例如通过在供应有必需生长因子如氨基酸、植物激素、维生素等的合适培养基中培养细胞，可以生长且维持用如上文所述的载体转化的植物细胞。
可以使用定向诱变方法(也称为定向核苷酸交换(targeted nucleotideexchange) (TNE)或寡核苷酸定向诱变(oligo-directed mutagenesis) (ODM))来执行核酸序列的修饰。定向诱变方法包括但不限于那些采用锌指核酸酶、TALEN (参见WO2011/072246和WO2010/079430)、Cas9-样、Cas9/crRNA/tracrRNA或Cas9/gRNA CRISPR系统(参见WO 2014/071006和WO2014/093622)、大范围核酸酶(参见WO2007/047859和WO2009/059195)的方法，或采用诱变寡核苷酸的定向诱变方法，可能含有进入植物原生质体内的与基因具有序列互补性的用于增强诱变的化学修饰的核苷酸(例如KeyBase®或TALEN)。
可替代地，诱变系统例如TILLING (定向诱导基因组局部突变(TargetingInduced Local Lesions IN Genomics)；McCallum等人，2000，Nat Biotech 18:455，以及McCallum等人2000，Plant Physiol. 123，439-442，两者均通过引用并入本文)，可以用于生成包含具有突变的编码蛋白质的基因的植物系。TILLING使用传统的化学诱变(例如甲基磺酸乙酯(EMS)诱变)，随后为突变的高通量筛选。因此，可以获得包含具有所期望的突变的基因的植物、种子和组织。
方法可以包括以下步骤：诱变植物种子(例如EMS诱变)，植物个体或DNA的合并，感兴趣的区域的PCR扩增，异源双链体形成和高通量检测，突变植物的鉴定，突变PCR产物的测序。应理解，其它诱变和选择方法可以同等地用于生成这种修饰的植物。种子可以例如进行辐射或化学处理，并且可以就修饰的表型筛选植物。
通过分子方法，例如DNA中存在的一种或多种突变，并且通过修饰的表型特征，可以将修饰的植物与未修饰的植物，即野生型植物区分开。修饰的植物对于突变可以是纯合的或杂合的。
适当地，该方法可以包括用能够抑制至少一种Nic3基因的活性或表达的遗传构建体(或能够抑制与至少一种Nic3基因组合的至少一种Nic1 ERF基因和/或至少一种Nic2 ERF基因的活性或表达的构建体)转化植物(例如烟草植物)的细胞。
在一些实施方案中，增加至少一种Nic3基因(或组合的至少一种Nic3基因和至少一种Nic1 ERF基因和/或至少一种Nic2 ERF基因)的活性或表达，且从而增加生物碱含量的修饰选自：
增加、促进或增进至少一种Nic3基因(或以组合的至少一种Nic3基因和至少一种Nic1 ERF基因和/或至少一种Nic2 ERF基因)的转录、翻译或表达；
增加由至少一种Nic3基因(或以组合的至少一种Nic3基因和至少一种Nic1 ERF基因和/或至少一种Nic2 ERF基因)编码的多肽的合成，或其从细胞内储库的释放；或
降低由至少一种Nic3基因(或以组合的至少一种Nic3基因和至少一种Nic1 ERF基因和/或至少一种Nic2 ERF基因)编码的多肽的降解率。
适当地，该方法可以包括用遗传构建体转化植物(例如烟草植物)的细胞，所述遗传构建体编码至少一种外源性Nic3基因(或编码组合的至少一种Nic3基因和至少一种Nic1 ERF基因和/或至少一种Nic2 ERF基因)，或包含编码蛋白质的核苷酸序列，所述蛋白质能够促进或增进至少一种内源性Nic3基因(或组合的至少一种内源性Nic3基因和至少一种内源性Nic1 ERF基因和/或至少一种内源性Nic2 ERF基因)。应了解，这些选项各自将导致由至少一种Nic3基因(或组合的至少一种Nic3基因和至少一种Nic1 ERF基因和/或至少一种Nic2 ERF基因)编码的多肽的活性和表达增加。该方法可以包括从转化的细胞再生植物。
因此，提供了遗传构建体的用途，所述遗传构建体能够增加由至少一种Nic3 (或以组合的至少一种Nic3基因和至少一种Nic1 ERF基因和/或至少一种Nic2 ERF基因)编码的多肽的活性和/或表达，用于增加用该构建体转化的植物中的生物碱含量。
遗传构建体可以编码包含如以下中所示的氨基酸序列的多肽：表1、表2和/或表3，或者其功能变体或功能片段或直向同源物。
在一些实施方案中，根据本发明的方法或用途包括通过增加Nic3基因的活性或表达、或Nic3基因和Nic1 ERF基因和/或Nic2 ERF基因的活性或表达，来增加植物(例如烟草植物)或细胞的生物碱含量。
如本文使用的，术语“抑制”(例如抑制Nic3基因的活性或表达)意指与基因在可比较产物中的基因活性或表达相比，该基因(例如Nic3基因)的活性或表达是减少或降低的，或者由该基因产生的蛋白质的量或活性是减少的。
在一个实施方案中，如本文使用的，术语“抑制”(例如抑制Nic3基因的活性或表达)意指与基因在可比较产物中的基因活性或表达相比，Nic3基因的活性或表达是减少的。
特异性Nic3基因、Nic1 ERF基因或Nic2 ERF基因的活性可以通过测量基因的转录进行测量。用于测量转录的方法是本领域众所周知的，并且尤其包括RNA印迹、RNA-Seq、原位杂交、DNA微阵列和RT-PCR。可替代地，可以通过测量基因产物例如由所述基因编码的蛋白质的水平，来间接测量基因的活性。
在一些实施方案中，当与尚未根据本发明进行修饰的植物(例如烟草植物)中的所述基因的活性或表达相比较时，Nic3基因、Nic1 ERF基因或Nic2 ERF基因的活性或表达可以被调节，即增加或降低至少约10%、20%、30%或40%，适当地至少约50%、60%、70%，更适当地至少约80%、90%、95%或100%。
适当地，Nic3基因、Nic1 ERF基因或Nic2 ERF基因的表达或功能可以被减少、部分失活、抑制、消除、敲除或丧失，从而使得所述基因的蛋白表达或功能是不可检测的。
在一个方面，至少一种Nic3基因、Nic1 ERF基因或Nic2 ERF基因基因被敲除。换言之，该基因已被致使完全无效。
在一个优选的实施方案中，Nic3基因可以基本上没有活性或表达，这意指优选地，当与尚未进行修饰以抑制Nic3基因的活性或表达的植物相比较时，该植物可以包含小于约1% (适当地小于约0.1%)的活性或表达。
在一个优选的实施方案中，Nic1 ERF基因可以基本上没有活性或表达，这意指，当优选地与尚未进行修饰以抑制Nic1 ERF基因的活性或表达的植物相比较时，该植物可以包含小于约1% (适当地小于约0.1%)的活性或表达。
在一个优选的实施方案中，Nic2 ERF基因可以基本上没有活性或表达，这意指，当优选地与尚未进行修饰以抑制Nic2 ERF基因的活性或表达的植物相比较时，该植物可以包含小于约1% (适当地小于约0.1%)的活性或表达。
如本文使用的，“ERF基因”指属于乙烯应答因子(ERF)亚家族的转录因子基因。
如本文使用的，“Nic1 ERF基因”指本发明人已在WO2018/237107中鉴定为映射到Nic1区域的ERF基因。如本文使用的Nic1 ERF基因连同其相应的核苷酸、cDNA、CDS和氨基酸序列标识符一起在表1中列出。
适当地，用于本发明中的至少一种Nic1 ERF基因是表1中列出的那些基因中的任何一种。
上表中列出的Nic1ERF和Nic2 ERF各自的基因组序列与其对应的编码序列相同，除了Nic1 ERFERF17L3之外。ERF17L3 (SEQ ID No. 1)的基因组序列与ERF17L3 (SEQ IDNo. 3)的编码序列不同。
如本文使用的，“Nic2 ERF基因”指映射到Nic2区域的ERF基因。如本文使用的Nic2 ERF基因连同其相应的核苷酸、cDNA、CDS和氨基酸序列标识符一起在下表2中列出。
适合地，用于本发明中的Nic2 ERF基因是表2中列出的那些基因中的任何一种。
在一个实施方案中，本文提及的至少一种Nic3基因可以由表3中所示的多核苷酸序列编码。
适当地，本文提及的至少一种Nic3基因可以由包含以下的多核苷酸序列编码：
i)本文显示为以下的多核苷酸序列：SEQ ID No. 73、SEQ ID No. 76、 SEQ IDNo. 79、SEQ ID No. 82、SEQ ID No. 85、SEQ ID No. 88、SEQ ID No. 91、SEQ ID No. 94、SEQ ID No. 97、SEQ ID No. 100、SEQ ID No. 103、SEQ ID No. 106、SEQ ID No. 109、SEQID No. 112、SEQ ID No. 115、 SEQ ID No. 118、SEQ ID No. 121、SEQ ID No. 124、SEQID No. 127、SEQ ID No. 130、SEQ ID No. 133、SEQ ID No. 136、SEQ ID No. 139、SEQ IDNo. 142、SEQ ID No. 145、SEQ ID No. 148或SEQ ID No. 151 (适当地SEQ ID No. 73、118、124或127)；或与其具有至少80%同一性的序列；或
ii) i)中所示的多核苷酸序列的功能片段，所述功能片段编码Nic3基因，或
iii)编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含本文显示为以下的氨基酸序列：SEQ IDNo. 75、SEQ ID No. 78、 SEQ ID No. 81、SEQ ID No. 84、SEQ ID No. 87、SEQ ID No.90、SEQ ID No. 93、SEQ ID No. 96、SEQ ID No. 99、SEQ ID No. 102、SEQ ID No. 105、SEQ ID No. 108、SEQ ID No. 111、SEQ ID No. 114、SEQ ID No. 117、 SEQ ID No. 120、SEQ ID No. 123、SEQ ID No. 126、SEQ ID No. 129、SEQ ID No. 132、SEQ ID No. 135、SEQ ID No. 138、SEQ ID No. 141、SEQ ID No. 144、SEQ ID No. 147、SEQ ID No. 150或SEQ ID No. 153，适当地SEQ No. 75、120、126或129)，或
iv)在高度严格条件下，可以与上文i)、ii)或iii)中教导的多核苷酸杂交的多核苷酸序列，或
v)与上文i)、ii)或iii)中所示的多核苷酸具有至少80% (优选85%、优选90%、优选95%、更优选96%、更优选97%、更优选98%)同一性的多核苷酸序列，或
vi)由于遗传密码的简并性而不同于i)、ii)或iii)中所示的多核苷酸的多核苷酸序列。
在一个实施方案中，本文提及的至少一种Nic1 ERF基因可以由包含以下的多核苷酸序列编码：
i)本文显示为以下的多核苷酸序列：SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 3；SEQ ID No.5、SEQ ID No. 9、SEQ ID No. 13、SEQ ID No. 17、SEQ ID No. 21、SEQ ID No. 25、SEQ IDNo. 29或SEQ ID No. 33；或
ii) i)中所示的多核苷酸序列的功能片段，所述功能片段编码Nic1 ERF合成基因，或
iii)编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含本文显示为以下的氨基酸序列：SEQ IDNo. 4、SEQ ID No. 8、SEQ ID No. 12、SEQ ID No. 16、SEQ ID No. 20、SEQ ID No. 24、SEQ ID No. 28、SEQ ID No. 32或SEQ ID No. 36，或
iv)在高度严格条件下，可以与上文i)、ii)或iii)中教导的多核苷酸杂交的多核苷酸序列，或
v)与上文i)、ii)或iii)中所示的多核苷酸具有至少70% (优选80%、优选85%、优选90%、优选95%、更优选96%、更优选97%、更优选98%)同一性的多核苷酸序列，或
vi)由于遗传密码的简并性而不同于i)、ii)或iii)中所示的多核苷酸的多核苷酸序列。
在一个实施方案中，本文提及的至少一种Nic2 ERF基因可以由包含以下的多核苷酸序列编码：
i)本文显示为以下的多核苷酸序列：SEQ ID No. 37、SEQ ID No. 41、SEQ ID No.45、SEQ ID No. 49、SEQ ID No. 53、SEQ ID No. 57、SEQ ID No. 61、SEQ ID No. 65或SEQID No. 69；或
ii) i)中所示的多核苷酸序列的功能片段，所述功能片段编码Nic2 ERF基因，或
iii)编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含本文显示为以下的氨基酸序列：SEQ IDNo. 40、SEQ ID No. 44、SEQ ID No. 48、SEQ ID No. 52、SEQ ID No. 56、SEQ ID No. 60、SEQ ID No. 64、SEQ ID No. 68或SEQ ID No. 72，或
iv)在高度严格条件下，可以与上文i)、ii)或iii)中教导的多核苷酸杂交的多核苷酸序列，或
v)与上文i)、ii)或iii)中所示的多核苷酸具有至少70% (优选80%、优选85%、优选90%、优选95%、更优选96%、更优选97%、更优选98%)同一性的多核苷酸序列，或
vi)由于遗传密码的简并性而不同于i)、ii)或iii)中所示的多核苷酸的多核苷酸序列。
在一个实施方案中，用于根据本发明使用的至少一种Nic3基因对于植物(例如烟草植物)可以是内源的。
在一个实施方案中，用于根据本发明使用的至少一种Nic1 ERF基因对于植物(例如烟草植物)可以是内源的。
在一个实施方案中，用于根据本发明使用的至少一种Nic2 ERF基因对于植物(例如烟草植物)可以是内源的。
本文提及“内源”基因不仅指如在植物中以其天然形式发现的所讨论的基因(即，不存在任何人为干预)，还指随后以分离的形式(重新)引入植物(转基因)或植物细胞内的该相同基因(或基本上同源的核酸/基因)。例如，含有此类转基因的转基因植物可能遇到转基因表达的显著减少和/或内源基因表达的显著减少。分离的基因可以从生物中分离或者可以是例如通过化学合成人造的。
在另一个实施方案中，用于根据本发明使用的至少一种Nic3基因对于植物(例如烟草植物)可以是外源的。
在另一个实施方案中，用于根据本发明使用的至少一种Nic1 ERF基因对于植物(例如烟草植物)可以是外源的。
在另一个实施方案中，用于根据本发明使用的至少一种Nic2 ERF基因对于植物(例如烟草植物)可以是外源的。
术语“外源基因”可以意指转化到未修饰植物内的基因来自外部来源，即来自与被转化的物种不同的物种。外源基因可以包含与未修饰植物中的内源基因基本上相同或不同的核酸序列。外源基因可以衍生自对应于来自任何物种的基因的基因组或cDNA序列。外源基因可以形成嵌合基因。外源基因可以编码包含如表1中所示的氨基酸序列的多肽，或者其功能变体或片段或直向同源物。外源基因可以包含如表2中所示的核苷酸序列，或者其功能变体或片段或直向同源物。外源基因可以包含如表3中所示的核苷酸序列，或者其功能变体或片段或直向同源物。
本发明还提供了Nic3基因用于调节植物的生物碱含量的用途。
在一个实施方案中，本发明进一步提供了Nic3基因和任选地Nic1 ERF和/或Nic2 ERF用于调节植物的生物碱含量的用途。
用于降低基因或基因产物表达的方法在本领域中得到充分记录。本文所述的用于调节Nic3基因的活性或表达的任何方法可以用于修饰Nic3基因，以及任选地Nic1 ERF基因和/或Nic2 ERF基因的活性或表达。
在一个实施方案中，可以通过本领域已知的任何方法来抑制Nic3基因的活性或表达、或者Nic3基因和任选地Nic1 ERF基因和/或Nic2 ERF基因的活性或表达。
用于抑制Nic3基因的活性或表达、或者Nic3基因和Nic1 ERF基因和/或Nic2 ERF基因的活性或表达的方法可以包括基因编辑、靶向诱变、RNA干扰、反义或有义共压制(参见Wang和Wagner 2003，Planta第216卷，第4期，第686-691页，其通过引用并入本文)。在一个实施方案中，基因的活性或表达抑制可以通过使用基因编辑来实现。基因编辑可以使用本领域已知的任何方法来进行。本文呈现了几个非限制性实例。
在一个实施方案中，可以使用包括CRISPR的基因编辑方法，包括使用CRISPR/Cas9系统来实现Nic3基因的活性或表达、或者Nic3基因和Nic1 ERF基因和/或Nic2 ERF基因的活性或表达抑制。CRISPR/Cas9基因组编辑工具是商购可得的，例如来自Clontech (Avenuedu President Kennedy 78100 Saint-Germain-en-Laye，法国)的“Guide-it”。
