CN106998787A - 通过改变硝酸同化路径减少烟草特异性亚硝胺 - Google Patents

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Abstract

提供硝酸盐水平降低的经修饰的烟草植物，以及由所述烟草特异性亚硝胺(TSNA)减少的经修饰的烟草植物产生的烟草产品。还提供通过改变硝酸盐同化路径的基因表达减少烟草产品中的TSNA的方法。

Description

通过改变硝酸同化路径减少烟草特异性亚硝胺
技术领域
本发明涉及硝酸盐水平降低的经修饰烟草植物，烟草特异性亚硝胺(TSNA)减少的由所述经修饰烟草植物产生的烟草产品，以及通过改变硝酸盐同化路径的基因表达减少烟草产品中TSNA的方法。
背景技术
商业烟草植物(例如白肋烟草(burley tobacco))在叶子中积聚高水平的游离硝酸根，这是不合需要的，因为高水平的硝酸根与称为烟草特异性亚硝胺(TSNA)的致癌化合物的形成有关。TSNA是主要在烟草叶烘烤期间产生的一类化合物，但在随后的叶子加工和储存期间以及可能在燃烧期间通过高温合成另外形成。烘烤叶子中存在的两种TSNA，即N-亚硝基去甲烟碱(NNN)和4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)，被国际癌症研究中心(International Agency for Research on Cancer)分类成第I类致癌物(最高标示)。由于暗示这些化合物涉及多种烟草相关癌症的大量证据，世界卫生组织(World Healthorganization)和所述领域中的其它专家已推荐实施授权以确保未来烟草产品中这些有毒物质的水平降低。TSNA表示烟草生物碱的亚硝化产物。在空气烘烤的烟草中，存在亚硝酸盐是直接造成TSNA形成的试剂的普遍共识。然而由于其细胞毒性，内源性亚硝酸盐在植物组织中的水平通常非常低。实际上，相信TSNA形成中涉及的大部分亚硝酸盐来源于在6到10周烘烤加工期间叶子表面上存在的微生物的硝酸还原酶(NR)活性，其随着这一时间段期间细胞膜和细胞器退化将叶子硝酸盐库的一部分转化成亚硝酸盐。
TSNA主要在叶子烘烤加工期间形成并且涉及烟草生物碱的亚硝化。降低烘烤叶子中的TSNA含量和水平的遗传学策略致力于：(1)生物碱前驱体；或(2)涉及的亚硝化剂。改变烟草遗传学水平的减少TSNA的大部分工作使生物碱前驱体靶向TSNA。这类策略通过下调负责合成其生物碱前驱体去甲烟碱的基因家族提供NNN的大体降低。然而，这类策略不能降低烟草产品中存在的全部TSNA水平。因此，仍迫切需要降低烟草产品中的全部TSNA水平。
发明内容
本发明的一个方面针对烟草植物产生的烟草特异性亚硝胺(TSNA)水平降低的烟草产品，所述烟草植物修饰成包含：(i)包含编码去调节的硝酸还原酶的序列、由其组成或基本上由其组成的多核苷酸；(ii)由(i)中所述的多核苷酸编码的多肽；(iii)包含去调节的硝酸还原酶、由其组成或基本上由其组成的多肽；或(iv)包含(i)中所述的多核苷酸的构筑体、载体或表达载体，其中所述硝酸还原酶的表达或活性与对照未经修饰的烟草植物相比去调节；并且其中所述去调节的硝酸还原酶包含(a)硝酸还原酶多肽，其在对应于SEQ IDNO:4的位置523的位置处包含氨基酸取代；或(b)硝酸还原酶多肽，其在对应于SEQ ID NO:4的位置523的位置处包含氨基酸取代，其中SEQ ID NO:4的位置523处的氨基酸取代成天冬氨酸。去调节的硝酸还原酶可以是组成性活性的硝酸还原酶。烟草植物可以来自普通烟草(Nicotiana tabacum)物种，例如烟草产品可包含来自普通烟草物种的烟草植物的植物材料。编码去调节的硝酸还原酶的多核苷酸可以是编码经修饰硝酸还原酶多肽的异源多核苷酸。异源多核苷酸可以连接到并非与内源性硝酸还原酶基因天然相关的启动子。启动子可以是花椰菜嵌纹病毒35S启动子(Cauliflower Mosaic Virus 35S promoter)。编码去调节的硝酸还原酶的多核苷酸可以包含SEQ ID NO:5的多核苷酸序列。编码去调节的硝酸还原酶的多核苷酸可以编码已经由基因组编辑系统或诱变剂修饰的内源性硝酸还原酶基因。基因组编辑系统可以包含工程改造的基于CRISPR/Cas的系统、工程改造的转录活化因子类效应子核酸酶、工程改造的锌指核酸酶或工程改造的大范围核酸酶。烟草可以是白肋烟草。所述烟草产品与来源于尚未去调节的硝酸还原酶的对照烟草植物的烟草产品相比可具有降低的烟草特异性亚硝胺(TSNA)水平。可以测量烟草植物叶子中的总TSNA水平，其中(a)叶子新鲜采摘；(b)叶子经烘烤、储存或加工；或(c)叶子是空气烘烤的。烟草产品中至少一种TSNA的水平与至少一种TSNA的对照水平相比可降低，其中所述至少一种TSNA选自由以下组成的群组：N-亚硝基去甲烟碱(NNN)、4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N-亚硝基新烟草碱(NAB)、N-亚硝基新烟草碱(NAT)以及其组合。TSNA的总水平可以降低至少50％。可以在燃烧烟草植物叶子获得的烟雾中测量TSNA水平。烟雾中的总TSNA水平可以降低至少70％。NNN的水平可以降低约90％。NNK的水平可以降低约66％。NAB的水平可以降低约92％。NAT的水平可以降低约88％。烟草植物可进一步包含经修饰的去甲烟碱路径基因。经修饰的去甲烟碱路径基因可以包含经修饰的烟碱去甲基化酶基因或细胞色素P450基因。烟草植物可以包含经修饰的CYP82E4或经修饰的CYP82E10基因。经修饰的CYP82E4基因或经修饰的CYP82E10基因可以是不活化的。
本发明的一个方面针对用于制造烟草产品的方法，其中燃烧经修饰的烟草植物叶子获得的烟雾中测得的TSNA水平与燃烧未经修饰的烟草植物获得的烟雾中测得的TSNA水平相比降低。所述方法包含(a)将烟草植物修饰成包含：(i)包含编码去调节的硝酸还原酶的序列、由其组成或基本上由其组成的多核苷酸；(ii)由(i)中所述的多核苷酸编码的多肽；(iii)包含去调节的硝酸还原酶、由其组成或基本上由其组成的多肽；或(iv)包含(i)中所述的多核苷酸构筑体、载体或表达载体，其中所述硝酸还原酶的表达或活性与对照未经修饰的烟草植物相比去调节；并且其中所述去调节的硝酸还原酶包含(I)硝酸还原酶多肽，其在对应于SEQ ID NO:4的位置523的位置处包含氨基酸取代；或(II)硝酸还原酶多肽，其在对应于SEQ ID NO:4的位置523的位置处包含氨基酸取代，其中SEQ ID NO:4的位置523处的氨基酸取代成天冬氨酸；(b)从所述经修饰的烟草植物采摘烟草叶；以及(c)从所述采摘的叶子制造烟草产品。
本文的另一方面还披露烟草植物产生的烟草特异性亚硝胺(TSNA)水平降低的烟草产品，所述烟草植物修饰成包含：(i)包含编码去调节的硝酸还原酶的序列、由其组成或基本上由其组成的的多核苷酸；(ii)由(i)中所述的多核苷酸编码的多肽；(iii)包含去调节的硝酸还原酶、由其组成或基本上由其组成的多肽；或(iv)包含(i)中所述的多核苷酸的构筑体、载体或表达载体，其中所述硝酸还原酶的表达或活性与对照未经修饰的烟草植物相比去调节；并且其中所述去调节的硝酸还原酶包含(a)截短的硝酸还原酶多肽；(b)硝酸还原酶多肽，其包含N端截短；或(c)硝酸还原酶多肽，其包含56个氨基酸的N端截短。
本文的另一方面还披露一种制造烟草产品的方法，其中燃烧经修饰的烟草植物叶子获得的烟雾中测得的TSNA水平与燃烧未经修饰的烟草植物获得的烟雾中测得的TSNA水平相比降低，所述方法包含(a)将烟草植物修饰成包含：(i)包含编码去调节的硝酸还原酶的序列、由其组成或基本上由其组成的多核苷酸；(ii)由(i)中所述的多核苷酸编码的多肽；(iii)包含去调节的硝酸还原酶、由其组成或基本上由其组成的多肽；或(iv)包含(i)中所述的多核苷酸的构筑体、载体或表达载体，其中所述硝酸还原酶的表达或活性与对照未经修饰的烟草植物相比去调节；并且其中所述去调节的硝酸还原酶包含(I)截短的硝酸还原酶多肽；(II)硝酸还原酶多肽，其包含N端截短；或(III)硝酸还原酶多肽，其包含56个氨基酸的N端截短；(b)从所述经修饰的烟草植物采摘烟草叶；以及(c)从采摘的叶子制造烟草产品。
编码去调节的硝酸还原酶的多核苷酸可以包含SEQ ID NO:7的多核苷酸序列。
附图说明
图1示出了高等植物中氮同化路径的示意图。在主要N-同化路径中，硝酸根(NO3 -)转化成亚硝酸根(NO2 -)，随后转化成铵(NH4 +)和谷氨酰胺，这些反应中涉及的主要酶是硝酸盐和亚硝酸还原酶(分别NR和NiR)、谷氨酰胺合成酶(GS)以及谷氨酸合成酶(GOGAT)。AMT，铵转运蛋白；AS，天冬酰胺合成酶；GDH，NADH依赖性谷氨酸脱氢酶；ICDH，NADP依赖性异柠檬酸脱氢酶；NRT，硝酸盐转运蛋白；TCA，三甲酸循环。
图2示出了来自多种植物物种的硝酸还原酶氨基酸序列的位置523的区域的比对。
图3A和3B示出了35S:GS1、35S:ICDH、35S:GOGAT、E4:GOGAT、35S:tr-NR、E4:tr-NR、35S:S523D-NR以及E4:S523D-NR构筑体的构筑体图。
图4示出了野生型(WT)植物的鲜重和三种硝酸盐(N)施肥水平下35S:tr-NR、35S:S523D-NR、35S:GS1、35S:GOGAT以及35S:ICDH转基因品系生长。
图5A-5C示出了WT植物的叶绿素a(Ca，图5A)、叶绿素b(Cb，图5B)以及叶绿素a+b(Ca+b，图5C)水平以及三种N-施肥水平下35S:tr-NR、35S:S523D-NR、35S:GS1、35S:GOGAT以及35S:ICDH转基因品系生长。
图6A和6B示出了WT植物叶子中的总硝酸盐水平以及三种N-施肥水平下35S:tr-NR、35S:S523D-NR、35S:GS1、35S:GOGAT以及35S:ICDH转基因品系生长。
图7示出了WT植物叶子中的平均氨水平以及三种N-施肥水平下35S:tr-NR、35S:S523D-NR、35S:GS1、35S:GOGAT以及35S:ICDH转基因品系生长。
图8示出了35S:GOGAT、35S:ICDH、35S:tr-NR、35S:S523D-NR、35S:GS1的叶子中的总游离氨基酸水平，以及中等(8mM)和高(19mM)N-施肥下的WT植物生长。
图9A-9D示出了WT植物烟草叶中的精氨酸(Arg)(图9A)、谷氨酰胺(Gln)(图9B)、天冬酰胺(Asn)(图9C)以及谷氨酸(Glu)(图9D)以及水平，以及中等(8mM)和高(19mM)N-施肥下的35S:tr-NR、35S:S523D-NR、35S:GS1、35S:GOGAT以及35S:ICDH转基因品系生长。
图10示出了来源于WT和35S:S523D-NR基因型的叶片的去筋烟叶中的平均硝酸盐和烟碱水平。
图11A-11E示出了去筋烟叶以及由WT叶片和35S:S523D-NR叶子制成的香烟的烟雾中的NAB(图11A)、NAT(图11B)、NNK(图11C)、NNN(图11D)以及总TSNA(图11E)的平均水平。
图12示出了在35S CaMV启动子和/或益收生长素诱导型CYP82E4(E4)启动子的转录控制下，含有S523D-NR构筑体的益收生长素处理的烟草叶中的硝酸盐浓度和相对NR转录物水平。
图13展示分别35S:S523D-NR和35S:S523D-NR/E4:S523D-NR转基因品系GH3-1、GH8-1以及GH8-5中的总生物碱水平(TA％DW)。
图14示出了分别三种35S:S523D-NR和35S:S523D-NR/E4:S523D-NR转基因品系GH3-1、GH8-1以及GH8-5中的硝酸盐水平(NO3％DW)。
图15示出了分别三种35S:S523D-NR和35S:S523D-NR/E4:S523D-NR转基因品系GH3-1、GH8-1以及GH8-5去筋烟叶中的TSNA(NNN、NNK、NAT以及NAB，ng/g)水平。
图16示出了分别用三种35S:S523D-NR和35S:S523D-NR/E4:S523D-NR转基因品系GH3-1、GH8-1以及GH8-5的去筋烟叶制成的香烟的烟雾中的TSNA(NNN、NNK、NAT以及NAB，ng/g)水平。
具体实施方式
本发明的一个方面针对一种降低经修饰的烟草植物叶子中的游离硝酸盐水平的新颖策略，其通过改变硝酸盐同化路径，由此降低来自经修饰的烟草植物的烘烤叶子中全部TSNA的水平。使用去调节的硝酸还原酶降低烟草叶的游离硝酸盐水平和TSNA含量和水平(包括总TSNA和/或特异性TSNA)。通过靶向亚硝化剂和减少叶子内储存的游离硝酸盐的量，使烟草产品中的致癌性TSNA的产生降到最低。这一技术提出一种用于减少TSNA的新颖方法，其可帮助烟草行业制造TSNA水平比使用当前操作产生的TSNA水平低的烟草产品。
去调节的硝酸还原酶已描述于皱叶烟草(Nicotiana plumbaginofolia)中，例如纳桑姆(Nussaume)等人,植物细胞(Plant Cell)7:611-621(1995)，以及李(Lea)等人,植物生理学(Plant Physiology)140:1085-1094(2006)。在本文提出的数据中，皱叶烟草中观测到的硝酸盐水平降低显著劣于普通烟草中观测到的。另外，此前尚未证实去调节的硝酸还原酶引起的TSNA水平降低。
这一章节和本文全部披露内容中使用的章节标题仅仅用于组构目的并且不打算限制。
1.定义
除非另外定义，否则本文中所用的所有技术和科学术语都具有与所属领域普通技术人员通常所理解相同的含义。在有矛盾的情况下，将以本文档(包括定义)为准。下文描述优选方法和材料，但与本文所述的那些类似或等效的方法和材料可用于实施或测试本发明。本文提及的所有公开案、专利申请案、专利和其它参考文献都以全文引用的方式并入。本文所披露的所述材料、方法和实例仅仅是说明性的并且不打算是限制性的。
如本文所用的术语“包含”、“包括”、“具有(having/has)”、“可以”、“含有”以及它们的变体打算是开放性过渡短语、术语或措辞，不排除额外动作或结构的可能性。除非上下文另外明确规定，否则单数形式“一(a/an)”以及“所述”包括多个指示物。本发明还涵盖其它实施例“包含本文提出的实施例或元件”、“由本文提出的实施例或元件组成”以及“基本上由本文提出的实施例或元件组成”，而不管是否明确阐述。为了叙述本文的数值范围，明确涵盖它们之间具有相同精确度的每一个插入数值。举例来说，对于范围6-9，除了6和9之外涵盖数值7和8，并且对于范围6.0-7.0，明确涵盖数值6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9以及7.0。
如整个说明书和权利要求书中所使用，以下术语具有以下含义：
如本文所用的“编码序列”或“编码核酸”意思是包含编码蛋白质的核苷酸序列的核酸(RNA或DNA分子)。编码序列可进一步包括与调节元件可操作地连接的起始和终止信号，包括能够引导投予核酸的个体或哺乳动物的细胞中的表达的启动子和聚腺苷酸化信号。编码序列可以经密码子优化。
如本文所用的“互补(Complement或complementary)”意思是核酸可以在核苷酸或核酸分子的核苷酸类似物之间进行沃森-克里克(Watson-Crick)(例如A-T/U和C-G)或胡斯坦(Hoogsteen)碱基配对。“互补”指的是两个核酸序列之间共用的特性，使得当它们彼此反平行比对时，每一个位置的核苷酸碱基将互补。
如本文所用的“构筑体”指的是包含一种或多种多核苷酸的双股重组核酸片段。构筑体包含与互补“有义股或编码股”碱基配对的“模板股”。给定构筑体可以在两个可能方向中插入载体内，所述两个可能方向是关于位于载体(例如表达载体)内的启动子方向来说相同(或有义)方向或相反(或反义)方向。
在对照植物或对照植物细胞背景下的如本文所用的术语“对照”意思是硝酸还原酶的表达或活性没有进行修饰(例如增加或降低)，并且因此可提供与硝酸还原酶的表达或活性已进行修饰的植物的比较的对照植物或对照植物细胞。如本文所用，“对照植物”是除了测试参数以外全部参数大体上等效于测试植物或经修饰植物的植物。举例来说，当提到已引入根据本发明的多核苷酸的植物时，在某些实施例中，对照植物是没有引入此类多核苷酸的等效植物。在某些实施例中，对照植物是已引入对照多核苷酸的等效植物。在此类情况下，对照多核苷酸是预期对植物几乎不产生或不产生表型作用的多核苷酸。对照植物可以包含空白载体。对照植物可对应于野生型植物。对照植物可以是T1分离体不再具有转基因的空分离体。
本文可互换使用的“供体DNA”或“供体模板”指的是包括至少一部分相关基因的双股DNA片段或分子。供体DNA可以编码整个功能蛋白或部分功能蛋白。
如本文所用的“内源性基因”指的是来源于生物体的基因组并且尚未发生改变(例如损失、获得或交换基因材料)的基因。内源性基因进行标准基因传递和基因表达。
如本文所用的“强化子序列”指的是可以提高基因表达的序列。这些序列可以位于经转录区域的上游、内含子内或下游。经转录区从启动子到转录终止区包含外显子和插入内含子。基因表达的提高可以通过多种机制，包括(但不限于)提高转录效率、稳定成熟mRNA以及转译提高。
如本文所用的“表达”指的是产生功能性产物。举例来说，核酸片段的表达可以指核酸片段的转录(例如转录导致mRNA或功能性RNA)和/或将mRNA转译成前驱体或成熟蛋白质。“过表达”指的是转基因生物体中产生的基因产物超过来自同一实验的空分离(或非转基因)生物体产生的水平。
如本文所用的“功能性”和“完整功能性”描述具有生物活性的蛋白质。“功能性基因”指的是转录成mRNA，mRNA转译成功能蛋白的基因。
如本文所用的“遗传构筑体”指的是包含编码蛋白质的核苷酸序列的DNA或RNA分子。编码序列包括与调节元件可操作地连接的起始和终止信号，包括能够引导投予核酸分子的个体的细胞中的表达的启动子和聚腺苷酸化信号。
如本文所用的“基因组编辑”指的是改变编码内源性多肽或蛋白质的内源性基因，使得获得截短的内源性蛋白质或具有氨基酸取代的内源性蛋白质的蛋白质表达。基因组编辑可以包括使用例如同源性引导修复(HDR)的修复机制用具有截短或氨基酸取代的基因拷贝置换靶向内源性基因的区域或置换全部内源性基因。基因组编辑还可以包括通过在内源性基因中产生双股断裂，接着使用非同源端接合(NHEJ)修复，在内源性基因中产生氨基酸取代。在可产生氨基酸取代的修复期间，NHEJ可添加或缺失至少一个碱基对。基因组编辑还可以包括通过两种核酸酶对同一DNA股同时起作用来删除基因区段，从而在两个核酸酶目标位点之间形成截短并且通过NHEJ修复DNA断裂。
如本文所用的关于序列的“异源”意思是序列来源于外来物种，或如果来自同一物种，那么组成和/或基因组位置通过故意人类干涉相对于其原生形式大体上经修饰。
如本文可交换使用的“同源性引导的修复”或“HDR”指的是当核中存在DNA的同源碎片(主要细胞周期的G2和S期)时，细胞中修复双股DNA损伤的机制。HDR使用供体DNA或供体模板引导修复并且可用于形成基因组的特异性序列改变，包括靶向添加整个基因。如果供体模板与定点核酸酶一起提供，那么细胞机制将通过同源重组修复断裂，所述同源重组在DNA裂解存在下将加强几个数量级。当不存在同源DNA碎片时，可以代替地进行非同源端接合。
如本文所用的术语“同源性”或“相似性”指的是通过序列比对比较的两个多肽或两个核酸分子之间的序列相似性程度。所比较的两个不连续核酸序列之间的同源性程度随着可比较位置处的相同或匹配核苷酸数目变化。
如本文所用的在两个或更多个核酸或多肽序列情形中的“相同”或“一致性”意思是序列的指定区域中指定百分比的残基相同。百分比可以通过最佳比对两个序列，比较两个序列的指定区域，测定两个序列中存在相同残基的位置数产生匹配位置数，匹配位置数除以指定区域中的位置总数，并且结果乘以100产生序列一致性百分比来计算。在两个序列具有不同长度或比对产生一个或多个交错端并且指定比较区域仅包括单个序列的情况下，单个序列的残基包括于计算的分母而非分子中。当比较DNA和RNA时，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)视为相当。一致性可以手动进行或通过使用计算机序列算法(例如ClustalW、ClustalX、BLAST、FASTA或史密斯-沃特曼(Smith-Waterman))进行。
如本文所用的术语“增加”或“增加的”指数量或活性约10％到约99％的增加，或者至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少100％、至少150％或至少200％或更多的增加，所述量或活性例如(但不限于)硝酸盐水平或TSNA水平。
如本文所用的术语“抑制”或“抑制的”指的是数量或活性约98％到约100％的降低，或者至少98％、至少99％但特别是100％的降低，所述活性例如(但不限于)多肽活性、转录活性和/或蛋白质表达。
如本文所用的术语“引入”意思是向细胞提供核酸(例如表达构筑体)或蛋白质。引入包括向真核细胞并入核酸，其中所述核酸可并入到细胞的基因组中，并且包括向细胞短暂提供核酸或蛋白质。引入包括稳定或短暂转型法，以及性别交叉。因此，向细胞插入核酸片段(例如重组DNA构筑体/表达构筑体)的情形中，“引入”意思是“转染”或“转型”或“转导”并且包括向真核细胞并入核酸片段，其中所述核酸片段可并入到细胞的基因组中(例如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)，转化成自发复制子，或暂时表达(例如经转染mRNA)。
如本文所用的术语“分离”、“纯化”或“生物纯”指的是材料大体上或基本上不含其原生状态时发现的通常与其相伴的组分。纯度和均质性通常使用例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱等分析化学技术测定。作为制备中存在的主要物质的蛋白质大体上经纯化。具体来说，本发明的经分离核酸与侧接所要基因并且编码除了所要蛋白质以外的蛋白质的开放阅读框架分隔开。如本文所用的术语“纯化”表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中基本上产生一个条带。具体来说，意思是核酸或蛋白质至少85％纯，更优选地至少95％纯，并且最优选至少99％纯。
分离的多核苷酸可以从其天然存在的宿主细胞纯化。所属领域技术人员已知的常规核酸纯化法可用于获得分离的多核苷酸。术语还涵盖重组多核苷酸和化学合成的多核苷酸。
如本文所用的“硝酸还原酶”指的是将硝酸盐(NO3 -)还原成亚硝酸盐(NO2 -)的酶。术语“去调节的硝酸还原酶”通常指的是不进行一种或多种调节机制(例如转录、转录后或转译后调节机制)的硝酸还原酶，所述机制控制或限定对照未经修饰的烟草植物中的硝酸还原酶表达或活性。因此，“所述硝酸还原酶的表达或活性经去调节”通常意思是经修饰的烟草植物中硝酸还原酶表达或活性相比于对照未经修饰的烟草植物增加。术语“去调节的硝酸还原酶多核苷酸”包括编码来自普通烟草的经修饰的硝酸还原酶(NR)的多核苷酸并且包括包含以下、由以下组成或基本上由以下组成的多核苷酸：与SEQ ID NO:5或7多核苷酸变异体大体同源(也就是说序列相似)或大体一致的多核苷酸，所述多核苷酸变异体具有与序列SEQ ID NO:5或7至少约60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、75％、80％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性；包括SEQ ID NO:5或7的片段的多核苷酸片段；以及与其大体同源(也就是说序列相似)或大体一致的SEQ ID NO:5或7的片段，其具有与SEQ ID NO:5或7的相应片段至少约60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、75％、80％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性。所述片段的长度可为至少约20、50、70、100、200、300、500、1000或2000个核苷酸，例如去调节的硝酸还原酶多核苷酸可以包含(i)SEQ ID NO:5或7的至少约20、50、70、100、200、300、500、1000或2000个核苷酸，或(ii)具有与SEQ ID NO:5或7的至少约20、50、70、100、200、300、500、1000或2000个核苷酸至少约60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、75％、80％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的序列。通常，片段可保留全长序列的生物活性，例如所述片段编码硝酸还原酶活性，通常经修饰或去调节的硝酸还原酶活性。硝酸还原酶多核苷酸还包括包含与SEQ ID NO:5或7的充分或大体程度的一致性或相似性以编码用作硝酸还原酶的多肽的序列。在一个实施例中，术语“硝酸还原酶多核苷酸”指的是包含本文命名为SEQ ID NO:1或3的多核苷酸、由其组成或基本上由其组成的核苷酸聚合物。
