KR20170078599A - 니트레이트 동화 경로의 변경을 통한 담배 특이적 니트로소아민의 감소 - Google Patents

니트레이트 동화 경로의 변경을 통한 담배 특이적 니트로소아민의 감소 Download PDF

Info

Publication number
KR20170078599A
KR20170078599A KR1020177008015A KR20177008015A KR20170078599A KR 20170078599 A KR20170078599 A KR 20170078599A KR 1020177008015 A KR1020177008015 A KR 1020177008015A KR 20177008015 A KR20177008015 A KR 20177008015A KR 20170078599 A KR20170078599 A KR 20170078599A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
tobacco
nitrate
plant
lys
nitrate reductase
Prior art date
Application number
KR1020177008015A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102524798B1 (ko
Inventor
지아닐 루
램지 에스. 루이스
랄프 듀이
루시앙 보베
Original Assignee
필립모리스 프로덕츠 에스.에이.
노쓰 캐롤라이나 스테이트 유니버시티
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 필립모리스 프로덕츠 에스.에이., 노쓰 캐롤라이나 스테이트 유니버시티 filed Critical 필립모리스 프로덕츠 에스.에이.
Publication of KR20170078599A publication Critical patent/KR20170078599A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102524798B1 publication Critical patent/KR102524798B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A24—TOBACCO; CIGARS; CIGARETTES; SIMULATED SMOKING DEVICES; SMOKERS' REQUISITES
    • A24B—MANUFACTURE OR PREPARATION OF TOBACCO FOR SMOKING OR CHEWING; TOBACCO; SNUFF
    • A24B15/00—Chemical features or treatment of tobacco; Tobacco substitutes, e.g. in liquid form
    • A24B15/18—Treatment of tobacco products or tobacco substitutes
    • A24B15/24—Treatment of tobacco products or tobacco substitutes by extraction; Tobacco extracts
    • A24B15/241—Extraction of specific substances
    • A24B15/245—Nitrosamines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A24—TOBACCO; CIGARS; CIGARETTES; SIMULATED SMOKING DEVICES; SMOKERS' REQUISITES
    • A24B—MANUFACTURE OR PREPARATION OF TOBACCO FOR SMOKING OR CHEWING; TOBACCO; SNUFF
    • A24B15/00—Chemical features or treatment of tobacco; Tobacco substitutes, e.g. in liquid form
    • A24B15/18—Treatment of tobacco products or tobacco substitutes
    • A24B15/20—Biochemical treatment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A24—TOBACCO; CIGARS; CIGARETTES; SIMULATED SMOKING DEVICES; SMOKERS' REQUISITES
    • A24B—MANUFACTURE OR PREPARATION OF TOBACCO FOR SMOKING OR CHEWING; TOBACCO; SNUFF
    • A24B15/00—Chemical features or treatment of tobacco; Tobacco substitutes, e.g. in liquid form
    • A24B15/18—Treatment of tobacco products or tobacco substitutes
    • A24B15/24—Treatment of tobacco products or tobacco substitutes by extraction; Tobacco extracts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0044—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on other nitrogen compounds as donors (1.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y107/00—Oxidoreductases acting on other nitrogenous compounds as donors (1.7)
    • C12Y107/01—Oxidoreductases acting on other nitrogenous compounds as donors (1.7) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.7.1)
    • C12Y107/01001—Nitrate reductase (NADH) (1.7.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y107/00—Oxidoreductases acting on other nitrogenous compounds as donors (1.7)
    • C12Y107/01—Oxidoreductases acting on other nitrogenous compounds as donors (1.7) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.7.1)
    • C12Y107/01002—Nitrate reductase [NAD(P)H] (1.7.1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y107/00—Oxidoreductases acting on other nitrogenous compounds as donors (1.7)
    • C12Y107/01—Oxidoreductases acting on other nitrogenous compounds as donors (1.7) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.7.1)
    • C12Y107/01003—Nitrate reductase (NADPH) (1.7.1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y107/00—Oxidoreductases acting on other nitrogenous compounds as donors (1.7)

Abstract

감소된 니트레이트 수준을 갖는 변형된 담배 식물 및 감소된 담배 특이적인 니트로사민(TSNA)을 갖는 변형된 담배 식물로부터 생산되는 담배 제품이 제공된다. 또한, 니트레이트 동화 경로의 유전자 발현을 변경함으로써 담배 제품에서 TSNA를 감소시키는 방법이 제공된다.