适当地，为了生成基因编辑载体pRGEB-M24，载体pRGEB31中的水稻snoRNA U3启动子可以如通过引用并入本文的WO2018/237107中所述的，通过用HindIII和BsaI辅助的无缝克隆(infusion cloning)，由从pSiM24 (通过引用并入本文的Sahoo等人，2014)扩增的M24启动子取代。例如，可以设计一对寡核苷酸，以特异性靶向每种候选基因。
寡核苷酸对首先退火以产生在两端处具有4-nt 5'突出端的双链片段，然后连接到BsaI消化的pRGEB-M24载体内。
基因编辑的另一种方法包括使用TALEN (转录激活因子样效应物核酸酶)技术连同商购可得的试剂盒(例如，来自Addgene，1Kendall Sq. Ste. B7102，Cambridge，MA02139，USA)。在一个实施方案中，可以使用TALEN来实现至少一种Nic3基因的活性或表达、或者至少一种Nic3基因和至少一种Nic1 ERF基因和/或至少一种Nic2 ERF基因的活性或表达抑制。
在另一个实施方案中，该方法可以包括使用锌指核酸酶，例如可从Sigma-Aldrich获得的CompoZr® Zinc Finger Nuclease Technology。另一个实施方案可以包括使用Silva等人Curr Gene Ther. 2011年2月；11 (1): 11–27 (其教导通过引用并入本文)中所述的大范围核酸酶(或进一步方法)。
在一个实施方案中，用于抑制Nic3基因或Nic3基因和Nic1 ERF基因和/或Nic2 ERF基因的活性或表达的方法可以是靶向诱变。可以使用靶向诱变的任何方法。在一个实施方案中，方法可以是寡核苷酸定向诱变(ODM)，例如可从Keygene (Agro Business Park90，6708 PW Wageningen，荷兰)获得的KeyBase®。在另一个实施方案中，Nic3基因的活性或表达、或者Nic3基因和Nic1 ERF基因和/或Nic2 ERF基因的活性或表达抑制可以通过使用构建体或载体(例如质粒)来实现。
本发明的遗传构建体可以是表达盒的形式，所述表达盒可以适合于抑制宿主细胞中的Nic3基因的活性或表达、或者Nic3基因和Nic1 ERF基因和/或Nic2 ERF基因的活性或表达，或者用于增加宿主细胞中的Nic3基因的活性或表达、或者Nic3基因和Nic1 ERF基因和/或Nic2 ERF基因的活性或表达。可以将遗传构建体引入宿主细胞内而不将其并入载体中。例如，可以是核酸分子的遗传构建体可以并入脂质体或病毒颗粒内。可替代地，可以通过合适的手段例如直接内吞摄取，将纯化的核酸分子(例如，无组蛋白的DNA或裸露的DNA)直接插入宿主细胞内。可以通过转染、感染、显微注射、细胞融合、原生质体融合或弹道轰击，将遗传构建体直接引入宿主受试者(例如植物)的细胞内。可替代地，可以使用粒子枪，将本发明的遗传构建体直接引入宿主细胞内。
可替代地，遗传构建体可以包含或容纳在重组载体内，用于在合适的宿主细胞中表达。重组载体可以是质粒、粘粒或噬菌体。此类重组载体对于用本发明的遗传构建体转化宿主细胞，以及用于复制其中的表达盒是高度有用的。本领域技术人员将了解，本发明的遗传构建体可以与多种类型的主链载体组合用于表达目的。主链载体可以是双元载体(binary vector)，例如可以在大肠杆菌(E. coli)和根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)两者中复制的双元载体。例如，合适的载体可以是pBIN质粒，例如pBIN19(Bevan M.，1984，Nucleic Acids Research 12:8711-21)。
除抑制至少一种Nic3基因的活性或表达、或者至少一种Nic3基因和至少一种Nic1 ERF基因和/或至少一种Nic2 ERF基因的活性或表达的序列之外，重组载体还可以包括各种其它功能元件。例如，载体可以包含启动子。另外，可以这样设计重组载体，使得它在宿主细胞的胞质溶胶中自主复制。在这种情况下，重组载体中可能需要诱导或调控DNA复制的元件。可替代地，可以这样设计重组载体，使得它整合到宿主细胞的基因组内。在这种情况下，设想了有利于靶向整合(例如通过同源重组)的DNA序列。
重组载体还可以包含编码基因的DNA，所述基因可以用作克隆过程中的选择性标记物，即，使得能够选择已转染或转化的细胞，并且使得能够选择容纳并入异源DNA的载体的细胞。载体还可以包含这样的DNA，其涉及调控编码序列的表达、或者用于将所表达的多肽靶向宿主细胞的某个部分例如毛状体或腺毛状体。因此，载体可以包含选自以下的至少一种另外元件：选择性标记物基因(例如抗生素抗性基因)；多肽终止信号；和蛋白质靶向序列(例如转运肽)。
在一个实施方案中，方法或用途可以包括使用干扰寡核苷酸来抑制Nic3基因的活性或表达、或者Nic3基因和Nic1 ERF基因和/或Nic2 ERF基因的活性或表达。在一个实施方案中，寡核苷酸是基于RNA的。在一个实施方案中，寡核苷酸是RNA干扰(RNAi)，例如dsRNAi。在一个实施方案中，方法可以包括用RNAi分子例如dsRNAi转化植物(例如烟草植物)的细胞，所述RNAi分子抑制Nic3基因的活性或表达、或者Nic3基因和Nic1 ERF基因和/或Nic2 ERF基因的活性或表达。适当地，RNAi分子可以由可以引入植物的细胞内的载体提供，例如可以使用病毒诱导基因沉默(virus-included gene silencing)，其携带相关基因的片段(例如长度为100至300个核苷酸的片段)，并且产生dsRNA以触发RNA介导的基因沉默。
在一个实施方案中，与可比较的植物或其部分或细胞中的多肽活性或表达相比，至少一种Nic3基因、Nic1 ERF基因和/或Nic2 ERF基因的活性或表达降低了至少30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多，或100%。
在一个实施方案中，与野生型植物或者可比较的植物、或其部分或细胞中的多肽活性或表达相比，至少一种Nic3基因、至少一种Nic1 ERF基因和至少一种Nic2 ERF基因的活性或表达降低了至少30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多，或100%。
可以通过本领域已知的任何方法来抑制至少一种Nic3基因的活性或表达、或者至少一种Nic3基因和至少一种Nic1 ERF基因和/或至少一种Nic2 ERF基因的活性或表达。在任何前述实施方案中，可以通过任何方法来抑制至少一种Nic3基因的活性或表达、或者至少一种Nic3基因和至少一种Nic1 ERF基因和/或至少一种Nic2 ERF基因的活性或表达，所述方法包括包含CRISPR的基因编辑方法，包括使用CRISPR-Cas9系统、RNA干扰(RNAi)、反义或有义共压制、基因编辑或靶向诱变。在任何前述实施方案中，可以使用RNAi方法例如使用miRNA、siRNA、dsRNA或shRNA，来抑制至少一种Nic3基因的活性或表达、或者至少一种Nic3基因和至少一种Nic1 ERF基因和/或至少一种Nic2 ERF基因的活性或表达。
在一个实施方案中，在载体中可以包含构建体，其调节Nic3基因的活性或表达、或者至少一种Nic3基因和至少一种Nic1 ERF基因和/或至少一种Nic2 ERF基因的活性或表达。适当地，载体可以是质粒。
在一个实施方案中，用于本发明中的载体是基于农杆菌属(Agrobacterium)的质粒。
相应地，在一个实施方案中，提供了植物(例如烟草植物)和植物繁殖材料(例如烟草植物繁殖材料)、叶片(例如烟草叶片)、切割的收获的叶片、加工叶片(例如加工烟草叶片)、或切割且加工的叶片(例如切割且加工的烟草叶片)，其中Nic3基因的活性或表达、或者Nic3基因和Nic1 ERF基因和/或Nic2 ERF基因的活性或表达是调节的。
在另一个实施方案中，细胞(例如烟草细胞)、植物(例如烟草植物)或其部分、和/或植物繁殖材料可以包含构建体，其调节Nic3基因的活性或表达、或者Nic3基因和Nic1 ERF基因和/或Nic2 ERF基因的活性或表达。在一个实施方案中，构建体降低Nic3基因的活性或表达、或者Nic3基因和Nic1 ERF基因和/或Nic2 ERF基因的活性或表达。在另一个实施方案中，构建体增加Nic3基因的活性或表达、或者Nic3基因和Nic1 ERF基因和/或Nic2 ERF基因的活性或表达。
在一个进一步的实施方案中，根据本发明的细胞(例如烟草细胞)、植物(例如烟草植物)或其部分、和/或植物繁殖材料可以包含：
i)表3中所示的多核苷酸序列；或
ii) i)中所示的多核苷酸序列的功能片段，所述功能片段编码Nic3基因，或
iii)编码包含表3中所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，或
iv)在高度严格条件下，可以与上文i)、ii)或iii)中教导的多核苷酸杂交的多核苷酸序列，或
v)与上文i)、ii)或iii)中所示的多核苷酸具有至少80% (优选85%、优选90%、优选95%、更优选96%、更优选97%、更优选98%)同一性的多核苷酸序列，或
vi)由于遗传密码的简并性而不同于i)、ii)或iii)中所示的多核苷酸的多核苷酸序列。适当地，表3序列如上文所述。
在一个进一步的实施方案中，根据本发明的细胞(例如烟草细胞)、植物(例如烟草植物)或其部分、和/或植物繁殖材料可以包含：
i)选自表3的多核苷酸序列、选自表1的多核苷酸序列和选自表2的多核苷酸序列；或
ii) i)中所示的多核苷酸序列的功能片段，所述功能片段编码Nic3基因、Nic1 ERF基因或Nic2 ERF基因；或
iii)编码包含表3、表1和表2中所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；或
iv)在高度严格条件下，可以与上文i)、ii)或iii)中教导的多核苷酸杂交的多核苷酸序列；或
v)与上文i)、ii)或iii)中所示的多核苷酸具有至少80% (优选85%、优选90%、优选95%、更优选96%、更优选97%、更优选98%)同一性的多核苷酸序列；或
vi)由于遗传密码的简并性而不同于i)、ii)或iii)中所示的多核苷酸的多核苷酸序列。适当地，表1、2或3序列如上文所述。
在一个实施方案中，细胞(例如烟草细胞)在细胞培养物中生长。
在一个实施方案中，至少一种Nic3基因(或者至少一种Nic3基因和至少一种Nic1 ERF基因和/或至少一种Nic2 ERF基因)用于调节细胞或细胞培养物(例如烟草细胞培养物)中的生物碱含量(例如尼古丁含量)。
在一个有利的实施方案中，至少一种Nic3基因的活性或表达、或者至少一种Nic3基因和至少一种Nic1 ERF基因和/或至少一种Nic2 ERF基因的活性或表达抑制可以导致生物碱含量的降低。适当地，至少一种Nic3基因的活性或表达、或者至少一种Nic3基因和至少一种Nic1 ERF基因和/或至少一种Nic2 ERF基因的活性或表达抑制可以导致尼古丁含量的降低。
在另一个实施方案中，增加Nic3基因的活性或表达(或者Nic3基因和Nic1 ERF基因和/或Nic2 ERF基因)的活性或表达可以导致生物碱含量的降低。适当地，增加Nic3 ERF基因的活性或表达、或者Nic3基因和Nic1 ERF基因和/或Nic2 ERF基因的活性或表达可以导致尼古丁含量的降低。
在一个实施方案中，植物或其部分是烟草植物。在一个实施方案中，根据本发明的烟草植物或其部分是根据本发明进行修饰的白肋烟或烤烟植物。在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明进行修饰的白肋烟或烤烟植物。在一个实施方案中，根据本发明的烟草植物(例如修饰的烟草植物)是东方(Oriental)或土耳其(Turkish)烟草植物。
在一个实施方案中，烟草植物或其部分是调制的。在一个实施方案中，烟草植物或其部分是调制的，例如晾制的、火管烘烤的、明火烘烤的或晒制的。在一个进一步方面，烟草植物或其部分是火管烘烤的。在一个进一步方面，烟草植物或其部分是晾制的。
火管烘烤是本领域众所周知的，并且指用由火箱或气体燃料系统供给的焰道来调制烟草的过程。这个过程热调制烟草而不使其暴露于烟中，在调制过程中缓慢升高温度。这种方法生产含糖量高且具有中至高水平的尼古丁的烟草。史密斯烟草谷仓(Smith TobaccoBarn)是传统烤烟谷仓的实例。
晾制烟草包括白肋烟、马里兰(Maryland)和深色(dark)烟草。共同因素是调制主要没有人工热源和湿度。白肋烟的颜色为浅棕色至深棕色，油含量高且糖含量低。白肋烟在谷仓中进行晾制。白肋烟的主要种植国是阿根廷、巴西、意大利、马拉维和美国。白肋烟烟草植物包括例如Clay 402、Clay 403、Clay 502、Ky 14、Ky 907、Ky 910、Ky 8959、NC 2、NC 3、NC 4、NC 5、NC 2000、TN 86、TN 90、TN 97、R 610、R 630、R711、R 712、NCBH 129、Bu 21xKy10、HB04P、Ky 14xL 8、Kt 200、Newton 98、Pedigo 561、Pf561和Va 509。
马里兰烟草具有良好的燃烧性质、低尼古丁和中性香气。马里兰烟草的主要种植国包括美国和意大利。深色晾制烟与其它类型的区别主要在于其发酵过程，所述发酵过程给予深色晾制烟草其中等至深棕色的颜色和独特的香气。它们的叶片具有低含糖量，但高尼古丁含量。深色晾制烟草主要用于生产嚼烟和鼻烟。深色烤烟的主要种植区是美国的Tennessee、Kentucky和Virginia。
如本文使用的，术语“功能片段”指能够以与多核苷酸相同的方式发挥功能的多核苷酸的一部分。例如，如果多核苷酸是ERF基因，则功能片段必须能够充当ERF基因，例如功能片段保留ERF基因的活性。功能片段可以具有等于或大于全长多核苷酸的活性水平的活性水平。
在一个实施方案中，功能片段可以是如本文讨论的Nic3基因的一部分，其包含至少50、75、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900或1000个邻接核苷酸。适当地，功能片段包含如上文所述的具有SEQ ID No. 75、120、127或129的Nic3基因的结构域。在一些实施方案中，功能片段可以包含本文讨论的Nic1 ERF的至少150个核苷酸。
在一个实施方案中，功能片段可以是如本文讨论的Nic1 ERF基因的一部分，其包含至少50、75、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900或1000个邻接核苷酸。在一些实施方案中，功能片段可以包含本文讨论的Nic1 ERF的至少150个核苷酸。
在一个实施方案中，Nic2 ERF基因的功能片段可以是如本文讨论的Nic2 ERF基因的一部分，其包含至少50、75、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900或1000个邻接核苷酸。在一些实施方案中，功能片段可以包含本文讨论的Nic2 ERF的至少150个核苷酸。
如本文使用的，术语“功能变体”指可能在基因组序列中出现的变异性，而无基因功能和/或蛋白质功能的活性的显著丧失。例如，多肽中存在的一些氨基酸(或多核苷酸中存在的一些核苷酸)可以被取代而无活性的显著丧失。功能变体可以具有等于或大于非变体多核苷酸和/或多肽的活性水平的活性水平。由于遗传密码的简并性而不同于本文公开的基因的序列是功能变体。变体可能与感兴趣的序列相差少至10、少至9、少至8、少至7、少至6、少至5、少至4、少至3、少至2或少至1个氨基酸。
如本文使用的，术语“遗传密码的简并性”指编码多肽序列的密码子中的冗余，其显示为指定氨基酸的三密码子组合的多重性。例如，在编码具有异亮氨酸氨基酸的多肽的mRNA分子中，异亮氨酸可以由AUU、AUC或AUA编码。这意指编码RNA的DNA分子可以具有多重序列，而所得到的多肽将具有相同的序列。换言之，多态性核苷酸序列可以编码相同的多肽产物。这意指一个核酸序列可以包含与第二个序列具有极低序列同一性的序列，同时编码相同的多肽序列。
与具有本文所述的特定性质的多肽的氨基酸序列或本文所述的任何核苷酸序列具有一定程度的序列同一性或序列同源性的序列可以是功能变体。
如本文使用的，术语“直向同源物”指衍生自共同祖先基因，并且由于物种形成而在不同物种中发现的基因。直向同源物可以在核苷酸序列和或氨基酸序列水平下共享至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大的序列同一性。直向同源物基因经常共享相同或相似的功能，即具有保守的功能。
在本发明的一些实施方案中，可以提供启动子。用于本发明中的启动子可以是选自以下中的一种或多种：组成型启动子、衰老特异性启动子、组织特异性启动子、发育调节的启动子和诱导型启动子。在一个实施方案中，启动子可以是组成型启动子。