术语“去调节的硝酸还原酶多肽”包括来自普通烟草的经修饰的硝酸还原酶(NR)并且包括包含以下、由以下组成或基本上由以下组成的的多肽：与SEQ ID NO:6或8大体同源(也就是说，序列相似)或大体一致的多肽，或具有与序列SEQ ID NO:6或8至少约60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、75％、80％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的多肽变异体；包括SEQ ID NO:6或8的片段的多肽片段；以及与其大体同源(也就是说序列相似)或大体一致的SEQ ID NO:6或8的片段，其具有与SEQ ID NO:6或8的相应片段至少约60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、75％、80％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性。所述片段的长度可以是至少约10、30、50、100、200、300、400、500、600、700、800或900个氨基酸残基，例如去调节的硝酸还原酶多肽可以包含(i)SEQ ID NO:6或8的至少约10、30、50、100、200、300、400、500、600、700、800或900个氨基酸或(ii)具有与SEQ ID NO:6或8的至少约10、30、50、100、200、300、400、500、600、700、800或900个氨基酸的至少约60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、75％、80％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列一致性的序列。通常，片段可保留全长序列的生物活性，例如所述片段包含硝酸还原酶活性，通常经修饰或去调节的硝酸还原酶活性。硝酸还原酶多肽还包括包含与用作硝酸还原酶的SEQ ID NO:6或8的充分或大体程度的一致性或相似性的序列。在一个实施例中，术语“硝酸还原酶多肽”指的是包含本文命名为SEQ ID NO:2或4的多肽、由其组成或基本上由其组成的氨基酸的聚合物。
如本文所用的“非同源端接合(NHEJ)路径”指的是通过无需同源模板而直接接合断裂端修复DNA中的双股断裂的路径。不依赖于模板的通过NHEJ的DNA端再接合是随机易错修复方法，其在DNA断点处引入无规微插入和微缺失(插入缺失)。这一方法可用于有意中断、缺失或改变靶向基因序列的读取范围。NHEJ通常使用称为微同源性的短同源DNA序列来引导修复。这些微同源性通常存在于双股断裂的末端上的单股悬垂物中。当悬垂物完全相容时，NHEJ通常精准修复断裂，但也可能存在导致核苷酸损失的不精确修复，但当悬垂物不相容时更常见。如本文所用的“核酸酶介导的NHEJ”指的是核酸酶切割双股DNA之后起始的NHEJ。
如本文所用的“N端截短”意思是N端处或N端附近的氨基酸缺失。在一些实施例中，氨基酸的缺失可以存在于多肽的N端处，也就是说缺失包括经转录或成熟蛋白质的第一氨基酸。在一些实施例中，氨基酸的缺失可存在于多肽的N端内，也就是说缺失不包括经转录或成熟蛋白质的第一氨基酸，而是存在于多肽的前半段内。
如本文所用的“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”意思是至少两个核苷酸共价连接在一起。单股的描述还定义互补链的序列。因此，核酸还涵盖所述单股的互补链。核酸的许多变异体可以用于与指定核酸相同的目的。因此，核酸还涵盖大体上相同的核酸和其互补序列。单股提供可以与目标序列在严格杂交条件下杂交的探针。因此，核酸还涵盖在严格杂交条件下杂交的探针。
核酸可以是单股或双股的，或可含有双股和单股序列的部分。核酸可以是DNA(基因组和cDNA)、RNA或杂合体，其中核酸可含有去氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合，以及包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶以及异鸟嘌呤的碱基的组合。核酸可以通过化学合成方法或重组方法获得。
单链DNA杂交互补片段的特异性由反应条件的“严格度”决定(萨布鲁克(Sambrook)等人.,分子克隆和实验室手册(Molecular Cloning and LaboratoryManual),第二版(Second Ed.),冷泉港(Cold Spring Harbor)(1989))。杂交严格度随着形成DNA双螺旋体的倾向降低而增加。在核酸杂交反应中，可以选择严格度来促进特异性交杂(高严格度)，这可以用于从文库鉴别例如全长纯系。低特异性交杂(低严格度)可用于鉴别相关但不精确(同源，但不相同)的DNA分子或区段。
DNA双螺旋体通过以下稳定化：(1)互补碱基对的数目；(2)碱基对类型；(3)反应混合物的盐浓度(离子强度)；(4)反应温度；以及(5)特定有机溶剂(例如甲酰胺)的存在，这降低DNA双螺旋体稳定性。一般来说，探针越长，适当退火所需的温度越高。常见方法是改变温度；较高相对温度导致较严格的反应条件。
在“严格条件”下杂交描述彼此至少60％同源的核苷酸序列保持杂交的杂交方案。一般来说，选择严格条件比规定的离子强度和pH值下的特异性序列的热熔点(Tm)低约5℃。Tm为50％的与目标序列互补的探针与目标序列在均衡状态下杂交的温度(在限定的离子强度、pH和核酸浓度下)。因为目标序列在Tm下一般过量存在，所以平衡状态下占据50％探针。
“严格的杂交条件”是使探针、引物或寡核苷酸仅与其目标序列(例如SEQ ID NO:1、3、5或7)杂交的条件。严格条件是序列依赖性的并且将不同。严格条件包含：(1)在50℃下，低离子强度和高温洗涤，例如15mM氯化钠、1.5mM柠檬酸钠、0.1％十二烷基硫酸钠；(2)在42℃下，杂交期间的变性剂，例如50体积％甲酰胺、0.1％牛血清白蛋白、0.1％Ficoll、0.1％聚乙烯吡咯烷酮、50mM磷酸钠缓冲剂(750mM氯化钠、75mM柠檬酸钠；pH 6.5)；或(3)50％甲酰胺。洗涤通常还包含42℃下的5xSSC(0.75M NaCl、75mM柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH6.8)、0.1％焦磷酸钠、5x邓波特溶液(Denhardt's solution)、超声处理的鲑鱼精子DNA(50μg/mL)、0.1％SDS以及10％硫酸葡聚糖，以及42℃下的0.2xSSC(氯化钠/柠檬酸钠)中以及55℃下的50％甲酰胺中，随后由55℃下的含有EDTA的0.1xSSC组成的高严格度洗涤。优选地，所述条件使得彼此至少约65％、70％、75％、85％、90％、95％、98％或99％同源的序列通常保持彼此杂交。这些条件作为实例提出并且不打算作为限制。
“中等严格条件”使用较不严格的洗涤溶液和杂交条件，使得多核苷酸将与目标序列(例如SEQ ID NO:1、3、5或7)的全部、片段、衍生物或类似物杂交。一个实例包含在55℃下在6xSSC、5x邓波特溶液、0.5％SDS以及100μg/mL变性鲑鱼精子DNA中杂交，随后在37℃下在1xSSC、0.1％SDS中一次或多次洗涤。可以调整温度、离子强度等来适应实验因素，例如探针长度。已描述其它中等严格条件(奥斯贝(Ausubel)等人,最新分子生物学实验方法汇编(Current Protocols in Molecular Biology),第1-3卷,约翰·威利父子公司(JohnWiley&Sons,Inc.),霍博肯(Hoboken),新泽西州(N.J.)(1993)；克里格勒(Kriegler),基因转移和表达：实验室手册(Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual),斯托克顿出版社(Stockton Press),纽约(New York),纽约州(N.Y.)(1990)；佩巴尔(Perbal),分子克隆实践指南(A Practical Guide to Molecular Cloning),第2版,约翰·威利父子公司(John Wiley&Sons),纽约(New York),纽约州(N.Y.)(1988))。
“低严格条件”使用比中等严格度较不严格的洗涤溶液和杂交条件，使得多核苷酸将与目标序列(例如SEQ ID NO:1、3、5或7)的全部、片段、衍生物或类似物杂交。低严格度杂交条件的非限制性实例包括在40℃下在35％甲酰胺、5xSSC、50mM Tris HCl(pH 7.5)、5mMEDTA、0.02％PVP、0.02％Ficoll、0.2％BSA、100μg/mL变性鲑鱼精子DNA、10体积％硫酸葡聚糖中杂交，随后在50℃下在2xSSC、25mM Tris HCl(pH 7.4)、5mM EDTA以及0.1％SDS中一次或多次洗涤。充分描述其它低严格度条件，例如交叉物种交杂的那些条件(奥斯贝(Ausubel)等人，1993；克里格勒(Kriegler),1990)。
如本文所用的“可操作地连接”意思是基因在空间连接的启动子控制下表达。启动子在其控制下可以位于基因的5'(上游)或3'(下游)。启动子和基因之间的距离可以与启动子和产生启动子的基因中其控制的基因之间的距离大致相同。如所属领域中已知，可以调节这一距离的变化而不损失启动子功能。“可操作地连接”指的是单个片段中核酸片段的关联是的一个的功能经另一个调节。举例来说，当启动子能够调节核酸片段的转录时，启动子与所述核酸片段可操作地连接。
如本文所用的术语“植物”指的是处于其生命周期或发育的任何阶段的任何植物及其后代。在一个实施例中，植物是烟草植物，它指的是属于烟草属的植物。“植物”包括整个植物、植物器官、植物组织、植物施肥体、种子和植物细胞以及其子代。植物细胞包括(但不限于)来自种子、悬浮培养物、胚芽、分生组织区域、愈伤组织、叶子、根、嫩枝、配子体、孢子体、花粉以及花粉粒的细胞。本文描述烟草植物的优选物种、栽培品种、杂合体和变种。
在本文中可互换地使用的“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸片段”指的是任选地含有合成、非天然或改变的核苷酸碱基的单股或双股的RNA或DNA的聚合物。核苷酸(通常以其5'单磷酸酯形式存在)由其如下的单字母名称指代：“A”针对腺苷酸或脱氧腺苷酸(分别针对RNA或DNA)，“C”针对胞苷酸或脱氧胞苷酸，“G”针对鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，“U”针对尿苷酸，“T”针对脱氧胸苷酸，“R”针对嘌呤(A或G)，“Y”针对嘧啶(C或T)，“K”针对G或T，“H”针对A或C或T，“I”针对肌苷并且“N”针对任何核苷酸。多核苷酸可以是(但不限于)基因组DNA、互补DNA(cDNA)、mRNA或反义RNA或其片段。此外，多核苷酸可以是单股或双股核酸，其为单股和双股区域的混合物；包含DNA和RNA的杂交分子；或具有单股和双股区域的混合物的杂交分子，或其片段。另外，多核苷酸可以由包含DNA、RNA或两个的三股区域或者其片段构成。多核苷酸可以含有一个或多个经修饰的碱基，例如硫代磷酸酯，并且可以是肽核酸(PNA)。一般来说，多核苷酸可以由经分离或克隆的cDNA片段、基因组DNA、寡核苷酸或个别核苷酸或前述的组合装配。尽管本文所述的多核苷酸序列显示为DNA序列，但序列包括其相应的RNA序列，以及其互补(例如完全互补)DNA或RNA序列，包括其逆向互补序列。
本文可互换使用的“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”以及“蛋白质”指的是氨基酸残基的聚合物。术语适用于一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物。术语“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”以及“蛋白质”还包括修饰，包括(但不限于)糖基化、脂质连结、硫酸化、谷氨酸残基的γ-羧基化、羟基化以及ADP-核糖基化。
如本文所用的“启动子”意思是能够赋予、活化或提高细胞中的核酸表达的合成或天然来源的分子。“启动子”指的是通常位于双股核酸片段上游并且与双股核酸片段可操作地连接的核酸元件/序列。启动子可以完全源自接近原生相关基因的区域，或可以由源自不同原生启动子的不同元件或合成核酸区段构成。启动子可以包含一个或多个特异性转录调节序列以进一步提高表达和/或改变其的空间表达和/或暂时表达。启动子还可以包含末端强化子或抑制子元件，其可位于来自转录起始位点的多达几千个碱基对。启动子可以来源于包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫以及动物的源。启动子可以关于发生表达的细胞、组织或器官或关于发生表达的发育阶段，或回应于外部刺激(例如生理学压力、病原体、金属离子或诱发剂)组成性或有差异地调节基因组分的表达。如本文可互换使用的“组织特异性启动子”和“组织优选启动子”指的是主要但并非必须专门在一种组织或器官中表达，而是还可以在一种特异性细胞中表达的启动子。如本文所用的“发育调节的启动子”指的是活性由发育事件决定的启动子。使基因大部分时间在大部分细胞类型中表达的启动子通常被称为“组成性启动子”。诱导型启动子回应于内源性或外源性刺激的存在，例如通过化合物(化学诱导剂)或回应于环境、激素、化学品和/或发育信号选择性表达可操作地连接的DNA序列。诱导型或经调节的启动子的实例包括(但不限于)通过光、热、应力、溢流或干旱、病原体、植物激素、卷绕或化学品(例如乙醇、茉莉酸酯、水杨酸或安全剂)调节的启动子。
如本文所用的“重组"指的是序列的两个另外分离的区段例如通过化学合成或通过分离的核酸区段的操作通过基因工程技术人工组合。“重组”还包括已通过引入来源于经所述修饰的细胞的异源核酸或细胞修饰的细胞或载体，但不涵盖天然存在事件(例如自发突变、天然转型/转导/移位)，例如未经人类故意干涉发生的事件，改变细胞或载体。
如本文所用的“重组DNA构筑体”指的是自然界中通常不一起存在的核酸片段的组合。因此，重组DNA构筑体可以包含来源于不同来源的调节序列和编码序列，或来源于同一来源的调节序列和编码序列，但其以与自然界中通常存在的方式不同的方式排列。术语“重组DNA构筑体”和“重组构筑体”在本文中可互换地使用。
如本文所用的术语“降低”或“降低的”指数量或活性约10％到约99％的降低，或者至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少100％或更多的降低，所述活性例如(但不限于)硝酸盐水平和烟草特异性亚硝胺(TSNA)水平。术语“降低的”或短语“降低的量”打算指经修饰的烟草植物或由经修饰的烟草植物产生的烟草产品中TSNA量低于未经修饰的烟草植物或以相同方式从相同多种烟草加工的烟草产品中存在的量低。因此，在一些情形中，已使用相同方式处理的相同变种的野生型烟草用作对照，由此测量通过本文所述的本发明方法是否已获得硝酸盐或TSNA的降低。
本文可互换使用的“调节序列”和“调节元件”指的是位于编码序列上游(5'非编码序列)、内或下游(3'非编码序列)，并且影响相关编码序列的转录、RNA处理或稳定性或转译的核苷酸序列。调节序列可以包括(但不限于)启动子、转译前导序列、内含子以及聚腺苷酸化识别序列。术语“调节序列”和“调节元件”在本文中可以互换使用。
如本文所用的“定点核酸酶”指的是能够特异性识别和裂解DNA序列的酶。定点核酸酶可以经工程改造。工程改造的定点核酸酶的实例包括锌指核酸酶(ZFN)、TAL效应子核酸酶(TALEN)、CRISPR/Cas9类系统以及大范围核酸酶。
在一些情形中，如本文所用的术语“烟草”整体意义上指的是烟草作物，(例如田间生长的多种烟草植物，即非水培生长的烟草)烟草植物以及其部分，包括(但不限于)如本文所述制备和/或获得的根、茎、叶子、花以及种子。应理解，“烟草”指的是普通烟草植物以及其产品。在一些情形中，术语“烟草产品”指的是消费型烟草产品，包括(但不限于)吸烟材料(例如香烟、雪茄和烟斗丝)、鼻烟、咀嚼烟草、口香糖以及口含片，以及用于制造消费型烟草产品的组分、材料以及成分。优选地，这些烟草产品由烟草(普通烟草)叶子和茎制成，这些叶子和茎从如上文所述处理的烟草采摘并且根据烟草制备中的常规技术切割、干燥、烘烤和/或发酵。
如本文所用的“转录终止子”、“终止序列”或“终止子”指的是位于编码序列下游的DNA序列，包括聚腺苷酸化识别序列和编码能够影响mRNA处理或基因表达的调节信号的其它序列。聚腺苷酸化信号通常特征为影响聚腺苷酸段向mRNA前驱体的3'端的添加。
如本文所用的“转基因”指的是基因组已经通过异源核酸的存在发生改变的任何细胞、细胞株、愈伤组织、组织、植物部分或植物，所述异源核酸例如重组DNA构筑体，包括那些初始转基因事件以及通过性别交叉或无性施肥从初始转基因事件产生的那些。如本文所用的术语“转基因”不涵盖通过常规植物育种方法或天然存在的事件(例如无规交叉施肥、非重组病毒感染、非重组细菌转型、非重组移位或自发突变)改变基因组(染色体或染色体外)。
如本文所用的“转基因植物”包括基因组内包含异源多核苷酸的植物，即含有这一类型的植物或树中通常不存在并且已经通过人类操作引入到所讨论的植物(或植物的祖细胞)中的重组基因材料的植物或树。举例来说，异源多核苷酸在基因组内稳定整合使得多核苷酸在连续继代中传递。异源多核苷酸可以整合到单独基因组中或整合成重组DNA构筑体的部分。基因改良胚质的商业开发还发展到向作物植物中引入多种特性的阶段，通常称为基因堆叠法。在这一方法中，可以向植物中引入赋予所关注的不同特征的多个基因。基因堆叠可以通过许多方式实现，包括(但不限于)共转型、重新转型以及用不同转基因品系交叉。因此，从通过转型引入重组DNA的植物细胞生长的植物是转基因植物，全部是含有所以引入转基因的植物的子代(有性产生或无性产生)。应理解术语转基因植物涵盖整个植物或树以及植物或树的部分，例如谷物、种子、花、叶子、根、果实、花粉、茎等。
“转基因植物”还包括基因组内包含超过一种异源多核苷酸的植物。各异源多核苷酸可以赋予转基因植物不同性状。
如本文所用的“转录活化因子类效应子”或“TALE”指的是识别以及结合到具体DNA序列的蛋白质结构。“TALE DNA结合域”指的是包括串联33-35个氨基酸重复的阵列的DNA结合域，也称为RVD模块，其中每一个特异性地识别单个DNA碱基对。RVD模块可以任何顺序安排来装配识别已确定序列的阵列。
TALE DNA结合域的结合特异性通过RVD阵列随后20个氨基酸的单个截短重复确定。TALE DNA结合域可具有12到27个RVD模块，其中每一个含有RVD并且识别单个DNA碱基对。特异性RVD已鉴别四个可能DNA核苷酸(A、T、C以及G)中每一个的识别。因为TALE DNA结合域是模块，所以识别四个不同DNA核苷酸的重复序列可以连接在一起来识别任何具体DNA序列。这些靶向DNA结合域又可与催化域组合形成功能性酶，包括人工转录因子、甲基转移酶、整合酶、核酸酶以及重组酶。
本文可互换使用的“转录活化因子类效应子核酸酶”或“TALEN”指的是核酸酶(例如核酸内切酶FokI)的催化域的工程改造的融合蛋白，以及可以靶向常规DNA序列的经设计TALE DNA结合域。“TALEN单体”指的是具有催化核酸酶结构域以及经设计的TALE DNA结合域的工程改造的融合蛋白。两个TALEN单体可以设计成目标并且裂解TALEN目标区域。
如本文所用的“转基因”指的是含有从一个生物体分离并且引入到不同生物体中的基因序列的基因或基因材料。DNA的这一非原生区段可以保留在转基因生物体中产生RNA或蛋白质的能力，或其可以改变转基因生物体的遗传密码的标准功能。转基因的引入具有改变生物体的表型的可能。
本文所用的关于核酸的“变异体”意思是(i)参考核苷酸序列的部分或片段；(ii)参考核苷酸序列或其部分的互补序列；(iii)与参考核酸或其互补序列大体上一致的核酸；或(iv)在严格条件下与参考核酸杂交的核酸、其互补序列，或与其大体上一致的序列。
关于肽或多肽的“变异体”通过插入、缺失或保守取代氨基酸而使氨基酸序列不同，但保留至少一种生物活性。变异体还可以意思是氨基酸序列与参考蛋白质大体上一致并且氨基酸序列保留至少一种生物活性的蛋白质。氨基酸的保守取代，也就是说用具有类似特性(例如亲水性、程度以及带电区域的分布)的不同氨基酸置换氨基酸在所属领域中认为是通常涉及次要改变。
如本文所用的术语“变种”指的是共享恒定特征的植物群体，所述恒定特征使其与相同物种的其它植物区分开。尽管具有一种或多种独特特性，但变种的特征进一步在于所述变种内个体之间的极小整体变化。变种通常市场上有出售。
如本文所用的“载体”意思是核酸媒介物，其包含允许核酸、核酸构筑体和核酸结合物等传输的核酸组分的组合。载体可以是病毒载体、细菌噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是DNA或RNA载体。适合载体包括能够染色体外复制例如环状双股核酸质粒；经线性化的双股核酸质粒；以及任何来源的其它载体的游离基因。举例来说，载体可以编码包含SEQ ID NO:5或7中的任一个的氨基酸序列的去调节的硝酸还原酶蛋白质。如本文所用的“表达载体”是核酸媒介物，其包含允许核酸、核酸构筑体和核酸缀合物等等表达的核酸组分的组合。适合表达载体包括能够染色体外复制的游离基因，例如环状双股核酸质粒；经线性化的双股核酸质粒；以及其它具有任何来源的功能等效表达载体。如下文所定义，表达载体包含位于核酸、核酸构筑体或核酸结合物上游并且与核酸、核酸构筑体或核酸结合物可操作地连接的至少一个启动子。
如本文所用的“锌指”指的是识别并且结合到DNA序列的蛋白质结构。锌指结构域是人类蛋白质组中最常见的DNA结合基元。单个锌指含有约30个氨基酸并且结构域通常通过结合3个连续DNA碱基对通过每个碱基对单个氨基酸侧链的相互作用起作用。
本文可互换使用的“锌指核酸酶”或“ZFN”指的是包含有效连接到至少一个核酸酶或完全装配时能够裂解DNA的核酸酶的部分的至少一个锌指DNA结合域的嵌合蛋白质分子。
除非本文另外定义，否则结合本发明使用的科学与技术术语将具有所属领域普通技术人员通常所理解的含义。举例来说，与本文所述的细胞和组织培养物、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学方法以及杂交结合使用的任何命名法和技术是所属领域众所周知并且常用的那些。术语的含义和范围应该明确；然而在具有任何潜在不明确性的事件中，本文提供的定义优先于任何词典或外来定义。另外，除非上下文另外需要，否则单数术语应包括复数并且复数术语应包括单数。
2.硝酸盐减少的经修饰烟草植物
本发明的一个方面针对叶子中游离硝酸盐水平降低的经修饰的烟草植物。游离硝酸盐水平通过硝酸盐同化路径降低。植物中氮同化路径的简化图示于图1中。植物暴露于土壤硝酸盐之后，存在几个涉及并入N的步骤，包括摄入、同化、移位以及再活化。通过位于根部细胞膜上的特异性转运蛋白摄入之后，硝酸盐进入特异性同化路径。最初，硝酸盐通过硝酸还原酶(NR；EC 1.7.1.1-3)还原成亚硝酸盐(NO2 -)。随后，亚硝酸盐通过亚硝酸还原酶(NiR)还原成氨。后一步骤在植物中倾向于高度有效，并且因此，植物细胞通常含有极低水平的亚硝酸盐。亚硝酸盐还原成氨之后，谷氨酰胺合成酶(GS)将氮并入到有机分子谷氨酰胺(Gln)中。GS酶与谷氨酸合成酶(GOGAT)结合起作用形成GS/GOGAT循环，所述循环用于将氨基从Gln穿梭到谷氨酸(Glu)从而用作随后将氮再分布到其它氨基酸和最终蛋白质以及其它含氮大分子的闸道。这一过程中的另一重要步骤由异柠檬酸脱氢酶(ICDH)催化，认为所述酶负责提供GOGAT所需的产生Glu的2-酮戊二酸碳骨架。
烟草(普通烟草)具有两个高度同源烟草NR基因，命名为Nia1和Nia2。如本文所披露的叶子中的游离硝酸盐水平降低的经修饰的烟草植物具有编码去调节的硝酸还原酶多肽(也就是说去调节的Nia1和Nia2基因产物)的经修饰的硝酸还原酶多核苷酸。硝酸还原酶的转录和转录后水平都受到高度调节。因为包括通过磷酸化进行亮/暗调节的转译后调节机制，所以NR基因在转基因植物中的过表达通常仅导致细胞中的NR活性适度提高。在一些实施例中，去调节的硝酸还原酶多肽是具有组成性活性的内源性或异源性硝酸还原酶多肽。经去调节的硝酸还原酶多肽可能已经失去通过磷酸化调节的能力，因为失去硝酸还原酶多肽内的磷酸化位点并且因此不受亮和暗调节。经修饰的烟草植物可具有编码去调节的硝酸还原酶多肽或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7的去调节的硝酸还原酶多肽的多核苷酸，或其变异体或片段。举例来说，去调节的硝酸还原酶可以是截短的硝酸还原酶多肽或磷酸化位点消除的具有氨基酸取代的硝酸还原酶多肽。
在一些实施例中，经修饰的烟草植物与未经修饰的对照植物相比大体上展示标准植物生长和发育。举例来说，经修饰的烟草植物可能正常衰老，即经修饰的烟草植物中的衰老可以与未经修饰的对照烟草植物中大体上相同。在一些实施例中，经修饰的烟草植物的视觉外观可能与未经修饰的对照植物大体上相同，例如田间移植之后3或6个月。举例来说，经修饰的烟草植物与未经修饰的对照植物相比，叶子的叶绿素含量、叶子的着色、成熟程度、每株植物的叶子数目、茎高度、叶子插入角度、叶子尺寸(宽度或长度)、节间距离和/或叶片-中脉比率可能大体上相同。
(1)截短的硝酸还原酶