Description

니트레이트 동화 경로의 변경을 통한 담배 특이적 니트로소아민의 감소{REDUCING TOBACCO SPECIFIC NITROSAMINES THROUGH ALTERATION OF THE NITRATE ASSIMILATION PATHWAY}
본 발명은 니트레이트 수준이 감소된 변형된 담배 식물, 담배 특이적 니트로소아민(TSNA)이 감소된 변형된 담배 식물로부터 생산되는 담배 제품, 및 니트레이트 동화 경로의 유전자 발현을 변경함으로써 담배 제품에서 TSNA를 감소시키는 방법에 관한 것이다.
버얼리종(burley) 담배와 같은 상업용 담배 식물들은 이들의 잎에 유리(free) 니트레이트가 높은 수준으로 축적되며, 이러한 축적은, 높은 수준의 니트레이트가 담배-특이적인 니트로소아민(TSNA)으로 지칭되는 발암성 화합물의 형성과 연관이 있기 때문에 바람직하지 않다. TSNA는 주로 담배 잎의 경화 동안 생성되는 화합물의 부류이긴 하지만, 부가적인 형성은 후속적인 잎의 가공 및 보관 시 발생할 수 있고, 가능하게는 연소 동안 열합성(pyrosynthesis)을 통해 발생할 수 있다. 경화된 잎에서 발견되는 TSNA 중 2가지인 N-니트로소노르니코틴(NNN) 및 4-(메틸니트로소아미노)-1-(3-피리딜)-1-부타논(NNK)은 국제 암 연구 기관에 의해 그룹 I 발암원(최고 지정(designation))으로 분류된다. 이들 화합물이 다양한 담배-연관 암들과 연루되어 있다는 증거가 상당하기 때문에, 세계 보건 기구 및 해당 분야의 다른 전문가들은, 향후 담배 제품들은 이들 독물(toxicant)의 수준을 감소시켰음을 보장하기 위한 지시들이 시행될 것을 권고하였다. TSNA는 담배 알칼로이드의 니트로소화 생성물을 나타낸다. 음건된(air-cured) 담배에서, 니트라이트가 TSNA 형성에 직접 책임이 있는 작용제라는 일반적인 견해가 존재한다. 그러나, 니트라이트의 세포 독성으로 인해, 내인성 니트라이트 수준은 전형적으로 식물 조직에서 매우 낮다. 대신에, TSNA 형성에 관여하는 니트라이트의 대부분은, 잎 니트레이트 풀(pool)의 일부를 니트라이트로 전환시키는 6주 내지 10주의 경화 과정 동안 세포막 및 세포 기관이 분해됨에 따라, 이러한 기간 동안 잎 표면 상에 거주하는 미생물의 니트레이트 리덕타제(NR) 활성으로부터 유래되는 것으로 여겨진다.
TSNA는 주로 잎의 경화 과정 동안에 형성되고, 담배 알칼로이드의 니트로소화를 수반한다. 경화된 잎에서 TSNA 함량 및 수준을 낮추기 위한 유전학적 전략은 (1) 알칼로이드 전구체(들); 또는 (2) 관여된 니트로소화제(들)를 표적으로 하는 것에 초점을 맞추었다. 담배의 유전적 특성을 변경시키는 수준에서 TSNA를 감소시키려는 대부분의 노력은 TSNA로의 알칼로이드 전구체를 표적으로 하였다. 이러한 전략은 NNN의 알칼로이드 전구체인 노르니코틴의 합성에 책임이 있는 유전자 패밀리의 하향조절을 통해 NNN의 상당한 감소를 제공한다. 그러나, 이러한 전략은 담배 제품에서 발견되는 TSNA 수준을 모두 감소시키지는 않는다. 이에, 담배 제품에서 모든 TSNA 수준을 감소시키는 것이 크게 요망되고 있다.
일 양태에서, 본 발명은 담배 식물로부터 발생되는 담배 특이적 니트로소아민(TSNA)의 수준이 감소된 담배 제품에 관한 것이며, 상기 담배 식물은 (i) 탈조절화된(deregulated) 니트레이트 리덕타제 효소를 인코딩하는 서열을 포함하거나, 이루어지거나 본질적으로 이루어진 폴리뉴클레오타이드; (ii) (i)에 나타낸 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드; (iii) 탈조절화된 니트레이트 리덕타제 효소를 포함하거나, 이루어지거나 본질적으로 이루어진 폴리펩타이드; 또는 (iv) (i)에 나타낸 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 구축물, 벡터 또는 발현 벡터를 포함하도록 변형되며, 여기서, 상기 니트레이트 리덕타제의 발현 또는 활성은 비변형된 대조군 담배 식물과 비교하여 탈조절화되고; 탈조절화된 니트레이트 리덕타제 효소는 (a) SEQ ID NO: 4의 위치 523에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함하는 니트레이트 리덕타제 폴리펩타이드; 또는 (b) SEQ ID NO: 4의 위치 523의 아미노산이 아스파르트산으로 치환되는, SEQ ID NO: 4의 위치 523에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함하는 니트레이트 리덕타제 폴리펩타이드를 포함한다. 탈조절화된 니트레이트 리덕타제 효소는 구성적으로 활성인 니트레이트 리덕타제 효소일 수 있다. 담배 식물은 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) 종으로부터 유래될 수 있으며, 예를 들어, 담배 제품은 니코티아나 타바쿰 종의 담배 식물로부터 유래되는 식물 재료를 포함할 수 있다. 탈조절화된 니트레이트 리덕타제를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 변형된 니트레이트 리덕타제 폴리펩타이드를 인코딩하는 이종성 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. 이종성 폴리뉴클레오타이드는 내인성 니트레이트 리덕타제 유전자에 천연적으로 연관되어 있지 않은 프로모터에 연결될 수 있다. 프로모터는 콜리플라워 모자이크 바이러스(Cauliflower Mosaic Virus) 35S 프로모터일 수 있다. 탈조절화된 니트레이트 리덕타제를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 5의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 탈조절화된 니트레이트 리덕타제를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 게놈 편집 시스템 또는 돌연변이원에 의해 변형된 내인성 니트레이트 리덕타제 유전자를 인코딩할 수 있다. 게놈 편집 시스템은 조작된 CRISPR/Cas-기재 시스템, 조작된 전사 활성화제-유사 효과기 뉴클레아제, 조작된 아연 핑거 뉴클레아제 또는 조작된 메가뉴클레아제를 포함할 수 있다. 담배는 버얼리종 담배일 수 있다. 담배 제품은 니트레이트 리덕타제 효소가 탈조절화되지 않은 대조군 담배 식물 유래의 담배 제품과 비교하여, 담배 특이적 니트로소아민(TSNA) 수준을 감소시켰을 수 있다. 총 TSNA 수준은 담배 식물의 잎에서 측정될 수 있으며, 여기서, (a) 잎은 신선하게 수확되거나; (b) 잎은 경화, 보관 또는 가공되거나; (c) 잎은 음건된다. 담배 제품에서 적어도 하나의 TSNA의 수준은 적어도 하나의 TSNA에 대한 대조군 수준과 비교하여 감소될 수 있으며, 여기서, 적어도 하나의 TSNA는 N-니트로소노르니코틴(NNN), 4-(메틸니트로소아미노)-1-(3-피리딜)-1-부타논(NNK), N-니트로소아나바신(NAB), N-니트로소아나타빈(NAT) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. TSNA의 총 수준은 적어도 50%만큼 감소될 수 있다. TSNA 수준은 담배 식물 잎의 연소로부터 수득되는 연기에서 측정될 수 있다. 연기 중 총 TSNA 수준은 적어도 70%만큼 감소될 수 있다. NNN의 수준은 약 90%만큼 감소될 수 있다. NNK의 수준은 약 66%만큼 감소될 수 있다. NAB의 수준은 약 92%만큼 감소될 수 있다. NAT의 수준은 약 88%만큼 감소될 수 있다. 담배 식물은 변형된 노르니코틴 경로 유전자를 추가로 포함할 수 있다. 변형된 노르니코틴 경로 유전자는 변형된 니코틴 데메틸라제 유전자 또는 시트크롬 P450 유전자를 포함할 수 있다. 담배 식물은 변형된 CYP82E4 유전자 또는 변형된 CYP82E10 유전자를 포함할 수 있다. 변형된 CYP82E4 유전자 또는 변형된 CYP82E10 유전자는 불활성화될 수 있다.
도1은 고등 식물에서 질소 동화 경로의 도식도를 보여준다. 1차 N-동화 경로에서, 니트레이트(NO3 -)는 니트라이트(NO2 -)로 전환된 다음, 후속적으로 암모늄(NH4 +) 및 글루타민으로 전환되고, 이때, 이들 반응에 관여하는 1차 효소는 니트레이트 리덕타제 및 니트라이트 리덕타제(각각 NR 및 NiR), 글루타민 신서타제(GS), 및 글루타메이트 신타제(GOGAT)이다. AMT, 암모늄 트랜스포터; AS, 아스파라긴 신서타제; GDH, NADH-의존적 글루타메이트 데하이드로게나제; ICDH, NADP-의존적 이소시트레이트 데하이드로게나제; NRT, 니트레이트 트랜스포터; TCA, 트리카르복실산 사이클.
도2는 다양한 식물 종들 유래의 니트레이트 리덕타제 아미노산 서열의 위치 523을 함유하는 영역의 정렬을 보여준다.
도 3a 및 도 3b는 35S:GS1, 35S:ICDH, 35S:GOGAT, E4:GOGAT, 35S:tr-NR, E4:tr-NR, 35S:S523D-NR 및 E4:S523D-NR 구축물의 구축물 지도를 보여준다.
도4는 3개의 니트레이트(N) 비옥화(fertilization) 수준 하에 생장된 야생형(WT) 식물 및 35S:tr-NR, 35S:S523D-NR, 35S:GS1, 35S:GOGAT 및 35S:ICDH 유전자이식 주(line)의 생중량(fresh weight)을 보여준다.
도 5a 내지 도 5c는 3개의 니트레이트(N) 비옥화 수준 하에 생장된 WT 식물 및 35S:tr-NR, 35S:S523D-NR, 35S:GS1, 35S:GOGAT 및 35S:ICDH 유전자이식 주의 엽록소 a(Ca, 도 5a), 엽록소 b(Cb, 도 5b) 및 엽록소 a+b(Ca + b, 도 5c) 함량을 보여준다.
도 6a 및 도 6b는 3개의 N-비옥화 수준 하에 생장된 WT 식물 및 35S:tr-NR, 35S:S523D-NR, 35S:GS1, 35S:GOGAT 및 35S:ICDH 유전자이식 주의 잎 내의 총 니트레이트 함량을 보여준다.
도 7은 3개의 N-비옥화 수준 하에 생장된 WT 식물 및 35S:tr-NR, 35S:S523D-NR, 35S:GS1, 35S:GOGAT 및 35S:ICDH 유전자이식 주의 잎 내의 평균 암모니아 함량을 보여준다.
도 8은 중간(8 mM) N-비옥화 및 높은(19 mM) N-비옥화 하에 생장된 35S:GOGAT, 35S:ICDH, 35S:tr-NR, 35S:S523D-NR, 35S:GS1 및 WT 식물의 잎 내의 총 유리(free) 아미노산 함량을 보여준다.
도 9a 내지 도 9d는 중간(8 mM) N-비옥화 및 높은(19 mM) N-비옥화 하에 생장된 WT 식물 및 35S:tr-NR, 35S:S523D-NR, 35S:GS1, 35S:GOGAT 및 35S:ICDH 유전자이식 주의 담배 잎 내의 아르기닌(Arg)(도 9a), 글루타민(Gln)(도 9b), 아스파라긴(Asn)(도 9c) 및 글루타메이트(Glu)(도 9d) 함량을 보여준다.
도 10은 WT 및 35S:S523D-NR 유전자형의 라미나(lamina)로부터 유래되는 대담배 충전제(cut tobacco filler) 내의 평균 니트레이트 및 니코틴 함량을 보여준다.
도 11a 내지 도 11e는 WT 및 35S:S523D-NR 잎의 라미나로부터 제조되는 각초(cut filler) 및 궐련 연기 내의 NAB(도 11a), NAT(도 11b), NNK(도 11c), NNN(도 11d) 및 총 TSNA(도 11e)의 평균 함량을 보여준다.
도 12는 35S CaMV 프로모터 및/또는 에테폰-유도성 CYP82E4(E4) 프로모터의 전사 조절 하에, S523D-NR 구축물을 함유하는 에테폰-처리 담배 잎 내의 니트레이트 농도 및 관련 NR 전사체 수준을 보여준다.
도는 13은 35S:S523D-NR 및 35S:S523D-NR/E4:S523D-NR 유전자이식 주인 GH3-1, GH8-1 및 GH8-5 각각에서 총 알칼로이드 함량(TA % DW)을 보여준다.
도 14는 3개의 35S:S523D-NR 및 35S:S523D-NR/E4:S523D-NR 유전자이식 주인 GH3-1, GH8-1 및 GH8-5 각각에서 니트레이트 함량(NO3 % DW)을 보여준다.
도 15는 3개의 35S:S523D-NR 및 35S:S523D-NR/E4:S523D-NR 유전자이식 주인 GH3-1, GH8-1 및 GH8-5 각각의 각초에서 TSNA(NNN, NNK, NAT 및 NAB, ng/g) 함량을 보여준다.
도 16은 3개의 35S:S523D-NR 및 35S:S523D-NR/E4:S523D-NR 유전자이식 주인 GH3-1, GH8-1 및 GH8-5 각각의 각초로 제조된 궐련의 연기에서 TSNA(NNN, NNK, NAT 및 NAB, ng/g) 함량을 보여준다.
일 양태에서, 본 발명은 담배 제품의 생산 방법에 관한 것이며, 여기서, 변형된 담배 식물 잎의 연소로부터 수득된 연기에서 측정된 TSNA 수준은 비변형된 담배 식물의 연소로부터 수득된 연기에서 측정된 TSNA 수준과 비교하여 감소된다. 이러한 방법은 (a) 담배 식물을, (i) 탈조절화된 니트레이트 리덕타제 효소를 인코딩하는 서열을 포함하거나, 이루어지거나 본질적으로 이루어진 폴리뉴클레오타이드; (ii) (i)에 나타낸 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드; (iii) 탈조절화된 니트레이트 리덕타제 효소를 포함하거나, 이루어지거나 본질적으로 이루어진 폴리펩타이드; 또는 (iv) (i)에 나타낸 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 구축물, 벡터 또는 발현 벡터를 포함하도록 변형하는 단계로서, 여기서, 상기 니트레이트 리덕타제의 발현 또는 활성은 비변형된 대조군 담배 식물과 비교하여 탈조절화되고; 탈조절화된 니트레이트 리덕타제 효소는 (I) SEQ ID NO: 4의 위치 523에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함하는 니트레이트 리덕타제 폴리펩타이드; 또는 (II) SEQ ID NO: 4의 위치 523의 아미노산이 아스파르트산으로 치환되는, SEQ ID NO: 4의 위치 523에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함하는 니트레이트 리덕타제 폴리펩타이드를 포함하는, 단계; (b) 상기 변형된 담배 식물로부터 담배 잎을 수확하는 단계; 및 (c) 수확된 잎으로부터 담배 제품을 생산하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 또한, 담배 식물로부터 발생되는 담배 특이적 니트로소아민(TSNA)의 수준이 감소된 담배 제품을 개시하며, 상기 담배 식물은 (i) 탈조절화된 니트레이트 리덕타제 효소를 인코딩하는 서열을 포함하거나, 이루어지거나 본질적으로 이루어진 폴리뉴클레오타이드; (ii) (i)에 나타낸 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드; (iii) 탈조절화된 니트레이트 리덕타제 효소를 포함하거나, 이루어지거나 본질적으로 이루어진 폴리펩타이드; 또는 (iv) (i)에 나타낸 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 구축물, 벡터 또는 발현 벡터를 포함하도록 변형되며, 여기서, 상기 니트레이트 리덕타제의 발현 또는 활성은 비변형된 대조군 담배 식물과 비교하여 탈조절화되고; 탈조절화된 니트레이트 리덕타제 효소는 (a) 절단된(truncated) 니트레이트 리덕타제 폴리펩타이드; (b) N-말단 절단을 포함하는 니트레이트 리덕타제 폴리펩타이드; 또는 (c) 56개의 아미노산의 N-말단 절단을 포함하는 니트레이트 리덕타제 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 또한, 담배 제품의 생산 방법을 개시하며, 여기서, 변형된 담배 식물 잎의 연소로부터 수득된 연기에서 측정된 TSNA 수준은 비변형된 담배 식물의 연소로부터 수득된 연기에서 측정된 TSNA 수준과 비교하여 감소되며, 이러한 방법은 (a) 담배 식물을, (i) 탈조절화된 니트레이트 리덕타제 효소를 인코딩하는 서열을 포함하거나, 이루어지거나 본질적으로 이루어진 폴리뉴클레오타이드; (ii) (i)에 나타낸 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드; (iii) 탈조절화된 니트레이트 리덕타제 효소를 포함하거나, 이루어지거나 본질적으로 이루어진 폴리펩타이드; 또는 (iv) (i)에 나타낸 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 구축물, 벡터 또는 발현 벡터를 포함하도록 변형하는 단계로서, 여기서, 상기 니트레이트 리덕타제의 발현 또는 활성은 비변형된 대조군 담배 식물과 비교하여 탈조절화되고; 탈조절화된 니트레이트 리덕타제 효소는 (I) 절단된 니트레이트 리덕타제 폴리펩타이드; (II) N-말단 절단을 포함하는 니트레이트 리덕타제 폴리펩타이드; 또는 (III) 56개의 아미노산의 N-말단 절단을 포함하는 니트레이트 리덕타제 폴리펩타이드를 포함하는, 단계; (b) 상기 변형된 담배 식물로부터 담배 잎을 수확하는 단계; 및 (c) 수확된 잎으로부터 담배 제품을 생산하는 단계를 포함한다.
탈조절화된 니트레이트 리덕타제를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 7의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 니트레이트 동화 경로를 변경함으로써 변형된 담배 식물의 잎에서 유리 니트레이트 수준을 감소시켜, 변형된 담배 식물 유래의 경화된 잎에서 모든 TSNA 수준을 감소시키기 위한 신규 전략에 관한 것이다. 담배 잎의 유리 니트레이트 수준, 및 총 TSNA 및/또는 특이적인 TSNA를 비롯한 TSNA 함량 및 수준은 탈조절화된 니트레이트 리덕타제를 사용하여 감소되었다. 니트로소화제를 표적으로 하고 잎 내에 저장되는 유리 니트레이트의 양을 감소시킴으로써, 담배 제품 내 발암성 TSNA의 생성은 최소화된다. 이러한 기술은, 현재의 관행을 사용하여 가능한 것보다 TSNA의 수준이 더 낮은 담배 제품을 생산하도록 도울 수 있는 TSAN 감소를 위한 신규 전략을 나타낸다.
탈조절화된 니트레이트 리덕타제는 예를 들어, 문헌[Nussaume 외, Plant Cell 7:611-621 (1995)]뿐만 아니라 문헌[Lea 외, Plant Physiology 140:1085-1094 (2006)]에 의해 니토티아나 플럼바기노폴리아 ( Nicotiana plumbaginofolia )에 기술되어 있다. 엔. 플럼바기노폴리아에서 관찰된 니트레이트 수준의 감소는 본원에 제시된 데이터에서 엔. 타바쿰에서 관찰된 것보다 상당히 더 낮다. 더욱이, 탈조절화된 니트레이트 리덕타제로 인한 TSNA 수준의 감소는 이전에는 언급된 바가 없다.
본 단락 및 본원의 전체 개시내용에 사용된 바와 같은 단락 앞머리는 단지 구조 목적을 위한 것이며, 제한하려는 것이 아니다.
1. 정의
다르게 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술적인 용어 및 과학적인 용어들은 당업자가 보편적으로 의미하는 것과 동일한 의미를 가진다. 상충하는 경우, 정의를 비롯한 본 문헌이 좌우할 것이다. 바람직한 방법 및 재료는 하기에 기술되어 있으며, 그렇더라도 본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있다. 본원에서 언급된 모든 공개문헌, 특허 출원, 특허 및 다른 참조문헌들은 그 전체가 원용에 의해 포함된다. 본원에 개시된 재료, 방법 및 예들은 단지 예시적일 뿐, 제한하려는 것이 아니다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "포함하다(포함한다)," "수반하다(수반한다)," "가진," "가진다," "할 수 있다," "함유하다(함유한다)" 및 이들의 변형된 표현들은 부가적인 작용 또는 구조의 가능성을 배제하지 않는 개방형의 연결(transitional) 구어, 용어 또는 단어이고자 한다. 단수형("a," "an" 및 "the")은 문맥상 명확하게 다르게 지시하지 않는 한, 복수형을 포함한다. 본 개시내용은 또한, 본원에 제시된 실시형태 또는 요소를 "포함하는," "이루어지는" 및 "본질적으로 이루어지는" 다른 실시형태들이 명쾌하게 나타나 있거나 나타나 있지 않든지 간에 이러한 다른 실시형태들을 고려한다. 본원에서 수치 범위의 언급을 위해, 이들 사이의 각각의 중간 수(intervening number)는 동일한 정밀도를 가지고 있으며 명백하게 고려된다. 예를 들어, 6 내지 9의 범위에 있어서, 6 및 9 외에도 수 7 및 8이 고려되고, 6.0 내지 7.0의 범위에 있어서, 수 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9 및 7.0이 명백하게 고려된다.
명세서 및 청구항 전체에서 사용되는 바와 같이, 하기 용어들은 하기 의미들을 가진다:
본원에 사용된 바와 같이, "코딩 서열" 또는 "인코딩 핵산"은 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산(RNA 분자 또는 DNA 분자)을 의미한다. 코딩 서열은 추가로, 핵산이 투여되는 개체 또는 포유류의 세포에서 발현을 지시할 수 있는 프로모터 및 폴리아데닐화 신호를 비롯한 조절 요소에 작동적으로 연결된 개시 신호 및 종결 신호를 추가로 포함할 수 있다. 코딩 서열은 코돈 최적화될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "상보체(complement)" 또는 "상보적(complementary)"은, 핵산이 핵산 분자의 뉴클레오타이드들 또는 뉴클레오타이드 유사체들 사이의 왓슨-크릭(예, A-T/U 및 C-G) 또는 후그스틴(Hoogsteen) 염기쌍을 의미할 수 있음을 의미한다. "상보성"은, 2개의 핵산 서열들이 서로 역평행하게 정렬된 경우, 각각의 위치의 뉴클레오타이드 염기들이 상보적이게 될, 이들 핵산 서열들 사이에 공유된 특성을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "구축물"은 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 이중-가닥, 재조합 핵산 단편을 지칭한다. 구성체는 상보적인 "센스 또는 암호화 가닥"으로 염기쌍을 이룬 "주형 가닥(template strand)"을 포함한다. 주어진 구축물은 2개의 가능한 배향인, 벡터 - 예컨대 발현 벡터 내에 위치한 프로모터의 배향에 대하여 동일한(또는 센스) 배향 또는 반대의(또는 안티-센스) 배향으로 벡터 내에 삽입될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 대조군 식물 또는 대조군 식물 세포의 맥락에서 용어 "대조군"은, 니트레이트 리덕타제의 발현 또는 활성이 변형(예, 증가 또는 감소)되지 않은 식물 또는 식물 세포를 의미하고, 따라서 대조군은 니트레이트 리덕타제의 발현 또는 활성이 변형된 식물과의 비교를 제공할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "대조군 식물"은, 시험 파라미터를 제외한 모든 파라미터에서 시험 식물 또는 변형된 식물과 실질적으로 동등한 식물이다. 예를 들어, 특정한 실시형태에서, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드가 도입된 식물을 지칭할 때, 대조군 식물은 이러한 폴리뉴클레오타이드가 도입되지 않은 동등한 식물이다. 특정한 실시형태에서, 대조군 식물은 대조군 폴리뉴클레오타이드가 도입된 동등한 식물이다. 이러한 경우, 대조군 폴리뉴클레오타이드는 식물에 대해 표현형 효과를 거의 미치지 않거나 전혀 미치지 않을 것으로 예상되는 폴리뉴클레오타이드이다. 대조군 식물은 빈(empty) 벡터를 포함할 수 있다. 대조군 식물은 야생형 식물에 상응할 수 있다. 대조군 식물은 널 분리물(null segregant)일 수 있으며, 여기서, T1 분리물은 이식유전자를 더 이상 갖지 않는다.
본원에서 상호호환적으로 사용되는 바와 같이, "공여자 DNA" 또는 "공여자 주형"은 관심 유전자의 적어도 일부를 포함하는 이중-가닥 DNA 단편 또는 분자를 지칭한다. 공여자 DNA는 전체-기능성 단백질 또는 부분-기능성 단백질을 인코딩할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "내인성 유전자"는 유기체의 게놈으로부터 기원하고 유전 물질의 변화, 예컨대 상실, 획득 또는 교환을 받지 않은 유전자를 지칭한다. 내인성 유전자는 정상적인 유전자 전파 및 유전자 발현을 수행한다.
본원에 사용된 바와 같이, "인핸서 서열"은 유전자 발현을 증가시킬 수 있는 서열을 지칭한다. 이들 서열은 전사되는 영역의 상류, 인트론 내 또는 하류에 위치할 수 있다. 전사되는 영역은 프로모터부터 전사 종결 영역까지 엑손 및 개입 인트론으로 이루어진다. 유전자 발현의 증강은 다양한 메커니즘을 통해 달성될 수 있으며, 이러한 메커니즘으로는 전사 효율의 증가, 성숙 mRNA의 안정화 및 번역 증강이 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
본원에 사용된 바와 같이, "발현"은 기능성 생성물의 생성을 지칭한다. 예를 들어, 핵산 단편의 발현은 핵산 단편의 전사(예, mRNA 또는 기능성 RNA를 초래하는 전사) 및/또는 전구체 또는 성숙 단백질로의 mRNA의 번역을 지칭할 수 있다. "과발현"은, 동일한 실험으로부터 널 격리(또는 비-유전자이식) 유기체에서의 생성 수준을 초과하는, 유전자이식 유기체에서의 유전자 생성물의 생성을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 기능성 및 "전체-기능성"은 생물학적 활성을 가진 단백질을 기술한다. "기능성 유전자"는 mRNA로 전사되어, 기능성 단백질로 번역되는 유전자를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "유전학적 구축물"은, 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 분자 또는 RNA 분자를 지칭한다. 코딩 서열은, 핵산 분자가 투여되는 개체의 세포에서 발현을 지시할 수 있는 프로모터 및 폴리아데닐화 신호를 비롯한 조절 요소에 작동적으로 연결된 개시 신호 및 종결 신호를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "게놈 편집"은, 내인성 폴리펩타이드 또는 단백질을 인코딩하는 내인성 유전자를 변화시켜, 절단된 내인성 단백질 또는 아미노산 치환을 가진 내인성 단백질의 단백질 발현이 수득되도록 하는 것을 지칭한다. 게놈 편집은, 표적화된 내인성 유전자의 영역을 대체하거나, 전체 내인성 유전자를 상동성-인도 복구(HDR)와 같은 복구 메커니즘을 이용하여 절단 또는 아미노산 치환을 가진 유전자의 복사본으로 대체하는 것을 포함할 수 있다. 게놈 편집은 또한, 내인성 유전자에 이중 가닥 절단부를 발생시킨 다음, 비-상동성 말단 접합(non-homologous end joining; NHEJ)을 사용하여 복구시킴으로써, 내인성 유전자에 아미노산 치환을 발생시키는 것을 포함할 수 있다. NHEJ는 아미노산 치환을 발생시킬 수 있는 복구 동안에 적어도 하나의 염기쌍을 첨가하거나 결실시킬 수 있다. 게놈 편집은 또한, 2개의 뉴클레아제 표적 부위들 사이에서 절단을 형성하기 위해 동일한 DNA 가닥 상에서 2개의 뉴클레아제를 동시에 작동시킴으로써 유전자 분절을 결실시키고, DNA 절단부를 NHEJ에 의해 복구시키는 것을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 서열과 관련하여 "이종성"은, 외래 종으로부터 기원하거나, 동일한 종으로부터 기원한다면 정교한 인간 개입에 의해 조성물 및/또는 게놈 유전자좌에서 이의 네이티브(native) 형태로부터 실질적으로 변형된 서열을 의미한다.
본원에서 상호호환적으로 사용되는 바와 같이, "상동성-인도 복구" 또는 "HDR"은, DNA의 상동성 조각이 핵에서, 대체로 세포 주기 중 G2기 및 S기에 존재할 때, 이중 가닥 DNA 병변을 복구시키기 위한 세포에서의 메커니즘을 지칭한다. HDR은 복구를 가이드하기 위해 공여자 DNA 또는 공여자 주형을 사용하고, 전체 유전자의 표적화된 첨가를 비롯한 특이적인 서열 변화를 게놈에 형성하는 데 사용될 수 있다. 공여자 주형이 부위 특이적인 뉴클레아제와 함께 제공된다면, 세포 머시너리(cellular machinery)는 절단부를 상동성 재조합에 의해 복구시킬 것이며, 이는 DNA 절단의 존재 시 수 자릿수(several orders of magnitude) 증강된다. 상동성 DNA 조각이 부재하는 경우, 비-상동성 말단 접합이 대신 발생할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "상동성" 또는 "유사성"은 서열 정렬에 의해 비교되는 2개의 폴리펩타이드들 사이 또는 2개의 핵산 분자들 사이에서의 서열 유사도를 지칭한다. 비교되는 두 개의 별개의 핵산 서열 사이의 상동성 정도는 상응하는 위치에서 동일하거나, 일치하는 뉴클레오티드의 수의 함수이다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩타이드 서열의 맥락에서 본원에 사용된 바와 같이, "동일한(identical)" 또는 "동일성(identity)"은 서열이 명시된 영역에 걸쳐 동일한 잔기들을 명시된 백분율로 가짐을 의미한다. 백분율은, 2개의 서열을 최적으로 정렬하고, 2개의 서열을 명시된 영역에 걸쳐 비교한 다음, 2개의 서열에서 동일한 잔기가 나타나는 위치의 수를 확인하여 매칭된 위치의 수를 수득하고, 매칭된 위치의 수를 명시된 영역 내의 위치의 총수로 나눈 다음, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 수득함으로써 계산될 수 있다. 2개의 서열의 길이가 상이하거나, 정렬로 인해 하나 이상의 스태거드 말단(staggered end)이 생성되고 비교되는 명시된 영역이 오로지 단일 서열만 포함하는 경우, 단일 서열의 잔기는 계산식의 분자(numerator)가 아니라 분모(denominator)에 포함된다. DNA와 RNA를 비교할 때, 티미딘(T) 및 우라실(U)은 동등한 것으로 간주될 수 있다. 동일성은 수동적으로 수행되거나, ClustalW, ClustalX, BLAST, FASTA 또는 Smith-Waterman와 같은 컴퓨터 서열 알고리즘을 사용함으로써 수행될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "증가하다" 또는 "증가되는"은 양 또는 활성, 예컨대 비제한적으로 니트레이트 수준 또는 TSNA 수준의 약 10% 내지 약 99%의 증가, 또는 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 100%, 적어도 150% 또는 적어도 200% 이상 또는 그보다 더 많은 증가를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "저해하다" 또는 "저해되는"은 양 또는 활성, 예컨대 비제한적으로 폴리펩타이드 활성, 전사 활성 및/또는 단백질 발현의 약 98% 내지 약 100%의 감소, 또는 적어도 98%, 적어도 99%, 그러나 특히 100%의 감소를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "도입되는"은 핵산(예, 발현 구축물) 또는 단백질을 세포 내에 제공하는 것을 의미한다. 도입된다는 것은, 세포의 게놈 내에 핵산이 혼입될 수 있는 진핵 세포 내로의 핵산의 혼입을 지칭하는 것을 포함하고, 세포에의 핵산 또는 단백질의 일시적인 제공을 지칭하는 것을 포함한다. 도입된다는 것은, 안정한 형질변환 방법 또는 일시적인 형질변환 방법, 뿐만 아니라 유성 교배를 지칭하는 것을 포함한다. 따라서, 핵산 단편(예, 재조합 DNA 구축물/발현 구축물)을 세포 내에 삽입하는 맥락에서 "도입되는"은 "형질감염" 또는 "형질변환" 또는 "형질도입"을 의미하고, 세포의 게놈(예, 염색체, 플라스미드, 플라스티드 또는 미토콘드리아 DNA) 내에 핵산 단편이 혼입된 다음, 자동 레플리콘(autonomous replicon)으로 전환되거나 일시적으로 발현(예, 형질감염된 mRNA)될 수 있는 진핵 세포 내로의 핵산 단편의 혼입을 지칭하는 것을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "단리된," "정제된" 또는 "생물학적으로 순수한"은, 물질을 이의 네이티브 상태로 발견되는 바와 같이 통상적으로 수반하는 구성성분들을 실질적으로 또는 본질적으로 포함하지 않는 물질을 지칭한다. 순도 및 균질성은 전형적으로, 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동 또는 고성능 액체 크로마토그래피와 같은 분석 화학 기술을 사용하여 확인된다. 조제물에 존재하는 주요 화학종인 단백질은 실질적으로 정제된다. 특히, 본 발명의 단리된 핵산은, 요망되는 유전자의 측면에 존재하며 요망되는 단백질 이외의 단백질을 인코딩하는 개방형 해독틀로부터 분리된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "정제된"은, 핵산 또는 단백질이 전기영동 젤에서 본질적으로 하나의 밴드를 발생시킴을 가리킨다. 특히, 이는, 핵산 또는 단백질이 적어도 85% 순수, 보다 바람직하게는 적어도 95% 순수, 가장 바람직하게는 적어도 99% 순수함을 의미한다.
단리된 폴리뉴클레오타이드는, 이들 폴리뉴클레오타이드가 천연적으로 발생하는 숙주 세포로부터 정제될 수 있다. 당업자에게 알려진 종래의 핵산 정제 방법이 사용되어, 단리된 폴리뉴클레오타이드를 수득할 수 있다. 또한, 이러한 용어는 재조합 폴리뉴클레오타이드 및 화학적으로 합성된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "니트레이트 리덕타제"는 니트레이트(NO3 -)를 니트라이트(NO2 -)로 환원시키는 효소를 지칭한다. 용어 "탈조절화된 니트레이트 리덕타제 효소"는 전형적으로, 비변형된 대조군 담배 식물에서 니트레이트 리덕타제 발현 또는 활성을 조절하거나 제약하는 하나 이상의 조절 메커니즘(예, 전사 조절 메커니즘, 전사-후 조절 메커니즘 또는 번역-후 조절 메커니즘)을 받지 않는 니트레이트 리덕타제 효소를 지칭한다. 따라서, "상기 니트레이트의 발현 또는 활성은 탈조절화된다"는 전형적으로, 비변형된 대조군 담배 식물과 비교하여 변형된 담배 식물에서 니트레이트 리덕타제 발현 또는 활성이 증가됨을 의미한다. 용어 "탈조절화된 니트레이트 리덕타제 폴리뉴클레오타이드"는 니코티아나 타바쿰 유래의 변형된 니트레이트 리덕타제(NR)를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고,SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 7의 서열과 적어도 약 60%, 61%, 62%, 63% 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 가진 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 7 폴리뉴클레오타이드 변이체와 실질적인 상동성(즉, 서열 유사성) 또는 실질적인 동일성을 가진 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나, 이루어지거나 본질적으로 이루어진 폴리뉴클레오타이드; SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 7의 단편을 포함한 폴리뉴클레오타이드의 단편; 및 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 7의 상응하는 단편과적어도 약 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가진 이에 실질적인 상동성(즉, 서열 유사성) 또는 실질적인 동일성을 가진 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 7의 단편을 포함한다. 단편은 길이가 적어도 약 20개, 50개, 70개, 100개, 200개, 300개, 500개, 1000개 또는 2000개 뉴클레오타이드일 수 있으며, 예를 들어, 탈조절화된 니트레이트 리덕타제 폴리뉴클레오타이드는(i) SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 7의 적어도 약 20개, 50개, 70개, 100개, 200개, 300개, 500개, 1000개 또는 2000개 뉴클레오타이드, 또는 (ii) SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 7의 적어도 약 20개, 50개, 70개, 100개, 200개, 300개, 500개, 1000개 또는 2000개 뉴클레오타이드와 적어도 약 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가진 서열을 포함할 수 있다. 전형적으로, 단편은 전장 서열의 생물학적 활성을 보유할 수 있으며, 예를 들어, 단편은 니트레이트 리덕타제 활성, 전형적으로 변형 또는 탈조절화된 니트레이트 리덕타제 활성을 인코딩한다. 니트레이트 리덕타제 폴리뉴클레오타이드는 또한, 니트레이트 리덕타제로서 작용하는 폴리펩타이드를 인코딩하기 위해 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 7과의 동일성 또는 유사성을 충분하거나 실질적인 정도로 포함하는 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 용어 "니트레이트 리덕타제 폴리뉴클레오타이드"는, 본원에서 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 3으로 지정된 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나, 이루어지거나 본질적으로 이루어진 뉴클레오타이드의 중합체를 지칭한다.
용어 "탈조절화된 니트레이트 리덕타제 폴리펩타이드"는 니코티아나 타바쿰 유래의 변형된 니트레이트 리덕타제(NR)를 포함하고,SEQ ID NO: 6 또는 SEQ ID NO: 8과 실질적인 상동성(즉, 서열 유사성) 또는 실질적인 동일성을 가진 폴리펩타이드, 또는 SEQ ID NO: 6 또는 SEQ ID NO: 8의 서열과 적어도 약 60%, 61%, 62%, 63% 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 가진 폴리펩타이드 변이체를 포함하거나, 이루어지거나 본질적으로 이루어진 폴리펩타이드; SEQ ID NO: 6 또는 SEQ ID NO: 8의 단편을 포함한 폴리펩타이드의 단편; 및 SEQ ID NO: 6 또는 SEQ ID NO: 8의 상응하는 단편과 SEQ ID NO: 6 또는 SEQ ID NO: 8의 상응하는 단편과 적어도 약 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가진 이에 실질적인 상동성(즉, 서열 유사성) 또는 실질적인 동일성을 가진 SEQ ID NO: 6 또는 SEQ ID NO: 8의 단편을 포함한다. 단편은 길이가 적어도 약 10개, 30개, 50개, 100개, 200개, 300개, 400개, 500개, 600개, 700개, 800개 또는 900개 아미노산 잔기일 수 있으며, 예를 들어, 탈조절화된 니트레이트 리덕타제 폴리펩타이드는(i) SEQ ID NO: 6 또는 SEQ ID NO: 8의 적어도 약 10개, 30개, 50개, 100개, 200개, 300개, 400개, 500개, 600개, 700개, 800개 또는 900개 아미노산, 또는 (ii) SEQ ID NO: 6 또는 SEQ ID NO: 8의 적어도 약 10개, 30개, 50개, 100개, 200개, 300개, 400개, 500개, 600개, 700개, 800개 또는 900개 아미노산과 적어도 약 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가진 서열을 포함할 수 있다. 전형적으로, 단편은 전장 서열의 생물학적 활성을 보유할 수 있으며, 예를 들어, 단편은 니트레이트 리덕타제 활성, 전형적으로 변형 또는 탈조절화된 니트레이트 리덕타제 활성을 포함한다. 니트레이트 리덕타제 폴리펩타이드는 또한, 니트레이트 리덕타제로서 작용하는 SEQ ID NO: 6 또는 SEQ ID NO: 8과의 동일성 또는 유사성을 충분하거나 실질적인 정도로 포함하는 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 용어 "니트레이트 리덕타제 폴리펩타이드"는, 본원에서 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4로 지정된 폴리펩타이드를 포함하거나, 이루어지거나 본질적으로 이루어진 아미노산의 중합체를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "비-상동성 말단 접합(NHEJ) 경로"는 상동성 주형의 필요 없이도, 절단부 말단들을 직접 연결함으로써 DNA에서 이중-가닥 절단부를 복구하는 경로를 지칭한다. NHEJ에 의한 DNA 말단들의 주형-독립적 재-연결은, DNA 절단부 지점에 랜덤 미세-삽입 및 미세-결실(indel)을 도입하는 확률적인 오류-유발(error-prone) 복구 과정이다. 이러한 방법은 표적화된 유전자 서열의 해독틀을 의도적으로 방해하거나, 결실시키거나 변경하는 데 사용될 수 있다. NHEJ는 전형적으로, 복구를 가이드하기 위해 미세상동성(microhomology)이라고 하는 짧은 상동성 DNA 서열을 사용한다. 이들 미세상동성은 종종 이중-가닥 절단부의 말단 상의 단일-가닥 오버행에 존재한다. 오버행이 완벽하게 융화성(compatible)인 경우, NHEJ는 통상 절단부를 정확하게 복구하지만, 뉴클레오타이드의 상실을 초래하는 부정확한 복구 또한 아직 발생할 수 있는데, 그러나, 이러한 부정확한 복구는 오버행이 융화성이 아닐 때에는 훨씬 더 보편적이다. 본원에 사용된 바와 같이, "뉴클레아제 매개 NHEJ"는, 뉴클레아제가 이중 가닥 DNA를 자른 후 개시되는 NHEJ를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "N-말단 절단"은 N-말단에서 또는 N-말단 근처에서의 아미노산의 결실을 의미한다. 일부 실시형태에서, 아미노산의 결실은 폴리펩타이드의 N-말단 끝(N-terminal end)에서 발생할 수 있으며, 즉, 결실은 전사된 단백질 또는 성숙 단백질의 첫 아미노산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 아미노산의 결실은 폴리펩타이드의 N-말단 끝 내에서 발생할 수 있으며, 즉, 결실은 전사된 단백질 또는 성숙 단백질의 첫 아미노산을 포함하지 않으나 폴리펩타이드의 처음 절반 내에서 발생한다.
본원에 사용된 바와 같이, "핵산" 또는 "올리고뉴클레오타이드" 또는 "폴리뉴클레오타이드"는 함께 공유 연결된 적어도 2개의 뉴클레오타이드를 의미한다. 단일 가닥의 묘사는 또한, 상보적 가닥의 서열을 규정한다. 따라서, 핵산은 또한, 묘사된 단일 가닥의 상보적 가닥을 포함한다. 핵산의 많은 변이체들은 주어진 핵산과 동일한 목적을 위해 사용될 수 있다. 따라서, 핵산은 또한, 실질적으로 동일한 핵산 및 이의 상보체를 포함한다. 단일 가닥은 엄격한 혼성화 조건 하에 표적 서열에 혼성화할 수 있는 프로브를 제공한다. 따라서, 핵산은 또한, 엄격한 혼성화 조건 하에 혼성화하는 프로브를 포함한다.
핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있거나, 이중 가닥 서열 및 단일 가닥 서열 둘 다의 일부를 함유할 수 있다. 핵산은 DNA, RNA 또는 하이브리드일 수 있으며, DNA는 게놈 DNA 및 cDNA 둘 다일 수 있으며, 여기서, 핵산은 데옥시리보뉴클레오타이드와 리보뉴클레오타이드의 조합, 및 우라실, 아데닌, 티미딘, 시토신, 구아닌, 이노신, 크산틴, 하이포크산틴, 이소시토신 및 이소구아닌을 비롯한 염기들의 조합을 함유할 수 있다. 핵산은 화학적 합성 방법 또는 재조합 방법에 의해 수득될 수 있다.
상보적 단편에 혼성화하는 단일-가닥 DNA의 특이성은 반응 조건의 "엄격성"에 의해 결정된다(문헌[Sambrook 외., Molecular Cloning and Laboratory Manual, Second Ed., Cold Spring Harbor (1989)]). DNA 듀플렉스를 형성하는 경향이 감소함에 따라 혼성화 엄격성은 증가한다. 핵산 혼성화 반응에서, 엄격성은 특이적인 혼성화(높은 엄격성)를 선호하기 위해 선택될 수 있으며, 이는 예를 들어, 라이브러리로부터 전장 클론을 동정하는 데 사용될 수 있다. 덜-특이적인 혼성화(낮은 엄격성)는 관련이 있으나 정확하지 않은(상동성이지만 동일하지 않은) DNA 분자 또는 분절을 동정하는 데 사용될 수 있다.
DNA 듀플렉스는 (1) 상보적 염기쌍의 수; (2) 염기쌍의 유형; (3) 반응 혼합물의 염 농도(이온 강도); (4) 반응 온도; 및 (5) DNA 듀플렉스 안정성을 감소시키는 특정한 유기 용매, 예컨대 포름아미드의 존재에 의해 안정화된다. 일반적으로, 프로브가 길수록, 적절한 어닐링에 필요한 온도는 더 높아진다. 보편적인 접근법은 온도를 다양하게 하는 것이며; 더 높은 상대 온도는 보다 엄격한 반응 조건을 초래한다.
"엄격한 조건" 하에 혼성화하기 위해, 서로 적어도 60% 상동성인 뉴클레오타이드 서열이 혼성화된 채로 남아 있는 혼성화 프로토콜이 기술된다. 일반적으로, 엄격한 조건은, 규정된 이온 강도 및 pH에서 특이적인 서열에 대한 열적 용융점(Tm)보다 약 5℃ 더 낮도록 선택된다. Tm은, 표적 서열에 상보적인 프로브의 50%가 (규정된 이온 강도, pH 및 핵산 농도 하에) 표적 서열에 동등하게 혼성화하는 온도이다. 표적 서열이 일반적으로 과량으로 존재하기 때문에, Tm에서 프로브의 50%는 동등하게 점유된다.
"엄격한 혼성화 조건"은 프로브, 프라이머 또는 올리고뉴클레오타이드가 이의 표적 서열(예, SEQ ID NO: 1, 3, 5 또는 7)에만 혼성화할 수 있는 조건이다. 엄격한 조건은 서열-의존적이고, 상이할 것이다. 엄격한 조건은, (1) 낮은 이온 강도 및 고온 세척, 예를 들어 15 mM 소듐 클로라이드, 1.5 mM 소듐 시트레이트, 0.1% 소듐 도데실 설페이트, 50℃; (2) 혼성화 동안의 변성화제, 예를 들어, 50%(v/v) 포름아미드, 0.1% 소 혈청 알부민, 0.1% Ficoll, 0.1% 폴리비닐피롤리돈, 50 mM 소듐 포스페이트 완충제(750 mM 소듐 클로라이드, 75 mM 소듐 시트레이트; pH 6.5), 42℃; 또는 (3) 50% 포름아미드를 포함한다. 세척은 전형적으로 또한, 42℃에서 5xSSC(0.75 M NaCl, 75 mM 소듐 시트레이트), 50 mM 소듐 포스페이트(pH 6.8), 0.1% 소듐 파이로포스페이트, 5x덴하르트 용액(Denhardt's solution), 소니케이션된 연어 정자 DNA(50 ㎍/mL), 0.1% SDS 및 10% 덱스트란 설페이트에 의한 세척, 42℃에서 0.2xSSC(소듐 클로라이드/소듐 시트레이트) 및 55℃에서 50% 포름아미드 중에서의 세척, 후속해서 55℃에서 EDTA를 함유하는 0.1xSSC로 이루어진 고-엄격성 세척을 포함한다. 바람직하게는, 조건은, 서로 적어도 약 65%, 70%, 75%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 상동성인 서열들이 전형적으로 서로 혼성화된 채로 남아 있는 조건이다. 이들 조건은 예로서 제시될 뿐, 제한하려는 것이 아니다.
"엄격성이 중간인 조건"은 덜 엄격하여, 폴리뉴클레오타이드가 표적 서열(예, SEQ ID NO: 1, 3, 5 또는 7)의 전체, 단편, 유도체 또는 유사체에 혼성화할 세척 용액 및 혼성화 조건을 사용한다. 일례는 55℃에서 6xSSC, 5x덴하르트 용액, 0.5% SDS 및 100 ㎍/mL 변성된 연어 정자 DNA에서 혼성화한 다음, 37℃에서 1xSSC, 0.1% SDS에서 1회 이상 세척하는 것을 포함한다. 온도, 이온 강도 등은 프로브 길이와 같은 실험 인자에 맞춰서 조정될 수 있다. 다른 엄격성이 중간인 조건은 기술되어 있다(문헌[Ausubel 외, Current Protocols in Molecular Biology, Volumes 1-3, John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, N.J. (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual, Stockton Press, New York, N.Y. (1990); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, 2nd edition, John Wiley & Sons, New York, N.Y. (1988)]).
"엄격성이 낮은 조건"은 엄격성이 중간인 조건보다 덜 엄격하여, 폴리뉴클레오타이드가 표적 서열(예, SEQ ID NO: 1, 3, 5 또는 7)의 전체, 단편, 유도체 또는 유사체에 혼성화할 세척 용액 및 혼성화 조건을 사용한다. 엄격성이 낮은 혼성화 조건의 비제한적인 예는 40℃에서 35% 포름아미드, 5xSSC, 50 mM Tris HCl(pH 7.5), 5 mM EDTA, 0.02% PVP, 0.02% Ficoll, 0.2% BSA, 100 ㎍/mL 변성된 연어 정자 DNA, 10%(wt/vol) 덱스트란 설페이트에서 혼성화한 다음, 50℃에서 2xSSC, 25 mM Tris HCl(pH 7.4), 5 mM EDTA 및 0.1% SDS에서 1회 이상 세척하는 것을 포함한다. 잡종(cross-species) 혼성화에 대한 조건과 같이 엄격성이 낮은 다른 조건들은 잘 기술되어 있다(문헌[Ausubel 외, 1993; Kriegler, 1990]).
본원에 사용된 바와 같이, "작동적으로 연결된"은, 유전자의 발현이 이러한 유전자가 공간적으로 연결되어 있는 프로모터의 조절 하에 있음을 의미한다. 프로모터는 이의 조절 하에 유전자의 5'(상류) 또는 3'(하류)에 위치할 수 있다. 프로모터와 유전자 사이의 거리는, 해당 프로모터와, 프로모터가 유래되는 유전자에서 프로모터가 조절하는 유전자 사이의 거리와 대략 동일할 수 있다. 당업계에 알려진 바와 같이, 이러한 거리의 변화는 프로모터 기능의 상실 없이 맞춰질 수 있다. "작동적으로 연결된"은 단일 단편에서 핵산 단편이 결합되어, 하나의 단편의 기능이 또 다른 단편에 의해 조절되는 것을 지칭한다. 예를 들어, 프로모터는 핵산 단편의 전사를 조절할 수 있을 때, 해당 핵산 단편과 작동적으로 연결된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "식물"은 생활 주기 또는 발달 중 임의의 단계에 있는 임의의 식물 및 이의 자손을 지칭한다. 한 구현예에서, 식물은 "담배 식물"로서, 니코티아나(Nicotiana) 속에 속하는 식물을 의미한다. "식물"은 전체 식물, 식물 기관, 식물 조직, 식물 주아(propagule), 종자 및 식물 세포 및 이들의 자손의 지칭을 포함한다. 식물 세포로는, 종자, 현탁 배양물, 배아, 분열 조직 영역, 유합 조직, 잎, 뿌리, 싹, 배우체, 포자체, 꽃가루 및 소포자가 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 담배 식물의 바람직한 종, 품종, 하이브리드 및 변종은 본원에 기술되어 있다.
"폴리뉴클레오타이드", "핵산 서열", "뉴클레오타이드 서열" 또는 "핵산 단편"은, 선택적으로 합성 뉴클레오타이드 염기, 비-천연 뉴클레오타이드 염기 또는 변경된 뉴클레오타이드 염기를 함유하는, 단일-가닥 또는 이중-가닥인 RNA 또는 DNA의 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 상호호환적으로 사용된다. 뉴클레오타이드(통상 이의 5'-모노포스페이트 형태로 발견됨)는 하기와 같이 이의 단일 문자로 지칭되는데: "A"는 (각각 RNA 또는 DNA에 대하여) 아데닐레이트 또는 데옥시아데닐레이트, "C"는 시티딜레이트 또는 데옥시시티딜레이트, "G"는 구아닐레이트 또는 데옥시구아닐레이트, "U"는 우리딜레이트, "T"는 데옥시티미딜레이트, "R"은 퓨린(A 또는 G), "Y"는 피리미딘(C 또는 T), "K"는 G 또는 T, "H"는 A 또는 C 또는 T, "I"는 이노신을 지칭하고, "N"은 임의의 뉴클레오타이드를 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드는 제한 없이, 게놈 DNA, 상보적 DNA(cDNA), mRNA 또는 안티센스 RNA 또는 이들의 단편(들)일 수 있다. 더욱이, 폴리뉴클레오타이드는 단일-가닥 또는 이중-가닥, 단일-가닥 영역과 이중-가닥 영역의 혼합물인 핵산, DNA 및 RNA를 포함하는 하이브리드 분자, 또는 단일-가닥 영역과 이중-가닥 영역의 혼합물과의 하이브리드 분자 또는 이들의 단편(들)일 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드는 DNA, RNA, 또는 둘 다 또는 이들의 단편(들)을 포함하는 삼중가닥 영역들로 구성될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 변형된 염기, 예컨대 포스포티오에이트를 함유할 수 있고, 펩타이드 핵산(PNA)일 수 있다. 일반적으로, 폴리뉴클레오티드는 cDNA, 유전체 DNA, 올리고뉴클레오티드, 또는 개별 뉴클레오티드의 단리된 혹은 클로닝된 단편, 또는 전술한 것들의 조합으로부터 조립될 수 있다. 비록 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열이 DNA 서열로 보여지지만, 상기 서열은 그의 대응하는 RNA 서열, 및 그의 역보체를 포함해서, 그의 상보성(예를 들어, 완전히 상보적인) DNA 또는 RNA 서열을 포함한다.
"폴리펩타이드", "펩타이드", "아미노산 서열" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 상호호환적으로 사용된다. 이러한 용어는, 자연적으로 발생하는 아미노산 중합체뿐만 아니라, 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연적으로 발생하는 아미노산의 인공적인 화학적 유사체인 아미노산 중합체에도 적용된다. 용어 "폴리펩타이드", "펩타이드", "아미노산 서열" 및 "단백질"은 또한, 글리코실화, 지질 부착, 설페이트화, 글루탐산 잔기의 감마-카르복실화, 하이드록실화 및 ADP-리보실화를 포함하지만 이들로 한정되지 않는 변형을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "프로모터"는 세포에서 핵산의 발현을 부여, 활성화 또는 증강시킬 수 있는 합성 분자 또는 천연-유래 분자를 의미한다. "프로모터"는, 전형적으로 이중-가닥 핵산 단편의 상류에 위치하고 작동적으로-연결된 핵산 요소/서열을 지칭한다. 프로모터는 네이티브 관심 유전자에 근접한 영역으로부터 전체적으로 유래될 수 있거나, 상이한 네이티브 프로모터 또는 합성 핵산 분절로부터 유래되는 상이한 요소들로 이루어질 수 있다. 프로모터는 이의 발현을 더 증강시키고/거나 공간적인 발현 및/또는 시간적인 발현을 변경하기 위해, 하나 이상의 특이적인 전사 조절 서열을 포함할 수 있다. 프로모터는 또한, 원위(distal) 인핸서 또는 억제자 요소를 포함할 수 있으며, 이들은 전사의 시작 부위로부터 수천 염기쌍만큼 떨어진 거리에 위치할 수 있다. 프로모터는 바이러스, 박테리아, 진균류, 식물, 곤충 및 동물을 비롯한 공급원으로부터 유래될 수 있다. 프로모터는 유전자 구성성분의 발현을, 발현이 발생하는 세포, 조직 또는 기관에 대하여, 발현이 발생하는 발달 단계에 대하여, 또는 외부 자극, 예컨대 생리학적 스트레스, 병원체, 금속 이온 또는 유도제에 반응하여, 구성적으로 또는 차별적으로 조절할 수 있다. 본원에서 상호호환적으로 사용되는 바와 같이, "조직-특이적 프로모터" 및 "조직-선호적(preferred) 프로모터"는, 하나의 조직 또는 기관에서 주로 발현되지만 본질적으로 독점적으로는 발현되지는 않으며, 그러나 하나의 특정한 세포에서 발현될 수도 있는 프로모터를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, "발달적으로 조절되는 프로모터"는, 이의 활성이 발달 사건에 의해 결정되는 프로모터를 지칭한다. 대부분의 경우에 대부분의 세포에서 유전자를 발현시키는 프로모터는 보편적으로 "구성적 프로모터"로 지칭된다. 유도성 프로모터는 작동적으로 연결된 DNA 서열을, 내인성 자극 또는 외인성 자극, 예를 들어 화학적 화합물(화학적 유도자)의 존재에 반응하거나 환경적 신호, 호르몬 신호, 화학적 신호 및/또는 발달 신호에 반응하여 선택적으로 발현한다. 유도성 프로모터 또는 조절된 프로모터의 예로는, 빛, 열, 스트레스, 홍수 또는 가뭄, 병원체, 식물 호르몬, 상처 또는 화학물질, 예컨대 에탄올, 자스모네이트(jasmonate), 살리실산 또는 완화제(safener)에 의해 조절되는 프로모터가 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
본원에 사용된 바와 같이, "재조합"은, 예를 들어 화학적 합성에 의해, 또는 유전자 조작 기술에 의한 핵산의 단리된 분절들의 조작(manipulation)에 의해, 서열의 2개의 다르게 분리된 분절들의 인공적인 조합을 지칭한다. "재조합"은 또한, 이종성 핵산의 도입에 의해 변형된 세포 또는 벡터, 또는 그렇게 변형된 세포로부터 유래되는 세포를 지칭하는 것을 포함하나, 자연적으로 발생하는 사건(예, 자발적인 돌연변이, 자연적인 형질변환/형질도입/전위), 예컨대 정교한 인간 개입 없이 발생하는 것들에 의한 세포 또는 벡터의 변경은 포함하지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, "재조합 DNA 구축물"은, 자연상에서 통상 함께 발견되지 않는 핵산 단편들의 조합을 지칭한다. 이에, 재조합 DNA 구축물은 상이한 공급원으로부터 유래되는 조절 서열 및 코딩 서열, 또는 동일한 공급원으로부터 유래되지만 자연상에서 통상적으로 발견되는 것과 상이한 방식으로 배열된 조절 서열 및 코딩 서열을 포함할 수 있다. 용어 "재조합 DNA 구축물" 및 "재조합 구축물"은 본원에서 상호호환적으로 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "감소시키다" 또는 "감소된"은 양 또는 활성, 예컨대 비제한적으로 니트레이트 수준 및 담배-특이적인 니트로소아민(TSNA) 수준의 약 10% 내지 약 99%의 감소, 또는 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 100% 이상의 감소를 지칭한다. 용어 "감소된" 또는 구어 "감소된 양"은, 변형되지 않았으며 동일한 방식으로 가공된 동일한 변종의 담배 유래의 담배 식물 또는 담배 제품에서 발견될 양보다 적은, 변형된 담배 식물 또는 변형된 담배 식물로부터 생산된 담배 제품에서의 TSNA의 양을 지칭하고자 한다. 따라서, 일부 맥락에서, 동일한 방식으로 가공된 동일한 변종의 야생형 담배는, 니트레이트 또는 TSNA의 감소가 본원에 기술된 본 발명의 방법에 의해 수득되었는지 측정하는 대조군으로서 사용된다.