组成型启动子指导基因在植物发育期间连续地遍及植物各个部分的表达，尽管基因可能不在所有细胞类型中以相同水平表达。已知的组成型启动子的实例包括与以下相关的那些：花椰菜花叶病毒35S转录物(Odell JT，Nagy F，Chua NH (1985) Identificationof DNA sequences required for activity of the cauliflower mosaic virus 35Spromoter，Nature 313 810-2)、水稻肌动蛋白1基因(Zhang W，McElroy D，Wu R. (1991)Analysis of rice Act1 5' region activity in transgenic rice plants (PlantCell 3 1155-65))以及玉蜀黍泛素1基因(Cornejo MJ，Luth D，Blankenship KM，AndersonOD，Blechl AE. (1993). Activity of a maize ubiquitin promoter in transgenicrice. Plant Molec. Biol. 23 567-81)，其通过引用并入本文。组成型启动子包括香石竹蚀环病毒(CERV)启动子。The sequence of carnation etched ring virus DNA:comparison with cauliflower mosaic virus and retroviruses ((Hull R，Sadler J，Longstaff M 1986 EMBO Journal，5(2):3083-3090)，其通过引用并入本文。
组成型启动子可以选自：香石竹蚀环病毒(CERV)启动子、花椰菜花叶病毒(CaMV35S启动子)、来自水稻肌动蛋白1基因或玉蜀黍泛素1基因的启动子。适当地，启动子可以是CERV启动子。
可替代地，在一些实施方案中，启动子可以不是花椰菜花叶病毒(CaMV 35S启动子)。在一个实施方案中，启动子可以是衰老特异性启动子。“衰老特异性启动子”(SAG)可以是与控制衰老相关基因的表达相关的启动子。因此，启动子可以限制它与之可操作地连接的编码序列(即基因)基本上排他地在衰老组织中的表达。因此，衰老特异性启动子可以是能够优先地促进以发育调控的方式在植物组织中的基因表达的启动子，使得3'蛋白质编码区的表达基本上仅在植物组织经历衰老时发生。应了解，衰老趋于在植物的较老部分例如较老的叶片中，而不是在植物的较年轻部分例如种子中发生。
已知表达众多衰老相关基因的植物的一个实例是拟南芥属(Arabidopsis)。因此，启动子可以从拟南芥属中的衰老相关基因中分离。通过引用并入本文的Gepstein等人(ThePlant Journal，2003，36，629-642)，使用拟南芥属作为模型进行了SAG及其启动子的详细研究。遗传构建体可以包含来自本文件中公开的任何SAG的启动子。例如，合适的启动子可以选自SAG12、SAG13、SAG101、SAG21和SAG18，或者其功能变体或功能片段。
在一个实施方案中，启动子可以是SAG12或SAG13启动子。在一个实施方案中，启动子可以是技术人员已知的SAG12启动子、或者其功能变体或功能片段(通过引用并入本文的Gan & Amasino，1997，Plant Physiology，113: 313-319)。合适的启动子及其序列可以在WO2010/097623 (通过引用并入本文)中找到。
在另一个实施方案中，启动子可以是组织特异性启动子。组织特异性启动子是指导基因在植物的一个(或几个)部分中的表达的启动子，通常贯穿那些植物部分的生存期。组织特异性启动子的类别通常还包括其特异性不绝对的启动子，即它们还可以指导在除优选组织外的组织中以较低水平的表达。许多组织特异性启动子是本领域已知的，并且包括与在马铃薯块茎中表达的patatin基因以及在小麦、大麦或玉蜀黍胚乳中表达的高分子量麦谷蛋白基因相关的那些启动子。这些启动子中的任一种都可以用于本发明中。
适当地，组织特异性启动子可以是叶片特异性启动子。适当地，叶片特异性启动子可以包括ASYMMETRIC LEAVES 1 (AS1)。
在一个特别优选的实施方案中，组织特异性启动子是根特异性启动子。
在另一个实施方案中，启动子可以是发育调节的启动子。发育调节的启动子指导基因在植物发育期间的特定时间，在植物的一个或多个部分中的表达变化。基因可以在其它时间以不同(通常较低)的水平在所述植物部分中表达，并且也可以在其它植物部分中表达。
在一个实施方案中，启动子可以是诱导型启动子。诱导型启动子能够响应诱导物指导基因的表达。在不存在诱导物的情况下，基因将不表达。诱导物可以直接作用于启动子序列，或者可以通过抵消阻遏物分子的效应而起作用。诱导物可以是化学试剂例如代谢物、蛋白质、生长调节剂或有毒元素，生理应激例如热、损伤或渗透压，或者病原体或害虫作用的间接后果。发育调节的启动子可以被描述为特定类型的诱导型启动子，其响应由植物产生的内源性诱导物或在植物的生活史中的特定时刻的环境刺激。已知的诱导型启动子的实例包括与以下相关的那些启动子：例如由通过引用并入本文的Warner SA，Scott R，DraperJ. (1993) (Isolation of an asparagus intracellular PR gene (AoPR1) wound-responsive promoter by the inverse polymerase chain reaction and itscharacterization in transgenic tobacco. Plant J. 3191-201.)描述的伤口应答，如由通过引用并入本文的Benfey & Chua (1989) (Benfey，P.N.和Chua，N-H. (1989)Regulated genes in transgenic plants. Science 244 174-181)公开的温度应答，以及如由通过引用并入本文的Gatz (1995) (Gatz，C. (1995) Novel inducible/repressiblegene expression systems. Methods in Cell Biol. 50411-424)描述的化学诱导的。
因此，在一个实施方案中，启动子可以选自：CERV启动子、花椰菜花叶病毒35S启动子(完整或截短的)、rubisco启动子、豌豆质体蓝素启动子、胭脂碱合酶启动子、叶绿素r/b结合启动子、高分子量麦谷蛋白启动子、α,β-麦醇溶蛋白启动子、大麦醇溶蛋白启动子和patatin启动子。
在一个实施方案中，启动子可以是CaMV 35S启动子或具有重复增强子区或双重增强子区的修饰的35S启动子(R. Kay等人Science. 1987年6月5日；236(4806):1299-302，其通过引用并入本文)。
在一个实施方案中，启动子可以是天然启动子。
如本文使用的，“天然启动子”指对于基因是内源的启动子，即在自然界中与基因可操作地连接的启动子。
重组载体还可以包含编码基因的DNA，所述基因可以用作克隆过程中的选择性标记物，即，使得能够选择已转染或转化的细胞，并且使得能够选择容纳并入异源DNA的载体的细胞。载体还可以包含这样的DNA，其涉及调控编码序列的表达、或者用于将所表达的多肽靶向宿主细胞的某个部分例如叶绿体。因此，载体可以包含选自以下的至少一种另外元件：选择性标记物基因(例如抗生素抗性基因)；多肽终止信号；和蛋白质靶向序列(例如叶绿体转运肽)。
合适的标记物基因的实例包括通过引用并入本文的抗生素抗性基因，例如赋予针对卡那霉素、遗传霉素(G418)和潮霉素(npt-II、hyg-B)的抗性的那些基因；除草剂抗性基因，例如赋予针对基于草丁膦和磺酰胺的除草剂的抗性的那些基因(分别为bar和suI；EP-A-242246、EP-A-0249637)；以及通过引用并入本文的可筛选标记物，例如β-葡糖醛酸酶(GB2197653)、萤光素酶和绿色荧光蛋白(GFP)。标记物基因可以由第二启动子控制，所述第二启动子允许在细胞中的表达，所述细胞可能在种子中或可能不在种子中，从而允许在植物发育的任何阶段选择含有标记物的细胞或组织。合适的第二启动子是农杆菌属的胭脂碱合酶基因的启动子，以及衍生自编码35S花椰菜花叶病毒(CaMV)转录物的基因的启动子。然而，可以使用任何其它合适的第二启动子。
商业上期望的性状
在一个实施方案中，本发明的植物具有减少的总生物碱含量，和/或减少的选自尼古丁、降烟碱、新烟碱、米喔斯明和新烟草碱的一种或多种生物碱含量和/或减少的尼古丁，而香味特征和/或其它商业上期望的性状至少得到维持。在一个实施方案中，本发明的植物产生与尚未根据本发明进行修饰的植物相似等级和/或质量的叶片。
在一个实施方案中，本发明的植物具有在没有植物的香味特征的显著变化的情况下减少的尼古丁含量(例如，与尚未根据本发明进行修饰的相同植物相比)。
在一个实施方案中，本发明的植物具有在没有植物的其它商业上期望的性状的显著变化(例如降低)的情况下减少的尼古丁含量(例如，与尚未根据本发明进行修饰的相同植物相比)。特别地，与尚未根据本发明进行修饰的相同植物相比，修饰的植物的产量优选没有减少。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法和用途涉及减少总生物碱含量，和/或减少选自尼古丁、降烟碱、新烟碱和新烟草碱的一种或多种生物碱，和/或减少尼古丁，同时维持香味特征和/或其它商业上期望的性状(例如产量)。
术语“商业上期望的性状”将包括性状如产量、成熟植株高度、可收获的叶片数、平均节长度、腰叶(cutter leaf)长度、腰叶宽度、质量、非生物(例如干旱)胁迫耐受性、除草剂耐受性和/或生物(例如昆虫、细菌或真菌)胁迫耐受性。
如本文教导的，术语“商业上期望的性状”将包括当在相似的田间条件下生长时，与在可比较植物的火管烘烤亲本中的那些所述性状可比较的性状，例如抗旱性、抗虫性、成熟植株高度、可收获的叶片数、平均节长度、腰叶长度、腰叶宽度和产量。
除非另有说明，否则本文使用的烟草产量指调制后的叶片产量，其遵循标准农学和调制实践，在标准的田间条件下，基于每英亩的调制后的烟草叶片重量进行计算。
在一个方面，当在相似的田间条件下生长时，本发明的植物(例如烟草植物)具有的产量为可比较植物的产量的50%至150%、55%至145%、60%至140%、65%至135%、70%至130%、75%至125%、80%至120%、85%至115%、90%至110%、95%至105%、50%至100%、55%至100%、60%至100%、65%至100%、70%至100%、75%至100%、80%至100%、85%至100%、90%至100%、95%至100%、100%至150%、105%至150%、110%至150%、115%至150%、120%至150%、125%至150%、130%至150%、135%至150%、140%至150%或145%至150%。
在另一个方面，当在相似的田间条件下生长时，本发明的植物(例如烟草植物)的产量是可比较植物的产量的大约1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3.0倍。
在另一个方面，当在相似的田间条件下生长时，本发明的烟草植物的产量与可比较植物的产量是可比较的。
在另一个方面，当在相似的田间条件下生长时，本发明的烟草植物的产量与火管烘烤的可比较植物的产量是可比较的。
在一个方面，本发明的烟草植物提供了选自以下的产量：约1200至3500、1300至3400、1400至3300、1500至3200、1600至3100、1700至3000、1800至2900、1900至2800、2000至2700、2100至2600、2200至2500以及2300至2400磅/英亩。
在另一个方面，本发明的烟草植物提供了选自以下的产量：约1200至3500、1300至3500、1400至3500、1500至3500、1600至3500、1700至3500、1800至3500、1900至3500、2000至3500、2100至3500、2200至3500、2300至3500、2400至3500、2500至3500、2600至3500、2700至3500、2800至3500、2900至3500、3000至3500以及3100至3500磅/英亩。
在一个进一步方面，本发明的烟草植物提供了选自以下的产量：约1200至3500、1200至3400、1200至3300、1200至3200、1200至3100、1200至3000、1200至2900、1200至2800、1200至2700、1200至2600、1200至2500、1200至2400、1200至2300、1200至2200、1200至2100、1200至2000、1200至1900、1200至1800、1200至1700、1200至1600、1200至1500以及1200至1400磅/英亩。
烟草植物
本发明提供了针对植物(例如烟草植物)的方法、用途以及细胞(例如烟草细胞)、植物(例如烟草植物)和植物繁殖材料。
如本文使用的，术语“烟草”指在递送系统的生产中使用的烟草属中的植物。合适的“烟草”植物的非限制性实例包括烟草和黄花烟草(例如，烟草(N. tabacum L.)、LA B21、LN KY171、Tl 1406、Basma、Galpao、Perique、Beinhart 1000-1和Petico)。
在一个实施方案中，合适的烟草植物可以是任何烟草种质、系或变种。
在另一个实施方案中，合适的烟草植物可以是非烟草种(non tabacum species)。
烟草材料可以衍生自或得自烟草类型的变种，通常称为白肋烟变种、烤烟(flue)或亮色(bright)变种和深色变种。在一些实施方案中，烟草材料衍生自白肋烟、弗吉尼亚(Virginia)或深色烟草植物。烟草植物可以选自白肋烟草、稀有烟草、特产烟草(speciality tobacco)、膨胀烟草等等。
本文还预期了烟草栽培种和原种(elite)烟草栽培种的使用。因此，用于本文的烟草植物可以是烟草变种或原种烟草栽培变种。特别有用的烟草变种包括烤烟弗吉尼亚型、白肋烟型和东方型。
在一些实施方案中，烟草植物可以例如选自下述变种中的一个或多个：L. 栽培种T.I. 1068、AA 37-1、B 13P、Xanthi(Mitchell-Mor)、KT D#3杂种(Hybrid)107、Bel-W3、79-615、Samsun Holmes NN、来自杂交BU21 x Hoja Parado的F4、品系97、KTRDC#2杂种49、KTRDC#4杂种1 10、Burley 21、PM016、KTRDC#5 KY 160 SI、KTRDC#7 FCA、KTRDC#6 TN 86SI、PM021、K 149、K 326、K 346、K 358、K 394、K 399、K 730、KY 10、KY 14、KY 160、KY 17、KY 8959、KY 9、KY 907、MD 609、McNair 373、NC 2000、PG 01、PG 04、P01、P02、P03、RG 11、RG 17、RG 8、Speight G-28、TN 86、TN 90、VA 509、AS44、Banket A1、Basma Drama B84/31、Basma I Zichna ZP4/B、Basma Xanthi BX 2A、Batek、Besuki Jember、C104、Coker 319、Coker 347、Criollo Misionero、PM092、Delcrest、Djebel 81、DVH 405、Galpao Comum、HB04P、Hicks Broadleaf、Kabakulak Elassona、PM102、Kutsage E1 、KY 14 x L8、KY 171、LA BU 21、McNair 944、NC 2326、NC 71、NC 297、NC 3、PVH 03、PVH 09、PVH 19、PVH 21 10、Red Russian、Samsun、Saplak、Simmaba、Talgar 28、PM132、Wislica、Yayaldag、NC 4、TRMadole、Prilep HC-72、Prilep P23、Prilep PB 156/1、Prilep P12-2/1、Yaka JK-48、YakaJB 125/3、TI-1068、KDH-960、TI-1070、TW136、PM204、PM205、Basma、TKF 4028、L8、 TKF2002、TN 90、GR141 、Basma xanthi、GR149、GR153和Petit Havana。