去调节的硝酸还原酶多肽可以是具有N端截短的硝酸还原酶多肽，也就是说N端处或N端附近缺失。在N端结构域具有56个氨基酸缺失的编码NR蛋白质的截短烟草Nia2基因对消除的酶具有许多转译后控制。与暗周期期间通过磷酸化变得不活化的野生型(WT)酶相比，56个氨基酸缺失使硝酸还原酶能够在亮和暗中具有同等的活性。当与强组成性启动子偶合时，截短硝酸还原酶基因的表达可提高植物中的整体N硝酸还原酶R活性，以及谷氨酰胺(Gln)和天冬酰胺(Asn)的去调节制造。
去调节的硝酸还原酶多肽可以是与SEQ ID NO:4相比具有约10个氨基酸到约100个氨基酸、约10个氨基酸到约90个氨基酸、约10个氨基酸到约80个氨基酸、约10个氨基酸到约70个氨基酸、约10个氨基酸到约60个氨基酸、约10个氨基酸到约55个氨基酸、约10个氨基酸到约50个氨基酸、约10个氨基酸到约40个氨基酸、约10个氨基酸到约30个氨基酸、约10个氨基酸到约20个氨基酸、约20个氨基酸到约100个氨基酸、约20个氨基酸到约90个氨基酸、约20个氨基酸到约80个氨基酸、约20个氨基酸到约70个氨基酸、约20个氨基酸到约60个氨基酸、约20个氨基酸到约55个氨基酸、约20个氨基酸到约50个氨基酸、约20个氨基酸到约40个氨基酸、约20个氨基酸到约30个氨基酸、约30个氨基酸到约100个氨基酸、约30个氨基酸到约90个氨基酸、约30个氨基酸到约80个氨基酸、约30个氨基酸到约70个氨基酸、约30个氨基酸到约60个氨基酸、约30个氨基酸到约55个氨基酸、约30个氨基酸到约50个氨基酸、约30个氨基酸到约40个氨基酸、约40个氨基酸到约100个氨基酸、约40个氨基酸到约90个氨基酸、约40个氨基酸到约80个氨基酸、约40个氨基酸到约70个氨基酸、约40个氨基酸到约60个氨基酸、约40个氨基酸到约55个氨基酸、约40个氨基酸到约50个氨基酸、约50个氨基酸到约100个氨基酸、约50个氨基酸到约90个氨基酸、约50个氨基酸到约80个氨基酸、约50个氨基酸到约70个氨基酸、约50个氨基酸到约60个氨基酸、约50个氨基酸到约55个氨基酸、约55个氨基酸到约100个氨基酸、约55个氨基酸到约90个氨基酸、约55个氨基酸到约80个氨基酸、约55个氨基酸到约70个氨基酸，或约55个氨基酸到约60个氨基酸，或至少约10个氨基酸、至少约20个氨基酸、至少约30个氨基酸、至少约40个氨基酸、至少约50个氨基酸、至少51个氨基酸、至少约52个氨基酸、至少53个氨基酸、至少约54个氨基酸、至少55个氨基酸、至少约56个氨基酸、至少57个氨基酸、至少约58个氨基酸、至少59个氨基酸、至少约60个氨基酸或至少65个氨基酸的N端截短的硝酸还原酶多肽。去调节的硝酸还原酶多肽可以是具有56个氨基酸N端截短的硝酸还原酶多肽。
(2)氨基酸取代
去调节的硝酸还原酶多肽可以是在对应于SEQ ID NO:4的位置523的位置处具有氨基酸取代的硝酸还原酶多肽。假定磷酸化位点中丝氨酸残基突变(参看图2)，因此消除光和暗产生的转译后调节控制，增加和保持转基因植物中高水平的硝酸还原酶的活性形式以促进硝酸盐同化。通过使用定点突变诱发将位置523处的丝氨酸(Ser)改变成SEQ ID NO:4的天冬氨酸(Asp)，硝酸还原酶多肽不再用作通常在暗期间通过这一Ser残基的磷酸化使这一酶失活的蛋白激酶的底物。在一些实施例中，去调节的硝酸还原酶包括在对应于SEQ IDNO:4的位置523的位置处包含氨基酸取代的多肽。在一些实施例中，去调节的硝酸还原酶包括在对应于SEQ ID NO:4的位置523的位置处包含除了丝氨酸以外的氨基酸的多肽。在一些实施例中，去调节的硝酸还原酶包括在对应于SEQ ID NO:4的位置523的位置处包含天冬氨酸的多肽。
a.降低的硝酸盐水平
经修饰的烟草植物与对照烟草植物(例如野生型烟草植物对照)相比可具有降低的硝酸盐水平。在一些实施例中，当使用高水平(例如19mM硝酸盐)或中等水平(例如8mM硝酸盐)硝酸盐施肥处理生长时，经修饰的烟草植物与对照烟草植物相比在叶子中可具有降低的硝酸盐水平。在一些实施例中，当在田间条件下生长时，经修饰的烟草植物与对照烟草植物相比，叶子中可具有降低的硝酸盐水平。在一些实施例中，叶子是新鲜采摘的。在一些实施例中，叶子经烘烤、储存或加工。在一些实施例中，叶子是空气烘烤的。
从高水平硝酸盐施肥处理下生长的经修饰烟草植物新鲜采摘的叶子与从对照烟草新鲜采摘的叶子相比，经修饰的烟草植物的硝酸盐水平可具有至少约1倍降低、至少约2倍降低、至少约3倍降低、至少约4倍降低、至少约5倍降低、至少约6倍降低、至少约7倍降低、至少约8倍降低、至少约9倍降低、至少约10倍降低、至少约15倍降低、至少约20倍降低、至少约25倍降低或至少约30倍降低。当在高水平硝酸盐施肥处理下生长时，从经修饰的烟草植物新鲜采摘的叶子可具有约0.5％到约99％、约0.5％到约95％、约0.5％到约90％、约0.5％到约85％、约0.5％到约80％、约0.5％到约75％、约0.5％到约70％、约0.5％到约65％、约0.5％到约60％、约0.5％到约55％、约0.5％到约50％、约0.5％到约45％、约0.5％到约40％、约0.5％到约35％、约0.5％到约30％、约0.5％到约25％、约0.5％到约20％、约0.5％到约15％、约0.5％到约13％、约0.5％到约10％、约0.5％到约5％、约1％到约99％、约1％到约95％、约1％到约90％、约1％到约85％、约1％到约80％、约1％到约75％、约1％到约70％、约1％到约65％、约1％到约60％、约1％到约55％、约1％到约50％、约1％到约45％、约1％到约40％、约1％到约35％、约1％到约30％、约1％到约25％、约1％到约20％、约1％到约15％、约1％到约13％、约1％到约10％、约1％到约5％、约5％到约99％、约5％到约95％、约5％到约90％、约5％到约85％、约5％到约80％、约5％到约75％、约5％到约70％、约5％到约65％、约5％到约60％、约5％到约55％、约5％到约50％、约5％到约45％、约5％到约40％、约5％到约35％、约5％到约30％、约5％到约25％、约5％到约20％、约5％到约15％、约5％到约13％、约5％到约10％、约10％到约99％、约10％到约95％、约10％到约90％、约10％到约85％、约10％到约80％、约10％到约75％、约10％到约70％、约10％到约65％、约10％到约60％、约10％到约55％、约10％到约50％、约10％到约45％、约10％到约40％、约10％到约35％、约10％到约30％、约10％到约25％、约10％到约20％、约10％到约15％、约10％到约13％、约20％到约99％、约20％到约95％、约20％到约90％、约20％到约85％、约20％到约80％、约20％到约75％、约20％到约70％、约20％到约65％、约20％到约60％、约20％到约55％、约20％到约50％、约20％到约45％、约20％到约40％、约20％到约35％、约20％到约30％、约20％到约25％、约30％到约99％、约30％到约95％、约30％到约90％、约30％到约85％、约30％到约80％、约30％到约75％、约30％到约70％、约30％到约65％、约30％到约60％、约30％到约55％、约30％到约50％、约30％到约45％、约30％到约40％、约30％到约35％、约40％到约99％、约40％到约95％、约40％到约90％、约40％到约85％、约40％到约80％、约40％到约75％、约40％到约70％、约40％到约65％、约40％到约60％、约40％到约55％、约40％到约50％、约40％到约45％、约50％到约99％、约50％到约95％、约50％到约90％、约50％到约85％、约50％到约80％、约50％到约75％、约50％到约70％、约50％到约65％、约50％到约60％、约50％到约55％、约60％到约99％、约60％到约95％、约60％到约90％、约60％到约85％、约60％到约80％、约60％到约75％、约60％到约70％、约60％到约65％，或至少约0.5％、至少约1％、至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约6％、至少约7％、至少约8％、至少约9％、至少约10％、至少约11％、至少约12％、至少约13％、至少约14％、至少约15％、至少约16％、至少约17％、至少约18％、至少约19％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％，或至少约99％从对照烟草植物(例如野生型烟草植物)新鲜采摘的叶子中存在的硝酸盐水平。从中等水平的硝酸盐施肥处理下生长的经修饰的烟草植物新鲜采摘的叶子与从对照烟草新鲜彩照的叶子相比，经修饰的烟草植物可具有至少约50ppm、至少约100ppm、至少约500ppm、至少约1000ppm、至少约1500ppm、至少约2000ppm、至少约2500ppm、至少约3000ppm、至少约3500ppm、至少约4000ppm、或至少约5000ppm硝酸盐。
从中等水平硝酸盐施肥处理下生长的经修饰烟草植物新鲜采摘的叶子与从对照烟草新鲜采摘叶子相比，经修饰的烟草植物的硝酸盐水平可具有至少约1倍降低、至少约2倍降低、至少约3倍降低、至少约4倍降低、至少约5倍降低、至少约6倍降低、至少约7倍降低、至少约8倍降低、至少约9倍降低、至少约10倍降低、至少约15倍降低、至少约20倍降低、至少约25倍降低或至少约30倍降低。从经修饰的烟草植物新鲜采摘的叶子可具有约0.5％到约99％、约0.5％到约95％、约0.5％到约90％、约0.5％到约85％、约0.5％到约80％、约0.5％到约75％、约0.5％到约70％、约0.5％到约65％、约0.5％到约60％、约0.5％到约55％、约0.5％到约50％、约0.5％到约45％、约0.5％到约40％、约0.5％到约35％、约0.5％到约30％、约0.5％到约25％、约0.5％到约20％、约0.5％到约15％、约0.5％到约13％、约0.5％到约10％、约0.5％到约5％、约1％到约99％、约1％到约95％、约1％到约90％、约1％到约85％、约1％到约80％、约1％到约75％、约1％到约70％、约1％到约65％、约1％到约60％、约1％到约55％、约1％到约50％、约1％到约45％、约1％到约40％、约1％到约35％、约1％到约30％、约1％到约25％、约1％到约20％、约1％到约15％、约1％到约13％、约1％到约10％、约1％到约5％、约5％到约99％、约5％到约95％、约5％到约90％、约5％到约85％、约5％到约80％、约5％到约75％、约5％到约70％、约5％到约65％、约5％到约60％、约5％到约55％、约5％到约50％、约5％到约45％、约5％到约40％、约5％到约35％、约5％到约30％、约5％到约25％、约5％到约20％、约5％到约15％、约5％到约13％、约5％到约10％、约10％到约99％、约10％到约95％、约10％到约90％、约10％到约85％、约10％到约80％、约10％到约75％、约10％到约70％、约10％到约65％、约10％到约60％、约10％到约55％、约10％到约50％、约10％到约45％、约10％到约40％、约10％到约35％、约10％到约30％、约10％到约25％、约10％到约20％、约10％到约15％、约10％到约13％、约20％到约99％、约20％到约95％、约20％到约90％、约20％到约85％、约20％到约80％、约20％到约75％、约20％到约70％、约20％到约65％、约20％到约60％、约20％到约55％、约20％到约50％、约20％到约45％、约20％到约40％、约20％到约35％、约20％到约30％、约20％到约25％、约30％到约99％、约30％到约95％、约30％到约90％、约30％到约85％、约30％到约80％、约30％到约75％、约30％到约70％、约30％到约65％、约30％到约60％、约30％到约55％、约30％到约50％、约30％到约45％、约30％到约40％、约30％到约35％、约40％到约99％、约40％到约95％、约40％到约90％、约40％到约85％、约40％到约80％、约40％到约75％、约40％到约70％、约40％到约65％、约40％到约60％、约40％到约55％、约40％到约50％、约40％到约45％、约50％到约99％、约50％到约95％、约50％到约90％、约50％到约85％、约50％到约80％、约50％到约75％、约50％到约70％、约50％到约65％、约50％到约60％、约50％到约55％、约60％到约99％、约60％到约95％、约60％到约90％、约60％到约85％、约60％到约80％、约60％到约75％、约60％到约70％、约60％到约65％，或至少约0.5％、至少约1％、至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约6％、至少约7％、至少约8％、至少约9％、至少约10％、至少约11％、至少约12％、至少约13％、至少约14％、至少约15％、至少约16％、至少约17％、至少约18％、至少约19％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约37％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％从对照烟草植物(例如在中等水平硝酸盐施肥处理下生长的野生型烟草植物)新鲜采摘的叶子中存在的硝酸盐水平。从中等水平硝酸盐施肥处理中生长的经修饰烟草植物新鲜采摘的叶子与从对照烟草新鲜采摘的叶子相比，经修饰的烟草植物可具有至少约50ppm、至少约100ppm、至少约150ppm、至少约200ppm、至少约250ppm、至少约300ppm、至少约350ppm、至少约400ppm、至少约450ppm、至少约500ppm、至少约550ppm、至少约600ppm、至少约650ppm、至少约700ppm、至少约750ppm、至少约800ppm、至少约850ppm、至少约900ppm、至少约950ppm或至少约1000ppm硝酸盐。
从经修饰的烟草植物新鲜采摘的叶子或烘烤的叶子在从田间生长的经修饰的烟草植物新鲜采摘的叶子或烘烤叶子中的硝酸盐水平可具有至少约1倍降低、至少约2倍降低、至少约3倍降低、至少约4倍降低、至少约5倍降低、至少约6倍降低、至少约7倍降低、至少约8倍降低、至少约9倍降低、至少约10倍降低、至少约15倍降低、至少约20倍降低、至少约25倍降低或至少约30倍降低。从经修饰的烟草植物新鲜采摘的叶子或烘烤的叶子可具有约0.5％到约99％、约0.5％到约95％、约0.5％到约90％、约0.5％到约85％、约0.5％到约80％、约0.5％到约75％、约0.5％到约70％、约0.5％到约65％、约0.5％到约60％、约0.5％到约55％、约0.5％到约50％、约0.5％到约45％、约0.5％到约40％、约0.5％到约35％、约0.5％到约30％、约0.5％到约25％、约0.5％到约20％、约0.5％到约15％、约0.5％到约13％、约0.5％到约10％、约0.5％到约5％、约1％到约99％、约1％到约95％、约1％到约90％、约1％到约85％、约1％到约80％、约1％到约75％、约1％到约70％、约1％到约65％、约1％到约60％、约1％到约55％、约1％到约50％、约1％到约45％、约1％到约40％、约1％到约35％、约1％到约30％、约1％到约25％、约1％到约20％、约1％到约15％、约1％到约13％、约1％到约10％、约1％到约5％、约5％到约99％、约5％到约95％、约5％到约90％、约5％到约85％、约5％到约80％、约5％到约75％、约5％到约70％、约5％到约65％、约5％到约60％、约5％到约55％、约5％到约50％、约5％到约45％、约5％到约40％、约5％到约35％、约5％到约30％、约5％到约25％、约5％到约20％、约5％到约15％、约5％到约13％、约5％到约10％、约10％到约99％、约10％到约95％、约10％到约90％、约10％到约85％、约10％到约80％、约10％到约75％、约10％到约70％、约10％到约65％、约10％到约60％、约10％到约55％、约10％到约50％、约10％到约45％、约10％到约40％、约10％到约35％、约10％到约30％、约10％到约25％、约10％到约20％、约10％到约15％、约10％到约13％、约20％到约99％、约20％到约95％、约20％到约90％、约20％到约85％、约20％到约80％、约20％到约75％、约20％到约70％、约20％到约65％、约20％到约60％、约20％到约55％、约20％到约50％、约20％到约45％、约20％到约40％、约20％到约35％、约20％到约30％、约20％到约25％、约30％到约99％、约30％到约95％、约30％到约90％、约30％到约85％、约30％到约80％、约30％到约75％、约30％到约70％、约30％到约65％、约30％到约60％、约30％到约55％、约30％到约50％、约30％到约45％、约30％到约40％、约30％到约35％、约40％到约99％、约40％到约95％、约40％到约90％、约40％到约85％、约40％到约80％、约40％到约75％、约40％到约70％、约40％到约65％、约40％到约60％、约40％到约55％、约40％到约50％、约40％到约45％、约50％到约99％、约50％到约95％、约50％到约90％、约50％到约85％、约50％到约80％、约50％到约75％、约50％到约70％、约50％到约65％、约50％到约60％、约50％到约55％、约60％到约99％、约60％到约95％、约60％到约90％、约60％到约85％、约60％到约80％、约60％到约75％、约60％到约70％、约60％到约65％或至少约0.5％、至少约1.0％、至少约2.0％、至少约3.0％、至少约4.0％、至少约4.1％、至少约4.2％、至少约4.3％、至少约4.4％、至少约4.5％、至少约5.0％、至少约5.1％、至少约5.2％、至少约5.3％、至少约5.4％、至少约5.5％、至少约5.6％、至少约5.7％、至少约5.8％、至少约5.9％、至少约6.0％、至少约7.0％、至少约8.0％、至少约9.0％、至少约10％、至少约11％、至少约12％、至少约13％、至少约14％、至少约15％、至少约16％、至少约17％、至少约18％、至少约19％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约37％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％从对照烟草植物(例如田间生长的野生型烟草植物)新鲜采摘的叶子或烘烤的叶子中存在的硝酸盐水平。
b.异源硝酸还原酶
去调节的硝酸还原酶多肽可以由异源硝酸还原酶多核苷酸或基因(也就是说并非经修饰的烟草植物内源的硝酸还原酶基因)编码。如下文所述，通过植物转型将异源硝酸还原酶基因引入到经修饰的烟草植物的基因组中。举例来说，可以通过稳定转型或短暂转型方法将异源硝酸还原酶基因引入到经修饰的烟草植物中。
异源硝酸还原酶基因可以是植物、真菌或藻类硝酸还原酶基因。举例来说，异源硝酸还原酶基因可以来自蓖麻(Ricinus communis)、蓖麻、酿酒葡萄(Vitis vinifera)、美国黑杨(Populus trichocarpa)、江南卷柏(Selaginella moellendorffii)、江南卷柏、黄瓜(Cucumis sativus)、笋瓜(Cucurbita maxima)、黄瓜、甘蓝型油菜(Brassica napus)、美国黑杨、垂枝桦(Betula pendula)、马铃薯(Solanum tuberosum)、茸毛烟草(Nicotianatomentosiformis)、普通烟草(Nicotiana tabacum)、西红柿(Solanum lycopersicum)、本氏烟(Nicotiana benthamiana)、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)、本氏烟、中国芜菁(Brassica rapa subsp.chinenis)、甜菜(Beta vulgaris)、美花烟草(Nicotianasylvestris)、各种不同普通烟草、皱叶烟草、大豆(Glycine max)、马铃薯、马铃薯、甘蓝型油菜、拟南芥琴亚种(Arabidopsis lyrata subsp.lyrata)、阿拉伯芥(Arabidopsisthaliana)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、蒺藜苜蓿、牵牛花(Petunia x hybrid)、菠菜(Spinacia oleracea)、百脉根(Lotus japonicas)、菊苣(Cichorium intybus)、牵牛花(Petuniax hybrid)、菠菜、卷盐芥(Thellungiella halophile)、水稻(Oryza sativaJaponica Group)、玉米(Zea Mays)、阿拉伯芥、拟南芥琴亚种、菜豆、高粱(Sorghumbicolor)、秈稻(Oryza sativa Indica Group)、粳稻(Oryza sativa Japonica Group)、大麦(Hordeum vulgare subsp vulgare)、高粱、粳稻、大豆(Glycine max)、大麦、高粱、玉米、赤潮异弯藻(Heterosignma akashiwo)、小球藻UTEX259(Chlorella vulgaris UTEX259)、小球藻NJ-7(Chlorella vulgaris NJ-7)、小球藻(Chlorella variabilis)、长囊水云(Ectocarpus siliculosus)、团藻(Volvox carteri f.nagariensis)、细基江蓠(Gracilaria tenuistipitata)、杜氏藻(Dunaliella tertiolecta)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、绿色杜氏藻(Dunaliella viridis)、假微型海链藻CCMP1335(Thalassiosira pseudonana CCMP1335)、盐生杜氏藻(Dunaliella salina)、三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)或绿色鞭毛藻CCE9901(Ostreococcuslucimarinus CCE9901)。
异源硝酸还原酶基因可以是具有GenBank寄存编号XP_002513830.1、AAG30576.1、XP_002285831.1、XP_002307415.1、XP_002984312.1、XP_002972481.1、ADN96689.1、P17569.1、ADK77877.1、P39867.1、XP_002301015.1、P27783.1、BAB93534.1、227925、P11605.1、P17570.1、BAE46746.1、ADV03139.1、BAE96752.1、ACF93242.1、ABW05098.1、227926、P08509.2、P39870.1、AAB18985.1、AAB52786.1、P39868.1、XP_002889158.1、NP_177899.1、P39866.1、ADV03138.1、P36859.1、P23312.1、P39869.1、P43101.1、AAA33712.1、BAA13047.1、BAJ33682.1、NP_001062006.1、AAD38068.1、NP_174901.1、XP_002891229.1、P39865.1、XP_002444490.1、EEC74079.1、NP_001048253.1、P27967.1、XP_002454625.1、NP_001062009.1、P54233.1、P27968.1、XP_002454083.1、P49102.1、ACS44801.1、ABP97095.1、ABJ91208.4、EFN52691.1、CBN78746.1、XP_002955156.1、ACX31652.1、AAL79356.1、AAF17595.1、AAT72293.1、XP_002294410.1、AAP75705.1、AAV66996.1或XP_001420098.1的硝酸还原酶基因。
c.内源性硝酸还原酶基因的修饰
烟草(普通烟草)具有两个高度同源烟草NR基因，命名为Nia1和Nia2，也就是说两个内源性硝酸还原酶基因。去调节的硝酸还原酶基因可以是通过基因组编辑系统或诱变剂修饰或诱变的内源性硝酸还原酶基因。本文所述的核苷酸序列和多肽中的突变可以包括人造突变或合成突变或遗传工程改造的突变。本文所述的核苷酸序列和多肽中的突变可以是通过包括体外或体内操纵步骤的过程获得或可获得的突变。本文所述的核苷酸序列和多肽中的突变可以是通过包括人为干预的过程获得或可获得的突变。
用于制备突变体的过程在所属领域中众所周知，并且可以包括使用外源添加的化学品的突变诱发，所述化学品例如诱变、致畸或致癌有机化合物，例如甲磺酸乙酯(EMS)，它在遗传材料中产生随机突变。进一步举例来说，所述过程可以包括一个或多个遗传工程改造步骤-例如本文所述的遗传改造步骤中的一个或多个或其组合。如本文别处所述，还可以使用基因组中的靶向诱导的局部损伤(TILLING)。