본원에서 상호호환적으로 사용되는 바와 같이, "조절 서열" 및 "조절 요소"는 코딩 서열의 상류(5' 비-코딩 서열), 코딩 서열 내 또는 코딩 서열의 하류(3' 비-코딩 서열)에 위치하며, 연관된 코딩 서열의 전사, RNA 가공 또는 안정성, 또는 번역에 영향을 미치는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 조절 서열로는, 프로모터, 번역 리더 서열, 인트론 및 폴리아데닐화 인지 서열이 있을 수 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 용어 "조절 서열" 및 "조절 요소"는 본원에서 상호호환적으로 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, "부위-특이적 뉴클레아제"는 DNA 서열을 특이적으로 인지하고 절단할 수 있는 효소를 지칭한다. 부위-특이적 뉴클레아제는 조작될 수 있다. 조작된 부위-특이적 뉴클레아제의 예로는, 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN), TAL 효과기 뉴클레아제(TALEN), CRISPR/Cas9-기재 시스템 및 메가뉴클레아제가 있다.
일부 맥락에서 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "담배"는 종합해서, 본원에 기술된 바와 같이 제조 및/또는 수득되는 담배 작물(예, 현장(field)에서 생장되는 복수의 담배 식물, 즉 수경 재배에 의해 생장되지 않는 담배), 담배 식물, 및 비제한적으로 뿌리, 줄기, 잎, 꽃 및 종자를 포함하는 이의 일부를 지칭하는 데 사용된다. "담배"는 니코티아나 타바쿰 식물 및 이의 제품을 지칭하는 것으로 이해된다. 일부 맥락에서, 용어 "담배 제품"은 비제한적으로 흡연용 재료(예, 궐련, 엽궐련 및 파이프 담배), 코담배, 씹는 담배, 검 및 론제지를 포함한 소비자용 담배 제품, 뿐만 아니라 소비자용 담배 제품의 제조를 위한 구성성분, 재료 및 성분을 지칭한다. 바람직하게는, 이들 담배 제품은 상기 기술된 바와 같이 처리된 담배로부터 수확된 다음, 담배 제조의 종래의 기술에 따라 절단, 건조, 경화 및/또는 발효된 담배(니코티아나 타바쿰) 잎 및 줄기로부터 제조된다.
본원에 사용된 바와 같이, "전사 종결자", "종결 서열" 또는 "종결자"는 mRNA 가공 또는 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있는 폴리아데닐화 인지 서열 및 조절 신호를 인코딩하는 다른 서열들을 비롯하여, 코딩 서열의 하류에 위치한 DNA 서열을 지칭한다. 폴리아데닐화 신호는 통상, mRNA 전구체의 3' 말단에 폴리아데닐산 트랙트(tract)의 첨가에 영향을 미치는 것을 특징으로 한다.
본원에 사용된 바와 같이, "유전자이식"은, 초기의 유전자이식 사건에 의해 생성되는 것들뿐만 아니라 초기의 유전자이식 사건으로부터 유성 교배 또는 무성 번식에 의해 생성되는 것들을 비롯하여, 이종성 핵산, 예컨대 재조합 DNA 구축물의 존재에 의해 변경된 임의의 세포, 세포주, 유합 조직, 조직, 식물 부분 또는 식물, 게놈을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유전자이식"은, 종래의 식물 육종 방법에 의한, 또는 자연적으로 발생하는 사건, 예컨대 랜덤 교차-비옥화, 비-재조합 바이러스 감염, 비-재조합 박테리아 형질변환, 비-재조합 전위 또는 자발적 돌연변이에 의한 (염색체 또는 염색체-외(extra-chromosomal)) 게놈의 변경을 포함하지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, "유전자이식 식물"은 식물의 게놈 내에 이종성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 식물, 즉, 이러한 유형의 식물 또는 나무에서 통상적으로 발견되지 않고 문제의 식물 내에(또는 식물의 조상 내에) 인간 조작에 의해 도입된 재조합 유전 물질을 함유하는 식물 또는 나무의 지칭을 포함한다. 예를 들어, 이종성 폴리뉴클레오타이드는, 이러한 폴리뉴클레오타이드가 대대로 전달되도록 게놈 내에서 안정하게 통합된다. 이종성 폴리뉴클레오타이드는 게놈 단독 내에 통합되거나 재조합 DNA 구축물의 일부로서 통합될 수 있다. 유전학적으로 개선된 생식질의 상업적인 발달 또한, 다수의 형질을 작물 식물 내에 도입하는 단계까지 나아갔으며, 이는 종종 유전자 적체(gene stacking) 접근법으로 지칭된다. 이러한 접근법에서, 관심의 상이한 특징들을 부여하는 다수의 유전자들이 식물 내에 도입될 수 있다. 유전자 적체는 비제한적으로 공동-형질변환, 재형질변환 및 세포주에 상이한 이식유전자들을 교배시키는 것을 비롯한 많은 수단들에 의해 달성될 수 있다. 따라서, 재조합 DNA가 형질변환에 의해 도입된 식물 세포로부터 생장된 식물은 유전자이식 식물이며, (유성 생식 또는 무성 생식에 의해 생산된) 도입된 이식유전자를 함유하는 해당 식물의 모든 자손들도 마찬가지이다. 용어 유전자이식 식물은 전체 식물 또는 나무 및 이러한 식물 또는 나무의 부분, 예를 들어 낟알, 종자, 꽃, 잎, 뿌리, 과일, 꽃가루, 줄기 등을 포함하는 것으로 이해된다.
"유전자이식 식물"은 또한, 식물의 게놈 내에 1개 초과의 이종성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 식물의 지칭을 포함한다. 각각의 이종성 폴리뉴클레오타이드는 상이한 형질들을 유전자이식 식물에 부여할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "전사 활성화제-유사 효과기" 또는 "TALE"는 특정 DNA 서열을 인지하고 결합하는 단백질 구조를 지칭한다. "TALE DNA-결합 도메인"은 RVD 모듈로도 알려져 있는 탠덤 33개 내지 35개 아미노산 반복부의 어레이를 포함하는 DNA-결합 도메인을 지칭하며, 이러한 RVD 모듈은 각각 DNA의 단일 염기쌍을 특이적으로 인지한다. RVD 모듈은 규정된 서열을 인지하는 어레이를 어셈블리하기 위해 임의의 순서로 배열될 수 있다.
TALE DNA-결합 도메인의 결합 특이성은 RVD 어레이 및 후속해서 20개 아미노산의 단일 절단 반복부에 의해 결정된다. TALE DNA-결합 도메인은 12개 내지 27개의 RVD 모듈을 가질 수 있으며, 이러한 RVD 모듈은 각각 RVD를 함유하고 DNA의 단일 염기쌍을 인지한다. 4개의 가능한 DNA 뉴클레오타이드(A, T, C 및 G)를 각각 인지하는 특이적인 RVD가 동정되어 있다. TALE DNA-결합 도메인이 모듈형(modular)이기 때문에, 4개의 상이한 DNA 뉴클레오타이드를 인지하는 반복부는 함께 연결되어, 임의의 특정한 DNA 서열을 인지할 수 있다. 그런 다음, 이들 표적화된 DNA-결합 도메인은 촉매성 도메인과 조합되어, 인공 전사 인자, 메틸트랜스퍼라제, 인테그라제, 뉴클레아제 및 리컴비나제를 비롯한 기능성 효소를 생성할 수 있다.
본원에서 상호호환적으로 사용되는 바와 같이, "전사 활성화제-유사 효과기 뉴클레아제" 또는 "TALEN"은 뉴클레아제, 예컨대 엔도뉴클레아제 FokI의 촉매성 도메인과, 통상의 DNA 서열에 표적화될 수 있는 디자인된 TALE DNA-결합 도메인의 조작된 융합 단백질을 지칭한다. "TALEN 단량체"는 촉매성 뉴클레아제 도메인 및 디자인된 TALE DNA-결합 도메인을 포함하는 조작된 융합 단백질을 지칭한다. 2개의 TALEN 단량체는 TALEN 표적 영역을 표적화하고 절단하도록 디자인된다.
본원에 사용된 바와 같이, "이식유전자"는 하나의 유기체로부터 단리된 유전자 서열을 함유하는 유전자 또는 유전 물질을 지칭하고, 상이한 유기체 내로 도입된다. DNA의 이러한 비-네이티브 분절은 유전자이식 유기체에서 RNA 또는 단백질을 생성하는 능력을 보유할 수 있거나, 유전자이식 유기체의 유전학적 코드의 정상적인 기능을 변경할 수 있다. 이식유전자의 도입은 유기체의 표현형을 변화시키는 잠재력을 가진다.
핵산과 관련하여 본원에서 사용된 "변이체"는 (i) 참조된 뉴클레오타이드 서열의 일부 또는 단편; (ii) 참조된 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 일부의 상보체; (iii) 참조된 핵산 또는 이의 상보체와 실질적으로 동일한 핵산; 또는 (iv) 엄격한 조건 하에, 참조된 핵산, 이의 상보체, 또는 이와 실질적으로 동일한 서열에 혼성화하는 핵산을 의미한다.
"변이체"는 아미노산의 삽입, 결실 또는 보존적 치환에 의해 아미노산 서열이 상이하지만 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 지칭한다. 변이체는 또한, 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유하는 아미노산 서열을 가진 참조 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가진 단백질을 의미할 수 있다. 아미노산의 보존적 치환, 즉, 아미노산을 유사한 특성(예, 친수성, 하전된 영역의 정도 및 분포)을 가진 상이한 아미노산으로 대체하는 것은 당업계에서 전형적으로 최소의 변화를 수반하는 것으로 인지된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "변종"은 동일한 종의 다른 식물로부터 구별되는 변함없는 특징을 공유하는 식물의 집단을 지칭한다. 하나 이상의 뚜렷한 특징을 가지면서, 변이체는 이러한 변이체 내의 개체들 사이에서 전체적인 변이가 매우 작은 것을 더욱 특징으로 한다. 변종은 종종 상업적으로 판매되고 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "벡터"는 핵산, 핵산 구축물 및 핵산 컨쥬게이트 등을 수송할 수 있는 핵산 구성성분들의 조합을 포함하는 핵산 비히클을 지칭함을 의미한다. 벡터는 바이러스 벡터, 박테리오파지, 박테리아 인공 염색체 또는 효모 인공 염색체일 수 있다. 벡터는 DNA 벡터 또는 RNA 벡터일 수 있다. 적절한 벡터는 원형의, 이중가닥의 핵산 플라스미드; 선형의 이중가닥의 핵산 플라스미드; 및 임의의 기원의 다른 벡터와 같은 과잉 염색체 복제가 가능한 에피솜을 포함한다. 예를 들어, 벡터는 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 7 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 탈조절화된 니트레이트 리덕타제 단백질을 인코딩할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "발현 벡터"는 핵산, 핵산 구축물 및 핵산 컨쥬게이트 등을 발현시킬 수 있는 핵산 구성성분들의 조합을 포함하는 핵산 비히클이다. 적절한 발현 벡터는 원형의, 이중 가닥의 핵산 플라스미드; 선형의 이중가닥의 핵산 플라스미드; 및 임의의 기원의 다른 기능적으로 동등한 발현 벡터와 같은 과잉 염색체 복제가 가능한 에피솜(episome)을 포함한다. 발현 벡터는 이하에서 정의된 바와 같이 핵산, 핵산 구성체 또는 핵산 접합체(conjugate) 상류에 위치하고 작동가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter)를 적어도 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "아연 핑거"는 DNA 서열을 인지하고 결합하는 단백질 구조를 지칭한다. 아연 핑거 도메인은 인간 프로테옴에서 가장 보편적인 DNA-결합 모티프이다. 단일 아연 핑거는 대략 30개의 아미노산을 함유하고, 이러한 도메인은 전형적으로, 1개 염기쌍 당 단일 아미노산 측쇄의 상호작용을 통해 DNA의 3개의 연속 염기쌍에 결함함으로써 작용한다.
본원에서 상호호환적으로 사용되는 바와 같이, "아연 핑거 뉴클레아제" 또는 "ZFN"은, 완전히 조립되었을 때 DNA를 절단할 수 있는 적어도 하나의 뉴클레아제 또는 뉴클레아제의 일부에 효과적으로 연결된 적어도 하나의 아연 핑거 DNA 결합 도메인을 포함하는 키메라 단백질 분자를 지칭한다.
본원에서 다르게 정의되지 않는 한, 본 개시내용과 연결하여 사용된 과학적 용어 및 기술적 용어는 당업자에 의해 보편적으로 이해되는 의미를 가져야 한다. 예를 들어, 본원에 기술된 세포 및 조직 배양 기술, 분자생물학, 면역학, 미생물학, 유전적 특성 및 단백질 및 핵산 화학 및 혼성화와 연결하여 사용된 임의의 명명법은 당업계에 잘 알려져 있으며 보편적으로 사용되는 것들이다. 용어의 의미 및 범위는 분명해야 하지만; 임의의 잠재적 다의성이 존재하는 경우, 본원에서 제공된 정의가 임의의 사전적 정의 또는 외적 정의를 능가하여 우세하다. 나아가, 문맥상 다르게 필요하지 않는 한, 단수형은 복수형을 포함해야 하고, 복수형은 단수형을 포함해야 한다.
2. 니트레이트가 감소된 , 변형된 담배 식물
일 양태에서, 본 발명은 식물의 잎에 감소된 유기 니트레이트 수준을 가진 변형된 담배 식물에 관한 것이다. 유리 니트레이트 수준은 니트레이트 동화 경로를 통해 감소된다. 식물에서 질소 동화 경로의 간략화된 다이어그램은 도 1에 도시되어 있다. 식물이 토양 니트레이트에 노출된 후, 흡수, 동화, 전좌 및 재동원(remobilization)을 비롯하여, N의 혼입에 관여하는 몇몇 단계들이 존재한다. 뿌리 세포막에 위치한 특정 트랜스포터에 의한 흡수 후, 니트레이트는 특정한 동화 경로에 들어간다. 처음에, 니트레이트는 효소 니트레이트 리덕타제(NR; EC 1.7.1.1-3)에 의해 니트라이트(NO2 -)로 환원된다. 후속해서, 니트라이트는 니트라이트 리덕타제(NiR) 효소에 의해 암모니아로 환원된다. 니트라이트 환원 단계는 식물에서 고도로 효율적인 경향이 있으며, 그 결과, 식물 세포는 전형적으로 니트라이트를 매우 낮은 수준으로 함유한다. 암모니아로의 니트라이트의 환원 후, 효소 글루타민 신서타제(GS)는 질소를 유기 분자 글루타민(Gln) 내에 혼입시킨다. GS 효소는 효소 글루타메이트 신타제(GOGAT)와 함께 작동하여, GS/GOGAT 사이클을 형성하고, 이러한 사이클은 Gln으로부터 아미노기를 글루탐산(Glu)으로 셔틀시키는 작용을 하여, 후속해서 질소를 다른 아미노산 및 궁극적으로 단백질 및 다른 질소-함유 거대분자로 재분포시키기 위한 관문의 역할을 한다. 이러한 과정에서 또 다른 중요한 단계는, Glu를 생성하기 위해 GOGAT에 의해 요구되는 2-옥소글루타레이트 탄소 골격을 제공하는 데 책임이 있는 것으로 여겨지는 효소인 이소시트레이트 데하이드로게나제(ICDH)에 의해 촉매화된다.
담배(니코티아나 타바쿰)는 Nia1 및 Nia2로 지정된 2개의 고도로 상동성인 담배 NR 유전자를 가진다. 식물의 잎에 감소된 유리 니트레이트 수준을 가진 본원에 개시된 바와 같은 변형된 담배 식물은, 탈조절화된 니트레이트 리덕타제 폴리펩타이드를 인코딩하는 변형된 니트레이트 리덕타제 폴리뉴클레오타이드, 즉, 탈조절화된 Nia1 및 Nia2 유전자 생성물을 가진다. 니트레이트 리덕타제는 전사 수준 및 전사-후 수준 둘 다에서 고도로 조절된다. 인산화를 통한 라이트/다크 조절을 비롯한 번역-후 조절 메커니즘 때문에, 유전자이식 식물에서 NR 유전자의 과발현은 전형적으로, 세포에서 NR 활성을 오로지 중간 정도 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 탈조절화된 니트레이트 리덕타제 폴리펩타이드는, 구성적으로 활성인 내인성 또는 이종성 니트레이트 리덕타제 폴리펩타이드이다. 탈조절화된 니트레이트 리덕타제 폴리펩타이드는 니트레이트 리덕타제 폴리펩타이드 내의 인산화 부위의 상실 때문에 인산화에 의해 조절되는 능력을 상실할 수 있으며, 따라서 라이트 및 다크에 의해 조절되지 않는다. 변형된 담배 식물은 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 7의 탈조절화된 니트레이트 리덕타제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 탈조절화된 니트레이트 리덕타제 폴리펩타이드, 또는 이들의 변이체 또는 단편을 가질 수 있다. 예를 들어, 탈조절화된 니트레이트 리덕타제는 절단된 니트레이트 리덕타제 폴리펩타이드 또는 아미노산 치환을 가진 니트레이트 리덕타제 폴리펩타이드일 수 있으며, 여기서, 인산화 부위는 제거되어 있다.
일부 실시형태에서, 변형된 담배 식물은 비변형된 대조군 식물과 비교하여, 실질적으로 정상적인 식물 생장 및 발달을 보여준다. 예를 들어, 변형된 담배 식물은 정상적으로 노화할 수 있으며, 즉, 변형된 담배 식물에서의 노화는 비변형된 대조군 담배 식물에서와 실질적으로 동일할 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형된 담배 식물의 시각적인 외양은 예를 들어 현장에 이식한 후 3개월 내지 6개월째에, 비변형된 대조군 식물과 실질적으로 동일할 수 있다. 예를 들어, 잎의 엽록소 함량, 잎의 색상, 숙도(degree of maturity), 1개 식물 당 잎의 수, 줄기 높이, 잎 삽입 각도, 잎 크기(폭 또는 길이), 마디사이 거리(internode distance) 및/또는 라미나-주맥(midrib) 비율은 비변형된 대조군 식물과 비교하여 변형된 담배 식물에서 실질적으로 동일할 수 있다.
(1) 절단된 니트레이트 리덕타제
탈조절화된 니트레이트 리덕타제 폴리펩타이드는 N-말단 절단, 즉 N-말단에서의 결실 또는 N-말단 근처에서의 결실을 가진 니트레이트 리덕타제 폴리펩타이드일 수 있다. N-말단 도메인에 56개의 아미노산 결실을 가진 NR 단백질을 인코딩하는 절단된 담배 Nia2 유전자는 무효화된 효소의 번역-후 조절을 상당히 많이 가진다. 56개 아미노산 결실은 니트레이트 리덕타제 효소를, 다크 사이클 동안에는 인산화를 통해 불활성화되는 야생형(WT) 효소와 비교하여, 라이트 및 다크 둘 다에서 동일하게 활성이 되게 할 수 있다. 강한 구성적 프로모터와 커플링될 때, 절단된 니트레이트 리덕타제 유전자의 발현은 식물에서 전체 N 니트레이트 리덕타제 R 활성을 증강시킬 수 있을 뿐만 아니라, 글루타민(Gln) 및 아스파라긴(Asn)의 탈조절화된 생성을 증강시킬 수 있다.
탈조절화된 니트레이트 리덕타제 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 4와 비교하여, 약 10개 아미노산 내지 약 100개 아미노산, 약 10개 아미노산 내지 약 90개 아미노산, 약 10개 아미노산 내지 약 80개 아미노산, 약 10개 아미노산 내지 약 70개 아미노산, 약 10개 아미노산 내지 약 60개 아미노산, 약 10개 아미노산 내지 약 55개 아미노산, 약 10개 아미노산 내지 약 50개 아미노산, 약 10개 아미노산 내지 약 40개 아미노산, 약 10개 아미노산 내지 약 30개 아미노산, 약 10개 아미노산 내지 약 20개 아미노산, 약 20 아미노산 내지 약 100개 아미노산, 약 20개 아미노산 내지 약 90개 아미노산, 약 20개 아미노산 내지 약 80개 아미노산, 약 20개 아미노산 내지 약 70개 아미노산, 약 20개 아미노산 내지 약 60개 아미노산, 약 20개 아미노산 내지 약 55개 아미노산, 약 20개 아미노산 내지 약 50개 아미노산, 약 20개 아미노산 내지 약 40개 아미노산, 약 20개 아미노산 내지 약 30개 아미노산, 약 30 아미노산 내지 약 100개 아미노산, 약 30 아미노산 내지 약 90개 아미노산, 약 30 아미노산 내지 약 80개 아미노산, 약 30 아미노산 내지 약 70개 아미노산, 약 30 아미노산 내지 약 60개 아미노산, 약 30 아미노산 내지 약 55개 아미노산, 약 30 아미노산 내지 약 50개 아미노산, 약 30 아미노산 내지 약 40개 아미노산, 약 40 아미노산 내지 약 100개 아미노산, 약 40 아미노산 내지 약 90개 아미노산, 약 40 아미노산 내지 약 80개 아미노산, 약 40 아미노산 내지 약 70개 아미노산, 약 40 아미노산 내지 약 60개 아미노산, 약 40 아미노산 내지 약 55개 아미노산, 약 40 아미노산 내지 약 50개 아미노산, 약 50 아미노산 내지 약 100개 아미노산, 약 50 아미노산 내지 약 90개 아미노산, 약 50 아미노산 내지 약 80개 아미노산, 약 50 아미노산 내지 약 70개 아미노산, 약 50 아미노산 내지 약 60개 아미노산, 약 50 아미노산 내지 약 55개 아미노산, 약 55 아미노산 내지 약 100개 아미노산, 약 55 아미노산 내지 약 90개 아미노산, 약 55 아미노산 내지 약 80개 아미노산, 약 55 아미노산 내지 약 70개 아미노산, 또는 약 55개 아미노산 내지 약 60개 아미노산, 또는 적어도 약 10개 아미노산, 적어도 약 20개 아미노산, 적어도 약 30개 아미노산, 적어도 약 40개 아미노산, 적어도 약 50개 아미노산, 적어도 51개 아미노산, 적어도 약 52개 아미노산, 적어도 53개 아미노산, 적어도 약 54개 아미노산, 적어도 55개 아미노산, 적어도 약 56개 아미노산, 적어도 57개 아미노산, 적어도 약 58개 아미노산, 적어도 59개 아미노산, 적어도 약 60개 아미노산 또는 적어도 65개 아미노산의 N-말단 절단을 가진 니트레이트 리덕타제 폴리펩타이드일 수 있다. 탈조절화된 니트레이트 리덕타제 폴리펩타이드는 56개 아미노산 N-말단 절단을 가진 니트레이트 리덕타제 폴리펩타이드일 수 있다.
(2) 아미노산 치환
탈조절화된 니트레이트 리덕타제 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 4의 위치 523에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 가진 니트레이트 리덕타제 폴리펩타이드일 수 있다. 추정상(putative) 인산화 부위에서 세린 잔기를 돌연변이화시키고(도 2 참조), 따라서 라이트 및 다크를 통한 번역-후 조절 제어를 제거하는 것은 유전자이식 식물에서 활성 형태의 니트레이트 리덕타제의 수준을 증가시키고 높은 수준을 유지시켜, 니트레이트 동화를 촉진한다. 부위-관련 돌연변이발생을 사용하여 SEQ ID NO: 4의 위치 523에서 세린(Ser) 잔기를 아스파테이트(Asp)로 변화시킴으로써, 니트레이트 리덕타제 폴리펩타이드는 더 이상, 이러한 Ser 잔기의 인산화를 통해 해당 다크 동안에 이러한 효소를 정상적으로 불활성화시키는 단백질 키나제에 대한 기질로서 역할을 하지 않는다. 일부 실시형태에서, 탈조절화된 니트레이트 리덕타제는 SEQ ID NO: 4의 위치 523에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 탈조절화된 니트레이트 리덕타제는 SEQ ID NO: 4의 위치 523에 상응하는 위치에 세린 이외의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 탈조절화된 니트레이트 리덕타제는 SEQ ID NO: 4의 위치 523에 상응하는 위치에 아스파테이트를 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다.
a. 감소된 니트레이트 수준
변형된 담배 식물은 대조군 담배 식물, 예컨대 야생형 담배 식물 대조군과 비교하여 감소된 니트레이트 수준을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형된 담배 식물은 대조군 담배 식물과 비교하여 니트레이트 비옥화 처리가 높은 수준, 예컨대 19 mM 니트레이트, 또는 중간 수준, 예컨대 8 mM 니트레이트에서 생장되었을 때, 잎에 감소된 니트레이트 수준을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형된 담배 식물은 대조군 담배 식물과 비교하여 현장 조건 하에 생장되었을 때, 잎에 감소된 니트레이트 수준을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 잎은 갓 수확된 것이다. 일부 실시형태에서, 잎은 경화, 보관 또는 가공된다. 일부 실시형태에서, 잎은 음건된다.
변형된 담배 식물은, 대조군 담배로부터 갓 수확된 잎과 비교하여, 높은 수준의 니트레이트 비옥화 처리에서 생장된 변형된 담배 식물로부터 갓 수확된 잎에 적어도 약 1배 감소, 적어도 약 2배 감소, 적어도 약 3배 감소, 적어도 약 4배 감소, 적어도 약 5배 감소, 적어도 약 6배 감소, 적어도 약 7배 감소, 적어도 약 8배 감소, 적어도 약 9배 감소, 적어도 약 10배 감소, 적어도 약 15배 감소, 적어도 약 20배 감소, 적어도 약 25배 감소 또는 적어도 약 30배 감소된 니트레이트 수준을 가질 수 있다. 변형된 담배 식물로부터 갓 수확된 잎은 높은 수준의 니트레이트 비옥화 처리에서 생장되었을 때, 대조군 담배 식물, 예컨대 야생형 담배 식물로부터 갓 수확된 잎에서 발견되는 니트레이트 수준의 약 0.5% 내지 약 99%, 약 0.5% 내지 약 95%, 약 0.5% 내지 약 90%, 약 0.5% 내지 약 85%, 약 0.5% 내지 약 80%, 약 0.5% 내지 약 75%, 약 0.5% 내지 약 70%, 약 0.5% 내지 약 65%, 약 0.5% 내지 약 60%, 약 0.5% 내지 약 55%, 약 0.5% 내지 약 50%, 약 0.5% 내지 약 45%, 약 0.5% 내지 약 40%, 약 0.5% 내지 약 35%, 약 0.5% 내지 약 30%, 약 0.5% 내지 약 25%, 약 0.5% 내지 약 20%, 약 0.5% 내지 약 15%, 약 0.5% 내지 약 13%, 약 0.5% 내지 약 10%, 약 0.5% 내지 약 5%, 약 1% 내지 약 99%, 약 1% 내지 약 95%, 약 1% 내지 약 90%, 약 1% 내지 약 85%, 약 1% 내지 약 80%, 약 1% 내지 약 75%, 약 1% 내지 약 70%, 약 1% 내지 약 65%, 약 1% 내지 약 60%, 약 1% 내지 약 55%, 약 1% 내지 약 50%, 약 1% 내지 약 45%, 약 1% 내지 약 40%, 약 1% 내지 약 35%, 약 1% 내지 약 30%, 약 1% 내지 약 25%, 약 1% 내지 약 20%, 약 1% 내지 약 15%, 약 1% 내지 약 13%, 약 1% 내지 약 10%, 약 1% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 99%, 약 5% 내지 약 95%, 약 5% 내지 약 90%, 약 5% 내지 약 85%, 약 5% 내지 약 80%, 약 5% 내지 약 75%, 약 5% 내지 약 70%, 약 5% 내지 약 65%, 약 5% 내지 약 60%, 약 5% 내지 약 55%, 약 5% 내지 약 50%, 약 5% 내지 약 45%, 약 5% 내지 약 40%, 약 5% 내지 약 35%, 약 5% 내지 약 30%, 약 5% 내지 약 25%, 약 5% 내지 약 20%, 약 5% 내지 약 15%, 약 5% 내지 약 13%, 약 5% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 99%, 약 10% 내지 약 95%, 약 10% 내지 약 90%, 약 10% 내지 약 85%, 약 10% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 75%, 약 10% 내지 약 70%, 약 10% 내지 약 65%, 약 10% 내지 약 60%, 약 10% 내지 약 55%, 약 10% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 45%, 약 10% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 35%, 약 10% 내지 약 30%, 약 10% 내지 약 25%, 약 10% 내지 약 20%, 약 10% 내지 약 15%, 약 10% 내지 약 13%, 약 20% 내지 약 99%, 약 20% 내지 약 95%, 약 20% 내지 약 90%, 약 20% 내지 약 85%, 약 20% 내지 약 80%, 약 20% 내지 약 75%, 약 20% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 65%, 약 20% 내지 약 60%, 약 20% 내지 약 55%, 약 20% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 45%, 약 20% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 35%, 약 20% 내지 약 30%, 약 20% 내지 약 25%, 약 30% 내지 약 99%, 약 30% 내지 약 95%, 약 30% 내지 약 90%, 약 30% 내지 약 85%, 약 30% 내지 약 80%, 약 30% 내지 약 75%, 약 30% 내지 약 70%, 약 30% 내지 약 65%, 약 30% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 55%, 약 30% 내지 약 50%, 약 30% 내지 약 45%, 약 30% 내지 약 40%, 약 30% 내지 약 35%, 약 40% 내지 약 99%, 약 40% 내지 약 95%, 약 40% 내지 약 90%, 약 40% 내지 약 85%, 약 40% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 75%, 약 40% 내지 약 70%, 약 40% 내지 약 65%, 약 40% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 55%, 약 40% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 45%, 약 50% 내지 약 99%, 약 50% 내지 약 95%, 약 50% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 85%, 약 50% 내지 약 80%, 약 50% 내지 약 75%, 약 50% 내지 약 70%, 약 50% 내지 약 65%, 약 50% 내지 약 60%, 약 50% 내지 약 55%, 약 60% 내지 약 99%, 약 60% 내지 약 95%, 약 60% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 85%, 약 60% 내지 약 80%, 약 60% 내지 약 75%, 약 60% 내지 약 70%, 약 60% 내지 약 65%, 또는 적어도 약 0.5%, 적어도 약 1%, 적어도 약 2%, 적어도 약 3%, 적어도 약 4%, 적어도 약 5%, 적어도 약 6%, 적어도 약 7%, 적어도 약 8%, 적어도 약 9%, 적어도 약 10%, 적어도 약 11%, 적어도 약 12%, 적어도 약 13%, 적어도 약 14%, 적어도 약 15%, 적어도 약 16%, 적어도 약 17%, 적어도 약 18%, 적어도 약 19%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99%를 가질 수 있다. 변형된 담배 식물은, 대조군 담배로부터 갓 수확된 잎과 비교하여, 중간 수준의 니트레이트 비옥화 처리에서 생장된 변형된 담배 식물로부터 갓 수확된 잎에 적어도 약 50 ppm, 적어도 약 100 ppm, 적어도 약 500 ppm, 적어도 약 1000 ppm, 적어도 약 1500 ppm, 적어도 약 2000 ppm, 적어도 약 2500 ppm, 적어도 약 3000 ppm, 적어도 약 3500 ppm, 적어도 약 4000 ppm, 또는 적어도 약 5000 ppm의 니트레이트를 가질 수 있다.
변형된 담배 식물은, 대조군 담배로부터 갓 수확된 잎과 비교하여, 중간 수준의 니트레이트 비옥화 처리에서 생장된 변형된 담배 식물로부터 갓 수확된 잎에 적어도 약 1배 감소, 적어도 약 2배 감소, 적어도 약 3배 감소, 적어도 약 4배 감소, 적어도 약 5배 감소, 적어도 약 6배 감소, 적어도 약 7배 감소, 적어도 약 8배 감소, 적어도 약 9배 감소, 적어도 약 10배 감소, 적어도 약 15배 감소, 적어도 약 20배 감소, 적어도 약 25배 감소 또는 적어도 약 30배 감소된 니트레이트 수준을 가질 수 있다. 변형된 담배 식물로부터 갓 수확된 잎은 중간 수준의 니트레이트 비옥화 처리에서 생장되었을 때, 대조군 담배 식물, 예컨대 야생형 담배 식물로부터 갓 수확된 잎에서 발견되는 니트레이트 수준의 약 0.5% 내지 약 99%, 약 0.5% 내지 약 95%, 약 0.5% 내지 약 90%, 약 0.5% 내지 약 85%, 약 0.5% 내지 약 80%, 약 0.5% 내지 약 75%, 약 0.5% 내지 약 70%, 약 0.5% 내지 약 65%, 약 0.5% 내지 약 60%, 약 0.5% 내지 약 55%, 약 0.5% 내지 약 50%, 약 0.5% 내지 약 45%, 약 0.5% 내지 약 40%, 약 0.5% 내지 약 35%, 약 0.5% 내지 약 30%, 약 0.5% 내지 약 25%, 약 0.5% 내지 약 20%, 약 0.5% 내지 약 15%, 약 0.5% 내지 약 13%, 약 0.5% 내지 약 10%, 약 0.5% 내지 약 5%, 약 1% 내지 약 99%, 약 1% 내지 약 95%, 약 1% 내지 약 90%, 약 1% 내지 약 85%, 약 1% 내지 약 80%, 약 1% 내지 약 75%, 약 1% 내지 약 70%, 약 1% 내지 약 65%, 약 1% 내지 약 60%, 약 1% 내지 약 55%, 약 1% 내지 약 50%, 약 1% 내지 약 45%, 약 1% 내지 약 40%, 약 1% 내지 약 35%, 약 1% 내지 약 30%, 약 1% 내지 약 25%, 약 1% 내지 약 20%, 약 1% 내지 약 15%, 약 1% 내지 약 13%, 약 1% 내지 약 10%, 약 1% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 99%, 약 5% 내지 약 95%, 약 5% 내지 약 90%, 약 5% 내지 약 85%, 약 5% 내지 약 80%, 약 5% 내지 약 75%, 약 5% 내지 약 70%, 약 5% 내지 약 65%, 약 5% 내지 약 60%, 약 5% 내지 약 55%, 약 5% 내지 약 50%, 약 5% 내지 약 45%, 약 5% 내지 약 40%, 약 5% 내지 약 35%, 약 5% 내지 약 30%, 약 5% 내지 약 25%, 약 5% 내지 약 20%, 약 5% 내지 약 15%, 약 5% 내지 약 13%, 약 5% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 99%, 약 10% 내지 약 95%, 약 10% 내지 약 90%, 약 10% 내지 약 85%, 약 10% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 75%, 약 10% 내지 약 70%, 약 10% 내지 약 65%, 약 10% 내지 약 60%, 약 10% 내지 약 55%, 약 10% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 45%, 약 10% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 35%, 약 10% 내지 약 30%, 약 10% 내지 약 25%, 약 10% 내지 약 20%, 약 10% 내지 약 15%, 약 10% 내지 약 13%, 약 20% 내지 약 99%, 약 20% 내지 약 95%, 약 20% 내지 약 90%, 약 20% 내지 약 85%, 약 20% 내지 약 80%, 약 20% 내지 약 75%, 약 20% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 65%, 약 20% 내지 약 60%, 약 20% 내지 약 55%, 약 20% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 45%, 약 20% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 35%, 약 20% 내지 약 30%, 약 20% 내지 약 25%, 약 30% 내지 약 99%, 약 30% 내지 약 95%, 약 30% 내지 약 90%, 약 30% 내지 약 85%, 약 30% 내지 약 80%, 약 30% 내지 약 75%, 약 30% 내지 약 70%, 약 30% 내지 약 65%, 약 30% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 55%, 약 30% 내지 약 50%, 약 30% 내지 약 45%, 약 30% 내지 약 40%, 약 30% 내지 약 35%, 약 40% 내지 약 99%, 약 40% 내지 약 95%, 약 40% 내지 약 90%, 약 40% 내지 약 85%, 약 40% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 75%, 약 40% 내지 약 70%, 약 40% 내지 약 65%, 약 40% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 55%, 약 40% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 45%, 약 50% 내지 약 99%, 약 50% 내지 약 95%, 약 50% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 85%, 약 50% 내지 약 80%, 약 50% 내지 약 75%, 약 50% 내지 약 70%, 약 50% 내지 약 65%, 약 50% 내지 약 60%, 약 50% 내지 약 55%, 약 60% 내지 약 99%, 약 60% 내지 약 95%, 약 60% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 85%, 약 60% 내지 약 80%, 약 60% 내지 약 75%, 약 60% 내지 약 70%, 약 60% 내지 약 65%, 또는 적어도 약 0.5%, 적어도 약 1%, 적어도 약 2%, 적어도 약 3%, 적어도 약 4%, 적어도 약 5%, 적어도 약 6%, 적어도 약 7%, 적어도 약 8%, 적어도 약 9%, 적어도 약 10%, 적어도 약 11%, 적어도 약 12%, 적어도 약 13%, 적어도 약 14%, 적어도 약 15%, 적어도 약 16%, 적어도 약 17%, 적어도 약 18%, 적어도 약 19%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 37%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99%를 가질 수 있다. 변형된 담배 식물은, 대조군 담배로부터 갓 수확된 잎과 비교하여, 중간 수준의 니트레이트 비옥화 처리에서 생장된 변형된 담배 식물로부터 갓 수확된 잎에 적어도 약 50 ppm, 적어도 약 100 ppm, 적어도 약 150 ppm, 적어도 약 200 ppm, 적어도 약 250 ppm, 적어도 약 300 ppm, 적어도 약 350 ppm, 적어도 약 400 ppm, 적어도 약 450 ppm, 적어도 약 500 ppm, 적어도 약 550 ppm, 적어도 약 600 ppm, 적어도 약 650 ppm, 적어도 약 700 ppm, 적어도 약 750 ppm, 적어도 약 800 ppm, 적어도 약 850 ppm, 적어도 약 900 ppm, 적어도 약 950 ppm, 또는 적어도 약 1000 ppm의 니트레이트를 가질 수 있다.
변형된 담배 식물 유래의 갓 수확된 잎 또는 경화된 잎은, 현장에서 생장된 변형된 담배 식물 유래의 갓 수확된 잎 또는 경화된 잎에서 적어도 약 1배 감소, 적어도 약 2배 감소, 적어도 약 3배 감소, 적어도 약 4배 감소, 적어도 약 5배 감소, 적어도 약 6배 감소, 적어도 약 7배 감소, 적어도 약 8배 감소, 적어도 약 9배 감소, 적어도 약 10배 감소, 적어도 약 15배 감소, 적어도 약 20배 감소, 적어도 약 25배 감소, 또는 적어도 약 30배 감소된 니트레이트 수준을 가질 수 있다. 변형된 담배 식물 유래의 갓 수확된 잎 또는 경화된 잎은, 현장에서 생장되었을 때 대조군 담배 식물, 예컨대 야생형 담배 식물 유래의 갓 수확된 잎 또는 경화된 잎에서 발견되는 니트레이트 수준의 약 0.5% 내지 약 99%, 약 0.5% 내지 약 95%, 약 0.5% 내지 약 90%, 약 0.5% 내지 약 85%, 약 0.5% 내지 약 80%, 약 0.5% 내지 약 75%, 약 0.5% 내지 약 70%, 약 0.5% 내지 약 65%, 약 0.5% 내지 약 60%, 약 0.5% 내지 약 55%, 약 0.5% 내지 약 50%, 약 0.5% 내지 약 45%, 약 0.5% 내지 약 40%, 약 0.5% 내지 약 35%, 약 0.5% 내지 약 30%, 약 0.5% 내지 약 25%, 약 0.5% 내지 약 20%, 약 0.5% 내지 약 15%, 약 0.5% 내지 약 13%, 약 0.5% 내지 약 10%, 약 0.5% 내지 약 5%, 약 1% 내지 약 99%, 약 1% 내지 약 95%, 약 1% 내지 약 90%, 약 1% 내지 약 85%, 약 1% 내지 약 80%, 약 1% 내지 약 75%, 약 1% 내지 약 70%, 약 1% 내지 약 65%, 약 1% 내지 약 60%, 약 1% 내지 약 55%, 약 1% 내지 약 50%, 약 1% 내지 약 45%, 약 1% 내지 약 40%, 약 1% 내지 약 35%, 약 1% 내지 약 30%, 약 1% 내지 약 25%, 약 1% 내지 약 20%, 약 1% 내지 약 15%, 약 1% 내지 약 13%, 약 1% 내지 약 10%, 약 1% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 99%, 약 5% 내지 약 95%, 약 5% 내지 약 90%, 약 5% 내지 약 85%, 약 5% 내지 약 80%, 약 5% 내지 약 75%, 약 5% 내지 약 70%, 약 5% 내지 약 65%, 약 5% 내지 약 60%, 약 5% 내지 약 55%, 약 5% 내지 약 50%, 약 5% 내지 약 45%, 약 5% 내지 약 40%, 약 5% 내지 약 35%, 약 5% 내지 약 30%, 약 5% 내지 약 25%, 약 5% 내지 약 20%, 약 5% 내지 약 15%, 약 5% 내지 약 13%, 약 5% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 99%, 약 10% 내지 약 95%, 약 10% 내지 약 90%, 약 10% 내지 약 85%, 약 10% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 75%, 약 10% 내지 약 70%, 약 10% 내지 약 65%, 약 10% 내지 약 60%, 약 10% 내지 약 55%, 약 10% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 45%, 약 10% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 35%, 약 10% 내지 약 30%, 약 10% 내지 약 25%, 약 10% 내지 약 20%, 약 10% 내지 약 15%, 약 10% 내지 약 13%, 약 20% 내지 약 99%, 약 20% 내지 약 95%, 약 20% 내지 약 90%, 약 20% 내지 약 85%, 약 20% 내지 약 80%, 약 20% 내지 약 75%, 약 20% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 65%, 약 20% 내지 약 60%, 약 20% 내지 약 55%, 약 20% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 45%, 약 20% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 35%, 약 20% 내지 약 30%, 약 20% 내지 약 25%, 약 30% 내지 약 99%, 약 30% 내지 약 95%, 약 30% 내지 약 90%, 약 30% 내지 약 85%, 약 30% 내지 약 80%, 약 30% 내지 약 75%, 약 30% 내지 약 70%, 약 30% 내지 약 65%, 약 30% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 55%, 약 30% 내지 약 50%, 약 30% 내지 약 45%, 약 30% 내지 약 40%, 약 30% 내지 약 35%, 약 40% 내지 약 99%, 약 40% 내지 약 95%, 약 40% 내지 약 90%, 약 40% 내지 약 85%, 약 40% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 75%, 약 40% 내지 약 70%, 약 40% 내지 약 65%, 약 40% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 55%, 약 40% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 45%, 약 50% 내지 약 99%, 약 50% 내지 약 95%, 약 50% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 85%, 약 50% 내지 약 80%, 약 50% 내지 약 75%, 약 50% 내지 약 70%, 약 50% 내지 약 65%, 약 50% 내지 약 60%, 약 50% 내지 약 55%, 약 60% 내지 약 99%, 약 60% 내지 약 95%, 약 60% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 85%, 약 60% 내지 약 80%, 약 60% 내지 약 75%, 약 60% 내지 약 70%, 약 60% 내지 약 65%, 또는 적어도 약 0.5%, 적어도 약 1.0%, 적어도 약 2.0%, 적어도 약 3.0%, 적어도 약 4.0%, 적어도 약 4.1%, 적어도 약 4.2%, 적어도 약 4.3%, 적어도 약 4.4%, 적어도 약 4.5%, 적어도 약 5.0%, 적어도 약 5.1%, 적어도 약 5.2%, 적어도 약 5.3%, 적어도 약 5.4%, 적어도 약 5.5%, 적어도 약 5.6%, 적어도 약 5.7%, 적어도 약 5.8%, 적어도 약 5.9%, 적어도 약 6.0%, 적어도 약 7.0%, 적어도 약 8.0%, 적어도 약 9.0%, 적어도 약 10%, 적어도 약 11%, 적어도 약 12%, 적어도 약 13%, 적어도 약 14%, 적어도 약 15%, 적어도 약 16%, 적어도 약 17%, 적어도 약 18%, 적어도 약 19%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 37%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 적어도 약 99%를 가질 수 있다.
b. 이종성 니트레이트 리덕타제
탈조절화된 니트레이트 리덕타제 폴리펩타이드는 이종성 니트레이트 리덕타제 폴리뉴클레오타이드 또는 유전자, 즉, 변형된 담배 식물에 내인성이지 않은 니트레이트 리덕타제 유전자에 의해 인코딩될 수 있다. 이종성 니트레이트 리덕타제 유전자는 하기 기술된 바와 같이 식물 형질변환에 의해, 변형된 담배 식물의 게놈 내에 도입될 수 있다. 예를 들어, 이종성 니트레이트 리덕타제 유전자는 안정한 형질변환 또는 일시적인 형질변환 방법에 의해, 변형된 담배 식물 내에 도입될 수 있다.
이종성 니트레이트 리덕타제 유전자는 식물, 진균류 또는 조류(algal) 니트레이트 리덕타제 유전자일 수 있다. 예를 들어, 이종성 니트레이트 리덕타제 유전자는 리키누스 콤무니스 ( Ricinus communis ), 리키누스 콤무니스 , 비티스 비니페라(Vitis vinifera ), 포풀루스 트리초카르파 ( Populus trichocarpa ), 셀라기넬라 모 엘렌도르피이이(Selaginella moellendorffii ), 셀라기넬라 모엘렌도르피이이 , 쿠쿠미스 사티부스 ( Cucumis sativus ), 쿠쿠르비타 막시마 ( Cucurbita maxima), 쿠쿠미스 사티부스 , 브라씨카 나푸스 ( Brassica napus ), 포풀루스 트리초카르파 , 베툴라 펜둘라 ( Betula pendula ), 솔라눔 투베로숨 ( Solanum tuberosum ), 니코티아나 토멘토시포르미스(Nicotiana tomentosiformis ), 니코티아나 타바쿰 , 솔라눔 리코페르시쿰 (Solanum lycopersicum ), 니코티아나 벤타미아나 ( Nicotiana benthamiana ), 메디카고 트룬카툴라 ( Medicago truncatula ), 니코티아나 벤싸미아나 , 브라씨카 라파 아종 치넨시스 ( Brassica rapa subsp . chinenis ), 베타 불가리스(Beta vulgaris), 니코티아나 실베스트리스 ( Nicotiana sylvestris ), 니코티아나 타바쿰의 상이한 변종, 니코티아나 플룸바기니폴리아 ( Nicotiana plumbaginifolia ), 글리신 막스(Glycine max), 솔라눔 투베로숨 , 솔라눔 투베로숨 , 브라씨카 나푸스 ( Brassica napus), 아라비돕시스 리라타 아종 리라타 ( Arabidopsis lyrata subsp . lyrata ), 아라비돕시스 탈리아나 ( Arabidopsis thaliana ), 파세오루스 불가리스( Phaseolus vulgaris), 메디카고 트룬카툴라 ( Medicago truncatula ), 페투니아 엑스 하이브리드(Petunia x hybrid), 스피나키아 올레라세아 ( Spinacia oleracea ), 로투스 야포니카스 (Lotus japonicas), 키초리움 인티부스 ( Cichorium intybus ), 페투니악스 하이브리드 ( Petuniax hybrid), 스피나키아 올레라세아 , 텔룬기엘라 할로필레(Thellungiella halophile ), 오리자 사티바 야포니카 그룹( Oryza sativa Japonica Group), 제아 마이스 ( Zea Mays), 아라비돕시스 탈리아나 , 아라비돕시스 리라타 아종 리라타 , 파세오루스 불가리스, 소르굼 비콜로 (Sorghum bicolor), 오리자 사티바 인디카 그룹( Oryza sativa Indica Group), 오리자 사티바 야포니카 그룹, 호르데움 불가레 아종 불가레 ( Hordeum vulgare subsp vulgare ), 소르굼 비콜로 , 오리자 사티바 야포니카 그룹, 글리신 막스 , 호르데움 불가레 아종 불가레 , 소르굼 비콜로 , 제아 마이 스, 헤테로사인마 아카시보 ( Heterosignma akashiwo ), 클로렐라 불가리스 UTEX259(Chlorella vulgaris UTEX259), 클로렐라 불가리스 NJ-7, 클로렐라 바리빌 리스, 엑토카르푸스 실리쿨로수스 ( Ectocarpus siliculosus ), 볼복스 카르테리 에프. 나가리엔시스 ( Volvox carteri f. nagariensis ), 그라실라리아 테누이스티피타타 (Gracilaria tenuistipitata ), 두날리엘라 테르티올렉타 ( Dunaliella tertiolecta), 클라미도모나스 레인하르드티이 ( Chlamydomonas reinhardtii ), 두날리엘라 비리디스 ( Dunaliella viridis ), 탈라씨오시라 슈도나나 CCMP1335(Thalassiosira pseudonana CCMP1335 ), 두날리엘라 살리나( Dunaliella salina), 패오닥틸룸 트리코르누툼 ( Phaeodactylum tricornutum ) 또는 오스트레오콕 커스 루시나리누스 CCE9901(Ostreococcus lucimarinus CCE9901)로부터 유래될 수 있다.
이종성 니트레이트 리덕타제 유전자는 GenBank 수탁 번호 XP_002513830.1, AAG30576.1, XP_002285831.1, XP_002307415.1, XP_002984312.1, XP_002972481.1, ADN96689.1, P17569.1, ADK77877.1, P39867.1, XP_002301015.1, P27783.1, BAB93534.1, 227925, P11605.1, P17570.1, BAE46746.1, ADV03139.1, BAE96752.1, ACF93242.1, ABW05098.1, 227926, P08509.2, P39870.1, AAB18985.1, AAB52786.1, P39868.1, XP_002889158.1, NP_177899.1, P39866.1, ADV03138.1, P36859.1, P23312.1, P39869.1, P43101.1, AAA33712.1, BAA13047.1, BAJ33682.1, NP_001062006.1, AAD38068.1, NP_174901.1, XP_002891229.1, P39865.1, XP_002444490.1, EEC74079.1, NP_001048253.1, P27967.1, XP_002454625.1, NP_001062009.1, P54233.1, P27968.1, XP_002454083.1, P49102.1, ACS44801.1, ABP97095.1, ABJ91208.4, EFN52691.1, CBN78746.1, XP_002955156.1, ACX31652.1, AAL79356.1, AAF17595.1, AAT72293.1, XP_002294410.1, AAP75705.1, AAV66996.1 또는 XP_001420098.1의 서열을 가진 니트레이트 리덕타제 유전자일 수 있다.
c. 내인성 니트레이트 리덕타제 유전자의 변형
담배(니코티아나 타바쿰)는 Nia1 및 Nia2로 지정된 2개의 고도로 상동성인 담배 NR 유전자, 즉 2개의 내인성 니트레이트 리덕타제 유전자를 가진다. 탈조절화된 니트레이트 리덕타제 유전자는 게놈 편집 시스템 또는 돌연변이원에 의해 변형되거나 돌연변이화된 내인성 니트레이트 리덕타제 유전자일 수 있다. 본원에 기술된 뉴클레오타이드 서열 및 폴리펩타이드에서의 돌연변이는 인조 돌연변이 또는 합성 돌연변이 또는 유전학적으로 조작된 돌연변이를 포함할 수 있다. 본원에 기재된 뉴클레오티드 서열 및 폴리펩티드에서의 돌연변이는 시험관 내 또는 생체 내 조작 단계를 포함하는 공정을 통해서 수득되거나 또는 수득가능한 돌연변이일 수 있다. 본원에 기재된 뉴클레오티드 서열 및 폴리펩티드에서의 돌연변이는 인간에 의한 개입을 포함하는 공정을 통해서 수득되거나 또는 수득가능한 돌연변이일 수 있다.
돌연변이체의 제조 과정은 당업계에 잘 알려져 있으며, 유전 물질에 랜덤 돌연변이를 생성하는 외적으로 첨가된 화학물질 - 예컨대 돌연변이원성, 기형발생성 또는 발암성 유기 화합물, 예를 들어 에틸 메탄설포네이트(EMS)를 사용한 돌연변이발생을 포함할 수 있다. 추가적인 예시로서, 공정은 본원에 기재된 하나 이상의 유전자 조작 단계와 같은 하나 이상의 유전자 조작 단계 또는 그의 조합을 포함할 수도 있다. 게놈에서 유도성 국소 병변 표적화(Targeting Induced Local Lesions in Genomes; TILLING) 또한, 다른 곳들에서 기술된 바와 같이 사용될 수 있다.
추가의 예로서, 이러한 과정은 하나 이상의 작물 교배 단계를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 식물의 종자는 돌연변이화된 다음, 제1 세대 돌연변이체 식물로 생장된다. 그런 다음 1세대 식물은 자가-수분되고 1세대 식물의 종자는 2세대 식물로 성장하는데, 그런 다음 이것은 그들의 좌위(loci)에서의 돌연변이를 위해 스크리닝된다. 돌연변이된 식물 재료는 돌연변이를 위해서 스크리닝될 수 있지만, 2세대 식물을 스크리닝하는 이점은 모든 체세포 돌연변이가 생식 돌연변이에 해당한다는 것이다. 당업자라면 이들에만 한정하는 것은 아니지만, 종자, 꽃가루, 식물 조직 또는 식물 세포를 포함해서, 다양한 식물 재료가 돌연변이 식물을 형성하기 위해 돌연변이되는 것을 이해할 것이다. 그러나 돌연변이된 식물 재료의 유형은 식물 핵산이 돌연변이를 위해 스크리닝될 때 영향을 줄 수도 있다. 예를 들어, 비-돌연변이된 식물이 수분되기 전에, 꽃가루가 돌연변이를 거친 경우, 이러한 수분으로부터 발생하는 종자는 1세대 식물로 성장한다. 1세대 식물의 모든 세포는 꽃가루에서 형성되는 돌연변이를 함유할 것이고; 따라서 이러한 1세대 식물은 2세대까지 기다리는 대신에 돌연변이를 위해 스크리닝될 것이다.
게놈 편집 시스템
게놈 편집 시스템은, 절단된 니트레이트 리덕타제 폴리펩타이드 또는 아미노산 치환을 가진 니트레이트 리덕타제 폴리펩타이드를 생성하기 위한 위치에서 내인성 니트레이트 리덕타제 유전자에 결합하여 이를 절단할 수 있다. 내인성 니트레이트 리덕타제 유전자는, 이러한 내인성 니트레이트 리덕타제 유전자에 결합하고 이를 절단하는 부위-특이적 뉴클레아제를 포함하는 게놈 편집 시스템에 의해 변형될 수 있다. 게놈 편집 시스템은 뉴클레아제 매개 비-상동성 말단 접합 또는 상동성-인도 복구를 이용할 수 있다. 게놈 편집 시스템은 안정한 형질변환 또는 일시적인 형질변환 방법에 의해 변형된 담배 식물 내에 도입될 수 있다.
부위-특이적 뉴클레아제는 조작될 수 있다. 예를 들어, 조작된 부위-특이적 뉴클레아제는 CRISPR/Cas9-기재 시스템, ZFN 또는 TALEN일 수 있다. 부위-특이적 뉴클레아제는 내인성 니트레이트 리덕타제 유전자에 결합하여 이를 절단할 수 있다. 게놈 편집 시스템은 조작된 CRISPR/Cas 시스템, 예컨대 조작된 CRISPR/Cas-9 시스템, 조작된 전사 활성화제-유사 효과기 뉴클레아제, 조작된 아연 핑거 뉴클레아제 또는 조작된 메가뉴클레아제를 포함할 수 있다.
돌연변이원
화학적 돌연변이원 또는 방사선을 비롯하여, 주로 점 돌연변이 및 짧은 결실, 삽입, 염기전환(transversion) 및/또는 염기전위(transition)를 생성하는 돌연변이원이 사용되어, 니트레이트 리덕타제 유전자에 돌연변이를 생성할 수 있다. 돌연변이원은 이들에만 한정하는 것은 아니지만, 에틸 메탄술포네이트, 메틸메탄 술포네이트, N-에틸-N-니트로소우레아, 트리에틸멜라민, N-메틸-N-니트로소우레아, 프로카르바진, 클로람부실, 시클로포스파미드, 디에틸 설페이트, 아크릴아미드 모노머, 멜파란, 질소 머스타드(mustard), 빈크리스틴, 디메틸니트로사민, N-메틸-N'-니트로-니트로소구아니딘, 니트로소구아니딘, 2-아미노퓨린, 7,12 디메틸-벤즈(자)안트라센, 에틸렌 산화물, 헥사메틸포스포아미드, 바이술판, 디에폭시알칸(디에폭시옥탄, 디에폭시부탄, 기타 등등), 2-메톡시-6-클로로-9[3-에틸-2-클로로-에틸)아미노프로필아미노]아크리딘 디하이드로클로라이드 및 포름알데히드를 포함한다.
d. 알칼로이드 전구체 유전자와의 조합
니트로소화제를 표적으로 하는 탈조절화된 니트레이트 리덕타제 폴리펩타이드는 노르니코틴 알칼로이드 전구체의 생성을 저해하는 변형된 알칼로이드 전구체 유전자와 조합하여 사용될 수 있다. 탈조절화된 니트레이트 리덕타제 폴리펩타이드와 변형된 알칼로이드 전구체 유전자의 조합은 탈조절화된 니트레이트 리덕타제 또는 변형된 알칼로이드 전구체 유전자를 단독으로 사용한 것과 비교하여, NNN 축적을 훨씬 더 크게 감소시킬 수 있다. 변형된 알칼로이드 전구체 유전자는 저(low) 노르니코틴을 낮추기 위해 전구체 알칼로이드 노르니코틴의 수준을 감소시킴으로써, 특이적인 TSNA, 예컨대 N'-니트로소노르니코틴을 감소시킬 수 있다. 변형된 알칼로이드 전구체 유전자는 변형된 니코틴 데메틸라제 유전자 또는 시트크롬 P450 유전자일 수 있다. 변형된 알칼로이드 전구체 유전자는 변형된 CYP82E4 유전자, 변형된 CYP82E5v2 유전자 또는 변형된 CYP82E10 유전자 및 이들의 조합일 수 있다. 일부 실시형태에서, 탈조절화된 니트레이트 리덕타제 폴리펩타이드는 내인성 니코틴 데메틸라제 유전자에 넉아웃 돌연변이를 가진 담배 식물, 예컨대 DH98-325-6#775 육종 주(line)(문헌[Lewis 외 Phytochem. 71:1988-1998 (2010)]), 또는 삼중 돌연변이체 니코틴 데메틸라제 유전학적 백그라운드를 가진 담배 식물 내에 도입될 수 있다. 일부 실시형태에서, 탈조절화된 니트레이트 리덕타제 폴리펩타이드는 CYP82E4 및 CYP82E5 니코틴 데메틸라제 유전자 둘 다에 넉아웃 돌연변이를 가진 담배 식물, 예컨대 상업적인 변종 TN90의 역교배-유래 변이체를 나타내는 주이고 미국 특허 출원 20120216822에 기술되어 있는 버얼리종 품종 TN90e4e5 내에 도입 수 있으며, 상기 출원은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 통합된다.