变种或栽培变种的非限制性实例是：BD 64、CC 101 、CC 200、CC 27、CC 301 、CC400、CC 500、CC 600、CC 700、CC 800、CC 900、Coker 176、Coker 319、Coker 371 Gold、Coker 48、CD 263、DF91 1 、DT 538 LC、Galpao烟草、GL 26H、GL 350、GL 600、GL 737、GL939、GL 973、HB 04P、HB 04P LC、HB3307PLC、杂种403LC、杂种404LC、杂种501 LC、K 149、K326、K 346、K 358、K394、K 399、K 730、KDH 959、KT 200、KT204LC、KY10、KY14、KY 160、KY17、KY 171 、KY 907、KY907LC、KTY14xL8 LC、Little Crittenden、McNair 373、McNair944、msKY 14xL8、Narrow Leaf Madole、Narrow Leaf Madole LC、NBH 98、N-126、N-777LC、N-7371 LC、NC 100、NC 102、NC 2000、NC 291、NC 297、NC 299、NC 3、NC 4、NC 5、NC 6、NC7、NC 606、NC 71、NC 72、NC 810、NC BH 129、NC 2002、Neal Smith Madole、OXFORD 207、PD7302 LC、PD 7309 LC、PD 7312 LC 'Periq'e'烟草、PVH03、PVH09、PVH19、PVH50、PVH51、R610、R 630、R 7-1 1 、R 7-12、RG 17、RG 81、RG H51、RGH 4、RGH 51、RS 1410、Speight168、Speight 172、Speight 179、Speight 210、Speight 220、Speight 225、Speight 227、Speight 234、Speight G-28、Speight G-70、Speight H-6、Speight H20、Speight NF3、Tl1406、Tl 1269、TN 86、TN86LC、TN 90、TN 97、TN97LC、TN D94、TN D950、TR(Tom Rosson)Madole、VA 309、VA359、AA 37-1、B 13P、Xanthi(Mitchell-Mor)、Bel-W3、79-615、SamsunHolmes NN、KTRDC 2号杂种49、Burley 21、KY 8959、KY 9、MD 609、PG 01、PG 04、P01、P02、P03、RG 1 1、RG 8、VA 509、AS44、Banket A1、Basma Drama B84/31、Basma I Zichna ZP4/B、Basma Xanthi BX 2A、Batek、Besuki Jember、C104、Coker 347、Criollo Misionero、Delcrest、Djebel 81、DVH 405、Galpao Comum、HB04P、Hicks Broadleaf、KabakulakElassona、Kutsage E1、LA BU 21、NC 2326、NC 297、PVH 21 10、Red Russian、Samsun、Saplak、Simmaba、Talgar 28、Wislica、Yayaldag、Prilep HC-72、Prilep P23、Prilep PB156/1、Prilep P12-2/1、Yaka JK-48、Yaka JB 125/3、TI-1068、KDH-960、Tl-1070、TW136、Basma、TKF 4028、L8、TKF 2002、GR141、Basma xanthi、GR149、GR153、Petit Havana。即使本文并未具体确定，还是预期了上述的低转化子亚变种(Low converter subvarieties)。
植物可以是通过使本文公开的任何变种杂交而产生的杂种。
烟草植物可以是白肋烟、烤烟弗吉尼亚或东方。
在一个实施方案中，植物繁殖材料可以是从本发明的植物(例如烟草植物)可获得的。如本文使用的，“植物繁殖材料”指取自植物的任何植物物质，可以由其产生进一步的植物。适当地，植物繁殖材料可以是种子。适当地，植物繁殖材料可以是花粉。
在一个实施方案中，本发明的细胞(例如烟草细胞)、植物(例如烟草植物)或其部分和/或植物繁殖材料可以包含Nic3基因(或者Nic3基因和Nic1 ERF基因和/或Nic2 ERF基因)的调节的活性或表达。在另一个实施方案中，细胞(例如烟草细胞)、植物(例如烟草植物)和/或植物繁殖材料可以包含根据本发明的构建体或载体。在另一个实施方案中，细胞(例如烟草细胞)、植物(例如烟草植物)和/或植物繁殖材料可以是通过根据本发明的方法可获得的(例如获得的)。
适当地，当与尚未进行修饰，以调节Nic3基因(或者Nic3基因和Nic1 ERF基因和/或Nic2 ERF基因)的活性或表达的植物(例如烟草植物)或其部分相比较时，根据本发明的植物(例如烟草植物)或其部分可以包含Nic3 ERF基因(或者Nic3基因和Nic1 ERF基因和/或Nic2 ERF基因)的调节的活性或表达。
在一个实施方案中，根据本发明的植物(例如烟草植物)或其部分包含本发明的细胞(例如烟草细胞)。在另一个实施方案中，植物繁殖材料可以是从本发明的植物(例如烟草植物)可获得的(例如获得的)。
在一个实施方案中，提供了如前述实施方案中提供的细胞(例如烟草细胞)用于生产产品(例如递送系统)的用途。此外，提供了如本文所述的植物(例如烟草植物)培育植物(例如烟草植物)的用途。
在另一个实施方案中，本发明还提供了前述实施方案的植物(例如烟草植物)用于生产产品(例如递送系统)的用途。在另一个实施方案中，提供了本发明的植物(例如烟草植物)种植作物的用途。在一个实施方案中，根据本发明的Nic3基因(或者Nic3基因和Nic1 ERF基因和/或Nic2 ERF基因)的使用导致植物(例如烟草植物)的生物碱含量的调节。
在一个实施方案中，根据本发明的Nic3基因(或者Nic3基因和Nic1 ERF基因和/或Nic2 ERF基因)的方法或用途可以导致生物碱含量的调节。在另一个实施方案中，Nic3基因(或者Nic3基因和Nic1 ERF基因和/或Nic2 ERF基因)的使用可以导致一种或多种生物碱含量的降低(例如，其降低的活性或表达)。适当地，新烟草碱、新烟碱、肌胺、降烟碱或尼古丁中的一种或多种的含量可以是减少的。适当地，尼古丁含量是减少的。适当地，当与野生型植物相比，Nic3基因的活性或表达(或者Nic3基因和Nic1 ERF基因和/或Nic2 ERF基因的活性)是降低的时，可以观察到这一点。
在另一个实施方案中，Nic3基因(或者Nic3基因和Nic1 ERF基因和/或Nic2 ERF基因)的方法或用途可以导致一种或多种生物碱含量的增加(例如其增加的活性或表达)。适当地，新烟草碱、新烟碱、降烟碱或尼古丁中的一种或多种的含量可以是增加的。适当地，尼古丁含量是减少的。
在一个实施方案中，植物(例如烟草植物)或其部分，例如叶片、或收获的叶片或收获的加工叶片、或细胞或产物(例如递送系统)包含本发明的修饰的(例如突变的或缺失的)Nic3基因(或者与根据本发明的修饰的(例如突变的或缺失的) Nic1 ERF基因和/或修饰的(例如突变的或缺失的) Nic2 ERF基因组合的修饰的(例如突变的或缺失的) Nic3基因)。
在一个实施方案中，本发明提供了烟草细胞培养物(例如体外培养物)。烟草细胞培养物可以是烟草细胞悬浮培养物。可以将这些体外培养的烟草细胞并入递送系统内，例如作为常规烟草颗粒、烟丝(shreds)、细切或长切烟草薄片的取代物，作为添加物成分，或者既作为取代物又作为添加物。
在一个实施方案中，提供了烟草细胞培养物，例如根据本发明的收获的和/或加工的烟草细胞培养物或来自其的提取物用于生产递送系统的用途。
从体外培养物中收获的烟草细胞可以进行干燥，例如冷冻干燥，例如以产生粉末。
技术人员会知道用于确立烟草细胞的体外培养物的已知方法。仅举例来说，可以使用下述方法：收集来自感兴趣的烟草植物的种子，并且对其外部进行灭菌以消除不希望有的生物，种植所述种子以生长感兴趣的烟草植物，从烟草植物中(例如，从烟草茎中)取出组织供用作外植体，从烟草外植体确立愈伤组织培养物，从愈伤组织培养物确立细胞悬浮培养物，并且收获培养材料(例如包括烟草细胞)以产生烟草细胞培养物。
烟草细胞可以通过各种方法进行收获，所述方法包括过滤，例如真空过滤。可以通过添加水在滤器中洗涤样品，并且用过滤例如真空过滤去除剩余的液体。
收获的烟草细胞培养物可以进一步进行加工，例如干燥，例如风干和/或冷冻干燥。可以将收获的烟草细胞培养物或干燥的收获的烟草细胞培养物或其提取物并入根据本发明的递送系统内。
在一个实施方案中，本发明提供了用于分子农业的烟草植物或其部分。适当地，根据本发明修饰的植物或其部分可以用于制造蛋白质，例如治疗剂，如抗生素、病毒样颗粒、营养药或小分子。
在一个实施方案中，本发明提供了用于生产蛋白质(例如治疗性蛋白质)的方法；该方法包括通过调节如本文所述的至少一种Nic3 ERF基因；或者至少一种Nic3基因和至少一种Nic1 ERF基因和/或至少一种Nic2 ERF基因的活性或表达，来修饰能够产生所述蛋白质(例如治疗性蛋白质)的植物或其部分，并且在足以允许产生所述蛋白质(例如治疗性蛋白质)的条件下培养植物。
在一个方面，本发明提供了将低尼古丁性状渐渗到烟草变种内的方法，所述方法包括，
a)使包含低尼古丁性状的第一烟草品种与不含低尼古丁性状的第二烟草变种杂交，以产生一种或多种后代烟草植物；
b)对于与低尼古丁性状连锁的多态性标记物，对一种或多种后代烟草植物进行基因分型，其中所述多态性标记物在Nic3基因座的20cM、10cM、5cM、4cM、3cM、2cM、1cM、0.5cM或小于0.5cM内；和
c)选择包含低尼古丁性状的后代烟草植物。
在一个方面，该方法任选地包括同时或并行地选择与Nic1基因座相关或紧密连锁的一种或多种分子标记物、和/或与Nic2基因座相关或紧密连锁的一种或多种分子标记物。
产物
本发明还提供了从根据本发明的烟草可获得或获得的产物。提供了从烟草植物可获得或获得的产物，在所述烟草植物中，Nic3基因的活性或表达(或者Nic3基因和Nic1 ERF基因和/或Nic2 ERF基因的活性或表达)已进行调节，并且包含调节的生物碱含量(例如减少的尼古丁含量)。
在一个方面，本发明包含递送系统，其包含根据本发明的烟草植物或其部分或植物细胞；
从根据本发明的烟草植物繁殖材料繁殖的烟草植物或其部分；根据本发明的植物的收获的叶片；根据本发明的加工叶片；或通过根据本发明的方法生产的植物。
如本文使用的，术语“递送系统”预期涵盖向使用者递送至少一种物质的系统，并且包括：
可燃气雾剂供应系统，例如香烟、小雪茄、雪茄烟、以及用于烟斗或手卷烟或自制烟的烟草(无论是基于烟草、烟草衍生物、膨胀烟草、再造的烟草、烟草取代物还是其它可抽吸材料)；
非可燃气雾剂供应系统，其无需燃烧气雾剂生成材料而从气雾剂生成材料中释放化合物，例如电子香烟、烟草加热产品、以及使用气雾剂生成材料的组合生成气雾剂的混杂系统；和
将至少一种物质经口、经鼻、经皮或以无需形成气雾剂的另一种方式递送给使用者的无气雾剂递送系统，包括但不限于锭剂、口香糖、贴剂、包含可吸入粉末的制品、以及经口产品例如包括口含烟或湿鼻烟的口嚼烟草(oral tobacco)，其中所述至少一种物质可以包含或不包含尼古丁。
根据本公开内容，“可燃”气雾剂供应系统是这样的系统，其中气雾剂供应系统(或其部件)的组成成分气雾剂生成材料在使用期间被燃烧或灼烧，以便促进至少一种物质递送至使用者。
在一些实施方案中，递送系统是可燃气雾剂供应系统，例如选自香烟、小雪茄和雪茄的系统。
在一些实施方案中，本公开内容涉及用于可燃气雾剂供应系统中的部件例如过滤嘴、过滤嘴条(filter rod)、过滤嘴段(filter segment)、烟草条、塞子(spill)，气雾剂修饰剂释放部件例如胶囊、线或珠，或者纸例如成型纸(plug wrap)、接装纸或卷烟纸。
根据本公开内容，“非可燃”气雾剂供应系统是这样的系统，其中气雾剂供应系统(或其部件)的组成成分气雾剂生成材料不燃烧或灼烧，以便促进至少一种物质递送至使用者。
在一些实施方案中，递送系统是非可燃气雾剂供应系统，例如动力非可燃气雾剂供应系统。
在一些实施方案中，非可燃气雾剂供应系统是电子香烟，也称为蒸汽烟设备(vaping device)或电子尼古丁递送系统(END)，尽管应指出在气雾剂生成材料中尼古丁的存在不是必需的。
在一些实施方案中，非可燃气雾剂供应系统是气雾剂生成材料加热系统，也称为加热不燃烧系统。此类系统的实例是烟草加热系统。
在一些实施方案中，非可燃气雾剂供应系统是混杂系统，以使用气雾剂生成材料的组合来生成气雾剂，所述气雾剂生成材料中的一种或多种可以被加热。气雾剂生成材料各自可以是例如固体、液体或凝胶的形式，并且可以含有或可以不含有尼古丁。在一些实施方案中，混杂系统包含液体或凝胶气雾剂生成材料和固体气雾剂生成材料。固体气雾剂生成材料可以包含例如烟草或非烟草产品。
通常，非可燃气雾剂供应系统可以包括非可燃气雾剂供应设备、以及用于与非可燃气雾剂供应设备一起使用的消耗品。
在一些实施方案中，本公开内容涉及包含气雾剂生成材料并且配置为与非可燃气雾剂供应设备一起使用的消耗品。本公开内容自始至终，这些消耗品有时被称为制品。
在一些实施方案中，非可燃气雾剂供应系统，例如其非可燃气雾剂供应设备，可以包括电源和控制器。例如，电源可以是电力来源或放热电源。在一些实施方案中，放热电源包括碳基底，其可以被通电，以便以热的形式将能量分配给气雾剂生成材料或靠近放热电源的传热材料。
在一些实施方案中，非可燃气雾剂供应系统可以包括用于接收消耗品的区域、气雾剂发生器、气雾剂生成区、外壳、接口、过滤器和/或气雾剂修饰剂。
在一些实施方案中，用于与非可燃气雾剂供应设备一起使用的消耗品可以包括气雾剂生成材料、气雾剂生成材料储存区、气雾剂生成材料转移部件、气雾剂发生器、气雾剂生成区、外壳、包装纸、过滤器、接口和/或气雾剂修饰剂。
适当地，递送系统可以由根据本发明的烟草植物或其部分制备(例如，可以包含根据本发明的烟草植物或其部分)。
适当地，递送系统可以由根据本发明的烟草细胞培养物制备。
适当地，递送系统可以由烟草植物或其部分制备(例如，可以包含烟草植物或其部分)，所述烟草植物或其部分由根据本发明的烟草植物繁殖材料繁殖。
适当地，递送系统可以由根据本发明的烟草植物的收获的叶片制备(例如，可以包含根据本发明的烟草植物的收获的叶片)。
适当地，递送系统可以由根据本发明的加工烟草叶片制备(例如可以包含根据本发明的加工烟草叶片)。
适当地，递送系统可以由根据本发明的调制后的烟草材料制备(例如可以包含根据本发明的调制后的烟草材料)。
适当地，递送系统可以由根据本发明的烟草掺合物制备(例如可以包含根据本发明的烟草掺合物)。
在一个实施方案中，递送系统是选自香烟、小雪茄和雪茄的可燃吸烟制品。
在一个实施方案中，递送系统包含可燃吸烟制品的一种或多种部件例如过滤嘴、过滤嘴条、过滤嘴条段(filter rod segment)、烟草、烟草条、烟草条段、塞子，添加物释放部件例如胶囊、线、珠，纸例如成型纸、接装纸或卷烟纸。
在一个实施方案中，递送系统是非可燃气雾剂供应系统。
在一个实施方案中，递送系统包括非可燃气雾剂供应系统的一种或多种部件，例如加热器和可雾化基质。
在一个实施方案中，气雾剂供应系统是电子香烟，也称为蒸汽烟设备。
在一个实施方案中，电子香烟包括加热器、能够向加热器供电的电源、可气雾化基质例如液体或凝胶、外壳以及任选的接口。
在一个实施方案中，可气雾化基质被容纳在基质容器中。在一个实施方案中，基质容器与加热器结合或包括加热器。
在一个实施方案中，递送系统是加热产品，其通过加热而不是燃烧基质材料而释放一种或多种化合物。基质材料是可气雾化材料，其可以是例如烟草或其它非递送系统，其可以含有或可以不含有尼古丁。在一个实施方案中，加热产品是烟草加热产品。
在一个实施方案中，加热产品是电子设备。
在一个实施方案中，烟草加热产品包括加热器、能够向加热器供电的电源、可气雾化基质例如固体或凝胶材料。
在一个实施方案中，加热产品是非电子制品。
在一个实施方案中，加热产品包括可气雾化基质例如固体或凝胶材料和热源，所述热源能够在没有任何电子工具的情况下向可气雾化基质供应热能，例如通过燃烧诸如炭的燃烧材料。
在一个实施方案中，加热产品还包括能够过滤通过加热可气雾化基质而生成的气雾剂的过滤器。
在一些实施方案中，可气雾化基质材料可以包含蒸气或气雾剂生成剂或湿润剂，例如甘油、丙二醇、乙酸甘油酯或二甘醇。
在一个实施方案中，递送系统是混杂系统，以通过加热而不燃烧基质材料的组合来生成气雾剂。基质材料可以包括例如固体、液体或凝胶，其可以含有或可以不含有尼古丁。在一个实施方案中，混杂系统包括液体或凝胶基质和固体基质。固体基质可以是例如烟草或其它非递送系统，其可以含有或可以不含有尼古丁。在一个实施方案中，混杂系统包括液体或凝胶基质和烟草。
在另一个实施方案中，产物可以包含本发明的构建体，其调节至少一种Nic3基因的活性或表达，并且从而当在植物(例如烟草植物)中表达时，降低生物碱含量(例如尼古丁含量)。
在另一个实施方案中，产物可以包含本发明的一种或多种构建体，其调节Nic3基因活性或表达(或者Nic3基因活性或表达和Nic1 ERF基因活性或表达和/或Nic2 ERF基因活性或表达)，其中所述产物具有调节的生物碱含量(例如减少的尼古丁含量)。
在一个实施方案中，提供了本发明的植物(例如烟草植物)生产叶片(例如烟草叶片)的用途。适当地，叶片(例如烟草叶片)可以经受下游应用，例如加工。因此，在一个实施方案中，前述实施方案的使用可以提供加工叶片(例如，加工烟草叶片)。适当地，烟草叶片可以经受调制、发酵、巴氏灭菌或其组合。
在另一个实施方案中，叶片(例如烟草叶片)可以被切割。在一些实施方案中，叶片(例如烟草叶片)可以在经受调制、发酵、巴氏灭菌或其组合之前或之后被切割。
在一个实施方案中，本发明提供了本发明的植物(例如烟草植物)的收获的叶片。在一个实施方案中，收获的叶片可以是从植物(例如烟草植物)可获得的，所述植物具有调节的Nic3基因活性或表达(或者调节的Nic3和Nic1 ERF和/或Nic2 ERF基因活性或表达)。适当地，收获的叶片具有调节的生物碱含量。在一个进一步的实施方案中，收获的叶片可以是从由本发明的繁殖材料繁殖的植物(例如烟草植物)可获得的(例如获得的)。在另一个实施方案中，提供了可得自本发明的方法或用途的收获的叶片。适当地，收获的叶片可以是切割的收获的叶片。在一些实施方案中，收获的叶片可以包含活细胞(例如，活的烟草细胞)。在一些实施方案中，收获的叶片不包含活细胞(例如，活的烟草细胞)。在其它实施方案中，收获的叶片可以经受进一步加工。