进一步举例来说，所述过程可以包括一个或多个植物杂交步骤。在一个实施例中，使来自植物的种子发生诱变并且随后生长成第一代突变植物。随后使第一代植物自花授粉，并且使来自第一代植物的种子生长成第二代植物，所述第二代植物随后就其基因座中的突变进行筛选。尽管诱变的植物材料可针对突变进行筛选，但筛选第二代植物的优点在于所有体细胞突变都对应于生殖系突变。所属领域技术人员将理解多种植物材料包括(但不限于)种子、花粉、植物组织或植物细胞可以进行诱变，以便制备突变植物。然而，当植物核酸针对突变进行筛选时，可以影响诱变的植物材料类型。举例来说，当在非诱变植物授粉之前对花粉实施诱变时，使授粉获得的种子生长成第一代植物。第一代植物的每一个细胞将含有在花粉中产生的突变；因此这些第一代植物随后可针对突变进行筛选，而不是等到第二代进行。
(1)基因组编辑系统
基因组编辑系统可以结合和裂解一个位置的内源性硝酸还原酶基因产生截短的硝酸还原酶多肽或具有氨基酸取代的硝酸还原酶多肽。内源性硝酸还原酶基因可以通过包括定点核酸酶的基因组编辑系统修饰，所述定点核酸酶结合和裂解内源性硝酸还原酶基因。基因组编辑系统可以利用核酸酶介导的非同源端接合或同源引导的修复。可以通过稳定转型或短暂转型方法将基因组编辑系统引入到经修饰的烟草植物中。
定点核酸酶可以经工程改造。举例来说，工程改造的定点核酸酶可以是基于CRISPR/Cas9的系统、ZFN或TALEN。定点核酸酶可以结合和裂解内源性硝酸还原酶基因。基因组编辑系统可以包括工程改造的CRISPR/Cas系统，例如工程改造的CRISPR/Cas-9系统、工程改造的转录活化因子类效应子核酸酶、工程改造的锌指核酸酶或工程改造的大范围核酸酶。
(2)诱变剂
包括化学诱变剂或辐射的主要形成点突变和短缺失、插入、颠换和或转换的诱变剂，可用于形成硝酸还原酶基因中的突变。诱变剂包括(但不限于)甲磺酸乙酯、甲磺酸甲酯、N-乙基-N-亚硝基脲、三乙基蜜胺、N-甲基-N-亚硝基脲、丙卡巴肼、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、硫酸二乙酯、丙烯酰胺单体、美法仑、氮芥、长春新碱、二甲基亚硝胺、N-甲基-N'-硝基-亚硝基胍、亚硝基胍、2-氨基嘌呤、7,12-二甲基苯并蒽、环氧乙烷、六甲基磷酸胺、白消安、二环氧烷烃(二环氧辛烷、二环氧丁烷等)、2-甲氧基-6-氯-9[3-(乙基-2-氯乙基)氨丙基氨基]吖啶二盐酸盐和甲醛。
d.与生物碱前驱基因的组合
靶向亚硝化剂的去调节的硝酸还原酶多肽可以与经修饰的生物碱前驱基因组合使用，这抑制去甲烟碱生物碱前驱体的产生。去调节的硝酸还原酶多肽和经修饰的生物碱前驱基因的组合与使用单独去调节的硝酸还原酶或经修饰的生物碱前驱基因相比可以产生更高的NNN积聚降低。经修饰的生物碱前驱基因可以通过将前驱体生物碱去甲烟碱的水平降低到较低去甲烟碱来减少特异性TSNA，例如N'-亚硝基去甲烟碱。经修饰的生物碱前驱基因可以是经修饰的烟碱去甲基化酶基因或细胞色素P450基因。经修饰的生物碱前驱基因可以是经修饰的CYP82E4基因、经修饰的CYP82E5v2基因或经修饰的CYP82E10基因以及其组合。在一些实施例中，去调节的硝酸还原酶多肽可以引入到内源性烟碱去甲基化酶基因中具有基因敲除突变的烟草植物，例如DH98-325-6#775饲养品系(路易斯(Lewis)等人.植物化学(Phytochem.)71:1988-1998(2010))，或具有三重突变烟碱去甲基化酶遗传背景的烟草植物中。在一些实施例中，去调节的硝酸还原酶多肽可以引入到CYP82E4和CYP82E5烟碱去甲基化酶基因中具有基因敲除突变的烟草植物，例如白肋栽培品种TN90e4e5，这是代表商业变种TN90的回交源变异体的品系并且描述于以全文引用的方式并入本文中的美国专利申请案第20120216822号中。
3.构筑体、载体和表达载体
在某些实施例中，打算引入到植物中的多核苷酸与启动子序列可操作地连接并且可以构筑体形式提供。如本文所用，当与第二多核苷酸序列呈功能性关系时，多核苷酸“可操作地连接”。举例来说，如果启动子连接到编码序列使得其可影响编码序列的转录，那么启动子与编码序列可操作地连接。在多个实施例中，多核苷酸可以与至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少十个启动子可操作地连接。
核酸序列可以组成遗传构筑体，所述遗传构筑体可以是载体。载体可以能够表达植物细胞中的去调节的硝酸还原酶多肽或基因组编辑系统。载体可以是重组的。载体可以包含编码去调节的硝酸还原酶多肽或基因组编辑系统的异源核酸。适合载体包括质粒和病毒产生的载体。可以使用适于转型成植物、克隆和蛋白质表达的所属领域中已知的载体。载体可适于用编码去调节的硝酸还原酶多肽或基因组编辑系统的核酸转染细胞，经转型宿主细胞在进行去调节的硝酸还原酶多肽或基因组编辑系统表达的条件下培养和保持。
遗传构筑体可以包含编码本文所披露的去调节的硝酸还原酶多肽或基因组编辑系统的核酸序列。遗传构筑体可以作为功能染色体外分子存在于细胞中。遗传构筑体可以是线性微型染色体，包括着丝点、端粒或质粒或粘粒。遗传构筑体还可以是重组病毒载体(包括重组花椰菜嵌纹病毒、重组烟草花叶病毒)和重组马铃薯病毒X类载体的基因组的部分。遗传构筑体可以是细胞中生存的灭毒活微生物或重组微生物载体中的基因材料的部分。遗传构筑体可以包含用于基因表达核酸的编码序列的调节元件。调节元件可以是启动子、强化子、起始密码子、终止密码子或聚腺苷酸化信号。
载体可以包含编码去调节的硝酸还原酶多肽的异源核酸并且可以进一步包含起始密码子，其可以在去调节的硝酸还原酶多肽编码序列的上游，以及终止密码子，其可以在去调节的硝酸还原酶多肽编码序列的下游。起始和终止密码子可以与去调节的硝酸还原酶多肽编码序列同框。载体还可以包含与去调节的硝酸还原酶多肽编码序列可操作地连接的启动子。与去调节的硝酸还原酶多肽编码序列可操作地连接的启动子本身可能与编码去调节的硝酸还原酶多肽的多核苷酸不相关。适用于本发明实践的启动子包括(但不限于)组成性、诱导型、暂时调节、发育调节、化学调节、组织优选以及组织特异性启动子。适合地，启动子使植物中的充分表达产生本文所述的表型。适合启动子包括(但不限于)花椰菜嵌纹病毒的35S启动子、CYP82E4启动子、泛素、tCUP隐含组成性启动子、Rsyn7启动子、病原体诱导型启动子、玉米In2-2启动子、烟草PR-1a启动子、糖皮质激素诱导型启动子以及四环素诱导型和四环素抑制型启动子。
载体还可以包含聚腺苷酸化信号，它可以在去调节的硝酸还原酶多肽编码序列的下游。载体还可以包含在去调节的硝酸还原酶多肽编码序列上游的强化子。强化子可能是DNA表达所必需的。载体还可以包含植物复制起点以染色体外维持载体并且在细胞中产生多个载体拷贝。载体还可以包含调节序列，所述调节序列可以充分适于在投予载体的植物细胞中基因表达。载体还可以包含报导基因，例如绿色荧光蛋白(“GFP”)和/或可选标记物，例如湿霉素(“Hygro”)。
编码序列可以针对稳定性和高水平表达优化。在一些情况下，选择密码子以减少RNA的二级结构(例如分子内结合形成的二级结构)形成。
载体可以是通过常规技术和容易获得的起始物质产生蛋白质的表达载体或系统，包括萨布鲁克(Sambrook)等人,1989，其以全文引用的方式并入本文中。在一些实施例中，载体可以包含编码去调节的硝酸还原酶多肽的核酸序列。载体可以是pBI121。
4.植物转型
编码去调节的硝酸还原酶的多核苷酸可以引入到植物细胞中产生转基因植物。如本文所用，关于多核苷酸的“引入到植物中”涵盖使用任何适合多核苷酸传递方法将多核苷酸传递到植物、植物组织或植物细胞中。适用于本发明实践的适于将多核苷酸引入到植物中的方法包括(但不限于)冻融法、微粒轰击、直接DNA摄入、电穿孔、超声处理、微注射、植物病毒介导和土壤杆菌介导的转移到植物。可以根据本发明采用任何适于转型植物的土壤杆菌菌株、载体或载体系统。在某些实施例中，使用稳定转型法、短暂转型法或病毒介导法中的至少一个引入多核苷酸。
“稳定转型”意思是引入到植物中的核苷酸构筑体整合到植物的基因组中并且能够被其子代遗传。举例来说，可以在随后植物产生中使用常规育种技术分离出引入的核苷酸和/或连接的可选标记物基因(例如基因组编辑系统)。
“短暂转型”意思是引入到植物中的核苷酸构筑体不整合到植物的基因组中。植物或植物细胞还可以进行短暂转型，使得重组多核苷酸不整合到其基因组内。短暂转型的细胞通常伴随每次细胞分裂失去所引入的重组多核苷酸的全部或一部分，使得在足够数目的细胞分裂后，所引入的重组多核苷酸无法在子细胞中检测到。举例来说，植物细胞可以最初用缺乏可选标记的大范围核酸酶表达盒进行转型，并且可以在缺乏选择试剂的培养基上生长。在这类条件下，一部分经处理的细胞将获得基因组编辑系统并且将短暂表达基因组编辑系统而不将基因组编辑系统整合到基因组中。因为它不负责转型效率，所以后面一种转型操作需要筛选更多数目的经处理的细胞，以获得所需基因组修饰。
将核苷酸序列引入到植物细胞并且随后插入到植物基因组中的适合方法包括微注射(克洛斯威(Crossway)等人,生物技术(Biotechniques)4:320-334(1986))、电穿孔(里格斯(Riggs)等人,美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)83:5602-5606(1986))、土壤杆菌介导的转型(美国专利第5,981,840号和第5,563,055号)、直接基因转移(帕什科夫斯基(Paszkowski)等人,欧洲分子生物学杂志(EMBO J.)3:2717-2722(1984))以及弹道式粒子加速(ballistic particle acceleration)(参看例如美国专利第4,945,050号；第5,879,918号；第5,886,244号；第5,932,782号；托姆斯(Tomes)等人,植物细胞、组织和器官培养物：基础方法(Plant Cell,Tissue,and Organ Culture:FundamentalMethods),冈堡(Gamborg)和菲利浦(Phillips)编(柏林施普林格出版社(Springer-Verlag,Berlin))(1995)；以及麦凯布(McCabe)等人,生物技术(Biotechnology)6:923-926(1988))，其全部以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，植物可以从植物、植物组织或植物细胞再生或生长。可以使用从植物细胞或植物组织再生或生长植物的任何适合方法，例如(但不限于)从原生质体组织培养或再生。适当地，植物可以通过在愈伤组织诱导培养基、嫩芽诱导培养基和/或根部诱导培养基上生长经转型的植物细胞再生。参看例如McCormick等人,植物细胞报告(PlantCell Reports)5:81-84(1986)。这些植物接着可生长，并且经相同经转型品系或不同品系授粉，并且鉴别具有所要表型特征表达的所得杂交体。可以生长两代或更多代来确保所要表型特征的表达稳定保持和遗传，并且采摘种子以确保获得所要表型特征的表达。因此如本文所用，“经转型种子”指的是种子含有稳定整合到植物基因组中的核苷酸构筑体。
5.烟草变种
可以根据所披露方法修饰的烟草变种包括(但不限于)深色变种(例如白肋)、烤烟或亮变种(例如弗吉尼亚烟)、东方或土尔其变种，例如拉塔基亚烟草(Latakia)，以及经遗传修饰变种(例如载体2141)。白肋烟草积聚的硝酸盐水平一般比其它烟草类型高并且倾向于造成常见“美国混合型”风格香烟(还含有烤烟和东方烟草)中存在的TSNA的不成比例的共用。
6.烟草特异性亚硝胺减少的烟草产品
一方面，本发明针对烟草特异性亚硝胺(TSNA)减少的烟草产品。TSNA在烟草烘烤加工和吸烟期间产生。TSNA通过亚硝化剂和烟草中天然存在的生物碱之间的反应形成并且在烟草烟雾中还致癌。如上文所述，烟草产品从经修饰的烟草植物制造。
经修饰的烟草植物可以新鲜采摘，烘烤并且加工成致癌可能降低的烟草产品。叶子可以空气烘烤、明火烘烤、烟道烘烤或阳光烘烤。空气烘烤的烟草悬挂在充分换气的仓库中并且干燥四到八周的时间段。空气烘烤烟草的糖较低(这使得烟草烟雾淡、温和风味)并且烟碱高。雪茄和白肋烟草是'深色'空气烘烤的。明火烘烤的烟草悬挂在大仓库中，视方法和烟草而定，大仓库中硬木的火保持连续或间歇闷烧并且进行三天到十周。明火烘烤产生糖低且烟碱高的烟草。烟道烘烤的烟草最初捆在烟草棒上，所述烟草棒悬挂在烘烤仓库中的层叠杆上。这些仓库具有来自外部馈入火箱的烟道，热烘烤烟草而不使其暴露于烟雾，在烘烤过程中缓慢升高温度。所述方法一般进行约一周并且制造高糖以及中等到高水平烟碱的香烟烟草。大部分香烟并入有烟道烘烤的烟草，产生更温和，更可吸入型烟雾。阳光烘烤的烟草在阳光中无覆盖的干燥。这一方法在土尔其、希腊和其它地中海国家用于生产东方烟草。阳光烘烤的烟草的糖和烟碱低并且用于香烟中。
包括(但不限于)由所述经处理的经修饰烟草植物制备的发烟材料(例如香烟、雪茄、烟斗丝、风味水烟料)、鼻烟、浸渍烟草、香烟代替品(例如烟碱贴片、烟碱漱口水、包装在具有推进剂的高压气体槽中的喷雾剂、烟碱口香糖以及烟碱饮料，以及口含片)的烟草产品也是实施例。用作电子烟、个人气化器或电子烟碱传递系统的电子液体或烟碱溶液的烟草产品也是实施例。
本文所述的经修饰烟草植物产生的烟草产品与对照烟草植物(例如野生型烟草植物对照)产生的烟草产品相比具有降低的TSNA水平。在一些实施例中，经修饰烟草植物制造的烟草产品与对照烟草植物(例如野生型烟草植物对照)制造的烟草产品相比可具有降低的总TSNA水平。在一些实施例中，经修饰烟草植物制造的烟草产品与相同变种并且通过常规技术栽培的烟草或由常规烟草制备的烟草产品相比可具有降低水平的至少一种TSNA，包括(但不限于)N-亚硝基去甲烟碱(NNN)、4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N-亚硝基新烟草碱(NAB)、N-亚硝基新烟碱(NAT)以及其组合。
与来自对照烟草植物的烘烤叶子制造的对照烟草产品相比，从来自经修饰烟草植物的烘烤叶子制造的烟草产品的总TSNA水平可具有至少约5.0％降低、至少约10.0％降低、至少约15.0％降低、至少约20.0％降低、至少约25.0％降低、至少约30.0％降低、至少约35.0％降低、至少约40.0％降低、至少约45.0％降低、至少约50.0％降低、至少约55.0％降低、至少约60.0％降低、至少约65.0％降低、至少约70.0％降低、至少约75.0％降低、至少约80.0％降低、至少约85.0％降低、至少约90.0％、至少约95.0％降低，或至少约99.0％降低。与从来自对照烟草植物的烘烤叶子制造的对照烟草产品相比，从来自经修饰烟草植物的烘烤叶子制造的烟草产品的总TSNA水平可具有约5.0％到约99.0％、约5.0％到约95.0％、约5.0％到约90.0％、约5.0％到约85.0％、约5.0％到约80.0％、约5.0％到约75.0％、约5.0％到约70.0％、约5.0％到约65.0％、约5.0％到约60.0％、约5.0％到约55.0％、约5.0％到约50.0％、约5.0％到约45.0％、约5.0％到约40.0％、约10.0％到约99.0％、约10.0％到约95.0％、约10.0％到约90.0％、约10.0％到约85.0％、约10.0％到约80.0％、约10.0％到约75.0％、约10.0％到约70.0％、约10.0％到约65.0％、约10.0％到约60.0％、约10.0％到约55.0％、约10.0％到约50.0％、约10.0％到约45.0％、约10.0％到约40.0％、约20.0％到约99.0％、约20.0％到约95.0％、约20.0％到约90.0％、约20.0％到约85.0％、约20.0％到约80.0％、约20.0％到约75.0％、约20.0％到约70.0％、约20.0％到约65.0％、约20.0％到约60.0％、约20.0％到约55.0％、约20.0％到约50.0％、约20.0％到约45.0％、约20.0％到约40.0％、约30.0％到约99.0％、约30.0％到约95.0％、约30.0％到约90.0％、约30.0％到约85.0％、约30.0％到约80.0％、约30.0％到约75.0％、约30.0％到约70.0％、约30.0％到约65.0％、约30.0％到约60.0％、约30.0％到约55.0％、约30.0％到约50.0％、约30.0％到约45.0％、约30.0％到约40.0％、约40.0％到约99.0％、约40.0％到约95.0％、约40.0％到约90.0％、约40.0％到约85.0％、约40.0％到约80.0％、约40.0％到约75.0％、约40.0％到约70.0％、约40.0％到约65.0％、约40.0％到约60.0％、约40.0％到约55.0％、约40.0％到约50.0％、约50.0％到约99.0％、约50.0％到约95.0％、约50.0％到约90.0％、约50.0％到约85.0％、约50.0％到约80.0％、约50.0％到约75.0％、约50.0％到约70.0％、约50.0％到约65.0％、约50.0％到约60.0％、约50.0％到约55.0％、约60.0％到约99.0％、约60.0％到约95.0％、约60.0％到约90.0％、约60.0％到约85.0％、约60.0％到约80.0％、约60.0％到约75.0％、约60.0％到约70.0％，或约60.0％到约65.0％降低。
与从来自对照烟草植物的烘烤叶子制造的对照烟草产品相比，从来自经修饰烟草植物的烘烤叶子制造的烟草产品的至少一种TSNA水平可具有至少约5.0％降低、至少约10.0％降低、至少约15.0％降低、至少约20.0％降低、至少约25.0％降低、至少约30.0％降低、至少约35.0％降低、至少约40.0％降低、至少约45.0％降低、至少约50.0％降低、至少约55.0％降低、至少约60.0％降低、至少约65.0％降低、至少约70.0％降低、至少约72.0％降低、至少约72.5％降低、至少约73.0％降低、至少约75.0％降低、至少约80.0％降低、至少约85.0％降低、至少约90.0％、至少约95.0％降低，或至少约99.0％降低，所述至少一种TSNA包括(但不限于)N-亚硝基去甲烟碱(NNN)、4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N-亚硝基新烟草碱(NAB)、N-亚硝基新烟碱(NAT)以及其组合。与从来自对照烟草植物的烘烤叶子制造的对照烟草产品相比，从来自经修饰烟草植物的烘烤叶子制造的烟草产品可具有约5.0％到约99.0％、约5.0％到约95.0％、约5.0％到约90.0％、约5.0％到约85.0％、约5.0％到约80.0％、约5.0％到约75.0％、约5.0％到约70.0％、约5.0％到约65.0％、约5.0％到约60.0％、约5.0％到约55.0％、约5.0％到约50.0％、约5.0％到约45.0％、约5.0％到约40.0％、约10.0％到约99.0％、约10.0％到约95.0％、约10.0％到约90.0％、约10.0％到约85.0％、约10.0％到约80.0％、约10.0％到约75.0％、约10.0％到约70.0％、约10.0％到约65.0％、约10.0％到约60.0％、约10.0％到约55.0％、约10.0％到约50.0％、约10.0％到约45.0％、约10.0％到约40.0％、约20.0％到约99.0％、约20.0％到约95.0％、约20.0％到约90.0％、约20.0％到约85.0％、约20.0％到约80.0％、约20.0％到约75.0％、约20.0％到约70.0％、约20.0％到约65.0％、约20.0％到约60.0％、约20.0％到约55.0％、约20.0％到约50.0％、约20.0％到约45.0％、约20.0％到约40.0％、约30.0％到约99.0％、约30.0％到约95.0％、约30.0％到约90.0％、约30.0％到约85.0％、约30.0％到约80.0％、约30.0％到约75.0％、约30.0％到约70.0％、约30.0％到约65.0％、约30.0％到约60.0％、约30.0％到约55.0％、约30.0％到约50.0％、约30.0％到约45.0％、约30.0％到约40.0％、约40.0％到约99.0％、约40.0％到约95.0％、约40.0％到约90.0％、约40.0％到约85.0％、约40.0％到约80.0％、约40.0％到约75.0％、约40.0％到约70.0％、约40.0％到约65.0％、约40.0％到约60.0％、约40.0％到约55.0％、约40.0％到约50.0％、约50.0％到约99.0％、约50.0％到约95.0％、约50.0％到约90.0％、约50.0％到约85.0％、约50.0％到约80.0％、约50.0％到约75.0％、约50.0％到约70.0％、约50.0％到约65.0％、约50.0％到约60.0％、约50.0％到约55.0％、约60.0％到约99.0％、约60.0％到约95.0％、约60.0％到约90.0％、约60.0％到约85.0％、约60.0％到约80.0％、约60.0％到约75.0％、约60.0％到约70.0％，或约60.0％到约65.0％至少一种TSNA水平，所述至少一种TSNA包括(但不限于)N-亚硝基去甲烟碱(NNN)、4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N-亚硝基新烟草碱(NAB)、N-亚硝基新烟碱(NAT)以及其组合。
7.烟草特异性亚硝胺减少的去筋烟叶烟草和烟草烟雾
一方面，本发明针对一种烟草产品，其中烟熏时从燃烧叶子获得的烟雾(也就是说烟草烟雾)中烟草特异性亚硝胺(TSNA)减少。燃烧后香烟主流烟雾中的TSNA含量依赖于以下因素：(1)去筋烟叶中预先存在的TSNA的量；(2)去筋烟叶中预先存在的TSNA向烟雾中的转移效率；(3)预先存在的TSNA通过热解破坏的程度；以及(4)通过高温合成形成新TSNA的程度。从如上文所述与对照烟草植物(例如野生型烟草植物对照)相比游离硝酸盐水平降低的经修饰烟草植物产生烟草烟雾。
本文所述的经修饰烟草植物制造的去筋烟叶烟草或烟草烟雾与对照烟草植物(例如野生型烟草植物对照)制造的去筋烟叶烟草或烟草烟雾相比可具有降低的TSNA水平。在一些实施例中，经修饰烟草植物制造的去筋烟叶烟草或烟草烟雾与对照烟草植物(例如野生型烟草植物对照)制造的去筋烟叶烟草或烟草烟雾相比可具有降低的总TSNA水平。在一些实施例中，与从相同变种并且通过常规技术栽培的烟草制造的去筋烟叶烟草或烟草烟雾或由常规烟草制备烟草产品相比，经修饰烟草植物制造的去筋烟叶烟草或烟草烟雾可具有降低水平的至少一种TSNA，包括(但不限于)N-亚硝基去甲烟碱(NNN)、4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N-亚硝基新烟草碱(NAB)、N-亚硝基新烟碱(NAT)以及其组合。
与对照烟草植物制造的对照去筋烟叶烟草相比，经修饰烟草植物制造的去筋烟叶烟草的总TSNA水平或至少一种TSNA水平可具有至少约5.0％降低、至少约10.0％降低、至少约15.0％降低、至少约20.0％降低、至少约25.0％降低、至少约30.0％降低、至少约32.0％降低、至少约35.0％降低、至少约40.0％降低、至少约44.0％降低、至少约45.0％降低、至少约50.0％降低、至少约52.0％降低、至少约55.0％降低、至少约60.0％降低、至少约64.0％降低、至少约65.0％降低、至少约70.0％降低、至少约72.0％降低、至少约72.5％降低、至少约73.0％降低、至少约75.0％降低、至少约80.0％降低、至少约85.0％降低、至少约90.0％、至少约95.0％降低或至少约99.0％降低，所述至少一种TSNA包括(但不限于)N-亚硝基去甲烟碱(NNN)、4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N-亚硝基新烟草碱(NAB)、N-亚硝基新烟碱(NAT)以及其组合。