3. 구축물, 벡터 및 발현 벡터
특정한 실시형태에서, 식물 내에 도입되는 폴리뉴클레오타이드는 프로모터 서열에 작동적으로 연결되고, 구축물로서 제공될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 폴리뉴클레오타이드는 제2 폴리뉴클레오타이드 서열과 기능적인 관계에 놓인 경우, "작동적으로 연결된" 것이다. 예를 들어, 프로모터는, 이러한 프로모터가 코딩 서열의 전사에 영향을 미칠 수 있도록 코딩 서열에 연결되어 있다면, 코딩 서열에 작동적으로 연결된 것이다. 다양한 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개 또는 적어도 10개의 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다.
핵산 서열은 벡터일 수 있는 유전학적 구축물을 형성할 수 있다. 벡터는 식물의 세포에서 탈조절화된 니트레이트 리덕타제 폴리펩타이드 또는 게놈 편집 시스템을 발현시킬 수 있다. 벡터는 재조합일 수 있다. 벡터는 탈조절화된 니트레이트 리덕타제 폴리펩타이드 또는 게놈 편집 시스템을 인코딩하는 이종성 핵산을 포함할 수 있다. 적합한 벡터로는, 플라스미드 및 바이러스-유래 벡터가 있다. 당업계에서 식물 내로의 형질변환, 클로닝 및 단백질 발현에 적합한 것으로 알려진 벡터가 사용될 수 있다. 벡터는 세포를, 탈조절화된 니트레이트 리덕타제 폴리펩타이드 또는 게놈 편집 시스템을 인코딩하는 핵산으로 형질감염시키는 데 유용할 수 있으며, 형질변환된 숙주 세포는 탈조절화된 니트레이트 리덕타제 폴리펩타이드 또는 게놈 편집 시스템의 발현이 수행되는 조건 하에 배양 및 유지된다.
유전학적 구축물은 본원에 개시된 탈조절화된 니트레이트 리덕타제 폴리펩타이드 또는 게놈 편집 시스템을 인코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 유전학적 구축물은 세포 내에 기능성 염색체외 분자로서 존재할 수 있다. 유전학적 구축물은 중심립, 텔로미어 또는 플라스미드 또는 코스미드를 비롯한 선형 미니염색체일 수 있다. 유전학적 구축물은 재조합 콜리플라워 모자이크 바이러스, 재조합 담배 모자이크 바이러스 및 재조합 감자 바이러스 X-기재 벡터를 비롯한 재조합 바이러스 벡터의 게놈의 일부일 수 있다. 유전학적 구축물은 세포 내에서 생존하는 감쇠된 생(live) 미생물 또는 재조합 미생물 벡터 내의 유전 물질의 일부일 수 있다. 유전학적 구축물은 핵산의 코딩 서열의 유전자 발현을 위한 조절 요소를 포함할 수 있다. 조절 요소는 프로모터, 인핸서, 개시 코돈, 정지 코돈 또는 폴리아데닐화 신호일 수 있다.
벡터는 탈조절화된 니트레이트 리덕타제 폴리펩타이드를 인코딩하는 이종성 핵산을 포함할 수 있고, 탈조절화된 니트레이트 리덕타제 폴리펩타이드 코딩 서열의 상류에 존재할 수 있는 개시 코돈 및 탈조절화된 니트레이트 리덕타제 폴리펩타이드 코딩 서열의 하류에 존재할 수 있는 정지 코돈을 추가로 포함할 수 있다. 개시 코돈 및 종결 코돈은 탈조절화된 니트레이트 리덕타제 폴리펩타이드 코딩 서열을 가진 프레임 내에 존재할 수 있다. 벡터는 또한, 탈조절화된 니트레이트 리덕타제 폴리펩타이드 코딩 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함할 수 있다. 탈조절화된 니트레이트 리덕타제 폴리펩타이드 코딩 서열에 작동적으로 연결된 프로모터는 탈조절화된 니트레이트 리덕타제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드와 천연적으로 연관되어 있지 않을 수 있다. 본 발명의 실시에 유용한 프로모터로는, 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 시간적으로-조절되는 프로모터, 발달적으로 조절되는 프로모터, 화학적으로 조절되는 프로모터, 조직-선호적 프로모터 및 조직-특이적 프로모터가 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 적합하게는, 프로모터는 본원에 기술된 표현형을 생성하기에 충분한 발현을 식물에서 유발한다. 적합한 프로모터로는 제한 없이, 콜리플라워 모자이크 바이러스의 35S 프로모터, CYP82E4 프로모터, 유비퀴틴, tCUP 크립틱 구성적 프로모터, Rsyn7 프로모터, 병원체-유도성 프로모터, 옥수수 In2-2 프로모터, 담배 PR-1a 프로모터, 글루코코티코이드-유도성 프로모터 및 테트라사이클린-유도성 프로모터 및 테트라사이클린-억제성 프로모터가 있다.
벡터는 또한, 탈조절화된 니트레이트 리덕타제 폴리펩타이드 코딩 서열의 하류에 존재할 수 있는 폴리아데닐화 신호를 포함할 수 있다. 벡터는 또한, 탈조절화된 니트레이트 리덕타제 폴리펩타이드 코딩 서열의 인핸서 상류를 포함할 수 있다. 인핸서는 DNA 발현에 필수적일 수 있다. 벡터는 또한, 벡터를 염색체외에서 유지시키고 벡터의 다수의 복사본을 세포에서 생성하기 위해, 식물 복제 기원을 포함할 수 있다. 벡터는 또한, 조절 서열을 포함할 수 있으며, 이러한 조절 서열은 벡터가 투여되는 세포에서 유전자 발현에 잘 적합하도록 될 수 있다. 벡터는 또한, 리포터 유전자, 예컨대 녹색 형광 단백질("GFP") 및/또는 선별 마커, 예컨대 하이그로마이신("Hygro")을 포함할 수 있다.
코딩 서열은 안정성 및 높은 수준의 발현을 위해 최적화될 수 있다. 일부 경우, 코돈은, RNA의 2차 구조 형성, 예컨대 분자내 결합으로 인해 형성되는 구조를 감소시키도록 선택된다.
벡터는 문헌[Sambrook 외, 1989]를 비롯하여 일상적인 기술 및 쉽게 입수가능한 출발 재료에 의해 단백질을 생성하는 발현 벡터 또는 시스템일 수 있으며, 상기 문헌은 전체적으로 원용에 의해 포함된다. 일부 실시형태에서, 벡터는 탈조절화된 니트레이트 리덕타제 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 pBI121일 수 있다.
4. 식물 형질변환
탈조절화된 니트레이트 리덕타제를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 식물 세포 내에 도입되어, 유전자이식 식물이 생성될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 폴리뉴클레오타이드와 관련하여 "식물 내에 도입되는"이란, 임의의 적합한 폴리뉴클레오타이드 전달 방법을 사용하여 폴리뉴클레오타이드를 식물, 식물 조직 또는 식물 세포 내에 전달하는 것을 포함한다. 본 발명의 실시에 유용한 식물 내에 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 데 적합한 방법으로는, 동결-해동 방법, 극미립자 충격, 직접 DNA 흡수, 전기천공법, 초음파처리, 현미주사, 및 식물에의 식물 바이러스-매개 트랜스퍼 및 아그로박테리움-매개 트랜스퍼가 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 식물을 형질변환시키기에 적합한 임의의 아그로박테리움 균주, 벡터 또는 벡터 시스템이 본 발명에 따라 이용될 수 있다. 특정한 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 안정한 형질변환 방법, 일시적인 형질변환 방법 또는 바이러스-매개 방법 중 적어도 하나의 방법을 사용하여 도입된다.
"안정한 형질변환"은, 식물 내에 도입된 뉴클레오타이드 구축물이 식물의 게놈 내에 통합되고 이의 자손에 유전될 수 있는 것이다. 예를 들어, 도입된 뉴클레오타이드 및/또는 연결된 선별 마커 유전자, 예컨대 게놈 편집 시스템은 종래의 육종 기술을 사용하여 후속적인 식물 세대들에서 멀리 격리(segregate)될 수 있다.
"일시적인 형질변환"은, 식물 내에 도입된 뉴클레오타이드 구축물이 식물의 게놈 내에 통합되지 않는 것이다. 또한 식물 또는 식물 세포는 일시적으로 형질전환되어서 재조합 폴리뉴클레오티드가 그의 유전체로 통합되지 않을 수도 있다. 일시적으로 형질전환된 세포는 전형적으로 각각의 세포분열시에 도입된 재조합 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부를 손실함으로써 상기 도입된 재조합 폴리뉴클레오티드가 충분한 수의 세포분열 후에 딸세포에서 검출될 수 없도록 한다. 예를 들어, 식물 세포는 처음에, 선별 마커가 결여된 게놈 편집 시스템에 의해 형질변환될 수 있으며, 선별제가 결여된 배지 상에서 성장될 수 있다. 이러한 조건 하에, 처리된 세포 중 일 분획은 게놈 편집 시스템을 획득할 것이고, 게놈 편집 시스템을 게놈 내에 통합하지 않으면서 이러한 게놈 편집 시스템을 일시적으로 발현할 것이다. 이것은 형질전환 효율에 중요하지 않기 때문에, 이러한 후자의 형질전환 절차는 더 많은 수의 처리된 세포가 스크리닝되어서 원하는 유전체 변형을 얻는 것이 필요하다.
뉴클레오타이드 서열을 식물 세포 내에 도입하고, 후속하여 식물 세포 내에 삽입하는 적합한 방법으로는, 현미주사(문헌[Crossway 외, Biotechniques 4:320-334 (1986)]), 전기천공법(문헌[Riggs 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602-5606 (1986)]), 아그로박테리움-매개 형질변환(미국 특허 5,981,840 및 미국 특허 5,563,055), 직접 유전자 트랜스퍼(문헌[Paszkowski 외, EMBO J. 3:2717-2722 (1984)]) 및 볼리스틱 입자 가속화(ballistic particle acceleration) (예를 들어, 미국 특허 4,945,050; 미국 특허 5,879,918; 미국 특허 5,886,244; 미국 특허 5,932,782; 문헌[Tomes 외, in Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg and Phillips (Springer-Verlag, Berlin) (1995); 및 McCabe 외, Biotechnology 6:923-926 (1988)] 참조)가 있으며, 이들은 모두 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 통합된다.
일부 실시형태에서, 식물은 식물, 식물 조직 또는 식물 세포로부터 재생되거나 생장될 수 있다. 식물 세포 또는 식물 조직으로부터 식물을 재생시키거나 생장시키기에 적합한 임의의 방법, 예컨대 비제한적으로, 조직 배양 또는 원형질체로부터의 재생이 사용될 수 있다. 적합하게는, 식물은 형질변환된 식물 세포를 유합 조직 유도 배지, 슈트 유도 배지 및/또는 뿌리 유도 배지 상에서 생장시킴으로써 재생될 수 있다. 예를 들어, 문헌[McCormick 외, Plant Cell Reports 5:81-84 (1986)]을 참조한다. 그런 다음, 이들 식물은 생장될 수 있고, 동일한 형질변환 균주 또는 상이한 균주로 수분될 수 있으며, 요망되는 표현형 특징이 발현되는 생성된 하이브리드가 동정될 수 있다. 2개 이상의 세대들은, 요망되는 표현형 특징의 발현이 안정하게 유지 및 유전되는지 보장하기 위해 생장될 수 있고, 그런 다음, 요망되는 표현형 특징의 발현을 보장하기 위해 수확된 종자가 달성되었다. 따라서, 본원에 사용된 바와 같이, "형질변환된 종자"는 식물 게놈 내에 안정하게 통합된 뉴클레오타이드 구축물을 함유하는 종자를 지칭한다.
5. 담배 변종
개시된 방법에 따라 변형될 수 있는 담배의 변종으로는, 다크 변종(예, 버얼리종), 플루 또는 브라이트 변종(예, 버지니아 플루), 오리엔탈 또는 터키 변종, 예컨대 라타키아, 및 유전학적으로 변형된 변종(예, 벡터 2141)이 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 버얼리종 담배는 일반적으로, 다른 담배 유형들보다 니트레이트를 더 높은 수준으로 축적하며, 궐련(열풍 건조된(flue-cured) 담배 및 오리엔탈종 담배를 또한 함유함)의 보편적인 "아메리칸 블렌드" 스타일에서 발견되는 TSNA가 불균형적으로 공유되는 데 기여하는 경향이 있다.
6. 담배 특이적 니트로소아민이 감소된 담배 제품
일 양태에서, 본 발명은 담배 특이적 니트로소아민(TSNA)이 감소된 담배 제품에 관한 것이다. TSNA는 담배 경화 과정 동안 및 흡연 동안에 생성된다. TSNA는 담배에서 천연적으로 발견되는 니트로소화제와 알칼로이드 사이의 반응에 의해 형성되고, 담배 연기 중의 발암원이기도 하다. 담배 제품은 상기 기술된 바와 같이, 변형된 담배 제품으로부터 생산된다.
변형된 담배 식물은 갓 수확되고, 경화된 다음, 담배 제품으로 가공될 수 있으며, 이러한 제품은 감소된 발암 잠재성을 나타낸다. 잎은 음건, 화건(fire cured), 열풍 건조 또는 양건될 수 있다. 음건된 담배는 통풍이 잘 되는 창고에 매달아두고, 4주 내지 8주 동안 건조시킨다. 음건된 담배는 당 함량이 낮아, 담배 연기가 연하고, 은은한 풍미를 풍기며, 니코틴 함량은 높다. 엽궐련 및 버얼리종 담배는 '다크' 음건된다. 화건 담배는 큰 창고에 매달아지고, 이곳에서 견목의 불길은 연속적이거나 간헐적인 낮은 연기나는 불(smolder)에서 유지되고, 과정 및 담배에 따라 3일 내지 10주 사이에 발생한다. 화건에 의해 당 함량이 낮고 니코틴 함량이 높은 담배가 생산된다. 황색종 담배를 본래, 담배 스틱 상으로 묶은 다음, 이러한 스틱을 경화 창고에서 타이어-폴(tier-pole)로부터 매달았다. 이들 창고는 외부에서 공급되는 화실(fire box)로부터 나오는 열풍을 가지고, 담배를 연기에 노출시지 않으면서 담배를 열기-건조(heat-curing)시키고, 경화 과정 동안 온도를 서서히 올린다. 이러한 과정은 일반적으로, 약 1주일 소요되고, 당 함량이 높고 니코틴 수준이 중간 내지 높은 궐련 담배를 생산한다. 대부분의 궐련은, 더 연하고, 더 흡입될 수 있는 연기를 생성하는 황색종 담배를 혼입한다. 양건 담배는 태양에 노출된 채 건조된다. 이러한 방법은 터키, 그리스 및 다른 지중해 국가들에서 사용되어, 오리엔탈종 담배가 제조된다. 양건된 담배는 당 및 니코틴 함량이 낮고, 궐련에 사용된다.
비제한적으로는, 상기 처리된 변형된 담배 식물로푸버 제조되는 흡연용 재료(예, 궐련, 엽궐련, 파이프 담배, 가향 물담배(flavored shisha tobacco)), 코담배, 디핑 담배, 궐련 대체물, 예컨대 니코틴 패치, 니코틴 마우스워시, 추진제와 함께 고압 가스 탱크에 포장된 스프레이 작용제, 니코틴 씹는 검 및 니코틴 음료, 및 론제지를 포함한 담배 제품 또한, 실시형태이다. e-액체 또는 e-궐련용 니코틴 용액, 개인용 기화기(personal vaporizer) 또는 전자 니코틴 전달 시스템 또한, 실시형태이다.
본원에 기술된 변형된 담배 제품으로부터 생산된 담배 제품은 대조군 담배 식물, 예컨대 야생형 담배 식물 대조군으로부터 생산된 담배 제품과 비교하여, 감소된 TSNA 수준을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형된 담배 제품으로부터 생산된 담배 제품은 대조군 담배 식물, 예컨대 야생형 담배 식물 대조군으로부터 생산된 담배 제품과 비교하여, 감소된 총 TSNA 수준을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형된 담배 제품으로부터 생산된 담배 제품은, 동일한 변종이고 종래의 기술에 의해 재배된 담배 또는 종래의 담배로부터 제조된 담배 제품과 비교하여, 비제한적으로, N-니트로소노르니코틴(NNN), 4-(메틸니트로소아미노)-1-(3-피리딜)-1-부타논(NNK), N-니트로소아나바신(NAB), N-니트로소아나타빈(NAT) 및 이들의 조합을 비롯한 적어도 하나의 TSNA를 감소된 수준으로 가질 수 있다.
변형된 담배 식물 유래의 경화된 잎으로 생산된 담배 제품은 대조군 담배 식물 유래의 경화된 잎으로부터 생산된 대조군 담배 제품과 비교하여, 적어도 약 5.0% 감소, 적어도 약 10.0% 감소, 적어도 약 15.0% 감소, 적어도 약 20.0% 감소, 적어도 약 25.0% 감소, 적어도 약 30.0% 감소, 적어도 약 35.0% 감소, 적어도 약 40.0% 감소, 적어도 약 45.0% 감소, 적어도 약 50.0% 감소, 적어도 약 55.0% 감소, 적어도 약 60.0% 감소, 적어도 약 65.0% 감소, 적어도 약 70.0% 감소, 적어도 약 75.0% 감소, 적어도 약 80.0% 감소, 적어도 약 85.0% 감소, 적어도 약 90.0%, 적어도 약 95.0% 감소 또는 적어도 약 99.0% 감소된 총 TSNA 수준을 가질 수 있다. 변형된 담배 식물 유래의 경화된 잎으로 생산된 담배 제품은 대조군 담배 식물 유래의 경화된 잎으로부터 생산된 대조군 담배 제품과 비교하여, 약 5.0% 내지 약 99.0%, 약 5.0% 내지 약 95.0%, 약 5.0% 내지 약 90.0%, 약 5.0% 내지 약 85.0%, 약 5.0% 내지 약 80.0%, 약 5.0% 내지 약 75.0%, 약 5.0% 내지 약 70.0%, 약 5.0% 내지 약 65.0%, 약 5.0% 내지 약 60.0%, 약 5.0% 내지 약 55.0%, 약 5.0% 내지 약 50.0%, 약 5.0% 내지 약 45.0%, 약 5.0% 내지 약 40.0%, 약 10.0% 내지 약 99.0%, 약 10.0% 내지 약 95.0%, 약 10.0% 내지 약 90.0%, 약 10.0% 내지 약 85.0%, 약 10.0% 내지 약 80.0%, 약 10.0% 내지 약 75.0%, 약 10.0% 내지 약 70.0%, 약 10.0% 내지 약 65.0%, 약 10.0% 내지 약 60.0%, 약 10.0% 내지 약 55.0%, 약 10.0% 내지 약 50.0%, 약 10.0% 내지 약 45.0%, 약 10.0% 내지 약 40.0%, 약 20.0% 내지 약 99.0%, 약 20.0% 내지 약 95.0%, 약 20.0% 내지 약 90.0%, 약 20.0% 내지 약 85.0%, 약 20.0% 내지 약 80.0%, 약 20.0% 내지 약 75.0%, 약 20.0% 내지 약 70.0%, 약 20.0% 내지 약 65.0%, 약 20.0% 내지 약 60.0%, 약 20.0% 내지 약 55.0%, 약 20.0% 내지 약 50.0%, 약 20.0% 내지 약 45.0%, 약 20.0% 내지 약 40.0%, 약 30.0% 내지 약 99.0%, 약 30.0% 내지 약 95.0%, 약 30.0% 내지 약 90.0%, 약 30.0% 내지 약 85.0%, 약 30.0% 내지 약 80.0%, 약 30.0% 내지 약 75.0%, 약 30.0% 내지 약 70.0%, 약 30.0% 내지 약 65.0%, 약 30.0% 내지 약 60.0%, 약 30.0% 내지 약 55.0%, 약 30.0% 내지 약 50.0%, 약 30.0% 내지 약 45.0%, 약 30.0% 내지 약 40.0%, 약 40.0% 내지 약 99.0%, 약 40.0% 내지 약 95.0%, 약 40.0% 내지 약 90.0%, 약 40.0% 내지 약 85.0%, 약 40.0% 내지 약 80.0%, 약 40.0% 내지 약 75.0%, 약 40.0% 내지 약 70.0%, 약 40.0% 내지 약 65.0%, 약 40.0% 내지 약 60.0%, 약 40.0% 내지 약 55.0%, 약 40.0% 내지 약 50.0%, 약 50.0% 내지 약 99.0%, 약 50.0% 내지 약 95.0%, 약 50.0% 내지 약 90.0%, 약 50.0% 내지 약 85.0%, 약 50.0% 내지 약 80.0%, 약 50.0% 내지 약 75.0%, 약 50.0% 내지 약 70.0%, 약 50.0% 내지 약 65.0%, 약 50.0% 내지 약 60.0%, 약 50.0% 내지 약 55.0%, 약 60.0% 내지 약 99.0%, 약 60.0% 내지 약 95.0%, 약 60.0% 내지 약 90.0%, 약 60.0% 내지 약 85.0%, 약 60.0% 내지 약 80.0%, 약 60.0% 내지 약 75.0%, 약 60.0% 내지 약 70.0% 또는 약 60.0% 내지 약 65.0% 감소된 총 TSNA 수준을 가질 수 있다.
변형된 담배 식물 유래의 경화된 잎으로 생산된 담배 제품은 대조군 담배 식물 유래의 경화된 잎으로부터 생산된 대조군 담배 제품과 비교하여, 적어도 약 5.0% 감소, 적어도 약 10.0% 감소, 적어도 약 15.0% 감소, 적어도 약 20.0% 감소, 적어도 약 25.0% 감소, 적어도 약 30.0% 감소, 적어도 약 35.0% 감소, 적어도 약 40.0% 감소, 적어도 약 45.0% 감소, 적어도 약 50.0% 감소, 적어도 약 55.0% 감소, 적어도 약 60.0% 감소, 적어도 약 65.0% 감소, 적어도 약 70.0% 감소, 적어도 약 72.0% 감소, 적어도 약 72.5% 감소, 적어도 약 73.0% 감소, 적어도 약 75.0% 감소, 적어도 약 80.0% 감소, 적어도 약 85.0% 감소, 적어도 약 90.0%, 적어도 약 95.0% 감소 또는 적어도 약 99.0% 감소된, 비제한적으로 N-니트로소노르니코틴(NNN), 4-(메틸니트로소아미노)-1-(3-피리딜)-1-부타논(NNK), N-니트로소아나바신(NAB), N-니트로소아나타빈(NAT) 및 이들의 조합을 비롯한 적어도 하나의 TSNA의 수준을 가질 수 있다. 변형된 담배 식물 유래의 경화된 잎으로 생산된 담배 제품은 대조군 담배 식물 유래의 경화된 잎으로부터 생산된 대조군 담배 제품과 비교하여, 약 5.0% 내지 약 99.0%, 약 5.0% 내지 약 95.0%, 약 5.0% 내지 약 90.0%, 약 5.0% 내지 약 85.0%, 약 5.0% 내지 약 80.0%, 약 5.0% 내지 약 75.0%, 약 5.0% 내지 약 70.0%, 약 5.0% 내지 약 65.0%, 약 5.0% 내지 약 60.0%, 약 5.0% 내지 약 55.0%, 약 5.0% 내지 약 50.0%, 약 5.0% 내지 약 45.0%, 약 5.0% 내지 약 40.0%, 약 10.0% 내지 약 99.0%, 약 10.0% 내지 약 95.0%, 약 10.0% 내지 약 90.0%, 약 10.0% 내지 약 85.0%, 약 10.0% 내지 약 80.0%, 약 10.0% 내지 약 75.0%, 약 10.0% 내지 약 70.0%, 약 10.0% 내지 약 65.0%, 약 10.0% 내지 약 60.0%, 약 10.0% 내지 약 55.0%, 약 10.0% 내지 약 50.0%, 약 10.0% 내지 약 45.0%, 약 10.0% 내지 약 40.0%, 약 20.0% 내지 약 99.0%, 약 20.0% 내지 약 95.0%, 약 20.0% 내지 약 90.0%, 약 20.0% 내지 약 85.0%, 약 20.0% 내지 약 80.0%, 약 20.0% 내지 약 75.0%, 약 20.0% 내지 약 70.0%, 약 20.0% 내지 약 65.0%, 약 20.0% 내지 약 60.0%, 약 20.0% 내지 약 55.0%, 약 20.0% 내지 약 50.0%, 약 20.0% 내지 약 45.0%, 약 20.0% 내지 약 40.0%, 약 30.0% 내지 약 99.0%, 약 30.0% 내지 약 95.0%, 약 30.0% 내지 약 90.0%, 약 30.0% 내지 약 85.0%, 약 30.0% 내지 약 80.0%, 약 30.0% 내지 약 75.0%, 약 30.0% 내지 약 70.0%, 약 30.0% 내지 약 65.0%, 약 30.0% 내지 약 60.0%, 약 30.0% 내지 약 55.0%, 약 30.0% 내지 약 50.0%, 약 30.0% 내지 약 45.0%, 약 30.0% 내지 약 40.0%, 약 40.0% 내지 약 99.0%, 약 40.0% 내지 약 95.0%, 약 40.0% 내지 약 90.0%, 약 40.0% 내지 약 85.0%, 약 40.0% 내지 약 80.0%, 약 40.0% 내지 약 75.0%, 약 40.0% 내지 약 70.0%, 약 40.0% 내지 약 65.0%, 약 40.0% 내지 약 60.0%, 약 40.0% 내지 약 55.0%, 약 40.0% 내지 약 50.0%, 약 50.0% 내지 약 99.0%, 약 50.0% 내지 약 95.0%, 약 50.0% 내지 약 90.0%, 약 50.0% 내지 약 85.0%, 약 50.0% 내지 약 80.0%, 약 50.0% 내지 약 75.0%, 약 50.0% 내지 약 70.0%, 약 50.0% 내지 약 65.0%, 약 50.0% 내지 약 60.0%, 약 50.0% 내지 약 55.0%, 약 60.0% 내지 약 99.0%, 약 60.0% 내지 약 95.0%, 약 60.0% 내지 약 90.0%, 약 60.0% 내지 약 85.0%, 약 60.0% 내지 약 80.0%, 약 60.0% 내지 약 75.0%, 약 60.0% 내지 약 70.0% 또는 약 60.0% 내지 약 65.0%의, 비제한적으로 N-니트로소노르니코틴(NNN), 4-(메틸니트로소아미노)-1-(3-피리딜)-1-부타논(NNK), N-니트로소아나바신(NAB), N-니트로소아나타빈(NAT) 및 이들의 조합을 비롯한 적어도 하나의 TSNA의 수준을 가질 수 있다.
7. 담배 특이적 니트로소아민이 감소된 각초 담배 및 담배 연기
일 양태에서, 본 발명은 흡연 시 잎의 연소로부터 수득되는 연기, 즉, 담배 연기에 감소된 담배 특이적 니트로소아민(TSNA)을 가진 담배 제품에 관한 것이다. 연소 후 궐련의 주증기 연기 내 TSNA 함량은 하기 인자들인 (1) 각초 내 기존의 TSNA의 양; (2) 각초로부터 연기로의 기존의 TSNA의 트랜스퍼 효율; (3) 열분해를 통한 기존의 TSNA의 파괴 정도; 및 (4) 열합성을 통한 새로운 TSNA의 형성 정도에 따라 다르다. 담배 연기는 상기 기술된 바와 같이, 대조군 담배 식물, 예컨대 야생형 담배 식물 대조군과 비교하여 감소된 유리 니트레이트 수준을 가진 변형된 담배 식물로부터 생산된다.
본원에 기술된 변형된 담배 식물로부터 생산되는 각초 담배 또는 담배 연기는 대조군 담배 식물, 예컨대 야생형 담배 식물 대조군으로부터 생산되는 각초 담배 또는 담배 연기와 비교하여 감소된 TSNA 수준을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형된 담배 식물로부터 생산되는 각초 담배 또는 담배 연기는 대조군 담배 식물, 예컨대 야생형 담배 식물 대조군으로부터 생산되는 각초 담배 또는 담배 연기와 비교하여 감소된 총 TSNA 수준을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형된 담배 식물로부터 생산되는 각초 담배 또는 담배 연기는 동일한 변종의 담배로부터 생산되고 종래의 기술에 의해 재배되는 각초 담배 또는 담배 연기 또는 종래의 담배로부터 제조되는 담배 제품과 비교하여, 비제한적으로 N-니트로소노르니코틴(NNN), 4-(메틸니트로소아미노)-1-(3-피리딜)-1-부타논(NNK), N-니트로소아나바신(NAB), N-니트로소아나타빈(NAT) 및 이들의 조합을 비롯한 적어도 하나의 TSNA를 감소된 수준으로 가질 수 있다.
변형된 담배 식물로부터 생산된 각초 담배는 대조군 담배 식물로부터 생산된 대조군 각초 담배로부터 생산된 각초 담배와 비교하여, 적어도 약 5.0% 감소, 적어도 약 10.0% 감소, 적어도 약 15.0% 감소, 적어도 약 20.0% 감소, 적어도 약 25.0% 감소, 적어도 약 30.0% 감소, 적어도 약 32.0% 감소, 적어도 약 35.0% 감소, 적어도 약 40.0% 감소, 적어도 약 44.0% 감소, 적어도 약 45.0% 감소, 적어도 약 50.0% 감소, 적어도 약 52.0% 감소, 적어도 약 55.0% 감소, 적어도 약 60.0% 감소, 적어도 약 64.0% 감소, 적어도 약 65.0% 감소, 적어도 약 70.0% 감소, 적어도 약 72.0% 감소, 적어도 약 72.5% 감소, 적어도 약 73.0% 감소, 적어도 약 75.0% 감소, 적어도 약 80.0% 감소, 적어도 약 85.0% 감소, 적어도 약 90.0%, 적어도 약 95.0% 감소 또는 적어도 약 99.0% 감소된, 총 TSNA 수준 또는 비제한적으로 N-니트로소노르니코틴(NNN), 4-(메틸니트로소아미노)-1-(3-피리딜)-1-부타논(NNK), N-니트로소아나바신(NAB), N-니트로소아나타빈(NAT) 및 이들의 조합을 비롯한 적어도 하나의 TSNA의 수준을 가질 수 있다.
담배 제품으로부터 생산된 각초 담배는 대조군 담배 식물로부터 생산된 대조군 각초 담배로부터 생산된 각초 담배와 비교하여, 약 5.0% 내지 약 99.0%, 약 5.0% 내지 약 95.0%, 약 5.0% 내지 약 90.0%, 약 5.0% 내지 약 85.0%, 약 5.0% 내지 약 80.0%, 약 5.0% 내지 약 75.0%, 약 5.0% 내지 약 70.0%, 약 5.0% 내지 약 65.0%, 약 5.0% 내지 약 60.0%, 약 5.0% 내지 약 55.0%, 약 5.0% 내지 약 50.0%, 약 5.0% 내지 약 45.0%, 약 5.0% 내지 약 40.0%, 약 10.0% 내지 약 99.0%, 약 10.0% 내지 약 95.0%, 약 10.0% 내지 약 90.0%, 약 10.0% 내지 약 85.0%, 약 10.0% 내지 약 80.0%, 약 10.0% 내지 약 75.0%, 약 10.0% 내지 약 70.0%, 약 10.0% 내지 약 65.0%, 약 10.0% 내지 약 60.0%, 약 10.0% 내지 약 55.0%, 약 10.0% 내지 약 50.0%, 약 10.0% 내지 약 45.0%, 약 10.0% 내지 약 40.0%, 약 20.0% 내지 약 99.0%, 약 20.0% 내지 약 95.0%, 약 20.0% 내지 약 90.0%, 약 20.0% 내지 약 85.0%, 약 20.0% 내지 약 80.0%, 약 20.0% 내지 약 75.0%, 약 20.0% 내지 약 70.0%, 약 20.0% 내지 약 65.0%, 약 20.0% 내지 약 60.0%, 약 20.0% 내지 약 55.0%, 약 20.0% 내지 약 50.0%, 약 20.0% 내지 약 45.0%, 약 20.0% 내지 약 40.0%, 약 30.0% 내지 약 99.0%, 약 30.0% 내지 약 95.0%, 약 30.0% 내지 약 90.0%, 약 30.0% 내지 약 85.0%, 약 30.0% 내지 약 80.0%, 약 30.0% 내지 약 75.0%, 약 30.0% 내지 약 70.0%, 약 30.0% 내지 약 65.0%, 약 30.0% 내지 약 60.0%, 약 30.0% 내지 약 55.0%, 약 30.0% 내지 약 50.0%, 약 30.0% 내지 약 45.0%, 약 30.0% 내지 약 40.0%, 약 40.0% 내지 약 99.0%, 약 40.0% 내지 약 95.0%, 약 40.0% 내지 약 90.0%, 약 40.0% 내지 약 85.0%, 약 40.0% 내지 약 80.0%, 약 40.0% 내지 약 75.0%, 약 40.0% 내지 약 70.0%, 약 40.0% 내지 약 65.0%, 약 40.0% 내지 약 60.0%, 약 40.0% 내지 약 55.0%, 약 40.0% 내지 약 50.0%, 약 50.0% 내지 약 99.0%, 약 50.0% 내지 약 95.0%, 약 50.0% 내지 약 90.0%, 약 50.0% 내지 약 85.0%, 약 50.0% 내지 약 80.0%, 약 50.0% 내지 약 75.0%, 약 50.0% 내지 약 70.0%, 약 50.0% 내지 약 65.0%, 약 50.0% 내지 약 60.0%, 약 50.0% 내지 약 55.0%, 약 60.0% 내지 약 99.0%, 약 60.0% 내지 약 95.0%, 약 60.0% 내지 약 90.0%, 약 60.0% 내지 약 85.0%, 약 60.0% 내지 약 80.0%, 약 60.0% 내지 약 75.0%, 약 60.0% 내지 약 70.0% 또는 약 60.0% 내지 약 65.0% 감소된, 총 TSNA 수준 또는 비제한적으로 N-니트로소노르니코틴(NNN), 4-(메틸니트로소아미노)-1-(3-피리딜)-1-부타논(NNK), N-니트로소아나바신(NAB), N-니트로소아나타빈(NAT) 및 이들의 조합을 비롯한 적어도 하나의 TSNA의 수준을 가질 수 있다.
담배 제품으로부터 생성되는 담배 연기는 대조군 담배 식물로부터 생산된 대조군 담배 제품 유래의 담배 연기와 비교하여, 적어도 약 5.0% 감소, 적어도 약 10.0% 감소, 적어도 약 15.0% 감소, 적어도 약 20.0% 감소, 적어도 약 25.0% 감소, 적어도 약 30.0% 감소, 적어도 약 32.0% 감소, 적어도 약 35.0% 감소, 적어도 약 40.0% 감소, 적어도 약 44.0% 감소, 적어도 약 45.0% 감소, 적어도 약 50.0% 감소, 적어도 약 52.0% 감소, 적어도 약 55.0% 감소, 적어도 약 60.0% 감소, 적어도 약 64.0% 감소, 적어도 약 65.0% 감소, 적어도 약 70.0% 감소, 적어도 약 72.0% 감소, 적어도 약 72.5% 감소, 적어도 약 73.0% 감소, 적어도 약 75.0% 감소, 적어도 약 80.0% 감소, 적어도 약 85.0% 감소, 적어도 약 90.0%, 적어도 약 95.0% 감소 또는 적어도 약 99.0% 감소된, 총 TSNA 수준 또는 비제한적으로 N-니트로소노르니코틴(NNN), 4-(메틸니트로소아미노)-1-(3-피리딜)-1-부타논(NNK), N-니트로소아나바신(NAB), N-니트로소아나타빈(NAT) 및 이들의 조합을 비롯한 적어도 하나의 TSNA의 수준을 가질 수 있다.
담배 제품으로부터 생성되는 담배 연기는 대조군 담배 식물로부터 생산된 대조군 담배 제품 유래의 담배 연기와 비교하여, 약 5.0% 내지 약 99.0%, 약 5.0% 내지 약 95.0%, 약 5.0% 내지 약 90.0%, 약 5.0% 내지 약 85.0%, 약 5.0% 내지 약 80.0%, 약 5.0% 내지 약 75.0%, 약 5.0% 내지 약 70.0%, 약 5.0% 내지 약 65.0%, 약 5.0% 내지 약 60.0%, 약 5.0% 내지 약 55.0%, 약 5.0% 내지 약 50.0%, 약 5.0% 내지 약 45.0%, 약 5.0% 내지 약 40.0%, 약 10.0% 내지 약 99.0%, 약 10.0% 내지 약 95.0%, 약 10.0% 내지 약 90.0%, 약 10.0% 내지 약 85.0%, 약 10.0% 내지 약 80.0%, 약 10.0% 내지 약 75.0%, 약 10.0% 내지 약 70.0%, 약 10.0% 내지 약 65.0%, 약 10.0% 내지 약 60.0%, 약 10.0% 내지 약 55.0%, 약 10.0% 내지 약 50.0%, 약 10.0% 내지 약 45.0%, 약 10.0% 내지 약 40.0%, 약 20.0% 내지 약 99.0%, 약 20.0% 내지 약 95.0%, 약 20.0% 내지 약 90.0%, 약 20.0% 내지 약 85.0%, 약 20.0% 내지 약 80.0%, 약 20.0% 내지 약 75.0%, 약 20.0% 내지 약 70.0%, 약 20.0% 내지 약 65.0%, 약 20.0% 내지 약 60.0%, 약 20.0% 내지 약 55.0%, 약 20.0% 내지 약 50.0%, 약 20.0% 내지 약 45.0%, 약 20.0% 내지 약 40.0%, 약 30.0% 내지 약 99.0%, 약 30.0% 내지 약 95.0%, 약 30.0% 내지 약 90.0%, 약 30.0% 내지 약 85.0%, 약 30.0% 내지 약 80.0%, 약 30.0% 내지 약 75.0%, 약 30.0% 내지 약 70.0%, 약 30.0% 내지 약 65.0%, 약 30.0% 내지 약 60.0%, 약 30.0% 내지 약 55.0%, 약 30.0% 내지 약 50.0%, 약 30.0% 내지 약 45.0%, 약 30.0% 내지 약 40.0%, 약 40.0% 내지 약 99.0%, 약 40.0% 내지 약 95.0%, 약 40.0% 내지 약 90.0%, 약 40.0% 내지 약 85.0%, 약 40.0% 내지 약 80.0%, 약 40.0% 내지 약 75.0%, 약 40.0% 내지 약 70.0%, 약 40.0% 내지 약 65.0%, 약 40.0% 내지 약 60.0%, 약 40.0% 내지 약 55.0%, 약 40.0% 내지 약 50.0%, 약 50.0% 내지 약 99.0%, 약 50.0% 내지 약 95.0%, 약 50.0% 내지 약 90.0%, 약 50.0% 내지 약 85.0%, 약 50.0% 내지 약 80.0%, 약 50.0% 내지 약 75.0%, 약 50.0% 내지 약 70.0%, 약 50.0% 내지 약 65.0%, 약 50.0% 내지 약 60.0%, 약 50.0% 내지 약 55.0%, 약 60.0% 내지 약 99.0%, 약 60.0% 내지 약 95.0%, 약 60.0% 내지 약 90.0%, 약 60.0% 내지 약 85.0%, 약 60.0% 내지 약 80.0%, 약 60.0% 내지 약 75.0%, 약 60.0% 내지 약 70.0% 또는 약 60.0% 내지 약 65.0% 감소된, 총 TSNA 수준 또는 비제한적으로 N-니트로소노르니코틴(NNN), 4-(메틸니트로소아미노)-1-(3-피리딜)-1-부타논(NNK), N-니트로소아나바신(NAB), N-니트로소아나타빈(NAT) 및 이들의 조합을 비롯한 적어도 하나의 TSNA의 수준을 가질 수 있다.
8. TSNA가 감소된 담배 제품의 생산 방법
본 발명은 또한, TSNA 수준이 감소된 담배 제품의 생산 방법에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 방법은 탈조절화된 니트레이트 리덕타제 폴리펩타이드를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 식물 세포 내에 도입하고; 형질변환된 세포를 재생시켜, 유전자이식 식물을 생산하고; 유전자이식 식물의 잎으로부터 담배 제품을 생산하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 방법은 내인성 니트레이트 리덕타제 유전자를 표적화하는 게놈 편집 시스템을 식물 세포 내에 도입하고; 형질변환된 세포를 재생시켜, 유전자이식 식물을 생산하고; 유전자이식 식물의 잎으로부터 담배 제품을 생산하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 식물은 식물, 식물 조직 또는 식물 세포로부터 재생되거나 생장될 수 있다. 식물 세포 또는 식물 조직으로부터 식물을 재생시키거나 생장시키기에 적합한 임의의 방법, 예컨대 비제한적으로, 조직 배양 또는 원형질체로부터의 재생이 사용될 수 있다. 적합하게는, 식물은 형질변환된 식물 세포를 유합 조직 유도 배지, 슈트 유도 배지 및/또는 뿌리 유도 배지 상에서 생장시킴으로써 재생될 수 있다. 재생된 식물은 변형된 담배 식물의 형태학적 특징 및 생리학적 특징을 실질적으로 모두 가진다.
9. 담배 제품에서 담배 특이적 니트로소아민을 감소시키는 방법
일 양태에서, 본 발명은 비변형된 담배 식물에서의 TSNA 수준과 비교하여 감소된 TSNA 수준을 가진 담배 제품의 생산 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은, 담배 식물을, 탈조절화된 니트레이트 리덕타제 효소를 인코딩하는 서열을 포함하거나, 이루어지거나 본질적으로 이루어진 폴리뉴클레오타이드; (i)에 나타낸 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드; 탈조절화된 니트레이트 리덕타제 효소를 인코딩하는 서열을 포함하거나, 이루어지거나 본질적으로 이루어진 폴리펩타이드; 또는 (i)에 나타낸 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 구축물, 벡터 또는 발현 벡터를 포함하도록 변형하는 단계로서, 여기서, 상기 니트레이트 리덕타제의 발현 또는 활성은 비변형된 대조군 담배 식물과 비교하여 탈조절화되는, 단계; 상기 변형된 담배 식물로부터 담배 잎을 수확하는 단계; 및 수확된 잎으로부터 담배 제품을 생산하는 단계를 포함한다.
10. 담배 제품 유래의 연기 내에서 담배 특이적 니트로소아민을 감소시키는 방법
일 양태에서, 본 발명은, 변형된 담배 식물의 잎의 연소로부터 수득된 연기에서 측정된 TSNA 수준이 비변형된 담배 식물의 연소로부터 수득된 연기에서 측정된 TSNA 수준과 비교하여 감소되는, 담배 제품의 생산 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은, 담배 식물을, 탈조절화된 니트레이트 리덕타제 효소를 인코딩하는 서열을 포함하거나, 이루어지거나 본질적으로 이루어진 폴리뉴클레오타이드; (i)에 나타낸 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드; 탈조절화된 니트레이트 리덕타제 효소를 인코딩하는 서열을 포함하거나, 이루어지거나 본질적으로 이루어진 폴리펩타이드; 또는 (i)에 나타낸 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 구축물, 벡터 또는 발현 벡터를 포함하도록 변형하는 단계로서, 여기서, 상기 니트레이트 리덕타제의 발현 또는 활성은 비변형된 대조군 담배 식물과 비교하여 탈조절화되는, 단계; 상기 변형된 담배 식물로부터 담배 잎을 수확하는 단계; 및 수확된 잎으로부터 담배 제품을 생산하는 단계를 포함한다.
당업자는, 본원에 기술된 본 개시내용의 다른 적합한 변형 및 조정이 쉽게 적용가능하고 이해될 수 있으며, 본 개시내용 또는 본원에 개시된 양태 및 실시형태의 범위로부터 벗어나지 않으면서 적합한 등가물을 사용하여 이루어질 수 있음을 쉽게 알게 될 것이다. 이제 본 개시내용을 상세히 기술하여, 이러한 개시내용은 하기 실시예를 참조로 보다 명확하게 이해될 것이며, 이러한 실시예는 단지 본 개시내용의 일부 양태 및 실시형태를 예시하고자 하는 것일 뿐이고, 본 개시내용의 범위를 제한하는 것으로 봐서는 안 된다. 본원에서 인용된 모든 저널 참조문헌, 미국 특허 및 공개문헌의 개시내용은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 통합된다.
본 발명은 하기 비제한적인 실시예에 의해 예시되는 다수의 양태들을 가진다.
실시예
실시예 1
방법 및 재료
플라스미드 구축물. 니트레이트-동화(N-동화) 경로에 관여된 하기 5개의 유전자들을 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 사용하여 클로닝하였다: "S523D-NR" - 부위-관련 돌연변이발생을 사용하여 코돈 523에 도입된 Ser → Asp 치환 돌연변이를 함유하는(문헌[Lillo 외 Plant J. 35:566-573 (2003)]) 담배 Nia2 cDNA(문헌[Vaucheret 외 Plant Mol. Biol. 12:597-200 (1989)]); "tr-NR" - 코돈 2 내지 56이 부위-관련 돌연변이발생에 의해 제거된 Nia2 cDNA의 N-말단 절단(문헌[Nussaume 외 Plant Cell 7:611-621 (1995)]); "GS1" - 담배 Gln1 -3 유전자의 전장 cDNA(문헌[Dubois 외 Plant Mol. Biol. 31:803-817 (1996)]); "GOGAT" - 아라비 돕시스 탈리아나의 GLT1 유전자의 전장 cDNA(문헌[Lancien 외 Plant J.29:347-358 (2002)]); 및 "ICDH" - 담배 시토졸 이소시트레이트 데하이드로게나제의 전장 cDNA(GenBank 수탁 번호 77944).
담배에서 다양한 구축물들을 발현시키기 위해, 각각의 cDNA를 바이너리(binary) 벡터 pBI121(문헌[Chen 외 Mol. Breed. 11:287-293 (2003)]) 내에, 이러한 벡터 내의 GUS 리포터 유전자를 각각의 N-동화 경로 cDNA로 대체함으로써, 개별적으로 삽입하였다. 이는 CaMV의 강한 구성적 35S 프로모터의 전사 조절 하에 구축물을 위치시켰다. 식물 발현 벡터 pBI121은 항생제 카나마이신을 사용하여 형질변환된 세포를 선별할 수 있는 nptII 유전자를 함유한다. CYP82E4 (E4) 프로모터를 함유하는 구축물에 있어서, 35S 프로모터를 함유하는 벡터의 약 850 bp 영역을 절제하였고, CYP82E4 출발 코돈의 바로 상류에 위치한 2.2 kb 영역으로 대체하였다(문헌[Chakrabarti 외 Plant Mol. Biol. 66:415-427 (2008)]). 생성된 식물 발현 벡터를 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 EHA105 내에 도입하고, 카나마이신(50 mg/L) 및 리팜피신(20 mg/L)이 보충된 YEP 배지(1% 박토-펩톤, 1% 박토-효모 추출물 및 0.5% NaCl) 상에서 성장시켰다.
식물 재료. 버얼리종 육종 주 DH98-325-6#775를 35S:tr-NR, 35S:S523D-NR, 35S:GS1, 35S:GOGAT, 35S:ICDH, E4:tr-NR, E4:S523D-NR 및 E4:GOGAT 구축물로 개별적으로 형질변환시켰다. 각각의 구축물에 대해 독립적인 유전자이식 주 몇몇을, 준-정량적 RT-PCR을 사용하여 검정하여, 담배 액틴 유전자와 비교하여 이식유전자 발현을 최고 수준으로 나타내는 개별 식물을 동정하였다. 녹색 잎 조직을, 35S CaMV 프로모터의 전사 조절 하에 구축물을 함유하는 식물의 발현 분석에 사용하였다. E4 프로모터를 함유하는 식물의 경우, 문헌[Chakrabarti 외 (2008)]에 기술된 바와 같이 탈착시키고 에테폰으로 처리한 잎에서 발현 분석을 수행하였다. 각각의 고 발현 T0 개체에 있어서는, 몇몇 T1 식물을 생장시키고, 동족(cognate) 이식유전자에 대한 진단 프라이머를 사용하여 유전자형 분석(genotype)하여, 이식 유전자를 유전하는 자손을 널 분리물로부터 구별하였다. 주어진 이식유전자를 가진 것으로 양성으로 검정된 각각의 T0 식물 유래의 수많은 T1 자손들을 준-정량적 RT-PCR에 의해 다시 검정하여, 고 발현 표현형이 다음 세대에도 신뢰성 있게 전파되는지 시험하였다. 고 발현 표현형을 균일하게 전파하는 것으로 나타난 주(line)들을 사용하여, T2 세대 자손을 생산하였다.
버얼리종 품종 TN90e4e5를 35S:S523D-NR 구축물 및 E4:S523D-NR 구축물에 의해 공동-형질변환시켰다. 각각 S523D-NR 구축물 중 하나를 가진 2개의 아그로박테리움 배양물을 동일한 양으로 조합하고, 이러한 조합물을 사용하여 TN90e4e5의 잎 디스크를 형질변환시켰다. PCR-기재 분자적 유전자형 분석을 수행하여, 각각의 T0 개체 내에서 이식유전자의 상보체를 구별하였다. 35S 또는 E4 프로모터 영역에 특이적인 프라이머를 S523D-NR에 상응하는 프라이머와 쌍을 이뤄서, 2개의 구축물을 구별하였다. TN90e4e5를 E4:GUS 구축물로 형질변환시킴으로써 벡터 대조군 식물을 발생시켰다(문헌[Chakrabarti 외, 2008]). 각각의 T0 식물에 대한 이식유전자 발현 수준을, Mx3000P QPCR 장비를 제조업체(Agilent Technologies)의 프로토콜에 따라 사용하여 RT-PCR에 의해 확인하였다. S523D-NR에 상응하는 프라이머를 사용한 RT-PCR 데이터를 신장 인자 1α 조절 유전자의 발현에 따라 정상화하였다.
조절된 환경 챔버 실험을 위한 성장 조건. 주 35S:tr-NR, 35S:S523D-NR, 35S:GS1, 35S:GOGAT, 35S:ICDH 및 WT 대조군 유래의 T2 유전자이식 담배 식물을, 노스캐롤라이나주 대학교 식물 생장 조절실 설비(Phytotron facility)에서 조절된 환경 챔버에서 생장시켰다. 종자를 2:1 토탄-모래 믹스 상에서 발아시켰다. 4주령 묘목을 개별 셀에 이식하고, 12시간 26℃ 낮/12시간 22℃ 밤 계획을 사용하여 생장시켰다. 1500 μmol m2s-1의 광합성 양자 유속 밀도를 1:1 비율의 금속 할라이드 및 고압 소듐 램프 및 백열 램프에 의해 제공하였다. 식물에게는 1일 1회 탈이온수로 물을 주었으며, 1일 1회 106.23 mg/L 질소, 10.41 mg/L 인, 111.03 mg/L 칼륨, 54.4 mg/L 칼슘, 12.4 mg/L 마그네슘, 5 mg/L 철, 13.13 mg/L 황, 0.113 mg/L 망간, 0.24 mg/L 붕소, 0.013 mg/L 아연, 0.005 mg/L 구리, 0.00003 mg/L 코발트, 0.05 mg/L 몰리브덴 및 11.04 mg/L 나트륨으로 이루어진 영양액을 제공하였다.
식재한 지 대략 2달째에, 1개 유전자형 당 18개의 식물을 증기-멸균된 강모래(river sand)로 충전된 6" 포트에 이식하였다. 유사한 크기의 개체들을 선별하는 데 주의를 기울였다. 1개 유전자형 당 6개의 식물을 각각의 니트레이트-비옥화 처리에 노출시켰다. 식물 사망 및/또는 비정상적으로 생장 저해된(stunted) 생장 표현형의 관찰에 의해 4개의 35S:ICDH, 2개의 35S:S523D-NR 및 1개의 35S:GS1 식물을 잃게 되었다.
6" 포트에 이식한 후 처음 7일 동안, 모든 식물에게 과량의 니트레이트(19 mM NO3-)를 함유하는 영양액과 함께 물을 주어, 이들 식물을 이식 쇼크에 대해 적응시켰다. 19 mM 니트레이트 영양액은 5 mM Ca(NO3)2, 2 mM Mg(NO3)2, 5 mM KNO3, 1 mM KH2PO4, 0.5 mM K2SO4, 19μM H3BO3, 3.7 μM MnCl2, 0.3 μM ZnSO4, 0.13 μM CuSO4, 0.05 μM Na2MoO4 및 10.0 μM 330 Fe-세퀘스트렌(Sequestrene)으로 이루어졌다. 7일간의 적응 기간 후, 각각의 유전자형 그룹 유래의 식물을 3개의 그룹으로 동일하게 나누고, 다음 16일 동안 매우 낮은 니트레이트(0.2 mM NO3 -), 중간 니트레이트 (8 mM NO3 -) 또는 높은 N(19 mM NO3 -) 영양액과 함께 물을 주었다. 이온 균형 및 삼투성 균형을 유지하기 위해, 적절하다면 낮은 용액 및 중간 용액에 대해 NO3-를 SO4 2-로 치환하였다. 따라서, 낮은(0.2 mM NO3 -) N 영양분은 0.1 mM Ca(NO3)2, 3 mM K2SO4, 2 mM MgSO4 및 4.9 mM CaSO4·2H2O (Mg(NO3)2 또는 KNO3)를 포함하지 않음)로 이루어졌고, 중간(8 mM NO3 -) N 영양분은 4 mM Ca(NO3)2, 3 mM K2SO4, 2 mM MgSO4 및 1 mM CaSO4·2H2O (Mg(NO3)2 또는 KNO3를 포함하지 않음)를 함유하였다.
16일의 실험 동안, 각각의 식물에 1일 3회 물을 주었으며: 아침에는 적절한 영양액 200 mL를 함께 주었고, 낮에는 200 mL 증류수를 함께 주었으며, 오후에는 1000 mL 증류수를 함께 주어 영양분을 걸러 내었고, 후속해서 적절한 영양액 200 mL을 주었다. 챔버 조건은 낮 26℃ 및 밤 22℃이었으며, 낮 12시간 및 밤 12시간 기간이었다.
엽록소 검정법. 처리 기간의 종료 시, 엽록소 검정법을 프로토콜 교환 (문헌[Ni 외 (2009) doi:10.1038/nprot.2009.12])에서 공개된 프로토콜에 따라 DU® 640 분광광도계(Beckman™ Coulter)를 사용하여 수행하였다. 엽록소 a(Ca), 엽록소 b(Cb) 및 엽록소 a+b(Ca+b) 농도를 하기 식에 따라 계산하였으며(문헌[Arnon Plant Physiol 24:1-15 (1949)]), 여기서, V는 추출물의 부피(mL)이고, W는 신선한 잎의 중량(g)이다.
Ca (mg/g) = (12.7 x A663 - 2.69 x A645) x V / (1000 x W)
Cb (mg/g) = (22.9 x A645 - 4.68 x A663) x V / (1000 x W)
Ca+b (mg/g) = (8.02 x A663 + 20.20 x A645) x V / (1000 x W)
생중량 분석 및 시료 제조. 16일의 처리 기간 후, 각각의 식물을 기부(base)에서 절단하고 이의 생중량을 기록함으로써, 총 식물 바이오매스 측정을 수행하였다. 각각의 시료를 칭량한 직후, 각각의 식물 상의 유사한 위치로부터의 단일 잎(상부로부터 4번째 잎 또는 5번째 잎)을 절제하고, 이의 주맥을 제거한 다음, 잔여 라미나를 액체 질소에서 동결시키고, 아미노산 분석을 위해 -80℃에 보관하였다. 엽록소 검정법용의 각각의 식물로부터 유사한 위치로부터 작은 잎 시료(약 300 mg)를 또한, 수집하였다. 후속적으로, 각각의 식물 상의 잔여 잎을 주요 줄기로부터 벗겨내고, 종이 가방에 놓은 다음, 65℃ 건조 오븐에서 2일 동안 인큐베이션하였다. 후속적으로, 건조된 잎 시료를 니트레이트 및 암모니아 분석을 위해 미세 분말로 분쇄하였다.
니트레이트 , 니트라이트 및 암모니아 검정법. 생장 챔버 실험을 위해, 각각의 시료로부터 건조된 잎 분말 약 100 mg을 칭량하고, 10 mL 탈이온수를 사용하여 추출하였다. #4 Whatman™ 필터 종이를 통해 여과한 후, 상층액을 노스캐롤라이나주 대학교의 환경 농업 시험 서비스(EATS) 실험실에서 멀티-채널 자동-분석기를 사용하여 니트레이트 및 암모늄 농도에 대해 검정하였다. 니트레이트 및 암모늄 양을 Lachat Instruments Handbook의 프로토콜에 따라 계산하였다.
현장에서 생장된 시료 및 온실에서 생장된 T0 재료에 대해, 토엽 조직을 켄터키 대학교 담배 분석 실험실에서 니트레이트에 대해 분석하였다. 니트레이트 정량화를 Crutchfield 및 Grove(문헌[J. AOAC International 94:1898-1905 (2011)])에 서술된 프로토콜에 따라 확인하였다. 니트라이트 분석을, Crutchfield 및 Burton(문헌[Anal. Letters 22:555-571 (1989)])에 의해 기술된 방법을 사용하여 토양 음건된 시료(ground air-cured field sample) 상에서 수행하였다.
아미노산 검정법. 액체 질소에서 동결되었던 생장 챔버에서 생장된 식물의 잎 시료를 동결 건조기에 2일 동안 두어서, 완전히 건조하였다. 그런 다음, 건조된 시료를 액체 질소에서 막자사발 및 막자를 사용하여 미세 분말로 분쇄하였다. 건조된 잎 분말 대략 100 mg을 칭량하고, 아미노산 검정법 측정을 위해 노스캐롤라이나주 대학교의 바이오제작 훈련 및 교육 센터의 분석 실험실에 제공하였다. 간략하게는, 각각의 시료를 80% MeOH-20% H2O 1.0 mL를 사용하여 추출하고, 와동시킨 후, 20,000 x g에서 원심분리하였다. 정화된 상층액 200-μL 분취물을 -80℃에서 대략 2시간 동안 냉각시킨 다음, 밤새 동결시켰다. 건조된 재료를 보레이트 완충제(pH 8.0) 200 μL에 용해시킨 다음, 다시 보레이트 완충제와 함께 1:10으로 희석시켰다. 추출된 시료 10 μL를 보레이트 완충제 70 μL 및 유도체 합성용 시약(derivatization reagent) 20 μL에 첨가함으로써, 시료를 유도체 합성하였다. 바이얼을 55℃에서 10분 동안 가열하고, 실온까지 냉각시킨 다음, 와동시켜 내용물들을 혼합하였다. 유도체 합성된 시료를 초고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 분석하였다.
음건된 잎의 알칼로이드 및 TSNA 분석. 경화된 잎 시료에서의 니코틴, 노르니코틴, 아나타빈 및 아나바신 수준을 이전에 구축된 프로토콜에 따라 Perkin-Elmer Autosystem XL Gas 크로마토그래피를 사용하여 정량화하였다(문헌[Jack 외 Rec. Adv. Tob. Sci. 33:58-79 (2007)]). 총 알칼로이드를 니코틴, 노르니코틴, 아나타빈 및 아나바신의 합계로서 계산하였다. NNN, NNK, NAT 및 NAB의 정량화를 Morgan 등의 "방법 1"에 따라 수행하였다(문헌[Beit. Tabakforschung 23:192-203 (2004)]). 총 TSNA는 NNN, NNK, NAT 및 NAB의 합계를 나타낸다.
각초 담배 및 연기에서의 TSNA 추출 및 분석. 각초 담배의 시료를, 정량화를 할 수 있도록 중수소화된 내부 표준을 함유하는 100 mM 암모늄 아세테이트 용액을 이용하여 추출하였다. 추출물을 PVDF 주사기 필터(0.45 ㎛ 기공 크기)를 사용하여 여과하고, 전기분무 이온화(ESI)와 커플링된 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분광법(LC-MS/MS)에 의해 분석하였다. D4-N-니트로소노르니코틴(D4-NNN)을 NNN에 대한 내부 표준으로서 사용하고, 한편, D4-4-(메틸-니트로소아민)-1-(3-피리딜)-1-부타논(D4-NNK)은 NNK, NAT 및 NAB에 대한 내부 표준으로서의 역할을 하였다.
각초로부터 제조된 시험 궐련을 조건화하고, 건강 캐나다 방법(Health Canada Method) 번호 T-115에서 명시된 흡연 절차에 따라 연기를 뿜었다. 주류 연기를 캠브리지 필터 상에서 수집하고, D4-NNN 표준 및 D4-NNK 표준을 함유하는 100 mM 암모늄 아세테이트를 이용하여 추출한 다음, 0.45 ㎛ 기공 PVDF 주사기 필터를 이용하여 여과하였다. 암모늄 아세테이트 추출물을 ESI와 커플링된 LC-MS/MS에 의해 분석하고, D4-NNN 표준 및 D4-NNK 표준에 따라 정량화하였다.
통계학적 분석. SAS 9.1(SAS Institute, Cary, NC)의 PROC GLM 절차를 사용하여, 분산(variance)의 분석을 수행하고, 포함된 유전자이식 주 및 WT 주 각각에 대한 평균을 계산하였다. 이질적인 분산 때문에, 자연 로그 데이터 변환을 수행하여, 생장 챔버 실험에 대해 수집된 생중량, 니트레이트 및 암모니아 데이터에 대한 정규 분포의 근사치를 내었다. 비-변환된 값을 모든 다른 데이터세트에 대해 사용하였다. 유의 수준을 라이언-아이노트-가브리엘-웰쉬(Ryan-Einot-Gabriel-Welsch; REGWQ) 다중 범위 검정에 따라 구축하였다.
실시예 2
버얼리종 담배에서 N-동화 유전자의 과발현
GS1, NADH-GOGAT, ICDH 또는 탈조절화된 NR 효소(56개 아미노산 절단 돌연변이 또는 S523D 점 돌연변이)를 버얼리종 담배 식물에서 과발현시켜, 이들 N-동화 경로 유전자 중 임의의 유전자의 생활환경적(ecotopic) 발현이 1) 버얼리종 담배의 특징적인 엽록소 부족 및/또는 N-비옥화-연관 성장 결함을 보상하고/거나; 2) 잎에 축적되는 유리 니트레이트의 수준을 감소시키고, 이러한 부류의 담배 식물의 특징인 높은 니트레이트 축적 표현형을 역전시키는 데 일조하는지 확인하였다. 식물 발현 벡터 pBI121에서 GUS 리포터 유전자를 N-동화 경로 유전자로 대체하면, 이들 구축물을 각각 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV)의 강한 구성적 35S 프로모터, 및 아그로박테리움 투메파시엔스의 노팔린(nopaline) 신타제 유전자의 3' nos 종결자 서열의 조절 하에 두었다(문헌[Chen 외 Mol. Breed. 11:287-293 (2003)]). 사용된 구축물의 다이어그램을 도 3a 및 도 3b에 도시한다.
버얼리종 담배 주 DH98-325-6#775를, 표준 아그로박테리움-매개 형질변환 프로토콜을 사용하여 5개의 구축물 각각으로 개별적으로 형질변환시켰다. DH98-325-6#775는, 담배의 주요 니코틴 데메틸라제 유전자인 CYP83E4에 넉아웃 돌연변이를 함유하는 에틸메탄 설포네이트(EMS) 돌연변이화된 버얼리종 집단으로부터의 선택을 나타낸다(문헌[Lewis 외 Phytochem. 71:1988-1998 (2010)]). 버얼리종 담배는, 정상적으로 불활성인 CYP82E4 유전자가 자발적으로 활성화되는 니코틴 전환이라고 하는 현상에 취약하여, TSNA 전구체 노르니코틴을 이례적으로 높은 수준으로 축적하는 자손을 높은 비율로 생성한다. DH98-325-6#775에서의 CYP82E4 넉아웃 돌연변이는 니코틴 전환을 방지하고, 이러한 주(line)는, 표준 버얼리종 품종이 사용되었다면 인자가 될 생성된 다양한 유전자이식 재료들 중에서 TSNA 데이터를 해석할 때 유발될 수 있는 잠재적인 복잡한 문제(complication)를 피하기 위해 선택되었다(정상적인 버얼리종 백그라운드를 사용하여 관찰되는 것으로 예상될 노르티코틴 수준에서의 큰 가변성으로 인해).