一些烟草植物可以通过切割柄且同时收获所有叶片来收获(例如与白肋烟一样)。其它烟草植物(例如烤烟)可以在过程例如采叶(priming)中分阶段收获，其中各个叶片在它们成熟时从柄上摘下。
如本文使用的，“采叶”指从烟草植物中摘下叶片。这可能指摘下烤烟植物的成熟或成年叶片。
还提供了加工叶片(例如加工烟草叶片)。加工叶片(例如加工烟草叶片)可以是从本发明的植物(例如烟草植物)可获得的。适当地，加工叶片可以是从根据本发明的任何方法和/或用途获得的植物可获得的。在一个实施方案中，加工叶片(例如加工烟草叶片)可以是从植物(例如烟草植物)可获得的，优选地，当与对照叶片相比较，即与来自未根据本发明进行修饰的植物(例如烟草植物)的叶片相比较时，所述植物具有调节的Nic3基因活性或表达(或者Nic3和Nic1 ERF基因和/或Nic2 ERF基因活性或表达)以及调节的生物碱含量。加工叶片(例如加工烟草叶片)可以包含Nic3基因活性或表达(或者Nic3和Nic1 ERF基因和/或Nic2 ERF基因活性或表达)的调节以及调节的生物碱含量。
在另一个实施方案中，加工叶片(例如加工烟草叶片)可以是从由根据本发明的植物(例如烟草植物)繁殖材料繁殖的植物(例如烟草植物)可获得的。本发明的加工叶片(例如加工烟草叶片)是通过加工本发明的收获的叶片可获得的。
如本文使用的，术语“加工叶片”指已经历了本领域中叶片经受的一个或多个加工步骤的叶片。“加工叶片”不包含或基本上不包含活细胞。
如本文使用的，术语“加工烟草叶片”指已经历了本领域中烟草经受的一个或多个加工步骤的烟草叶片。“加工烟草叶片”不包含或基本上不包含活细胞。
术语“活细胞”指能够生长和/或具有代谢活性的细胞。因此，如果细胞被说成不是活的，也被称为“不能存活的”，则细胞不展示活细胞的特征。
术语“基本上无活细胞”意指全部细胞的小于约5%是活的。全部细胞的优选地，小于约3%，更优选小于约1%，甚至更优选小于约0.1%是活的。
在一个实施方案中，加工烟草叶片可以通过以下中的一种或多种进行加工：调制、发酵和/或巴氏灭菌。适当地，加工烟草叶片可以通过调制进行加工。烟草叶片可以通过本领域已知的任何方法进行调制。在一个实施方案中，烟草叶片可以通过选自以下的一种或多种调制方法进行调制：晾制、明火烘烤、火管烘烤和晒制。适当地，烟草叶片可以被晾制。适当地，烟草叶片可以被火管烘烤。
通常，晾制通过将烟草叶片悬挂在通风良好的谷仓中并允许干燥来实现。这通常在四至八周的时间段期间进行。晾制尤其适合于白肋烟。
适当地，烟草叶片可以被明火烘烤。明火烘烤一般通过将烟草叶片悬挂在大型谷仓中来实现，在所述大型谷仓中，让硬木火一直连续或间歇低闷烧着，并且取决于工艺和烟草，通常需要三天至十周。
在另一个实施方案中，烟草叶片可以被火管烘烤。火管烘烤可以包括将烟草叶片串到烟草杆上，并且将它们挂在调制谷仓中的挂烟杆(tier-poles)上。谷仓通常具有以外部供应的火箱运行的焰道。通常，这导致在不暴露于烟的情况下已进行热调制的烟草。通常，温度在调制的过程期间缓慢升高，而整个过程需要大约1周。
适当地，烟草叶片可以被晒制。这种方法一般包括将无覆盖物的烟草暴露于太阳。
适当地，加工烟草叶片可以通过发酵进行加工。发酵可以以本领域已知的任何方式进行。通常，在发酵过程中，将烟草叶片堆成覆盖在例如麻袋中的调制后的烟草垛(堆)以保留水分。叶片内部的剩余水与烟草重量的组合生成了使烟草成熟的天然热量。每天监控堆中心的温度。在一些方法中，每周将整个堆打开。然后取出叶片以摇动且润湿，并且将堆旋转，从而使得内部叶片到外面且底部叶片置于堆的顶部。这确保了整个堆的均匀发酵。叶片上的额外水分加上叶片本身的实际旋转生成热量，从而释放烟草的天然氨并减少尼古丁，同时也加深了颜色并改善了烟草的香气。通常，发酵过程延续最多到6个月，这取决于烟草的变种、叶片上的柄位置、叶片的厚度和预期用途。
适当地，加工烟草叶片可以通过巴氏灭菌进行加工。当烟草叶片将用于制备无烟递送系统，最优选口含烟时，巴氏灭菌可以是特别优选的。烟草叶片巴氏灭菌法可以通过本领域已知的任何方法来进行。例如，巴氏灭菌法可以如J Foulds，L Ramstrom，M Burke，KFagerstrom. Effect of smokeless tobacco (snus) on smoking and public healthin Sweden. Tobacco Control (2003) 12: 349–359中详述的进行，所述参考文献的教导通过引用并入本文。
在口含烟生产过程中，巴氏灭菌法一般通过其中用蒸气将烟草热处理24-36小时(达到大约100℃的温度)的工艺来进行。这导致几乎无菌的产物，并且不希望受理论的束缚，这样的后果之一被认为是限制进一步的TSNA形成。
在一个实施方案中，巴氏灭菌法可以是蒸气巴氏灭菌法。
在一些实施方案中，加工烟草叶片可以被切割。加工烟草叶片可以在加工之前或之后被切割。适当地，加工烟草叶片可以在加工之后被切割。
在一些实施方案中，烟草植物、烟草植物的收获的叶片和/或加工烟草叶片可以用于提取尼古丁。尼古丁的提取可以使用本领域已知的任何方法来实现。例如，用于从烟草中提取尼古丁的方法在通过引用并入本文的US 2,162,738中得到教导。
在一个方面，本发明提供了由根据本发明的烟草植物或其部分制成的调制后的烟草材料。
在另一个方面，本发明提供了烟草掺合物，其包含由根据本发明的烟草植物或其部分制成的烟草材料。在一个方面，本发明提供了烟草掺合物，其包含根据本发明的调制后的烟草材料。
适当地，根据本发明的烟草掺合物可以包含来自根据本发明的烟草植物或其部分的大约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%的烟草。适当地，烟草掺合物可以包含来自根据本发明的烟草植物或其部分的大约10%的烟草。适当地，烟草掺合物可以包含来自根据本发明的烟草植物或其部分的大约20%的烟草。适当地，烟草掺合物可以包含来自根据本发明的烟草植物或其部分的大约30%的烟草。适当地，烟草掺合物可以包含来自根据本发明的烟草植物或其部分的大约40%的烟草。适当地，烟草掺合物可以包含来自根据本发明的烟草植物或其部分的大约50%的烟草。适当地，烟草掺合物可以包含来自根据本发明的烟草植物或其部分的大约60%的烟草。适当地，烟草掺合物可以包含来自根据本发明的烟草植物或其部分的大约70%的烟草。适当地，烟草掺合物可以包含来自根据本发明的烟草植物或其部分的大约80%的烟草。适当地，烟草掺合物可以包含来自根据本发明的烟草植物或其部分的大约90%的烟草。
在一个方面，本发明的烟草掺合物产物包含按干重计至少约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或95百分比的烟草，所述烟草由根据本发明的烟草植物或其部分调制。
适当地，调制后的烟草材料可以被晾制。适当地，调制后的烟草材料可以被火管烘烤。适当地，调制后的烟草材料可以被晒制。
根据本发明的递送系统或吸烟制品可以包含根据本发明的烟草材料(例如，调制后的烟草材料)。
在另一个方面，本发明提供了递送系统。适当地，递送系统可以是掺合的递送系统。在一个实施方案中，递送系统可以由本发明的烟草植物或其部分制备。在一个实施方案中，递送系统可以由烟草植物制备，所述烟草植物具有调节的Nic3基因活性或表达、或者Nic3基因和Nic1 ERF基因和/或Nic2 ERF基因活性或表达。递送系统可以包含Nic1 ERF基因活性或表达的减少以及减少的生物碱含量。适当地，烟草植物或其部分可以由根据本发明的烟草植物繁殖材料繁殖。
如本文在植物(例如烟草植物)的上下文中使用的术语“其部分”指植物(例如烟草植物)的一部分。优选地，“其部分”是植物(例如烟草植物)的叶片。
在另一个实施方案中，递送系统可以由本发明的收获的叶片制备。在一个进一步的实施方案中，递送系统可以由本发明的加工烟草叶片制备。适当地，递送系统可以由通过以下中的一种或多种进行加工的烟草叶片制备：调制、发酵和/或巴氏灭菌。适当地，递送系统可以包含切割的烟草叶片，任选地按照前述实施方案进行加工。
在一个实施方案中，递送系统可以是吸烟制品。如本文使用的，术语“吸烟制品”可以包括可抽吸产品，例如卷烟、香烟、雪茄和小雪茄，无论是基于烟草、烟草衍生物、膨胀烟草、再造的烟草还是烟草取代物。
在另一个实施方案中，递送系统可以是无烟递送系统。如本文使用的，术语“无烟递送系统”指并不预期抽吸和/或经受燃烧的递送系统。在一个实施方案中，无烟递送系统可以包括口含烟、鼻烟、嚼烟等等。
在一个进一步的实施方案中，递送系统可以是烟草加热设备或混杂设备或电子烟等等。通常在加热设备或混杂设备中，通过将热量从热源传递到物理上分开的气雾剂形成基质或材料来生成气雾剂，所述气雾剂形成基质或材料可以位于热源内、周围或下游。在吸烟期间，挥发性化合物通过来自热源的热传递而从气雾剂形成基质释放，并且夹带在通过吸烟制品吸进的空气中。随着释放的化合物冷却，它们凝聚以形成被使用者吸入的气雾剂。
用于消费或抽吸烟草加热设备的气雾剂生成制品和设备是本领域已知的。它们可以包括例如电加热的气雾剂生成设备，其中通过将热量从气雾剂生成设备的一个或多个电加热元件传递到烟草加热设备的气雾剂形成基质来生成气雾剂。适当地，烟草加热设备可以是气雾剂生成设备。
优选地，烟草加热设备可以是加热不燃烧设备。加热不燃烧设备是本领域已知的，并且通过加热而不是燃烧烟草来释放化合物。合适的、加热不燃烧设备的实例可以是通过引用并入本文的WO2013/034459或GB2515502中教导的设备。
在一个实施方案中，烟草加热设备的气雾剂形成基质可以是根据本发明的递送系统。
在一个实施方案中，烟草加热设备可以是混杂设备。
分子农业
本发明可能在植物分子农业领域中特别有用，其中植物或其部分或植物细胞(例如烟草和其它烟草属物种)用于生产蛋白质、肽和代谢物，例如用于生产治疗剂和药物如抗生素、病毒样颗粒、或营养药或小分子。
如本文使用的，“分子农业”涉及在植物或其部分或植物细胞中生产重组蛋白质和/或其它次生代谢物。
适当地，分子农业(或生物制药)可以包括通过引入编码重组蛋白质的核酸序列来修饰植物或其部分或植物细胞，并且在允许所述重组蛋白质表达的条件下，培养包含核酸序列的所述植物或其部分或植物细胞。适当地，该方法可以进一步包括从植物或其部分或植物细胞中提取和任选地纯化重组蛋白质。适当地，分子农业(或生物制药)可以包括通过引入编码重组蛋白质的核酸序列来修饰植物或其部分或植物细胞，在允许所述重组蛋白质表达的条件下，培养包含核酸序列的所述植物或其部分或植物细胞，以及从植物或其部分或植物细胞中提取和纯化重组蛋白质。
适当地，分子农业(或生物制药)可以包括在允许次生代谢物表达的条件下，培养植物或其部分或植物细胞。适当地，该方法可以进一步包括从植物或其部分或植物细胞中提取和任选地纯化次生代谢物。适当地，分子农业(或生物制药)可以包括在允许次生代谢物表达的条件下，培养植物或其部分或植物细胞，以及从植物或其部分或植物细胞中提取和纯化重组蛋白质。
用于从植物或其部分或植物细胞中提取且纯化重组蛋白质和/或次生代谢物的方法是本领域已知的，例如：在美国专利号：US9220295；美国专利号：US9289011；美国专利号：US9175052和美国专利申请号：2016/0029663中。
因此，根据本发明的植物或其部分或植物细胞可以用于分子农业。根据本发明的植物或其部分或植物细胞可以用于减少或消除植物或其部分或植物细胞中尼古丁和/或其它尼古丁生物碱的存在。根据本发明的植物或其部分或植物细胞可以用于减少或消除从植物或其部分或植物细胞提取和/或纯化的产物中尼古丁和/或其它尼古丁生物碱的存在。
有利地，低尼古丁植物或根状茎(rootsock)在分子农业中的使用将减少与从植物或其部分或植物细胞中纯化产物相关的下游加工成本。烟草植物由于其用于大规模和低成本生产的潜力而成为用于生产重组蛋白质的有吸引力的生物反应器。
适用于分子农业中的植物或其部分或植物细胞包括但不限于烟草属物种。适当地，用于分子农业中的植物或其植物或植物细胞可以是本氏烟草(Nicotiana benthamiana)。适当地，用于分子农业中的植物或其植物或植物细胞可以是烟草。
在一个方面，提供了用于分子农业中的烟草植物。例如，根据本发明的烟草植物可以用于生产重组蛋白质。可以在烟草植物中生产的重组蛋白质包括例如：用于生产疫苗的抗原、抗体、酶、疫苗、生长因子。
单克隆抗体及其片段可以通过使用根据本发明的植物或其部分或植物细胞的分子农业进行生产，包括例如免疫球蛋白G (IgG)和免疫球蛋白A (IgA)、IgA和IgG shimmer分子、分泌的IgG和IgA分子、单链可变片段、抗原结合片段、以及重链和轻链的可变。
药物蛋白质可以通过使用根据本发明的植物或其部分或植物细胞的分子农业进行生产，例如，已在植物中表达的药物蛋白质包括促红细胞生成素、干扰素、水蛭素、抑肽酶、Leu-脑啡肽、人生长激素的促生长素。
非药物蛋白质可以通过使用根据本发明的植物或其部分或植物细胞的分子农业进行生产，例如衍生自植物的非药物蛋白质包括抗生物素蛋白、胰蛋白酶、抑肽酶、β-葡糖脑苷脂酶、过氧化物酶和纤维素。
适当地，根据本发明用于分子农业中的植物或其部分或植物细胞可以包含在干重基础上约0.01%、0.02%、0.05%、0.0.75%. 0.1%、0.2%、0.3%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、1.1%、1.2%、1.3%、1,4%、1.5%、1.6%、1.7%、1.8%、1.9%、2.0%、2.1%、2.2%、2.3%、2,4%、2,5%、2.6%、2,7%、2.8%、2.9%、3%、4%或5%的平均生物碱水平或平均尼古丁水平。适当地，根据本发明用于分子农业中的植物或其部分或植物细胞可以包含小于5%、小于4%、小于3%、小于2%、小于1%、小于0.9%、小于0.8%、小于0.7%、小于0.6%、小于0.5%、小于0.4%、小于0.3%、小于0.2%、小于0.1%、小于0.075%、小于0.05%、小于0.02%或小于0.01%的平均生物碱水平或平均尼古丁水平。
适当地，根据本发明的分子农业可以生产产物、提取物或纯化产物(例如重组蛋白质)，其包含在干重基础上约0.01%、0.02%、0.05%、0.0.75%. 0.1%、0.2%、0.3%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、1.1%、1.2%、1.3%、1,4%、1.5%、1.6%、1.7%、1.8%、1.9%、2.0%、2.1%、2.2%、2.3%、2,4%、2,5%、2.6%、2,7%、2.8%、2.9%、3%、4%或5%的平均生物碱水平或平均尼古丁水平。适当地，根据本发明的分子农业可以生产产物、提取物或纯化产物(例如重组蛋白质)，其包含小于5%、小于4%、小于3%、小于2%、小于1%、小于0.9%、小于0.8%、小于0.7%、小于0.6%、小于0.5%、小于0.4%、小于0.3%、小于0.2%、小于0.1%、小于0.075%、小于0.05%、小于0.02%或小于0.01%的平均生物碱水平或平均尼古丁水平。
多核苷酸/多肽/构建体
在本发明的某些实施方案中，适当地在启动子的指导下，可以将调节至少一种Nic3基因(或者至少一种Nic3基因和至少一种Nic1 ERF基因和/或至少一种Nic2 ERF基因)的活性或表达的构建体转化到植物细胞内。
在本发明的某些实施方案中，在启动子的指导下，可以将降低(即抑制) Nic3基因(或者Nic3基因和Nic1 ERF基因和/或Nic2 ERF基因)的活性或表达的构建体转化到植物细胞内。遗传构建体可以是基因编辑构建体或可以包含RNAi分子，所述RNAi分子可以包含小干扰RNA (siRNA)分子或短发夹环(shRNA)分子。
在本发明的某些实施方案中，在启动子的指导下，可以将增加Nic3基因(或者Nic3基因和Nic1 ERF基因和/或Nic2 ERF基因)的活性或表达的构建体转化到植物细胞内，例如编码等价内源基因的构建体。
可以借助于合适的载体例如植物转化载体，将构建体引入根据本发明的植物内。植物转化载体可以包含表达盒，其在转录方向5'-3'上包含启动子序列、靶向Nic3基因(或者Nic3基因和Nic1 ERF基因和/或Nic2 ERF基因)的构建体序列和任选地3'非翻译的终止子序列，包括用于RNA聚合酶的终止信号和用于多腺苷酸化酶(polyadenylase)的多腺苷酸化信号。启动子序列可以以一个或多个拷贝存在，并且这种拷贝可以是相同的或是如上所述的启动子序列的变体。终止子序列可以得自植物、细菌或病毒基因。合适的终止子序列是例如豌豆rbcS E9终止子序列，衍生自根癌农杆菌的胭脂氨酸合成酶基因的nos终止子序列，以及来自花椰菜花叶病毒的35S终止子序列。本领域技术人员将容易地知道其它合适的终止子序列。
本发明的构建体还可以包含基因表达增强机制，以增加启动子的强度。这种增强子元件的实例是衍生自豌豆质体蓝素基因的启动子的一部分的增强子元件，并且是通过引用并入本文的国际专利申请号WO 97/20056的主题。合适的增强子元件可以是例如衍生自根癌农杆菌的胭脂氨酸合成酶基因的nos增强子元件，以及来自花椰菜花叶病毒的35S增强子元件。