与对照烟草植物制造的对照去筋烟叶烟草相比，烟草产品制造的去筋烟叶烟草可具有约5.0％到约99.0％、约5.0％到约95.0％、约5.0％到约90.0％、约5.0％到约85.0％、约5.0％到约80.0％、约5.0％到约75.0％、约5.0％到约70.0％、约5.0％到约65.0％、约5.0％到约60.0％、约5.0％到约55.0％、约5.0％到约50.0％、约5.0％到约45.0％、约5.0％到约40.0％、约10.0％到约99.0％、约10.0％到约95.0％、约10.0％到约90.0％、约10.0％到约85.0％、约10.0％到约80.0％、约10.0％到约75.0％、约10.0％到约70.0％、约10.0％到约65.0％、约10.0％到约60.0％、约10.0％到约55.0％、约10.0％到约50.0％、约10.0％到约45.0％、约10.0％到约40.0％、约20.0％到约99.0％、约20.0％到约95.0％、约20.0％到约90.0％、约20.0％到约85.0％、约20.0％到约80.0％、约20.0％到约75.0％、约20.0％到约70.0％、约20.0％到约65.0％、约20.0％到约60.0％、约20.0％到约55.0％、约20.0％到约50.0％、约20.0％到约45.0％、约20.0％到约40.0％、约30.0％到约99.0％、约30.0％到约95.0％、约30.0％到约90.0％、约30.0％到约85.0％、约30.0％到约80.0％、约30.0％到约75.0％、约30.0％到约70.0％、约30.0％到约65.0％、约30.0％到约60.0％、约30.0％到约55.0％、约30.0％到约50.0％、约30.0％到约45.0％、约30.0％到约40.0％、约40.0％到约99.0％、约40.0％到约95.0％、约40.0％到约90.0％、约40.0％到约85.0％、约40.0％到约80.0％、约40.0％到约75.0％、约40.0％到约70.0％、约40.0％到约65.0％、约40.0％到约60.0％、约40.0％到约55.0％、约40.0％到约50.0％、约50.0％到约99.0％、约50.0％到约95.0％、约50.0％到约90.0％、约50.0％到约85.0％、约50.0％到约80.0％、约50.0％到约75.0％、约50.0％到约70.0％、约50.0％到约65.0％、约50.0％到约60.0％、约50.0％到约55.0％、约60.0％到约99.0％、约60.0％到约95.0％、约60.0％到约90.0％、约60.0％到约85.0％、约60.0％到约80.0％、约60.0％到约75.0％、约60.0％到约70.0％，或约60.0％到约65.0％总TSNA水平或至少一种TSNA水平降低，所述至少一种TSNA包括(但不限于)N-亚硝基去甲烟碱(NNN)、4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N-亚硝基新烟草碱(NAB)、N-亚硝基新烟碱(NAT)以及其组合。
烟草产品产生的烟草烟雾的总TSNA水平或至少一种TSNA水平可具有至少约5.0％降低、至少约10.0％降低、至少约15.0％降低、至少约20.0％降低、至少约25.0％降低、至少约30.0％降低、至少约32.0％降低、至少约35.0％降低、至少约40.0％降低、至少约44.0％降低、至少约45.0％降低、至少约50.0％降低、至少约52.0％降低、至少约55.0％降低、至少约60.0％降低、至少约64.0％降低、至少约65.0％降低、至少约70.0％降低、至少约72.0％降低、至少约72.5％降低、至少约73.0％降低、至少约75.0％降低、至少约80.0％降低、至少约85.0％降低、至少约90.0％、至少约95.0％降低，或至少约99.0％降低，所述至少一种TSNA包括(但不限于)N-亚硝基去甲烟碱(NNN)、4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N-亚硝基新烟草碱(NAB)、N-亚硝基新烟碱(NAT)以及其组合。
与对照烟草植物制造的对照烟草产品产生的烟草烟雾相比，烟草产品产生的烟草烟雾的总TSNA水平或至少一种TSNA水平可具有约5.0％到约99.0％、约5.0％到约95.0％、约5.0％到约90.0％、约5.0％到约85.0％、约5.0％到约80.0％、约5.0％到约75.0％、约5.0％到约70.0％、约5.0％到约65.0％、约5.0％到约60.0％、约5.0％到约55.0％、约5.0％到约50.0％、约5.0％到约45.0％、约5.0％到约40.0％、约10.0％到约99.0％、约10.0％到约95.0％、约10.0％到约90.0％、约10.0％到约85.0％、约10.0％到约80.0％、约10.0％到约75.0％、约10.0％到约70.0％、约10.0％到约65.0％、约10.0％到约60.0％、约10.0％到约55.0％、约10.0％到约50.0％、约10.0％到约45.0％、约10.0％到约40.0％、约20.0％到约99.0％、约20.0％到约95.0％、约20.0％到约90.0％、约20.0％到约85.0％、约20.0％到约80.0％、约20.0％到约75.0％、约20.0％到约70.0％、约20.0％到约65.0％、约20.0％到约60.0％、约20.0％到约55.0％、约20.0％到约50.0％、约20.0％到约45.0％、约20.0％到约40.0％、约30.0％到约99.0％、约30.0％到约95.0％、约30.0％到约90.0％、约30.0％到约85.0％、约30.0％到约80.0％、约30.0％到约75.0％、约30.0％到约70.0％、约30.0％到约65.0％、约30.0％到约60.0％、约30.0％到约55.0％、约30.0％到约50.0％、约30.0％到约45.0％、约30.0％到约40.0％、约40.0％到约99.0％、约40.0％到约95.0％、约40.0％到约90.0％、约40.0％到约85.0％、约40.0％到约80.0％、约40.0％到约75.0％、约40.0％到约70.0％、约40.0％到约65.0％、约40.0％到约60.0％、约40.0％到约55.0％、约40.0％到约50.0％、约50.0％到约99.0％、约50.0％到约95.0％、约50.0％到约90.0％、约50.0％到约85.0％、约50.0％到约80.0％、约50.0％到约75.0％、约50.0％到约70.0％、约50.0％到约65.0％、约50.0％到约60.0％、约50.0％到约55.0％、约60.0％到约99.0％、约60.0％到约95.0％、约60.0％到约90.0％、约60.0％到约85.0％、约60.0％到约80.0％、约60.0％到约75.0％、约60.0％到约70.0％，或约60.0％到约65.0％降低，所述至少一种TSNA包括(但不限于)N-亚硝基去甲烟碱(NNN)、4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N-亚硝基新烟草碱(NAB)、N-亚硝基新烟碱(NAT)以及其组合。
8.制造TSNA减少的烟草产品的方法
本发明还针对一种制造TSNA水平降低的烟草产品的方法。在一些实施例中，本文所述方法可用于向植物细胞中引入编码去调节的硝酸还原酶多肽的分离多核苷酸；再生经转型细胞产生转基因植物；以及从转基因植物的叶子制造烟草产品。在一些实施例中，本文所述方法可用于向植物细胞中引入靶向内源性硝酸还原酶基因的基因组编辑系统；再生经转型细胞产生转基因植物；以及从转基因植物的叶子制造烟草产品。
在一些实施例中，植物可以从植物、植物组织或植物细胞再生或生长。可以使用从植物细胞或植物组织再生或生长植物的任何适合方法，例如(但不限于)从原生质体组织培养或再生。适当地，植物可以通过在愈伤组织诱导培养基、嫩芽诱导培养基和/或根部诱导培养基上生长经转型植物细胞再生。再生植物大体上具有经修饰烟草植物的全部形态和生理学特征。
9.减少烟草产品中烟草特异性亚硝胺的方法
一方面，本发明针对制造与未经修饰烟草植物中TSNA水平相比TSNA水平降低的烟草产品的方法。所述方法包含修饰烟草植物以包括包含编码去调节的硝酸还原酶的序列、由其组成或基本上由其组成的多核苷酸，所述去调节的硝酸还原酶也就是由(i)中所述的多核苷酸编码的多肽；包含编码去调节的硝酸还原酶的序列、由其组成或基本上由其组成的多肽；包含(i)中所述的多核苷酸的构筑体、载体或表达载体，且其中所述硝酸还原酶的表达或活性与对照未经修饰的烟草植物相比去调节；从所述经修饰的烟草植物采摘烟草叶子；以及从所述采摘的叶子制造烟草产品。
10.减少烟草产品的烟雾中烟草特异性亚硝胺的方法
一方面，本发明针对制造烟草产品的方法，其中燃烧经修饰烟草植物的叶子获得的烟雾中测量到的TSNA水平与燃烧未经修饰烟草植物获得的烟雾中测量到的TSNA水平相比降低。所述方法包含修饰烟草植物以包括包含编码去调节的硝酸还原酶的序列、由其组成或基本上由其组成的多核苷酸，所述去调节的硝酸还原酶也就是由(i)中所述的多核苷酸编码的多肽；包含编码去调节的硝酸还原酶的序列、由其组成或基本上由其组成的多肽；包含(i)中所述的多核苷酸的构筑体、载体或表达载体，且其中所述硝酸还原酶的表达或活性与对照未经修饰的烟草植物相比去调节；从所述经修饰的烟草植物采摘烟草叶子；以及从所述采摘的叶子制造烟草产品。
所属领域的技术人员容易显而易知，本文所述的本发明方法的其它适合修正和调适容易获得并且明显，并且可以使用不脱离本发明范畴或本文所披露的方面和实施例的适合等效物进行。本发明现详细描述，参考以下实例将更明确理解本发明，所述实例仅打算说明本发明的一些方面和实施例，并且不应视为是本发明范畴的限制。本文提到的全部期刊参考文件、美国专利和公开案的披露内容以本文引用的方式并入本文中。
本发明的多个方面通过以下非限制性实例说明。
实例
实例1
材料和方法
质粒构筑体.硝酸盐同化(N-同化)路径中涉及的以下五个基因使用聚合酶链反应(PCR)克隆：“S523D-NR”-烟草Nia2cDNA(沃舍雷(Vaucheret)等人.植物分子生物学(PlantMol.Biol.)12:597-200(1989))，其含有使用定点突变诱发在密码子523处引入的Ser到Asp取代突变(利略(Lillo)等人.植物期刊(Plant J.)35:566-573(2003))；“tr-NR”-Nia2cDNA的N端截短，其中通过定点突变诱发去除密码子2-56(拿索姆(Nussaume)等人.植物细胞(Plant Cell)7:611-621(1995))；“GS1”-烟草Gln1-3基因的全长cDNA(杜布瓦(Dubois)等人.植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)31:803-817(1996))；“GOGAT”-阿拉伯芥的GLT1基因的全长cDNA(兰森(Lancien)等人.植物期刊(Plant J.)29:347-358(2002))；以及“ICDH”-烟草异柠檬酸脱氢酶的全长cDNA(GenBank寄存编号77944)。
为了表达烟草中的多种构筑体，各cDNA通过用各别N-同化路径cDNA置换这一载体内的GUS报导基因独立地插入到双运载体pBI121(陈(Chen)等人.分子育种(Mol.Breed.)11:287-293(2003))。这使构筑体处于CaMV的强组成性35S启动子的转录控制下。植物表达载体pBI121含有能够使用抗生素卡那霉素(kanamycin)选择经转型细胞的nptII基因。对于含有CYP82E4(E4)启动子的构筑体，在紧靠CYP82E4开始密码子的上游切除含有35S启动子的载体的约850bp区域且置换成2.2kb区域(查克拉巴蒂(Chakrabarti)等人.植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)66:415-427(2008))。所得植物表达载体引入到根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EHA105中并且在补充有卡那霉素(50mg/L)和利福平(rifampicin)(20mg/L)的YEP培养基(1％细菌-蛋白胨、1％细菌-酵母提取物和0.5％NaCl)上生长。
植物材料.白肋育种品系DH98-325-6#775独立地用35S:tr-NR、35S:S523D-NR、35S:GS1、35S:GOGAT、35S:ICDH、E4:tr-NR、E4:S523D-NR以及E4:GOGAT构筑体转型。使用半定量RT-PCR分析针对各构筑体的几个独立转基因品系，鉴别相对于烟草肌动蛋白基因展现最高转基因表达水平的个别植物。使用绿色叶子组织进行含有构筑体的植物在35S CaMV启动子的转录控制下的表达分析。对于含有E4启动子的植物，对剥落并且用益收生长素处理的叶子进行表达分析，如查克拉巴蒂等人,(2008)所述。对于各高表达T0个体，若干T1植物生长并且使用诊断引物针对同源转基因进行基因分型，区分继承转基因与空分离体的子代。来自针对具有指定转基因分析呈阳性的各T0植物的许多T1子代再次通过半定量RT-PCR分析，测试高表达表型是否精确传达给下一代。使用显示均匀传达高表达表型的品系制造T2代子代。
白肋栽培品种TN90e4e5用35S:S523D-NR和E4:S523D-NR构筑体共转型。组合等量的各自含有S523D-NR构筑体中的一个的两种土壤杆菌培养物并且用于转型TN90e4e5的叶盘片。进行基于PCR的分子基因分型来区分各T0个体内转基因的互补序列。对35S或E4启动子区域具有特异性的引物与对应于S523D-NR的引物配对以区分两个构筑体。通过用E4:GUS构筑体转型TN90e4e5来产生载体对照植物(查克拉巴蒂等人,2008)。通过RT-PCR使用Mx3000P QPCR仪器根据制造商(安捷伦技术(Agilent Technologies))方案测定各T0植物的转基因表达水平。使用对应于S523D-NR的引物的RT-PCR数据根据延伸因子1α对照基因的表达进行标准化。
经控制的环境室实验的生长条件.来自品系35S:tr-NR、35S:S523D-NR、35S:GS1、35S:GOGAT、35S:ICDH和WT对照的T2转基因烟草植物在北卡罗莱纳州立大学人工气候设施(North Carolina State University Phytotron facility)的经控制的环境室中生长。种子在2:1泥炭-砂石混合物上发芽。四周大幼苗移植到单独单元并且使用12小时26℃白天/12小时22℃夜晚方案生长。通过1:1比率的金属卤化物和高压钠灯和白炽灯提供1500μmolm2s-1的光合成光子通量密度。植物每天用去离子水浇水一次，并且每天用由以下组成的营养物溶液浇水一次：106.23mg/L氮、10.41mg/L磷、111.03mg/L钾、54.4mg/L钙、12.4mg/L镁、5mg/L铁、13.13mg/L硫、0.113mg/L锰、0.24mg/L硼、0.013mg/L锌、0.005mg/L铜、0.00003mg/L钴、0.05mg/L钼以及11.04mg/L钠。
栽植约两个月之后，每种基因型18株植物移植到填充有蒸汽灭菌的河砂的6”盆中。小心选择具有类似尺寸的个体。每种基因型六株植物暴露于硝酸盐施肥处理中的每一个。植物死亡和/或观察到异常发育不良生长表型导致损失四个35S:ICDH、两个35S:S523D-NR以及一个35S:GS1植物。
移植到6”盆之后的前七天期间，全部植物用含有过量硝酸盐(19mM NO3 -)的营养物溶液浇水，使其调整适应移植冲击。19mM硝酸盐营养物溶液由以下组成：5mM Ca(NO3)2、2mMMg(NO3)2、5mM KNO3、1mM KH2PO4、0.5mM K2SO4、19μM H3BO3、3.7μM MnCl2、0.3μM ZnSO4、0.13μM CuSO4、0.05μM Na2MoO4以及10.0μM 330Fe-西奎斯特林(Sequestrene)。七天调整时段之后，来自各基因型群组的植物等分成三组并且在随后的16天时程用极低硝酸盐(0.2mMNO3 -)、中等硝酸盐(8mM NO3 -)或高N(19mM NO3 -)营养物溶液浇水。为了保持离子和渗透平衡，低和中等溶液根据需要用SO4 2-代替NO3 -。因此，低(0.2mM NO3 -)N营养物由以下组成：0.1mM Ca(NO3)2、3mM K2SO4、2mM MgSO4以及4.9mM CaSO4·2H2O(不具有Mg(NO3)2或KNO3)，并且中等(8mM NO3 -)N营养物含有4mM Ca(NO3)2、3mM K2SO4、2mM MgSO4以及1mM CaSO4·2H2O(不具有Mg(NO3)2或KNO3)。
16天实验时程期间，各植物每天浇水三次：早晨使用200mL适当营养物溶液，中午使用200mL DI水，并且下午使用1000mL DI水浸出营养物，随后200mL适当营养物溶液。腔室条件是26℃/22℃白天/晚上，12小时/12小时白天/晚上时间段。
叶绿素分析法.处理时段结束时，根据方案交换(倪(Ni)等人.(2009)doi:10.1038/nprot.2009.12)公布的方案使用640分光光度计(BeckmanTMCoulter)进行叶绿素分析。根据下式(植物生理学报(Arnon Plant Physiol)24:1-15(1949))计算叶绿素a(Ca)、叶绿素b(Cb)和叶绿素a+b(Ca+b)浓度，其中V是提取体积(mL)并且W是新鲜叶子重量(g)。
Ca(mg/g)＝(12.7×A663-2.69×A645)×V/(1000×W)
Cb(mg/g)＝(22.9×A645-4.68×A663)×V/(1000×W)
Ca+b(mg/g)＝(8.02×A663+20.20×A645)×V/(1000×W)
鲜重分析和样品制备.16天处理时段之后，通过在基部切割各植物并且记录其鲜重来进行总植物生物质测量。紧接各样品称量之后，从各植物的类似位置切除单片叶子(从顶部起第4片或第5片叶子)，去除中脉，并且剩余叶片在液氮中冷冻，并且在-80℃下储存用于氨基酸分析。还从与叶绿素分析法类似的各植物的位置收集小叶子样品(约300mg)。各植物上其余的叶子随后从主干剥离，置于纸袋中，并且在干燥烘箱中在65℃下培育两天。干燥的叶子样品随后研磨成精细粉末用于硝酸盐和氨分析。
硝酸盐、亚硝酸盐和氨分析.对于生长室实验，从各样品称量约100mg干燥叶子粉末，并且使用10mL去离子水提取。经#4WhatmanTM滤纸过滤之后，在北卡罗莱纳州立大学的环境和农业测试服务(EATS)实验室使用多通道自动分析器分析上清液的硝酸盐和铵浓度。根据Lachat工具手册中的方案计算硝酸盐和铵量。
对于田间生长的样品和温室生长的T0材料，在肯塔基大学烟草分析实验室(University of Kentucky Tobacco Analytical Laboratory)分析经研磨的叶组织。根据克拉奇菲尔德(Crutchfield)和格罗夫(Grove)(美国分析化学家组织(J.AOACInternational)94:1898-1905(2011))中所概述的方案测定硝酸盐定量。使用克拉奇菲尔德和伯顿(Burton)(分析快报(Anal.Letters)22:555-571(1989))所述的方法对经研磨的空气烘烤的田间样品进行亚硝酸盐分析。
氨基酸分析.已经在液氮中冷冻的来自生长室生长的植物的叶子样品通过在冷冻干燥器中放置两天来完全干燥。干燥的样品接着在液氮中使用研钵和研杵研磨成精细粉末。称量约100mg经干燥的叶子粉末并且提供给北卡罗莱纳州立大学的生物制造培训和教育中心(Biomanufacturing Training and Education Center at North Carolina StateUniversity)的分析实验室进行氨基酸分析测量。简单来说，各样品用1.0mL 80％MeOH-20％H2O提取并且涡动，随后在20,000x g下离心。澄清清液层的200-μL等分试样在-80℃下冷却约2小时，接着冻干隔夜。将干燥材料溶解于200μL硼酸盐缓冲液(pH 8.0)中，接着再使用硼酸盐缓冲液1:10倍稀释。通过向70μL硼酸盐缓冲液和20μL衍生化试剂添加10μL提取样品对样品进行衍生化。小瓶在55℃下加热10分钟，冷却到室温并且涡动混合含量。衍生样品使用超高效液相色谱分析。
空气烘烤叶子的生物碱和TSNA分析.烘烤叶子样品中的烟碱、去甲烟碱、新烟草碱以及毒藜碱水平使用派金-埃尔默自动系统XL气相色谱(Perkin-Elmer Autosystem XLGas Chromatography)根据上文确定的方案(杰克(Jack)等人,近期高级烟草科学(Rec.Adv.Tob.Sci.)33:58-79(2007))定量。总生物碱作为烟碱、去甲烟碱、新烟草碱和毒藜碱的总和计算。根据摩尔根(Morgan)等人.(Beit.Tabakforschung 23:192-203(2004))的“方法1”进行NNN、NNK、NAT和NAB的定量。总TSNA代表NNN、NNK、NAT和NAB的总和。
去筋烟叶烟草和烟雾中的TSNA提取和分析.去筋烟叶烟草的样品用100mM含有氘化内标的乙酸铵溶液提取以实现定量。使用PVDF针筒过滤器(0.45μm孔径)过滤提取物并且通过与电喷雾电离(ESI)耦联的液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)分析。使用D4-N-亚硝基去甲烟碱(D4-NNN)作为NNN的内标，而D4-4-(甲基-亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(D4-NNK)用作NNK、NAT和NAB的内标。
由去筋烟叶制成的测试香烟经调节并且根据第T-115号加拿大健康方法(HealthCanada Method No.T-115)规定的吸烟程序烟熏。主流烟雾收集到剑桥过滤器(Cambridgefilter)上并且用100mM含有D4-NNN和D4-NNK标准品的乙酸铵提取，随后使用0.45μm孔PVDF针筒过滤器过滤。乙酸铵提取物通过与ESI耦联的LC-MS/MS分析并且根据D4-NNN和D4-NNK标准品定量。
统计分析.使用SAS 9.1的PROC GLM程序(北卡罗来纳州卡里的SAS研究所(SASInstitute,Cary,NC))进行方差分析并且计算所包括的转基因和WT品系中的每一个的平均值。因为异质性方差，进行自然对数数据转换以趋近针对生长室实验收集的鲜重、硝酸盐和氨数据的正态分布。全部其它数据集使用非转换值。根据Ryan-Einot-Gabriel-Welsch(REGWQ)多范围测试形成显著水平。
实例2
白肋烟草中N-同化基因的过表达
GS1、NADH-GOGAT、ICDH或去调节NR酶(56氨基酸截短突变或S523D点突变)在白肋烟草植物中过表达以测定这些N-同化路径基因中任一个的生态表达是否1)补偿白肋烟草的叶绿素缺乏和/或N-施肥相关生长缺陷特征；和/或2)降低叶子中积聚的游离硝酸盐水平并且帮助这类烟草植物的特征的高硝酸盐积聚表型逆转。将植物表达载体pBI121中的GUS报导基因置换成N-同化路径基因使这些构筑体中的每一个处于花椰菜嵌纹病毒(CaMV)的强组成性35S启动子和根癌土壤杆菌的胭脂碱合成酶基因的3’nos终止序列的调节控制下(Chen等人.分子育种(Mol.Breed.)11:287-293(2003))。图3A-3B示出了所用构筑体的简图。
白肋烟草品系DH98-325-6#775分别经五种构筑体中的每一个使用标准土壤杆菌介导的转型方案转型。DH98-325-6#775代表CYP83E4中含有基因敲除突变的甲磺酸乙酯诱变的白肋种群的选择，CYP83E4是烟草的主要烟碱去甲基化酶基因(路易斯(Lewis)等人.植物化学(Phytochem.)71:1988-1998(2010))。白肋烟草容易发生称为烟碱转化的现象，其中不活化CYP82E4基因通常变得自发活化，产生积聚格外高水平的TSNA前驱体去甲烟碱的高比例子代。DH98-325-6#775中的CYP82E4基因敲除突变防止烟碱转化，并且选择这一品系来避免解释所产生的多种转基因材料之间的TSNA数据时可能出现的并发情况，这可能成为是否使用标准白肋栽培品种的因素(由于使用标准白肋背景已经预期观测到的去甲烟碱水平的极大变化)。
为了能够选择高水平表达各别转基因的植物，通过半定量RT-PCR分析针对各构筑体的至少10个独立T0植物。从呈现高水平转基因积聚的各构筑体的三个T0品系采摘种子。因为例如转基因沉默的现象，或相同T0植物内弱表达转基因和高表达转基因可能在独立基因座整合的情况，一些显示高转基因表达的T0品系可能产生分离高转基因表达和低转基因表达的子代。因此，还对所选各高表达T0植物的许多子代进行半定量RT-PCR以测试遗传转基因的T1子代是否继续高水平表达。随后研究中所用的全部植物都是从T1种子批次获得的T2植物，其中测得转基因阳性(通过分子基因分型)的全部子代继续高水平表达转基因。不再具有转基因的T1分离体用作WT(空分离体)对照的来源。
实例3
经控制的生长室环境中转基因植物的分析
为了检查在硝酸盐可用性的变化条件下生长的白肋植物中N-同化路径基因过表达的作用，在经控制的环境生长室中生长三组植物，包含各转基因基因型(35S:tr-NR、35S:S523D-NR、35S:GS1、35S:GOGAT以及35S:ICDH)和WT对照的的六个末成熟T2植物。每组植物用含有0.2mM、8mM或19mM硝酸盐的营养物溶液浇水16天。然而，在进行实验期间，少数植物死亡或展现发育不良的生长并且因此没有包括在分析中。16天处理时段结束时，暴露于不同水平的硝酸盐的植物组织间观测到显著差异。正如所料，用含有0.2mM硝酸盐的培养基浇水的烟草植物有褪绿病并且展现最少量的生长，而提供19mM硝酸盐的植物最大并且呈现最深绿色。然而，任何指定N-施肥处理下的含有任何特异性转基因的植物的整体生长表型与WT对照没有观测到明显差异。
在处理时段结束时进行全部植物的空中部分的鲜重测量，并且显示于表1和图4中。图4中所示的值表示各基因型的4-6株植物的未转型平均值±标准误差。对经转型数据(自然对数转型)进行统计测试。对于各硝酸盐处理水平，共用同一字母的平均值彼此没有显著不同(P<0.5)。举例来说，字母“a”仅应用于19mM硝酸盐处理的植物，字母“b”和“c”仅应用于用8mM硝酸盐培养基浇水的植物，并且“d”和“e”仅应用于0.2mM硝酸盐处理的植物。表1示出了在三种N-施肥条件下生长的表达N-同化路径基因的植物的平均鲜重、叶绿素、硝酸盐和氨测量值，其中“Ca”是叶绿素a并且“Cb”是叶绿素b。对于8mM和19mM硝酸盐处理的植物，多种转基因基因型与WT对照之间没有观测到显著差异。然而，在极低硝酸盐处理下，表达35S:tr-NR构筑体的植物的鲜重适当地高于WT，差值视为统计学上显著的。