각각의 이식유전자를 높은 수준으로 발현시키는 식물을 선별하기 위해, 각각의 구축물에 대해 적어도 10개의 독립적인 T0 식물을 준-정량적 RT-PCR에 의해 검정하였다. 이식유전자 축적을 최고 수준으로 나타낸 각각의 구축물의 3개 T0 주들로부터 종자를 수확하였다. 이식유전자 침묵, 또는 약하게 발현하는 이식유전자 및 고도로 발현하는 이식유전자가 동일한 T0 식물 내의 독립적인 유전자좌들에서 통합되었을 수 있는 상황과 같은 현상 때문에, 높은 이식유전자 발현을 보여주는 일부 T0 주들은 높은 이식유전자 발현 및 낮은 이식유전자 발현 둘 다를 격리시키는 자손을 생성할 수 있다는 것이 가능하다. 따라서, 준-정량적 RT-PCR을 또한, 고 발현 T0 식물인 것으로 선택되는 수많은 자손들 중 각각에서 수행하여, 이식유전자(들)를 유전하는 T1 자손이 계속해서 이를 높은 수준으로 발현하는지 시험하였다. 후속적인 연구에 사용된 모든 식물들은, (분자적 유전자형 분석을 통해) 이식유전자에 대해 양성인 것으로 시험된 모든 자손들이 계속해서 이식유전자를 높은 수준으로 발현하는 T1 종자 로트(lot)로부터 취해진 T2 식물이었다. 이식유전자를 더 이상 갖지 않는 T1 분리물을 WT(널 분리물) 대조군을 위한 공급원으로서 사용하였다.
실시예 3
조절된 생장 챔버 환경에서의 유전자이식 식물의 분석
니트레이트 입수가능성 조건을 다양하게 하여 생장된 버얼리종 식물에서 N-동화 경로 유전자 과발현의 효과를 검사하기 위해, 각각의 이식유전자 유전자형 (35S:tr-NR, 35S:S523D-NR, 35S:GS1, 35S:GOGAT 및 35S:ICDH)에 대한 6개의 어린 T2 식물 및 하나의 WT 대조군으로 이루어진 식물 세트 3개를 조절된 환경 생장 챔버에서 생장시켰다. 각각의 세트의 식물에게 16일 동안 0.2 mM, 8 mM 또는 19 mM 니트레이트를 함유하는 영양액과 함께 물을 주었다. 그러나, 실험 수행 동안, 소수의 식물은 사망하거나 생장 저해된 생장을 보여주었으며, 따라서, 분석에 포함되지 않았다. 16일간의 처리 기간 종료 시, 상이한 수준의 니트레이트에 노출된 식물 세트들 사이에 확연한 차이가 관찰되었다. 예상된 바와 같이, 0.2 mM 니트레이트를 함유하는 배지와 함께 물을 준 담배 식물은 황백화(chlorotic)되었고, 최소량의 생장을 보여주었으며, 한편, 19 mM 니트레이트가 제공된 식물은 가장 컸으며 가장 진한 녹색을 띄었다. 그러나, 임의의 주어진 N-비옥화 처리에서 WT 대조군과 비교하여, 임의의 특정한 이식유전자를 함유하는 식물의 전체 생장 표현형에서 명확한 차이가 관찰되지 않았다.
모든 식물의 공기중 부분(aerial portion)의 생중량 측정을 처리 기간의 종료 시 수행하였으며, 표 1 및 도 4에 나타낸다. 도 4에 나타낸 값은 각각의 유전자형에 대한 4개 내지 6개의 식물의 비-변환된 평균 ± 표준 오차를 나타낸다. 통계학적 검정을 변환된 데이터(자연 로그 변환) 상에서 수행하였다. 각각의 니트레이트 처리 수준에 대해, 동일한 문자를 공유하는 평균은 서로 유의하게 차이나지 않았다(P < 0.5). 예를 들어, 문자 "a"는 19 mM 니트레이트로 처리된 식물에만 적용되며, 문자 "b" 및 문자 "c"는 8 mM 니트레이트 배지로 처리된 식물에만 적용되고, "d" 및 "e"는 0.2 mM 니트레이트로 처리된 식물에만 적용된다. 표 1은 3개의 N-비옥화 조건 하에 생장된 N-동화 경로 유전자를 발현하는 식물의 평균 생중량, 엽록소, 니트레이트 및 암모니아 측정값을 보여주며, 여기서, "Ca"는 엽록소 a이고, "Cb"는 엽록소 b이다. 8 mM 니트레이트 처리 및 19 mM 니트레이트 처리를 받은 식물에 있어서, 다양한 유전자이식 유전자형 대(versus) WT 대조군 사이에 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 그러나, 매우 낮은 니트레이트 처리에서는, 35S:tr-NR 구축물을 발현하는 식물의 생중량은 WT보다 중간 정도로 더 컸으며, 통계학적으로 유의한 차이였다.
Figure pct00001
Figure pct00002
버얼리종 담배 식물들은 엽록소 부족을 나타내고, 이들의 더 옅은 녹색 외양에 의해 다른 담배 유형들로부터 명확하게 구별된다. 과발현된 이식유전자들 중 임의의 이식유전자가 버얼리종 유형을 특징화하는 yb1 돌연변이 및/또는 yb2 돌연변이를 보상할 수 있다면, 당업자는 이들 식물의 엽록소 함량의 증가를 볼 것으로 예상할 것이다. 시험된 WT 대조군과 다양한 유전자이식 유전자형 사이에서 단순히 시각적인 관찰로는 분명한 차이가 관찰되지 않긴 하지만, 보다 미묘한 차이가 존재하는 경우에는 엽록소 a, b 및 a+b 함량의 직접적인 측정을 수행하였다(표 1). 생중량 측정과 유사하게, 증가하는 니트레이트 비옥화와 양의 상관관계에 있는 엽록소 함량과 함께 매우 강한 처리 효과가 있었다. 그러나, 3개의 니트레이트 처리 중 임의의 처리에서 임의의 이식유전자 유전자형과 WT 대조군 사이에서 엽록소 농도의 유의한 차이가 관찰되지 않았다(도 5a 내지 도 5c). 도 5a 내지 도 5c에 나타낸 값들은 각각의 유전자형에 대한 4개 내지 6개의 식물의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다. 각각의 니트레이트 처리 수준에 대하여, 동일한 문자를 공유하는 평균은 유의하게 상이하지 않다(P < 0.5).
각각의 니트레이트 비옥화 수준에서 다양한 유전자형들에 대한 평균 니트레이트 및 암모니아 농도 또한, 표 1에 나타나 있다. 0.2 mM 니트레이트 처리 수준에서, 모든 식물들은 이례적으로 낮은 니트레이트 축적을 보여주었고, 또한, 임의의 이식유전자 유전자형과 WT 대조군 사이에 유의한 차이가 관찰되지 않았다(도 6). 도 6a는 19 mM NO3 - 처리 및 8 mM NO3 - 처리를 사용하여 생장된 식물로부터의 데이터를 나타내며; 0.2 mM NO3 - 처리의 결과를 도 6b에 나타낸다. 표시된 값들은 각각의 유전자형에 대한 4개 내지 6개의 식물의 비-변환된 평균 ± 표준 오차를 나타낸다. 통계학적 검정을 변환된 데이터(자연 로그 변환) 상에서 수행하였다. 각각의 니트레이트 처리 수준에 대하여, 동일한 문자를 공유하는 평균은 유의하게 상이하지 않다(P < 0.5).
8 mM 니트레이트 및 19 mM 니트레이트 처리 하에, 35S:tr-NR 식물에서 측정된 니트레이트의 평균 농도는 WT 대조군에서 관찰된 평균 농도의 각각 단지 37% 및 60%였다. 8 mM 니트레이트 또는 19 mM 니트레이트로 비옥화될 때, 35S:S523D-NR 구축물을 발현하는 식물의 잎에서 측정된 니트레이트의 급격한 감소가 존재하였다. 평균적으로, 이러한 탈조절화된 NR 구축물을 함유하는 식물은 8 mM 니트레이트 비옥화 계획 하게 물을 주었을 때 대조군 식물에 존재하는 니트레이트 양의 단지 약 5%를 축적하였다. 19 mM N-비옥화 처리를 사용할 때, WT 식물에서 니트레이트는 평균적으로 대략 14,900 ppm이었으며, 이와 비교하여 35S:S523D-NR 식물에서는 단지 약 2000 ppm이 관찰되었으며, 이는 유전자이식 개체에서 거의 8배 감소된 것이었다(도 6a).
이 실험에서 검정된 식물의 암모니아 농도는 도 7에 나타나 있다. 도 7에 나타낸 값은 각각의 유전자형에 대해 4개 내지 6개의 식물의 비-변환된 평균 ± 표준 오차를 나타낸다. 통계학적 검정을 변환된 데이터(자연 로그 변환) 상에서 수행하였다. 각각의 니트레이트 처리 수준에 대하여, 동일한 문자를 공유하는 평균은 유의하게 상이하지 않다(P < 0.5). 암모니아 수준이 니트레이트만큼 크게 다양하지 않았더라도, 35S:S523D-NR 식물은 이러한 N-동화 경로 대사산물을 19 mM 니트레이트 처리 수준에서 대조군 식물의 대략 2배만큼 축적하였다. 그러나, 낮은 N 처리 수준 및 중간 N 처리 수준에서, 주어진 유전자이식 유전자형은 WT 대조군, 또는 임의의 다른 유전자이식 유전자형으로부터의 이의 평균 암모니아 함량과 통계학적으로 상이하였다.
N-동화 경로가 아미노산 생합성에 직접 공급되기 때문에, 유리 아미노산의 농도가 유전자이식 식물에서 변경될 수 있었던 정도를 구축하였다. 이식유전자의 유전자형과 무관하게, 니트레이트 수준 및 암모늄 수준에서 단지 미미한 차이가 0.2 mM 니트레이트 배지로 비옥화된 식물에서 관찰되었으며(도 6 및 도 7); 따라서, 유리 아미노산 함량의 정량화는 8 mM 니트레이트 및 19 mM 니트레이트로 처리된 식물에서만 수행하였다. 표 2는 중간(8 mM) 및 높은(19 mM) 니트레이트 조건에서 생장된 각각의 유전자이식 및 대조군 유전자형에 걸쳐 모든 20개 아미노산에 대한 평균 농도(μmol/g 건조 중량)를 나타낸다.
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
19 mM 니트레이트로 처리된 35S:S523D-NR 구축물을 가진 식물에서 총 유리 아미노산이 크게 증가하였다(도 8). 도 8에서 나타낸 값은 각각의 유전자형에 대한 4개 내지 6개의 식물의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다. 각각의 니트레이트 처리 수준에 대하여, 동일한 문자를 공유하는 평균은 유의하게 상이하지 않다(P < 0.5). 이러한 구축물을 발현하는 담배 식물은 총 유리 아미노산을 WT 식물보다 평균 3.7배 더 많이 축적하였다. 사실상 모든 아미노산이, 높은 N 처리에서 WT와 비교하여 35S:S523D-NR 그룹에서 더 높긴 하지만, Gln, Asn 및 Arg의 수준이 특히 상승하였으며, 각각 8.5배, 5.5배 및 5.3배 증가를 나타내었다(도 9). 도 9에서 나타낸 값은 각각의 유전자형에 대한 4개 내지 6개의 식물의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다. 각각의 니트레이트 처리 수준에 대하여, 동일한 문자를 공유하는 평균은 유의하게 상이하지 않다(P < 0.5). 8 mM 니트레이트 영양액을 사용하여 생장되었을 때, Gln 및 Asn의 수준 또한, 대조군보다 35S:S523D-NR 식물에서 유의하게 더 높았으며(각각 2배 및 3.4배), 그렇지만, 2개 주들 사이에서 총 아미노산 농도는 WT와 비교하여 35S:S523D-NR 식물에서 몇몇 다른 아미노산들의 수준의 평균 감소로 인해(표 2), 거의 동일하였다(도 8). 전체적으로, 다른 탈조절화된 NR 유전자 구축물(35S:tr-NR)을 발현하는 식물의 아미노산 프로파일은 WT 식물과 유사하였다.
글루타민은 GS 효소의 반응 생성물이다. 따라서, Gln의 수준은 GS 유전자를 과발현하는 식물에서 증가되지 않았다는 것이 흥미롭다(도 9b). 이는, 알팔파(alfalfa) GS cDNA가 담배 식물에서 과발현되고 높은 니트레이트 용액으로 비옥화되었을 때 관찰되는 Gln의 2배 증가와 대조적이다. 마찬가지로, Glu의 수준은, 이의 합성을 직접 책임지는 GOGAT 효소를 인코딩하는 유전자를 과발현하는 유전자이식 식물에서 유의하게 증가되지 않았다(도 9). 8 mM 니트레이트 비옥화 수준에서, ICDH를 과발현하는 식물은 총괄적으로 더 낮은 아미노산을 보여주었고(도 8), 구체적으로는 다른 유전자형 각각보다 더 낮은 양의 Glu를 보여주었다(도 9).
엽록소 부족은 버얼리종 담배의 특질들 중 하나를 나타내고, 구체적으로는 yb1 유전자좌 및 yb2 유전자좌로 인한 형질이다. 생장 챔버, 온실 또는 현장 환경에서 생장되었든지 간에, 모든 식물들은 이러한 담배 유형에 독특한 동일한 옅은 녹색 표현형을 나타내었다. 생장 챔버 환경에서, WT 주 및 유전자이식 주의 엽록소 함량을 직접 측정하였으며, 이들 재료들 중 임의의 재료 사이에서 차이가 관찰되지 않았다. 이들 결과는, N-동화 경로 연관 유전자(tr-NR, S523D-NR, GS1, GOGAT 및 ICDH)의 과발현이 상보적이지 않거나, 그렇지 않다면 버얼리종 표혐형을 규정하는 yb1 및/또는 yb2 돌연변이체 유전자좌를 기능적으로 우회함을 제시한다.
시험된 N-동화 경로 이식유전자들 중 임의의 이식유전자의 과발현이 버얼리종 담배의 특징인 엽록소 부족 또는 N-비옥화-연관성장 결함을 극복할 수 있다는 증거가 발견되지는 않았더라도, 탈조절화된 NR 활성의 과발현은 유리 니트레이트의 수준을 저하시키는 데 분명하게 효과가 있었다.
실시예 4
현장 조건에서 생장된 유전자이식 식물의 분석
탈조절화된 S523D-NR 구축물의 구성적 발현은 중간 N-비옥화 또는 높은 N-비옥화 조건 하에 생장되었을 때, 잎에서 유리 니트레이트 축적의 급격한 감소를 매개하였다. 또한, 탈조절화된 tr-NR 구축물은 니트레이트 함량의 온건한(modest) 감소를 부여할 수 있는 것으로 보였다. 현장 환경에서 생장되었을 때, 잎 니트레이트 농도에 미치는 35S:S523D-NR 구축물 및 35S:tr-NR 구축물의 효과를 확인하기 위해, 생장 챔버 실험에 사용된 동일한 종자 로트 유래의 T2 식물을 부유 트레이(float tray) 상에 발아시키고, 현장에 이식하였다. TSNA 형성과 관련하여 잎 내에 과량의 유리 니트레이트가 존재한 결과가 잎 노화 및 경화 동안에 주로 표시되기 때문에, 탈조절화된 NR 구축물을 강한 노화-특이적 프로모터의 전사 조절 하에 놓았다. CYP82E4 니코틴 데메틸라제 유전자를 조절하는 프로모터는 노화 및 음건 동안에 유전자 발현의 수준을 특이적으로 매개한다. S532D-NR 및 tr-NR cDNA를 CYP82E4 (E4) 프로모터의 조절 하에 놓은 구축물은, 우선 식물 발현 벡터 pBI121 유래의 CaMV 35S 프로모터를 번역 Met 시작 코돈의 CYP82E4 개시의 바로 상류에 있는 2.2 kb 영역으로 대체한 다음, E4 프로모터의 하류에 NR cDNA를 삽입함으로써 생성하였다. 잎 니트레이트 함량에 영향을 주지 않는 N-동화 경로 유전자의 과발현을 나타내는 대조군으로서, 35S:GOGAT 및 E4:GOGAT 유전자이식 식물을 또한, 현장 실험에 포함시켰다. 이들 벡터의 다이어그램을 도 3a 내지 도 3b에 나타낸다. E4 프로모터-구동 구축물을 가진 현장에서 시험된 특정한 T2 집단은, 노화-유도 화합물 에테폰로 처리되었을 때 이식유전자를 높은 수준으로 발현하는 것으로 나타난 T1 식물의 종자 로트로부터 유래되었다(문헌[Chakrabarti 외, 2008]). 생장 챔버 연구와 유사하게, 이식유전자를 더 이상 갖지 않은 T1 식물 유래의 널 분리물을 현장 실험용 WT 대조군을 위한 공급원으로서 사용하였다.
시험된 7개의 유전자형(WT, 35S:S523D-NR, E4:S523D-NR, 35S:tr-NR, E4:tr-NR, 35S:GOGAT 및 E4:GOGAT) 중 각각에 대해 대략 100개의 어린 식물을 동일하게 나누고, 랜덤화된 완전 블록 디자인을 사용하여 노스캐롤라이나주에 있는 2개의 현장 위치에 이식하였다. 식물을 노스캐롤라이나주 클레이턴 마을 근처의 현장 연구소 또는 노스캐롤라이나주 로키 마운트 마을 근처의 현장 연구소에서 생장시켰다. 이식 후 상당한 수의 식물이 사망하였기 때문에, 성숙할 때까지 생장한 식물의 총 수는 1개 유전자형 당 60개 내지 79개의 범위였다. 담배 식물을 버얼리종 담배에 대한 표준 산업 시행에 따라 생장시키고, 끝을 쳐내고(topped), 수확하였다. 성숙되었을 때, 식물의 줄기를 수확하고, 상부에서부터 약 1/3의 줄기 위치에 있는 2개의 잎을 각각의 식물로부터 떼어 내고, 주맥을 제거하고, 잔여 라미나 조직을 종이 가방 안에 넣었다. 그런 다음, 식물을 스틱에 매달고, 음건을 위한 방우(rain-protected) 구조물로 옮겼다. 종이 가방 내의 잎 재료를 건조 오븐에 놔두고, 65℃에서 완전히 건조하였다. 건조된 잎 시료를 분쇄하고, 니트레이트 함량에 대해 분석하였다.
니트레이트 동화에 관여하는 상이한 유전자들을 발현하는 T2 식물에서 평균 니트레이트 농도를 표 3에 나타낸다. 표 3에 나타낸 바와 같이, 검정된 상이한 유전자형들에 걸쳐 관찰된 평균 니트레이트 수준은 2개의 현장 위치들(하나는 노스캐롤라이나주 클레이턴 근처에 있으며, 나머지 하나는 노스캐롤라이나주 로키 마운트 근처에 있음) 사이에서 매우 유사하였다. 이러한 데이터세트에서 가장 두드러진 관찰은 35S:S523D-NR 식물의 잎에서 니트레이트의 큰 감소이었다. 평균적으로, 35S:S523D-NR 구축물을 함유하는 담배 식물은 각각 클레이튼 위치 및 로키 마운트 위치에서 WT 대조군에서 관찰된 니트레이트 양의 단지 4.2% 및 5.6%를 보여주었다.
Figure pct00007
2개의 위치들에 대한 조합된 데이터세트의 통계학적 분석을 표 4에 나타낸다. 표 4는 성숙한 T2 세대 유전자이식 버얼리종 식물의 잎에서 NO3 -(N) 함량(건조 중량의 ppm)에 미치는 니트레이트-관련 유전자 구축물의 효과를 나타낸다. 35S:S523D-NR 그룹은 임의의 다른 유전자형보다 유의하게 더 적은 니트레이트를 축적하였다. 탈조절화된 니트레이트 리덕타제 cDNA를 함유하는 다른 식물 유전자형(35S:tr-NR, E4:tr-NR 및 E4:S532D-NR)에서의 유리 니트레이트 수준은 두드러진 감소만큼은 거의 아니더라도, 이러한 유리 니트레이트 수준 또한, WT 그룹보다 더 적은 니트레이트를 축적하였으나, 35S:tr-NR 구축물을 함유하는 식물만이 GOGAT-발현 대조군 유전자형보다 유의하게 상이한 것으로 간주되었다. E4:GOGAT 및 35S:GOGAT의 니트레이트 함량은 WT보다 유의하게 상이한 것으로 간주되지 않았다.
Figure pct00008
경화 창고에 옮겨진 줄기-수확된 식물을 대략 10주 동안 음건시킬 수 있었다. 이러한 기간의 종료 시, 상부 1/3 줄기 위치의 부가적인 2개의 잎을 수확하고, 주맥을 떼어 내고, 종이 가방에 넣었다. 경화-후 수확 시 재료가 매우 건조한 상태이긴 하였지만, 완전히 건조하기 위해 실온에서 송풍기에서 바람이 나오는 건조기에 가방을 넣었다(고온이 TSNA 형성에 미치는 잠재적인 영향으로 인해 열을 부가하지 않았음). 건조된 시료를 분쇄하고, 니트레이트 분석을 받게 하였다. 표 5는, 8주간의 음건 후, T2 세대 유전자이식 버얼리종 식물의 잎에서 NO3 -(N) 함량(건조 중량의 ppm)에 미치는 니트레이트-관련 유전자 구축물의 효과를 나타낸다. 표 4의 데이터를 표 5에 제시된 데이터와 비교하면, 모든 유전자형들에 대하여 잎의 라미나에서의 니트레이트 함량이 음건 후 약 2배 더 높았음을 보여준다. 그러한 메커니즘이 알려져 있지 않더라도, 잎 니트레이트 농도의 증가는 버얼리종 담배에서 음건 후 보편적으로 관찰된다. 성숙한 비-경화된 조직을 사용하여 수득된 결과와 유사하게, 35S:S523D-NR 유전자형의 식물은 유리 니트레이트를 임의의 다른 유전자형 그룹보다 훨씬 더 적게 축적하였고, WT 식물에서 관찰된 유리 니트레이트의 단지 약 4%였다(표 5). 탈조절화된 NR 구축물을 함유하는 다른 유전자형들의 경화된 잎 시료 또한, WT 식물과 비교하여 니트레이트 함량의 통계학적으로 유의한 감소를 계속 보여주었으며, 이러한 니트레이트 함량은 WT 그룹에서 관찰된 니트레이트 농도의 70% 내지 77%의 범위였다.
Figure pct00009
짐작컨대 내인성 니트라이트 리덕타제 활성의 효율로 인해, 식물에서 니트라이트 수준이 일반적으로 매우 낮더라도, 구성적으로 발현되는 S523D-NR 효소에 의해 매개되는 세포 니트레이트 비축물(reserve)의 두드러진 물질대사는 이의 최종 생성물인 니트라이트의 수준을 증가시킬 수 있다. 니트라이트가 궁극적으로 음건 동안에 TSNA 형성을 책임지는 것으로 여겨지는 화합물인 것을 고려하면, 니트레이트 풀의 감소를 초래하는 유전학적 변형은 경화된 잎 내에서 니트라이트의 수준을 증가시키지 않는다는 것이 중요하다. 임의의 이식유전자 구축물의 과발현이 잎의 니트라이트 함량의 변화와 연관되었는지 확인하기 위해, 수집된 음건된 잎 시료 모두에서 니트라이트 검정법을 수행하였다. 종합적으로, 다양한 유전자형들 사이에서 니트라이트 수준은 유사하였다(표 6). 표 6은, 8주간의 음건 후, T2 세대 유전자이식 버얼리종 식물의 잎에서 NO2 -(N) 함량(건조 중량의 ppm)에 미치는 니트레이트-관련 유전자 구축물의 효과를 나타낸다.
Figure pct00010
35S:S523D-NR 그룹의 수치 평균이 모든 유전자형들 중에서 가장 낮았더라도, 이는 WT 대조군과 통계학적으로 유의한 것으로 간주되지 않았다(그렇더라도, E4:GOGAT 주보다는 유의하게 더 낮은 것으로 여겨졌음). 이들 결과는, 탈조절화된 S523D-NR 구축물의 구성적 발현이 니트라이트 수준을 증가시키지 않으며; 그 대신에, 이러한 이식유전자는 경화된 잎의 니트라이트 농도의 온건한 감소를 매개할 수 있음을 보여준다.
잎 니트레이트 함량의 감소가 TSNA 축적 또는 알칼로이드 축적에 영향을 미칠지 시험하기 위해, WT, 35S:S523D-NR 및 35S:GOGAT 유전자형의 상기 기술된 경화된 잎 시료의 하위세트를 추가 분석용으로 선별하였다. 각각의 유전자형에 대하여, 총 33개의 잎 시료를 선택하였으며, 2개의 위치들(클레이턴으로부터 16개, 로키 마운트로부터 17개) 사이에 고르게 분포시켰고, 모든 3개의 유전자형이 표시되는(즉, 주어진 선별된 열(row) 내에서 3개의 유전자형 중 임의의 유전자형에 대해 사망한 식물이 없음) 개별 열로부터 선별하였다. TSNA 및 알칼로이드 분석의 결과를 표 7에 나타낸다. 표 7은 WT, 35S:GOGAT 및 35S:S523D-NR 식물의 경화된 잎에서의 TSNA 함량 및 알칼로이드 함량을 나타낸다. 점증적으로, WT와 비교하여 35S:S523D-NR 유전자형에서 TSNA 함량의 총 감소는 77.5%이었다. WT 식물 대 35S:GOGAT 식물에서 임의의 개별 TSNA 사이 또는 총 TSNA 함량 사이에서 통계학적으로 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 이들 결과는 명백하게는, S523D-NR 구축물의 구성적 발현이 음건된 담배 잎의 TSNA 함량의 실질적인 감소를 초래하며, 이는 대체로, 잎 내에서 유리 니트레이트의 수준을 두드러지게 감소시키는 이러한 구축물의 능력으로 인한 현상임을 나타낸다.
Figure pct00011
3개의 유전자형들 사이에서, 검정된 총 알칼로이드 함량 또는 임의의 개별 알칼로이드(니코틴, 노르니코틴, 아나바신 및 아나타빈)에서 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 이와는 대조적으로, TSNA 함량의 주요 차이는 낮은 수준의 니트레이트를 함유하는 35S:S523D-NR 잎 재료에서 확연하였다. NNN의 수준의 90% 감소는 WT 대조군과 비교하여 35S:S523D-NR 그룹에서 관찰되었다. N-니트로소아나타빈(NAT) 축적 및 NNK 축적은 35S:S523D-NR 대 WT 식물에서 각각 72.5% 및 55%만큼 감소되었다. N-니트로소아나바신(NAB)이 전형적으로 경화된 담배 잎에서 가장 최소로 풍부한 TSNA이긴 하였지만, 35S:S523D-NR 식물에서 이러한 화합물의 존재는 거의 검출이 불가능하였다(표 7).
35S:S523D-NR 구축물에 의해 매개된 저-니트레이트(low nitrate) 표현형은 경화된 잎의 TSNA 함량의 주요 감소와 연관이 있었으며, 이는, 잎 표면의 미생물이 잎 니트레이트 풀을 이용하여, 담배 알칼로이드의 니트로소화를 직접 책임지는 니트라이트를 생성한다는 것을 상정하는 음건된 담배에서의 TSNA 형성 모델과 일치한다. 니트레이트, 알칼로이드 및 TSNA의 농도가 담배 식물에서 잎의 줄기 위치에 따라 상당히 다양하더라도, 35S:S523D-NR 구축물이 전체 식물을 통틀어서 니트레이트 및 TSNA의 감소를 매개하는 데 효과적이었으며, 이들 화합물에서의 주요 감소는, 선별된 상위 위치의 잎에서와, 하위 줄기 잎 쪽으로 심하게 기울여진 식물의 잔여 부분으로부터 생산된 각초 담배의 시료 둘 다에서 관찰되었다. 이와는 대조적으로, 니코틴 수준은 35S:S523D-NR-매개 니트레이트 감소의 결과 유의하게 변경되지 않았다.
실시예 5
저- 니트레이트 담배 식물로 제조된 각초 및 궐련으로부터의 연기의 분석
감소된 니트레이트 표현형이, 주류 연기에서 TSNA의 만연성(prevalence)에 미치는 영향을 확인하기 위해, 궐련을 35S:S523-NR 식물 및 WT 대조군의 경화된 잔여 잎 재료의 풀링된 시료로부터 제조하였다. 이전의 단락에서 기술된 처음 2개의 잎 시료를 상위 1/3 줄기 위치로부터 취하였으며; 따라서, 각초를 제조하는 데 사용된 잔여 잎 조직은 식물의 하위 줄기 위치로부터 잎 쪽으로 크게 기울어졌다. 니트레이트, 니코틴 및 TSNA의 상대 농도가 줄기 위치에 따라 상이하기 때문에, 상응하는 연기 데이터를 정확하게 해석하기 위해서는, 각초에서 나타나는 바와 같이 이들 화합물의 수준을 독립적으로 확인하는 것이 중요하였다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 니트레이트 농도는 WT 잎 라미나로부터 제조된 각초에서 평균적으로 15,800 ppm이었다. 이와는 대조적으로, 35S:S523D-NR 식물로부터 생성된 각초에서, 니트레이트 수준은 평균적으로 930 ppm이었고, 이러한 값은 WT 충전제에서 관찰된 값의 대략 5.9%이었으며, 경화된 상위 줄기 잎에서 이들 2개의 유전자형 사이에서 관찰된 비율(표 5)과 일치하였다. 상위 잎 판독과 비교하여(표 5와 도 10을 비교) WT 및 35S:S523D-NR 식물의 각초에서 측정된 전반적으로 더 높은 니트레이트 농도는, 담배의 하부 잎에서의 니트레이트 수준이 상부 잎에서 발견된 니트레이트 수준보다 크게 더 높다는 이전의 관찰과 일치한다. 도 10에서, 각각의 유전자형의 모든 식물 재료들을 위치에 따라 풀링하였다(35S:S523D-NR에 대하여, 클레이턴 및 로키 마운트로부터 각각 약 30개의 식물; WT에 대하여, 2개의 위치들로부터 각각 약 40개의 식물). 도시된 데이터는 2개의 위치들에 걸친 평균 및 표준 오차를 나타낸다. 담배 잎의 니코틴 농도는 반대되는 경향을 보여주는데, 차이의 규모가 니트레이트에서 관찰된 것만큼 극심하진 않더라도, 상위 잎이 하위 잎보다 더 높은 농도를 나타내었다. WT 식물 및 35S:S523D-NR 식물의 각초에서의 니코틴 함량은, 이들의 각각의 상위 잎에서의 2.5% 및 2.4%와 비교하여(표 7), 평균적으로 각각 1.6% 및 1.7% 건조 중량이었다(도 10). 어느 경우에서든, 잎 니트레이트 함량에 미치는 S523D-NR 구축물의 영향이 아무리 거대하더라도, S523D-NR 구축물의 구성적 발현은 잎의 니코틴 수준을 유의하게 변경시키지 않았다.
각초 담배의 TSNA 분석 결과를 도 11a 내지 도 11e에 나타낸다. 경화된 상위 잎 재료를 사용한 관찰(표 7)과 유사하게, 저-니트레이트 식물 유래의 잎 재료를 사용하여 4개의 TSNA 화학종들 각각에서 주요 감소가 관찰되었으며, 그렇더라도, 각각의 감소의 상대적인 범위에서 일부 차이가 관찰되었다. 35S:S523D-NR 식물 유래의 각초는 WT 대조군 식물로부터 제조된 충전제보다 NNN, NNK, NAT 및 NAB를 각각 44%, 64%, 65% 및 32% 더 적게 함유하였으며, 관찰된 총 TSNA 감소는 52%였다. 전체적인 TSNA 수준은 경화된 상위 잎과 비교하여(표 7과 도 11을 비교) 각초 재료에서 다소 더 높았으며, 이러한 결과는, TSNA 축적이 상부 위치의 잎보다 하위 줄기 위치의 잎에서 더 높다는 이전의 관찰들과 일치한다. 도 11에서, 각각의 유전자형의 잎 재료를 도 10에 기술된 바와 같이 2개의 위치들 각각에 따라 풀링하였다. 도시된 데이터는, 각초의 TSNA 함량에 대하여 1개의 위치 당 2개의 복제물, 및 주류 연기에서의 TSNA 함량에 대하여 1개의 위치 당 3개의 복제물의 조합된 평균 및 표준 오차를 나타낸다.
WT 및 35S:S523D-NR 각초로 제조된 궐련으로부터 유래되는 주류 연기의 TSNA 데이터를 또한, 도 11에 나타낸다. 놀랍게도, 저-니트레이트 표현형으로 인한 총 TSNA 감소의 양은 상응하는 각초에서 관찰되는 것보다 주류 연기에서 훨씬 더 크다. 35S:S523D-NR 궐련의 주류 연기는, 35S:S523D-NR의 각초 담배에서 52% 감소가 관찰된 것과 반대로, WT 궐련과 비교하여 총 TSNA 함량의 76% 감소를 나타내었다(도 11e). 35S:S523D-NR과 WT 각초 담배 사이의 TSNA 함량의 감소 정도의 차이 대 이들의 상응하는 주류 연기 사이의 TSNA 함량의 감소 정도의 차이는 NNN 및 NAB에서 가장 두드러졌다. 35S:S523D-NR 식물 유래의 비연소된 충전제 담배의 NNN 함량은 WT 충전제보다 44% 더 적었으며, 그렇더라도 주류 연기에서 이러한 차이는 78%까지 증가하였다(도 11d). 마찬가지로, 35S:S523D-NR 식물의 NAB 수준은, 주류 연기에서는 86% 감소된 것과 비교하여, 충전제에서는 WT보다 32% 더 낮았다(도 11a). 측정된 4개의 TSNA 화학종들 중에서, 오로지 NNK만, WT 및 35S:S523D-NR 궐련의 결과를 비교하였을 때, 각초 대 주류 연기에서의 이의 상대적인 감소에서 통계학적으로 유의한 차이를 나타내지 않았다. 각초 및 주류 연기 둘 다에서, NNK는, WT 담배 대조군과 비교하여, 저-니트레이트 35S:S523D-NR 담배를 사용하여 제조된 궐련에서 대략 67%만큼 감소되었다(도 11c). NNK를 제외한 모든 TSNA 화학종들의 수준의 상대적인 감소는 상응하는 비연소된 각초에서보다 저-니트레이트 궐련의 주류 연기에서 훨씬 더 컸다.
니트레이트 수준의 35S:S523D-NR-매개 감소는, (1) 경화된 잎 자체 내에서 TSNA의 생성을 감소시킴으로써; 및 (2) TSNA가 주류 연기에서 나타나는 과정을 추가로 저해함으로써, 2개의 수준에서 담배 제품의 TSNA 문제를 경감시킬 수 있다.
실시예 6
부가적인 버얼리종 백그라운드에서 S523D - NR의 과발현은 잎에서의 니트레이 트 축적을 두드러지게 감소시킨다.
35S:S523D-NR 구축물 및 E4:S523D-NR 구축물을 함유하는 식물 발현 벡터를 사용하여, 버얼리종 품종 TN90e4e5를 형질변환시켰다. 35S:S523D-NR 구축물 및 E4:S523D-NR 구축물을 개별적으로 함유하는 식물을 생성시키는 것 외에도, 2개의 구축물들을 동일한 식물 내에 조합하여, 단일 구축물에 의해 달성되는 것을 능가하여 니트레이트의 부가적인 감소가 수득될 수 있는지 확인하였다. 각각의 이식유전자 및 이식유전자 조합을 가진 T0 식물을 수득하기 위해, 공동-형질변환 전략을 이용하였다. 회수된 각각의 T0 식물에서 이식유전자의 상보체를 구별하기 위해, PCR-기재 유전자형 분석을, 구축물의 S523D-NR 영역에 대항하여(against) 방향을 잡은 3' 프라이머와 쌍을 이룬, 35S 프로모터 또는 E4 프로모터 영역에 특이적인 5' 프라이머를 사용하여 수행하였다. 벡터 대조군으로서, TN90e4e5 잎 디스크를 또한, E4 프로모터의 전사 조절 하에 US 리포터 유전자를 함유하는 구축물을 이용하여 형질변환시켰다.
일단 식물이 토양에 옮길 정도로 충분히 커지면, 하기 T0 주들을 온실에서 성숙할 때까지 생장시켰다: E4:GUS 벡터 대조군(12개 사건); 35S:S523D-NR(10개 사건); E4:S523D-NR (11개 사건); 및 35S:S523D-NR + E4:S523D-NR(7개 사건). 식물을, 조절 방출 비료(14-14-16 NPK + 최소 영양분)인 Multicote 4로 비옥화된 표준 토양 믹스에서 생장시켰다. 개화 직전에, 각각의 식물의 중간-상위 단락의 2개의 잎들을 수확하고, 주맥을 제거하고, 잔여 라미나를 65℃에서 건조하였다. 동일한 수확 일자에, 2개의 부가적인 잎을 각각의 식물의 동일한 단락으로부터 취하고, 에테폰으로 처리하여, Jack 등에 의해 기술된 바와 같이 노화를 유도하였다(문헌[Rec. Adv. Tob. Sci. 33:58-79 (2007)]). 일단 에테폰-처리 잎이 완전히 황변화되면(처리 후 7일 내지 8일째), 각각의 잎의 일부를 실시간 PCR(RT-PCR) 분석을 위해 동결시키고, 한편, 잔여 잎 조직을 후속적인 니트레이트 분석을 위해 완전히 건조하였다.
표 8은 T0 식물(즉, TN90 e4e5 T0 식물) 유래의 녹색 잎 시료 및 "인공 노화" 잎 시료의 니트레이트 함량을 나타낸다. 모든 12개의 독립적인 E4:GUS 벡터 대조군 식물들은 이들의 잎에서 3,938 백만분율(ppm) 내지 12,730 백만분율(ppm) 범위의 높은 수준의 니트레이트를 보여주었다. 일반적으로, 녹색 잎에서 니트레이트 농도는 에테폰 처리 잎에서 관찰된 니트레이트 농도와 매우 유사하였다. E4:GUS 대조군과는 달리, 10개의 독립적인 35S:S523D-NR T0개 사건 중 5개는 1000 ppm 미만을 축적하였으며, 3개의 개체들은 녹색 시료 및 에테폰 처리 시료 둘 다에서 300 ppm 이하를 축적하였다. 모든 11개의 E4:S523D-NR 개체들은 녹색 잎에서 높은 니트레이트 축적을 보여주었다(3,987 ppm 초과).
Figure pct00012
Figure pct00013
그러나, 동일한 식물로부터 유래되는 에테폰 처리 잎에서, 니트레이트 수준은 2배 내지 3배 감소된 것이 관찰되었다(표 8). 이들 식물에서 S523D-NR의 발현을 조절하는 E4 프로모터는 녹색 잎에서는 불활성이지만, 에테폰 처리, 노화 및 음건 동안에 고도로 발현되는 것으로 예상된다. 35S:S523D-NR 구축물 및 E4:S523D-NR 구축물을 둘 다 함유하는 7개의 T0 식물 중 2개의 식물은 녹색 잎에서 니트레이트를 매우 낮은 수준으로 나타내었다(146 ppm 및 238 ppm). 이들 식물의 녹색 조직에서 낮은 수준의 니트레이트는, 35S:S523D-NR 구축물이 이들 2개의 개체들에서 활성적으로 발현됨을 제시한다. 이들 식물(35S+E4:S523D-NR 5-2) 중 하나에서, 녹색 잎 대 에테폰 처리 잎에서 니트레이트의 수준은 사실상 동일하게 남아 있었다. 그러나, 다른 식물들(35S+E4:S523D-NR 8-1)에서, 유리 니트레이트는 에테폰 처리 잎에서는 검출이 불가능하였다. 니트레이트 축적의 최대 감소는, S523D-NR의 강한 구성적 발현을 구동하는 구축물을 S523D-NR의 강한 노화/경화-특이적인 발현을 매개하는 구축물과 조합함으로써 달성될 수 있다. 주목할만하게는, 유리 니트레이트를 이례적으로 낮은 수준으로 가지는 T0 식물과 니트레이트를 정상 수준으로 보여주는 T0 개체 사이에서 명백한 표현형 차이는 관찰되지 않았다.
"위치 효과" 및 유전자 침묵과 같은 현상으로 인해, 임의의 주어진 형질변환 실험에서, 상이한 T0 사건들 중에서 전사체 축적 수준의 큰 가변성을 관찰하는 것은 보편적이다. T0 식물에서의 니트레이트 검정법의 결과는, S523D-NR 이식유전자가 일부 개체들에서는 효과적으로 발현되고 있었으나, 다른 개체들에서는 그렇지 않았음을 제시하였다(특히, 35S:S523D-NR 구축물에 대하여). 이를 시험하기 위해, 상기 기술된 황변화된 에테폰-처리 시료 상에서 RT-PCR 분석을 수행하였다. 녹색 잎 조직을 사용한 RT-PCR 분석은, 이러한 검정법이 내인성 Nia2 전사체와 S523D-NR-유래 전사체를 구별하지 않았으며(이들의 코딩 영역들이 단일 코돈에서만 상이하기 때문에), 네이티브 NR 전사체가 대조군 식물의 녹색 잎 조직에서 높은 수준으로 검출되었다는 사실에 의해, 틀린 것으로 입증되었다. 이와는 대조적으로, 인공 노화 에테폰-처리 잎에서 최소의 내인성 NR 전사체 축적이 검출되었다. 도 12는 표 8에 열거된 각각의 T0 식물의 에테폰-처리 잎에서의 상대적인 NR 전사체 수준(담배 신장 인자 1α 유전자로 정상화됨)을, 상응하는 니트레이트 농도와 함께 나타내었다. 도 12에서, RT-PCR 데이터(황색 막대, 좌측에 눈금이 있음)는, 담배 신장 인자 1α 참조 전사체로의 정상화 후, NR 전사체(내인성 NR 및 S523D-NR 둘 다)의 상대적인 축적을 보여준다. 적색 상자는 니트레이트 농도(우측에 눈금이 있음)를 가리킨다. 모든 벡터 대조군 식물들에서, 내인성 NR 전사체 축적은 상대적으로 낮고, 니트레이트 함량은 높다(5,000 ppm 초과). 35S:S523D-NR 구축물만 함유하는 T0 식물에서, 높은 NR 전사체 축적과 낮은 니트레이트 표현형 사이에 매우 양호한 상관관계가 존재한다. E4:S523D-NR 이식유전자만 가진 모든 T0 식물들은 벡터 대조군보다 더 높은 수준의 NR 전사체 축적을 보여주었고, 이들의 상응하는 니트레이트 수준 또한, 균일하게 더 낮았다. 탈조절화된 NR 효소가 E4:S523D-NR 식물에서 에테폰 처리 후에만 니트레이트 풀을 감소시키는 데 기여할 것으로 예상되고 35S:S523D-NR 식물 개체에 대해서는 식물의 전체 수명을 통틀어서 이러한 기여가 예상되지 않을 것을 고려하면, 고도 발현 35S:S523D-NR 식물과 비교하여 E4:S523D-NR 식물에서 니트레이트 수준은 낮게 유도되지 않는다는 것은 놀랍지 않다. 이러한 그룹 내의 식물 5-2 및 식물 8-1에서 NR 전사체의 상당 부분은 35S:S523D-NR 구축물로부터 개시될 수 있으며, 단, 이들 식물의 녹색 잎 시료 및 에테폰-처리 잎 시료 둘 다에서 이례적으로 낮은 수준의 니트레이트가 관찰된다(표 8).
실시예 7
T1 식물에서의 S523D - NR의 과발현은 잎 노트레이트 축적의 두드러진 감소를 보여준다
부유 트레이로부터의 TN90e4e5 백그라운드(대조군 포함, 1920개 식물)의 T1 유전자이식 식물의 유전자형을 분석하고, 이를 2개의 현장 위치(완전히 랜덤화된 현장 디자인)에 이식하였다. 각각의 식물의 잎 조직 시료(라미나)를 니트레이트 분석을 위해 수집한 다음, 식물을 음건 구조물에 넣어, 궐련 연기 분석용 각초를 생성하였다.
2개의 현장 위치에서 중간-줄기 위치에서 수집된 녹색 잎의 니트레이트 데이터를 표 9 및 표 10에 제시한다. 2개의 경우에서 데이터는 이식유전자의 존재로 인해 니트레이트의 강한 감소를 나타내었다.
Figure pct00014
Figure pct00015
본 발명자들은 이러한 실험으로부터, 보다 왕성한 TN90e4e5 백그라운드에서 35S:S523D-NR 이식유전자를 발현하는 것은 잎 니트레이트 함량을 열등 주(inferior line) DH98 325-6#775에서 관찰된 것만큼만 저하하는 데 효과적인 것으로 결론 내릴 수 있다.
일부 주들(GH3-1, GH8-1 및 GH8-5)을 선별하여, 경화된 잎(중간-줄기 위치, 식물 플롯을 대표하는 벌크 파우더)에서 니트레이트 및 총 알칼로이드를 분석하였다. 일반적으로, 이전에 관찰된 바와 같이, 총 알칼로이드 및 니코틴은 이식유전자(35S:S523D-NR)의 존재에 의해 영향을 받지 않았다. 그러나, TN90e4e5 백그라운드에서, 하나의 주인 GH8-5에서 약간의 감소(15%)가 관찰되었다(도 13).
이전의 결과로부터 예상되는 바와 같이, 잎 니트레이트는 보다 활성적인 니트레이트 동화로 인해, 라미나에서 강하게 감소된다(95% 초과). 노화 프로모터 E4에 의해 조절되는 이식유전자의 첨가는 데이터에 영향을 미치지 않았으며, 이로써, 구성적 프로모터 35S의 조절 하에서의 유전자이식 니트레이트 리덕타제의 활성은 녹색 잎에서 강하게 효율적이고(표 9 및 표 10 참조), 잎 라미나에 저장된 니트레이트를 감소시키기에 충분함(도 14)을 제시한다.
각초를 경화된 잎으로부터 생산하였으며, TSNA에 대해 분석하였다. 흥미롭게는, TSNA가 현저하게 감소되었으며(NNN의 경우 약 72%, NNK의 경우 약 45%, NAT의 경우 약 76%, 및 NAB의 경우 약 78%), 이는 녹색 잎에서 니트레이트를 저하하는 것은 각초 재료에서 TSNA의 생성에 강하게 영향을 미침을 가리킨다(도 15).
정확하게 35S:S523D-NR로 형질변환된 열등 주 DH98 325-6#775에 대해서 말하자면(실시예 2 참조), 궐련을 도 15에서 분석된 재료로 제조하였으며, 연기를 내었다. TSNA를 연기에서 확인하였고, 데이터를 도 16에 기록하였다. TSNA는 각초에서보다 연기에서 훨씬 더 감소되었으며(NNN의 경우 약 90%, NNK의 경우 약 66%, NAT의 경우 약 88% 및 NAB의 경우 약 92%), 이는 분명하게는 열분해 동안에 니트로소화를 저하하는 영향으로 인한 것이다. 따라서, 전반적으로, 이는, 탈조절화된 형태의 니트레이트 리덕타제를 과발현시킴으로써 녹색 잎에서 니트레이트를 저하하는 것은 TN90e4e5와 같은 상업용 담배의 연기에서 TSNA의 생성을 강하게 감소시킴을 가리킨다.
상기 상세한 설명 및 첨부된 실시예는 단지 예시적인 것일 뿐이고, 본 발명의 범위를 제한하려는 것으로 간주되어서는 안 되며, 본 발명의 범위는 첨부된 청구항 및 이들의 등가물에 의해서만 규정되는 것을 이해한다.
당업자는 개시된 실시형태들에 대한 다양한 변화 및 변형들을 알 것이다. 비제한적으로 본 발명의 화학적 구조, 치환기, 유도체, 중간산물, 합성, 조성물, 제형 또는 사용 방법과 관련된 이러한 변화 및 변형들은 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 이루어질 수 있다.
완성의 이유에서, 본 발명의 다양한 양태들은 하기 숫자가 매겨진 조항들에 나타나 있다:
조항 1. 담배 식물로부터 발생되는 담배 특이적 니트로소아민(TSNA) 수준이 감소된 담배 제품으로서, 상기 담배 식물은 (i) 탈조절화된 니트레이트 리덕타제 효소를 인코딩하는 서열을 포함하거나, 이루어지거나 본질적으로 이루어진 폴리뉴클레오타이드; (ii) (i)에 나타낸 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드; (iii) 탈조절화된 니트레이트 리덕타제 효소를 포함하거나, 이루어지거나 본질적으로 이루어진 폴리펩타이드; 또는 (iv) (i)에 나타낸 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 구축물, 벡터 또는 발현 벡터를 포함하도록 변형되고, 상기 니트레이트의 발현 또는 활성이, 비변형된 대조군 담배 식물과 비교하여 탈조절화되는, 담배 제품.
조항 2. 조항 1에 있어서, 탈조절화된 니트레이트 리덕타제 효소가, 구성적으로 활성인 니트레이트 리덕타제 효소인, 담배 제품.
조항 3. 조항 1 또는 2에 있어서, 탈조절화된 니트레이트 리덕타제 효소를 인코딩하는 서열이 (i) 절단된 니트레이트 리덕타제 폴리펩타이드; (ii) N-말단 절단을 포함하는 니트레이트 리덕타제 폴리펩타이드; (iii) 56개 아미노산의 N-말단 절단을 포함하는 니트레이트 리덕타제 폴리펩타이드; (iv) SEQ ID NO: 4의 위치 523에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함하는 니트레이트 리덕타제 폴리펩타이드; 또는 (v) SEQ ID NO: 4의 위치 523에서 아미노산이 아스파르트산으로 치환되는, SEQ ID NO: 4의 위치 523에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함하는 니트레이트 리덕타제 폴리펩타이드를 인코딩하는, 담배 제품.
조항 4. 조항 1 내지 3 중 어느 한 조항에 있어서, 탈조절화된 니트레이트 리덕타제를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가, 변형된 니트레이트 리덕타제 폴리펩타이드를 인코딩하는 이종성 폴리뉴클레오타이드인, 담배 제품.
조항 5. 조항 4에 있어서, 이종성 폴리뉴클레오타이드가 내인성 니트레이트 리덕타제 유전자와 천연적으로 연관(associated)되지 않은 프로모터에 연결되어 있는, 담배 제품.
조항 6. 조항 5에 있어서, 프로모터가 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터 또는 CYP82E4 프로모터인, 담배 제품.
조항 7. 조항 1 내지 6 중 어느 한 조항에 있어서, 탈조절화된 니트레이트 리덕타제를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 7의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 담배 제품.
조항 8. 조항 1 내지 3 중 어느 한 조항에 있어서, 탈조절화된 니트레이트 리덕타제를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 게놈 편집 시스템 또는 돌연변이원에 의해 변형된 내인성 니트레이트 리덕타제 유전자인, 담배 제품.
조항 9. 조항 8에 있어서, 게놈 편집 시스템이, 조작된 CRISPR/Cas-기재 시스템, 조작된 전사 활성화제-유사 효과기 뉴클레아제, 조작된 아연 핑거 뉴클레아제 또는 조작된 메가뉴클레아제를 포함하는, 담배 제품.
조항 10. 조항 1 내지 9 중 어느 한 조항에 있어서, 담배가 버얼리종 담배, 오리엔탈종 담배, 다크 담배, 엽궐련형 담배 및 황색종 담배인, 담배 제품.
조항 11. 조항 1 내지 10 중 어느 한 조항에 있어서, 니트레이트 리덕타제 효소가 탈조절화되지 않은 대조군 담배 식물 유래의 담배 제품과 비교하여, 감소된 담배 특이적 니트로소아민(TSNA) 수준을 가진, 담배 제품.
조항 12. 조항 11에 있어서, 총 TSNA 수준이 담배 식물의 잎에서 측정되며, (a) 잎은 신선하게 수확되거나; (b) 잎은 경화, 보관 또는 가공되거나; (c) 잎은 음건되는, 담배 제품.
조항 13. 조항 11 또는 12에 있어서, 담배 제품에서 적어도 하나의 TSNA의 수준이 적어도 하나의 TSNA에 대한 대조군 수준과 비교하여 감소되며, 적어도 하나의 TSNA는 N-니트로소노르니코틴(NNN), 4-(메틸니트로소아미노)-1-(3-피리딜)-1-부타논(NNK), N-니트로소아나바신(NAB), N-니트로소아나타빈(NAT) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 담배 제품.
조항 14. 조항 11 내지 13 중 어느 한 조항에 있어서, TSNA의 총 수준이 적어도 50%만큼 감소되는, 담배 제품.
조항 15. 조항 11에 있어서, TSNA 수준이 담배 식물 잎의 연소로부터 수득된 연기에서 측정되는, 담배 제품.
조항 16. 조항 15에 있어서, 연기 중 총 TSNA 수준이 적어도 70%만큼 감소되는, 담배 제품.
조항 17. 담배 제품의 생산 방법으로서, 변형된 담배 식물 잎의 연소로부터 수득된 연기에서 측정된 TSNA 수준은 비변형된 담배 식물의 연소로부터 수득된 연기에서 측정된 TSNA 수준과 비교하여 감소되며, 상기 방법은 (a) 담배 식물을, (i) 탈조절화된 니트레이트 리덕타제 효소를 인코딩하는 서열을 포함하거나, 이루어지거나 본질적으로 이루어진 폴리뉴클레오타이드; (ii) (i)에 나타낸 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드; (iii) 탈조절화된 니트레이트 리덕타제 효소를 포함하거나, 이루어지거나 본질적으로 이루어진 폴리펩타이드; 또는 (iv) (i)에 나타낸 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 구축물, 벡터 또는 발현 벡터를 포함하도록 변형하는 단계로서, 여기서, 상기 니트레이트 리덕타제의 발현 또는 활성은 비변형된 대조군 담배 식물과 비교하여 탈조절화되는, 단계; (b) 상기 변형된 담배 식물로부터 담배 잎을 수확하는 단계; 및 (c) 수확된 잎으로부터 담배 제품을 생산하는 단계를 포함하는, 담배 제품의 생산 방법.
조항 18. 조항 1 내지 17 중 어느 한 조항에 있어서, 담배 식물이, 변형된 노르니코틴 경로 유전자를 추가로 포함하는, 담배 제품.
조항 19. 조항 18에 있어서, 변형된 노르니코틴 경로 유전자가, 변형된 니코틴 데메틸라제 유전자 또는 시트크롬 P450 유전자를 포함하는, 담배 제품.
조항 20. 조항 18 또는 19에 있어서, 담배 식물이, 변형된 CYP82E4 또는 변형된 CYP82E10 유전자를 포함하는, 담배 제품.
조항 21. 조항 20에 있어서, 변형된 CYP82E4 유전자 또는 변형된 CYP82E10 유전자가 불활성화되는, 담배 제품.
조항 22. 조항 1 내지 21 중 어느 한 조항에 있어서, 담배 식물이 버얼리종 담배, 오리엔탈종 담배, 다크 담배, 엽궐련형 담배 및 황색종 담배로 이루어진 군으로부터 선택되는 변종인, 담배 제품.
조항 23. 조항 1 내지 22 중 어느 한 조항에 있어서, 담배 제품이 흡연용 재료, 코담배, 씹는 담배, 검, 론제지 또는 니코틴 용액인, 담배 제품.
조항 24. 조항 1 내지 23 중 어느 한 조항에 따른 담배 제품의 생산 방법으로서, 상기 방법은 (a) 변형된 니트레이트 리덕타제 유전자 또는 변형된 니트레이트 트랜스포터 유전자를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 식물 세포 내에 도입하는 단계; (b) 형질변환된 세포를 재생시켜, 유전자이식 식물을 생산하는 단계; 및 (c) 유전자이식 식물의 잎으로부터 담배 제품을 생산하는 단계를 포함하는, 방법.
조항 25. 조항 1 내지 23 중 어느 한 조항에 따른 담배 제품의 생산 방법으로서, 상기 방법은 (a) 내인성 니트레이트 리덕타제 유전자를 표적화하는 게놈 편집 시스템을 식물 세포 내에 도입하는 단계; (b) 형질변환된 세포를 재생시켜, 유전자이식 식물을 생산하는 단계; 및 (c) 유전자이식 식물의 잎으로부터 담배 제품을 생산하는 단계를 포함하는, 방법.
조항 26. 조항 25에 있어서, 게놈 편집 시스템이 내인성 니트레이트 리덕타제 유전자에 결합하고 상기 유전자를 절단하여, 변형된 니트레이트 리덕타제 유전자를 생성하는, 방법.
조항 27. 조항 25 또는 26에 있어서, 게놈 편집 시스템이, 조작된 CRISPR/Cas9-기재 시스템, 조작된 전사 활성화제-유사 효과기 뉴클레아제, 조작된 아연 핑거 뉴클레아제 또는 조작된 메가뉴클레아제를 포함하는, 방법.
조항 28. 조항 25 내지 27 중 어느 한 조항에 있어서, 게놈 편집 시스템이 담배 식물에서 일시적으로 발현되는, 방법.
조항 29. 조항 25 내지 27 중 어느 한 조항에 있어서, 게놈 편집 시스템이 담배 식물의 게놈 내에 혼입되는, 방법.
조항 30. 조항 25 내지 29 중 어느 한 조항에 있어서, 담배 식물이, 변형된 노르니코틴 경로 유전자를 추가로 포함하는, 방법.
조항 31. 조항 30에 있어서, 변형된 노르니코틴 경로 유전자가, 변형된 니코틴 데메틸라제 유전자 또는 시트크롬 P450 유전자를 포함하는, 방법.
조항 32. 조항 30 또는 31에 있어서, 담배 식물이, 변형된 CYP82E4 또는 변형된 CYP82E10 유전자를 포함하는, 방법.
조항 33. 조항 32에 있어서, 변형된 CYP82E4 유전자 또는 변형된 CYP82E10 유전자가 불활성화되는, 방법.
조항 34. 조항 25 내지 33 중 어느 한 조항에 있어서, 식물 세포가 버얼리종 담배, 오리엔탈종 담배, 다크 담배, 엽궐련형 담배 및 황색종 담배로 이루어진 군으로부터 선택되는 담배 변종의 식물 세포인, 방법.
조항 35. 조항 25 내지 34 중 어느 한 조항에 있어서, 담배 제품이 흡연용 재료, 코담배, 씹는 담배, 검, 론제지 또는 니코틴 용액인, 방법.
하기 핵산 및 아미노산 서열은 본원에 첨부된 서열 목록에 개시되어 있다:
SEQ ID NO:1 - Nia1 cDNA의 코딩 영역
SEQ ID NO:2 - Nia1p의 예측된 단백질 서열
SEQ ID NO:3 - (위치 523에 Ser 잔기를 함유하는) Nia2 cDNA의 코딩 영역
SEQ ID NO:4 - Nia2p의 예측된 단백질 서열
SEQ ID NO:5 - Nia2 S523D-NR cDNA의 코딩 영역
SEQ ID NO:6 - (위치 523에 Asp 잔기를 함유하는) S523D-NRp의 예측된 단백질 서열
SEQ ID NO:7 - tr-NR cDNA의 코딩 영역