这些调控区可以衍生自与启动子DNA序列相同的基因，或者可以衍生自来自烟草或其它生物，例如来自茄科(Solanaceae)植物或来自亚科亚香树亚科(Cestroideae)的不同基因。所有调控区都应该能够在待转化组织的细胞中起作用。
启动子DNA序列可以衍生自与感兴趣的基因相同的基因，例如启动子将要指导的基因，例如编码本发明的Nic3基因的基因，本发明中使用的编码序列，或者可以衍生自来自烟草或另一种生物，例如来自茄科植物或来自亚科亚香树亚科的不同基因。
可以将表达盒并入基础植物转化载体，例如pBIN 19 Plus、pBI 101、pKYLX71:35S2、pCAMBIA2300或本领域已知的其它合适的植物转化载体内。除表达盒之外，植物转化载体将含有如对于转化过程必需的这种序列。这些可以包括农杆菌属vir基因，一个或多个T-DNA边界序列(border sequences)，以及选择性标记物或鉴定转基因植物细胞的其它手段。
术语“植物转化载体”意指能够在体内或体外表达的构建体。优选地，将表达载体并入生物的基因组中。术语“并入”优选包括稳定并入基因组内。
用于转化植物的技术是本领域众所周知的，并且包括例如农杆菌属介导的转化。基因修饰植物的构建中的基本原理是在植物基因组中插入遗传信息，以便获得所插入的遗传物质的稳定维持。一般技术的综述可以在通过Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205-225)和Christon (AgroFood-Industry Hi-Tech 1994年3月/4月17-27)的论文中找到，所述参考文献通过引用并入本文。
通常，在农杆菌属介导的转化中，通过农杆菌属与来自靶植物的外植体的共培养，将携带感兴趣的外源DNA的双元载体，即Nic3构建体，从适当的农杆菌属菌株转移到靶植物。然后在选择培养基上再生转化的植物组织，所述选择培养基包含选择性标记物和植物生长激素。替代方案是浸花法(Clough & Bent，1998 Plant J. 1998年12月；16(6):735-43，其通过引用并入本文)，由此使完整植物的花芽与含有嵌合基因的农杆菌属菌株的悬浮液接触，并且在结实之后，通过在选择培养基上的生长，使转化的个体萌发并进行鉴定。通过农杆菌属直接感染植物组织是简单技术，其已得到广泛采用，并且在Butcher D. N.等人，(1980)，Tissue Culture Methods for Plant Pathologists，编辑: D. S. Ingrams和J.P. Helgeson，203-208中进行描述，所述参考文献通过引用并入本文。
进一步的合适转化方法包括例如使用聚乙二醇或电穿孔技术、粒子轰击、显微注射以及碳化硅纤维的使用，将基因直接转移到原生质体内。使用冲击转化(ballistictransformation)包括碳化硅须晶技术来转化植物在Frame B R，Drayton P R，Bagnaall SV，Lewnau C J，Bullock W P，Wilson H M，Dunwell J M，Thompson J A & Wang K(1994)中得到教导，所述参考文献通过引用并入本文。通过碳化硅须晶介导的转化生产能育的转基因玉米植物在The Plant Journal 6: 941-948中得到教导，所述参考文献通过引用并入本文)，并且病毒转化技术在例如Meyer P，Heidmmm I & Niedenhof I(1992)中得到教导，所述参考文献通过引用并入本文。木薯花叶病毒作为用于植物的载体系统的用途在Gene110: 213-217中得到教导，所述参考文献通过引用并入本文。关于植物转化的进一步教导可以在通过引用并入本文的EP-A-0449375中找到。
在一个进一步方面，本发明涉及载体系统，其携带构建体，并且将其引入生物例如植物，适当地烟草植物的基因组内。载体系统可以包含一种载体，但它可以包含两种载体。在两种载体的情况下，载体系统通常被称为双元载体系统。双元载体系统在GynheungAnetal，(1980)，Binary Vectors，Plant Molecular Biology Manual A3，1-19中得到进一步详细描述，所述参考文献通过引用并入本文。
用于转化植物细胞的一种广泛采用的系统使用来自根癌农杆菌的Ti质粒或来自发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的Ri质粒，其通过An等人，(1986)，Plant Physiol. 81，301-305和Butcher D. N.等人，(1980)，Tissue Culture Methods for Plant Pathologists，编辑: D. S. Ingrams和J.P. Helgeson，203-208进行描述，所述参考文献通过引用并入本文。在植物中根据本发明的所期望的外源基因的每种引入方法后，进一步的DNA序列的存在和/或插入可能是必需的。T-DNA用于植物细胞转化的用途已得到充分研究，并且在EP-A-120516；Hoekema，in: The Binary Plant Vector System Offset-drukkerij Kanters B. B.，Amsterdam，1985，第V章；Fraley等人，Crit. Rev. Plant Sci.，4:1-46；以及Anetal.，EMBO J (1985) 4:277-284中进行描述，所述参考文献通过引用并入本文。
根据众所周知的组织培养方法，例如通过在供应有必需生长因子如氨基酸、植物激素、维生素等的合适培养基中培养细胞，可以生长且维持用一种或多种构建体转化的植物细胞，所述一种或多种构建体调节Nic3基因(或者Nic3基因和Nic1 ERF基因和/或Nic2 ERF基因)的活性或表达。
与本发明有关的术语“转基因植物”包括包含构建体的任何植物，所述构建体调节根据本发明的Nic3基因(或者Nic3基因和Nic1 ERF基因和/或Nic2 ERF基因)的活性或表达。相应地，转基因植物是已用根据本发明的构建体进行转化的植物。优选地，根据本发明，转基因植物显示出调节的Nic3基因活性或表达(或者Nic3基因和Nic1 ERF基因和/或Nic2 ERF基因的活性或表达)以及调节的生物碱含量。术语“转基因植物”不包括当处于其天然启动子(所述天然启动子也处于其自然环境中)的控制下时处于其自然环境中的天然核苷酸编码序列。
在一个方面，根据本发明的Nic3基因、Nic1 ERF基因、Nic2 ERF基因、构建体、植物转化载体或植物细胞处于分离的形式。术语“分离的”意指序列至少基本上不含该序列与之在自然界中天然结合且如自然界中发现的至少一种其它组分。
在一个方面，根据本发明的Nic3基因、Nic1 ERF基因、Nic2 ERF基因、构建体、植物转化载体或植物细胞处于纯化的形式。术语“纯化的”意指处于相对纯的状态，例如至少约90%纯、或至少约95%纯或至少约98%纯。
如本文使用的，术语“核苷酸序列”指寡核苷酸序列或多核苷酸序列，以及其变体、同源物、片段和衍生物(例如其部分)。核苷酸序列可以具有基因组或合成或重组起源，其可以是双链或单链的，无论代表有义链还是反义链。
与本发明有关的术语“核苷酸序列”包括基因组DNA、cDNA、合成DNA和RNA。优选地，它意指编码本发明的DNA，更优选cDNA序列。
在一个优选的实施方案中，当与本发明本身的范围有关并且当被本发明的范围本身包括时，核苷酸序列即Nic3基因、Nic1 ERF基因或Nic2 ERF基因包括当处于其自然环境中时并且当它连接到也处于其自然环境中的一种或多种其天然相关序列时的天然核苷酸序列。为了便于参考，我们应该将这个优选实施方案称为“天然核苷酸序列”。在这方面，术语“天然核苷酸序列”意指整个核苷酸序列，其处于其自然环境中，并且当可操作地连接至它与之天然结合的整个启动子时，所述启动子也处于其自然环境中。
可以从产生所述蛋白质的任何细胞或生物中鉴定和/或分离和/或纯化核苷酸序列，所述核苷酸序列编码具有作为如本文定义的Nic3基因、Nic1 ERF或Nic2 ERF的特定性质的蛋白质或者适合于修饰的蛋白质。用于核苷酸序列的鉴定和/或分离和/或纯化的各种方法是本领域内众所周知的。例如，一旦合适的序列已鉴定和/或分离和/或纯化，就可以使用PCR扩增技术来制备更多的序列。
在一个再进一步的替代方案中，编码Nic3基因、Nic1 ERF或Nic2 ERF的核苷酸序列可以通过确立的标准方法进行合成制备，所述标准方法例如通过Beucage S.L.等人，(1981) Tetrahedron Letters 22，第1859-1869页(其通过引用并入本文)描述的亚磷酰胺法，或者通过Matthes等人，(1984) EMBO J. 3，第801-805页(其通过引用并入本文)描述的方法。在亚磷酰胺法中，寡核苷酸例如在自动DNA合成仪中合成、纯化、退火、连接且在适当的载体中克隆。
如本文使用的，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“酶”同义。
本发明还包括序列的使用，所述序列与具有本文定义的特定性质的多肽的一种或多种氨基酸序列、或任何核苷酸序列即编码这种多肽的Nic3基因、Nic1 ERF基因、Nic2 ERF基因具有一定程度的序列同一性或序列同源性(在下文中被称为“一种或多种同源序列”)。此处，术语“同源物”意指与主题氨基酸序列和主题核苷酸序列具有一定同源性的实体。此处，术语“同源性”可以与“同一性”相等。
同源氨基酸序列和/或核苷酸序列和/或片段应该提供和/或编码多肽，其保留Nic3或Nic1 ERF或Nic2 ERF基因的功能活性和/或增强Nic3或Nic1 ERF或Nic2 ERF基因的活性。通常，同源序列将包含例如与主题氨基酸序列相同的活性位点等，或者将编码相同的活性位点。尽管同源性也可以按照相似性加以考虑(即具有相似化学性质/功能的氨基酸残基)，但在本发明的背景下，它优选表示按照序列同一性的同源性。同源序列一般保留功能性结构域或基序。
在一个实施方案中，采用同源序列以包括氨基酸序列或核苷酸序列，所述氨基酸序列或核苷酸序列与主题序列相比具有一个、两个或几个添加、缺失和/或取代。
同源性或同一性比较可以通过眼力进行，或更通常地，借助于可容易获得的序列比较程序进行。这些商购可得的计算机程序可以计算两个或更多个序列之间的%同源性。%同源性或%同一性可以在邻接序列上进行计算，即一个序列与另一序列进行比对，并且一个序列中的每个氨基酸与另一序列中的相应氨基酸直接进行比较，一次比较一个残基。这称为“无缺口”比对。通常，仅在相对短数目的残基上执行这种无缺口比对。
尽管这是非常简单且一致的方法，但它未能考虑到，例如，在其它方面等同的序列对中，一个插入或缺失将导致后面的氨基酸残基不能比对，因此潜在地导致当执行总体比对时，%同源性的大大降低。因而，大多数序列比较方法被进行设计以产生最佳比对，其在不过度惩罚总同源性得分的情况下考虑到可能的插入和缺失。这通过在序列比对中插入“缺口”以尝试使局部同源性达到最大来实现。
然而，这些更复杂的方法将“缺口罚分(gap penalties)”分配给比对中出现的每个缺口，从而使得对于相同数目的相同氨基酸，具有尽可能少的缺口的序列比对 - 反映了两个比较的序列之间的更高相关性 – 将获得比具有许多缺口的比对更高的得分。一般使用“仿射缺口成本(Affine gap cost)”，其对于缺口的存在负担相对高的成本，而对缺口中的每个之后的残基负担较小的罚分。这是最常用的缺口评分系统。高缺口罚分将当然产生具有较少缺口的最优化比对。大多数比对程序允许修改缺口罚分。然而，当使用这种软件用于序列比较时，优选使用缺省值。
因此，最大%同源性的计算首先需要产生考虑到缺口罚分的最佳比对。用于进行这种比对的合适计算机程序是Vector NTI(Invitrogen Corp.)。可以执行序列比较的软件实例包括，但不限于，例如BLAST程序包(参见Ausubel等人1999 Short Protocols inMolecular Biology，第4版 - 第18章)、BLAST 2 (参见FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50；FEMS Microbiol Lett 1999 177 (1): 187-8和tatiana@ ncbi.nlm.nih.gov)、FASTA (Altschul等人1990 J. Mol. Biol. 403-410)和AlignX。至少BLAST、BLAST 2和FASTA可用于离线和在线检索(参见Ausubel等人1999，第7-58至7-60页)。
尽管最终的%同源性可以按照同一性进行测量，但比对过程本身一般不基于全或无成对比较。相反，通常使用改变比例的相似性得分矩阵，其基于化学相似性或进化距离对每个配对比较分配得分。通常使用的这种矩阵的实例是BLOSUM62矩阵 - BLAST程序套件的缺省矩阵。Vector NTI程序通常使用公开的缺省值或惯例符号比较表(如果提供的话) (关于进一步细节，参见用户手册)。对于一些应用，优选使用Vector NTI程序包的缺省值。
可替代地，可以基于类似于CLUSTAL(Higgins DG & Sharp PM(1988)，Gene 73(1)，237-244)的算法，使用Vector NTI(Invitrogen Corp.)中的多重比对特征计算来百分比同源性。一旦软件已产生最佳比对，就可能计算%同源性，优选%序列同一性。软件一般将其作为序列比较的一部分来执行，并且生成数值结果。
如果当确定序列同一性时应该使用缺口罚分，则优选地下述参数用于配对比对：
对于BLAST
缺口打开(GAP OPEN) 0
缺口延伸(GAP EXTENSION) 0
对于CLUSTAL DNA 蛋白质
字长 2 1 K三联体
缺口罚分 15 10
缺口延伸 6.66 0.1
在一个实施方案中，CLUSTAL可以与如上定义的缺口罚分和缺口延伸集合一起使用。在一些实施方案中，用于BLAST或CLUSTAL比对的缺口罚分可以不同于上文详述的那些。技术人员将理解，用于执行BLAST和CLUSTAL比对的标准参数可能定期改变，并且将能够基于当时对于BLAST或CLUSTAL比对算法详述的标准参数来选择适当的参数。
适当地，可以在至少50个邻接核苷酸上，优选在至少60个邻接核苷酸上，优选在至少70个邻接核苷酸上，优选在至少80个邻接核苷酸上，优选在至少90个邻接核苷酸上，优选在至少100个邻接核苷酸上，优选在至少150个邻接核苷酸上，优选在至少200个邻接核苷酸上，优选在至少250个邻接核苷酸上，优选在至少300个邻接核苷酸上，优选在至少350个邻接核苷酸上，优选在至少400个邻接核苷酸上，优选在至少450个邻接核苷酸上，优选在至少500个邻接核苷酸上，优选在至少550个邻接核苷酸上，优选在至少600个邻接核苷酸上，优选在至少650个邻接核苷酸上，或优选在至少700个邻接核苷酸上，确定关于核苷酸序列的同一性程度。
适当地，可以在整个序列上确定关于核苷酸、cDNA、CDS或氨基酸序列的同一性程度。
序列还可以具有氨基酸残基的缺失、插入或取代，其产生沉默变化并导致功能上等价的物质。可以基于残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲特性中的相似性，来进行有意的氨基酸取代，只要物质的次级结合活性得到保留。例如，带负电的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；且具有相似的亲水性值的具有不带电的极性头基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。
可以例如根据下表4进行保守取代。第二列中相同组中的氨基酸，且优选第三列中的同一行中的氨基酸可以彼此取代：
表4：保守取代的实例
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本发明还包括可能出现的同源取代(取代和置换两者在本文中均用于意指现有氨基酸残基与可替代残基的互换)，即同类(like-for-like)取代，例如碱性取代碱性、酸性取代酸性、极性取代极性等。非同源取代也可以出现，即从一类残基到另一类残基，或者另一方面涉及非天然氨基酸的包括，所述非天然氨基酸例如鸟氨酸(下文称为Z)、二氨基丁酸鸟氨酸(下文称为B)、正亮氨酸鸟氨酸(下文称为O)、吡啶基丙氨酸、噻吩丙氨酸、萘基丙氨酸和苯甘氨酸。
置换也可以由非天然氨基酸进行，所述非天然氨基酸包括；α*和α-双取代的*氨基酸，N-烷基氨基酸*，乳酸*，天然氨基酸的卤化物衍生物例如三氟酪氨酸*，对- Cl -苯丙氨酸*，对-Br-苯丙氨酸*，对-I-苯丙氨酸*，L-烯丙基-甘氨酸*，β-丙氨酸*，L-α-氨基丁酸*，L-γ-氨基丁酸*，L-α-氨基异丁酸*，L-ε-氨基己酸#，7-氨基庚酸*，L-甲硫氨酸砜#*，L-正亮氨酸*，L-正缬氨酸*，对硝基-L-苯丙氨酸*，L-羟脯氨酸#，L-硫代脯氨酸(thioproline)*，苯丙氨酸(Phe)的甲基衍生物例如4-甲基-Phe*，五甲基-Phe*，L-Phe(4-氨基)#，L-Tyr(甲基)*，L-Phe(4-异丙基)*，L-Tic(1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸)*，L-二氨基丙酸#和L-Phe(4-苄基)*。记号*已用于上文讨论的目的(与同源取代或非同源取代有关)，以指示衍生物的疏水特性，而#已用于指示衍生物的亲水特性，#*指示两亲特征。