表1
白肋烟草植物显示叶绿素缺乏，并且与其它烟草类型明确区别在于其较淡的绿色外观。如果过表达的转基因中的任一个能够补偿表征白肋类型的yb1和/或yb2突变，那么可能预期发现这些植物的叶绿素含量增加。尽管仅凭目测没有观测到WT对照和所测试的多种转基因基因型之间的显著差异，在存在更细微差异的情况下进行叶绿素a、b和a+b含量的直接测量(表1)。与鲜重测量类似，叶绿素含量存在与硝酸盐施肥增加正相关的极强处理作用。然而，三种硝酸盐处理的任一个中都没有观测到任何转基因基因型和WT对照之间叶绿素浓度的显著差异(图5A-5C)。图5A-5C中所示的值表示各基因型的4-6株植物的平均值±标准误差。对于各硝酸盐处理水平，共用同一字母的平均值彼此没有显著不同(P<0.5)。
各硝酸盐施肥水平下的多种基因型的平均硝酸盐和氨浓度也显示于表1中。0.2mM硝酸盐处理水平下，全部植物都展现格外低的硝酸盐积聚，并且任何转基因基因型与WT对照之间没有观测到显著差异(图6)。图6A示出了使用19mM NO3 -和8mM NO3 -处理生长的植物的数据；0.2mM NO3 -处理的结果显示于图6B中。所示值代表各基因型的4-6株植物的非转型平均值±标准误差。对经转型数据(自然对数转型)进行统计测试。对于各硝酸盐处理水平，共用同一字母的平均值没有显著不同(P<0.5)。
在8mM和19mM硝酸盐处理下，35S:tr-NR植物中测量的硝酸盐平均浓度分别仅为WT对照中观测到的37％和60％。当用8mM或19mM硝酸盐施肥时，表达35S:S523D-NR构筑体的植物叶子中测量的硝酸盐显著降低。平均起来，当在8mM硝酸盐施肥方案下浇水时，含有这一去调节NR构筑体的植物仅积聚对照植物中存在的约5％的量的硝酸盐。使用19mM N-施肥处理，WT植物平均约14,900ppm硝酸盐，相比于35S:S523D-NR植物中观测到的仅约2000ppm，转基因个体中有近8倍降低(图6A)。
这一实验中分析的植物的氨浓度显示于图7中。图7中所示的值表示各基因型的4-6株植物的未转型平均值±标准误差。对经转型数据(自然对数转型)进行统计测试。对于各硝酸盐处理水平，共用同一字母的平均值彼此没有显著不同(P<0.5)。在19mM硝酸盐处理水平下，尽管氨水平没有随着硝酸盐极大变化，但35S:S523D-NR植物积聚对照植物的约两倍的这一N-同化路径代谢物。然而，在低和中等N处理水平下，指定转基因基因型的平均氨含量与WT对照或任何其它转基因基因型不存在显著不同。
因为N-同化路径直接馈入到氨基酸生物合成，所以达到转基因植物中游离氨基酸的浓度可能改变的程度。与转基因基因型无关，用0.2mM硝酸盐培养基(图6和7)施肥的植物中仅观测到硝酸盐和铵水平的最小差异；因此，仅对用8mM和19mM硝酸盐处理的植物进行游离氨基酸含量的定量。表2示出了在中等(8mM)和高(19mM)硝酸盐条件下生长的各转基因和对照基因型的全部20种氨基酸的平均浓度(μmol/g干重)。
表2
表2续
用19mM硝酸盐处理的含有35S:S523D-NR构筑体的植物中总游离氨基酸大大提高(图8)。图8中所示的值表示各基因型的4-6株植物的平均值±标准误差。对于各硝酸盐处理水平，共用同一字母的平均值彼此没有显著不同(P<0.5)。表达这一构筑体的烟草植物积聚的总游离氨基酸比WT植物平均高3.7倍。尽管在高N处理下35S:S523D-NR组中的每一种氨基酸实际上比WT中的高，但Gln、Asn和Arg的水平特定升高，分别显示8.5倍、5.5倍和5.3倍增加(图9)。图9中所示的值表示各基因型的4-6株植物的平均值±标准误差。对于各硝酸盐处理水平，共用同一字母的平均值彼此没有显著不同(P<0.5)。当使用8mM硝酸盐营养物溶液生长时，35S:S523D-NR植物中的Gln和Asn水平也显著高于对照(分别2和3.4倍)，但两个品系之间的总氨基酸浓度几乎相同(图8)，由于35S:S523D-NR植物中的几种其它氨基酸的水平与WT中相比平均值降低(表2)。整体来说，表达另一去调节NR基因构筑体(35S:tr-NR)的植物的氨基酸特征与WT植物类似。
谷氨酰胺为GS酶的反应产物。因此，有趣的是过表达GS基因的植物中Gln水平不增加(图9B)。这与alfalfa GS cDNA在烟草植物中过表达并且用高硝酸盐溶液施肥时观测到的Gln 2倍增加形成对比。同样，过表达编码直接负责其合成的GOGAT酶的基因的转基因植物中Glu水平没有显著增加(图9)。在8mM硝酸盐施肥水平下，过表达ICDH的植物与其它基因型中的每一个相比展现较低的总氨基酸(图8)，以及具体来说较低量的Glu(图9D)。
叶绿素缺乏代表白肋烟草的一个标志，并且是具体来说归因于yb1和yb2基因座的性状。不管是在生长室、温室还是田间环境中生长，全部植物展示这一烟草类型特有的相同淡绿色表型。在生长室实验中，直接测量WT和转基因品系的叶绿素含量并且这些材料中的任一个中都没有观测到差异。这些结果表明N-同化路径相关基因(tr-NR、S523D-NR、GS1、GOGAT和ICDH)的过表达不会补充或用其它方式功能上绕过界定白肋表型的yb1和/或yb2突变体基因座。
尽管没有发现所测试的N-同化路径转基因中的任一个的过表达可以克服N-施肥相关生长缺陷或作为白肋烟草特征叶的绿素缺乏，但是去调节NR活性的过表达在降低游离硝酸盐水平时明确有效。
实例4
在田间条件下生长的转基因植物的分析
当在中等或高N-施肥条件下生长时，去调节S523D-NR构筑体的组成性表达介导叶子中游离硝酸盐积聚的显著降低。看起来去调节tr-NR构筑体也可以赋予硝酸盐含量的适度减少。为了测定在田间环境生长时35S:S523D-NR和35S:tr-NR构筑体对叶子硝酸盐浓度的作用，生长室实验中所用的来自相同种子批次的T2植物在浮盘上发芽并且移植到田间。因为叶子内关于TSNA形成的过量游离硝酸盐的后果主要在叶子衰老和烘烤期间显现，所以去调节NR构筑体置于强老化特异性启动子的转录控制下。控制CYP82E4烟碱去甲基化酶基因的启动子具体来说介导老化和空气烘烤期间的高水平基因表达。将S532D-NR和tr-NRcDNA置于CYP82E4(E4)启动子控制下的构筑体通过最初将来自植物表达载体pBI121的CaMV35S启动子置换成紧靠转译Met开始密码子的CYP82E4引发上游的2.2kb区域，随后在E4启动子下游插入NR cDNA。作为不影响叶子硝酸盐含量的代表N-同化路径基因的过表达的对照，田间实验中还包括35S:GOGAT和E4:GOGAT转基因植物。这些载体的图式示于图3A-3B中。田间测试的具有E4启动子驱动的构筑体的特异性T2群体来自T1植物的种子批次，所述T1植物在用老化诱导化合物益收生长素处理时显示高水平表达转基因(查克拉巴蒂等人,2008)。与生长室研究类似，来自T1植物的不再具有转基因的空分离体用作田间实验的WT对照的来源。
所测试的七个基因型(WT、35S:S523D-NR、E4:S523D-NR、35S:tr-NR、E4:tr-NR、35S:GOGAT以及E4:GOGAT)中的每一个的约100株末成熟植物等分并且在北卡罗莱纳州使用随机化完全模块设计移植到两个田间场所。植物在北卡罗来纳州克莱顿市或北卡罗来纳州落基山市附近的田间研究工作站生长。因为移植之后大量植物死亡，所以生长到成熟期的植物总数在每种基因型60到79的范围内。烟草植物根据白肋烟草的标准行业实践生长、拔顶和采摘。在成熟期，采摘植物的茎并且距离顶部约三分之一的茎位置从各植物剥离两片叶子，去除中脉并且将剩余的叶片组织置于纸袋中。接着将植物悬挂在棒上并且转移到防雨结构进行空气烘烤。纸袋中的叶子材料置于干燥烘箱中并且在65℃下完全干燥。研磨干燥叶子样品并且分析硝酸盐含量。
硝酸盐同化中涉及的表达不同基因的T2植物中的平均硝酸盐浓度显示于表3中。如表3中所示，两个田间场所(一个靠近北卡罗来纳州克莱顿，另一个靠近北卡罗来纳州落基山)之间所分析的不同基因型观测到的平均硝酸盐水平非常类似。这一数据集中的最显著观测是35S:S523D-NR植物的叶子中硝酸盐大大减少。平均起来，在克莱顿和落基山场所，含有35S:S523D-NR构筑体的烟草植物分别仅呈现WT对照中观测到的硝酸盐的量的4.2％和5.6％。
表3
平均ppm NO3 - 平均标准误差
克莱顿
WT(n＝40) 1510 116
35S:S523D-NR(n＝31) 63 7
E4:S523D-NR(n＝32) 1107 102
35S:tr-NR(n＝37) 988 103
E4:tr-NR(n＝31) 1124 96
35S:GOGAT(n＝36) 1277 119
E4:GOGAT(n＝31) 1426 113
落基山
WT(n＝38) 1240 121
35S:S523D-NR(n＝27) 69 10
E4:S523D-NR(n＝43) 1135 96
35S:tr-NR(n＝31) 838 95
E4:tr-NR(n＝43) 1084 88
35S:GOGAT(n＝43) 1247 110
E4:GOGAT(n＝32) 1292 121
两个场所的组合数据集的统计分析显示于表4中。表4展示成熟期的T2代转基因白肋植物的叶子中硝酸盐相关基因构筑体对NO3 -(N)含量(ppm干重)的作用。35S:S523D-NR组积聚的硝酸盐显著少于任何其它基因型。尽管不如减少一样显著，但是含有去调节的硝酸还原酶cDNA的其它植物基因型(35S:tr-NR、E4:tr-NR和E4:S532D-NR)中游离硝酸盐水平积聚的硝酸盐也比WT组少，但仅含有35S:tr-NR构筑体的植物视为与GOGAT表达对照基因型显著不同。不认为E4:GOGAT和35S:GOGAT组的硝酸盐含量与WT显著不同。
表4
使转移到烘烤仓库的茎采摘的植物空气烘烤约10周。在这一时段结束时，从上部第三茎位置采摘额外两片叶子，剥离中脉并且置于纸袋中。尽管材料在烘烤后采摘时非常干燥，在室温下将袋子置于干燥器中，使用鼓风机确保完全干燥(由于高温对TSNA形成的可能影响而没有加热)。研磨干燥样品并且进行硝酸盐分析。表5示出了空气烘烤八周之后硝酸盐相关基因构筑体对T2代转基因白肋植物的叶子中NO3 -N含量(ppm干重)的作用。将表4的数据与表5提出的数据进行比较，揭露全部基因型的叶子的叶片中的硝酸盐含量在空气烘烤之后高约2倍。尽管机制未知，在白肋烟草空气烘烤之后通常观测到叶子硝酸盐浓度提高。与使用成熟未烘烤组织获得的结果类似，35S:S523D-NR基因型植物积聚的游离硝酸盐远远低于任何其它基因型基团，并且仅为WT植物中观测到的约4％(表5)。含有去调节NR构筑体的其它基因型的经烘烤叶子样品的硝酸盐含量与WT植物相比还继续展现统计学上显著的降低，在WT组中观测到的硝酸盐浓度的70％到77％范围内。
表5
尽管植物中的亚硝酸盐水平通常非常低，但是可能由于内源性亚硝酸还原酶活性的效率，保持由组成性表达的S523D-NR酶介导的细胞硝酸盐的显著代谢可能导致其最终产物亚硝酸盐的水平增加。由于亚硝酸盐最终是相信在空气烘烤期间负责TSNA形成的化合物，因此重要的是导致硝酸盐池减少的遗传修饰不会导致经烘烤的叶子中亚硝酸盐水平增加。为了测定任何转基因构筑体的过表达是否与叶子亚硝酸盐含量的改变有关，对所收集的全部空气烘烤的叶子样品进行亚硝酸盐分析。整体来说，多种基因型中的亚硝酸盐水平类似(表6)。表6示出了空气烘烤八周之后硝酸盐相关基因构筑体对T2代转基因白肋植物的叶子中NO2 -N含量(ppm干重)的作用。
表6
尽管35S:S523D-NR组的数值平均值为全部基因型中最低的，但是不认为与WT对照相比统计学上显著(尽管其看起来比E4:GOGAT品系显著低)。这些结果显示去调节的S523D-NR构筑体的组成性表达不会导致亚硝酸盐水平增加；实际上这一转基因可能介导经烘烤的叶子的亚硝酸盐浓度适当降低。
为了测试叶子硝酸盐含量减少是否将影响TSNA或生物碱积聚，选择WT、35S:S523D-NR和35S:GOGAT基因型的上述经烘烤的叶子样品的子单元进行进一步分析。对于各基因型，总共选择33个叶子样品，在两个场所之间平均分布(16个来自克莱顿，17个来自落基山)并且从展现全部三种基因型的个别行选择(也就是说指定的所选行内的三种基因型中的任一个都没有死亡的植物)。TSNA和生物碱分析的结果显示于表7中。表7示出了WT、35S:GOGAT和35S:S523D-NR植物的经烘烤叶子中的TSNA和生物碱含量。累积起来，35S:S523D-NR基因型中TSNA含量与WT相比的总减少是77.5％。任何个别TSNA之间或WT植物对比35S:GOGAT植物的总TSNA含量没有观测到统计学上显著的差异。这些结果明确表明S523D-NR构筑体的组成性表达导致空气烘烤的烟草叶的TSNA含量大体降低，这是一种最可能由其显著降低叶子内游离硝酸盐水平的能力造成的现象。
表7
三种基因型中，总生物碱含量或所分析的任何个别生物碱(烟碱、去甲烟碱、毒藜碱和新烟草碱)中都没有观测到显著差异。相比之下，含有低硝酸盐的35S:S523D-NR叶子材料中T可见SNA含量的重大差异。35S:S523D-NR组中观测到的NNN水平与WT对照相比降低90％。35S:S523D-NR与WT植物相比，N-亚硝基新烟碱(NAT)和NNK积聚分别降低72.5％和55％。而N-亚硝基新烟草碱(NAB)通常是经烘烤的烟草叶中最不丰富的TSNA，在35S:S523D-NR植物中，几乎检测不到这一化合物的存在(表7)。
35S:S523D-NR构筑体介导的低硝酸盐表型与经烘烤的叶子中的TSNA含量的大大降低有关，这与空气烘烤的烟草中TSNA形成的模型相符，所述模型假定叶子表面微生物利用叶子硝酸盐池产生直接造成烟草生物碱亚硝化的亚硝酸盐。尽管烟草植物中硝酸盐、生物碱和TSNA的浓度根据叶子的茎位置显著变化，但35S:S523D-NR构筑体有效调节整个植物中的硝酸盐和TSNA降低，因为在选择上部位置叶子和由植物的剩余部分制造的去筋烟叶烟草的样品中都观测到这些化合物的大大降低，大量偏向下部茎叶子。相比之下，因为35S:S523D-NR介导的硝酸盐减少，烟碱水平没有显著改变。
实例5
去筋烟叶和用低硝酸盐烟草植物制成的香烟产生的烟雾的分析
为了测定降低的硝酸盐表型对主流烟雾中TSNA的占有率的影响，由35S:S523-NR植物和WT对照的剩余经烘烤的叶子材料的汇聚样品制成香烟。上一章节中所述的前两个叶子样品取自上部第三原料位置；因此，用于制备去筋烟叶的剩余叶子组织大量偏向来自植物的较低茎位置的叶子。因为硝酸盐、烟碱和TSNA的相对浓度根据茎位置不同，所以重要的是独立地测定去筋烟叶中呈现的这些化合物的水平，精确解释相应烟雾数据。
如图10中所示，由WT叶片制成的去筋烟叶中的硝酸盐浓度平均为15,800ppm。相比之下，在由35S:S523D-NR植物产生的去筋烟叶中，硝酸盐水平平均为930ppm，大约是WT填料中观测到的值的约5.9％，并且与经烘烤的上部茎叶子中这两个基因型之间观测到的比率相符(表5)。WT和35S:S523D-NR植物的去筋烟叶中测量到的与上部叶子数相比整体较高的硝酸盐浓度(比较表5和图10)与烟草的底部叶子中的硝酸盐水平大大高于顶部叶子中存在的含量的先前观测相符。在图10中，各基因型的全部植物材料根据位置汇聚(针对35S:S523D-NR各自来自克莱顿和落基山的约30株植物；针对WT的各自来自两个场所的约40株植物)。所示数据代表两个场所的平均值和标准误差。烟草叶中的烟碱浓度展现相对趋势，上部叶子显示比下部叶子高的浓度，但差异的量值不如硝酸盐观测到的极端。与各别上部叶子中的2.5％和2.4％(表7)相比，WT和35S:S523D-NR植物的去筋烟叶中的烟碱含量分别为平均1.6％和1.7％干重(图10)。在任一情况下，尽管极大影响叶子硝酸盐含量，但S523D-NR构筑体的组成性表达不会显著改变叶子的烟碱水平。
去筋烟叶烟草的TSNA分析的结果显示于图11A-11E中。与使用经烘烤的上部叶子材料观测类似(表7)，使用来自低硝酸盐植物的叶子材料的四个TSNA物质中的每一个中观测到大大降低，但观测到相对程度的各别降低的一些差异。与由WT对照植物制成的填料相比，来源于35S:S523D-NR植物的去筋烟叶分别含有少44％、64％、65％和32％的NNN、NNK、NAT和NAB，总观测TSNA降低为52％。与经烘烤的上部叶子相比，整体TSNA水平略微高于去筋烟叶材料中(比较表7和图11)，结果与较低茎位置的叶子中的TSNA积聚比顶部位置叶子高的前述观测相符。在图11中，各基因型的叶子材料根据如图10中所述的两个场所中的每一个汇聚。所示数据代表针对主流烟雾中的TSNA含量的每个场所两个复制品以及每个场所三个复制品的组合平均值和标准误差。
来源于WT和35S:S523D-NR去筋烟叶制成的香烟的主流烟雾中的TSNA数据也显示于图11中。出乎意料地，主流烟雾中由低硝酸盐表型引起的总TSNA降低的量甚至比相应去筋烟叶中观测到的高。与去筋烟叶烟草中观测到的52％降低相对，35S:S523D-NR香烟的主流烟雾与WT香烟相比显示76％总TSNA含量降低(图11E)。35S:S523D-NR和WT去筋烟叶烟草之间的TSNA含量与其相应主流烟雾相比的降低程度的差异对于NNN和NAB来说最明显。来自35S:S523D-NR植物的未燃烧填料烟草的NNN含量比WT填料少44％，而主流烟雾中的差异增加到78％(图11D)。同样，与主流烟雾中的86％降低相比，35S:S523D-NR植物的填料中的NAB水平比WT低32％(图11A)。当比较WT和35S:S523D-NR香烟的结果时，所测量的四个TSNA物质中，仅NNK在其去筋烟叶对比主流烟雾中的相对降低中未能展示统计学上显著的差异。在去筋烟叶和主流烟雾中，使用低硝酸盐35S:S523D-NR烟草制成的香烟与WT烟草对照相比，NNK降低约67％(图11C)。低硝酸盐香烟的主流烟雾中全部TSNA物质(除了NNK之外)水平的相对降低甚至高于相应未燃烧的去筋烟叶中。
35S:S523D-NR介导的硝酸盐水平降低可以在两个水平缓解烟草产品中的TSNA问题：(1)减少经烘烤的叶子本身的TSNA产生；以及(2)进一步抑制主流烟雾中出现TSNA的过程。
实例6
额外白肋背景中S523D-NR的过表达导致叶子硝酸盐积聚显著减少
使用含有35S:S523D-NR和E4:S523D-NR构筑体的植物表达载体转型白肋栽培品种TN90e4e5。除了独立地产生含有35S:S523D-NR和E4:S523D-NR构筑体的植物之外，将两种构筑体合并到同一植物中来判断除了单个构筑体获得的硝酸盐减少之外是否可以获得额外硝酸盐减少。为了获得具有各转基因和转基因组合的T0植物，采用共转型策略。为了区分所回收的各T0植物中转基因的互补序列，使用对35S或E4启动子区具有特异性的5’引物进行基于PCR的基因分型，所述5’引物与针对构筑体的S523D-NR区的3’引物配对。作为载体对照，TN90e4e5叶盘片也在E4启动子的转录控制下使用含有GUS报导基因的构筑体转型。
一旦植物足够大到转移到土壤，以下T0品系在温室中生长到成熟期：E4:GUS载体对照(12个事件)；35S:S523D-NR(10个事件)；E4:S523D-NR(11个事件)；以及35S:S523D-NR+E4:S523D-NR(7个事件)。植物在用Multicote 4施肥的标准土壤混合物中生长，Multicote4是控制释放的肥料(14-14-16NPK+微量营养素)。在即将开花之前，从各植物的中上部部分采摘两片叶子，去除中脉，并且在65℃下干燥剩余叶片。在同一采摘日期，两片额外叶子取自各植物的同一部分并且用益收生长素处理诱导老化，如Jack等人.(烟草科学的新近进展(Rec.Adv.Tob.Sci.)33:58-79(2007))所述。一旦益收生长素处理的叶子完全变黄(处理之后7-8天)，将各叶子的一部分冻结用于实时PCR(RT-PCR)分析，而使剩余叶子组织完全干燥以进行随后的硝酸盐分析。
表8示出了来自T0植物(也就是说TN90e4e5T0植物)的绿色和“人工衰老”叶子样品的硝酸盐含量。全部12株独立E4:GUS载体对照植物在其叶子中展现高水平的硝酸盐，在3,938到12,730ppm范围内。一般来说，绿色叶子中的硝酸盐浓度与益收生长素处理的叶子中观测到的非常相似。与E4:GUS对照不同，5/10独立35S:S523D-NR T0事件积聚低于1000ppm，绿色和益收生长素处理的样品中的三个个体积聚300ppm或更低。全部11株E4:S523D-NR个体在绿色叶子中显示高硝酸盐积聚(大于3,987ppm)。
表8
然而，在来源于相同植物的益收生长素处理的叶子中，观测到硝酸盐水平2到3倍降低(表8)。预期这些植物中控制S523D-NR表达的E4启动子在绿色叶子中失活，但在益收生长素处理、老化和空气烘烤期间变得高度表达。含有35S:S523D-NR和E4:S523D-NR构筑体的2/7T0植物在绿色叶子中显示非常低的硝酸盐水平(146和238ppm)。这些植物的绿色组织中的低硝酸盐水平表明35S:S523D-NR构筑体在这两种个体中主动地表达。在这些植物(35S+E4:S523D-NR 5-2)中的一个中，绿色对比益收生长素处理的叶子中的硝酸盐水平保持实际上相同。然而，在另一植物(35S+E4:S523D-NR 8-1)中，益收生长素处理的叶子中的游离硝酸盐不可检测。硝酸盐积聚的最大减少可以通过组合驱动S523D-NR强组成性表达的构筑体与介导S523D-NR的强老化/烘烤特异性表达的构筑体实现。值得注意的是，具有格外低游离硝酸盐水平的T0植物与展现标准硝酸盐水平的T0个体之间没有观测到明显表型差异。
由于例如“位置作用”和基因沉默的现象，任何指定转型实验中通常在不同T0事件之间观测到非常大的转录物积聚水平变化。对T0植物的硝酸盐分析结果表明S523D-NR转基因在一些个体中有效表达，但在其它个体(具体来说关于35S:S523D-NR构筑体)中不有效表达。对上文所述的黄色益收生长素处理的样品进行RT-PCR分析来测试。使用绿色叶子组织的RT-PCR分析被不区分内源性Nia2转录物和S523D-NR源的转录物(因为其编码区仅一个密码子不同)的分析法混淆，并且在对照植物的绿色叶子组织中检测到高水平的原生NR转录物。相比之下，人工衰老的益收生长素处理的叶子中检测到最小内源性NR转录物积聚。图12示出了表8中所列出的各T0植物的益收生长素处理的叶子中的相对NR转录物水平(根据烟草延伸因子1α基因标准化)，以及相应硝酸盐浓度。在图12中，RT-PCR数据(黄色条，标尺在左)示出了根据烟草延伸因子1α参考转录物标准化之后NR转录物的相对积聚(内源性NR和S523D-NR)。红色方框指示硝酸盐浓度(标尺在右)。在全部载体对照植物中，内源性NR转录物积聚相对低并且硝酸盐含量高(高于5,000ppm)。在仅含有35S:S523D-NR构筑体的T0植物中，高NR转录物积聚和低硝酸盐表型之间存在非常好的相关性。仅具有E4:S523D-NR转基因的全部T0植物展现的NR转录物积聚水平比载体对照高，并且其相应硝酸盐水平也均匀地较低。不足为奇的是，预计E4:S523D-NR植物中驱动的硝酸盐水平没有高表达35S:S523D-NR植物那么低，因为去调节的NR酶将预期仅在前一植物的益收生长素处理之后造成硝酸盐池减少，而不是像关于后一植物所预期的那样在植物的整个寿命期间起作用。这一组中的植物5-2和8-1中相当大一部分NR转录物可能从35S:S523D-NR构筑体起始，因为这些植物的绿色和益收生长素处理的叶子样品中观测到格外低的硝酸盐水平(表8)。
实例7
T1植物中的S523D-NR过表达展示叶子硝酸盐积聚的显著降低
来自浮盘的TN90e4e5背景中的T1转基因植物(包括对照1920株植物)进行基因分型并且移植到两个田间场所(完全随机的田间设计)。收集来自各植物的叶子组织样品(叶片)用于硝酸盐分析并且接着将植物置于空气烘烤结构中，产生用于香烟烟雾分析的去筋烟叶。
在两个田间场所从中部茎位置收集的绿色叶子的硝酸盐数据在表9和10中提出。两种情况的数据显示由于存在转基因引起硝酸盐大大减少。
表9.在300kg/ha N施肥下去调节的硝酸还原酶基因构筑体对T1转基因植物的绿色叶子中的游离NO3N含量的作用
具有同一字母的平均值没有显著不同，α＝0.05。全部“GH”品系都在TN90e4e5背景中；C3-11是2013年田间研究包括的DH98-325-6#775中的品系。分析中使用原始数据的对数，但为了方便起见，显示原始数据的平均值。
表10.在300kg/ha N施肥下去调节的硝酸还原酶基因构筑体对T1转基因植物的经烘烤的叶子中的游离NO3N含量的作用
我们从这一实验可以推断在更强烈TN90e4e5背景中的35S:S523D-NR转基因表达和我们在较差品系DH98 325-6#775中观测到的同样有效的降低叶子硝酸盐含量。
选择一些品系(GH3-1、GH8-1和GH8-5)来分析经烘烤的叶子中的硝酸盐和总生物碱(中部茎位置，代表植物曲线图的散装粉末)。一般来说，如上文所观测，总生物碱和烟碱不受转基因(35S:S523D-NR)存在的影响。然而，在TN90e4e5背景中，一个品系GH8-5中观测到略微减少(15％)(图13)。
正如从前述结果所预期，叶片中的叶子硝酸盐由于更具活性的硝酸盐同化而大大减少(>95％)。添加老化启动子E4调节的转基因不会影响数据，由此表明转基因硝酸还原酶在组成性启动子35S控制下的活性在绿色叶子中强有效(参看表9和10)并且足以减少叶片中储存的硝酸盐(图14)。