SEQUENCE LISTING <110> North Carolina State University Philip Morris Products SA <120> REDUCING TOBACCO SPECIFIC NITROSAMINES THROUGH ALTERATION OF THE NITRATE ASSIMILATION PATHWAY <130> P4597PC00 <150> EP 14194798.6 <151> 2014-11-25 <150> EP 14186705.1 <151> 2014-09-26 <160> 28 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2715 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 1 atggcggcat ctgtcgaaaa caggcagttc agtcacatag aagccggttt atcccggtct 60 ttcaagcctc ggtctgattc cccggttcgt ggctgcaact tccctccgcc caacagtact 120 aatttccaaa agaaaccaaa ttccaccatt ttccttgatt actcgtcgag tgaagacgac 180 gatgatgatg acgaaaaaaa tgagtacctt caaatgatca aaaaagggaa ttcagaatta 240 gagccatctg ttcatgacag cagggacgaa ggtaccgctg ataactggat tgaacgcaac 300 ttttccttga ttcgtctcac cggaaagcat ccatttaact ccgaaccgcc gttgaaccgt 360 ctcatgcacc acggttttat cacaccggtc ccacttcatt acgttcgtaa ccatggaccg 420 gttcccaagg gcacatggga tgactggacc gtggaagtca cgggactagt gaaacgtcct 480 atgaaattca caatggacca gttggttaac gaattccctt ccagagaatt gcccgttacg 540 cttgtgtgtg ctggcaaccg aaggaaagaa cagaacatgg ttaaacaaac cattggtttc 600 aactggggtg ccgctgccgt ttcaacaact gtatggcgcg gggtacccct acgcgctttg 660 ttaaaacggt acggtgtttt tagcaagaat aaaggggcgc ttaatgtttg cttcgaagga 720 gctgatgtct tgcccggagg cggtggttca aagtatggaa ccagcattaa gaaggaattt 780 gcaatggatc cagcacgaga tatcataata gcttacatgc agaacggaga aaaattggca 840 cccgaccacg ggtttccagt acgaatgata attccaggat tcattggagg aagaatggtg 900 aaatggataa agaggattat agtcaccacc caagaatcag acagctatta tcatttcaag 960 gacaatagag ttcttcctcc ccatgttgat gctgaacttg caaatactga agcatggtgg 1020 tacaagccag agtacatcat caatgagctc aatattaact ctgtcattac gacgccgtgt 1080 catgaagaaa ttttgcctat taacgcctgg acgactcagc gaccttacac gttgaggggc 1140 tattcttatt ctggcggagg gaaaaaagta acgcgagtag aagtgacctt ggatggagga 1200 gaaacatggc aagtttgcac actagatcac ccagagaagc ccaccaaata tggcaagtac 1260 tggtgttggt gcttttggtc actcgaggtt gaggtgttag acttgctcag tgccaaagaa 1320 attgctgttc gagcttggga tgagaccctc aatactcaac ctgagaagct tatttggaat 1380 gtcatgggaa tgatgaacaa ttgctggttc cgagtaaaga tgaatgtgtg caagcctcac 1440 aagggagaga ttggaatagt gtttgaacac ccgactcaac ctggaaacca atcaggtgga 1500 tggatggcaa aggagaggca tttggagata tcagcagagg cacctccaac actaaagaag 1560 agtatctcaa ctccattcat gaacacagct tccaagatgt actccatgtc ggaggtgagg 1620 aaacacagct ctgctgactc tgcttggatc atagtccatg gtcatatcta tgacgccacg 1680 cgtttcttga aagatcaccc cggtggttct gacagcattc tcatcaatgc tggcactgat 1740 tgcactgagg aatttgatgc aattcattct gataaggcta agaagctatt ggaggaattc 1800 aggattggtg aactcctaac tactggttac acctctgact ctcctggcaa ctccgtccat 1860 ggatcttctt ccttcagcag ctttctagca cctattaagg aacttgttcc agcgcagagg 1920 agtgtggccc tcattccaag agagaaaatc ccatgcaaac tcatcgacaa acaatccatc 1980 tcccctgatg ttaggaaatt tcgatttgca ttgccctctg aggatcaagt cttgggcttg 2040 cctgttggta aacacatctt cctctgtgcc gttattgacg ataagctctg catgcgcgcc 2100 tacacgccta ctagcacgat cgatgaggtg gggtacttcg agttggttgt caagatatac 2160 ttcaaaggaa ttcaccctaa attccccaat ggggggcaaa tgtcacaata ccttgattct 2220 ctccaattag ggtcatttct cgacgtgaaa ggtccattag gtcacattga ataccaagga 2280 aagggcaatt tcttagttca tggcaaacaa aagtttgcca agaagttggc catgatagca 2340 ggtggaacag ggataactcc agtttatcaa gtcatgcagg caattctgaa agatccagaa 2400 gatgacacag aaatgtatgt ggtctatgct aatagaacag aggatgatat tttacttaag 2460 gaagagcttg attcatgggc tgagaaaatt ccagaaaggg ttaaagtttg gtatgtggtt 2520 caagattcta ttaaagaagg atggaagtac agccttggtt ttatttcaga agccattttg 2580 agagaacata tccctgagcc atctcacaca acactggctt tggcttgtgg accacctcct 2640 atgattcaat ttgctgttaa tccaaacttg gagaagatgg gctatgacat taaggattcc 2700 ttattggtgt tctaa 2715 <210> 2 <211> 904 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 2 Met Ala Ala Ser Val Glu Asn Arg Gln Phe Ser His Ile Glu Ala Gly 1 5 10 15 Leu Ser Arg Ser Phe Lys Pro Arg Ser Asp Ser Pro Val Arg Gly Cys 20 25 30 Asn Phe Pro Pro Pro Asn Ser Thr Asn Phe Gln Lys Lys Pro Asn Ser 35 40 45 Thr Ile Phe Leu Asp Tyr Ser Ser Ser Glu Asp Asp Asp Asp Asp Asp 50 55 60 Glu Lys Asn Glu Tyr Leu Gln Met Ile Lys Lys Gly Asn Ser Glu Leu 65 70 75 80 Glu Pro Ser Val His Asp Ser Arg Asp Glu Gly Thr Ala Asp Asn Trp 85 90 95 Ile Glu Arg Asn Phe Ser Leu Ile Arg Leu Thr Gly Lys His Pro Phe 100 105 110 Asn Ser Glu Pro Pro Leu Asn Arg Leu Met His His Gly Phe Ile Thr 115 120 125 Pro Val Pro Leu His Tyr Val Arg Asn His Gly Pro Val Pro Lys Gly 130 135 140 Thr Trp Asp Asp Trp Thr Val Glu Val Thr Gly Leu Val Lys Arg Pro 145 150 155 160 Met Lys Phe Thr Met Asp Gln Leu Val Asn Glu Phe Pro Ser Arg Glu 165 170 175 Leu Pro Val Thr Leu Val Cys Ala Gly Asn Arg Arg Lys Glu Gln Asn 180 185 190 Met Val Lys Gln Thr Ile Gly Phe Asn Trp Gly Ala Ala Ala Val Ser 195 200 205 Thr Thr Val Trp Arg Gly Val Pro Leu Arg Ala Leu Leu Lys Arg Tyr 210 215 220 Gly Val Phe Ser Lys Asn Lys Gly Ala Leu Asn Val Cys Phe Glu Gly 225 230 235 240 Ala Asp Val Leu Pro Gly Gly Gly Gly Ser Lys Tyr Gly Thr Ser Ile 245 250 255 Lys Lys Glu Phe Ala Met Asp Pro Ala Arg Asp Ile Ile Ile Ala Tyr 260 265 270 Met Gln Asn Gly Glu Lys Leu Ala Pro Asp His Gly Phe Pro Val Arg 275 280 285 Met Ile Ile Pro Gly Phe Ile Gly Gly Arg Met Val Lys Trp Ile Lys 290 295 300 Arg Ile Ile Val Thr Thr Gln Glu Ser Asp Ser Tyr Tyr His Phe Lys 305 310 315 320 Asp Asn Arg Val Leu Pro Pro His Val Asp Ala Glu Leu Ala Asn Thr 325 330 335 Glu Ala Trp Trp Tyr Lys Pro Glu Tyr Ile Ile Asn Glu Leu Asn Ile 340 345 350 Asn Ser Val Ile Thr Thr Pro Cys His Glu Glu Ile Leu Pro Ile Asn 355 360 365 Ala Trp Thr Thr Gln Arg Pro Tyr Thr Leu Arg Gly Tyr Ser Tyr Ser 370 375 380 Gly Gly Gly Lys Lys Val Thr Arg Val Glu Val Thr Leu Asp Gly Gly 385 390 395 400 Glu Thr Trp Gln Val Cys Thr Leu Asp His Pro Glu Lys Pro Thr Lys 405 410 415 Tyr Gly Lys Tyr Trp Cys Trp Cys Phe Trp Ser Leu Glu Val Glu Val 420 425 430 Leu Asp Leu Leu Ser Ala Lys Glu Ile Ala Val Arg Ala Trp Asp Glu 435 440 445 Thr Leu Asn Thr Gln Pro Glu Lys Leu Ile Trp Asn Val Met Gly Met 450 455 460 Met Asn Asn Cys Trp Phe Arg Val Lys Met Asn Val Cys Lys Pro His 465 470 475 480 Lys Gly Glu Ile Gly Ile Val Phe Glu His Pro Thr Gln Pro Gly Asn 485 490 495 Gln Ser Gly Gly Trp Met Ala Lys Glu Arg His Leu Glu Ile Ser Ala 500 505 510 Glu Ala Pro Pro Thr Leu Lys Lys Ser Ile Ser Thr Pro Phe Met Asn 515 520 525 Thr Ala Ser Lys Met Tyr Ser Met Ser Glu Val Arg Lys His Ser Ser 530 535 540 Ala Asp Ser Ala Trp Ile Ile Val His Gly His Ile Tyr Asp Ala Thr 545 550 555 560 Arg Phe Leu Lys Asp His Pro Gly Gly Ser Asp Ser Ile Leu Ile Asn 565 570 575 Ala Gly Thr Asp Cys Thr Glu Glu Phe Asp Ala Ile His Ser Asp Lys 580 585 590 Ala Lys Lys Leu Leu Glu Glu Phe Arg Ile Gly Glu Leu Leu Thr Thr 595 600 605 Gly Tyr Thr Ser Asp Ser Pro Gly Asn Ser Val His Gly Ser Ser Ser 610 615 620 Phe Ser Ser Phe Leu Ala Pro Ile Lys Glu Leu Val Pro Ala Gln Arg 625 630 635 640 Ser Val Ala Leu Ile Pro Arg Glu Lys Ile Pro Cys Lys Leu Ile Asp 645 650 655 Lys Gln Ser Ile Ser Pro Asp Val Arg Lys Phe Arg Phe Ala Leu Pro 660 665 670 Ser Glu Asp Gln Val Leu Gly Leu Pro Val Gly Lys His Ile Phe Leu 675 680 685 Cys Ala Val Ile Asp Asp Lys Leu Cys Met Arg Ala Tyr Thr Pro Thr 690 695 700 Ser Thr Ile Asp Glu Val Gly Tyr Phe Glu Leu Val Val Lys Ile Tyr 705 710 715 720 Phe Lys Gly Ile His Pro Lys Phe Pro Asn Gly Gly Gln Met Ser Gln 725 730 735 Tyr Leu Asp Ser Leu Gln Leu Gly Ser Phe Leu Asp Val Lys Gly Pro 740 745 750 Leu Gly His Ile Glu Tyr Gln Gly Lys Gly Asn Phe Leu Val His Gly 755 760 765 Lys Gln Lys Phe Ala Lys Lys Leu Ala Met Ile Ala Gly Gly Thr Gly 770 775 780 Ile Thr Pro Val Tyr Gln Val Met Gln Ala Ile Leu Lys Asp Pro Glu 785 790 795 800 Asp Asp Thr Glu Met Tyr Val Val Tyr Ala Asn Arg Thr Glu Asp Asp 805 810 815 Ile Leu Leu Lys Glu Glu Leu Asp Ser Trp Ala Glu Lys Ile Pro Glu 820 825 830 Arg Val Lys Val Trp Tyr Val Val Gln Asp Ser Ile Lys Glu Gly Trp 835 840 845 Lys Tyr Ser Leu Gly Phe Ile Ser Glu Ala Ile Leu Arg Glu His Ile 850 855 860 Pro Glu Pro Ser His Thr Thr Leu Ala Leu Ala Cys Gly Pro Pro Pro 865 870 875 880 Met Ile Gln Phe Ala Val Asn Pro Asn Leu Glu Lys Met Gly Tyr Asp 885 890 895 Ile Lys Asp Ser Leu Leu Val Phe 900 <210> 3 <211> 2715 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 3 atggcggcat ctgtcgaaaa caggcagttc agtcacctag aagccggttt atcccggtct 60 ttcaagcccc ggtctgattc cccggttcgt ggctgcaact tcccttcgcc caacagtact 120 aatttccaaa agaaaccaaa ttccaccatt taccttgatt actcgtcgag tgaagacgac 180 gatgatgatg acgaaaaaaa tgagtacctt caaatgatta aaaaagggaa ttcagagtta 240 gagccatctg ttcatgacac tagggacgaa ggtaccgctg ataattggat tgaacgcaac 300 ttttccatga ttcgtctcac cggaaagcat ccatttaact ccgaaccacc gttgaaccgg 360 ctcatgcacc acggctttat cacaccggtc ccacttcatt acgttcgtaa ccatggaccg 420 gttcccaagg gcacgtggga tgactggacc gtggaagtca cgggactagt gaagcgtcct 480 atgaaattca caatggacca gttggttaac gaattccctt gtagagaatt gcccgttacg 540 cttgtttgtg ctggcaatcg aaggaaagaa cagaacatgg ttaaacaaac cattggtttc 600 aactggggcg ccgctgccgt ttcaacaacg atatggcgcg gggtacccct ccgcgctttg 660 ctaaaacggt gcggtgtttt tagcaagaat aaaggggcgc ttaatgtttg cttcgaagga 720 gctgatgtgt tgcccggagg tggtggttca aagtatggaa ccagcattaa gaaggaattt 780 gcaatggatc cagcacgaga tatcatcgta gcctacatgc agaacggaga aaaattggca 840 cccgaccacg ggtttccagt acgaatgata attccaggat tcattggagg aagaatggtg 900 aaatggataa agaggattat agtcaccacc caagaatcag acagctatta tcatttcaag 960 gacaatagag ttcttcctcc ccatgttgat gctgaacttg caaataccga agcatggtgg 1020 tacaagccag agtatatcat caatgagctt aatattaact ctgtcattac gacgccgtgt 1080 catgaagaaa ttttgccaat taacgcctgg acgactcagc gaccttacac gttgaggggc 1140 tattcttatt ctggcggagg gaaaaaagta acgcgagtag aagtgacgtt ggatggagga 1200 gaaacatggc aagttagcac actagatcac ccagagaagc ccaccaaata tggcaagtac 1260 tggtgttggt gcttttggtc actcgaggtt gaggtgttag acttgctcag tgctaaagaa 1320 attgctgttc gagcttggga tgagaccctc aatactcaac ccgagaagct tatttggaac 1380 gtcatgggaa tgatgaataa ttgctggttc cgagtaaaga tgaatgtgtg caagcctcac 1440 aagggagaga ttggaatagt gtttgagcat ccgactcaac ctggaaacca atcaggtgga 1500 tggatggcga aggagagaca tttggagata tcagcagagg cacctcaaac actaaagaag 1560 agtatctcaa ctccattcat gaacacagct tccaagatgt actccatgtc cgaggtcagg 1620 aaacacagct ctgctgactc tgcttggatc atagtccatg gtcatatcta tgacgccacg 1680 cgtttcttga aagatcaccc tggtgggact gacagcattc tcatcaatgc tggcactgat 1740 tgcactgagg aatttgatgc aattcattct gataaggcta agaagctctt ggaggatttc 1800 aggattggtg aactcataac tactggttac acctctgact ctcctggcaa ctccgtgcac 1860 ggatcttctt ccttcagcag ctttctagca cctattaagg aacttgttcc agcgcagagg 1920 agtgtggccc taattccaag agagaaaatc ccatgcaaac tcatcgacaa gcaatccatc 1980 tcccatgatg ttaggaaatt tcgatttgca ttgccctctg aggatcaagt cttgggcttg 2040 cctgttggaa aacatatctt cctctgtgcc gttattgacg ataagctctg catgcgcgct 2100 tacacgccta ctagcacgat cgatgaggtg gggtacttcg agttggttgt caagatatac 2160 ttcaaaggaa ttcaccctaa attccccaat ggagggcaaa tgtcacagta tcttgattct 2220 atgccgttag ggtcatttct cgacgtgaaa ggtccattag gtcacattga ataccaagga 2280 aagggaaatt tcttagttca tggcaaacag aagtttgcca agaagttggc catgatagca 2340 ggtggaacag gaataactcc agtgtatcaa gtcatgcagg caattctgaa agatccagaa 2400 gatgacacag aaatgtatgt ggtgtatgct aacagaacag aggatgatat tttacttaag 2460 gaagagcttg attcatgggc tgagaaaatt ccagagaggg ttaaagtttg gtatgtggtt 2520 caggattcta ttaaagaagg atggaagtac agcattggtt ttattacaga agccattttg 2580 agagaacata tccctgagcc atctcacaca acactggctt tggcttgtgg accacctcct 2640 atgattcaat ttgctgttaa tccaaacttg gagaagatgg gctatgacat taaggattcc 2700 ttattggtgt tctaa 2715 <210> 4 <211> 904 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 4 Met Ala Ala Ser Val Glu Asn Arg Gln Phe Ser His Leu Glu Ala Gly 1 5 10 15 Leu Ser Arg Ser Phe Lys Pro Arg Ser Asp Ser Pro Val Arg Gly Cys 20 25 30 Asn Phe Pro Ser Pro Asn Ser Thr Asn Phe Gln Lys Lys Pro Asn Ser 35 40 45 Thr Ile Tyr Leu Asp Tyr Ser Ser Ser Glu Asp Asp Asp Asp Asp Asp 50 55 60 Glu Lys Asn Glu Tyr Leu Gln Met Ile Lys Lys Gly Asn Ser Glu Leu 65 70 75 80 Glu Pro Ser Val His Asp Thr Arg Asp Glu Gly Thr Ala Asp Asn Trp 85 90 95 Ile Glu Arg Asn Phe Ser Met Ile Arg Leu Thr Gly Lys His Pro Phe 100 105 110 Asn Ser Glu Pro Pro Leu Asn Arg Leu Met His His Gly Phe Ile Thr 115 120 125 Pro Val Pro Leu His Tyr Val Arg Asn His Gly Pro Val Pro Lys Gly 130 135 140 Thr Trp Asp Asp Trp Thr Val Glu Val Thr Gly Leu Val Lys Arg Pro 145 150 155 160 Met Lys Phe Thr Met Asp Gln Leu Val Asn Glu Phe Pro Cys Arg Glu 165 170 175 Leu Pro Val Thr Leu Val Cys Ala Gly Asn Arg Arg Lys Glu Gln Asn 180 185 190 Met Val Lys Gln Thr Ile Gly Phe Asn Trp Gly Ala Ala Ala Val Ser 195 200 205 Thr Thr Ile Trp Arg Gly Val Pro Leu Arg Ala Leu Leu Lys Arg Cys 210 215 220 Gly Val Phe Ser Lys Asn Lys Gly Ala Leu Asn Val Cys Phe Glu Gly 225 230 235 240 Ala Asp Val Leu Pro Gly Gly Gly Gly Ser Lys Tyr Gly Thr Ser Ile 245 250 255 Lys Lys Glu Phe Ala Met Asp Pro Ala Arg Asp Ile Ile Val Ala Tyr 260 265 270 Met Gln Asn Gly Glu Lys Leu Ala Pro Asp His Gly Phe Pro Val Arg 275 280 285 Met Ile Ile Pro Gly Phe Ile Gly Gly Arg Met Val Lys Trp Ile Lys 290 295 300 Arg Ile Ile Val Thr Thr Gln Glu Ser Asp Ser Tyr Tyr His Phe Lys 305 310 315 320 Asp Asn Arg Val Leu Pro Pro His Val Asp Ala Glu Leu Ala Asn Thr 325 330 335 Glu Ala Trp Trp Tyr Lys Pro Glu Tyr Ile Ile Asn Glu Leu Asn Ile 340 345 350 Asn Ser Val Ile Thr Thr Pro Cys His Glu Glu Ile Leu Pro Ile Asn 355 360 365 Ala Trp Thr Thr Gln Arg Pro Tyr Thr Leu Arg Gly Tyr Ser Tyr Ser 370 375 380 Gly Gly Gly Lys Lys Val Thr Arg Val Glu Val Thr Leu Asp Gly Gly 385 390 395 400 Glu Thr Trp Gln Val Ser Thr Leu Asp His Pro Glu Lys Pro Thr Lys 405 410 415 Tyr Gly Lys Tyr Trp Cys Trp Cys Phe Trp Ser Leu Glu Val Glu Val 420 425 430 Leu Asp Leu Leu Ser Ala Lys Glu Ile Ala Val Arg Ala Trp Asp Glu 435 440 445 Thr Leu Asn Thr Gln Pro Glu Lys Leu Ile Trp Asn Val Met Gly Met 450 455 460 Met Asn Asn Cys Trp Phe Arg Val Lys Met Asn Val Cys Lys Pro His 465 470 475 480 Lys Gly Glu Ile Gly Ile Val Phe Glu His Pro Thr Gln Pro Gly Asn 485 490 495 Gln Ser Gly Gly Trp Met Ala Lys Glu Arg His Leu Glu Ile Ser Ala 500 505 510 Glu Ala Pro Gln Thr Leu Lys Lys Ser Ile Ser Thr Pro Phe Met Asn 515 520 525 Thr Ala Ser Lys Met Tyr Ser Met Ser Glu Val Arg Lys His Ser Ser 530 535 540 Ala Asp Ser Ala Trp Ile Ile Val His Gly His Ile Tyr Asp Ala Thr 545 550 555 560 Arg Phe Leu Lys Asp His Pro Gly Gly Thr Asp Ser Ile Leu Ile Asn 565 570 575 Ala Gly Thr Asp Cys Thr Glu Glu Phe Asp Ala Ile His Ser Asp Lys 580 585 590 Ala Lys Lys Leu Leu Glu Asp Phe Arg Ile Gly Glu Leu Ile Thr Thr 595 600 605 Gly Tyr Thr Ser Asp Ser Pro Gly Asn Ser Val His Gly Ser Ser Ser 610 615 620 Phe Ser Ser Phe Leu Ala Pro Ile Lys Glu Leu Val Pro Ala Gln Arg 625 630 635 640 Ser Val Ala Leu Ile Pro Arg Glu Lys Ile Pro Cys Lys Leu Ile Asp 645 650 655 Lys Gln Ser Ile Ser His Asp Val Arg Lys Phe Arg Phe Ala Leu Pro 660 665 670 Ser Glu Asp Gln Val Leu Gly Leu Pro Val Gly Lys His Ile Phe Leu 675 680 685 Cys Ala Val Ile Asp Asp Lys Leu Cys Met Arg Ala Tyr Thr Pro Thr 690 695 700 Ser Thr Ile Asp Glu Val Gly Tyr Phe Glu Leu Val Val Lys Ile Tyr 705 710 715 720 Phe Lys Gly Ile His Pro Lys Phe Pro Asn Gly Gly Gln Met Ser Gln 725 730 735 Tyr Leu Asp Ser Met Pro Leu Gly Ser Phe Leu Asp Val Lys Gly Pro 740 745 750 Leu Gly His Ile Glu Tyr Gln Gly Lys Gly Asn Phe Leu Val His Gly 755 760 765 Lys Gln Lys Phe Ala Lys Lys Leu Ala Met Ile Ala Gly Gly Thr Gly 770 775 780 Ile Thr Pro Val Tyr Gln Val Met Gln Ala Ile Leu Lys Asp Pro Glu 785 790 795 800 Asp Asp Thr Glu Met Tyr Val Val Tyr Ala Asn Arg Thr Glu Asp Asp 805 810 815 Ile Leu Leu Lys Glu Glu Leu Asp Ser Trp Ala Glu Lys Ile Pro Glu 820 825 830 Arg Val Lys Val Trp Tyr Val Val Gln Asp Ser Ile Lys Glu Gly Trp 835 840 845 Lys Tyr Ser Ile Gly Phe Ile Thr Glu Ala Ile Leu Arg Glu His Ile 850 855 860 Pro Glu Pro Ser His Thr Thr Leu Ala Leu Ala Cys Gly Pro Pro Pro 865 870 875 880 Met Ile Gln Phe Ala Val Asn Pro Asn Leu Glu Lys Met Gly Tyr Asp 885 890 895 Ile Lys Asp Ser Leu Leu Val Phe 900 <210> 5 <211> 2715 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 5 atggcggcat ctgtcgaaaa caggcagttc agtcacctag aagccggttt atcccggtct 60 ttcaagcccc ggtctgattc cccggttcgt ggctgcaact tcccttcgcc caacagtact 120 aatttccaaa agaaaccaaa ttccaccatt taccttgatt actcgtcgag tgaagacgac 180 gatgatgatg acgaaaaaaa tgagtacctt caaatgatta aaaaagggaa ttcagagtta 240 gagccatctg ttcatgacac tagggacgaa ggtaccgctg ataattggat tgaacgcaac 300 ttttccatga ttcgtctcac cggaaagcat ccatttaact ccgaaccacc gttgaaccgg 360 ctcatgcacc acggctttat cacaccggtc ccacttcatt acgttcgtaa ccatggaccg 420 gttcccaagg gcacgtggga tgactggacc gtggaagtca cgggactagt gaagcgtcct 480 atgaaattca caatggacca gttggttaac gaattccctt gtagagaatt gcccgttacg 540 cttgtttgtg ctggcaatcg aaggaaagaa cagaacatgg ttaaacaaac cattggtttc 600 aactggggcg ccgctgccgt ttcaacaacg atatggcgcg gggtacccct ccgcgctttg 660 ctaaaacggt gcggtgtttt tagcaagaat aaaggggcgc ttaatgtttg cttcgaagga 720 gctgatgtgt tgcccggagg tggtggttca aagtatggaa ccagcattaa gaaggaattt 780 gcaatggatc cagcacgaga tatcatcgta gcctacatgc agaacggaga aaaattggca 840 cccgaccacg ggtttccagt acgaatgata attccaggat tcattggagg aagaatggtg 900 aaatggataa agaggattat agtcaccacc caagaatcag acagctatta tcatttcaag 960 gacaatagag ttcttcctcc ccatgttgat gctgaacttg caaataccga agcatggtgg 1020 tacaagccag agtatatcat caatgagctt aatattaact ctgtcattac gacgccgtgt 1080 catgaagaaa ttttgccaat taacgcctgg acgactcagc gaccttacac gttgaggggc 1140 tattcttatt ctggcggagg gaaaaaagta acgcgagtag aagtgacgtt ggatggagga 1200 gaaacatggc aagttagcac actagatcac ccagagaagc ccaccaaata tggcaagtac 1260 tggtgttggt gcttttggtc actcgaggtt gaggtgttag acttgctcag tgctaaagaa 1320 attgctgttc gagcttggga tgagaccctc aatactcaac ccgagaagct tatttggaac 1380 gtcatgggaa tgatgaataa ttgctggttc cgagtaaaga tgaatgtgtg caagcctcac 1440 aagggagaga ttggaatagt gtttgagcat ccgactcaac ctggaaacca atcaggtgga 1500 tggatggcga aggagagaca tttggagata tcagcagagg cacctcaaac actaaagaag 1560 agtatcgata ctccattcat gaacacagct tccaagatgt actccatgtc cgaggtcagg 1620 aaacacagct ctgctgactc tgcttggatc atagtccatg gtcatatcta tgacgccacg 1680 cgtttcttga aagatcaccc tggtgggact gacagcattc tcatcaatgc tggcactgat 1740 tgcactgagg aatttgatgc aattcattct gataaggcta agaagctctt ggaggatttc 1800 aggattggtg aactcataac tactggttac acctctgact ctcctggcaa ctccgtgcac 1860 ggatcttctt ccttcagcag ctttctagca cctattaagg aacttgttcc agcgcagagg 1920 agtgtggccc taattccaag agagaaaatc ccatgcaaac tcatcgacaa gcaatccatc 1980 tcccatgatg ttaggaaatt tcgatttgca ttgccctctg aggatcaagt cttgggcttg 2040 cctgttggaa aacatatctt cctctgtgcc gttattgacg ataagctctg catgcgcgct 2100 tacacgccta ctagcacgat cgatgaggtg gggtacttcg agttggttgt caagatatac 2160 ttcaaaggaa ttcaccctaa attccccaat ggagggcaaa tgtcacagta tcttgattct 2220 atgccgttag ggtcatttct cgacgtgaaa ggtccattag gtcacattga ataccaagga 2280 aagggaaatt tcttagttca tggcaaacag aagtttgcca agaagttggc catgatagca 2340 ggtggaacag gaataactcc agtgtatcaa gtcatgcagg caattctgaa agatccagaa 2400 gatgacacag aaatgtatgt ggtgtatgct aacagaacag aggatgatat tttacttaag 2460 gaagagcttg attcatgggc tgagaaaatt ccagagaggg ttaaagtttg gtatgtggtt 2520 caggattcta ttaaagaagg atggaagtac agcattggtt ttattacaga agccattttg 2580 agagaacata tccctgagcc atctcacaca acactggctt tggcttgtgg accacctcct 2640 atgattcaat ttgctgttaa tccaaacttg gagaagatgg gctatgacat taaggattcc 2700 ttattggtgt tctaa 2715 <210> 6 <211> 904 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 6 Met Ala Ala Ser Val Glu Asn Arg Gln Phe Ser His Leu Glu Ala Gly 1 5 10 15 Leu Ser Arg Ser Phe Lys Pro Arg Ser Asp Ser Pro Val Arg Gly Cys 20 25 30 Asn Phe Pro Ser Pro Asn Ser Thr Asn Phe Gln Lys Lys Pro Asn Ser 35 40 45 Thr Ile Tyr Leu Asp Tyr Ser Ser Ser Glu Asp Asp Asp Asp Asp Asp 50 55 60 Glu Lys Asn Glu Tyr Leu Gln Met Ile Lys Lys Gly Asn Ser Glu Leu 65 70 75 80 Glu Pro Ser Val His Asp Thr Arg Asp Glu Gly Thr Ala Asp Asn Trp 85 90 95 Ile Glu Arg Asn Phe Ser Met Ile Arg Leu Thr Gly Lys His Pro Phe 100 105 110 Asn Ser Glu Pro Pro Leu Asn Arg Leu Met His His Gly Phe Ile Thr 115 120 125 Pro Val Pro Leu His Tyr Val Arg Asn His Gly Pro Val Pro Lys Gly 130 135 140 Thr Trp Asp Asp Trp Thr Val Glu Val Thr Gly Leu Val Lys Arg Pro 145 150 155 160 Met Lys Phe Thr Met Asp Gln Leu Val Asn Glu Phe Pro Cys Arg Glu 165 170 175 Leu Pro Val Thr Leu Val Cys Ala Gly Asn Arg Arg Lys Glu Gln Asn 180 185 190 Met Val Lys Gln Thr Ile Gly Phe Asn Trp Gly Ala Ala Ala Val Ser 195 200 205 Thr Thr Ile Trp Arg Gly Val Pro Leu Arg Ala Leu Leu Lys Arg Cys 210 215 220 Gly Val Phe Ser Lys Asn Lys Gly Ala Leu Asn Val Cys Phe Glu Gly 225 230 235 240 Ala Asp Val Leu Pro Gly Gly Gly Gly Ser Lys Tyr Gly Thr Ser Ile 245 250 255 Lys Lys Glu Phe Ala Met Asp Pro Ala Arg Asp Ile Ile Val Ala Tyr 260 265 270 Met Gln Asn Gly Glu Lys Leu Ala Pro Asp His Gly Phe Pro Val Arg 275 280 285 Met Ile Ile Pro Gly Phe Ile Gly Gly Arg Met Val Lys Trp Ile Lys 290 295 300 Arg Ile Ile Val Thr Thr Gln Glu Ser Asp Ser Tyr Tyr His Phe Lys 305 310 315 320 Asp Asn Arg Val Leu Pro Pro His Val Asp Ala Glu Leu Ala Asn Thr 325 330 335 Glu Ala Trp Trp Tyr Lys Pro Glu Tyr Ile Ile Asn Glu Leu Asn Ile 340 345 350 Asn Ser Val Ile Thr Thr Pro Cys His Glu Glu Ile Leu Pro Ile Asn 355 360 365 Ala Trp Thr Thr Gln Arg Pro Tyr Thr Leu Arg Gly Tyr Ser Tyr Ser 370 375 380 Gly Gly Gly Lys Lys Val Thr Arg Val Glu Val Thr Leu Asp Gly Gly 385 390 395 400 Glu Thr Trp Gln Val Ser Thr Leu Asp His Pro Glu Lys Pro Thr Lys 405 410 415 Tyr Gly Lys Tyr Trp Cys Trp Cys Phe Trp Ser Leu Glu Val Glu Val 420 425 430 Leu Asp Leu Leu Ser Ala Lys Glu Ile Ala Val Arg Ala Trp Asp Glu 435 440 445 Thr Leu Asn Thr Gln Pro Glu Lys Leu Ile Trp Asn Val Met Gly Met 450 455 460 Met Asn Asn Cys Trp Phe Arg Val Lys Met Asn Val Cys Lys Pro His 465 470 475 480 Lys Gly Glu Ile Gly Ile Val Phe Glu His Pro Thr Gln Pro Gly Asn 485 490 495 Gln Ser Gly Gly Trp Met Ala Lys Glu Arg His Leu Glu Ile Ser Ala 500 505 510 Glu Ala Pro Gln Thr Leu Lys Lys Ser Ile Asp Thr Pro Phe Met Asn 515 520 525 Thr Ala Ser Lys Met Tyr Ser Met Ser Glu Val Arg Lys His Ser Ser 530 535 540 Ala Asp Ser Ala Trp Ile Ile Val His Gly His Ile Tyr Asp Ala Thr 545 550 555 560 Arg Phe Leu Lys Asp His Pro Gly Gly Thr Asp Ser Ile Leu Ile Asn 565 570 575 Ala Gly Thr Asp Cys Thr Glu Glu Phe Asp Ala Ile His Ser Asp Lys 580 585 590 Ala Lys Lys Leu Leu Glu Asp Phe Arg Ile Gly Glu Leu Ile Thr Thr 595 600 605 Gly Tyr Thr Ser Asp Ser Pro Gly Asn Ser Val His Gly Ser Ser Ser 610 615 620 Phe Ser Ser Phe Leu Ala Pro Ile Lys Glu Leu Val Pro Ala Gln Arg 625 630 635 640 Ser Val Ala Leu Ile Pro Arg Glu Lys Ile Pro Cys Lys Leu Ile Asp 645 650 655 Lys Gln Ser Ile Ser His Asp Val Arg Lys Phe Arg Phe Ala Leu Pro 660 665 670 Ser Glu Asp Gln Val Leu Gly Leu Pro Val Gly Lys His Ile Phe Leu 675 680 685 Cys Ala Val Ile Asp Asp Lys Leu Cys Met Arg Ala Tyr Thr Pro Thr 690 695 700 Ser Thr Ile Asp Glu Val Gly Tyr Phe Glu Leu Val Val Lys Ile Tyr 705 710 715 720 Phe Lys Gly Ile His Pro Lys Phe Pro Asn Gly Gly Gln Met Ser Gln 725 730 735 Tyr Leu Asp Ser Met Pro Leu Gly Ser Phe Leu Asp Val Lys Gly Pro 740 745 750 Leu Gly His Ile Glu Tyr Gln Gly Lys Gly Asn Phe Leu Val His Gly 755 760 765 Lys Gln Lys Phe Ala Lys Lys Leu Ala Met Ile Ala Gly Gly Thr Gly 770 775 780 Ile Thr Pro Val Tyr Gln Val Met Gln Ala Ile Leu Lys Asp Pro Glu 785 790 795 800 Asp Asp Thr Glu Met Tyr Val Val Tyr Ala Asn Arg Thr Glu Asp Asp 805 810 815 Ile Leu Leu Lys Glu Glu Leu Asp Ser Trp Ala Glu Lys Ile Pro Glu 820 825 830 Arg Val Lys Val Trp Tyr Val Val Gln Asp Ser Ile Lys Glu Gly Trp 835 840 845 Lys Tyr Ser Ile Gly Phe Ile Thr Glu Ala Ile Leu Arg Glu His Ile 850 855 860 Pro Glu Pro Ser His Thr Thr Leu Ala Leu Ala Cys Gly Pro Pro Pro 865 870 875 880 Met Ile Gln Phe Ala Val Asn Pro Asn Leu Glu Lys Met Gly Tyr Asp 885 890 895 Ile Lys Asp Ser Leu Leu Val Phe 900 <210> 7 <211> 2547 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 7 atggcggcat ctgtcgaaaa caggcagttc agtcacctag aagccggttt atcccggtct 60 aattcagagt tagagccatc tgttcatgac actagggacg aaggtaccgc tgataattgg 120 attgaacgca acttttccat gattcgtctc accggaaagc atccatttaa ctccgaacca 180 ccgttgaacc ggctcatgca ccacggcttt atcacaccgg tcccacttca ttacgttcgt 240 aaccatggac cggttcccaa gggcacgtgg gatgactgga ccgtggaagt cacgggacta 300 gtgaagcgtc ctatgaaatt cacaatggac cagttggtta acgaattccc ttgtagagaa 360 ttgcccgtta cgcttgtttg tgctggcaat cgaaggaaag aacagaacat ggttaaacaa 420 accattggtt tcaactgggg cgccgctgcc gtttcaacaa cgatatggcg cggggtaccc 480 ctccgcgctt tgctaaaacg gtgcggtgtt tttagcaaga ataaaggggc gcttaatgtt 540 tgcttcgaag gagctgatgt gttgcccgga ggtggtggtt caaagtatgg aaccagcatt 600 aagaaggaat ttgcaatgga tccagcacga gatatcatcg tagcctacat gcagaacgga 660 gaaaaattgg cacccgacca cgggtttcca gtacgaatga taattccagg attcattgga 720 ggaagaatgg tgaaatggat aaagaggatt atagtcacca cccaagaatc agacagctat 780 tatcatttca aggacaatag agttcttcct ccccatgttg atgctgaact tgcaaatacc 840 gaagcatggt ggtacaagcc agagtatatc atcaatgagc ttaatattaa ctctgtcatt 900 acgacgccgt gtcatgaaga aattttgcca attaacgcct ggacgactca gcgaccttac 960 acgttgaggg gctattctta ttctggcgga gggaaaaaag taacgcgagt agaagtgacg 1020 ttggatggag gagaaacatg gcaagttagc acactagatc acccagagaa gcccaccaaa 1080 tatggcaagt actggtgttg gtgcttttgg tcactcgagg ttgaggtgtt agacttgctc 1140 agtgctaaag aaattgctgt tcgagcttgg gatgagaccc tcaatactca acccgagaag 1200 cttatttgga acgtcatggg aatgatgaat aattgctggt tccgagtaaa gatgaatgtg 1260 tgcaagcctc acaagggaga gattggaata gtgtttgagc atccgactca acctggaaac 1320 caatcaggtg gatggatggc gaaggagaga catttggaga tatcagcaga ggcacctcaa 1380 acactaaaga agagtatctc aactccattc atgaacacag cttccaagat gtactccatg 1440 tccgaggtca ggaaacacag ctctgctgac tctgcttgga tcatagtcca tggtcatatc 1500 tatgacgcca cgcgtttctt gaaagatcac cctggtggga ctgacagcat tctcatcaat 1560 gctggcactg attgcactga ggaatttgat gcaattcatt ctgataaggc taagaagctc 1620 ttggaggatt tcaggattgg tgaactcata actactggtt acacctctga ctctcctggc 1680 aactccgtgc acggatcttc ttccttcagc agctttctag cacctattaa ggaacttgtt 1740 ccagcgcaga ggagtgtggc cctaattcca agagagaaaa tcccatgcaa actcatcgac 1800 aagcaatcca tctcccatga tgttaggaaa tttcgatttg cattgccctc tgaggatcaa 1860 gtcttgggct tgcctgttgg aaaacatatc ttcctctgtg ccgttattga cgataagctc 1920 tgcatgcgcg cttacacgcc tactagcacg atcgatgagg tggggtactt cgagttggtt 1980 gtcaagatat acttcaaagg aattcaccct aaattcccca atggagggca aatgtcacag 2040 tatcttgatt ctatgccgtt agggtcattt ctcgacgtga aaggtccatt aggtcacatt 2100 gaataccaag gaaagggaaa tttcttagtt catggcaaac agaagtttgc caagaagttg 2160 gccatgatag caggtggaac aggaataact ccagtgtatc aagtcatgca ggcaattctg 2220 aaagatccag aagatgacac agaaatgtat gtggtgtatg ctaacagaac agaggatgat 2280 attttactta aggaagagct tgattcatgg gctgagaaaa ttccagagag ggttaaagtt 2340 tggtatgtgg ttcaggattc tattaaagaa ggatggaagt acagcattgg ttttattaca 2400 gaagccattt tgagagaaca tatccctgag ccatctcaca caacactggc tttggcttgt 2460 ggaccacctc ctatgattca atttgctgtt aatccaaact tggagaagat gggctatgac 2520 attaaggatt ccttattggt gttctaa 2547 <210> 8 <211> 848 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 8 Met Ala Ala Ser Val Glu Asn Arg Gln Phe Ser His Leu Glu Ala Gly 1 5 10 15 Leu Ser Arg Ser Asn Ser Glu Leu Glu Pro Ser Val His Asp Thr Arg 20 25 30 Asp Glu Gly Thr Ala Asp Asn Trp Ile Glu Arg Asn Phe Ser Met Ile 35 40 45 Arg Leu Thr Gly Lys His Pro Phe Asn Ser Glu Pro Pro Leu Asn Arg 50 55 60 Leu Met His His Gly Phe Ile Thr Pro Val Pro Leu His Tyr Val Arg 65 70 75 80 Asn His Gly Pro Val Pro Lys Gly Thr Trp Asp Asp Trp Thr Val Glu 85 90 95 Val Thr Gly Leu Val Lys Arg Pro Met Lys Phe Thr Met Asp Gln Leu 100 105 110 Val Asn Glu Phe Pro Cys Arg Glu Leu Pro Val Thr Leu Val Cys Ala 115 120 125 Gly Asn Arg Arg Lys Glu Gln Asn Met Val Lys Gln Thr Ile Gly Phe 130 135 140 Asn Trp Gly Ala Ala Ala Val Ser Thr Thr Ile Trp Arg Gly Val Pro 145 150 155 160 Leu Arg Ala Leu Leu Lys Arg Cys Gly Val Phe Ser Lys Asn Lys Gly 165 170 175 Ala Leu Asn Val Cys Phe Glu Gly Ala Asp Val Leu Pro Gly Gly Gly 180 185 190 Gly Ser Lys Tyr Gly Thr Ser Ile Lys Lys Glu Phe Ala Met Asp Pro 195 200 205 Ala Arg Asp Ile Ile Val Ala Tyr Met Gln Asn Gly Glu Lys Leu Ala 210 215 220 Pro Asp His Gly Phe Pro Val Arg Met Ile Ile Pro Gly Phe Ile Gly 225 230 235 240 Gly Arg Met Val Lys Trp Ile Lys Arg Ile Ile Val Thr Thr Gln Glu 245 250 255 Ser Asp Ser Tyr Tyr His Phe Lys Asp Asn Arg Val Leu Pro Pro His 260 265 270 Val Asp Ala Glu Leu Ala Asn Thr Glu Ala Trp Trp Tyr Lys Pro Glu 275 280 285 Tyr Ile Ile Asn Glu Leu Asn Ile Asn Ser Val Ile Thr Thr Pro Cys 290 295 300 His Glu Glu Ile Leu Pro Ile Asn Ala Trp Thr Thr Gln Arg Pro Tyr 305 310 315 320 Thr Leu Arg Gly Tyr Ser Tyr Ser Gly Gly Gly Lys Lys Val Thr Arg 325 330 335 Val Glu Val Thr Leu Asp Gly Gly Glu Thr Trp Gln Val Ser Thr Leu 340 345 350 Asp His Pro Glu Lys Pro Thr Lys Tyr Gly Lys Tyr Trp Cys Trp Cys 355 360 365 Phe Trp Ser Leu Glu Val Glu Val Leu Asp Leu Leu Ser Ala Lys Glu 370 375 380 Ile Ala Val Arg Ala Trp Asp Glu Thr Leu Asn Thr Gln Pro Glu Lys 385 390 395 400 Leu Ile Trp Asn Val Met Gly Met Met Asn Asn Cys Trp Phe Arg Val 405 410 415 Lys Met Asn Val Cys Lys Pro His Lys Gly Glu Ile Gly Ile Val Phe 420 425 430 Glu His Pro Thr Gln Pro Gly Asn Gln Ser Gly Gly Trp Met Ala Lys 435 440 445 Glu Arg His Leu Glu Ile Ser Ala Glu Ala Pro Gln Thr Leu Lys Lys 450 455 460 Ser Ile Ser Thr Pro Phe Met Asn Thr Ala Ser Lys Met Tyr Ser Met 465 470 475 480 Ser Glu Val Arg Lys His Ser Ser Ala Asp Ser Ala Trp Ile Ile Val 485 490 495 His Gly His Ile Tyr Asp Ala Thr Arg Phe Leu Lys Asp His Pro Gly 500 505 510 Gly Thr Asp Ser Ile Leu Ile Asn Ala Gly Thr Asp Cys Thr Glu Glu 515 520 525 Phe Asp Ala Ile His Ser Asp Lys Ala Lys Lys Leu Leu Glu Asp Phe 530 535 540 Arg Ile Gly Glu Leu Ile Thr Thr Gly Tyr Thr Ser Asp Ser Pro Gly 545 550 555 560 Asn Ser Val His Gly Ser Ser Ser Phe Ser Ser Phe Leu Ala Pro Ile 565 570 575 Lys Glu Leu Val Pro Ala Gln Arg Ser Val Ala Leu Ile Pro Arg Glu 580 585 590 Lys Ile Pro Cys Lys Leu Ile Asp Lys Gln Ser Ile Ser His Asp Val 595 600 605 Arg Lys Phe Arg Phe Ala Leu Pro Ser Glu Asp Gln Val Leu Gly Leu 610 615 620 Pro Val Gly Lys His Ile Phe Leu Cys Ala Val Ile Asp Asp Lys Leu 625 630 635 640 Cys Met Arg Ala Tyr Thr Pro Thr Ser Thr Ile Asp Glu Val Gly Tyr 645 650 655 Phe Glu Leu Val Val Lys Ile Tyr Phe Lys Gly Ile His Pro Lys Phe 660 665 670 Pro Asn Gly Gly Gln Met Ser Gln Tyr Leu Asp Ser Met Pro Leu Gly 675 680 685 Ser Phe Leu Asp Val Lys Gly Pro Leu Gly His Ile Glu Tyr Gln Gly 690 695 700 Lys Gly Asn Phe Leu Val His Gly Lys Gln Lys Phe Ala Lys Lys Leu 705 710 715 720 Ala Met Ile Ala Gly Gly Thr Gly Ile Thr Pro Val Tyr Gln Val Met 725 730 735 Gln Ala Ile Leu Lys Asp Pro Glu Asp Asp Thr Glu Met Tyr Val Val 740 745 750 Tyr Ala Asn Arg Thr Glu Asp Asp Ile Leu Leu Lys Glu Glu Leu Asp 755 760 765 Ser Trp Ala Glu Lys Ile Pro Glu Arg Val Lys Val Trp Tyr Val Val 770 775 780 Gln Asp Ser Ile Lys Glu Gly Trp Lys Tyr Ser Ile Gly Phe Ile Thr 785 790 795 800 Glu Ala Ile Leu Arg Glu His Ile Pro Glu Pro Ser His Thr Thr Leu 805 810 815 Ala Leu Ala Cys Gly Pro Pro Pro Met Ile Gln Phe Ala Val Asn Pro 820 825 830 Asn Leu Glu Lys Met Gly Tyr Asp Ile Lys Asp Ser Leu Leu Val Phe 835 840 845 <210> 9 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tomato; NIA; 523-533 <400> 9 Leu Lys Lys Ser Ile Ser Thr Pro Phe Met Asn 1 5 10 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tobacco; NIA1; 518-528 <400> 10 Leu Lys Lys Ser Ile Ser Thr Pro Phe Met Asn 1 5 10 <210> 11 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tobacco; NIA2; 518-528 <400> 11 Leu Lys Lys Ser Ile Ser Thr Pro Phe Met Asn 1 5 10 <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Petunia; NIA; 522-532 <400> 12 Leu Lys Lys Ser Ile Ser Thr Pro Phe Met Asn 1 5 10 <210> 13 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Squash; NIA; 530-540 <400> 13 Leu Lys Lys Ser Val Ser Thr Pro Phe Met Asn 1 5 10 <210> 14 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Birch; NIA1; 515-525 <400> 14 Leu Lys Lys Ser Val Ser Thr Pro Phe Met Asn 1 5 10 <210> 15 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Arabidopsis; NIA1; 532-542 <400> 15 Leu Lys Lys Ser Val Ser Ser Pro Phe Met Asn 1 5 10 <210> 16 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Arabidopsis; NIA2; 529-539 <400> 16 Leu Lys Lys Ser Val Ser Thr Pro Phe Met Asn 1 5 10 <210> 17 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rape; NIA1; 526-536 <400> 17 Leu Lys Lys Ser Val Ser Ser Pro Phe Met Asn 1 5 10 <210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rape; NIA2; 526-536 <400> 18 Leu Lys Lys Ser Val Ser Thr Pro Phe Met Asn 1 5 10 <210> 19 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Soybean; NIA2; 504-514 <400> 19 Leu Lys Lys Ser Val Ser Ser Pro Phe Met Asn 1 5 10 <210> 20 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kidney bean; NIA1; 502-512 <400> 20 Leu Lys Lys Ser Val Ser Thr Pro Phe Met Asn 1 5 10 <210> 21 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kidney bean; NIA2; 500-510 <400> 21 Leu Lys Lys Ser Val Ser Ser Pro Phe Met Asn 1 5 10 <210> 22 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lotus japonicus; NIA; 508-518 <400> 22 Leu Lys Lys Ser Val Ser Ser Pro Phe Met Asn 1 5 10 <210> 23 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cichorium; NIA1; 521-531 <400> 23 Leu Lys Lys Ser Val Ser Ser Pro Phe Met Asn 1 5 10 <210> 24 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Maize; NIA1; 234-244 <400> 24 Leu Lys Arg Ser Thr Ser Thr Pro Phe Met Asn 1 5 10 <210> 25 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Barley; NIA1; 524-534 <400> 25 Leu Lys Arg Ser Thr Ser Thr Pro Phe Met Asn 1 5 10 <210> 26 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Barley; NIA2; 521-531 <400> 26 Leu Lys Arg Ser Thr Ser Thr Pro Phe Met Asn 1 5 10 <210> 27 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rice; NIA1; 527-537 <400> 27 Leu Lys Arg Ser Thr Ser Thr Pro Phe Met Asn 1 5 10 <210> 28 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Spinach; NIA; 538-548 <400> 28 Leu Lys Arg Thr Ala Ser Thr Pro Phe Met Asn 1 5 10