除氨基酸间隔基例如甘氨酸或β-丙氨酸残基之外，变体氨基酸序列可以包括合适的间隔基，其可以插入序列的任何两个氨基酸残基之间，包括烷基例如甲基、乙基或丙基。进一步的变异形式涉及拟肽形式的一个或多个氨基酸残基的存在，其将是本领域技术人员充分理解的。为了避免疑问，“拟肽形式”用于指变体氨基酸残基，其中α-碳取代基位于残基的氮原子而不是α-碳上。用于制备拟肽形式的肽的方法是本领域已知的，例如Simon RJ等人，PNAS(1992)89(20)，9367-9371以及Horwell DC，Trends Biotechnol. (1995)13 (4)，132-134。
用于本发明中的核苷酸序列可以在其内包括合成或修饰的核苷酸。许多不同类型的对寡核苷酸的修饰是本领域已知的。这些包括甲基膦酸酯和硫代磷酸酯主链和/或在分子的3'和/或5'端处的吖啶或聚赖氨酸链添加。对本发明来说，应理解本文描述的核苷酸序列可以通过本领域中可获得的任何方法进行修饰。可以进行这种修饰，以增强本发明的核苷酸序列的体内活性或寿命。
本发明还包括与本发明的核酸序列互补的序列，或能够与本发明的序列或与和其互补的序列杂交的序列。如本文使用的，术语“杂交”应该包括“通过其核酸链经由碱基配对与互补链结合的过程”，以及如在聚合酶链反应(PCR)技术中进行的扩增过程。
本发明还涉及可以与本发明的核苷酸序列(包括本文呈现的那些的互补序列)杂交的核苷酸序列。优选地，在严格性条件(例如50℃和0.2xSSC {1xSSC = 0.15 M NaCl、0.015 M柠檬酸Na3，pH 7.0})下测定杂交。更优选地，在高严格性条件(例如65℃和0.1xSSC{1xSSC = 0.15 M NaCl、0.015 M柠檬酸Na3，pH 7.0})下测定杂交。
在一个方面，用于本发明中的序列是合成序列 - 即已通过体外化学或酶促合成进行制备的序列。它包括但不限于用对于宿主生物的最佳密码子使用制备的序列。
术语“表达载体”意指能够在体内或体外表达的构建体。在一个实施方案中，本发明的载体表达如本文所述的Nic3基因。在一个实施方案中，本发明的载体进一步表达如本文所述的Nic1 ERF和/或Nic2 ERF基因。优选地，将表达载体并入合适宿主生物的基因组内。术语“并入”优选包括稳定并入基因组内。
用于本发明中的核苷酸序列可以存在于载体中，其中所述核苷酸序列可操作地连接至调控序列，所述调控序列能够保证核苷酸序列由合适的宿主生物的表达。用于本发明中的构建体可以转化到如本文所述的合适的宿主细胞内，以保证本发明的多肽的表达。载体例如质粒、粘粒或噬菌体载体的选择经常取决于它待引入其内的宿主细胞。载体可以在体外例如用于RNA的生产，或者用于转染、转化、转导或感染宿主细胞。
在一些应用中，用于本发明中的核苷酸序列可操作地连接至调控序列，所述调控序列能够保证核苷酸序列例如通过所选宿主细胞的表达。例如，本发明包括包含与这种调控序列可操作地连接的如本文所述的Nic3基因的核苷酸序列的载体，即载体是表达载体。适当地，载体可以另外包含与调控序列可操作地连接的如本文所述的Nic1 ERF基因和/或Nic2 ERF基因的核苷酸序列。
术语“可操作地连接的”指其中所述组分处于允许其以其预期方式起作用的关系中的并列。与编码序列“可操作地连接”的调控序列以这样的方式连接，从而使得在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。
术语“调控序列”包括启动子和增强子以及其它表达调节信号。术语“启动子”以本领域的通常含义使用，例如RNA聚合酶结合位点。编码Nic3基因或者与Nic1 ERF基因和/或Nic2 ERF基因组合的Nic3基因的构建体内的核苷酸序列可以与至少一个启动子可操作地连接。
与术语例如“盒”或“载体”同义的术语“构建体”包括直接或间接附着至启动子的用于根据本发明使用的核苷酸序列。
间接附着的实例是在启动子和本发明的核苷酸序列的中间，提供合适的间隔基团，例如内含子序列，例如Sh1-内含子或ADH内含子。对于与本发明有关的术语“融合的”同样如此，其包括直接或间接附着。在一些情况下，所述术语并不包括通常与野生型基因启动子结合，以及当它们均处于其自然环境中时的编码蛋白质的核苷酸序列的天然组合。构建体甚至可以含有或表达标记物，其允许遗传构建体的选择。
用于转化植物的一般技术的综述可以在通过Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205-225)和Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech 1994年3月/4月17-27)的论文中找到，所述参考文献通过引用并入本文。关于植物转化的进一步教导可以在通过引用并入本文的EP-A-0449375中找到。
在一个实施方案中，本文提供的是用于对具有低生物碱(例如，低尼古丁)性状的植物(例如烟草植物)进行基因分型的SNP。适当地，SNP可以选自下表5-9。适当地，可以选择至少两种SNP，第一SNP可以选自表5至7中的任一种，并且第二SNP可以选自表5至7中的任一种。适当地，可以选择至少两种SNP，第一SNP可以选自表5，并且第二SNP可以选自表5。适当地，可以选择至少两种SNP，第一SNP可以选自表6，并且第二SNP可以选自表6。适当地，可以选择至少两种SNP，第一SNP可以选自表7，并且第二SNP可以选自表7。
在一个实施方案中，本文提供的是用于对具有低生物碱(例如，低尼古丁性状)的植物(例如烟草植物)进行基因分型的标记物。
在一个实施方案中，本文提供的是用于对植物(例如烟草植物)中的Nic3基因座进行基因分型的SNP。适当地，SNP可以选自下表5-7。
在一个实施方案中，本文提供的是用于对植物(例如烟草植物)中的Nic3基因座进行基因分型的标记物。
表5与实施例中鉴定的QTL相关的SNP。
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表6. 与实施例中鉴定的Nic3基因座相关的SNP。
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表7. 与标记物Nt2AG2015相关的SNP。
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在一个实施方案中，本文提供的是用于鉴定具有低水平尼古丁的植物的标记物。
用于对Nic1和/或Nic2基因座进行基因分型的SNP或标记物可在通过引用并入本文的WO2018237107中获得。
如本文使用的，“SNP”或“单核苷酸多态性”意指当基因组序列中的单个核苷酸(A、T、C或G)相对于参考序列改变或可变时发生的序列变异。当SNP被映射到基因组上的位点时，存在“SNP标记物”。
如本文使用的，“标记物”或“SNP标记物”意指足够唯一以表征基因组上的特定基因座的核酸或氨基酸序列。如果多态性性状是差异遗传的并且与感兴趣的表型性状显示出连锁不平衡，则它可以用作标记物。当性状被陈述为与给定标记物相连锁时，应理解其序列影响性状的实际DNA区段通常与标记物共隔离。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与本公开内容所属领域中的普通技术人员通常理解的相同的含义。Singleton等人，DICTIONARY OFMICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY，20 ED.，John Wiley and Sons，New York(1994)以及Hale & Marham，THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY，Harper Perennial，NY(1991)为技术人员提供了本公开内容中使用的众多术语的一般字典。
本公开内容并不受本文公开的示例性方法和材料的限制，并且与本文描述的那些方法和材料相似或等价的任何方法和材料都可以用于本公开内容的实施方案的实践或测试中。数值范围包括限定范围的数值在内。除非另外指出，否则分别地，任何核酸序列均以5'至3'的取向从左到右书写；氨基酸序列以氨基至羧基的取向从左到右书写。
本文提供的标题不是对本公开内容的各个方面或实施方案的限制，其可以通过整个地参考说明书来获得。相应地，紧在下文定义的术语通过整个地参考说明书更全面地定义。
氨基酸在本文中使用氨基酸的名称、三字母缩写或单字母缩写来提及。如本文使用的，术语“蛋白质”包括蛋白质、多肽和肽。如本文使用的，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“酶”同义。
在本公开内容和权利要求中，可以使用氨基酸残基的常规单字母和三字母代码。氨基酸的3-字母代码如依照IUPACIUB生物化学命名联合委员会(IUPACIUB JointCommission on Biochemical Nomenclature) (JCBN)定义的。还应理解，由于遗传密码的简并性，多肽可以由不止一种核苷酸序列编码。
术语的其它定义可能在整个说明书中出现。在更详细地描述示例性实施方案之前，应理解，本公开内容并不限于所述的特定实施方案，因为这些当然可以变化。还应理解，本文使用的术语学仅为了描述特定实施方案起见，且不预期是限制性的，这是因为本公开内容的范围将仅受所附权利要求的限制。
本文描述的各个实施方案仅呈现用于帮助理解和教导请求保护的特征。这些实施方案仅作为实施方案的代表性样品提供，并且不是详尽的和/或排他的。应理解，本文所述的优点、实施方案、实施例、功能、特征、结构和/或其它方面不应被视为对如通过权利要求限定的本发明范围的限制或对权利要求的等价物的限制，并且可以利用其它实施方案并且可以进行修改，而不背离本发明的范围。本发明的各个实施方案可以适当地包含除本文具体所述外的所公开元件、部件、特征、部分、步骤、手段等的适当组合，由其组成或基本上由组成。另外，本公开内容可能包括目前未请求保护但将来可能请求保护的其它发明。
在提供值范围的场合，应理解，除非上下文另有明确指示，否则在所述范围的上限和下限之间的每个以下限单位的十分之一为基准的中间值也被具体公开。在规定范围内的任何规定值或中间值与所述规定范围内的任何其它规定值或中间值之间的每个较小范围都包括在本公开内容内。根据规定范围中任何具体排除的限值，这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在所述范围内或从所述范围中排除，并且其中在较小范围内包括任一限值、不包括限值或包括两个限值的每个范围也包括在本公开内容中。在规定范围包括一个或两个限值的场合，排除这些包括的限值中的任一或两者的范围也包括在本公开内容中。
必须指出的是，如本文和所附权利要求中使用的，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该/所述(the)”包括复数对象，除非上下文另有明确指示。因此，例如，提及“酶”或“硝酸还原酶”包括本领域技术人员已知的多种这种候选试剂及其等价物，等等。
优点
已令人惊讶地发现，通过调节如本文教导的Nic3基因的活性或表达，例如通过提供在Nic3基因座中的突变，可以调节烟草细胞和烟草植物或其部分的生物碱含量(例如尼古丁含量)和/或TSNA前体含量。由此，可以生产具有调节的生物碱(例如减少的尼古丁)和/或减少的TSNA前体含量、以及由递送系统的消费者所追求的商业上期望性状的递送系统。特别地，通过提供在Nic3基因座中的至少一种突变、以及任选地在Nic1基因座中的至少一种突变和/或在Nic2基因座中的至少一种突变，可以生产具有减少的尼古丁含量的烟草细胞和烟草植物或其部分。
本发明人已首次鉴定了能够产生超低尼古丁表型的新基因座。在本发明之前，尚不知道如本文所述的Nic3基因的活性或表达的调节可以用于调节生物碱和/或TSNA含量。
本发明人已确定，本文称为Nic3基因座的新基因座的调节，可以将修饰的植物的生物碱含量(例如尼古丁含量)减少到令人惊讶地低水平。特别地，本发明人已确定，通过提供在Nic3基因座中的至少一种突变、以及任选地在Nic1基因座中的至少一种突变和/或在Nic2基因座中的至少一种突变，可以将生物碱含量(例如尼古丁含量)减少到令人惊讶地低水平。
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实施例
实施例1 – 对于Nic3隔离的种群的开发
基于单独的这两个基因座，发现含有nic1和nic2的烤烟变种(FC101)具有低于预计的尼古丁水平。
本发明人假设第三个基因座Nic3控制该变种中减少的尼古丁水平。在此处，我们呈现了关于鉴定控制该基因座的潜在基因的工作。
植物材料
为了开发对于Nic3隔离的种群，由FC101 (nic1 nic2 nic3)和LAFC53 (nic1 nic2 Nic3)之间的杂交生成了262个个体的F2种群。
所有个体连同两个亲本的五个重复在温室中播种，然后在正常的美国生长季节期间，移植到Kernersville，North Carolina的田间。
在收获前，植物生长直至移植后140天。下部、中部和上部柄叶片位置在它们变得成熟时进行收获。然后按照标准火管烘烤实践在六架火管烘烤谷仓中调制上部叶片(顶部5-7个叶片)。
实施例2 – 衍生自FC101 (nic1 nic2 nic3)和LAFC53 (nic1 nic2 Nic3)之间的 杂交的亲本和F2的表型分析
对于亲本双方以及来自F2种群的218个个体，在三个技术重复中测量了尼古丁和降烟碱。
我们经由标准气相层析测量生物碱。
结果
两个亲本的尼古丁和降烟碱含量分析显示了，与LAFC53相比，FC101含有显著更低的两种生物碱水平(图1)。
发现衍生自FC101 x LAFC53的F2植物的尼古丁水平是连续分布的(图2A)，因此不能基于表型值明确地推断Nic3的基因型。
发现F2中的降烟碱含量在很大程度上是一致的，其中少数个体显示出自发高水平的降烟碱(图2B)。
实施例3 - 标记物开发和连锁分析
使用CTAB方法从所有F2系及其各自亲本的叶片样品中提取DNA。选择所有F2系和亲本DNA样品用于使用定制的烟草50K Infinium iSelect HD BeadChip (Illumina Inc.，San Diego，CA)的SNP基因分型。使用GenomeStudio版本2.0 (Illumina Inc.，San Diego，CA)生成SNP簇，并且所有鉴定的多态性标记物都用于进一步分析。使用软件Joinmap版本4.0 (Stam，1993)，使用回归映射函数，伴随默认设置，来构建用于种群的遗传连锁图。
为了粗略绘制nic3基因座，使用Haley-Knott回归方法，使用R/QTL (Broman &Sen，2009；Manichaikul等人2009)的stepwiseqtl功能，对两个种群进行多重QTL映射，其中基因型概率在1 cM的最大距离和1000个排列下计算，以确定在逐个实验α = 0.01下，用于并入加性QTL和上位相互作用两者的几率(LOD)显著阈值的对数。
结果
衍生自FC101 x LAFC53的F2个体的iSelect HD BeadChip基因分型
为了经由QTL分析鉴定Nic3基因座，我们随后用定制的50K Infinium iSelect HDBeadChip，对F2个体进行基因分型。使用iSelect HD BeadChip，我们鉴定了在FC101和LAFC53之间是多态性的大约4,400种SNP标记物。
这些标记物能够映射到F2种群中的2992个独特基因座。
F2种群的QTL分析鉴定了一个连锁群，其含有与总尼古丁含量显著相关的许多标记物(最大LOD得分为22.17)，解释了该性状中37.4%的变异(图3)。
这些标记物与2015年烟草30k Infinium HD共有图谱的连锁群5 (Edwards等人(2017)基因组的假染色体5)上的标记物共定位。
结果
使用鉴定为与尼古丁含量的QTL峰值密切连锁的标记物，我们鉴定了一个基因组区域，其涵盖由标记物Nt1AG1750 (SEQ ID No. 311)和Nt1AC2307 (SEQ ID No. 312)包含的Nic3基因座(图3中的206 cM至398 cM)。
利用Edwards等人(2017)的BioNano混杂组装，我们能够鉴定映射到覆盖该区域的大部分的假染色体的支架。无法置于假染色体上，但在Edwards等人(2017)基因组中，能够唯一地映射到支架的标记物，基于其在遗传图谱上的位置进行整合。我们然后利用来自Edwards等人(2017)的RNA-seq信息，以便改善关于该鉴定区域内的基因的基因模型。
然后基于预测的功能选择候选基因。
鉴定了MYC转录因子(Nitab4.5_0002539g0040.1)，其含有在其编码区(标记物IDNt2AG2015)中的SNP，所述SNP导致氨基酸变化(K87E，其中K是野生型)和G84V。分类为在该标记物处含有FC101或LAFC53等位基因的F2个体，显示出关于尼古丁和降烟碱含量的明确分离(图4)，指示了这种改变可能是低尼古丁表型的原因。
实施例4 - 物理映射和候选基因鉴定
通过使用R/QTL (Broman & Sen，2009)的lodint功能，使用1.5的LOD下降来定义该区域，鉴定了与Nic3基因座密切遗传连锁的SNP标记物。在Nic3基因座周围的感兴趣区域内能够唯一地锚定到改善的烟草基因组组装(Edwards等人，2017)的标记物，用于鉴定包含该区域的BioNano混杂支架(即假染色体区域)，并且因此鉴定Nic3位于其上的染色体。假染色体序列中的缺口由能够唯一地映射到基因组支架的标记物填充，但基于其在遗传图谱中的相对位置，并不存在于BioNano混杂支架上。
然后将更新区域中的候选基因模型针对RNA-seq数据(Edwards等人，2017)进行比较，并且在必要时进行修正。
实施例5 - 候选基因的鉴定
为了鉴定Nic3基因座内负责FC101中观察到的尼古丁调节的基因，例如，如在WO2020/025963中所述，通过病毒诱导基因沉默(VIGS)，在低尼古丁背景(即nic1nic2背景)下个别地沉默每种基因，并且测量了生物碱含量。
实施例6 - 候选基因的活性调节
为了确认蛋白质功能需要的感兴趣的氨基酸，使用了两种方法：
1. 基因编辑以在低尼古丁背景(即nic1nic2背景)下使感兴趣的残基(例如关于MYC2的G84V和/或K87E)突变
2. 未突变基因以及基因编辑变体(例如全长MYC2、MYC2 G84V、MYC2 K87E和MYC2G84V K87E)的过表达
功能结构域：
为了将超低尼古丁表型与我们感兴趣的基因的功能相关联，使用了两种方法：
1. 基因编辑以缺失功能结构域(例如MYC2的DNA结合位点)
2. 全长蛋白质的过表达以及包含功能结构域中的缺失的版本(例如全长MYC2和MYC2deltaDNA结合结构域)
测量生物碱含量。
实施例7 - Nic3基因座中的基因的病毒诱导基因沉默
包含(TRV RNA1，SEQ ID No. 570)和(TRV RNA2，选自SEQ ID No. 571-574)两者的TRV载体在根癌农杆菌中分开进行繁殖，所述TRV载体包含靶向核苷酸序列(来自SEQ IDNO: 73 (Nitab4.5_0002539g0040.2)、118 (Nitab4.5_0002683g0080.2)、124 (Nitab4.5_0005412g0010.2)和127 (Nitab4.5_0005412g0020.2)。将这些培养物混合(1:1)，并且注射器渗入到2周龄的LaBY21植物内，所述LaBY21植物具有nic1nic2背景(分别携带在Nic1和Nic2基因中的ERF199和ERF189突变，如WO2018/237107中公开的)。通过评价靶基因的表达水平(数据未显示)，来评价病毒感染后5周的沉默效应。
TRV RNA2序列显示于图5-8中，其中基因特异性序列以粗体且加下划线显示。
结果
表达所示基因的沉默构建体的6周龄LaBY21 (nic1nic2)叶片的尼古丁含量显示于图9中。含量相对于对照表示，并且包含通过单因素ANOVA分析的三个生物学重复。值显示为平均值± SEM。星号指示P值≤ 0.001的统计显著性。
与nic1 nic2相比，Nic3基因座中基因的沉默导致尼古丁含量的降低。
上文说明书中提到的所有出版物都通过引用并入本文。本发明的所述方法和系统的各种修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的，而不脱离本发明的范围和精神。尽管本发明已与具体的优选实施方案结合进行描述，但应当理解，如请求保护的本发明不应过度地限制于此类具体实施方案。实际上，对生物化学和生物技术或相关领域的技术人员显而易见的，用于实施本发明的所述模式的各种修改预期在下述权利要求的范围内。
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Claims (31)

1.一种调节(例如降低)烟草植物或其部分或烟草植物细胞的生物碱含量(例如尼古丁含量)的方法，所述方法包括通过调节以下的活性或表达来修饰所述植物或细胞：
a)至少一种Nic3基因；
以及任选地
b)至少一种Nic1 ERF基因；和/或
c)至少一种Nic2 ERF基因。
2. 一种调节(例如降低)烟草植物或其部分或烟草植物细胞的生物碱含量(例如尼古丁含量)的方法，所述方法包括通过以下修饰所述植物或其部分或细胞：对Nic3基因座(例如在Nic3基因中)引入至少一种突变，并且任选地对Nic1基因座(例如在Nic1 ERF基因中)引入至少一种突变和/或对Nic2基因座(例如在Nic2 ERF基因中)引入至少一种突变。
3.一种调节(例如降低)烟草植物或其植物部分或烟草植物细胞中的烟草特有亚硝胺(TSNA)前体含量的方法，所述方法包括通过以下修饰所述植物或细胞：
i)调节以下的活性或表达：
a)至少一种Nic3基因；以及任选地
b)至少一种Nic1 ERF基因；和/或
c)至少一种Nic2 ERF基因；或
ii)对Nic3基因座(例如在Nic3基因中)引入至少一种突变，并且任选地对Nic1基因座(例如在Nic1 ERF基因中)引入至少一种突变和/或对Nic2基因座(例如在Nic2 ERF基因中)引入至少一种突变。
4. 以下用于调节(例如降低)烟草植物或其部分或烟草植物细胞的生物碱含量(例如尼古丁含量)和或TSNA前体含量的用途：
a)至少一种Nic3基因，以及任选地至少一种Nic1 ERF基因和/或至少一种Nic2 ERF基因；或
b)在Nic3基因座中(例如在Nic3基因中)的至少一种突变，以及任选地在Nic1基因座中(例如在Nic1 ERF基因中)的至少一种突变和/或在Nic2基因座中(例如在Nic2 ERF基因中)的至少一种突变。
5.一种用于生产具有调节的(例如降低的)生物碱含量(例如尼古丁含量)的植物或其部分、烟草植物细胞、烟草植物繁殖材料、烟草叶片、切割的收获的烟草叶片、加工烟草叶片或切割且加工的烟草叶片的方法，所述方法包括修饰所述烟草植物或其部分或烟草细胞，以：
i)调节以下的活性或表达：
a)至少一种Nic3基因；以及任选地
b)至少一种Nic1 ERF基因；和/或
c)至少一种Nic2 ERF基因；或
ii)在Nic3基因座中(例如在Nic3基因中)引入至少一种突变，并且任选地在Nic1基因座中(例如在Nic1 ERF基因中)引入至少一种突变和/或在Nic2基因座中(例如在Nic2 ERF基因中)引入至少一种突变。
6.根据前述权利要求中任一项的方法或用途，其中与未进行修饰以对Nic3基因座引入至少一种突变，并且任选地对Nic1基因座引入至少一种突变和/或对Nic2基因座引入至少一种突变的烟草植物或其部分或烟草细胞相比，所述尼古丁含量是降低的。
7.一种烟草植物或其部分或烟草细胞，其已进行修饰，以实现与未修饰的烟草植物或其部分或烟草细胞相比，生物碱含量(例如尼古丁含量)的减少，其中所述修饰包含：
i)调节以下的活性或表达：
a)至少一种Nic3基因；以及任选地
b)至少一种Nic1 ERF基因；和/或
c)至少一种Nic2 ERF基因；或
ii)在Nic3基因座中(例如在Nic3基因中)的至少一种突变，以及任选地在Nic1基因座中(例如在Nic1 ERF基因中)的至少一种突变和/或在Nic2基因座中(例如在Nic2 ERF基因中)的至少一种突变。
8.一种烟草植物繁殖材料，其可从根据权利要求7的烟草植物或其部分或烟草细胞、或者通过权利要求5或6中任一项的方法生产的烟草植物或其部分或烟草细胞获得。
9.根据权利要求1-6中任一项的方法或用途、根据权利要求7的植物或其部分或细胞、或者根据权利要求8的植物繁殖材料，其中：
a)调节选自SEQ ID No. 73、118、124或127的Nic3基因，或者与其具有至少90%同一性的序列，或者所述基因的功能变体或功能片段或直向同源物的活性或表达；或者所述Nic3基因座中的至少一种突变在选自SEQ ID No. 73、118、124或127的Nic3基因，或者与其具有至少90%同一性的序列，或者所述基因的功能变体或功能片段或直向同源物中：
b)调节选自表1中列出的Nic1 ERF基因的活性或表达；或者所述Nic1基因座中的至少一种突变在选自以下的Nic1 ERF基因中：
SEQ ID No. 8；或SEQ ID No. 12；或SEQ ID No. 16；或SEQ ID No. 20；或SEQ ID No.24；或SEQ ID No. 28；或SEQ ID No. 32；或者与其具有至少90%同一性的序列，或者所述基因的功能变体或功能片段或直向同源物；和/或
c)调节选自表2中列出的Nic2 ERF基因的活性或表达；或者所述Nic2基因座中的至少一种突变在选自以下的Nic2 ERF基因中：SEQ ID No. 69；SEQ ID No. 37；或SEQ ID No.41；或SEQ ID No. 45；或SEQ ID No. 49；或SEQ ID No. 53；或SEQ ID No. 57；或SEQ IDNo. 61；或SEQ ID No. 65；或者与其具有至少90%同一性的序列、或者所述基因的功能变体或功能片段或直向同源物。
10. 根据权利要求1-6或9中任一项的方法或用途、根据权利要求7或9的植物或其部分、或者根据权利要求8或9的植物繁殖材料，其中：
i)调节SEQ ID No. 8的活性或表达；或所述Nic1基因座中的至少一种突变在SEQ IDNo. 8中；和/或
ii)调节SEQ ID No. 69的活性或表达；或所述Nic2基因座中的至少一种突变在SEQ IDNo. 69中。
11. 根据权利要求1-6或9或10中任一项的方法或用途、根据权利要求7或9的植物或其部分、或者根据权利要求8至10的植物繁殖材料，其中所述Nic3基因座中的至少一种突变在选自SEQ ID No. 73、118、124或127的Nic3基因，或者与其具有至少90%同一性的序列，或者所述基因的功能变体或功能片段或直向同源物中，并且所述Nic3基因中的至少一种突变选自：
i) Nic3基因SEQ ID No. 73、或者与其具有至少90%同一性的序列、或者所述基因的功能变体或功能片段或直向同源物中的突变，其导致SEQ ID No. 75的氨基酸残基74至258或483-538、或者与其具有至少90%同一性的序列、或者所述多肽的功能变体或功能片段或直向同源物中的突变；
ii) Nic3基因SEQ ID No. 118、或者与其具有至少90%同一性的序列、或者所述基因的功能变体或功能片段或直向同源物中的突变，其导致SEQ ID No. 120的氨基酸残基120-584、或者与其具有至少90%同一性的序列、或者所述多肽的功能变体或功能片段或直向同源物中的突变；
iii) Nic3基因SEQ ID No. 124、或者与其具有至少90%同一性的序列、或者所述基因的功能变体或功能片段或直向同源物中的突变，其导致SEQ ID No. 126的氨基酸残基166-406或483-970、或者与其具有至少90%同一性的序列、或者所述多肽的功能变体或功能片段或直向同源物中的突变；和
iv) Nic3基因SEQ ID No. 127、或者与其具有至少90%同一性的序列、或者所述基因的功能变体或功能片段或直向同源物中的突变，其导致SEQ ID No. 129的氨基酸残基171-406或509-967、或者与其具有至少90%同一性的序列、或者所述多肽的功能变体或功能片段或直向同源物中的突变。
12.根据权利要求7或9-11中任一项的植物或其部分，或者通过权利要求5或6、或9至11中任一项的方法生产的植物培育植物的用途。
13.根据权利要求7或9-11中任一项的植物或其部分，或者通过权利要求5或6、或9至11中任一项的方法生产的植物用于生产产品的用途。
14.根据权利要求7或9-11中任一项的植物或其部分，或者通过权利要求5或6、或9至11中任一项的方法生产的植物种植作物的用途。
15.根据权利要求7或9-11中任一项的植物或其部分，或者通过权利要求5或6、或9至11中任一项的方法生产的植物生产叶片的用途。
16.一种收获的叶片，其是根据权利要求7或9-11中任一项的植物的，或者可得自从根据权利要求7-11中任一项的繁殖材料繁殖的植物，或者可得自通过根据权利要求4、6或9-15中任一项的用途获得的植物，或者可得自通过权利要求5或6、或9至15中任一项的方法生产的植物。
17.根据权利要求16的植物的收获的叶片，其中所述植物的收获的叶片是切割的收获的叶片。
18.一种加工叶片，优选加工烟草叶片，优选不能存活的加工烟草叶片，其：
可得自(例如得自)从根据权利要求4、6或9-15中任一项的用途可获得的植物；
通过加工根据权利要求7或9-11中任一项的植物可获得(例如获得)；
可得自(例如得自)从根据权利要求8-11中任一项的植物繁殖材料繁殖的植物；或
通过加工根据权利要求16或17的植物的收获的叶片可获得(例如获得)；或
可得自(例如得自)通过权利要求5或6、或9至11中任一项的方法生产的植物。
19. 根据权利要求18的加工叶片，其中所述叶片通过调制、发酵、巴氏灭菌或其组合进行加工，优选地其中选自N'-亚硝基降烟碱(NNN)、4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N'-亚硝基新烟草碱(NAT)和N-亚硝基新烟碱(NAB)的一种或多种TSNA的含量是降低的，其中优选地调节(例如降低) NNN和/或NNK的含量，其中更优选地降低NNN的含量。
20.根据权利要求18或19的加工叶片，其中所述加工叶片是切割的加工叶片。
21.由植物或其部分制成的调制后的烟草材料，其：
可得自(例如得自)从根据权利要求4、6或9-15中任一项的用途可获得的植物；
通过加工根据权利要求7或9-11中任一项的植物可获得(例如获得)；
可得自(例如得自)从根据权利要求8-11中任一项的植物繁殖材料繁殖的植物；或
通过加工根据权利要求16或17的植物的收获的叶片可获得(例如获得)；或
可得自通过权利要求5或6、或9至11中任一项的方法生产的植物。
22.一种烟草掺合物，其包含权利要求21的所述调制后的烟草材料。
23.一种递送系统，其由以下进行制备：
根据权利要求7或9-11中任一项的烟草植物，或者根据权利要求7或9-11中任一项的其部分；
从根据权利要求8-11中任一项的烟草植物繁殖材料繁殖的烟草植物或其部分；
根据权利要求16或17的植物的收获的叶片；
根据权利要求18或19中任一项的加工叶片；
或
通过权利要求5或6、或9至11中任一项的方法生产的植物。
24.根据权利要求23的递送系统，其中所述递送系统是可燃吸烟制品。
25.根据权利要求23的递送系统，其中所述递送系统是无烟递送系统。
26.根据权利要求25的递送系统，其中所述递送系统是非可燃气雾剂供应系统，例如烟草加热设备或气雾剂生成设备。
27.一种可燃吸烟制品、非可燃气雾剂供应系统、无烟递送系统或烟草加热设备，其包含根据权利要求7-11中任一项的植物或其部分或其提取物(例如烟草提取物)；或者根据权利要求21的调制后的烟草材料；或者根据权利要求22的烟草掺合物。
28.Nic3基因座(例如选自具有SEQ ID No. 73、118、124或127的基因的Nic3基因，或者与其具有至少90%同一性的序列，或者所述基因的功能变体或功能片段或直向同源物)、以及任选地Nic1基因座(例如Nic1 ERF基因)和/或Nic2基因座(例如Nic2 ERF基因)的核苷酸序列，用于选择具有减少的生物碱含量(例如尼古丁含量)和/或减少的烟草特有亚硝胺(TSNA)或TSNA前体含量的植物的用途。
29. 一种植物的突变体，其携带在Nic3基因座中(例如在选自具有SEQ ID No. 73、118、124或127的基因的Nic3基因，或者与其具有至少90%同一性的序列，或者所述基因的功能变体或功能片段或直向同源物中)的至少一种可遗传突变，以及任选地在Nic1基因座中(例如在Nic1 ERF基因中)的至少一种可遗传突变和/或在至少Nic2基因座中(例如在Nic2 ERF基因中)的至少一种可遗传突变；其中相对于并不携带所述可遗传突变的可比较植物，所述可遗传突变降低突变烟草植物中的生物碱含量(例如尼古丁含量)，和/或降低烟草特有亚硝胺(TSNA)或TSNA前体的含量。
30.根据权利要求29的携带可遗传突变的突变植物的后代或种子。
31. 一种由植物产生的收获的叶片、加工叶片或调制后的烟草材料，所述植物包含在Nic3基因座中(例如在选自具有SEQ ID No. 73、118、124或127的基因的Nic3 ERF基因，或者与其具有至少90%同一性的序列，或者所述基因的功能变体或功能片段或直向同源物中)的至少一种突变，以及任选地在Nic1基因座中(例如在Nic1 ERF基因中)的至少一种突变和/或在至少Nic2基因座中(例如在Nic2 ERF基因中)的至少一种突变，并且其中相对于并不携带在Nic3基因座中以及任选地Nic1基因座和/或Nic2基因座中的所述突变的可比较植物，所述植物具有降低的尼古丁含量和/或降低的烟草特有亚硝胺(TSNA)或TSNA前体含量。
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