从经烘烤的叶子制造去筋烟叶并且针对TSNA进行分析。有趣的是，TSNA显著减少(针对NNN约72％，针对NNK约45％，针对NAT约76％以及针对NAB约78％)，表明绿色叶子中硝酸盐的减少大大影响去筋烟叶材料中TSNA的产生(图15)。
正如用35S:S523D-NR转型的较差品系DH98 325-6#775(参看实例2)，使用图15中分析的材料制成香烟并且烟熏。测定烟雾中的TSNA并且数据报道于图16中。由于热解期间较少亚硝化的影响，烟雾中的TSNA甚至比去筋烟叶中减少更多(针对NNN约90％，针对NNK约66％，针对NAT约88％以及针对NAB约92％)。因此，整体来说，这表明通过过表达去调节形式的硝酸还原酶减少绿色叶子中的硝酸盐来大大减少商业烟草(如TN90e4e5)的烟雾中TSNA的产生。
应理解前述实施方式和随附实例仅仅是说明性的并且不认为是限制本发明的范围，本发明的范围仅由随附权利要求书以及其等效物限定。
所披露的实施例的多种改变和修改对于所属领域的技术人员将显而易知。这类改变和修改包括(但不限于)与本发明的化学结构、取代基、衍生物、中间物、合成、组合物、调配物或使用方法有关的那些，可以进行这类改变和修改而不脱离其精神和范围。
出于完整性的原因，本发明的多个方面在以下带编号的条项中陈述：
条项1.一种由烟草植物产生的烟草特异性亚硝胺(TSNA)水平降低的烟草产品，所述烟草植物修饰成包含：(i)包含编码去调节的硝酸还原酶的序列、由其组成或基本上由其组成的多核苷酸；(ii)由(i)中所述的多核苷酸编码的多肽；(iii)包含去调节的硝酸还原酶、由其组成或基本上由其组成的多肽；或(iv)包含(i)中所述的多核苷酸的构筑体、载体或表达载体，并且其中所述硝酸还原酶的所述表达或活性与对照未经修饰的烟草植物相比去调节。
条项2.根据条项1的烟草产品，其中去调节的硝酸还原酶是具有组成性活性的硝酸还原酶。
条项3.根据条项1或2的烟草产品，其中所述编码去调节的硝酸还原酶的序列编码(i)截短的硝酸还原酶多肽；(ii)包含N端截短的硝酸还原酶多肽；(iii)包含56个氨基酸的N端截短的硝酸还原酶多肽；(iv)在对应于SEQ ID NO:4的位置523的位置处包含氨基酸取代的硝酸还原酶多肽；或(v)硝酸还原酶多肽，其在对应于SEQ ID NO:4的位置523的位置处包含氨基酸取代，其中SEQ ID NO:4的位置523处的氨基酸取代成天冬氨酸。
条项4.根据前述条项中任一项的烟草产品，其中所述编码去调节的硝酸还原酶的多核苷酸为编码经修饰的硝酸还原酶多肽的异源多核苷酸。
条项5.根据条项4的烟草产品，其中所述异源多核苷酸连接到本身不与内源性硝酸还原酶基因相关的启动子。
条项6.根据条项5的烟草产品，其中所述启动子为花椰菜嵌纹病毒35S启动子或CYP82E4启动子。
条项7.根据前述条项中任一项的烟草产品，其中所述编码去调节的硝酸还原酶的多核苷酸包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7的多核苷酸序列。
条项8.根据条项1到3中任一项的烟草产品，其中所述编码去调节的硝酸还原酶的多核苷酸是已经由基因组编辑系统或诱变剂修饰的内源性硝酸还原酶基因。
条项9.根据条项8的烟草产品，其中所述基因组编辑系统包含工程改造的基于CRISPR/Cas的系统、工程改造的转录活化因子类效应子核酸酶、工程改造的锌指核酸酶或工程改造的大范围核酸酶。
条项10.根据前述条项中任一项的烟草产品，其中所述烟草是白肋东方深色雪茄型烟草和烟道烘烤的烟草。
条项11.根据前述条项中任一项的烟草产品，其烟草特异性亚硝胺(TSNA)水平与来源于硝酸还原酶未经去调节的对照烟草植物的烟草产品相比降低。
条项12.根据条项11的烟草产品，其中测量来自烟草植物的叶子中的总TSNA水平，其中(a)叶子新鲜采摘；(b)叶子经烘烤、储存或加工；或(c)叶子是空气烘烤的。
条项13.根据条项11或12的烟草产品，其中所述烟草产品中至少一种TSNA的水平与至少一种TSNA的对照水平相比降低，其中所述至少一种TSNA选自由以下组成的群组：N-亚硝基去甲烟碱(NNN)、4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N-亚硝基新烟草碱(NAB)、N-亚硝基新烟碱(NAT)以及其组合。
条项14.根据条项11到13中任一项的烟草产品，其中TSNA的总水平降低至少50％。
条项15.根据条项11的烟草产品，其中在从燃烧所述烟草植物的叶子获得的烟雾中测量所述TSNA水平。
条项16.根据条项15的烟草产品，其中烟雾中的总TSNA水平降低至少70％。
条项17.一种用于制造烟草产品的方法，其中燃烧经修饰的烟草植物的叶子获得的烟雾中测量的TSNA水平与燃烧未经修饰的烟草植物获得的烟雾中测量的TSNA水平相比降低，所述方法包含：(a)将烟草植物修饰成包含：(i)包含编码去调节的硝酸还原酶的序列、由其组成或基本上由其组成的多核苷酸；(ii)由(i)中所述的多核苷酸编码的多肽；(iii)包含去调节的硝酸还原酶、由其组成或基本上由其组成的多肽；或(iv)包含(i)中所述的多核苷酸的构筑体、载体或表达载体，且其中所述硝酸还原酶的所述表达或活性与对照未经修饰的烟草植物相比去调节；(b)从所述经修饰的烟草植物采摘烟草叶；以及(c)由采摘的叶子制造烟草产品。
条项18.根据前述条项中任一项的烟草产品，其中所述烟草植物进一步包含经修饰的去甲烟碱路径基因。
条项19.根据条项18的烟草产品，其中所述经修饰的去甲烟碱路径基因包含经修饰的烟碱去甲基化酶基因或细胞色素P450基因。
条项20.根据条项18或19的烟草产品，其中所述烟草植物包含经修饰的CYP82E4或经修饰的CYP82E10基因。
条项21.根据条项20的烟草产品，其中所述经修饰的CYP82E4基因或经修饰的CYP82E10基因是不活化的。
条项22.根据前述条项中任一项的烟草产品，其中所述烟草植物是从由以下组成的群组中选出的变种：白肋东方深色雪茄型烟草和烟道烘烤的烟草。
条项23.根据前述条项中任一项的烟草产品，其中所述烟草产品是吸烟材料、鼻烟、咀嚼烟草、口香糖、口含片或烟碱溶液。
条项24.一种制造根据条项1到23中任一项的烟草产品的方法，所述方法包含：(a)向植物细胞中引入编码经修饰的硝酸还原酶基因或经修饰的硝酸盐转运体基因的经分离的多核苷酸；(b)再生所述经转型细胞产生转基因植物；以及(c)从所述转基因植物的叶子制造烟草产品。
条项25.一种制造根据条项1到23中任一项的烟草产品的方法，所述方法包含：(a)向植物细胞中引入靶向内源性硝酸还原酶基因的基因组编辑系统；(b)再生所述经转型细胞产生转基因植物；以及(c)从所述转基因植物的叶子制造烟草产品。
条项26.根据条项25的方法，其中所述基因组编辑系统结合和裂解所述内源性硝酸还原酶基因产生所述经修饰的硝酸还原酶基因。
条项27.根据条项25或26的方法，其中所述基因组编辑系统包含基于工程改造的CRISPR/Cas9的系统、工程改造的转录活化因子类效应子核酸酶、工程改造的锌指核酸酶或工程改造的大范围核酸酶。
条项28.根据条项25到27中任一项的方法，其中所述基因组编辑系统在所述烟草植物中暂时表达。
条项29.根据条项25到27中任一项的方法，其中所述基因组编辑系统并入到所述烟草植物的所述基因组中。
条项30.根据条项25到29中任一项的方法，其中所述烟草植物进一步包含经修饰的去甲烟碱路径基因。
条项31.根据条项30的方法，其中所述经修饰的去甲烟碱路径基因包含经修饰的烟碱去甲基化酶基因或细胞色素P450基因。
条项32.根据条项30或31的方法，其中所述烟草植物包含经修饰的CYP82E4或经修饰的CYP82E10基因。
条项33.根据条项32的方法，其中所述经修饰的CYP82E4基因或经修饰的CYP82E10基因是不活化的。
条项34.根据条项25到33中任一项的方法，其中所述植物细胞是从由以下组成的群组中选出的烟草变种：白肋东方深色雪茄型烟草和烟道烘烤的烟草。
条项35.根据条项25到34中任一项的方法，其中所述烟草产品是吸烟材料、鼻烟、咀嚼烟草、口香糖、口含片或烟碱溶液。
以下核酸和氨基酸序列在所附的序列表中披露：
SEQ ID NO:1-Nia1cDNA的编码区
SEQ ID NO:2-Nia1p的预测蛋白质序列
SEQ ID NO:3-Nia2cDNA的编码区(在位置523处含有Ser残基)
SEQ ID NO:4-Nia2p的预测蛋白质序列
SEQ ID NO:5-Nia2S523D-NR cDNA的编码区
SEQ ID NO:6-S523D-NRp的预测蛋白质序列(在位置523处含有Asp残基)
SEQ ID NO:7-tr-NR cDNA的编码区
序列表
<110> 北卡罗莱纳州立大学菲利普·莫里斯公司的产品SA
<120> 通过改变硝酸同化路径减少烟草特异性亚硝胺
<130> P4597PC00
<150> EP 14194798.6
<151> 2014-11-25
<150> EP 14186705.1
<151> 2014-09-26
<160> 28
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2715
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1
atggcggcat ctgtcgaaaa caggcagttc agtcacatag aagccggttt atcccggtct 60
ttcaagcctc ggtctgattc cccggttcgt ggctgcaact tccctccgcc caacagtact 120
aatttccaaa agaaaccaaa ttccaccatt ttccttgatt actcgtcgag tgaagacgac 180
gatgatgatg acgaaaaaaa tgagtacctt caaatgatca aaaaagggaa ttcagaatta 240
gagccatctg ttcatgacag cagggacgaa ggtaccgctg ataactggat tgaacgcaac 300
ttttccttga ttcgtctcac cggaaagcat ccatttaact ccgaaccgcc gttgaaccgt 360
ctcatgcacc acggttttat cacaccggtc ccacttcatt acgttcgtaa ccatggaccg 420
gttcccaagg gcacatggga tgactggacc gtggaagtca cgggactagt gaaacgtcct 480
atgaaattca caatggacca gttggttaac gaattccctt ccagagaatt gcccgttacg 540
cttgtgtgtg ctggcaaccg aaggaaagaa cagaacatgg ttaaacaaac cattggtttc 600
aactggggtg ccgctgccgt ttcaacaact gtatggcgcg gggtacccct acgcgctttg 660
ttaaaacggt acggtgtttt tagcaagaat aaaggggcgc ttaatgtttg cttcgaagga 720
gctgatgtct tgcccggagg cggtggttca aagtatggaa ccagcattaa gaaggaattt 780
gcaatggatc cagcacgaga tatcataata gcttacatgc agaacggaga aaaattggca 840
cccgaccacg ggtttccagt acgaatgata attccaggat tcattggagg aagaatggtg 900
aaatggataa agaggattat agtcaccacc caagaatcag acagctatta tcatttcaag 960
gacaatagag ttcttcctcc ccatgttgat gctgaacttg caaatactga agcatggtgg 1020
tacaagccag agtacatcat caatgagctc aatattaact ctgtcattac gacgccgtgt 1080
catgaagaaa ttttgcctat taacgcctgg acgactcagc gaccttacac gttgaggggc 1140
tattcttatt ctggcggagg gaaaaaagta acgcgagtag aagtgacctt ggatggagga 1200
gaaacatggc aagtttgcac actagatcac ccagagaagc ccaccaaata tggcaagtac 1260
tggtgttggt gcttttggtc actcgaggtt gaggtgttag acttgctcag tgccaaagaa 1320
attgctgttc gagcttggga tgagaccctc aatactcaac ctgagaagct tatttggaat 1380
gtcatgggaa tgatgaacaa ttgctggttc cgagtaaaga tgaatgtgtg caagcctcac 1440
aagggagaga ttggaatagt gtttgaacac ccgactcaac ctggaaacca atcaggtgga 1500
tggatggcaa aggagaggca tttggagata tcagcagagg cacctccaac actaaagaag 1560
agtatctcaa ctccattcat gaacacagct tccaagatgt actccatgtc ggaggtgagg 1620
aaacacagct ctgctgactc tgcttggatc atagtccatg gtcatatcta tgacgccacg 1680
cgtttcttga aagatcaccc cggtggttct gacagcattc tcatcaatgc tggcactgat 1740
tgcactgagg aatttgatgc aattcattct gataaggcta agaagctatt ggaggaattc 1800
aggattggtg aactcctaac tactggttac acctctgact ctcctggcaa ctccgtccat 1860
ggatcttctt ccttcagcag ctttctagca cctattaagg aacttgttcc agcgcagagg 1920
agtgtggccc tcattccaag agagaaaatc ccatgcaaac tcatcgacaa acaatccatc 1980
tcccctgatg ttaggaaatt tcgatttgca ttgccctctg aggatcaagt cttgggcttg 2040
cctgttggta aacacatctt cctctgtgcc gttattgacg ataagctctg catgcgcgcc 2100
tacacgccta ctagcacgat cgatgaggtg gggtacttcg agttggttgt caagatatac 2160
ttcaaaggaa ttcaccctaa attccccaat ggggggcaaa tgtcacaata ccttgattct 2220
ctccaattag ggtcatttct cgacgtgaaa ggtccattag gtcacattga ataccaagga 2280
aagggcaatt tcttagttca tggcaaacaa aagtttgcca agaagttggc catgatagca 2340
ggtggaacag ggataactcc agtttatcaa gtcatgcagg caattctgaa agatccagaa 2400
gatgacacag aaatgtatgt ggtctatgct aatagaacag aggatgatat tttacttaag 2460
gaagagcttg attcatgggc tgagaaaatt ccagaaaggg ttaaagtttg gtatgtggtt 2520
caagattcta ttaaagaagg atggaagtac agccttggtt ttatttcaga agccattttg 2580
agagaacata tccctgagcc atctcacaca acactggctt tggcttgtgg accacctcct 2640
atgattcaat ttgctgttaa tccaaacttg gagaagatgg gctatgacat taaggattcc 2700
ttattggtgt tctaa 2715
<210> 2
<211> 904
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 2
Met Ala Ala Ser Val Glu Asn Arg Gln Phe Ser His Ile Glu Ala Gly
1 5 10 15
Leu Ser Arg Ser Phe Lys Pro Arg Ser Asp Ser Pro Val Arg Gly Cys
20 25 30
Asn Phe Pro Pro Pro Asn Ser Thr Asn Phe Gln Lys Lys Pro Asn Ser
35 40 45
Thr Ile Phe Leu Asp Tyr Ser Ser Ser Glu Asp Asp Asp Asp Asp Asp
50 55 60
Glu Lys Asn Glu Tyr Leu Gln Met Ile Lys Lys Gly Asn Ser Glu Leu
65 70 75 80
Glu Pro Ser Val His Asp Ser Arg Asp Glu Gly Thr Ala Asp Asn Trp
85 90 95
Ile Glu Arg Asn Phe Ser Leu Ile Arg Leu Thr Gly Lys His Pro Phe
100 105 110
Asn Ser Glu Pro Pro Leu Asn Arg Leu Met His His Gly Phe Ile Thr
115 120 125
Pro Val Pro Leu His Tyr Val Arg Asn His Gly Pro Val Pro Lys Gly
130 135 140
Thr Trp Asp Asp Trp Thr Val Glu Val Thr Gly Leu Val Lys Arg Pro
145 150 155 160
Met Lys Phe Thr Met Asp Gln Leu Val Asn Glu Phe Pro Ser Arg Glu
165 170 175
Leu Pro Val Thr Leu Val Cys Ala Gly Asn Arg Arg Lys Glu Gln Asn
180 185 190
Met Val Lys Gln Thr Ile Gly Phe Asn Trp Gly Ala Ala Ala Val Ser
195 200 205
Thr Thr Val Trp Arg Gly Val Pro Leu Arg Ala Leu Leu Lys Arg Tyr
210 215 220
Gly Val Phe Ser Lys Asn Lys Gly Ala Leu Asn Val Cys Phe Glu Gly
225 230 235 240
Ala Asp Val Leu Pro Gly Gly Gly Gly Ser Lys Tyr Gly Thr Ser Ile
245 250 255
Lys Lys Glu Phe Ala Met Asp Pro Ala Arg Asp Ile Ile Ile Ala Tyr
260 265 270
Met Gln Asn Gly Glu Lys Leu Ala Pro Asp His Gly Phe Pro Val Arg
275 280 285
Met Ile Ile Pro Gly Phe Ile Gly Gly Arg Met Val Lys Trp Ile Lys
290 295 300
Arg Ile Ile Val Thr Thr Gln Glu Ser Asp Ser Tyr Tyr His Phe Lys
305 310 315 320
Asp Asn Arg Val Leu Pro Pro His Val Asp Ala Glu Leu Ala Asn Thr
325 330 335
Glu Ala Trp Trp Tyr Lys Pro Glu Tyr Ile Ile Asn Glu Leu Asn Ile
340 345 350
Asn Ser Val Ile Thr Thr Pro Cys His Glu Glu Ile Leu Pro Ile Asn
355 360 365
Ala Trp Thr Thr Gln Arg Pro Tyr Thr Leu Arg Gly Tyr Ser Tyr Ser
370 375 380
Gly Gly Gly Lys Lys Val Thr Arg Val Glu Val Thr Leu Asp Gly Gly
385 390 395 400
Glu Thr Trp Gln Val Cys Thr Leu Asp His Pro Glu Lys Pro Thr Lys
405 410 415
Tyr Gly Lys Tyr Trp Cys Trp Cys Phe Trp Ser Leu Glu Val Glu Val
420 425 430
Leu Asp Leu Leu Ser Ala Lys Glu Ile Ala Val Arg Ala Trp Asp Glu
435 440 445
Thr Leu Asn Thr Gln Pro Glu Lys Leu Ile Trp Asn Val Met Gly Met
450 455 460
Met Asn Asn Cys Trp Phe Arg Val Lys Met Asn Val Cys Lys Pro His
465 470 475 480
Lys Gly Glu Ile Gly Ile Val Phe Glu His Pro Thr Gln Pro Gly Asn
485 490 495
Gln Ser Gly Gly Trp Met Ala Lys Glu Arg His Leu Glu Ile Ser Ala
500 505 510
Glu Ala Pro Pro Thr Leu Lys Lys Ser Ile Ser Thr Pro Phe Met Asn
515 520 525
Thr Ala Ser Lys Met Tyr Ser Met Ser Glu Val Arg Lys His Ser Ser
530 535 540
Ala Asp Ser Ala Trp Ile Ile Val His Gly His Ile Tyr Asp Ala Thr
545 550 555 560
Arg Phe Leu Lys Asp His Pro Gly Gly Ser Asp Ser Ile Leu Ile Asn
565 570 575
Ala Gly Thr Asp Cys Thr Glu Glu Phe Asp Ala Ile His Ser Asp Lys
580 585 590
Ala Lys Lys Leu Leu Glu Glu Phe Arg Ile Gly Glu Leu Leu Thr Thr
595 600 605
Gly Tyr Thr Ser Asp Ser Pro Gly Asn Ser Val His Gly Ser Ser Ser
610 615 620
Phe Ser Ser Phe Leu Ala Pro Ile Lys Glu Leu Val Pro Ala Gln Arg
625 630 635 640
Ser Val Ala Leu Ile Pro Arg Glu Lys Ile Pro Cys Lys Leu Ile Asp
645 650 655
Lys Gln Ser Ile Ser Pro Asp Val Arg Lys Phe Arg Phe Ala Leu Pro
660 665 670
Ser Glu Asp Gln Val Leu Gly Leu Pro Val Gly Lys His Ile Phe Leu
675 680 685
Cys Ala Val Ile Asp Asp Lys Leu Cys Met Arg Ala Tyr Thr Pro Thr
690 695 700
Ser Thr Ile Asp Glu Val Gly Tyr Phe Glu Leu Val Val Lys Ile Tyr
705 710 715 720
Phe Lys Gly Ile His Pro Lys Phe Pro Asn Gly Gly Gln Met Ser Gln
725 730 735
Tyr Leu Asp Ser Leu Gln Leu Gly Ser Phe Leu Asp Val Lys Gly Pro
740 745 750
Leu Gly His Ile Glu Tyr Gln Gly Lys Gly Asn Phe Leu Val His Gly
755 760 765
Lys Gln Lys Phe Ala Lys Lys Leu Ala Met Ile Ala Gly Gly Thr Gly
770 775 780
Ile Thr Pro Val Tyr Gln Val Met Gln Ala Ile Leu Lys Asp Pro Glu
785 790 795 800
Asp Asp Thr Glu Met Tyr Val Val Tyr Ala Asn Arg Thr Glu Asp Asp
805 810 815
Ile Leu Leu Lys Glu Glu Leu Asp Ser Trp Ala Glu Lys Ile Pro Glu
820 825 830
Arg Val Lys Val Trp Tyr Val Val Gln Asp Ser Ile Lys Glu Gly Trp
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gctggcactg attgcactga ggaatttgat gcaattcatt ctgataaggc taagaagctc 1620
ttggaggatt tcaggattgg tgaactcata actactggtt acacctctga ctctcctggc 1680
aactccgtgc acggatcttc ttccttcagc agctttctag cacctattaa ggaacttgtt 1740
ccagcgcaga ggagtgtggc cctaattcca agagagaaaa tcccatgcaa actcatcgac 1800
aagcaatcca tctcccatga tgttaggaaa tttcgatttg cattgccctc tgaggatcaa 1860
gtcttgggct tgcctgttgg aaaacatatc ttcctctgtg ccgttattga cgataagctc 1920
tgcatgcgcg cttacacgcc tactagcacg atcgatgagg tggggtactt cgagttggtt 1980
gtcaagatat acttcaaagg aattcaccct aaattcccca atggagggca aatgtcacag 2040
tatcttgatt ctatgccgtt agggtcattt ctcgacgtga aaggtccatt aggtcacatt 2100
gaataccaag gaaagggaaa tttcttagtt catggcaaac agaagtttgc caagaagttg 2160
gccatgatag caggtggaac aggaataact ccagtgtatc aagtcatgca ggcaattctg 2220
aaagatccag aagatgacac agaaatgtat gtggtgtatg ctaacagaac agaggatgat 2280
attttactta aggaagagct tgattcatgg gctgagaaaa ttccagagag ggttaaagtt 2340
tggtatgtgg ttcaggattc tattaaagaa ggatggaagt acagcattgg ttttattaca 2400
gaagccattt tgagagaaca tatccctgag ccatctcaca caacactggc tttggcttgt 2460
ggaccacctc ctatgattca atttgctgtt aatccaaact tggagaagat gggctatgac 2520
attaaggatt ccttattggt gttctaa 2547
<210> 8
<211> 848
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 8
Met Ala Ala Ser Val Glu Asn Arg Gln Phe Ser His Leu Glu Ala Gly
1 5 10 15
Leu Ser Arg Ser Asn Ser Glu Leu Glu Pro Ser Val His Asp Thr Arg
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Ala Asp Asn Trp Ile Glu Arg Asn Phe Ser Met Ile
35 40 45
Arg Leu Thr Gly Lys His Pro Phe Asn Ser Glu Pro Pro Leu Asn Arg
50 55 60
Leu Met His His Gly Phe Ile Thr Pro Val Pro Leu His Tyr Val Arg
65 70 75 80
Asn His Gly Pro Val Pro Lys Gly Thr Trp Asp Asp Trp Thr Val Glu
85 90 95
Val Thr Gly Leu Val Lys Arg Pro Met Lys Phe Thr Met Asp Gln Leu
100 105 110
Val Asn Glu Phe Pro Cys Arg Glu Leu Pro Val Thr Leu Val Cys Ala
115 120 125
Gly Asn Arg Arg Lys Glu Gln Asn Met Val Lys Gln Thr Ile Gly Phe
130 135 140
Asn Trp Gly Ala Ala Ala Val Ser Thr Thr Ile Trp Arg Gly Val Pro
145 150 155 160
Leu Arg Ala Leu Leu Lys Arg Cys Gly Val Phe Ser Lys Asn Lys Gly
165 170 175
Ala Leu Asn Val Cys Phe Glu Gly Ala Asp Val Leu Pro Gly Gly Gly
180 185 190
Gly Ser Lys Tyr Gly Thr Ser Ile Lys Lys Glu Phe Ala Met Asp Pro
195 200 205
Ala Arg Asp Ile Ile Val Ala Tyr Met Gln Asn Gly Glu Lys Leu Ala
210 215 220
Pro Asp His Gly Phe Pro Val Arg Met Ile Ile Pro Gly Phe Ile Gly
225 230 235 240
Gly Arg Met Val Lys Trp Ile Lys Arg Ile Ile Val Thr Thr Gln Glu
245 250 255
Ser Asp Ser Tyr Tyr His Phe Lys Asp Asn Arg Val Leu Pro Pro His
260 265 270
Val Asp Ala Glu Leu Ala Asn Thr Glu Ala Trp Trp Tyr Lys Pro Glu
275 280 285
Tyr Ile Ile Asn Glu Leu Asn Ile Asn Ser Val Ile Thr Thr Pro Cys
290 295 300
His Glu Glu Ile Leu Pro Ile Asn Ala Trp Thr Thr Gln Arg Pro Tyr
305 310 315 320
Thr Leu Arg Gly Tyr Ser Tyr Ser Gly Gly Gly Lys Lys Val Thr Arg
325 330 335
Val Glu Val Thr Leu Asp Gly Gly Glu Thr Trp Gln Val Ser Thr Leu
340 345 350
Asp His Pro Glu Lys Pro Thr Lys Tyr Gly Lys Tyr Trp Cys Trp Cys
355 360 365
Phe Trp Ser Leu Glu Val Glu Val Leu Asp Leu Leu Ser Ala Lys Glu
370 375 380
Ile Ala Val Arg Ala Trp Asp Glu Thr Leu Asn Thr Gln Pro Glu Lys
385 390 395 400
Leu Ile Trp Asn Val Met Gly Met Met Asn Asn Cys Trp Phe Arg Val
405 410 415
Lys Met Asn Val Cys Lys Pro His Lys Gly Glu Ile Gly Ile Val Phe
420 425 430
Glu His Pro Thr Gln Pro Gly Asn Gln Ser Gly Gly Trp Met Ala Lys
435 440 445
Glu Arg His Leu Glu Ile Ser Ala Glu Ala Pro Gln Thr Leu Lys Lys
450 455 460
Ser Ile Ser Thr Pro Phe Met Asn Thr Ala Ser Lys Met Tyr Ser Met
465 470 475 480
Ser Glu Val Arg Lys His Ser Ser Ala Asp Ser Ala Trp Ile Ile Val
485 490 495
His Gly His Ile Tyr Asp Ala Thr Arg Phe Leu Lys Asp His Pro Gly
500 505 510
Gly Thr Asp Ser Ile Leu Ile Asn Ala Gly Thr Asp Cys Thr Glu Glu
515 520 525
Phe Asp Ala Ile His Ser Asp Lys Ala Lys Lys Leu Leu Glu Asp Phe
530 535 540
Arg Ile Gly Glu Leu Ile Thr Thr Gly Tyr Thr Ser Asp Ser Pro Gly
545 550 555 560
Asn Ser Val His Gly Ser Ser Ser Phe Ser Ser Phe Leu Ala Pro Ile
565 570 575
Lys Glu Leu Val Pro Ala Gln Arg Ser Val Ala Leu Ile Pro Arg Glu
580 585 590
Lys Ile Pro Cys Lys Leu Ile Asp Lys Gln Ser Ile Ser His Asp Val
595 600 605
Arg Lys Phe Arg Phe Ala Leu Pro Ser Glu Asp Gln Val Leu Gly Leu
610 615 620
Pro Val Gly Lys His Ile Phe Leu Cys Ala Val Ile Asp Asp Lys Leu
625 630 635 640
Cys Met Arg Ala Tyr Thr Pro Thr Ser Thr Ile Asp Glu Val Gly Tyr
645 650 655
Phe Glu Leu Val Val Lys Ile Tyr Phe Lys Gly Ile His Pro Lys Phe
660 665 670
Pro Asn Gly Gly Gln Met Ser Gln Tyr Leu Asp Ser Met Pro Leu Gly
675 680 685
Ser Phe Leu Asp Val Lys Gly Pro Leu Gly His Ile Glu Tyr Gln Gly
690 695 700
Lys Gly Asn Phe Leu Val His Gly Lys Gln Lys Phe Ala Lys Lys Leu
705 710 715 720
Ala Met Ile Ala Gly Gly Thr Gly Ile Thr Pro Val Tyr Gln Val Met
725 730 735
Gln Ala Ile Leu Lys Asp Pro Glu Asp Asp Thr Glu Met Tyr Val Val
740 745 750
Tyr Ala Asn Arg Thr Glu Asp Asp Ile Leu Leu Lys Glu Glu Leu Asp
755 760 765
Ser Trp Ala Glu Lys Ile Pro Glu Arg Val Lys Val Trp Tyr Val Val
770 775 780
Gln Asp Ser Ile Lys Glu Gly Trp Lys Tyr Ser Ile Gly Phe Ile Thr
785 790 795 800
Glu Ala Ile Leu Arg Glu His Ile Pro Glu Pro Ser His Thr Thr Leu
805 810 815
Ala Leu Ala Cys Gly Pro Pro Pro Met Ile Gln Phe Ala Val Asn Pro
820 825 830
Asn Leu Glu Lys Met Gly Tyr Asp Ile Lys Asp Ser Leu Leu Val Phe
835 840 845
<210> 9
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 西红柿；NIA；523-533
<400> 9
Leu Lys Lys Ser Ile Ser Thr Pro Phe Met Asn
1 5 10
<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 烟草；NIA1；518-528
<400> 10
Leu Lys Lys Ser Ile Ser Thr Pro Phe Met Asn
1 5 10
<210> 11
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 烟草；NIA2；518-528
<400> 11
Leu Lys Lys Ser Ile Ser Thr Pro Phe Met Asn
1 5 10
<210> 12
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 矮牵牛花；NIA；522-532
<400> 12
Leu Lys Lys Ser Ile Ser Thr Pro Phe Met Asn
1 5 10
<210> 13
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 南瓜；NIA；530-540
<400> 13
Leu Lys Lys Ser Val Ser Thr Pro Phe Met Asn
1 5 10
<210> 14
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 桦树；NIA1；515-525
<400> 14
Leu Lys Lys Ser Val Ser Thr Pro Phe Met Asn
1 5 10
<210> 15
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 阿拉伯芥；NIA1；532-542
<400> 15
Leu Lys Lys Ser Val Ser Ser Pro Phe Met Asn
1 5 10
<210> 16
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 阿拉伯芥；NIA2；529-539
<400> 16
Leu Lys Lys Ser Val Ser Thr Pro Phe Met Asn
1 5 10
<210> 17
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 油菜；NIA1；526-536
<400> 17
Leu Lys Lys Ser Val Ser Ser Pro Phe Met Asn
1 5 10
<210> 18
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 油菜；NIA2；526-536
<400> 18
Leu Lys Lys Ser Val Ser Thr Pro Phe Met Asn
1 5 10
<210> 19
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 大豆；NIA2；504-514
<400> 19
Leu Lys Lys Ser Val Ser Ser Pro Phe Met Asn
1 5 10
<210> 20
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 菜豆；NIA1；502-512
<400> 20
Leu Lys Lys Ser Val Ser Thr Pro Phe Met Asn
1 5 10
<210> 21
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 菜豆；NIA2；500-510
<400> 21
Leu Lys Lys Ser Val Ser Ser Pro Phe Met Asn
1 5 10
<210> 22
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 百脉根；NIA；508-518
<400> 22
Leu Lys Lys Ser Val Ser Ser Pro Phe Met Asn
1 5 10
<210> 23
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 菊苣；NIA1；521-531
<400> 23
Leu Lys Lys Ser Val Ser Ser Pro Phe Met Asn
1 5 10
<210> 24
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 玉米；NIA1；234-244
<400> 24
Leu Lys Arg Ser Thr Ser Thr Pro Phe Met Asn
1 5 10
<210> 25
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 大麦；NIA1；524-534
<400> 25
Leu Lys Arg Ser Thr Ser Thr Pro Phe Met Asn
1 5 10
<210> 26
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 大麦；NIA2；521-531
<400> 26
Leu Lys Arg Ser Thr Ser Thr Pro Phe Met Asn
1 5 10
<210> 27
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 水稻；NIA1；527-537
<400> 27
Leu Lys Arg Ser Thr Ser Thr Pro Phe Met Asn
1 5 10
<210> 28
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 菠菜；NIA；538-548
<400> 28
Leu Lys Arg Thr Ala Ser Thr Pro Phe Met Asn
1 5 10
1

Claims (25)

1.一种由烟草植物产生的烟草特异性亚硝胺(TSNA)水平降低的烟草产品，所述烟草植物修饰成包含：
(i)包含编码去调节的硝酸还原酶的序列、由其组成或基本上由其组成的多核苷酸；
(ii)由(i)中所述的多核苷酸编码的多肽；
(iii)包含去调节的硝酸还原酶、由其组成或基本上由其组成的多肽；或
(iv)包含(i)中所述的多核苷酸的构筑体、载体或表达载体，
其中所述硝酸还原酶的表达或活性与对照未经修饰的烟草植物相比去调节；
且其中所述去调节的硝酸还原酶包含：
(a)在与SEQ ID NO:4的位置523对应的位置处包含氨基酸取代的硝酸还原酶多肽；或
(b)在与SEQ ID NO:4的位置523对应的位置处包含氨基酸取代的硝酸还原酶多肽，其中SEQ ID NO:4的位置523处的所述氨基酸取代成天冬氨酸。
2.根据权利要求1所述的烟草产品，其中所述去调节的硝酸还原酶是具有组成性活性的硝酸还原酶。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的烟草产品，其中所述烟草产品包含来自普通烟草物种的烟草植物的植物材料。
4.根据前述权利要求中任一项所述的烟草产品，其中所述编码去调节的硝酸还原酶的多核苷酸为编码经修饰的硝酸还原酶多肽的异源多核苷酸。
5.根据权利要求4所述的烟草产品，其中所述异源多核苷酸连接到并非与内源性硝酸还原酶基因天然相关的启动子。
6.根据权利要求5所述的烟草产品，其中所述启动子为花椰菜嵌纹病毒35S启动子(Cauliflower Mosaic Virus 35S promoter)。
7.根据前述权利要求中任一项所述的烟草产品，其中所述编码去调节的硝酸还原酶的多核苷酸包含SEQ ID NO:5的多核苷酸序列。
8.根据权利要求1到3中任一项所述的烟草产品，其中所述编码去调节的硝酸还原酶的多核苷酸是已经由基因组编辑系统或诱变剂修饰的内源性硝酸还原酶基因。
9.根据权利要求8所述的烟草产品，其中所述基因组编辑系统包含工程改造的基于CRISPR/Cas的系统、工程改造的转录活化因子类效应子核酸酶、工程改造的锌指核酸酶或工程改造的大范围核酸酶。
10.根据前述权利要求中任一项所述的烟草产品，其中所述烟草为白肋烟草。
11.根据前述权利要求中任一项所述的烟草产品，其烟草特异性亚硝胺(TSNA)水平与来源于所述硝酸还原酶未经去调节的对照烟草植物的烟草产品相比降低。
12.根据权利要求11所述的烟草产品，其中在来自所述烟草植物的叶子中测量所述总TSNA含量，其中
(a)所述叶子新鲜采摘；
(b)所述叶子经烘烤、储存或加工；或
(c)所述叶子是空气烘烤的。
13.根据权利要求11或权利要求12所述的烟草产品，其中所述烟草产品中至少一种TSNA的含量与所述至少一种TSNA的对照含量相比降低，其中所述至少一种TSNA选自由以下组成的群组：N-亚硝基去甲烟碱(NNN)、4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N-亚硝基新烟草碱(NAB)、N-亚硝基新烟碱(NAT)以及其组合。
14.根据权利要求11到13中任一项所述的烟草产品，其中TSNA的总水平降低至少50％。
15.根据权利要求11所述的烟草产品，其中在燃烧所述烟草植物的叶子获得的烟雾中测量所述TSNA水平。
16.根据权利要求15所述的烟草产品，其中烟雾中的总TSNA水平降低至少70％。
17.根据权利要求13到16中任一项所述的烟草产品，其中所述NNN的水平降低约90％。
18.根据权利要求13到17中任一项所述的烟草产品，其中所述NNK的水平降低约66％。
19.根据权利要求13到18中任一项所述的烟草产品，其中所述NAB的水平降低约92％。
20.根据权利要求13到19中任一项所述的烟草产品，其中所述NAT的水平降低约88％。
21.根据前述权利要求中任一项所述的烟草产品，其中所述烟草植物进一步包含经修饰的去甲烟碱路径基因。
22.根据权利要求21所述的烟草产品，其中所述经修饰的去甲烟碱路径基因包含经修饰的烟碱去甲基化酶基因或细胞色素P450基因。
23.根据权利要求21或权利要求22所述的烟草产品，其中所述烟草植物包含经修饰的CYP82E4或经修饰的CYP82E10基因。
24.根据权利要求23所述的烟草产品，其中所述经修饰的CYP82E4基因或经修饰的CYP82E10基因是不活化的。
25.一种用于制造烟草产品的方法，其中燃烧经修饰的烟草植物的叶子获得的烟雾中测量的TSNA水平与燃烧未经修饰的烟草植物获得的烟雾中测量的TSNA水平相比降低，所述方法包含：
(a)将烟草植物修饰成包含：
(i)包含编码去调节的硝酸还原酶的序列、由其组成或基本上由其组成的多核苷酸；
(ii)由(i)中所述的多核苷酸编码的多肽；
(iii)包含去调节的硝酸还原酶、由其组成或基本上由其组成的多肽；或
(iv)包含(i)中所述的多核苷酸的构筑体、载体或表达载体，
其中所述硝酸还原酶的所述表达或活性与对照未经修饰的烟草植物相比去调节；
且其中所述去调节的硝酸还原酶包含：
(I)在与SEQ ID NO:4的位置523对应的位置处包含氨基酸取代的硝酸还原酶多肽；或
(II)在与SEQ ID NO:4的位置523对应的位置处包含氨基酸取代的硝酸还原酶多肽，其中SEQ ID NO:4的位置523处的所述氨基酸取代成天冬氨酸；
(b)从所述经修饰的烟草植物采摘烟草叶子；以及
(c)从所述采摘的叶子制造烟草产品。
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