Claims (25)

  1. 담배 식물로부터 발생되는 담배 특이적 니트로소아민(TSNA) 수준이 감소된 담배 제품으로서, 상기 담배 식물은
    (i) 탈조절화된 니트레이트 리덕타제 효소를 인코딩하는 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 본질적으로 이루어진 폴리뉴클레오타이드;
    (ii) (i)에 나타낸 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드;
    (iii) 탈조절화된 니트레이트 리덕타제 효소를 포함하거나, 이로 이루어지거나 본질적으로 이루어진 폴리펩타이드; 또는
    (iv) (i)에 나타낸 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 구축물, 벡터 또는 발현 벡터를 포함하도록 변형하는 단계로서,
    여기서, 상기 니트레이트 리덕타제의 발현 또는 활성은 비변형된 대조군 담배 식물과 비교하여 탈조절화되고;
    탈조절화된 니트레이트 리덕타제 효소는
    (a) SEQ ID NO: 4의 위치 523에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함하는 니트레이트 리덕타제 폴리펩타이드; 또는
    (b) SEQ ID NO: 4의 위치 523의 아미노산이 아스파르트산으로 치환되는, SEQ ID NO: 4의 위치 523에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함하는 니트레이트 리덕타제 폴리펩타이드를 포함하는, 담배 제품.
  2. 제1항에 있어서, 탈조절화된 니트레이트 리덕타제 효소가, 구성적으로 활성인 니트레이트 리덕타제 효소인, 담배 제품.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 담배 제품이 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) 종의 담배 식물로부터 유래되는 식물 재료를 포함하는, 담배 제품.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 탈조절화된 니트레이트 리덕타제를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가, 변형된 니트레이트 리덕타제 폴리펩타이드를 인코딩하는 이종성 폴리뉴클레오타이드인, 담배 제품.
  5. 제4항에 있어서, 이종성 폴리뉴클레오타이드가 내인성 니트레이트 리덕타제 유전자와 선천적으로(natively) 연관(associated)되어 있지 않은 프로모터에 연결되어 있는, 담배 제품.
  6. 제5항에 있어서, 프로모터가 콜리플라워 모자이크 바이러스(Cauliflower Mosaic Virus) 35S 프로모터인, 담배 제품.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 탈조절화된 니트레이트 리덕타제를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 SEQ ID NO: 5의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 담배 제품.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 탈조절화된 니트레이트 리덕타제를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 게놈 편집 시스템 또는 돌연변이원에 의해 변형된 내인성 니트레이트 리덕타제 유전자인, 담배 제품.
  9. 제8항에 있어서, 게놈 편집 시스템이, 조작된 CRISPR/Cas-기반 시스템, 조작된 전사 활성화제-유사(Transcription Activator-Like) 효과기 뉴클레아제, 조작된 아연 핑거 뉴클레아제 또는 조작된 메가뉴클레아제를 포함하는, 담배 제품.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 담배가 버얼리종(burley) 담배인, 담배 제품.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 니트레이트 리덕타제 효소가 탈조절화되지 않은 대조군 담배 식물 유래의 담배 제품과 비교하여, 감소된 담배 특이적인 니트로사민(TSNA) 수준을 가진, 담배 제품.
  12. 제11항에 있어서, 총 TSNA 수준이 담배 식물의 잎에서 측정되며,
    (a) 잎은 신선하게 수확되거나;
    (b) 잎은 경화, 보관 또는 가공되거나;
    (c) 잎은 음건되는, 담배 제품.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 담배 제품에서 적어도 하나의 TSNA의 수준이 적어도 하나의 TSNA에 대한 대조군 수준과 비교하여 감소되며, 적어도 하나의 TSNA는 N-니트로소노르니코틴(NNN), 4-(메틸니트로사미노)-1-(3-피리딜)-1-부타논(NNK), N-니트로소아나바신(NAB), N-니트로소아나타빈(NAT) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 담배 제품.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, TSNA의 총 수준이 적어도 50%까지 감소되는, 담배 제품.
  15. 제11항에 있어서, TSNA 수준이 담배 식물 잎의 연소로부터 수득된 연기에서 측정되는, 담배 제품.
  16. 제15항에 있어서, 연기 중 총 TSNA 수준이 적어도 70%까지 감소되는, 담배 제품.
  17. 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, NNN의 수준이 약 90%까지 감소되는, 담배 제품.
  18. 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, NNK의 수준이 약 66%까지 감소되는, 담배 제품.
  19. 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, NAB의 수준이 약 92%까지 감소되는, 담배 제품.
  20. 제13항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, NAT의 수준이 약 88%까지 감소되는, 담배 제품.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 담배 식물이, 변형된 노르니코틴 경로 유전자를 추가로 포함하는, 담배 제품.
  22. 제21항에 있어서, 변형된 노르니코틴 경로 유전자가, 변형된 니코틴 데 메틸라제 유전자 또는 시트크롬 P450 유전자를 포함하는, 담배 제품.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 담배 식물이, 변형된 CYP82E4 유전자 또는 변형된 CYP82E10 유전자를 포함하는, 담배 제품.
  24. 제23항에 있어서, 변형된 CYP82E4 유전자 또는 변형된 CYP82E10 유전자가 불활성화되는, 담배 제품.
  25. 담배 제품의 생산 방법으로서, 변형된 담배 식물 잎의 연소로부터 수득된 연기에서 측정된 TSNA 수준은 비변형된 담배 식물의 연소로부터 수득된 연기에서 측정된 TSNA 수준과 비교하여 감소되며, 상기 방법은
    담배 식물을,
    (i) 탈조절화된 니트레이트 리덕타제 효소를 인코딩하는 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 본질적으로 이루어진 폴리뉴클레오타이드;
    (ii) (i)에 나타낸 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드;
    (iii) 탈조절화된 니트레이트 리덕타제 효소를 포함하거나, 이로 이루어지거나 본질적으로 이루어진 폴리펩타이드; 또는
    (iv) (i)에 나타낸 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 구축물, 벡터 또는 발현 벡터를 포함하도록 변형하는 단계로서,
    여기서, 상기 니트레이트 리덕타제의 발현 또는 활성은 비변형된 대조군 담배 식물과 비교하여 탈조절화되고;
    탈조절화된 니트레이트 리덕타제 효소는
    (I) SEQ ID NO: 4의 위치 523에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함하는 니트레이트 리덕타제 폴리펩타이드; 또는
    (II) SEQ ID NO: 4의 위치 523의 아미노산이 아스파르트산으로 치환되는, SEQ ID NO: 4의 위치 523에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함하는 니트레이트 리덕타제 폴리펩타이드를 포함하는, 단계;
    상기 변형된 담배 식물로부터 담배 잎을 수확하는 단계; 및
    수확된 잎으로부터 담배 제품을 생산하는 단계를 포함하는, 담배 제품의 생산 방법.
KR1020177008015A 2014-09-26 2015-09-23 니트레이트 동화 경로의 변경을 통한 담배 특이적 니트로소아민의 감소 KR102524798B1 (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP14186705.1 2014-09-26
EP14186705 2014-09-26
EP14194798 2014-11-25
EP14194798.6 2014-11-25
PCT/EP2015/071919 WO2016046288A1 (en) 2014-09-26 2015-09-23 Reducing tobacco specific nitrosamines through alteration of the nitrate assimilation pathway

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20170078599A true KR20170078599A (ko) 2017-07-07
KR102524798B1 KR102524798B1 (ko) 2023-04-24

Family

ID=54148547

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020177008015A KR102524798B1 (ko) 2014-09-26 2015-09-23 니트레이트 동화 경로의 변경을 통한 담배 특이적 니트로소아민의 감소

Country Status (12)

Country Link
US (1) US11666082B2 (ko)
EP (1) EP3198015A1 (ko)
JP (1) JP6921740B2 (ko)
KR (1) KR102524798B1 (ko)
CN (1) CN106998787A (ko)
BR (1) BR112017003842B1 (ko)
CA (1) CA2959245A1 (ko)
CO (1) CO2017004076A2 (ko)
MX (1) MX2017003932A (ko)
PH (1) PH12017500313A1 (ko)
RU (1) RU2721799C2 (ko)
WO (1) WO2016046288A1 (ko)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20240013283A (ko) 2014-12-03 2024-01-30 애질런트 테크놀로지스, 인크. 화학적 변형을 갖는 가이드 rna
JP6873911B2 (ja) 2015-04-06 2021-05-19 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー 初代細胞において標的核酸の遺伝子調節を誘導するためにインビトロで行う方法
BR112017023719A2 (pt) * 2015-05-05 2018-07-17 Univ North Carolina State planta de tabaco, parte de planta e/ou célula de planta, semente, cultura de planta, produto de tabaco, método para reduzir pon e/ou nnk, método de produção de uma planta e método para produzir um produto de tabaco
US10767175B2 (en) 2016-06-08 2020-09-08 Agilent Technologies, Inc. High specificity genome editing using chemically modified guide RNAs
CN106036984B (zh) * 2016-07-03 2017-08-08 赖高生 一种固定化蜗牛酶制备烟草浸膏的方法
WO2019185703A1 (en) 2018-03-28 2019-10-03 Philip Morris Products S.A. Modulating amino acid content in a plant
JP2021519064A (ja) 2018-03-28 2021-08-10 フィリップ・モーリス・プロダクツ・ソシエテ・アノニム 植物体における還元糖含有量の調節
CN108424922B (zh) * 2018-04-20 2021-04-16 云南省烟草农业科学研究院 一种降低尼古丁转化率的cyp82e10基因错义突变体m271及其应用
GB201812603D0 (en) * 2018-08-02 2018-09-19 British American Tobacco Investments Ltd Method
KR20210109578A (ko) * 2018-12-30 2021-09-06 필립모리스 프로덕츠 에스.에이. 니트레이트 환원효소의 돌연변이를 통한 식물 내 니트레이트 수준 조절
WO2021063860A1 (en) 2019-10-01 2021-04-08 Philip Morris Products S.A. Modulating reducing sugar content in a plant (inv)
KR20220071260A (ko) 2019-10-01 2022-05-31 필립모리스 프로덕츠 에스.에이. 식물 내 당 및 아미노산 (sultr3) 함량 조절
CN110747208B (zh) * 2019-11-28 2022-04-22 海南大学 一种木薯硝酸还原酶基因及其过量表达载体的构建和抗病应用
CN110819640B (zh) * 2019-12-19 2022-06-21 中国烟草总公司郑州烟草研究院 烟草NtNRP1基因其应用
US11865139B2 (en) 2020-11-12 2024-01-09 Thermolife International, Llc Method of treating migraines and headaches
WO2022124361A1 (ja) 2020-12-09 2022-06-16 日本たばこ産業株式会社 タバコ植物及びたばこ製品
WO2022192743A1 (en) * 2021-03-11 2022-09-15 Thermolife International, Llc Enhanced nitrate, elemental metal, and amino acid compositions and methods of use
AU2022343300A1 (en) 2021-09-10 2024-04-18 Agilent Technologies, Inc. Guide rnas with chemical modification for prime editing
WO2023117661A1 (en) 2021-12-20 2023-06-29 Philip Morris Products S.A. Increasing anatabine in tobacco leaf by regulating methyl putrescine oxidase
WO2023117701A1 (en) 2021-12-21 2023-06-29 Philip Morris Products S.A. Modulation of nicotine production by alteration of nicotinamidase expression or function in plants
WO2024079137A1 (en) 2022-10-13 2024-04-18 Philip Morris Products S.A. Increasing leaf biomass and nitrogen use efficiency by regulating ntp2

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013140155A1 (en) * 2012-03-20 2013-09-26 British Americal Tobacco (Investments) Limited Transgenic plants with altered nitrate levels in leaves

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US5990387A (en) 1988-06-10 1999-11-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Stable transformation of plant cells
US5879918A (en) 1989-05-12 1999-03-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Pretreatment of microprojectiles prior to using in a particle gun
US5932782A (en) 1990-11-14 1999-08-03 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant transformation method using agrobacterium species adhered to microprojectiles
BR9306802A (pt) 1992-07-27 1998-12-08 Pioneer Hi Bred Int Processo independente de genótipos para produção de planta de soja transgénica e processo de regeneração de plantas de soja a partir de nodos cotiledonais
US5981840A (en) 1997-01-24 1999-11-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for agrobacterium-mediated transformation
CA2420724A1 (en) * 2000-08-30 2002-03-07 North Carolina State University Transgenic plants containing molecular decoys that alter protein content therein
EP1406518A4 (en) * 2001-06-08 2006-03-29 Vector Tobacco Ltd CHANGES IN NICOTINE AND NITROSAMINE LEVELS IN TOBACCO
AP2265A (en) * 2003-08-19 2011-08-01 22Nd Century Ltd Llc Reduced-exposure tobacco products.
CN1926235B (zh) * 2003-10-16 2012-07-18 美国无烟烟草有限责任公司 从烟草克隆细胞色素p450基因
US20070199097A1 (en) * 2004-09-03 2007-08-23 U.S. Smokeless Tobacco Company Tobacco plants having a mutation in a nicotine demethylase gene
WO2008070274A2 (en) 2006-10-13 2008-06-12 North Carolina State University Alteration of tobacco alkaloid content through modification of specific cytochrome p450 genes
RU2324737C1 (ru) * 2006-10-18 2008-05-20 Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук (СО РАН) Способ получения трансгенных растений табака с повышенным содержанием пролина
JP5780702B2 (ja) * 2007-02-23 2015-09-16 ユーエス スモークレス タバコ カンパニー リミテッド ライアビリティ カンパニー タバコ組成物および作製法
WO2008115487A1 (en) * 2007-03-16 2008-09-25 New York University Methods of affecting plant growth with microrna
EP2220231B1 (en) * 2007-11-12 2017-10-11 North Carolina State University Alteration of tobacco alkaloid content through modification of specific cytochrome p450 genes
WO2011088180A1 (en) 2010-01-15 2011-07-21 North Carolina State University Compositions and methods for minimizing nornicotine synthesis in tobacco
WO2011102394A1 (ja) * 2010-02-17 2011-08-25 日本たばこ産業株式会社 植物内容成分の調節因子、およびその利用
WO2012038717A1 (en) * 2010-09-22 2012-03-29 Advanced Technologies (Cambridge) Limited Transgenic plants
RU2013139871A (ru) 2011-02-28 2015-04-10 Норт Каролина Стейт Юниверсити Инбредные растения табака ncbex1f, ncbex1mc и nc ex90

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013140155A1 (en) * 2012-03-20 2013-09-26 British Americal Tobacco (Investments) Limited Transgenic plants with altered nitrate levels in leaves

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Unni S. Lea 등. Plant Physiology. Vol. 140, No. 3, 페이지 1085-1094 (2006.03.) *

Also Published As

Publication number Publication date
PH12017500313A1 (en) 2017-07-17
CN106998787A (zh) 2017-08-01
JP6921740B2 (ja) 2021-08-18
MX2017003932A (es) 2017-06-30
RU2017114356A3 (ko) 2019-04-29
US11666082B2 (en) 2023-06-06
CA2959245A1 (en) 2016-03-31
JP2017529850A (ja) 2017-10-12
US20170303582A1 (en) 2017-10-26
BR112017003842A2 (pt) 2017-12-19
WO2016046288A1 (en) 2016-03-31
RU2017114356A (ru) 2018-10-29
CO2017004076A2 (es) 2017-09-20
RU2721799C2 (ru) 2020-05-22
BR112017003842B1 (pt) 2024-02-20
EP3198015A1 (en) 2017-08-02
KR102524798B1 (ko) 2023-04-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102524798B1 (ko) 니트레이트 동화 경로의 변경을 통한 담배 특이적 니트로소아민의 감소
CN106459923B (zh) 植物中烟碱向降烟碱转化的减少
US11304440B2 (en) Tobacco having altered leaf properties and methods of making and using
US11950563B2 (en) Compositions and methods for producing tobacco plants and products having altered alkaloid levels
CN105247053B (zh) 植物中的烟草特异性亚硝胺降低
CN108697059B (zh) 减少田地生长烟草植物中的镉累积
KR102012531B1 (ko) 니코티아나 타바쿰으로부터의 트레오닌 합성효소 및 그의 방법 및 용도
JP7280245B2 (ja) タバコにおける改善された窒素利用効率に関する方法および組成物
JP2018527934A5 (ko)
US20200239899A1 (en) Tobacco Plants Comprising Reduced Nicotine and Reduced Tobacco Specific Nitrosamines
JP2023504511A (ja) 変化したアルカロイドレベルを有するタバコ植物およびタバコ製品を作製するための組成物および方法
WO2021247740A1 (en) Compositions and methods for producing tobacco plants and products having altered alkaloid levels
CN113271768B (zh) 经由硝酸盐还原酶的突变来调节植物中的硝酸盐水平
US20240067977A1 (en) Compositions and methods for producing tobacco plants and products having altered alkaloid levels with desirable leaf quality via manipulating leaf quality genes
CN111801423A (zh) 调节植物中的氨基酸含量
US20190309317A1 (en) Compositions and methods for producing tobacco plants and products having altered alkaloid levels
JP2010136623A (ja) 燃焼煙中のカルボニル類含量が低減されたタバコ属植物およびその作製法
US20210230627A1 (en) Methods and compositions related to improved nitrogen use efficiency
RU2799785C2 (ru) Модулирование содержания аминокислот в растении

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant