CN106459923B - 植物中烟碱向降烟碱转化的减少 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种突变型、非天然存在的或转基因烟草植物细胞，其包括：(i)多核苷酸，其包括编码功能性烟碱N‑去甲基酶的序列、由编码功能性烟碱N‑去甲基酶的序列组成或基本上由编码功能性烟碱N‑去甲基酶的序列组成且与SEQ ID NO：2具有至少95％的序列同一性；(ii)由阐述于(i)中的所述多核苷酸编码的多肽；(iii)多肽，其包括编码N‑去甲基酶的序列、由编码N‑去甲基酶的序列组成或基本上由编码N‑去甲基酶的序列组成且与SEQ ID NO：3具有至少95％的序列同一性；或(iv)构建体、载体或表达载体，其包括阐述于(i)中的所述分离的多核苷酸，且其中与所述烟碱去甲基酶的表达或活性未降低的对照烟草植物细胞相比，所述烟碱去甲基酶的表达或活性得以降低。

Description

植物中烟碱向降烟碱转化的减少
技术领域
本发明公开了来自烟草属和其变体、同系物和片段的烟碱N-去甲基酶(NND3)的新颖变体的多核苷酸序列。本发明还公开了多肽序列以及其变体、同系物及片段。本发明还公开了这些基因的表达或由其编码的蛋白质活性的修改以调节植物细胞或植物中的一或多种烟草特有亚硝胺(TSNA)水平。
背景技术
烟草特有亚硝胺(TSNA)主要在烟叶烘烤和加工期间形成。烟草烘烤是带出每个烟草品种的香气和风味的物理和生物化学变化过程。认为烘烤的烟叶中的TSNA量取决于亚硝酸盐的累积，所述亚硝酸盐在植物细胞的死亡期间累积，并且通过在接近厌氧(氧缺乏)环境的条件下的硝酸盐还原而在烘烤期间形成。硝酸盐至亚硝酸盐的还原被认为通过在厌氧条件下在叶表面上的细菌作用而发生，并且该还原在某些条件下特别显著。一旦形成亚硝酸盐，这些化合物就被认为与多种烟草生物碱(包含含吡啶化合物)组合以形成亚硝胺。
四种主要的TSNA，即通常发现以最高浓度存在的那些，是N-亚硝基去甲烟碱(NNN)、4-(甲基亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N-亚硝基假木贼碱(NAB)和N-亚硝基新烟草碱(NAT)。次要化合物，即通常以显著低于主要TSNA的水平发现的那些，包含4-(甲基亚硝氨基)4-(3-吡啶基)丁醛(NNA)、4-(甲基亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇(NNAL)、4-(甲基亚硝氨基)4-(3-吡啶基)-1-丁醇(异-NNAL)和4-(甲基亚硝氨基)-4-(3-吡啶基)-1-丁酸(异-NNAC)。至少NNN和NNK据报道当应用于实验室研究中的动物时是致癌的。
NNN形成的主要的生化机制是降烟碱的N-亚硝化，通过酶类烟碱N-去甲基酶经烟碱的N-脱甲基化产生生物碱。尽管降烟碱通常表示所种植烟草中<5％的总生物碱含量，但降烟碱水平可通过被称为“转化”的机制显著地增加，其中累积烟碱作为其主要生物碱的植物产生使叶烟碱的大部分(高达95％)代谢成降烟碱的后代。在已经基因转化的个体(被称为“转换子”)中，烟碱向降烟碱的N-去甲基化主要在衰老和烘烤期间发生。维持低降烟碱水平是合乎需要的，因为其作为NNN的前体充分表征的作用，并且还因为降烟碱本身可导致非所要的健康影响。Dickerson和Janda(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA99，15084-15088证实降烟碱可诱发蛋白质的异常糖化，并且展示在吸烟者的血浆中经修改蛋白质的累积增加。此外，同一报告提供降烟碱可与常用类固醇类药物(例如强的松(prednisone))共价反应，从而潜在地改变这些药物的功效和毒性的证据。WO98/58555描述在通过微波烘烤以减少TSNA之前或期间对烟叶的处理。US 5,810,020描述了通过使烟草材料与捕集槽接触用于去除来自烟草的TSNA的方法，其中所述捕集槽包括选择过渡金属络合物，其容易亚硝化以形成亚硝酰基复合物，伴随很少的动力学或热力学阻力。US 6,202,649描述了通过尤其在受控环境中烘烤烟草，基本上阻止TSNA形成的方法，所述受控环境具有足够的气流以基本上阻止环绕烟叶附近的厌氧条件。受控环境通过控制一种或多种烘烤参数而提供，所述一种或多种烘烤参数例如气流、湿度和温度。然而，诸如此类的方法可增加相当大的烟草生产成本和时间，并且因此不太可能由烟草行业接受。因此，仍存在用于降低TSNA的有效和相对廉价方法的需要。
用于降低植物中的TSNA水平的基于分子的方法是高度期望的，因为它们不需要昂贵且通常复杂的方法来实现TSNA水平的降低。一种此类基于分子的方法公开于WO2011/088180中。在WO2011/088180中公开了用于抑制根部特有烟碱去甲基酶多肽(CYP82E10)的表达或功能的组合物和方法，所述根部特有烟碱去甲基酶多肽涉及烟草植物根部中烟碱向降烟碱的代谢转化。烟碱去甲基酶属于细胞色素P450单加氧酶(CYP)家族。其它烟碱去甲基酶基因已经描述包含参与烟碱向降烟碱转化的CYP82E4和CYP82E5，且描述于WO2006091194、WO2008070274和WO2009064771中。CYP82E4、CYP82E5和CYP82E10的基因敲除能够将白肋烟中烟碱向降烟碱的转化从3.2％减少到1.1％(参见WO 2011088180A1)。
本领域中存在进一步降低烟草植物中降烟碱的水平以进一步降低在烘烤期间形成的降烟碱的代谢物(例如，TSNA，例如NNN)水平的持续需求。本发明寻求解决这一需要。
发明内容
本发明者已确定属于烟草中的烟碱N-去甲基酶(NND)家族的另一基因，其在本文中被称为NND3。尽管NND3的多肽序列与CYP82E4的已知多肽序列呈现94％的序列同源性，且与CYP82E5和CYP82E10的已知多肽序列呈现91％的序列同源性，但令人惊讶的是，当与CYP82E4、CYP82E5和CYP82E10相比时，NND3在N.烟草中的表达谱是不同的。如图1所展示，当CYP82E4、CYP82E5、CYP82E10和NND3各自在花和根部中呈现表达时，NND3未以可侦测水平表达于叶子中，而CYP82E4只在衰老叶子中呈现表达，且CYP82E5和CYP82E10在所有经测试叶子类型中呈现表达。NND3的多核苷酸编码序列对功能性烟碱N-去甲基酶进行编码。所述基因示于SEQ ID NO：1中且所述多核苷酸编码序列示于SEQ ID NO：2中。所述多肽序列示于SEQ ID NO：3中。通过减少此基因在烟草植物中的表达，可观察到烟碱向降烟碱的转化减少。这可使得降烟碱水平和在烘烤期间形成的降烟碱的代谢物(例如NNN)水平降低。这可使得从经烘烤烟草材料吸入的NNN水平降低。因此，本发明适用于调节(例如，降低)降烟碱水平及/或植物中的TSNA(例如至少NNN)水平。确切地说，本发明在与能够降低降烟碱及/或TSNA(例如NNN)水平的其它方法组合时，可为尤其有用的。因此，举例来说，在某些实施方式中，可能需要减少NND3以及一种或多种其它烟碱去甲基酶基因在烟草植物中的表达。预期此组合进一步减少烟碱向降烟碱的转化，此将进一步降低在烘烤期间及当熏制经烘烤材料时在烟草中形成的代谢物水平。来源于本文所描述的烟草植物的烟草产品可应用于降低烟草产品的致癌可能性及减少人类暴露于致癌亚硝胺的方法中。设想在基因编码NND3中的一或多个突变，其中所述突变使得NND3的表达或功能减少。烟草植物可进一步包括编码CYP82E4烟碱去甲基酶的基因中的一或多个突变及/或编码CYP82E5烟碱去甲基酶的基因中的一或多个突变及/或编码CYP82E4烟碱去甲基酶的基因中的一或多个突变，其中这些基因内的所述突变使得CYP82E4及/或CYP82E5及/或CYP82E10烟碱去甲基酶的表达或功能减少。
本发明的方面和实施方式
本发明的方面和实施方式在所附权利要求中阐述。
在第一个方面中，描述一种突变的、非天然存在的或转基因的烟草植物细胞，其包括：(i)多核苷酸，其包括编码功能性烟碱N-去甲基酶的序列、由编码功能性烟碱N-去甲基酶的序列组成或基本上由编码功能性烟碱N-去甲基酶的序列组成，且与SEQ ID NO:3具有至少95％的序列同源性；(ii)通过阐述于(i)中的多核苷酸编码的多肽；(iii)多肽，其包括编码烟碱N-去甲基酶的序列、由编码烟碱N-去甲基酶的序列组成或基本上由编码烟碱N-去甲基酶的序列组成，且与SEQ ID NO:3具有至少95％的序列同源性；或(iv)构建体、载体或表达载体，其包括阐述于(i)中的分离的多核苷酸，且其中与所述烟碱去甲基酶的表达或活性未经降低的对照烟草植物细胞相比，所述烟碱去甲基酶的表达或活性得以降低。
在一个实施方式中，所述烟草植物细胞包括降低所述烟碱去甲基酶的表达或活性的一或多个突变。
在一个实施方式中，所述突变的、非天然存在的或转基因的烟草植物细胞进一步包括编码CYP82E4烟碱去甲基酶的基因中的一或多个突变，其中所述突变使得所述CYP82E4烟碱去甲基酶的表达或功能降低，优选地，其中所述CYP82E4烟碱去甲基酶选自由SEQ IDNO：12至SEQ ID NO：16或其两者或多于两者的组合组成的群组，优选地，其中所述突变引起对所述CYP82E4烟碱去甲基酶的修改且在选自由SEQ ID NO：5的氨基酸残基329、364、376、382及458或其两者或多于两者的组合组成的群组的位置处发生，优选地，其中所述突变选自由以下各者组成的群组：a)用终止密码子替换SEQ ID NO：5的位置329处的色氨酸残基；b)用天冬酰胺替换SEQ ID NO：5的位置364处的赖氨酸残基；c)用蛋氨酸替换SEQ ID NO：5的位置376处的缬氨酸残基；d)用丝氨酸替换SEQ ID NO：5的位置382处的脯氨酸残基；d)用丝氨酸替换SEQ ID NO：5的位置458处的脯氨酸残基；和e)其两者或多于两者的任何组合。
在一个实施方式中，所述突变的、非天然存在的或转基因的烟草植物细胞进一步包括编码CYP82E5烟碱去甲基酶的基因中的一或多个突变，其中所述突变使得所述CYP82E5烟碱去甲基酶的表达或功能降低，优选地，其中所述CYP82E5烟碱去甲基酶选自SEQ ID NO：24至SEQ ID NO：25或其组合，优选地，其中所述突变引起对所述CYP82E5烟碱去甲基酶的修改且在SEQ ID NO：17的氨基酸残基422或449或其组合处发生，优选地，其中所述突变选自由以下各者组成的群组：a)用终止密码子替换SEQ ID NO：17的位置422处的色氨酸残基；b)用亮氨酸替换SEQ ID NO：17的位置449处的脯氨酸残基；和c)其组合。
在一个实施方式中，所述突变的、非天然存在的或转基因的烟草植物细胞进一步包括编码CYP82E10烟碱去甲基酶的基因中的一或多个突变，其中所述突变使得所述CYP82E10烟碱去甲基酶的表达或功能降低，优选地，其中所述CYP82E10烟碱去甲基酶选自由SEQ ID NO：32至SEQ ID NO：35或其两者或多于两者的组合组成的群组，优选地，其中所述突变引起对所述CYP82E10烟碱去甲基酶的修改且在选自由SEQ ID NO：26的氨基酸残基79、107、382、419或其两者或多于两者的组合组成的群组的位置处发生，优选地，其中所述突变选自由以下各者组成的群组：a)用丝氨酸替换SEQ ID NO：26的位置79处的甘氨酸残基；b)用丝氨酸替换SEQ ID NO：26的位置107处的脯氨酸残基；c)用丝氨酸替换SEQ ID NO：26的位置382处的脯氨酸残基；d)用丝氨酸替换SEQ ID NO：26的位置419处的脯氨酸残基；和e)其任何组合。
在一个实施方式中，所述突变的、非天然存在的或转基因的烟草植物细胞进一步包括：(i)编码CYP82E4烟碱去甲基酶的基因中的一或多个突变，其中所述突变使得所述CYP82E4烟碱去甲基酶的表达或功能降低，优选地，其中所述CYP82E4烟碱去甲基酶选自由SEQ ID NO：12至SEQ ID NO：16或其两者或多于两者的组合组成的群组，优选地，其中所述突变引起对所述CYP82E4烟碱去甲基酶的修改且在选自由SEQ ID NO：5的氨基酸残基329、364、376、382和458或其两者或多于两者的组合组成的群组的位置处发生，优选地，其中所述突变选自由以下各者组成的群组：a)用终止密码子替换SEQ ID NO：5的位置329处的色氨酸残基；b)用天冬酰胺替换SEQ ID NO：5的位置364处的赖氨酸残基；c)用蛋氨酸替换SEQID NO：5的位置376处的缬氨酸残基；d)用丝氨酸替换SEQ ID NO：5的位置382处的脯氨酸残基；d)用丝氨酸替换SEQ ID NO：5的位置458处的脯氨酸残基；和e)其两者或多于两者的任一组合；及(ii)编码CYP82E5烟碱去甲基酶的基因中的一或多个突变，其中所述突变使得所述CYP82E5烟碱去甲基酶的表达或功能降低，优选地，其中所述CYP82E5烟碱去甲基酶选自SEQ ID NO：24至SEQ ID NO：25或其组合，优选地，其中所述突变引起对所述CYP82E5烟碱去甲基酶的修改且在SEQ ID NO：17的氨基酸残基422或449或其组合处发生，优选地，其中所述突变选自由以下各者组成的群组：a)用终止密码子替换SEQ ID NO：17的位置422处的色氨酸残基；b)用亮氨酸替换SEQ ID NO：17的位置449处的脯氨酸残基；17；和c)其组合；及(iii)编码CYP82E10烟碱去甲基酶的基因中的一或多个突变，其中所述突变使得所述CYP82E10烟碱去甲基酶的表达或功能降低，优选地，其中所述CYP82E10烟碱去甲基酶选自由SEQ ID NOs：组成的群组32至SEQ ID NO：35或其两者或多于两者的组合组成的群组，优选地，其中所述突变引起对所述CYP82E10烟碱去甲基酶的修改且在选自由SEQ ID NO：26的氨基酸残基79、107、382、419或其两者或多于两者的组合组成的群组的位置处发生，优选地，其中所述突变选自由以下各者组成的群组：a)用丝氨酸替换SEQ ID NO：26的位置79处的甘氨酸残基；b)用丝氨酸替换SEQ ID NO：26的位置107处的脯氨酸残基；c)用丝氨酸替换SEQ ID NO：26的位置382处的脯氨酸残基；d)用丝氨酸替换SEQ ID NO：26的位置419处的脯氨酸残基；和e)其任何组合。
在一个实施方式中，所述突变的、非天然存在的或转基因的烟草植物细胞进一步包括：(i)编码CYP82E4烟碱去甲基酶的基因中的一或多个突变、编码CYP82E5烟碱去甲基酶的基因中的一或多个突变和编码CYP82E10烟碱去甲基酶的基因中的一或多个突变，其中所述CYP82E4烟碱去甲基酶包括示于SEQ ID NO：13(W329Stop)中的序列，所述CYP82E5烟碱去甲基酶包括示于SEQ ID NO：24(W422Stop)中的序列，且所述CYP82E10烟碱去甲基酶包括示于SEQ ID NO：33(G79S)中的序列；或(ii)编码CYP82E4烟碱去甲基酶的基因中的一或多个突变、编码CYP82E5烟碱去甲基酶的基因中的一或多个突变和编码CYP82E10烟碱去甲基酶的基因中的一或多个突变，其中所述CYP82E4烟碱去甲基酶包括示于SEQ ID NO：13(W329Stop)中的序列，所述CYP82E5烟碱去甲基酶包括示于SEQ ID NO：24(W422Stop)中的序列，且所述CYP82E10烟碱去甲基酶包括示于SEQ ID NO：34(P107S)中的序列；或(iii)编码CYP82E4烟碱去甲基酶的基因中的一或多个突变、编码CYP82E5烟碱去甲基酶的基因中的一或多个突变和编码CYP82E10烟碱去甲基酶的基因中的一或多个突变，其中所述CYP82E4烟碱去甲基酶包括示于SEQ ID NO：13(W329Stop)中的序列，所述CYP82E5烟碱去甲基酶包括示于SEQ ID NO：24(W422Stop)中的序列，且所述CYP82E10烟碱去甲基酶包括示于SEQ IDNO：35(P382S)中的序列；或(iv)编码CYP82E4烟碱去甲基酶的基因中的一或多个突变、编码CYP82E5烟碱去甲基酶的基因中的一或多个突变和编码CYP82E10烟碱去甲基酶的基因中的一或多个突变，其中所述CYP82E4烟碱去甲基酶包括示于SEQ ID NO：13(W329Stop)中的序列，所述CYP82E5烟碱去甲基酶包括示于SEQ ID NO：24(W422Stop)中的序列，且所述CYP82E10烟碱去甲基酶包括示于SEQ ID NO：32(P419S)中的序列。
在一个实施方式中，所述突变为纯合突变。
在一个实施方式中，所述植物细胞或包括所述植物细胞的植物具有小于约1.0％、小于约0.9％、小于约0.8％、小于约0.7％、小于约0.6％、小于约0.5％、小于约0.4％、小于约0.3％、小于约0.2％或小于约0.1％的烟碱向降烟碱转化。使用等式[％降烟碱/(％降烟碱+％烟碱)]×100来计算％转化。
在一个实施方式中，所述植物细胞或包括所述植物细胞的植物具有小于约0.04％、小于约0.03％、小于约0.02％或小于约0.01％的降烟碱，以干重为基础计算。
在另一方面中，描述一种包括本文所描述植物细胞的突变型、非天然存在的或转基因植物。
在另一方面中，描述包含来自本文所描述植物的生物质、种子、茎或叶的植物物质。适当地，NND3表达于植物物质的花(例如，未成熟的花、成熟的花、未成熟蒴果、干燥蒴果)和根中。适当地，NND3唯一地或特异性地表达于植物物质的花(例如，未成熟的花、成熟的花、未成熟蒴果、干燥蒴果)和根中。
在另一方面中，描述一种包括本文所描述植物细胞、植物或植物物质的烟草产品。
在另一方面中，描述一种用于制备具有降低水平的降烟碱及/或NNN的烟草植物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供包括(i)多核苷酸的植物，所述多核苷酸包括编码(功能性)烟碱N-去甲基酶的序列、由编码(功能性)烟碱N-去甲基酶的序列组成或基本上由编码(功能性)烟碱N-去甲基酶的序列组成且与SEQ ID NO:2具有至少95％的序列同源性；(b)将一或多个突变插入所述烟草植物的所述多核苷酸中以产生突变型烟草植物；(c)任选地烘烤烟草植物物质；及(d)测量突变型烟草植物中降烟碱及/或NNN的水平，其中突变型烟草植物中降烟碱及/或NNN的水平相较于对照烟草植物的降低表示所述突变型烟草植物中的降烟碱及/或NNN水平已降低。同样设想使用本文所描述序列的片段。举例来说，片段可用作RNAi构建体以调节表达。
在一个实施方式中，步骤(b)中的烟草植物为突变型烟草植物，优选地，其中所述突变型烟草植物在一或多个其它烟碱N-去甲基酶基因中包括一或多个突变。
在一个实施方式中，所述突变型烟草植物在由CYP82E4、CYP82E5或CYP82E10或其两者或多于两者的组合的群组组成的基因中具有一或多个其它突变。
在一个实施方式中，步骤(b)中的烟草植物为突变型烟草植物，其与对照烟草植物相比具有降低水平的降烟碱。
在一个实施方式中，所述烟草植物在CYP82E4、CYP82E5或CYP82E10或其两者或多于两者的组合中具有一或多个其它突变。
在另一方面中，描述一种用于鉴定烟草植物中与低水平降烟碱及/或NNN相关的一或多个突变的方法，所述方法包括以下步骤：(a)鉴定与对照烟草植物相比具有较低水平降烟碱及/或NNN的烟草植物；(b)提供来自在步骤(a)中所鉴定的烟草植物的核酸样本；(c)针对不存在于对照植物中的SEQ ID NO：2序列中的一或多个突变的存在筛选来自步骤(b)的核酸样本；(d)任选地将步骤(c)中所鉴定的一或多个突变与降低烟草植物中降烟碱及/或NNN水平的已知突变进行比较；及(e)鉴定与低水平降烟碱及/或NNN相关的那些一或多个突变。
在另一方面中，描述一种用于制造其中具有降低水平的降烟碱及/或至少NNN的经烘烤植物物质(优选地经烘烤叶子)的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供本文所描述植物或植物物质的至少一部分；(b)任选地从其收获植物物质；及(c)将植物物质烘烤足以使其中的降烟碱及/或至少NNN水平降低的一段时间。
在另一方面中，描述一种烟草植物，其包括编码NND3烟碱去甲基酶的基因中的一或多个突变、编码CYP82E10烟碱去甲基酶的基因中的一或多个突变、编码CYP82E4烟碱去甲基酶的基因中的一或多个突变和编码CYP82E5烟碱去甲基酶的基因中的一或多个突变，任选地其中所述CYP82E10烟碱去甲基酶包括SEQ ID NO：SEQ ID NO:26的位置382处的突变，所述CYP82E4烟碱去甲基酶包括SEQ ID NO：5的位置329处的突变，且所述CYP82E5烟碱去甲基酶包括SEQ ID NO：17的位置422处的突变，优选地，其中所述突变中的每一者是纯合突变。
在另一方面中，描述一种烟草植物，其包括抑制花(例如，未成熟的花、成熟的花、未成熟蒴果、干燥蒴果)和根中烟碱去甲基酶活性的NND3基因中的一或多个突变、抑制根及/或叶中烟碱去甲基酶活性的CYP82E10基因中的一或多个突变、抑制衰老叶中烟碱去甲基酶活性的CYP82E4v2基因中的一或多个突变和抑制根及/或叶中烟碱去甲基酶活性的CYP83E5v2基因中的一或多个突变。
在另一方面中，描述一种分离的多核苷酸序列，其包括编码NND3烟碱N-去甲基酶的序列、由编码NND3烟碱N-去甲基酶的序列组成或基本上由编码NND3烟碱N-去甲基酶的序列组成且具有SEQ ID NO：2的序列，或与SEQ ID NO：2具有至少95％的序列同源性，优选地其中所述分离的多核苷酸是合成多核苷酸或cDNA。
在另一方面中，描述一种由本文所描述多核苷酸编码的分离的多肽。
在另一方面中，描述一种分离的多肽，其包括编码NND3烟碱N-去甲基酶的序列、由编码NND3烟碱N-去甲基酶的序列组成或基本上由编码NND3烟碱N-去甲基酶的序列组成且具有SEQ ID NO：3的序列，或与SEQ ID NO：3具有至少95％的序列同源性，优选地其中所述分离的多肽是合成多肽。同样设想如本文所描述的多肽片段。
在另一方面中，描述一种包括本文所描述的分离的多核苷酸的构建体、载体或表达载体。
在另一方面中，描述编码NND3烟碱去甲基酶的基因中的一种突变，其中所述突变使得所述NND3烟碱去甲基酶的表达或功能降低。
在另一方面中，描述一种用于降低烟草植物细胞中降烟碱水平、或烟碱向降烟碱转化的速率或至少NNN水平的方法，所述方法包括以下步骤：(a)降低以下各者的表达或活性：(i)多核苷酸，其包括编码烟碱N-去甲基酶的序列、由编码烟碱N-去甲基酶的序列组成或基本上由编码烟碱N-去甲基酶的序列组成且与SEQ ID NO:2具有至少95％的序列同源性；(ii)由阐述于(i)中的多核苷酸编码的多肽；(iii)多肽，其包括编码烟碱N-去甲基酶的序列、由编码烟碱N-去甲基酶的序列组成或基本上由编码烟碱N-去甲基酶的序列组成且与SEQ ID NO:3具有至少95％的序列同源性；(b)测量在步骤(a)中获得的植物细胞中的至少降烟碱及/或NNN含量；及(c)鉴定与其中阐述于(a)中的多核苷酸和多肽的表达或活性未经调节的对照植物相比，其中至少降烟碱及/或NNN含量已改变的植物细胞。
在另一方面中，提供一种用于降低烟草产品的致癌可能性的方法，所述方法包括由如本文描述的烟草植物或其后代制备所述烟草产品。
在另一方面中，提供一种用于降低烟草植物中降烟碱水平、或烟碱向降烟碱转化的速率或至少NNN水平的方法，所述方法包括将NND3烟碱去甲基酶基因的至少一个等位基因内的一或多个突变引入所述植物的基因组中，其中所述突变降低所述烟碱去甲基酶基因的表达。
在一个实施方式中，NND3表达于花(例如，未成熟的花、成熟的花、未成熟蒴果、干燥蒴果)和根中。
在一个实施方式中，NND3唯一地或特异性地表达于花(例如，未成熟的花、成熟的花、未成熟蒴果、干燥蒴果)和根中。
上文讨论的实施方式中的每一个作为本发明的方面中的每一个的实施方式公开。同样设想一或多个实施方式的组合。
附图说明
图1展示NND3和相关功能性CYP82E基因在不同植物组织中的相对表达水平。条状物表示从三种温室种植的成熟N.烟草var.TN90植物获得的三个生物学重复的平均值±SD。
图2展示在超低转换子TN90cyp82e4/cyp82e5/cyp82e10背景中，在强力组成型启动子下与NND3编码序列转换的个别成熟T0植物的叶片中测量的相对NND3表达(A)和烟碱向降烟碱转化水平(B)。
图3展示NND3和相关功能性CYP82E基因在N.烟草var.斯特拉(Stella)叶中在不同烘烤时间点处的相对表达水平。样本取自若干叶片的储备库。两个储备库作为生物学重复进行分析：(a)重复1和(b)重复2。条状物表示三个技术重复的平均值±SD。
定义
在本申请的范围内使用的技术术语和表达通常被赋予在植物和分子生物学的相关领域中经常应用于它们的含义。所有以下术语定义适用于本申请的整个内容。词语“包括”不排除其它元件或步骤，且不定冠词“一(a)”或“一(an)”不排除多个/多种。单个步骤可以完成在权利要求中列出的几个特征的功能。在给定数值或范围背景下，术语“约”、“基本上”和“大约”指在给定值或范围20％内，10％内或者5％、4％、3％、2％或1％内的值或范围。
术语“经分离的”指取自其天然环境的任何实体，但该术语不意味着任何纯化程度。
“表达载体”是包括使得核酸能够表达的核酸组分的组合的核酸媒介物。合适的表达载体包括能够染色体外复制的附加体，例如环状双链核酸质粒；线性化的双链核酸质粒；以及其他具有任何起源的功能等价表达载体。如下文定义的，表达载体包含置于核酸、核酸构建体或核酸缀合物上游，且与核酸、核酸构建体或核酸缀合物可操作地连接的至少启动子。
术语“构建体”指包含一种或多种多核苷酸的双链重组核酸片段。构建体包括与互补“有义链或编码链”碱基配对的“模板链”。给定构建体可在两个可能定向上插入载体内，所述两个可能定向是就置于载体(例如表达载体)内的启动子定向而言的相同(或有义)定向或相反(或反义)定向。
“载体”指核酸媒介物，其包含允许核酸、核酸构建体和核酸缀合物等等转运的核酸组分组合。合适的载体包括能够染色体外复制的附加体，例如环状双链核酸质粒；线性化的双链核酸质粒；以及其他具有任何起源的载体。
“启动子”指通常置于双链DNA片段上游，且与双链DNA片段可操作地连接的核酸元件/序列。启动子可完全源自接近天然目的基因的区域，或可由源自不同天然启动子的不同元件或合成DNA区段组成。
术语“同一性、同一性或相似性”指通过序列比对比较的两个多肽或两个核酸分子之间的序列相似性程度。被比较的两个不连续核酸序列之间的同一性程度是在可比较位置处的相同或匹配核苷酸数目的函数。同一性百分比可通过目视检查和数学计算进行确定。作为另外一种选择，可通过使用计算机程序(例如ClustalW、BLAST、FASTA或Smith-Waterman)比较序列信息，确定两个核酸序列的同一性百分比。
“变体”是指大体上相似的序列。变体可与野生型序列具有相似的功能或大体上相似的功能。对于烟碱去甲基酶，相似功能为在相同条件下将烟碱向降烟碱转化的野生型酶功能的至少约50％、60％、70％、80％或90％。对于烟碱去甲基酶，大体上相似的功能为在相同条件下将烟碱向降烟碱转化的野生型酶功能的至少约90％、95％、96％、97％、98％或99％。举例来说，野生型NND3编码序列示于SEQ ID NO:中 2中。所述变体可具有一或多个有利的突变，所述突变使得所述酶与野生型多肽相比具有降低水平的烟碱去甲基酶活性。所述变体可具有一或多个有利的突变，所述突变使得其烟碱去甲基酶活性被基因敲除(亦即，100％抑制且因此非功能性多肽)。野生型CYP82E10的示范性变体包含CYP82E10P419S，其具有使得酶仅具有野生型CYP82E10多肽的约25％的烟碱去甲基酶活性的有利突变。所述变体CYP82E10G79S、CYP82E10P107S和CYP82E10P382S具有使得其烟碱去甲基酶活性被基因敲除(亦即，100％抑制且因此非功能性多肽)的有利突变。野生型CYP82E4的示范性变体包含CYP82E4V376M，其具有使得酶仅具有野生型CYP82E4多肽的约50％的烟碱去甲基酶活性的有利突变。所述变体CYP82E4W329Stop、CYP82E4K364N、CYP82E4P382S和CYP82E4P458S具有使得其烟碱去甲基酶活性被基因敲除(亦即，100％抑制且因此非功能性多肽)的有利突变。野生型CYP82E5的示范性变体包含CYP82E5P449L，其具有使得其烟碱去甲基酶活性被抑制的有利突变，且变体CYP82E5W22Stop具有使得其烟碱去甲基酶活性被基因敲除(亦即，100％抑制且因此非功能性多肽)的有利突变。本文中公开这些变体的组合。
术语“植物”指处于其生命周期或发育的任何阶段的任何植物或植物的部分以及其后代。在一个实施方式中，植物是“烟草植物”，这指属于烟草属的植物。优选烟草植物种类在本文中描述。
“植物部分”包含植物细胞、植物原生质体、从其可再生完整植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物团块以及植物或植物的部分中完整的植物细胞，所述植物的部分例如胚、花粉、花药、胚珠、种子、叶、花、茎、枝、果实、根、根尖及其类似物。经再生植物的后代、变体和突变体也包含在本发明的范畴内，限制条件为其包括本文中所描述的经引入多核苷酸。
“植物细胞”指植物的结构和生理单位。植物细胞可采取不含细胞壁的原生质体、经分离的单细胞或培养细胞的形式，或作为更高等组构单位的一部分，例如但不限于植物组织、植物器官或全植物。
术语“植物材料”指可得自植物的任何固体、液体或气体组合物或其组合，包括生物质、叶、茎、根、花或花的部分、果实、花粉、卵细胞、合子、种子、插条、分泌物、提取物、细胞或组织培养物、或任何其他植物部分或产物。在一个实施方式中、植物材料包含生物质、茎、种子或叶，或者由生物质、茎、种子或叶组成。在另一个实施方式中，植物材料包含叶或由叶组成。
术语“品种”指共享恒定特征的植物群体，所述恒定特征使其与相同物种的其他植物分开。虽然具有一种或多种独特性状，但品种的特征还在于该品种内的个体之间的极少总体变化。品种通常在商业上出售。
如本文使用的术语“品系”或“育种品系”指示在植物育种期间使用的一群植物。品系可与品种区分，因为它展示对于一种或多种目的性状在个体间的很少变化，尽管对于其他性状在个体间可能存在一些变化。
术语“调节”可指降低、抑制、增加或以其他方式影响多肽的表达或活性。该术语还可指降低、抑制、增加或以其他方式影响编码多肽的基因的活性，所述影响活性可包括但不限于调节转录活性。
如本文使用的，术语“降低”或“降低的”指数量或活性约10％至约99％的降低，或者至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少100％或更多的降低，所述活性诸如(但不限于)多肽活性、转录活性和蛋白质表达。
如本文使用的，术语“抑制”或“抑制的”指数量或活性约98％至约100％的降低，或者至少98％、至少99％但特别是100％的降低，所述活性例如但不限于多肽活性、转录活性和蛋白质表达。
如本文使用的，术语“增加”或“增加的”指数量或活性约5％-约99％的增加，或者至少5％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少100％或更多的增加，所述活性例如但不限于多肽活性、转录活性和蛋白质表达。
在对照植物背景下的术语“对照”意指这样的植物或植物细胞，其中酶的表达或活性未进行修饰(例如，增加或降低的)，并且因此它可提供与其中酶的表达或活性已进行修饰的植物的比较。对照植物可包含空载体。对照植物或植物细胞可对应于野生型植物或野生型植物细胞。举例来说，对照植物或植物细胞可与用于产生标题植物的基因改变的起始材料属于同一基因型。在所有此等案例中，出于比较目的，使用相同的方案来培养和收获标题植物和对照植物。本文中所描述的基因或多肽的水平、比例、活性或分布的改变，或烟草植物表现型的改变，确切地说降烟碱和其致癌代谢物NNN的累积的降低，可通过比较标题植物与对照植物来测量，其中使用相同的方案来培养及/或收获标题植物和对照植物。对照植物可提供用于测量标题植物的表现型改变的参照点。对表现型的改变的测量可在任何时候在植物中测量，包含在植物发育、衰老期间或在烘烤后。对表现型的改变的测量可在在任何条件下生长的植物中测量，包含在生长室、温室或在野外生长的植物。表现型的改变可通过测定烟碱向降烟碱转化的速率来测量。可通过用降烟碱或其代谢物的百分比(作为总组织重量的百分比)除以烟碱百分比及降烟碱或其代谢物的百分比(作为总组织重量的百分比)的总和并且乘以100来测量转化。表现型的改变可通过使用本领域中已知的方法测量TSNA含量(例如至少NNN含量)来测量。
具体实施方式
在一个实施方式中，提供一种分离的多核苷酸，其包含以下成分、由以下成分组成或基本上由以下成分组成：与本文描述的序列中的任一者，包含序列表中所展示的多核苷酸中的任一者，具有至少95％序列同一性的多核苷酸序列。适当地，所述分离的多核苷酸包括以下成分、由以下成分组成或基本上由以下成分组成：与之具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。
在另一个实施方式中，提供一种分离的多核苷酸，其包括以下成分、由以下成分组成或基本上由以下成分组成：与SEQ ID NO:2具有至少95％序列同一性的多核苷酸序列。适当地，所述分离的多核苷酸包括以下成分、由以下成分组成或基本上由以下成分组成：与SEQ ID NO:2具有至少约95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％序列同一性的序列。
在另一个实施方式中，提供一种多核苷酸，其包括以下成分、由以下成分组成或基本上由以下成分组成：与SEQ ID NO:2具有基本同源性(即，序列相似性)或基本同一性的多核苷酸。
在另一个实施方式中，提供多核苷酸变体，所述多核苷酸变体与SEQ ID NO:2的序列具有至少约95％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性。
在另一个实施方式中，提供与其具有基本同源性(即，序列相似性)或基本同一性的SEQ ID NO:2的片段，所述片段与SEQ ID NO:2的对应片段具有至少约95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％序列同一性。
优选的是，所述片段在SEQ ID NO:1的至少15个连续核苷酸段上具有所规定的序列同一性。在实施方式中，序列同一性在至少20、25、30、35、40、45、50或更多连续核苷酸上延续。
在另一实施方式中，提供包括与编码充当烟碱N-去甲基酶的多肽的SEQ ID NO:2足够或相当程度的同一性或相似性的多核苷酸。适当地，本文所描述的多核苷酸编码具有烟碱N-去甲基酶活性的蛋白质，所述活性为阐述于SEQ ID NO:3中的蛋白质活性的至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％更多。为确定多肽是否为功能性烟碱去甲基酶，可将其cDNA克隆到表达载体中且将其转化为酵母菌株，例如菌株W(R)。菌株W(R)是经工程化以过度表达酵母NADPH依赖性P450还原酶的酵母细胞系，所述还原酶是充当到达P450的直接电子供体的酶；这个系统增强了对在酵母中表达的不异质P450酶活性的检测(Pompon等人，(1995)Methods Enzymol.272:51-64)。烟碱去甲基酶分析可通过用[14C]-烟碱培育酵母微粒体膜制备物，且通过如Siminszky等人所描述的薄层层析法解析产物而进行(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:14919-14924。
如本文描述的多核苷酸可包括核苷酸聚合物，其可以是未经修饰或经修饰的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。相应地，多核苷酸可以是(无限制地)基因组DNA、互补DNA(cDNA)、mRNA、或反义RNA或其一个或多个片段。此外，多核苷酸可以是单链或双链DNA，其为单链和双链区的混合物的DNA，包含DNA和RNA的杂交物分子，或具有单链和双链区的混合物的杂交物分子，或其一个或多个片段。另外，多核苷酸可由包含DNA、RNA或两者的三链区或者其一个或多个片段组成。多核苷酸可含有一个或多个经修饰的碱基，例如硫代磷酸酯，并且可以是肽核酸。一般地，多核苷酸可由经分离或克隆的cDNA片段、基因组DNA、寡核苷酸或个别核苷酸或前述的组合装配。尽管本文描述的多核苷酸序列显示为DNA序列，但序列包括其相应的RNA序列，及其互补(例如完全互补的)DNA或RNA序列，包括其反向互补体。
如本文描述的多核苷酸一般含有磷酸二酯键，尽管在一些情况下，包括多核苷酸类似物，其可具有替代主链，包含例如氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、或O-甲基亚磷酰胺(O-methylphophoroamidite)键；以及肽多核苷酸主链和键。其他类似多核苷酸包括具有阳性主链；非离子主链和非核糖主链的那些。磷酸核糖主链的修饰可出于多种原因而完成，例如以增加此类分子在生理环境中的稳定性和半衰期，或作为生物芯片上的探针。可制备天然存在的多核苷酸和类似物的混合物；作为另外一种选择，可制备不同多核苷酸类似物的混合物，以及天然存在的多核苷酸和类似物的混合物。
多种多核苷酸类似物是已知的，包括例如氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、O-甲基亚磷酰胺键以及肽多核苷酸主链和键。其他类似多核苷酸包括具有阳性主链；非离子主链和非核糖主链的那些。还包括含一种或多种碳环糖的多核苷酸。
其他类似物包括其为肽多核苷酸类似物的肽多核苷酸。这些主链在中性条件下是基本上非离子的，与天然存在的多核苷酸的高度荷电的磷酸二酯主链形成对比。这可导致优点。首先，肽多核苷酸主链可显示出改善的杂交动力学。对于错配碱基对相对于完全匹配的碱基对，肽多核苷酸在解链温度中具有更大变化。对于内部错配，DNA和RNA通常显示出在解链温度中的2-4℃下降。对于非离子肽多核苷酸主链，下降接近7-9℃。类似地，由于其非离子性质，附着至这些主链的碱基的杂交对盐浓度相对不敏感。另外，肽多核苷酸可不被细胞酶降解或被细胞酶降解至更少程度，并且因此可以是更稳定的。
在所公开的多核苷酸及其片段的用途中有片段作为核酸杂交测定中的探针或用于核酸扩增测定的引物的用途。此类片段一般含有DNA序列的至少约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个或更多个邻接核苷酸。在其它实施方式中，DNA片段包含DNA序列的至少约10、15、20、30、40、50或60个或更多个邻接核苷酸。因此，在一个方面中，还提供一种用于检测编码具有烟碱N-去甲基酶活性成员的蛋白质或编码烟碱N-去甲基酶酶类的多核苷酸的方法，所述方法包括使用探针或引物或两者。
影响杂交条件选择的基本参数和设计合适条件的指导由Sambrook,J.,E.F.Fritsch和T.Maniatis(1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.)使用遗传密码的知识与本文描述的氨基酸序列组合，可制备简并寡核苷酸组。此类寡核苷酸可用作例如聚合酶链反应(PCR)中的引物，由此分离且扩增DNA片段。在某些实施方式中，简并引物可用作遗传文库的探针。此类文库包括但不限于cDNA文库、基因组文库、以及甚至电子表达序列标签或DNA文库。通过这种方法鉴定的同源序列随后用作探针，以鉴定本文鉴定的序列的同源物。
另外的潜在用途是多核苷酸和寡核苷酸(例如引物或探针)，其在降低的严格条件下(通常为中等严格条件，且通常为高度严格条件下)与如本文描述的一种或多种多核苷酸杂交。影响杂交条件选择的基本参数和设计合适条件的指导由Sambrook,J.,E.F.Fritsch和T.Maniatis(1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.阐述，并且可基于例如多核苷酸的长度或碱基组成，由本领域普通技术人员容易地确定。一种实现中等严格条件的方法涉使用预洗涤溶液(所述预洗涤溶液含有5×标准柠檬酸钠、0.5％十二烷基硫酸钠、1.0mM乙二胺四乙酸(pH 8.0))，具有约50％甲酰胺、6×标准柠檬酸钠的杂交缓冲液，和约55℃的杂交温度(或其它相似的杂交溶液，例如含有约50％甲酰胺的杂交溶液，伴随约42℃的杂交温度)，以及在0.5×标准柠檬酸钠、0.1％十二烷基硫酸钠中，约60℃的洗涤条件。一般地，高度严格条件定义为如上的杂交条件，但使用在大约68℃下的洗涤、0.2x标准柠檬酸钠、0.1％十二烷基硫酸钠。SSPE(1×SSPE是0.15M氯化钠、10mM磷酸钠和1.25mM乙二胺四乙酸，pH 7.4)可替代杂交和洗涤缓冲液中的标准柠檬酸钠(1×标准柠檬酸钠是0.15M氯化钠和15mM柠檬酸钠)；洗涤在杂交完成后执行15分钟。应当理解通过应用控制杂交反应和双链体稳定性的基本原则，洗涤温度和洗涤盐浓度可根据需要进行调整，以实现所需严格性程度，如本领域技术人员已知的和下文进一步描述的(参见例如，Sambrook,J.,E.F.Fritsch和T.Maniatis(1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y)。当使多核苷酸与未知序列的靶多核苷酸杂交时，杂交物长度假定为杂交多核苷酸的那种。当杂交已知序列的多核苷酸时，可通过比对多核苷酸的序列且鉴定一个或多个最佳序列互补性区域，来确定杂交物长度。长度预期为小于50个碱基对的杂交物的杂交温度应比杂交物的解链温度低5-10℃，其中解链温度根据下述等式进行确定。对于长度小于18个碱基对的杂交物，解链温度(℃)＝2(A+T碱基数目)+4(G+C碱基数目)。对于长度在18个碱基对以上的杂交物，解链温度(℃)＝81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(％G+C)-(600/N)，其中N是杂交物中的碱基数目，并且[Na+]是杂交缓冲液中的钠离子浓度(1x标准柠檬酸钠的[Na+]＝0.165M)。通常，每种此类杂交多核苷酸具有它与之杂交的多核苷酸的长度的至少25％(通常至少50％、60％或70％，且最通常至少80％)长度，并且和它与之杂交的多核苷酸具有至少60％序列同一性(例如至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)。
如本领域技术人员应当理解的，线性DNA具有两个可能定向：例如，如果参考序列以5'-至-3'方向放置，并且如果第二序列以5'-至-3'方向置于相同多核苷酸分子/链中，则参考序列和第二序列以相同方向定向，或具有相同定向。通常，启动子序列和处于给定启动子调节下的目的基因以相同定向放置。然而，就以5'-至-3'方向放置的参考序列而言，如果第二序列以3'-至-5'方向置于相同多核苷酸分子/链中，则参考序列和第二序列以反义方向定向，或具有反义定向。如果参考序列(5'-至-3'方向)和参考序列的反向互补序列(以5'-至-3'放置的参考序列)置于相同多核苷酸分子/链中，则就彼此而言具有反义定向的两个序列可替代地可描述为具有相同定向。本文所示的序列以5'-至-3'方向显示。
本文提供的重组构建体可用于转化植物或植物细胞，以便调节蛋白质表达及/或活性水平。重组多核苷酸构建体可包括编码如本文描述的一种或多种多核苷酸的多核苷酸，所述一种或多种多核苷酸可操作地连接至适合表达多肽的调节区。因此，多核苷酸可包含编码如本文描述的多肽的编码序列。蛋白质表达及/或活性水平经调节的植物或植物细胞可包括突变型、非天然存在的、转基因的、人造的或经基因工程的植物或植物细胞。适当地，转基因植物或植物细胞包括已通过重组DNA的稳定整合而改变的基因组。重组DNA包括已在细胞外部遗传改造且构建的DNA，并且包括含有天然存在的DNA或cDNA或合成DNA的DNA。转基因植物可包括由最初转化的植物细胞再生的植物，以及来自经转化的植物的以后世代或杂交的后代转基因植物。适当地，与对照植物相比较，转基因修饰改变本文描述的多核苷酸或多肽的表达或活性。
由重组多核苷酸编码的多肽可以是天然多肽，或对于细胞可以是异源的。在一些情况下，重组构建体含有可操作地连接至调节区，调节表达的多核苷酸。合适调节区的例子在本文中描述。
本发明还提供了含有重组多核苷酸构建体的载体，例如本文描述的那些。合适的载体主链包括例如本领域常规使用的那些，例如质粒、病毒、人工染色体、细菌人工染色体、酵母人工染色体、或噬菌体人工染色体。合适的表达载体包括但不限于源自例如细菌噬菌体、杆状病毒和逆转录病毒的质粒和病毒载体。众多载体和表达系统是商购可得的。载体可包含(例如)复制起点、支架附着区或标记。标记基因可对植物细胞赋予可选择表型。例如，标记可赋予杀生物剂抗性，例如对抗生素(例如卡那霉素、G418、博来霉素或潮霉素)、或者除草剂(例如草甘膦、氯磺隆或草胺膦)的抗性。另外，表达载体可包括设计为促进所表达多肽的操纵或检测(例如纯化或定位)的标签序列。标签序列例如萤光素酶、β-葡糖醛酸酶、绿色荧光蛋白、谷胱甘肽S-转移酶、聚组氨酸、c-myc或血凝素序列，通常作为具有所编码多肽的融合物表达。此类标签可插入多肽内的任何地方，包括在羧基末端或氨基末端处。
植物或植物细胞可通过具有重组多核苷酸整合到其基因组进行转化，以变得稳定转化。本文描述的植物或植物细胞可以是稳定转化的。稳定转化的细胞通常伴随每次细胞分裂保留所引入的多核苷酸。植物或植物细胞可进行瞬时转化，使得重组多核苷酸不整合到其基因组内。瞬时转化的细胞通常伴随每次细胞分裂丧失所引入的重组多核苷酸的全部或一部分，使得在足够数目的细胞分裂后，所引入的重组多核苷酸无法在子细胞中检测到。适当地，NND3表达于植物的花(例如，未成熟的花、成熟的花、未成熟蒴果、干燥蒴果)和根中。适当地，NND3唯一地或特异性地表达于植物的花(例如，未成熟的花、成熟的花、未成熟蒴果、干燥蒴果)和根中。同样设想使用基因组编辑。
用于转化植物细胞的许多方法是本领域可获得的，所述方法全部在本文中涵盖，包括生物射弹、基因枪技术、土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化、病毒载体介导的转化和电穿孔。用于将外源DNA整合到植物染色体内的土壤杆菌属系统已就植物遗传改造进行广泛研究、修饰且探究。包含对应于主题纯化的烟草蛋白质的DNA序列的裸露重组DNA分子，通过常规方法连接至适当的T-DNA序列，所述DNA序列以有义或反义定向可操作地连接至调节序列。通过聚乙二醇技术或电穿孔技术，将这些引入烟草原生质体内，所述两种技术均为标准的。作为另外一种选择，将此类包含重组DNA分子的载体引入活土壤杆菌属细胞内，所述重组DNA分子编码主题纯化的烟草蛋白质，所述活土壤杆菌属细胞随后将DNA转移到烟草植物细胞内。通过裸露DNA而无伴随T-DNA载体序列的转化可经由烟草原生质体与含DNA脂质体的融合或经由电穿孔来完成。不伴随T-DNA载体序列的裸露DNA也可用于经由惰性、高速度微弹转化烟草细胞。
如果细胞或培养的组织用作转化的受体组织，则需要时，通过本领域技术人员已知的技术，可由经转化的培养物再生植物。
待包括在重组构建体中的调节区的选择取决于几个因素，包括但不限于效率、可选择性、可诱导性、所需表达水平、和细胞或组织优先表达。通过适当选择调节区且相对于编码序列放置调节区，调节编码序列的表达对于本领域技术人员是常规工作。多核苷酸的转录可以相似方式进行调节。一些合适的调节区仅或占优势地在某些细胞类型中起始转录。用于鉴定且表征植物基因组DNA中的调节区的方法是本领域已知的。
合适的启动子包括由组织特异性因子鉴定的组织特异性启动子，所述组织特异性启动子存在于不同组织或细胞类型中(例如根特异性启动子、枝条特异性启动子、木质部特异性启动子)，或存在于不同发育阶段期间，或响应不同环境条件存在。合适的启动子包括组成型启动子，其可在大多数细胞类型中活化，而无需特异性诱导剂。用于控制RNAi多肽生产的合适启动子的例子包括花椰菜花叶病毒35S(CaMV/35S)、SSU、OCS、lib4、usp、STLS1、B33、nos或遍在蛋白或菜豆球蛋白启动子。本领域技术人员能够生成多种变化的重组启动子。
组织特异性启动子是仅在植物发育期间的特异性时间，在特定细胞或组织中(例如在营养组织或生殖组织中)活跃的转录控制元件。例如，当多核苷酸在某些组织中的表达是优选的时，组织特异性表达可以是有利的。在发育控制下的组织特异性启动子的例子包括可仅(或主要仅)在某些组织中起始转录的启动子，所述某些组织例如营养组织，例如根或叶，或者生殖组织，例如果实、胚珠、种子、花粉、雌蕊(pistol)、花或任何胚组织。生殖组织特异性启动子可以是例如花药特异性、胚珠特异性、胚特异性、胚乳特异性、珠被特异性、种子和种皮特异性、花粉特异性、花瓣特异性、萼片特异性或其组合。
合适的叶特异性启动子包括来自C4植物(玉蜀黍)的丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)启动子、来自玉蜀黍的cab-m1Ca+2启动子、拟南芥(Arabidopsis thaliana)myb相关基因启动子(Atmyb5)、二磷酸核酮糖羧化酶(RBCS)启动子(例如，在叶和光生长幼苗中表达的番茄RBCS 1、RBCS2和RBCS3A基因，在发育中的番茄果实中表达的RBCS1和RBCS2，或几乎专一地以高水平在叶片和叶鞘的叶肉细胞中表达的二磷酸核酮糖羧化酶启动子)。
合适的衰老特异性启动子包含在果实催熟、叶枯萎和脱落期间活跃的番茄启动子、编码半胱氨酸蛋白酶的基因的玉蜀黍启动子、82E4的启动子和SAG基因的启动子。可使用合适的花药特异性启动子。可选择本领域技术人员已知的合适的根优先启动子。合适的种子优先的启动子包括种子特异性启动子(在种子发育期间活跃的那些启动子，例如种子贮藏蛋白质的启动子)和种子发芽启动子(在种子发芽期间活跃的那些启动子)。此类种子优先的启动子包括但不限于Cim1(细胞分裂素诱导的信息)；cZ19B1(玉蜀黍19kDa玉米醇溶蛋白)；milps(肌-肌醇-1-磷酸合酶)；mZE40-2，也称为Zm-40；nuclc；和celA(纤维素合酶)。γ-玉米醇溶蛋白是胚乳特异性启动子。Glob-1是胚特异性启动子。对于双子叶植物，种子特异性启动子包括但不限于豆β菜豆球蛋白、油菜籽蛋白、β-伴大豆球蛋白、大豆凝集素、十字花科蛋白(cruciferin)等等。β对于单子叶植物，种子特异性启动子包括但不限于玉蜀黍15kDa玉米醇溶蛋白启动子、22kDa玉米醇溶蛋白启动子、27kDa玉米醇溶蛋白启动子、g-玉米醇溶蛋白启动子、27kDaγ-玉米醇溶蛋白启动子(例如gzw64A启动子，参见Genbank登记号S78780)、蜡质启动子、shrunken 1启动子、shrunken 2启动子、球蛋白1启动子(参见Genbank登记号L22344)、Itp2启动子、cim1启动子、玉蜀黍end1和end2启动子、nuc1启动子、Zm40启动子、eep1和eep2；lec1、硫氧还蛋白H启动子；mlip15启动子、PCNA2启动子；和shrunken-2启动子。
诱导型启动子的例子包括响应病原体攻击、厌氧条件、温度升高、光、干旱、寒冷温度或高盐浓度的启动子。病原体诱导型启动子包括来自发病机制相关蛋白质(PR蛋白质)的那些，所述发病机制相关蛋白质在通过病原体感染后诱导(例如PR蛋白质、SAR蛋白质、β-1,3-葡聚糖酶、壳多糖酶)。
除植物启动子之外，其它合适的启动子可来源于细菌源(例如，章鱼碱合成酶启动子、胭脂碱合成酶启动子及来源于Ti质粒的其它启动子)，或可来源于病毒启动子(例如，花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S和19S RNA启动子、烟草花叶病毒的组成型启动子、花椰菜花叶病毒(CaMV)19S和35S启动子、或玄参花叶病毒35S启动子)。
在另一方面中，提供一种分离的多肽，其包括以下成分、由以下成分组成或基本上由以下成分组成：与本文描述的多肽序列中的任一者，包含序列表中所展示的多肽中的任一者，具有至少95％序列同一性的多肽序列。适当地，所述分离的多肽包括以下成分、由以下成分组成或基本上由以下成分组成：与其具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％序列同一性的序列。在一个实施方式中，提供一种由SEQ ID NO:编码的多肽3中。
在另一实施方式中，提供一种分离的多肽，其包括以下成分、由以下成分组成或基本上由以下成分组成：与SEQ ID NO:具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％序列同一性的序列。3中。
在另一实施方式中，提供一种多肽变体，其包括以下成分、由以下成分组成或基本上由以下成分组成：由与SEQ ID NO:具有至少约95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的多核苷酸变体编码的氨基酸序列。3中。
在另一实施方式中，提供SEQ ID NO:3的多肽片段或SEQ ID NO:3的片段，所述片段与SEQ ID NO:的对应片段具有至少约95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％的序列同一性。3中。
SEQ ID NO:3的片段(例如)为至少15个氨基酸的长度，其包括SEQ ID NO:3的15个连续氨基酸。此外，所述片段可为20个、25个、30个、35个、40个或更多个氨基酸的长度，至多全部517个氨基酸，且包括SEQ ID NO:3的对应数目个连续氨基酸。
优选的片段包含涵盖SEQ ID NO:3的氨基酸1至15、330至345、420至450及480至510的片段。
多肽可包含与SEQ ID NO:3具有足够程度或很大程度的同一性或相似性的序列以充当烟碱N-去甲基酶。多肽片段通常保持全长序列的一些或全部活性。
如本文所讨论，多肽还包括通过引入任何类型的改变(例如，氨基酸的插入、缺失或替换；糖基化状态的变化；影响重折叠或异构化、三维结构或自缔合状态的变化)而产生的突变体，所述突变体可以是有意改造或天然分离的，其限制条件是它们仍具有其作为烟碱N-去甲基酶的一些或全部功能或活性。适当地，调节、降低或抑制作为烟碱N-去甲基酶的功能或活性。适当地，抑制作为烟碱N-去甲基酶的功能或活性，使得不可检测烟碱N-去甲基酶活性。
本发明还公开了与之具有100％序列同一性，由SEQ ID NO:3编码的多肽，或者包括以下成分、由以下成分组成或基本上由以下成分组成的多肽：阐述于SEQ ID NO：3中、与之具有100％序列同一性的序列。
多肽包括通过引入任何类型改变(例如，氨基酸的插入、缺失或置换；糖基化状态的变化；影响重折叠或异构化、三维结构或自结合状态的变化)而产生的变体，所述变体可以是有意改造或天然分离的。变体可具有产生沉默变化且导致功能等价蛋白质的改变。有意的氨基酸置换可在残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和两亲性质中的相似性基础上作出，只要物质的二级结合活性被保留。例如，带负电的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；并且具有相似亲水性值含不带电极性首基的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。保守置换可例如根据下表进行。第二列中的相同块和优选第三列中的相同行中的氨基酸可彼此置换：
Figure BDA0001145126730000181
多肽可以是成熟蛋白质或不成熟蛋白质或源自不成熟蛋白质的蛋白质。多肽可采取线性形式或使用已知方法环化。多肽通常包含至少10、至少20、至少30或至少40个邻接氨基酸。
本发明公开了包括如本文所描述编码NND3的基因中的突变的烟草植物或植物细胞，其中所述突变使得所述NND3的表达减少或功能减弱。可抑制NND3突变体的表达或功能。NND3突变体的表达或功能可能是不可检测的。除了NND3中的一或多个突变外，所述突变型植物或植物细胞可在一或多个其它基因或多肽中具有一或多个其它突变。在某些实施方式中，除了NND3中的一或多个突变外，所述突变体可在一或多个其它基因或多肽(例如一或多个其它烟碱去甲基酶基因或多肽)中具有一或多个其它突变。适当地，NND3表达于突变型植物的花(例如，未成熟的花、成熟的花、未成熟蒴果、干燥蒴果)和根中。适当地，NND3唯一地或特异性地表达于突变型植物的花(例如，未成熟的花、成熟的花、未成熟蒴果、干燥蒴果)和根中。
适当地，NND3突变型烟草植物或植物细胞进一步包括编码CYP82E4烟碱去甲基酶的基因中的一个突变，其中所述突变使得所述CYP82E4烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱。适当地，所述CYP82E4烟碱去甲基酶选自示于SEQ ID NO：6至SEQ ID NO：16中的序列或其两者或多于两者的组合。适当地，所述突变引起对所述CYP82E4烟碱去甲基酶的修改，所述修改在选自由SEQ ID NO：5的氨基酸残基38、171、201、169、459、427、329、364、376、382和458或其两者或多于两者的组合组成的群组的一位置处发生。适当地，所述突变选自由以下各者组成的群组：a)用亮氨酸替换SEQ ID NO：5的位置38处的脯氨酸残基；b)用天冬酰胺替换SEQ ID NO：5的位置171处的天冬氨酸残基；c)用赖氨酸替换SEQ ID NO：5的位置201处的谷氨酸残基；d)用谷氨酰胺替换SEQ ID NO：5的位置169处的精氨酸残基；e)用精氨酸替换SEQ ID NO：5的位置459处的甘氨酸残基；f)用异亮氨酸替换SEQ ID NO：5的位置427处的苏氨酸残基；g)用蛋氨酸替换SEQ ID NO：5的位置376处的缬氨酸残基；h)用终止密码子替换SEQ ID NO：5的位置329处的色氨酸残基；i)用天冬酰胺替换SEQ ID NO：5的位置364处的赖氨酸残基；j)用丝氨酸替换SEQ ID NO：5的位置382处的脯氨酸残基；k)用丝氨酸替换SEQID NO：5的位置458处的脯氨酸残基；或l)其两者或多于两者的组合。
适当地，NND3突变型烟草植物或植物细胞进一步包括编码CYP82E5烟碱去甲基酶的基因中的一个突变，其中所述突变使得所述CYP82E5烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱。适当地，所述CYP82E5烟碱去甲基酶选自示于SEQ ID NO：18至SEQ ID NO：25中的序列或其两者或更多于两者的组合。适当地，所述突变引起对所述CYP82E5烟碱去甲基酶的修改，所述修改在选自由SEQ ID NO：17的氨基酸残基72、143、174、224、235、410、422或449组成的群组的一位置或其两者或多于两者的组合处发生。适当地，所述突变选自由以下各者组成的群组：a)用亮氨酸替换SEQ ID NO：17的位置72处的脯氨酸残基；b)用苯基丙氨酸替换SEQID NO：17的位置143处的亮氨酸残基；c)用亮氨酸替换SEQ ID NO：17的位置174处的丝氨酸残基；d)用异亮氨酸替换SEQ ID NO：17的位置224处的蛋氨酸残基；e)用丝氨酸替换SEQ IDNO：17的位置235处的脯氨酸残基；f)用异亮氨酸替换SEQ ID NO：17的位置427处的苏氨酸残基；g)用蛋氨酸替换SEQ ID NO：17的位置376处的缬氨酸残基；h)用终止密码子替换SEQID NO：17的位置329处的色氨酸残基；i)用缬氨酸替换SEQ ID NO：17的位置410处的丙氨酸残基；j)用终止密码子替换SEQ ID NO：17的位置422处的色氨酸残基；k)用亮氨酸替换SEQID NO：17的位置449处的脯氨酸残基；或l)其两者或多于两者的组合。
适当地，NND3突变型烟草植物或植物细胞进一步包括编码CYP82E10烟碱去甲基酶的基因中的一个突变，其中所述突变使得所述CYP82E10烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱。适当地，所述CYP82E4烟碱去甲基酶选自示于27至35或其两者或多于两者的组合。适当地，所述突变引起对所述CYP82E10烟碱去甲基酶的修改，所述修改在选自由SEQ ID NO：26的氨基酸残基148、172、344、410、417、419、79、107或382组成的群组的一位置或其两者或多于两者的组合处发生。适当地，所述突变选自由以下各者组成的群组：a)用苯丙氨酸替换SEQ ID NO：26的位置148处的亮氨酸残基；b)用精氨酸替换SEQ ID NO：26的位置172处的甘氨酸残基；c)用苏氨酸替换SEQ ID NO：26的位置344处的丙氨酸残基；d)用苏氨酸替换SEQID NO：26的位置410处的丙氨酸残基；e)用组氨酸替换SEQ ID NO：26的位置417处的精氨酸残基；f)用丝氨酸替换SEQ ID NO：26的位置419处的脯氨酸残基；g)用丝氨酸替换SEQ IDNO：26的位置79处的甘氨酸残基；h)用丝氨酸密码子替换SEQ ID NO：26的位置107处的脯氨酸残基；i)用丝氨酸替换SEQ ID NO：26的位置382处的脯氨酸残基；或j)其两者或多于两者的组合。
适当地，NND3突变型烟草植物或植物细胞进一步包括编码CYP82E4烟碱去甲基酶的基因中的一个突变，其中所述突变使得所述CYP82E4烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱。适当地，所述CYP82E4烟碱去甲基酶选自示于13至16或其两者或多于两者的组合。适当地，所述突变引起对所述CYP82E4烟碱去甲基酶的修改，所述修改在选自由SEQ ID NO：的氨基酸残基329、365、382或458组成的群组的一位置处发生。或其两者或多于两者的组合组成的群组的一位置处发生。适当地，所述突变选自由以下各者组成的群组：a)用终止密码子替换位置329处的色氨酸残基；b)用天冬酰胺替换位置364处的赖氨酸残基；c)用蛋氨酸替换位置376处的缬氨酸残基；d)用丝氨酸替换位置382处的脯氨酸残基；e)用丝氨酸替换位置458处的脯氨酸残基；及f)其任一组合。适当地，所述烟草植物或植物细胞进一步包括编码CYP82E4烟碱去甲基酶的基因中的一个突变，其中所述突变使得所述CYP82E4烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱。适当地，所述CYP82E4烟碱去甲基酶包括示于SEQ ID NO：13(W329Stop)中的序列。适当地，所述突变引起对所述CYP82E4烟碱去甲基酶的修改，所述修改在SEQ ID NO：5的氨基酸残基329处发生。适当地，所述突变为终止密码子替换位置329处的色氨酸残基。
适当地，NND3突变型烟草植物或植物细胞进一步包括编码CYP82E5烟碱去甲基酶的基因中的一个突变，其中所述突变使得所述CYP82E5烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱。适当地，所述CYP82E5烟碱去甲基酶包括示于SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25中的序列或其两者或多于两者的组合。适当地，所述突变引起对所述CYP82E5烟碱去甲基酶的修改，所述修改在选自由氨基酸残基422和449组成的群组的一位置处发生，其中所述编号是根据SEQ ID NO：12。适当地，所述突变选自由以下各者组成的群组：a)用终止密码子替换位置422处的色氨酸残基；b)用亮氨酸替换位置449处的脯氨酸残基；及c)其任一组合。
适当地，NND3突变型烟草植物或植物细胞进一步包括编码CYP82E5烟碱去甲基酶的基因中的一个突变，其中所述突变使得所述CYP82E5烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱。适当地，所述CYP82E5烟碱去甲基酶包括示于SEQ ID NO：24(W422Stop)中的序列。适当地，所述突变引起对所述CYP82E5烟碱去甲基酶的修改，所述修改在氨基酸残基422处发生，其中所述编号是根据SEQ ID NO：17。适当地，所述突变是用终止密码子替换位置422处的色氨酸残基。
适当地，NND3突变型烟草植物或植物细胞进一步包括编码CYP82E10烟碱去甲基酶的基因中的一个突变，其中所述突变使得所述CYP82E10烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱。适当地，所述CYP82E10烟碱去甲基酶选自由SEQ ID NO：32至SEQ ID NO：35组成的群组或其两者或多于两者的组合。适当地，所述突变引起对所述CYP82E10烟碱去甲基酶的修改，所述修改在选自由氨基酸残基79、107、382、419和其任一组合组成的群组的一位置处发生，其中所述编号是根据SEQ ID NO：26。适当地，所述突变选自由以下各者组成的群组：a)用丝氨酸替换位置79处的甘氨酸残基；b)用丝氨酸替换位置107处的脯氨酸残基；c)用丝氨酸替换位置382处的脯氨酸残基；d)用丝氨酸替换位置419处的脯氨酸残基；和e)其任一组合。
适当地，NND3突变型烟草植物或植物细胞进一步包括编码CYP82E10烟碱去甲基酶的基因中的一个突变，其中所述突变使得所述CYP82E10烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱。适当地，所述CYP82E10烟碱去甲基酶选自由32至34或其两者或多于两者的组合。适当地，所述突变引起对所述CYP82E10烟碱去甲基酶的修改，所述修改在选自由氨基酸残基79、107、382和其任一组合组成的群组的一位置处发生，其中所述编号是根据SEQ ID NO：26。适当地，所述突变选自由以下各者组成的群组：a)用丝氨酸替换位置79处的甘氨酸残基；b)用丝氨酸替换位置107处的脯氨酸残基；c)用丝氨酸替换位置382处的脯氨酸残基；和d)其任一组合。
适当地，所述NND3突变型烟草植物或植物细胞进一步包括CYP82E4烟碱去甲基酶基因和CYP82E5烟碱去甲基酶基因中的如上文所公开的一或多个突变。适当地，所述烟草植物或植物细胞进一步包括CYP82E4烟碱去甲基酶基因和CYP82E10烟碱去甲基酶基因中的如上文所公开的一或多个突变。适当地，所述烟草植物或植物细胞进一步包括CYP82E5烟碱去甲基酶基因和CYP82E10烟碱去甲基酶基因中的如上文所公开的一或多个突变。适当地，所述烟草植物或植物细胞进一步包括CYP82E4烟碱去甲基酶基因和CYP82E5烟碱去甲基酶基因以及CYP82E10烟碱去甲基酶基因中的如上文所公开的一或多个突变。
适当地，所述CYP82E4烟碱去甲基酶包括示于SEQ ID NO：13(W329Stop)中的序列，所述CYP82E5烟碱去甲基酶包括示于SEQ ID NO：24(W422Stop)中的序列，且所述CYP82E10烟碱去甲基酶包括示于SEQ ID NO：33(G79S)、
适当地，所述CYP82E4烟碱去甲基酶包括示于SEQ ID NO：13(W329Stop)中的序列，所述CYP82E5烟碱去甲基酶包括示于SEQ ID NO：24(W422Stop)中的序列，且所述CYP82E10烟碱去甲基酶包括示于SEQ ID NO：34(P107S)、
适当地，所述CYP82E4烟碱去甲基酶包括示于SEQ ID NO：13(W329Stop)中的序列，所述CYP82E5烟碱去甲基酶包括示于SEQ ID NO：24(W422Stop)中的序列，且所述CYP82E10烟碱去甲基酶包括示于SEQ ID NO：35(P382S)中的序列。
适当地，所述CYP82E4烟碱去甲基酶包括示于SEQ ID NO：13(W329Stop)中的序列，所述CYP82E5烟碱去甲基酶包括示于SEQ ID NO：24(W422Stop)中的序列，且所述CYP82E10烟碱去甲基酶包括示于SEQ ID NO：32(P419S)中的序列。
适当地，NND3突变型烟草植物或植物细胞进一步包括：编码CYP82E4烟碱去甲基酶的基因中的一个突变，其中所述突变使得所述CYP82E4烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱且在SEQ ID NO：25的氨基酸残基329处发生；且包括编码CYP82E5烟碱去甲基酶的基因中的一个突变，其中所述突变使得所述CYP82E5烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱且在SEQID NO：17的氨基酸残基422处发生；且包括编码CYP82E10烟碱去甲基酶的基因中的一个突变，其中所述突变使得所述CYP82E10烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱且在SEQ ID NO：26的氨基酸残基419处发生。
适当地，NND3突变型烟草植物或植物细胞进一步包括：编码CYP82E4烟碱去甲基酶的基因中的一个突变，其中所述突变使得所述CYP82E4烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱且在SEQ ID NO：25的氨基酸残基329处发生；且包括编码CYP82E5烟碱去甲基酶的基因中的一个突变，其中所述突变使得所述CYP82E5烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱且在SEQID NO：17的氨基酸残基422处发生；且包括编码CYP82E10烟碱去甲基酶的基因中的一个突变，其中所述突变使得所述CYP82E10烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱且在SEQ ID NO：26的氨基酸残基79处发生。
适当地，NND3突变型烟草植物或植物细胞进一步包括：编码CYP82E4烟碱去甲基酶的基因中的一个突变，其中所述突变使得所述CYP82E4烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱且在SEQ ID NO：25的氨基酸残基329处发生；且包括编码CYP82E5烟碱去甲基酶的基因中的一个突变，其中所述突变使得所述CYP82E5烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱且在SEQID NO：17的氨基酸残基422处发生；且包括编码CYP82E10烟碱去甲基酶的基因中的一个突变，其中所述突变使得所述CYP82E10烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱且在SEQ ID NO：26的氨基酸残基107处发生。
适当地，NND3突变型烟草植物或植物细胞进一步包括：编码CYP82E4烟碱去甲基酶的基因中的一个突变，其中所述突变使得所述CYP82E4烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱且在SEQ ID NO：25的氨基酸残基329处发生；且包括编码CYP82E5烟碱去甲基酶的基因中的一个突变，其中所述突变使得所述CYP82E5烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱且在SEQID NO：17的氨基酸残基422处发生；且包括编码CYP82E10烟碱去甲基酶的基因中的一个突变，其中所述突变使得所述CYP82E10烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱且在SEQ ID NO：26的氨基酸残基382处发生。
适当地，NND3突变型烟草植物或植物细胞进一步包括：编码CYP82E4烟碱去甲基酶的基因中的一个突变，其中所述突变使得所述CYP82E4烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱且为用终止密码子替换SEQ ID NO：5的位置329处的色氨酸残基；且包括编码CYP82E5烟碱去甲基酶的基因中的一个突变，其中所述突变使得所述CYP82E5烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱且为用终止密码子替换SEQ ID NO：17的位置422处的色氨酸残基；且包括编码CYP82E10烟碱去甲基酶的基因中的一个突变，其中所述突变使得所述CYP82E10烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱且为用丝氨酸替换SEQ ID NO：26的位置79处的甘氨酸残基。
适当地，NND3突变型烟草植物或植物细胞进一步包括：编码CYP82E4烟碱去甲基酶的基因中的一个突变，其中所述突变使得所述CYP82E4烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱且为用终止密码子替换SEQ ID NO：5的位置329处的色氨酸残基；且包括编码CYP82E5烟碱去甲基酶的基因中的一个突变，其中所述突变使得所述CYP82E5烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱且为用终止密码子替换SEQ ID NO：17的位置422处的色氨酸残基；17，且包括编码CYP82E10烟碱去甲基酶的基因中的一个突变，其中所述突变使得所述CYP82E10烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱且为用丝氨酸替换SEQ ID NO：26的位置107处的脯氨酸残基。
适当地，NND3突变型烟草植物或植物细胞进一步包括：编码CYP82E4烟碱去甲基酶的基因中的一个突变，其中所述突变使得所述CYP82E4烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱且为用终止密码子替换SEQ ID NO：5的位置329处的色氨酸残基；且包括编码CYP82E5烟碱去甲基酶的基因中的一个突变，其中所述突变使得所述CYP82E5烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱且为用终止密码子替换SEQ ID NO：17的位置422处的色氨酸残基；17，且包括编码CYP82E10烟碱去甲基酶的基因中的一个突变，其中所述突变使得所述CYP82E10烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱且为用丝氨酸替换SEQ ID NO：26的位置382处的脯氨酸残基。
适当地，NND3突变型烟草植物或植物细胞进一步包括：编码CYP82E4烟碱去甲基酶的基因中的一个纯合突变，其中所述突变使得所述CYP82E4烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱且在SEQ ID NO：25的氨基酸残基329处发生；且包括编码CYP82E5烟碱去甲基酶的基因中的一个纯合突变，其中所述突变使得所述CYP82E5烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱且在SEQ ID NO：17的氨基酸残基422处发生；且包括编码CYP82E10烟碱去甲基酶的基因中的一个纯合突变，其中所述突变使得所述CYP82E10烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱且在SEQ ID NO：26的氨基酸残基419处发生。
适当地，NND3突变型烟草植物或植物细胞进一步包括：编码CYP82E4烟碱去甲基酶的基因中的一个纯合突变，其中所述突变使得所述CYP82E4烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱且为用终止密码子替换SEQ ID NO：5的位置329处的色氨酸残基；且包括编码CYP82E5烟碱去甲基酶的基因中的一个纯合突变，其中所述突变使得所述CYP82E5烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱且为用终止密码子替换SEQ ID NO：17的位置422处的色氨酸残基；且包括编码CYP82E10烟碱去甲基酶的基因中的一个纯合突变，其中所述突变使得所述CYP82E10烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱且为用丝氨酸替换SEQ ID NO：26的位置382处的脯氨酸残基。
适当地，NND3突变型烟草植物或植物细胞进一步包括编码CYP82E4烟碱去甲基酶的基因中的一个突变，其中所述突变使得所述CYP82E4烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱。适当地，所述CYP82E4烟碱去甲基酶选自示于12至16或其两者或多于两者的组合。适当地，所述突变引起对所述CYP82E4烟碱去甲基酶的修改，所述修改在选自由SEQ ID NO：的氨基酸残基329、364、376、382和458组成的群组的一位置处发生。5的氨基酸残基329处发生。适当地，所述突变选自由以下各者组成的群组：a)用终止密码子替换位置329处的色氨酸残基；b)用天冬酰胺替换位置364处的赖氨酸残基；c)用蛋氨酸替换位置376处的缬氨酸残基；d)用丝氨酸替换位置382处的脯氨酸残基；e)用丝氨酸替换位置458处的脯氨酸残基；及f)其任一组合。适当地，NND3突变型烟草植物或植物细胞进一步包括编码CYP82E4烟碱去甲基酶的基因中的一个突变，其中所述突变使得所述CYP82E4烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱。适当地，所述CYP82E4烟碱去甲基酶包括示于SEQ ID NO：13(W329Stop)中的序列。适当地，所述突变引起对所述CYP82E4烟碱去甲基酶的修改，所述修改在SEQ ID NO：5的氨基酸残基329处发生。适当地，所述突变为终止密码子替换位置329处的色氨酸残基。
适当地，NND3突变型烟草植物或植物细胞进一步包括编码CYP82E5烟碱去甲基酶的基因中的一个突变，其中所述突变使得所述CYP82E5烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱。适当地，所述CYP82E5烟碱去甲基酶包括示于SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25中的序列或其两者或多于两者的组合。适当地，所述突变引起对所述CYP82E5烟碱去甲基酶的修改，所述修改在选自由氨基酸残基422和449组成的群组的一位置处发生，其中所述编号是根据SEQ ID NO：12。适当地，所述突变选自由以下各者组成的群组：a)用终止密码子替换位置422处的色氨酸残基；b)用亮氨酸替换位置449处的脯氨酸残基；及c)其任一组合。
适当地，NND3突变型烟草植物或植物细胞进一步包括编码CYP82E5烟碱去甲基酶的基因中的一个突变，其中所述突变使得所述CYP82E5烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱。适当地，所述CYP82E5烟碱去甲基酶包括示于SEQ ID NO：24(W422Stop)中的序列。适当地，所述突变引起对所述CYP82E5烟碱去甲基酶的修改，所述修改在氨基酸残基422处发生，其中所述编号是根据SEQ ID NO：17。适当地，所述突变是用终止密码子替换位置422处的色氨酸残基。
适当地，NND3突变型烟草植物或植物细胞包括编码CYP82E10烟碱去甲基酶的基因中的另一突变，其中所述突变使得所述CYP82E10烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱。适当地，所述CYP82E10烟碱去甲基酶选自由SEQ ID NO：32至SEQ ID NO：35组成的群组或其两者或多于两者的组合。适当地，所述突变引起对所述CYP82E10烟碱去甲基酶的修改，所述修改在选自由氨基酸残基79、107、382、419和其任一组合组成的群组的一位置处发生，其中所述编号是根据SEQ ID NO：26。适当地，所述突变选自由以下各者组成的群组：a)用丝氨酸替换位置79处的甘氨酸残基；b)用丝氨酸替换位置107处的脯氨酸残基；c)用丝氨酸替换位置382处的脯氨酸残基；d)用丝氨酸替换位置419处的脯氨酸残基；和e)其任一组合。
适当地，NND3突变型烟草植物或植物细胞包括编码CYP82E10烟碱去甲基酶的基因中的另一突变，其中所述突变使得所述CYP82E10烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱。适当地，所述CYP82E10烟碱去甲基酶选自由32至34或其两者或多于两者的组合。适当地，所述突变引起对所述CYP82E10烟碱去甲基酶的修改，所述修改在选自由氨基酸残基79、107、382和其任一组合组成的群组的一位置处发生，其中所述编号是根据SEQ ID NO：26。适当地，所述突变选自由以下各者组成的群组：a)用丝氨酸替换位置79处的甘氨酸残基；b)用丝氨酸替换位置107处的脯氨酸残基；c)用丝氨酸替换位置382处的脯氨酸残基；和d)其任一组合。
适当地，所述NND3突变型烟草植物或植物细胞进一步包括CYP82E4烟碱去甲基酶基因和CYP82E5烟碱去甲基酶基因中的如上文所公开的一或多个突变。适当地，所述烟草植物或植物细胞进一步包括CYP82E4烟碱去甲基酶基因和CYP82E10烟碱去甲基酶基因中的如上文所公开的一或多个突变。适当地，所述烟草植物或植物细胞进一步包括CYP82E5烟碱去甲基酶基因和CYP82E10烟碱去甲基酶基因中的如上文所公开的一或多个突变。适当地，所述烟草植物或植物细胞进一步包括CYP82E4烟碱去甲基酶基因和CYP82E5烟碱去甲基酶基因以及CYP82E10烟碱去甲基酶基因中的如上文所公开的一或多个突变。
适当地，所述CYP82E4烟碱去甲基酶包括示于SEQ ID NO：13(W329Stop)中的序列，所述CYP82E5烟碱去甲基酶包括示于SEQ ID NO：24(W422Stop)中的序列，且所述CYP82E10烟碱去甲基酶包括示于SEQ ID NO：33(G79S)、
适当地，所述CYP82E4烟碱去甲基酶包括示于SEQ ID NO：13(W329Stop)中的序列，所述CYP82E5烟碱去甲基酶包括示于SEQ ID NO：24(W422Stop)中的序列，且所述CYP82E10烟碱去甲基酶包括示于SEQ ID NO：34(P107S)、
适当地，所述CYP82E4烟碱去甲基酶包括示于SEQ ID NO：13(W329Stop)中的序列，所述CYP82E5烟碱去甲基酶包括示于SEQ ID NO：24(W422Stop)中的序列，且所述CYP82E10烟碱去甲基酶包括示于SEQ ID NO：35(P382S)中的序列。
适当地，所述CYP82E4烟碱去甲基酶包括示于SEQ ID NO：13(W329Stop)中的序列，所述CYP82E5烟碱去甲基酶包括示于SEQ ID NO：24(W422Stop)中的序列，且所述CYP82E10烟碱去甲基酶包括示于SEQ ID NO：32(P419S)中的序列。
适当地，NND3突变型烟草植物或植物细胞进一步包括：编码CYP82E4烟碱去甲基酶的基因中的一个突变，其中所述突变使得所述CYP82E4烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱且在SEQ ID NO：25的氨基酸残基329处发生；且包括编码CYP82E5烟碱去甲基酶的基因中的一个突变，其中所述突变使得所述CYP82E5烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱且在SEQID NO：17的氨基酸残基422处发生；且包括编码CYP82E10烟碱去甲基酶的基因中的一个突变，其中所述突变使得所述CYP82E10烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱且在SEQ ID NO：26的氨基酸残基419处发生。
适当地，NND3突变型烟草植物或植物细胞进一步包括：编码CYP82E4烟碱去甲基酶的基因中的一个突变，其中所述突变使得所述CYP82E4烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱且在SEQ ID NO：25的氨基酸残基329处发生；且包括编码CYP82E5烟碱去甲基酶的基因中的一个突变，其中所述突变使得所述CYP82E5烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱且在SEQID NO：17的氨基酸残基422处发生；且包括编码CYP82E10烟碱去甲基酶的基因中的一个突变，其中所述突变使得所述CYP82E10烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱且在SEQ ID NO：26的氨基酸残基79处发生。
适当地，NND3突变型烟草植物或植物细胞进一步包括：编码CYP82E4烟碱去甲基酶的基因中的一个突变，其中所述突变使得所述CYP82E4烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱且在SEQ ID NO：25的氨基酸残基329处发生；且包括编码CYP82E5烟碱去甲基酶的基因中的一个突变，其中所述突变使得所述CYP82E5烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱且在SEQID NO：17的氨基酸残基422处发生；且包括编码CYP82E10烟碱去甲基酶的基因中的一个突变，其中所述突变使得所述CYP82E10烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱且在SEQ ID NO：26的氨基酸残基107处发生。
适当地，NND3突变型烟草植物或植物细胞进一步包括：编码CYP82E4烟碱去甲基酶的基因中的一个突变，其中所述突变使得所述CYP82E4烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱且在SEQ ID NO：25的氨基酸残基329处发生；且包括编码CYP82E5烟碱去甲基酶的基因中的一个突变，其中所述突变使得所述CYP82E5烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱且在SEQID NO：17的氨基酸残基422处发生；且包括编码CYP82E10烟碱去甲基酶的基因中的一个突变，其中所述突变使得所述CYP82E10烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱且在SEQ ID NO：26的氨基酸残基382处发生。
适当地，NND3突变型烟草植物或植物细胞进一步包括：编码CYP82E4烟碱去甲基酶的基因中的一个突变，其中所述突变使得所述CYP82E4烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱且为用终止密码子替换SEQ ID NO：5的位置329处的色氨酸残基；且包括编码CYP82E5烟碱去甲基酶的基因中的一个突变，其中所述突变使得所述CYP82E5烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱且为用终止密码子替换SEQ ID NO：17的位置422处的色氨酸残基；且包括编码CYP82E10烟碱去甲基酶的基因中的一个突变，其中所述突变使得所述CYP82E10烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱且为用丝氨酸替换SEQ ID NO：26的位置79处的甘氨酸残基。
适当地，NND3突变型烟草植物或植物细胞进一步包括：编码CYP82E4烟碱去甲基酶的基因中的一个突变，其中所述突变使得所述CYP82E4烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱且为用终止密码子替换SEQ ID NO：5的位置329处的色氨酸残基；且包括编码CYP82E5烟碱去甲基酶的基因中的一个突变，其中所述突变使得所述CYP82E5烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱且为用终止密码子替换SEQ ID NO：17的位置422处的色氨酸残基；17，且包括编码CYP82E10烟碱去甲基酶的基因中的一个突变，其中所述突变使得所述CYP82E10烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱且为用丝氨酸替换SEQ ID NO：26的位置107处的脯氨酸残基。
适当地，NND3突变型烟草植物或植物细胞进一步包括：编码CYP82E4烟碱去甲基酶的基因中的一个突变，其中所述突变使得所述CYP82E4烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱且为用终止密码子替换SEQ ID NO：5的位置329处的色氨酸残基；且包括编码CYP82E5烟碱去甲基酶的基因中的一个突变，其中所述突变使得所述CYP82E5烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱且为用终止密码子替换SEQ ID NO：17的位置422处的色氨酸残基；17，且包括编码CYP82E10烟碱去甲基酶的基因中的一个突变，其中所述突变使得所述CYP82E10烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱且为用丝氨酸替换SEQ ID NO：26的位置382处的脯氨酸残基。
适当地，NND3突变型烟草植物或植物细胞进一步包括：编码CYP82E4烟碱去甲基酶的基因中的一个纯合突变，其中所述突变使得所述CYP82E4烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱且在SEQ ID NO：25的氨基酸残基329处发生；且包括编码CYP82E5烟碱去甲基酶的基因中的一个纯合突变，其中所述突变使得所述CYP82E5烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱且在SEQ ID NO：17的氨基酸残基422处发生；且包括编码CYP82E10烟碱去甲基酶的基因中的一个纯合突变，其中所述突变使得所述CYP82E10烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱且在SEQ ID NO：26的氨基酸残基419处发生。
适当地，NND3突变型烟草植物或植物细胞进一步包括：编码CYP82E4烟碱去甲基酶的基因中的一个纯合突变，其中所述突变使得所述CYP82E4烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱且为用终止密码子替换SEQ ID NO：5的位置329处的色氨酸残基；且包括编码CYP82E5烟碱去甲基酶的基因中的一个纯合突变，其中所述突变使得所述CYP82E5烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱且为用终止密码子替换SEQ ID NO：17的位置422处的色氨酸残基；且包括编码CYP82E10烟碱去甲基酶的基因中的一个纯合突变，其中所述突变使得所述CYP82E10烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱且为用丝氨酸替换SEQ ID NO：26的位置382处的脯氨酸残基。
适当地，根据本发明获得或可获得的植物、植物细胞、植物物质或(经烘烤)烟草产品及其类似物具有小于约1.0％、小于约0.9％、小于约0.8％、小于约0.7％、小于约0.6％、小于约0.5％、小于约0.4％、小于约0.3％、小于约0.2％或小于约0.1％的烟碱向降烟碱转化。使用等式[％降烟碱/(％降烟碱+％烟碱)]×100来计算％转化。
适当地，根据本发明获得或可获得的植物、植物细胞、植物物质或(经烘烤)烟草产品及其类似物具有小于约0.04％、小于约0.03％、小于约0.02％或小于约0.01％的降烟碱，以干重为基础计算。
所述NND3突变型烟草植物或植物细胞的突变可以是杂合的或纯合的。所述NND3突变型烟草植物或植物细胞的至少一个突变可以是杂合的，且至少一个不同突变是纯合的。
本发明还提供了一种用于降低(经烘烤)烟草植物或(经烘烤)烟草植物物质中降烟碱水平、或烟碱向降烟碱转化的速率或至少NNN水平的方法，所述方法包括将减少至少一种烟碱去甲基酶基因的表达的一或多个突变引入所述植物的基因组中，其中所述至少一种烟碱去甲基酶基因编码NND3。适当地，除NND3中的突变之外，还可将一或多个突变引入至少一个、两个或三个或更多个其它烟碱去甲基酶基因中的至少一个等位基因中，其中所述基因选自由以CYP82E4、CYP82E5和CYP82E10组成的群组或其两者或多于两者的组合，如上文所论述。
本发明还提供了一种用于鉴定具有低水平的降烟碱或低水平的至少NNN的烟草植物，所述方法包括针对SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中一或多个突变的存在筛选来自所关注烟草植物的核酸样本，且任选地使所鉴定突变与已知用以调节降烟碱或至少NNN水平的突变相互关联。适当地，所述方法进一步包括针对SEQ ID NO：5中一个突变的存在、SEQ IDNO：12中一个突变的存在或SEQ ID NO：19中一个突变的存在筛选来自所关注的所述烟草植物的所述核酸样本或另一核酸样本，且任选地使所鉴定突变与已知用以调节降烟碱或至少NNN水平的突变相互关联。
本发明还公开了一种烟草植物或植物细胞，其编码NND3的基因、编码CYP82E10烟碱去甲基酶的基因、编码CYP82E4烟碱去甲基酶的基因和编码CYP82E5烟碱去甲基酶的基因中的突变为杂合或纯合的，其中所述突变使得NND3、CYP82E10、CYP82E4和CYP82E5烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱。
本发明还描述了烟草植物或植物细胞，其包括NND3基因或多肽中的一或多个杂合或纯合突变，组成NND3基因或多肽中的一或多个杂合或纯合突变或基本上由NND3基因或多肽中的一或多个杂合或纯合突变组成，如本文所描述，其降低花(例如，未成熟的花，成熟的花、未成熟的蒴果，干燥蒴果)和根中的烟碱去甲基酶活性，包括CYP82E10基因或多肽中的一或多个杂合或纯合突变，组成CYP82E10基因或多肽中的一或多个杂合或纯合突变或基本上由CYP82E10基因或多肽中的一或多个杂合或纯合突变组成，其降低根中的烟碱去甲基酶活性，包括CYP82E4基因或多肽中的一或多个杂合或纯合突变，组成CYP82E4基因或多肽中的一或多个杂合或纯合突变基本上由CYP82E4基因或多肽中的一或多个杂合或纯合突变组成，其降低衰老叶片中的烟碱去甲基酶活性，及包括CYP83E5基因或多肽中的一或多个杂合或纯合突变，组成CYP83E5基因或多肽中的一或多个杂合或纯合突变或基本上由CYP83E5基因或多肽中的一或多个杂合或纯合突变组成，其降低绿叶中的烟碱去甲基酶活性。
大量方法可用于组合一种植物中的突变，包含有性杂交。具有降低烟碱去甲基酶的NND3中的一或多个有利杂合或纯合突变的植物可与具有烟碱去甲基酶活性的CYP82E4、CYP82E5、CYP82E10中之一或多者中的一或多个有利杂合或纯合突变的植物杂交。在一个实施方式中，杂交是为了引入相同植物内的NND3和CYP82E10或NND3和CYP82E4或NND3和CYP82E5内的一或多个有利杂合或纯合突变。以这种方式，具有降低花(例如，未成熟的花，成熟的花、未成熟的蒴果，干燥蒴果)和根中的烟碱去甲基酶活性的NND3中的一或多个有利杂合或纯合突变的植物与具有降低根中的烟碱去甲基酶活性的CYP82E10中的一或多个有利杂合或纯合突变的植物杂交，或与具有降低衰老叶片中的烟碱去甲基酶活性的CYP82E4中的一或多个有利杂合或纯合突变的植物杂交，或与具有降低绿叶中的烟碱去甲基酶活性的CYP83E5中的一或多个有利杂合或纯合突变的植物杂交。在另一实施方式中，杂交是为了引入相同植物内的NND3、CYP82E10和CYP82E4内的一或多个有利杂合或纯合突变。以这种方式，具有降低花(例如，未成熟的花，成熟的花、未成熟的蒴果，干燥蒴果)和根中的烟碱去甲基酶活性的NND3中的一或多个有利杂合或纯合突变的植物与具有降低根中的烟碱去甲基酶活性的CYP82E10中的一或多个有利杂合或纯合突变的植物杂交，或与具有降低衰老叶片中的烟碱去甲基酶活性的CYP82E4中的一或多个有利杂合或纯合突变的植物杂交，或与具有降低绿叶中的烟碱去甲基酶活性的CYP83E5中的一或多个有利杂合或纯合突变的植物杂交。在一个实施方式中，杂交是为了引入相同植物内的NND3、CYP82E10和CYP82E5内的一或多个有利杂合或纯合突变。以这种方式，具有降低花(例如，未成熟的花，成熟的花、未成熟的蒴果，干燥蒴果)和根中的烟碱去甲基酶活性的NND3中的一或多个有利杂合或纯合突变的植物与具有降低根中的烟碱去甲基酶活性的CYP82E10中的一或多个有利杂合或纯合突变的植物杂交，和与具有降低绿叶中的烟碱去甲基酶活性的CYP83E5中的一或多个有利杂合或纯合突变的植物杂交。在另一实施方式中，杂交是为了引入相同植物内的NND3、CYP82E4和CYP82E5内的一或多个有利杂合或纯合突变。以这种方式，具有降低花(例如，未成熟的花，成熟的花、未成熟的蒴果，干燥蒴果)和根中的烟碱去甲基酶活性的NND3中的一或多个有利杂合或纯合突变的植物与具有降低衰老叶片中的烟碱去甲基酶活性的CYP82E4中的一或多个有利杂合或纯合突变的植物杂交，和与具有降低绿叶中的烟碱去甲基酶活性的CYP83E5中的一或多个有利杂合或纯合突变的植物杂交。在另一实施方式中，杂交是为了引入相同植物内的NND3、CYP82E4、CYP82E5和CYP82E10内的一或多个有利杂合或纯合突变。以这种方式，具有降低花(例如，未成熟的花，成熟的花、未成熟的蒴果，干燥蒴果)和根中的烟碱去甲基酶活性的NND3中的一或多个有利杂合或纯合突变的植物与具有降低根中的烟碱去甲基酶活性的CYP82E10中的一或多个有利杂合或纯合突变、降低衰老叶片中的烟碱去甲基酶活性的CYP82E4中的一或多个有利杂合或纯合突变和降低绿叶中的烟碱去甲基酶活性的CYP83E5中的一或多个有利杂合或纯合突变的植物杂交。通过将一或多个有力突变引入至烟碱去甲基酶基因(诸如本文所描述的有利突变)中，有可能产生具有降低的或可忽略的或不可检测的烟碱向降烟碱转化或其代谢物的植物或降低的或可忽略的或不可检测的NNN的植物。
如果转化活性在统计学上低于未经修饰以抑制烟碱去甲基酶多肽的转化活性且使用相同方案培养及收获的烟草植物中的相同烟碱去甲基酶多肽的转化活性，那么本发明降低或抑制烟草植物中的烟碱向降烟碱转化或其代谢物中的一或多个烟碱去甲基酶多肽的活性。当不能通过本文所描述的分析方法检测活性时，考虑消除烟草植物中的烟碱向降烟碱转化中的烟碱去甲基酶多肽中的活性。本文描述确定烟草植物中的烟碱向降烟碱转化中的烟碱去甲基酶多肽中的活性的方法。
在一些实施方式中，使用诱变法将有利突变引入烟草植物或植物细胞中，且使用所属领域的技术人员已知鉴定的方法(诸如Southern印迹分析法、DNA排序、PCR分析法或表型分析法)鉴定或选择所引入的突变。可使用所属领域的技术人员已知的方法来确定影响基因表达或干扰所编码的蛋白质的功能的突变。基因外显子中的插入突变通常导致空突变。经转化残基中的突变可在抑制所编码的蛋白质的代谢功能中特别有效。
还公开了用于获得突变型多核苷酸和多肽的方法。任何目的植物包括植物细胞或植物材料，可通过多种已知诱导诱变的方法进行遗传修饰，所述方法包括定点诱变、寡核苷酸指导的诱变、化学诱导的诱变、辐射诱导的诱变、利用经修饰的碱基的诱变、利用缺口双链体DNA的诱变、双链断裂诱变、利用修复缺陷型宿主株的诱变、通过全基因合成的诱变、DNA改组及其他等价方法。
还公开了由此编码的NND3多核苷酸或多肽的片段。多核苷酸的片段可编码保留天然蛋白的生物活性的蛋白质片段且因此涉及烟碱向降烟碱的代谢转化。或者，适用作杂交探针或PCR引物的多核苷酸的片段通常不编码保留生物活性的片段蛋白质。此外，所公开的核苷酸序列的片段包含可在本文所描述的重组构建体内组装的那些。多核苷酸序列的片段的范围可介于至少约25核苷酸、约50核苷酸、约75核苷酸、约100核苷酸、约150核苷酸、约200核苷酸、约250核苷酸、约300核苷酸、约400核苷酸、约500核苷酸、约600核苷酸、约700核苷酸、约800核苷酸、约900核苷酸、约1000核苷酸、约1100核苷酸、约1200核苷酸、约1300核苷酸或约1400核苷酸且至多达到本文所描述的编码多肽的全长多核苷酸。多肽序列的片段的范围可介于至少约25个氨基酸、约50个氨基酸、约75个氨基酸、约100个氨基酸、约150个氨基酸、约200个氨基酸、约250个氨基酸、约300个氨基酸、约400个氨基酸、约500个氨基酸，且至多达到本文所描述的全长多肽。
突变型多肽变体可用于制备包括一种或多种突变型多肽变体的突变型、非天然存在的或转基因植物(例如，突变型、非天然存在的、转基因、人造或遗传改造的植物)。适当地，突变型多肽变体保留未突变多肽的活性。与未突变的多肽相比较，突变型多肽变体的活性可更高、更低或大约相同。
本文描述的核苷酸序列和多肽中的突变可包括人造突变或合成突变或遗传改造的突变。本文描述的核苷酸序列和多肽中的突变可以是经由过程获得或可获得的突变，所述过程包括体外或体内操作步骤。本文描述的核苷酸序列和多肽中的突变可以是经由包括人为干预的过程获得或可获得的突变。作为实例，所述过程可包含使用外源添加的化学品的突变形成，诸如致突变、致畸形或致癌有机化合物，例如甲磺酸乙酯(EMS)，所述化学品在遗传物质中产生随机突变。作为进一步例子，该过程可包括一个或多个遗传改造步骤-例如本文描述的遗传改造步骤中的一个或多个或其组合。作为进一步例子，该过程可包括一个或多个植物杂交步骤。
多肽可通过在适合表达多肽的培养条件下培养经转化的或重组宿主细胞进行制备。所得到的表达多肽随后可使用已知的纯化过程由此类培养物进行纯化。多肽的纯化可包括含有与多肽结合的试剂的亲和柱；一个或多个在此类亲和树脂上的柱步骤；一个或多个涉及疏水作用层析的步骤；或免疫亲和层析。作为另外一种选择，多肽还可以促进纯化的形式表达。举例来说，它可经表达为融合多肽，例如麦芽糖结合多肽、谷胱甘肽-5-转移酶、组氨酸标签或硫氧还蛋白的那些。用于融合多肽的表达和纯化的试剂盒是商购可得的。多肽可用表位加上标签，并且随后通过使用针对此类表位的特异性抗体纯化。一个或多个液相层析步骤-例如反相高效液相层析可用于进一步纯化多肽。以多个组合的前述纯化步骤中的一些或全部可用于提供基本上同质的重组多肽。因此纯化的多肽可基本上不含其他多肽，并且在本文中定义为“基本上纯化的多肽”；此类纯化的多肽包括多肽、片段、变体等等。多肽和片段的表达、分离和纯化可通过任何合适技术实现，所述合适技术包括但不限于本文描述的方法。
还能够利用亲和柱例如针对多肽生成的单克隆抗体，以亲和纯化所表达的多肽。这些多肽可使用常规技术，例如在高盐洗脱缓冲液中，从亲和柱中取出，且随后透析到更低盐的缓冲液内用于使用，或取决于利用的亲和基质，通过改变pH或其他组分，或使用天然存在的亲和部分的底物竞争性取出。
本发明公开了分离的或基本上纯化的多核苷酸或蛋白质组合物。“分离的”或“纯化的”多核苷酸或蛋白质或其生物学上的活性部分大体上或基本上不含通常伴随多核苷酸或蛋白质或者与其相互作用(如在其自然存在的环境中发现的那样)的组分。因此，分离的或纯化的多核苷酸或蛋白质在通过重组技术产生时，其大体上不含其它细胞物质或培养介质，或当以化学方式合成时，其大体上不含化学前体或其它化学品。任选地，“分离的”多核苷酸不含天然地侧接于所述多核苷酸的来源生物体的基因组DNA中的多核苷酸的序列(最佳地，蛋白质编码序列)(例如，位于多核苷酸的5'和3'末端的序列)。举例来说，在各种实施方式中，分离的多核苷酸可含有少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，所述核苷酸序列天然地侧接于所述多核苷酸的来源细胞的基因组DNA中的多核苷酸。大体上不含细胞物质的蛋白质包含具有小于约30％、20％、10％、5％或1％(以干重计)受污染蛋白质的蛋白质制备物。
多肽还可通过已知的常规化学合成来产生。通过合成方法用于构建多肽或其片段的方法是本领域技术人员已知的。由于与天然多肽共享一级、二级或三级结构或构象特征，合成构建的多肽序列可具有与之共同的生物特性，包括生物活性。
如本文使用的，术语‘非天然存在的’描述并非天然形成或在自然界中不存在的实体(例如多核苷酸、基因突变、多肽、植物、植物细胞和植物材料)。可通过本文描述或本领域已知的方法，制备、合成、起始、修饰、干预或操纵此类非天然存在的实体或人工实体。可由人制备、合成、起始、修饰、干预或操纵此类非天然存在的实体或人工实体。因此，例如，非天然存在的植物、非天然存在的植物细胞或非天然存在的植物材料，可使用传统植物育种技术(例如回交)或通过遗传操纵技术(例如反义RNA、干扰RNA、大范围核酸酶等等)进行制备。作为进一步例子，可通过第一植物或植物细胞基因渗入第二植物或植物细胞(其自身可为天然存在的)内，或通过将一个或多个遗传突变(例如一种或多种多态性)从第一植物或植物细胞转移到第二植物或植物细胞内，来制备非天然存在的植物、非天然存在的植物细胞或非天然存在的植物材料，使得所得到的植物、植物细胞或植物材料或其后代包含并非天然形成或在自然界中不存在的遗传组成(例如基因组、染色体或其区段)。所得到的植物、植物细胞或植物材料因此是人工的或非天然存在的。相应地，可通过修饰第一天然存在的植物或植物细胞中的遗传序列，来制备人工的或非天然存在的植物或植物细胞，即使所得到的遗传序列在第二植物或植物细胞中天然存在，所述第二植物或植物细胞包含与第一植物或植物细胞不同的遗传背景。在某些实施方式中，突变是非天然存在的突变，其天然存在于核苷酸序列或多肽(例如基因或蛋白质)中。
遗传背景中的差异可通过表型差异或本领域已知的分子生物学技术进行检测，所述分子生物学技术例如核酸测序、遗传标记(例如微卫星RNA标记)的存在或不存在。
本发明还提供了与本文描述的多肽免疫反应的抗体。如本文描述的，多肽、片段、变体、融合多肽等等可用作生产与之免疫反应的抗体中的“免疫原”。此类抗体可经由抗体的抗原结合位点与多肽特异性结合。特异性结合抗体是特异性鉴定且结合多肽、同源物和变体，而不是其他分子的那些。在一个实施方式中，抗体对于具有与如本文所示的氨基酸序列的多肽是特异性的，并且不与其它多肽交叉反应。
更具体而言，多肽、片段、变体、融合多肽等等含有引发抗体形成的抗原决定簇或表位。这些抗原决定簇或表位可以是线性的或构象的(不连续的)。线性表位由多肽的单个氨基酸区段组成，而构象或不连续表位由来自多肽链的不同区域的氨基酸区段组成，所述氨基酸区段在多肽折叠后达到紧密接近。表位可通过本领域已知的方法中的任一种进行鉴定。另外，来自多肽的表位可用作测定中的研究试剂，且纯化来自物质例如多克隆血清或来自培养杂交瘤的上清液的特异性结合抗体。此类表位或其变体可使用本领域已知的技术或使用重组DNA技术产生，所述本领域已知的技术例如固相合成、多肽的化学或酶促切割。
针对多肽的多克隆抗体和单克隆抗体两者均可通过常规技术进行制备。本文还考虑了产生对于多肽特异性的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。此类杂交瘤可通过常规技术进行生产且鉴定。对于抗体生产，多种宿主动物可通过用多肽、其片段、变体或突变体注射进行免疫接种。仅举几个例子，此类宿主动物可包括但不限于兔、小鼠和大鼠。多种佐剂可用于增加免疫应答。取决于宿主物种，此类佐剂包括但不限于弗氏(完全和不完全)、矿物凝胶如氢氧化铝，表面活性物质如溶血卵磷脂、普鲁兰尼克多元醇、聚阴离子、肽、油乳剂、钥孔血蓝蛋白、二硝基苯酚，以及潜在有用的人佐剂如BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)。单克隆抗体可通过常规技术进行回收。此类单克隆抗体可具有任何免疫球蛋白类别，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD，及其任何亚类。
抗体还可用于测定中，以在体外或体内检测多肽或片段的存在。抗体还可用于通过免疫亲和层析纯化多肽或片段。
除了突变形成以外，可调节选自由NND3、CYP82E4、CYP82E5或CYP82E10组成的群组或其两者、三者或四者的组合(例如，NND3、CYP82E4、CYP82E5和CYP82E10的组合)的多核苷酸或多肽中的一或多者的表达或活性的组合物包含(但不限于)：可干扰一或多种内源基因的转录的序列特异性多核苷酸；可干扰RNA转录体(例如双链RNA、siRNA、核酶)翻译的序列特异性多核苷酸；可干扰一或多种蛋白质的稳定性的序列特异性多肽；可干扰一或多种蛋白质的酶促活性或者一种或多种蛋白质对于底物或调节蛋白质的结合活性的序列特异性多核苷酸；对一或多种蛋白质呈现特异性的抗体；可干扰一或多种蛋白质的稳定性、或者一或多种蛋白质的酶促活性、或者一或多种蛋白质的结合活性的小分子化合物；结合一或多种多核苷酸的锌指蛋白质；以及对一或多种多核苷酸具有活性的大范围核酸酶。基因编辑技术、遗传编辑技术和基因组编辑技术是本领域众所周知的。
一种基因编辑方法涉及转录激活因子样效应物核酸酶(transcriptionactivator-like effector nuclease)(TALEN)的使用，所述TALEN诱导细胞可以修复机制响应的双链断裂。非同源末端连接使来自双链断裂任一侧的DNA再连接，其中存在很少的序列重叠或无序列重叠用于退火。该修复机制经由插入或缺失、或染色体重排诱导基因组中的误差。任何此类误差可致使在该位置处编码的基因产物无功能。另一种基因编辑方法涉及细菌CRISPR/Cas系统的使用。细菌和古细菌显示出称为规律成簇间隔短回文重复(clustered regularly interspaced short palindromic repeat)(CRISPR)的染色体元件，所述CRISPR是适应性免疫系统的一部分，所述适应性免疫系统保护不受侵袭性病毒和质粒DNA。在II型CRISPR系统中，CRISPR RNA(crRNA)与反式激活crRNA(tracrRNA)和CRISPR相关(Cas)蛋白质起作用，以在靶DNA中引入双链断裂。通过Cas9的靶切割要求在crRNA和tracrRNA之间的碱基配对，以及在crRNA和靶DNA之间的碱基配对。靶鉴定通过称为原型间隔序列毗邻基序(protospacer-adjacent motif)(PAM)的短基序的存在得到促进，所述PAM符合序列NGG。该系统可用于基因组编辑。Cas9通常通过双重RNA按程序工作，所述双重RNA由crRNA和tracrRNA组成。然而，这些RNA的核心组分可组合成单一杂交物‘引导RNA’用于Cas9靶向。对靶DNA使用非编码RNA引导用于位点特异性切割有希望比现有技术(例如TALEN)明显更直截了当。使用CRISPR/Cas策略，再靶向核酸酶复合物仅要求引入新RNA序列，并且不需要再改造蛋白质转录因子的特异性。
反义技术是可用于调节多肽表达的另一熟知方法。将待阻遏的基因的多核苷酸克隆且可操作地连接至调节区和转录终止序列，使得RNA的反义链被转录。重组构建体随后转化到植物细胞内，并且产生RNA的反义链。多核苷酸无需是待阻遏基因的整个序列，但通常与待阻遏基因的有义链的至少一部分基本上互补。
多核苷酸可转录成核酶，或催化RNA，其影响mRNA的表达。核酶可设计为与基本上任何靶RNA特异性配对，且切割在特定位置处的磷酸二酯主链，由此使靶RNA功能失活。异源多核苷酸可编码设计为切割特定mRNA转录物的核酶，从而阻止多肽的表达。锤头状核酶可用于破坏特定mRNA，尽管可使用切割在位点特异性鉴定序列处的mRNA的多种核酶。锤头状核酶在由侧翼区指示的位置处切割mRNA，所述侧翼区与靶mRNA形成互补碱基对。唯一要求是靶RNA含有5'-UG-3'核苷酸序列。锤头状核酶的构建和产生是本领域已知的。锤头状核酶序列可嵌入稳定RNA例如转移RNA(tRNA)内，以增加体内切割效率。
在一个实施方式中，可干扰一种或多种RNA转录物翻译的序列特异性多核苷酸是干扰RNA。RNA干扰或RNA沉默是进化上保守的过程，特异性mRNA通过其可被靶向用于酶促降解。一种双链RNA(双链RNA)通过细胞(例如双链RNA病毒、或干扰RNA多核苷酸)引入或产生，以起始干扰RNA途径。双链RNA可通过核糖核酸酶III而转换成长度为21bp至24bp的多重小干扰RNA双链体，所述核糖核酸酶III是双链RNA特异性核酸内切酶。小干扰RNA随后可由RNA诱导沉默复合物鉴定，所述RNA诱导沉默复合物促进通过ATP依赖性过程的小干扰RNA的解旋。小干扰RNA的解旋的反义链将活化RNA诱导沉默复合物导向靶向mRNA，所述靶向mRNA包含与小干扰RNA反义链互补的序列。靶向mRNA和反义链可形成A形螺旋，并且A形螺旋的大沟可由活化RNA诱导沉默复合物鉴定。可在由小干扰RNA链的5'末端的结合位点限定的单个位点处，通过活化RNA诱导沉默复合物切割靶mRNA。活化RNA诱导沉默复合物可再循环，以催化另一切割事件。
干扰RNA表达载体可包含编码干扰RNA多核苷酸的干扰RNA构建体，其通过降低mRNA、mRNA前体或相关RNA变体的表达水平，显示出RNA干扰活性。表达载体可包含置于干扰RNA构建体上游，且可操作地连接至干扰RNA构建体的启动子，如本文进一步描述的。干扰RNA表达载体可包含合适的最小核心启动子、目的干扰RNA构建体、上游(5')调节区、下游(3')调节区，包括转录终止和多腺苷酸化信号，以及其他本领域技术人员已知的序列，例如多种选择标记。
多核苷酸可以多种形式产生，包括作为双链结构(即，包含反义链和互补有义链的双链RNA分子)、双链发夹样结构、或单链结构(即，仅包含反义链的ssRNA分子)。结构可包含具有自互补的有义链和反义链的双链体、不对称双链体、发夹或不对称的发夹二级结构。双链干扰RNA可酶促转换为双链小干扰RNA。小干扰RNA双链体的链之一可对靶mRNA和相关RNA变体内的互补序列退火。小干扰RNA/mRNA双链体由RNA诱导沉默复合物鉴定，所述RNA诱导沉默复合物可以序列依赖性方式切割在多个位点处的RNA，从而导致靶mRNA和相关RNA变体的降解。
双链RNA分子可包括以茎环结构由单个寡核苷酸装配的小干扰RNA分子，其中借助于一种或多种基于多核苷酸或基于非多核苷酸的接头，连接小干扰RNA分子的自互补的有义区和反义区；以及具有两个或更多个环结构和包含自互补的有义链和反义链的茎的环状单链RNA，其中所述环状RNA可在体内或体外加工，以生成能够调节干扰RNA的活性小干扰RNA分子。
还考虑了小发夹RNA分子的使用。它们包含通常由间隔物或环序列分开的，特异性反义序列加上反向互补体(有义)序列。间隔物或环的切割提供了单链RNA分子及其反向互补体，使得它们可退火以形成双链RNA分子(任选具有另外的加工步骤，其可导致来自任一或两条链的3'末端或5'末端的一个、两个、三个或更多个核苷酸的添加或去除)。间隔物可具有足够长度，以在间隔物切割(和任选地，可导致来自任一或两条链的3'末端或5'末端的一个、两个、三个、四个或更多个核苷酸的添加或去除的后续加工步骤)之前，允许反义和有义序列退火且形成双链结构(或茎)。间隔物序列通常为位于两个互补的核苷酸序列区域之间的无关核苷酸序列，当退火成双链多核苷酸时，所述两个互补的核苷酸序列区域含有小发夹RNA。间隔物序列一般包含约3至约100个核苷酸。
可通过选择用于生产发夹双链体的合适序列组成、环大小和茎长，生产任何目的RNA多核苷酸。用于设计发夹双链体的茎长的合适范围包括至少约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸的茎长，例如约14-30个核苷酸、约30-50个核苷酸、约50-100个核苷酸、约100-150个核苷酸、约150-200个核苷酸、约200-300个核苷酸、约300-400个核苷酸、约400-500个核苷酸、约500-600个核苷酸、以及约600-700个核苷酸。用于设计发夹双链体的环长的合适范围包括约4-25个核苷酸、约25-50个核苷酸或更长的环长，如果发夹双链体的茎长是重要的。在某些实施方式中，双链RNA或ssRNA分子长度在约15和约40个核苷酸之间。在另一个实施方式中，小干扰RNA分子是长度在约15和约35个核苷酸之间的双链RNA或ssRNA分子。在另一个实施方式中，小干扰RNA分子是长度在约17和约30个核苷酸之间的双链RNA或ssRNA分子。在另一个实施方式中，小干扰RNA分子是长度在约19和约25个核苷酸之间的双链RNA或ssRNA分子。在另一个实施方式中，小干扰RNA分子是长度在约21至约24个核苷酸之间的双链RNA或ssRNA分子。在某些实施方式中，具有长于21个核苷酸的双链区的发夹结构可促进有效的小干扰RNA指导的沉默，与环序列和长度无关。RNA干扰的示范性序列示于SEQ ID NO：4中。
靶mRNA序列通常长度为约14至约50个核苷酸。约2:1-约1:2的A+T/G+C比；在靶序列的5'末端处的AA二核苷酸或CA二核苷酸；对靶mRNA独特的至少10个连续核苷酸的序列(即，序列不存在于来自相同植物的其他mRNA序列中)；以及不超过三个连续鸟嘌呤(G)核苷酸或超过三个连续胞嘧啶(C)核苷酸的“运行”。这些标准可使用本领域已知的多种技术进行评价，例如计算机程序例如BLAST可用于搜索可公开获得的数据库，以确定所选择的靶序列是否对靶mRNA独特。作为另外一种选择，使用商购可得的计算机软件(例如商购可得的OligoEngine、Target Finder和小干扰RNA Design Tool)，可选择靶序列(和设计的小干扰RNA序列)。
在一个实施方式中，选择满足上述标准中的一个或多个，长度在约14和约30个核苷酸之间的靶mRNA序列。在另一个实施方式中，选择满足上述标准中的一个或多个，长度在约16和约30个核苷酸之间的靶序列。在进一步的实施方式中，选择满足上述标准中的一个或多个，长度在约19和约30个核苷酸之间的靶序列。在另一个实施方式中，选择满足上述标准中的一个或多个，长度在约19和约25个核苷酸之间的靶序列。
在示例性实施方式中，小干扰RNA分子包含特异性反义序列，其与本文所述多核苷酸序列中的任何一个的至少12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个邻接核苷酸互补。
由小干扰RNA分子包含的特异性反义序列可与靶序列的互补体相同或基本上相同。在一个实施方式中，由小干扰RNA分子包含的特异性反义序列与靶mRNA序列的互补体至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。确定序列同一性的方法是本领域已知的，并且可例如通过使用University of Wisconsin Computer Group(GCG)软件的或NCBI网站上提供的BLASTN程序进行确定。
通过在一个、两个、三个或四个核苷酸处与靶mRNA的序列不同(例如，通过核苷酸置换，包括转换或颠换)，小干扰RNA分子的特异性反义序列可显示出变化性。当此类核苷酸置换存在于双链RNA分子的反义链中时，在有义链中置换核苷酸通常与之形成氢键碱基配对的互补核苷酸可相应地置换或不置换。还考虑了双链RNA分子，其中一种或多种核苷酸置换在有义序列而不是反义链中发生。如上所述，当小干扰RNA分子的反义序列包含在小干扰RNA的核苷酸序列和靶核苷酸序列之间的一个或多个错配时，错配可在反义序列的3'末端、5'末端或中心部分发现。
在另一个实施方式中，小干扰RNA分子包括特异性反义序列，在严格条件下，所述特异性反义序列能够与天然存在的靶基因或靶mRNA的一部分选择性杂交。如本领域普通技术人员已知的，可通过改变用于杂交和洗涤步骤的时间、温度或溶液浓度，来实现杂交条件的严格性中的变化。合适条件还可部分取决于使用的具体核苷酸序列，例如靶mRNA或基因的序列。
一种用于在植物中引入双链RNA沉默的方法是用产生发夹RNA的基因构建体的转化(参见Smith等人(2000)Nature,407,319-320)。(参见Smith等人(2000)Nature,407,319-320)。此类构建体包含由适当间隔物分开的，靶基因序列的倒转区。由于内含子剪接的发夹RNA的生成，功能植物内含子区作为间隔物片段的插入另外增加基因沉默诱导的效率(Wesley等人(2001)Plant J.,27,581-590)。适当地，茎长为约50个核苷酸至约1千个碱基长度。用于生成内含子沉默发夹RNA的方法在本领域中充分描述(参见例如Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry(2008)72,2,615-617)。
具有双链体或双链结构的干扰RNA分子，例如双链RNA或小发夹RNA可具有平端，或可具有3'或5'突出端。如本文使用的，“突出端”指一个或多个不成对的核苷酸，当一个RNA链的3'末端延伸超出另一条链的5'末端(3'突出端)，或反之亦然(5'突出端)时，所述不成对的核苷酸由双链体结构突出。包含突出端的核苷酸可为核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或其修饰形式。在一个实施方式中，干扰RNA分子的至少一条链具有长度约1至约6个核苷酸的3'突出端。在其它实施方式中，3'突出端长度为约1至约5个核苷酸、约1至约3个核苷酸、以及约2至约4个核苷酸。
当干扰RNA分子包含在分子的一个末端处的3'突出端时，另一个末端可为平端的或也具有突出端(5'或3')。当干扰RNA分子包含在分子的两个末端处的突出端时，突出端的长度可以是相同的或不同的。在一个实施方式中，干扰RNA分子包含在分子的两个末端处约1至约3个核苷酸的3'突出端。在进一步的实施方式中，干扰RNA分子是在分子的两个末端处具有2个核苷酸的3'突出端的双链RNA。在另外一个实施方式中，干扰RNA的突出端包含的核苷酸是TT二核苷酸或UU二核苷酸。
当确定包含一个或多个突出端的干扰RNA分子与靶mRNA序列的同一性百分比时，一个或多个突出端可加以考虑或不加以考虑。例如，来自3'突出端的核苷酸以及来自双链的5'或3'末端的最高达2个核苷酸可进行修饰，而无小干扰RNA分子活性的显著丧失。
干扰RNA分子可包含一个或多个5'或3'帽状结构。干扰RNA分子可包含在干扰RNA分子的有义链、反义链、或有义链和反义链两者的3'末端处；或者在有义链、反义链、或有义链和反义链两者的5'末端处的帽状结构。作为另外一种选择，干扰RNA分子可包含在干扰RNA分子的3'末端和5'末端两者处的帽状结构。术语“帽状结构”指在寡核苷酸的任一末端处掺入的化学修饰，这使分子免于核酸外切酶降解，并且还可促进在细胞内的递送或定位。
另一种可应用于干扰RNA分子的修饰是干扰RNA分子与一个或多个部分或缀合物的化学连接，这增强干扰RNA分子的活性、细胞分布、细胞摄取、生物利用度或稳定性。多核苷酸可通过本领域充分确定的方法进行合成或修饰。化学修饰可包括但不限于2'修饰、非天然碱基的引入、与配体的共价附着、以及用硫代磷酸酯键替换磷酸酯键。在该实施方式中，双链体结构的完整性通过至少一个，且通常为两个化学键得到加强。化学连接可通过多种众所周知技术中的任一种实现，例如通过引入共价、离子或氢键；疏水作用、范德华力或堆积相互作用；借助于金属离子配位，或通过使用嘌呤类似物。
在两条单链之一或两者处的核苷酸可进行修饰，以调节细胞酶例如但不限于某些核酸酶的活性。用于降低或抑制细胞酶活化的技术是本领域已知的，包括但不限于2'-氨基修饰、2'-氟修饰、2'-烷基修饰、不带电的主链修饰、吗啉代修饰、2'-O-甲基修饰和氨基磷酸酯。因此，双链RNA上的核苷酸的至少一个2'-羟基替换为化学基团。另外，至少一个核苷酸可进行修饰，以形成锁核苷酸。此类锁核苷酸含有连接核糖的2'-氧与核糖的4'-碳的亚甲基或亚乙基桥。锁核苷酸引入寡核苷酸内改善互补序列的亲和力，且使解链温度增加几度。
配体可缀合至干扰RNA分子，例如以增强其细胞吸收。在某些实施方式中，疏水配体缀合至分子，以促进细胞膜的直接渗透。这些方法已用于促进反义寡核苷酸的细胞渗透。在某些情况下，阳离子配体与寡核苷酸的缀合通常导致对核酸酶的抗性改善。阳离子配体的代表性例子包括丙铵和二甲基丙铵。当阳离子配体分布遍及寡核苷酸时，反义寡核苷酸可保留其与mRNA的高结合亲和力。
本文描述的分子和多核苷酸可使用众所周知的固相合成技术进行制备。可另外或可替代地采用本领域已知的用于此类合成的任何其他方法。
多个实施方式是针对包括多核苷酸中的一或多种的表达载体或者包括本文所描述的一或多种多核苷酸的干扰RNA构建体。示范性干扰RNA构建体展示于SEQ ID NO:4中。
多个实施方式涉及包含本文描述的多核苷酸中的一种或多种或者一种或多种干扰RNA构建体的表达载体。
(a)本文描述的多核苷酸中的一种或多种；(b)编码间隔物元件的第二序列，所述间隔物元件形成发夹结构的环；和(c)包含置于与第一序列相同的定向、第一序列的反向互补序列的第三序列，其中所述第二序列置于第一序列和第三序列之间，并且第二序列可操作地连接至第一序列和第三序列。
所公开的序列可用于构建不形成发夹结构的多种多核苷酸。(1)通过可操作地连接至第一启动子，来转录DNA的第一条链，和(2)通过可操作地连接至第二启动子，来转录DNA片段的第一条链的反向互补序列。多核苷酸的每条链可由相同表达载体或不同表达载体转录。具有RNA干扰活性的RNA双链体可酶促转换为小干扰RNA，以调节RNA水平。
(a)本文描述的多核苷酸中的一种或多种；和(b)包含置于与第一序列相同的定向、第一序列的互补(例如反向互补)序列的第二序列。
本发明提供了通过促进基因表达的共抑制，用于调节本文所述多肽中的一种或多种(或如本文描述的其任何组合)的内源表达水平的多种组合物和方法。由于将转基因的多个拷贝引入植物细胞宿主内，发生共抑制现象。转基因的多个拷贝的整合可导致转基因和靶向内源基因的调节表达。共抑制程度取决于靶基因和靶向内源基因之间的序列同一性程度。内源基因和靶基因两者的沉默均可通过沉默基因座(即内源启动子和内源目的基因)的广泛甲基化而发生，所述广泛甲基化可阻碍转录。作为另外一种选择，在一些情况下，内源基因和转基因的共抑制可通过转录后基因沉默而发生，其中可产生转录物，但增强的降解速率阻碍转录物的累积。通过转录后基因沉默的共抑制机制被认为类似RNA干扰，因为RNA看起来是这些过程中的重要起始子和靶，并且可至少部分地通过相同分子机制、可能通过RNA指导的mRNA降解进行介导。
可通过将核酸或其片段的多个拷贝作为转基因整合到目的植物的基因组内，来实现核酸的共抑制。宿主植物可用表达载体进行转化，所述表达载体包含可操作地连接至核酸或其片段的启动子。多个实施方式涉及用于促进内源基因的共抑制的表达载体，所述内源基因包含可操作地连接至多核苷酸的启动子。
多个实施方式涉及通过将一种或多种多核苷酸的多个拷贝整合到(烟草)植物基因组内，用于调节本文描述的多核苷酸中的一种或多种(或如本文描述的其任何组合)的表达水平的方法，其包括：用表达载体转化植物细胞宿主，所述表达载体包含可操作地连接至多核苷酸的启动子。
本发明提供了通过调节mRNA的翻译用于调节内源基因表达水平的多种组合物和方法。可操作地连接至多核苷酸的启动子，所述多核苷酸以就启动子而言的反义定向放置，以允许与mRNA的一部分具有序列互补性的RNA多核苷酸的表达。
用于调节mRNA翻译的多种表达载体可包含：可操作地连接至多核苷酸的启动子，其中序列以就启动子而言的反义定向放置。反义RNA多核苷酸的长度可改变，并且可为约15-20个核苷酸、约20-30个核苷酸、约30-50个核苷酸、约50-75个核苷酸、约75-100个核苷酸、约100-150个核苷酸、约150-200个核苷酸、以及约200-300个核苷酸。
还可通过将转座子(例如，IS元素)引入目的植物的基因组内，靶向基因以灭活。这些活动基因元件可通过伴性异花受精而引入，并且可就蛋白质活性的丧失筛选插入突变体。通过例如伴性异花受精，通过使亲本植物与未实施转座子诱导诱变的植物杂交，可将亲本植物中的破坏基因引入其他植物内。可利用本领域技术人员已知的任何标准育种技术。在一个实施方式中，一种或多种基因可通过插入一个或多个转座子进行灭活。突变可导致一种或多种基因的纯合破坏，一种或多种基因的杂合破坏，或如果破坏超过一种基因，则可导致纯合和杂合破坏两者的组合。合适的可转座元件包括反转录转座子、反转座子和SINE样元件。此类方法是本领域技术人员已知的。
作为另外一种选择，可通过将源自许多小环状RNA的核酶引入植物中，靶向基因以灭活，所述小环状RNA能够自切割和复制。这些RNA可单独复制(类病毒RNA)或伴随辅助病毒(卫星RNA)而复制。合适RNA的例子包括源自鳄梨日斑病类病毒的那些，以及源自烟草环斑病毒、苜蓿短暂条纹病毒、绒毛烟草斑驳病毒、茄属植物斑驳病毒和地下三叶草斑驳病毒的卫星RNA。多种靶RNA特异性核酶是本领域技术人员已知的。
如本文所讨论，可通过非转基因方法来调节一或多种多肽的表达，例如如本所讨论的在一或多个基因中产生一或多个突变。在基因序列中随机引入突变的方法可包括化学诱变、EMS诱变和辐射诱变。将一或多个靶向突变引入细胞内的方法包含(但不限于)基因组编辑技术(确切地说锌指核酸酶介导的突变形成和靶向诱导的基因组局部损伤(TILLING))、同源重组、寡核苷酸引导的突变形成和大范围核酸酶介导的突变形成。在一个实施方式中，使用TILLING。此为可用于生成及/或鉴定编码具有经修改表达及/或活性的多肽的多核苷酸的突变形成技术。TILLING还允许选择携带此类突变体的植物。TILLING组合高密度诱变与高流通量筛选方法。用于TILLING的方法是本领域众所周知的(参见McCallum等人，(2000)Nat Biotechnol 18:455-457和Stemple(2004)Nat Rev Genet 5(2):145-50)。
突变的一些非限制性例子是至少一个核苷酸的缺失、插入和错义突变，单核苷酸多态性和简单序列重复。在突变后，可执行筛选，以鉴定产生提前终止密码子或以其他方式无功能的基因的突变。在突变后，可执行筛选以鉴定产生功能基因的突变，所述功能基因能够以升高水平表达。可通过测序或使用对于基因或蛋白质特异性的一个或多个探针或引物，进行突变体的筛选。还可制备多核苷酸中的特异性突变，其可导致调节的基因表达、mRNA的稳定性调节、或蛋白质的稳定性调节。此类植物在本文中被称为“非天然存在的”或“突变型”植物。通常，突变型或非天然存在的植物包括外源或合成或人造核酸(例如DNA或RNA)的至少一部分，其在被操纵前不存在于植物中。外源核酸可以是单个核苷酸、两个或更多个核苷酸、两个或更多个邻接核苷酸、或者两个或更多个不邻接核苷酸-例如至少10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400或1500个或更多个邻接或不邻接核苷酸。
突变型或非天然存在的植物或植物细胞可具有一或多种基因中的一或多个突变的任何组合，所述一或多个突变使得蛋白质水平得以调节。举例来说，突变型或非天然存在的植物或植物细胞可具有单个基因中的单个突变；单个基因中的多个突变；两个或多于两个或者三个或多于三个基因中的单个突变；或者两个或多于两个或者三个或多于三个或者四个或多于四个基因中的多个突变。这些突变的实例描述于本文中。作为进一步例子，突变型或非天然存在的植物或植物细胞可具有在基因的特定部分中的一或多个突变，所述特定部分例如基因中编码蛋白质的活性位点或其一部分的区域中。作为进一步例子，突变型或非天然存在的植物或植物细胞可具有在基因的特定部分中的一或多个突变，所述特定部分例如其调节的基因的上游或下游区域，只要其调节基因的活性或表。上游元件可包括启动子、增强子或转录因子。一些元件例如增强子可置于它调节的基因的上游或下游。一种或多种元件无需定位接近于它调节的基因，因为一些元件已发现位于它调节的基因上游或下游几百上千个碱基对处。突变型或非天然存在的植物或植物细胞可具有位于基因的前100个核苷酸内、基因的前200个核苷酸内、基因的前300个核苷酸内、基因的前400个核苷酸内、基因的前500个核苷酸内、基因的前600个核苷酸内、基因的前700个核苷酸内、基因的前800个核苷酸内、基因的前900个核苷酸内、基因的前1000个核苷酸内、基因的前1100个核苷酸内、基因的前1200个核苷酸内、基因的前1300个核苷酸内、基因的前1400个核苷酸内、或基因的前1500个核苷酸内的一或多个突变。突变型或非天然存在的植物或植物细胞可具有位于基因的100个核苷酸的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四或第十五集合或其组合内的一或多个突变。本发明公开了包括突变型多肽变体的突变型或非天然存在的植物或植物细胞(例如，如本文描述的突变型、非天然存在的或转基因植物或植物细胞等)。
在一个实施方式中，使来自植物的种子诱变且随后生长成第一代突变型植物。随后允许第一代植物自花授粉，并且使来自第一代植物的种子生长成第二代植物，所述第二代植物随后就其基因座中的突变进行筛选。尽管诱变的植物材料可就突变进行筛选，但筛选第二代植物的优点在于所有体细胞突变均对应于种系突变。多种植物材料包括但不限于种子、花粉、植物组织或植物细胞可进行诱变，以便制备突变型植物。然而，当植物核酸就突变进行筛选时，可影响诱变的植物材料类型。例如，当在非诱变植物授粉前对花粉实施诱变时，使起源于授粉的种子生长成第一代植物。第一代植物的每一个细胞将含有在花粉中制备的突变；因此这些第一代植物随后可就突变进行筛选，代替等待直到第二代时。
主要制备点突变和短缺失、插入、颠换和或转换的诱变剂包括化学诱变剂或辐射，可用于制备突变。诱变剂包括但不限于甲磺酸乙酯、甲磺酸甲酯、N-乙基-N-亚硝基脲、三乙基蜜胺、N-甲基-N-亚硝基脲、丙卡巴肼、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、硫酸二乙酯、丙烯酰胺单体、美法仑、氮芥、长春新碱、二甲基亚硝胺、N-甲基-N'-硝基-亚硝基胍、亚硝基胍、2-氨基嘌呤、7,12-二甲基苯并蒽、环氧乙烷、六甲基磷酸胺、白消安、二环氧烷烃(二环氧辛烷、二环氧丁烷等等)、2-甲氧基-6-氯-9[3-(乙基-2-氯乙基)氨丙基氨基]吖啶二盐酸盐和甲醛。
还考虑了无法由诱变剂直接引起的基因座中的自发突变，条件是它们导致所需表型。合适的诱变试剂还可包括例如电离辐射，例如X射线、γ射线、快中子照射和UV辐射。本领域技术人员已知的植物核酸制备的任何方法均可用于制备用于突变筛选的植物核酸。
可任选合并由个别植物、植物细胞或植物材料制备的核酸，以便加速源于诱变的植物组织、细胞或材料的植物群体中的突变筛选。可筛选植物、植物细胞或植物材料的一个或多个后续世代。任选合并的组的大小取决于使用的筛选方法的灵敏度。
在核酸样品任选合并后，可对它们实施多核苷酸特异性扩增技术，例如聚合酶链反应。对于基因或与基因紧相邻的序列特异性的任何一个或多个引物或探针可用于扩增任选合并的核酸样品内的序列。适当地，一个或多个引物或探针设计为扩增基因座的区域，在所述区域中有用的突变最可能出现。最优选地，引物设计为检测多核苷酸区域内的突变。另外，优选一个或多个引物和一个或多个探针避免已知的多态性位点，以便容易筛选点突变。为了促进扩增产物的检测，一个或多个引物或探针可使用任何常规标记方法进行标记。使用本领域充分理解的方法，可基于本文描述的序列来设计一个或多个引物或一个或多个探针。
为了促进扩增产物的检测，可使用任何常规标记方法来标记一个或多个引物或一个或多个探针。使用本领域充分理解的方法，可基于本文描述的序列来设计这些。多态性可通过本领域已知的方法进行鉴定，并且一些已在文献中得到描述。
在进一步方面，本发明提供了制备突变型植物的方法。该方法涉及提供包含编码本文所述功能多核苷酸(或如本文描述的其任何组合)的基因的植物的至少一个细胞。接下来，植物的至少一个细胞在有效调节本文所述一种或多种多核苷酸的活性的条件下进行处理。至少一个突变型植物细胞随后繁殖成突变型植物，其中与对照植物的那种相比较，所述突变型植物具有调节水平的一种或多种所述多肽(或如本文描述的其任何组合)。在制备突变型植物的该方法的一个实施方式中，处理步骤涉及使至少一个细胞经受如上所述的化学诱变试剂，及有效获得至少一个突变型植物细胞的条件。在该方法的另一个实施方式中，处理步骤涉及在有效获得至少一个突变型植物细胞的条件下，使至少一个细胞经受辐射源。术语“突变型植物”包括这样的突变型植物，与对照植物相比较，所述突变型植物中的基因型适当地通过除了遗传改造或遗传修饰之外的方式进行修饰。
在某些实施方式中，突变型植物、突变型植物细胞或突变型植物材料可包含一个或多个突变，所述一个或多个突变在另一种植物、植物细胞或植物材料中天然存在，且赋予所需性状。该突变可引入(例如基因渗入)另一种植物、植物细胞或植物材料(例如具有与突变源自于其的植物不同的遗传背景的植物、植物细胞或植物材料)内，以对其赋予该性状。因此，例如，在第一植物中天然存在的突变可引入第二植物内，例如与第一植物具有不同遗传背景的第二植物。技术人员因此能够搜索且鉴定在其基因组中天然携带本文所述基因的一种或多种突变等位基因的植物，所述基因赋予所需性状。可通过多种方法包括育种、回交和基因渗入，将天然存在的一种或多种突变等位基因转移至第二植物，以产生在本文所述基因中具有一个或多个突变的品系、品种或杂交物。可在突变型植物的库中筛选显示所需性状的植物。适当地，利用如本文描述的核苷酸序列的知识进行选择。因此，能够与对照相比较筛选遗传性状。此类筛选方法可涉及如本文讨论的常规核酸扩增和/或杂交技术的应用。因此，本发明的进一步方面涉及用于鉴定突变型植物的方法，其包括下述步骤：(a)提供来自植物的包含核酸的样品；和(b)确定多核苷酸的核酸序列，其中与对照植物的多核苷酸序列相比较，在多核苷酸序列中的差异指示所述植物是突变型植物。在另一个方面，本发明提供了用于鉴定突变型植物的方法，与对照植物相比，所述突变型植物累积降低水平的降烟碱及/或至少NNK，所述方法包括下述步骤：(a)提供来自待筛选的植物的样品；(b)确定所述样品是否包括在本文所述的多核苷酸中的一种或多种中的一个或多个突变；和(c)确定所述植物的至少区间研究及/或NNK。适当地，在绿叶中或在烟中确定至少NNK和/或硝酸盐含量。
在另一个方面，本发明提供了用于鉴定突变型植物的方法，与对照植物相比，所述突变型植物累积降低水平的降烟碱及/或至少NNK，所述方法包括下述步骤：(a)提供来自第一植物的样品；(b)确定所述样品是否包括在本文所述的多核苷酸中的一种或多种中的一个或多个突变，所述一个或多个突变导致降低水平的降烟碱及/或至少NNN；和(c)将一个或多个突变转移到第二植物内。适当地，在绿叶中或在烟中确定至少NNK和/或硝酸盐含量。可使用本领域已知的多种方法，例如通过遗传改造、遗传操纵、基因渗入、植物育种、回交等等，将一个或多个突变转移到第二植物内。在一个实施方式中，第一植物是天然存在的植物。在一个实施方式中，第二植物具有与第一植物不同的遗传背景。
在另一个方面，本发明提供了用于鉴定突变型植物的方法，与对照植物相比，所述突变型植物累积降低水平的降烟碱及/或至少NNK，所述方法包括下述步骤：(a)提供来自第一植物的样品；(b)确定所述样品是否包括在本文所述的多核苷酸中的一种或多种中的一个或多个突变，所述一个或多个突变导致降低水平的降烟碱及/或至少NNN；和(c)将一个或多个突变渗入到第二植物内。适当地，在绿叶中或在烟中确定至少NNK和/或硝酸盐含量。在一个实施方式中，基因渗入步骤包括植物育种，任选包括回交等等。在一个实施方式中，第一植物是天然存在的植物。在一个实施方式中，第二植物具有与第一植物不同的遗传背景。在一个实施方式中，第一植物不是栽培变种或优良栽培变种。在一个实施方式中，第二植物是栽培变种或优良栽培变种。进一步方面涉及通过本文所述方法获得或可获得的突变型植物(包括栽培变种或优良栽培变种突变型植物)。在某些实施方式中，“突变型植物”可具有仅定位于植物的特定区域，例如在本文所述的一种或多种多核苷酸的序列内的一个或多个突变。根据该实施方式，突变型植物的剩余基因组序列将与诱变前的植物相同或基本上相同。
在某些实施方式中，突变型植物可具有定位于植物的超过一个区域，例如在本文所述的多核苷酸中的一种或多种的序列内以及基因组的一个或多个进一步区域中的一个或多个突变。根据该实施方式，突变型植物的剩余基因组序列将与诱变前的植物不同或基本上不同。在某些实施方式中，突变型植物可不具有在本文描述的一种或多种多核苷酸的一个或多个、两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、或者五个或更多个外显子中的一个或多个突变；或可不具有在本文描述的一种或多种多核苷酸的一个或多个、两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、或者五个或更多个内含子中的一个或多个突变；或可不具有在本文描述的一种或多种多核苷酸的启动子中的一个或多个突变；或可不具有在本文描述的一种或多种多核苷酸的3’非翻译区中的一个或多个突变；或可不具有在本文描述的一种或多种多核苷酸的5’非翻译区中的一个或多个突变；或可不具有在本文描述的一种或多种多核苷酸的编码区中的一个或多个突变；或可不具有在本文描述的一种或多种多核苷酸的非编码区中的一个或多个突变；或其部分中的其两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个；或者六个或更多个的任何组合。
在进一步方面，本发明提供了鉴定在基因中包含突变的植物、植物细胞或植物材料的方法，所述基因编码本文描述的多核苷酸，所述方法包括：(a)对植物、植物细胞或植物材料实施诱变；(b)由所述植物、植物细胞或植物材料或其后代获得核酸样品；和(c)测定编码本文描述的多核苷酸的基因或其变体或片段的核酸序列，其中所述序列中的差异指示其中的一个或多个突变。
锌指蛋白可用于调节本文描述的多核苷酸中的一种或多种的表达或活性。在多个实施方式中，通过锌指核酸酶介导的诱变，修饰包含多核苷酸编码序列的一部分或全部的基因组DNA序列。在基因组DNA序列中搜索锌指蛋白结合的独特位点。作为另外一种选择，在基因组DNA序列中搜索锌指蛋白结合的两个独特位点，其中两个位点在相反链上且紧靠在一起，例如相隔1、2、3、4、5、6个或更多个碱基对。相应地，本发明提供了与多核苷酸结合的锌指蛋白。
锌指蛋白可进行改造，以鉴定基因中的所选靶位点。通过截短或扩增或与选择方法偶联的定点诱变过程(所述选择方法例如但不限于噬菌体展示选择、细菌双杂交选择或细菌单杂交选择)，锌指蛋白可包含源自天然锌指DNA结合结构域和非天然锌指DNA结合结构域的任何基序组合。术语“非天然锌指DNA结合结构域”指锌指DNA结合结构域，其结合靶核酸内的三碱基对序列，并且在包含待修饰的核酸的细胞或生物中不存在。用于设计结合特异性核苷酸序列的锌指蛋白的方法是本领域已知的，所述特异性核苷酸序列对于靶基因是独特的。
可通过制备编码结合多核苷酸的锌指蛋白的第一多核苷酸以及编码非特异性核酸内切酶的第二多核苷酸(例如但不限于IIS型核酸内切酶的那些)的融合物，来构建锌指核酸酶。在锌指蛋白和核酸酶之间的融合蛋白可包含由两个碱基对组成的间隔物，或作为另外一种选择，间隔物可由三个、四个、五个、六个、七个或更多个碱基对组成。在多个实施方式中，锌指核酸酶在多核苷酸的基因组DNA序列的调节区、编码区或非编码区中引入双链断裂，且导致多核苷酸的表达水平降低，或由其编码的蛋白质活性中的降低。通过锌指核酸酶的切割通常导致在通过非同源末端连接的DNA修复后，在切割位点处的DNA缺失。
在其它实施方式中，锌指蛋白可选择为结合多核苷酸的调节序列。更具体而言，调节序列可包含转录起始位点、起始密码子、外显子区、外显子-内含子边界、终止子或终止密码子。相应地，本发明提供了在本文描述的一种或多种多核苷酸附近或其内通过锌指核酸酶介导的诱变产生的突变型、非天然存在的或转基因植物细胞，以及通过锌指核酸酶介导的诱变用于制备此类植物或植物细胞的方法。用于将锌指蛋白和锌指核酸酶递送至烟草植物的方法类似于下文对于大范围核酸酶递送描述的那些。
在另一个方面，本发明描述了使用大范围核酸酶例如I-CreI，用于产生突变型、非天然存在的或转基因或以其他方式遗传修饰的植物的方法。天然存在的大范围核酸酶以及重组大范围核酸酶可用于特异性引起在植物基因组DNA的单个位点或相对少数位点处的双链断裂，以允许破坏本文描述的一种或多种多核苷酸。大范围核酸酶可以是具有改变的DNA鉴定特性的经改造的大范围核酸酶。大范围核酸酶蛋白质可通过本领域已知的多种不同机制递送到植物细胞内。
本发明涵盖大范围核酸酶的用途，以使植物细胞或植物中的本文所述一种或多种多核苷酸(或如本文描述的其任何组合)失活。(a)提供包含如本文描述的多核苷酸的植物细胞；(b)将大范围核酸酶或编码大范围核酸酶的构建体引入所述植物细胞内；和(c)允许大范围核酸酶使一种或多种多核苷酸基本失活。
大范围核酸酶可用于切割在多核苷酸的编码区内的大范围核酸酶鉴定位点。此类切割通常导致在通过非同源末端连接的诱变DNA修复后，在大范围核酸酶鉴定位点处的DNA缺失。基因编码序列中的此类突变通常足以使基因失活。这种修饰植物细胞的方法首先涉及使用合适的转化方法，将大范围核酸酶表达盒递送至植物细胞。为了最高效率，期望将大范围核酸酶表达盒连接至可选标记，且在选择试剂的存在下选择成功转化的细胞。这种方法导致大范围核酸酶表达盒整合到基因组内，然而，如果植物可能需要监管机构批准，则这可能是不期望的。在此类情况下，使用常规育种技术，大范围核酸酶表达盒(和连接的可选标记基因)可在后续植物世代中分离开。作为另外一种选择，植物细胞可最初用缺乏可选标记的大范围核酸酶表达盒进行转化，并且可在缺乏选择试剂的培养基上生长。在此类条件下，经处理的细胞的一部分获得大范围核酸酶表达盒，并且瞬时表达经改造的大范围核酸酶，而不将大范围核酸酶表达盒整合到基因组内。因为它不负责转化效率，所以后面一种转化操作需要筛选更多数目的经处理的细胞，以获得所需基因组修饰。当利用锌指蛋白或锌指核酸酶时，上述方法还可应用于修饰植物细胞。
在大范围核酸酶表达盒递送后，植物细胞最初在对于使用的具体转化操作典型的条件下生长。这可意指在26℃以下的温度下，通常在黑暗中，使经转化的细胞在培养基上生长。此类标准条件可使用一段时间，优选1-4天，以允许植物细胞从转化过程恢复。在该最初恢复期后的任何点，生长温度可上升，以刺激经改造的大范围核酸酶的活性，以切割且突变大范围核酸酶鉴定位点。
对于一些应用，可能期望精确地从植物的基因组中去除多核苷酸。此类应用使用一对经改造的大范围核酸酶是可能的，所述一对大范围核酸酶各自切割在预期缺失的任一侧上的大范围核酸酶鉴定位点。还可使用TAL效应物核酸酶(TALEN)，其能够鉴定且结合基因，并且将双链断裂引入基因组内。因此，在另一个方面，考虑了使用TAL效应物核酸酶，用于生产如本文描述的突变型、非天然存在的或转基因或以其他方式遗传修饰的植物的方法。
适用于遗传修饰的植物包括但不限于单子叶和双子叶植物和植物细胞系统，包括来自下述科之一的物种：爵床科(Acanthaceae)、葱科(Alliaceae)、六出花科(Alstroemeriaceae)、石蒜科(Amaryllidaceae)、夹竹桃科(Apocynaceae)、棕榈科(Arecaceae)、菊科(Asteraceae)、小檗科(Berberidaceae)、红木科(Bixaceae)、十字花科(Brassicaceae)、凤梨科(Bromeliaceae)、大麻科(Cannabaceae)、石竹科(Caryophyllaceae)、三尖杉科(Cephalotaxaceae)、藜科(Chenopodiaceae)、秋水仙科(Colchicaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、薯蓣科(Dioscoreaceae)、麻黄科(Ephedraceae)、古柯科(Erythroxylaceae)、大戟科(Euphorbiaceae)、豆科(Fabaceae)、唇形科(Lamiaceae)、亚麻科(Linaceae)、石松科(Lycopodiaceae)、锦葵科(Malvaceae)、黑药花科(Melanthiaceae)、芭蕉科(Musaceae)、桃金娘科(Myrtaceae)、蓝果树科(Nyssaceae)、罂粟科(Papaveraceae)、松科(Pinaceae)、车前草科(Plantaginaceae)、禾本科(Poaceae)、蔷薇科(Rosaceae)、茜草科(Rubiaceae)、杨柳科(Salicaceae)、无患子科(Sapindaceae)、茄科(Solanaceae)、红豆杉科(Taxaceae)、山茶科(Theaceae)或葡萄科(Vitaceae)。
合适物种可包括下述属的成员：黄葵属(Abelmoschus)、冷杉属(Abies)、槭属(Acer)、剪股颖属(Agrostis)、葱属(Allium)、六出花属(Alstroemeria)、凤梨属(Ananas)、穿心莲属(Andrographis)、须芒草属(Andropogon)、蒿属(Artemisia)、芦竹属(Arundo)、颠茄属(Atropa)、小檗属(Berberis)、甜菜属(Beta)、红木属(Bixa)、芸苔属(Brassica)、金盏菊属(Calendula)、山茶属(Camellia)、喜树属(Camptotheca)、大麻属(Cannabis)、辣椒属(Capsicum)、红花属(Carthamus)、长春花属(Catharanthus)、三尖杉属(Cephalotaxus)、菊属(Chrysanthemum)、金鸡纳属(Cinchona)、西瓜属(Citrullus)、咖啡属(Coffea)、秋水仙属(Colchicum)、鞘蕊花属(Coleus)、甜瓜属(Cucumis)、南瓜属(Cucurbita)、狗牙根属(Cynodon)、曼陀罗属(Datura)、石竹属(Dianthus)、洋地黄属(Digitalis)、薯蓣属(Dioscorea)、油棕属(Elaeis)、麻黄属(Ephedra)、蔗茅属(Erianthus)、古柯属(Erythroxylum)、桉树属(Eucalyptus)、羊茅属(Festuca)、草莓属(Fragaria)、雪花莲属(Galanthus)、大豆属(Glycine)、棉属(Gossypium)、向日葵属(Helianthus)、橡胶树属(Hevea)、大麦属(Hordeum)、天仙子属(Hyoscyamus)、麻风树属(Jatropha)、莴苣属(Lactuca)、亚麻属(Linum)、黑麦草属(Lolium)、羽扇豆属(Lupinus)、番茄属(Lycopersicon)、石松属(Lycopodium)、木薯属(Manihot)、苜蓿属(Medicago)、薄荷属(Mentha)、芒属(Miscanthus)、芭蕉属(Musa)、烟草属、稻属(Oryza)、黍属(Panicum)、罂粟属(Papaver)、银胶菊属(Parthenium)、狼尾草属(Pennisetum)、矮牵牛属(Petunia)、虉草属(Phalaris)、梯牧草属(Phleum)、松属(Pinus)、早熟禾属(Poa)、一品红属(Poinsettia)、杨属(Populus)、萝芙木属(Rauwolfia)、蓖麻属(Ricinus)、蔷薇属(Rosa)、甘蔗属(Saccharum)、柳属(Salix)、血根草属(Sanguinaria)、赛莨菪属(Scopolia)、黑麦属(Secale)、茄属(Solanum)、高粱属(Sorghum)、米草属(Spartina)、菠菜属(Spinacea)、菊蒿属(Tanacetum)、红豆杉属(Taxus)、可可属(Theobroma)、小黑麦属(Triticosecale)、小麦属(Triticum)、北美穗草属(Uniola)、藜芦属(Veratrum)、长春花属(Vinca)、葡萄属(Vitis)和玉蜀黍属(Zea)。
、大须芒草(Andropogon gerardii)(大蓝秆草)、象草(Pennisetum purpureum)(象草)、虉草(Phalaris arundinacea)(草芦)、狗牙根(Cynodon dactylon)(狗牙根)、高羊茅(Festuca arundinacea)(高羊茅)、互花米草(Spartina pectinata)(草原索草)、苜蓿(Medicago sativa)(苜蓿)、芦竹(Arundo donax)(芦竹)、黑麦(Secale cereale)(黑麦)、柳属物种(Salix spp.)(柳树)、桉树属物种(Eucalyptus spp.)(桉树)、小黑麦(Triticosecale)(小麦杂交黑麦)、竹、向日葵(Helianthus annuus)(向日葵)、红花(Carthamus tinctorius)(红花)、桐油树(Jatropha curcas)(麻风树)、蓖麻(Ricinuscommunis)(蓖麻)、油棕(Elaeis guineensis)(棕榈)、亚麻(Linum usitatissimum)(亚麻)、芥菜(Brassica juncea)、甜菜(Beta vulgaris)(甜菜)、木薯(Manihot esculenta)(木薯)、番茄(Lycopersicon esculentum)(番茄)、莴苣(Lactuca sativa)(生菜)、香蕉(Musyclise alca)(香蕉)、马铃薯(Solanum tuberosum)(土豆)、甘蓝(Brassicaoleracea)(绿花椰菜、花椰菜、抱子甘蓝(Brussels sprouts))、山茶(Camellia sinensis)(茶)、草莓(Fragaria ananassa)(草莓)、可可(Theobroma cacao)(可可)、咖啡(Coffe45ycliseca)(咖啡)、葡萄(Vitis vinifera)(葡萄)、菠萝(Ananas comosus)(菠萝)、辣椒(Capsicum annum)(辣椒和甜椒)、洋葱(Allium cepa)(洋葱)、甜瓜(Cucumismelo)(甜瓜)、黄瓜(Cucumis sativus)(黄瓜)、笋瓜(Cucurbita maxima)(南瓜)、南瓜(Cucurbita moschata)(南瓜)、菠菜(Spinacea oleracea)(菠菜)、西瓜(Citrulluslanatus)(西瓜)、秋葵(Abelmoschus esculentus)(秋葵)、茄子(Solanum melongena)(茄子)、蔷薇属物种(Rosa spp.)47(玫瑰)、香石竹(Dianthus caryophyllus)(康乃馨)、矮牵牛属物种(Petunia spp.)(矮牵牛)、一品红(Poinsettia pulcherrima)(一品红)、白羽扇豆(Lupinus albus)(羽扇豆)、燕麦(Uniola paniculata)(燕麦)、翦股颖(翦股颖属物种(Agrostis spp.)(松树)、冷杉属物种(Abies spp.)(冷杉)、槭属物种(Acer spp.)(枫木)、大麦(Hordeum vulgare)(大麦)、草地早熟禾(Poa pratensis)(早熟禾)、黑麦草属物种(Lolium spp.)(黑麦草)和猫尾草(Phleum pratense)(梯牧草)、柳枝稷(Panicumvirgatum)(柳枝稷)、高粱(Sorghu45yclise45)或(高粱、苏丹草)、芒草(Miscanthusgiganteus)(芒草)、甘蔗属物种(Saccharum sp.)4747(能源蔗)、香脂杨(Populusbalsamifera)(白杨)、玉蜀黍(Zea mays)(玉米)、大豆(Glycine max)(黄豆)、油菜(Brassica napus)(芸苔)、小麦(Triticum aestivum)(小麦)、陆地棉(Gossypiumhirsutum)(棉花)、水稻(Oryza sativa)(稻)、向日葵(Helianthus annuus)(向日葵)、苜蓿(Medicago sativa)(苜蓿)、甜菜(Beta vulgaris)(甜菜)或珍珠粟(Pennisetum glaucum)(珍珠粟)。
多个实施方式涉及经修饰的突变型烟草植物、非天然存在的烟草植物或转基因烟草植物，以调节基因表达水平，由此产生与对照植物相比较，其中多肽的表达水平在目的植物组织中是调节的植物(例如烟草植物)。所公开的组合物和方法可应用于烟草属的任何物种，包括黄花烟草(N.rustica)和普通烟草(例如LA B21、LN KY171、TI 1406、巴斯玛、Galpao、Perique、Beinhart 1000-1和Petico)。其它物种包含无茎烟草(N.acaulis)、尖叶烟草(N.acuminata)、尖叶多花烟草(N.acuminata var.multiflora)、非洲烟草(N.africana)、花叶烟草(N.alata)、抱茎烟草(N.amplexicaulis)、阿伦兹氏烟草(N.arentsii)、渐狭叶烟草(N.attenuata)、贝纳莫特氏烟草(N.benavidesii)、本赛姆氏烟草(N.benthamiana)、印度烟草(N.bigelovii)、博内里烟草(N.bonariensis)、洞生烟草(N.cavicola)、克利夫兰氏烟草(N.clevelandii)、心叶烟草(N.cordifolia)、伞床烟草(N.corymbosa)、迪伯纳氏烟草(N.debneyi)、木丝烟草(N.excelsior)、福尔吉特氏烟草(N.forgetiana)、香烟草(N.fragrans)、粉蓝烟草(N.glauca)、粘烟草(N.glutinosa)、古特斯比氏烟草(N.goodspeedii)、哥西氏烟草(N.gossei)、杂交烟草(N.hybrid)、因古儿巴烟草(N.ingulba)、卡瓦卡米氏烟草(N.kawakamii)、奈特氏烟草(N.knightiana)、郎氏烟草(N.langsdorffii)、渐尖叶烟草(N.linearis)、长花烟草(N.longiflora)、海滨烟草(N.maritima)、特大管烟草(N.megalosiphon)、摩西氏烟草(N.miersii)、夜花烟草(N.noctiflora)、裸茎烟草(N.nudicaulis)、欧布斯特烟草(N.obtusifolia)、西方烟草(N.occidentalis)、西方亚种香芥烟草(N.occidentalis subsp.hesperis)、耳状烟草(N.otophora)、圆锥烟草(N.paniculata)、少花烟草(N.pauciflora)、矮牵牛状烟草(N.petunioides)、蓝茉莉叶烟草(N.plumbaginifolia)、夸德瑞伍氏烟草(N.quadrivalvis)、雷蒙德氏烟草(N.raimondii)、波缘烟草(N.repanda)、莲座烟草(N.rosulata)、莲座亚种因古儿巴烟草(N.rosulata subsp.ingulba)、圆叶烟草(N.rotundifolia)、赛特氏烟草(N.setchellii)、拟似烟草(N.simulans)、茄叶烟草(N.solanifolia)、斯佩格茨氏烟草(N.spegazzinii)、斯托可通氏烟草(N.stocktonii)、香甜烟草(N.suaveolens)、美花烟草(N.sylvestris)、拟穗状烟草(N.thyrsiflora)、绒毛烟草(N.tomentosa)、绒毛状烟草(N.tomentosiformis)、三角叶烟草(N.trigonophylla)、荫生烟草(N.umbratica)、波叶烟草(N.undulata)、颤毛烟草(N.velutina)、序叶烟草(N.wigandioides)和花烟草(N.x sanderae)。
本文还考虑使用烟草栽培变种和优良烟草栽培变种。因此，转基因、非天然存在的或突变型植物可以是烟草品种或优良烟草栽培变种，其包含一种或多种转基因、或者一个或多个遗传突变或其组合。一个或多个遗传突变(例如，一种或多种多态性)可以是非天然存在于个别烟草品种或烟草栽培变种(例如，优良烟草栽培变种)的突变，或可以是的确天然存在的一个或多个遗传突变，条件是所述突变并非天然存在于个别烟草品种或烟草栽培变种(例如，优良烟草栽培变种)中。
特别有用的普通烟草品种包括白肋烟型、深型、烤烟型和东方型烟草。品种或栽培变种的非限制性例子是：BD 64、CC 101、CC 200、CC 27、CC 301、CC 400、CC 500、CC 600、CC700、CC 800、CC 900、Coker 176、Coker 319、Coker 371Gold、Coker 48、CD 263、DF911、DT538LC Galpao烟草、GL 26H、GL 350、GL 600、GL 737、GL 939、GL 973、HB 04P、HB 04P LC、HB3307PLC、杂交403LC、杂交404LC、杂交501LC、K 149、K 326、K 346、K 358、K394、K 399、K730、KDH 959、KT 200、KT204LC、KY10、KY14、KY 160、KY 17、KY 171、KY 907、KY907LC、KTY14×L8LC、Little Crittenden、McNair 373、McNair 944、msKY 14×L8、窄叶Madole、窄叶Madole LC、NBH 98、N-126、N-777LC、N-7371LC、NC 100、NC 102、NC 2000、NC 291、NC 297、NC 299、NC 3、NC 4、NC 5、NC 6、NC7、NC 606、NC 71、NC 72、NC 810、NC BH 129、NC 2002、Neal Smith Madole、OXFORD 207、PD 7302LC、PD 7309LC、PD 7312LC、'Perique'烟草、PVH03、PVH09、PVH19、PVH50、PVH51、R 610、R 630、R 7-11、R 7-12、RG 17、RG 81、RG H51、RGH 4、RGH 51、RS 1410、Speight 168、Speight 172、Speight 179、Speight 210、Speight220、Speight 225、Speight 227、Speight 234、Speight G-28、Speight G-70、Speight H-6、Speight H20、Speight NF3、TI 1406、TI 1269、TN 86、TN86LC、TN 90、TN 97、TN97LC、TND94、TN D950、TR(Tom Rosson)Madole、VA 309、VA359、AA 37-1、B 13P、Xanthi(Mitchell-Mor)、Bel-W3、79-615、Samsun Holmes NN、KTRDC 2号杂交49、白肋21、KY 8959、KY 9、MD609、PG 01、PG 04、PO1、PO2、PO3、RG 11、RG 8、VA 509、AS44、Banket A1、巴斯玛Drama B84/31、巴斯玛I Zichna ZP4/B、巴斯玛Xanthi BX 2A、Batek、Besuki Jember、C104、Coker347、Criollo Misionero、Delcrest、Djebel 81、DVH 405、
Figure BDA0001145126730000481
Comum、HB04P、希克斯阔叶、Kabakulak Elassona、Kutsage E1、LA BU 21、NC 2326、NC 297、PVH 2110、RedRussian、Samsun、Saplak、Simmaba、Talgar 28、Wislica、Yayaldag、Prilep HC-72、PrilepP23、Prilep PB 156/1、Prilep P12-2/1、Yaka JK-48、Yaka JB 125/3、TI-1068、KDH-960、TI-1070、TW136、巴斯玛、TKF 4028、L8、TKF 2002、GR141、Basma xanthi、GR149、GR153、Petit Havana。即使本文未特别指明，也考虑上述的低转化亚变种。
实施方式还涉及用于产生突变型植物、非天然存在的植物、杂交植物或转基因植物的组合物和方法，所述植物已进行修饰，以调节本文所述的一种或多种多核苷酸(或如本文描述的其任何组合)的表达或活性。有利地，所获得的突变型植物、非天然存在的植物、杂交植物或转基因植物可在整体外观上与对照植物相似或基本上相同。多种表型特征，例如成熟程度、每植物叶数、杆高、叶插入角度、叶大小(宽度和长度)、节间距离、以及叶片-中脉比可通过田间观察进行评价。
一个方面涉及本文所述的突变型植物、非天然存在的植物、杂交植物或转基因植物的种子。优选地，所述种子是烟草种子。进一步方面涉及本文所述的突变型植物、非天然存在的植物、杂交植物或转基因植物的花粉或胚珠。另外，本发明提供了如本文所述的突变型植物、非天然存在的植物、杂交植物或转基因植物，其还含有赋予雄性不育的核酸。
本发明还提供了如本文所述的突变型植物、非天然存在的植物、杂交植物或转基因植物或其一部分的可再生细胞的组织培养物，其中培养物再生为能够表达亲本的所有形态和生理特征的植物。叶、花粉、胚、子叶、下胚轴、根、根尖、花药、花及其一部分、胚珠、枝条、茎、杆、髓和荚膜或源自其的愈伤组织或原生质体。
再进一步方面涉及源自或可源自突变型、非天然存在的或转基因植物或细胞的烘烤的植物材料，诸如烘烤的叶或烘烤的烟草，其中本文所述多核苷酸中的一或多种的表达或者由其编码的蛋白质的活性是降低的并且其中烟碱向降烟碱的转化是减少的，其导致降低水平的NNN。
适当地，所述植物(例如，叶)的视觉外观与对照植物大体上相同。适当地，所述植物是烟草植物。
实施方式还涉及用于产生突变型、非天然存在的或转基因植物的组合物和方法，所述植物已进行修饰，以调节本文所述多核苷酸或多肽中的一种或多种的表达或活性，所述修饰可导致与对照植物相比较，具有调节水平的硝酸盐和/或NNK和/或NNN和/或TSNA和/或烟碱的植物或植物组分(例如叶，例如绿叶或烘烤的叶，或者烟草)。
根据本文所述方法获得的突变型、非天然存在的或转基因植物在视觉外观上与对照植物相似或大体上相同。在一个实施方式中，突变型、非天然存在的或转基因植物的叶重与对照植物基本上相同。在一个实施方式中，突变型、非天然存在的或转基因植物的叶数目与对照植物基本上相同。在一个实施方式中，突变型、非天然存在的或转基因植物的叶重和叶数目与对照植物基本上相同。在一个实施方式中，例如在田间移植后一、二或三或更多个月或者在打顶后10、20、30或36或更多天，突变型、非天然存在的或转基因植物的杆高与对照植物基本上相同。例如，突变型、非天然存在的或转基因植物的杆高不低于对照植物的杆高。在另一个实施方式中，突变型、非天然存在的或转基因植物的叶绿素含量与对照植物基本上相同。在另一个实施方式中，突变型、非天然存在的或转基因植物的杆高与对照植物基本上相同，并且突变型、非天然存在的或转基因植物的叶绿素含量与对照植物基本上相同。在其它实施方式中，突变型、非天然存在的或转基因植物的叶的大小、或形状、或数目、或着色与对照植物基本上相同。适当地，所述植物是烟草植物。
在另一个方面，本发明提供了用于调节(例如，降低)植物(例如叶，例如烘烤的叶，或者烟草)的降烟碱及/或NNN的量的方法，所述方法其包括下述步骤：(i)调节(例如，降低)本文所述多肽中的一种或多种(或如本文描述的其任何组合)的表达或活性，适当地，其中多肽由本文所述的相应多核苷酸序列编码；(ii)测量在步骤(i)中获得的突变型、非天然存在的或转基因植物的至少部分(例如叶，例如烘烤的叶，或者烟草)中的降烟碱及/或NNN含量；和(iii)鉴定与对照植物相比较，其中的降烟碱及/或NNN含量已进行调节(例如，降低)的突变型、非天然存在的或转基因植物。适当地，所述突变型、非天然存在的或转基因植物的视觉外观与对照植物基本上相同。适当地，所述植物是烟草植物。
在另一个方面，本发明提供了用于调节(例如，降低)烘烤植物的至少部分(例如叶，例如烘烤的叶)中的降烟碱及/或NNN的量的方法，所述方法其包括下述步骤：(i)调节(例如，降低)多肽(或如本文描述的其任何组合)的一种或多种的表达或活性，适当地，其中多肽由本文所述的相应多核苷酸序列编码；(ii)收获植物材料(诸如叶中的一或多种)，且烘烤一段时间；(iii)测量在步骤(ii)中获得的经烘烤植物材料的至少部分中的降烟碱及/或NNN含量；和(iv)鉴定与对照植物相比较，其中的降烟碱及/或NNN含量已进行调节(例如，降低)的经烘烤植物材料。
与对照相比较，表达中的增加可为约5％至约100％，或者至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或100％或更多(诸如200％或300％或更多)的增加，这包含转录活性或多核苷酸表达或多肽表达或其组合中的增加。
与对照相比较，表达中的增加可为约5％至约100％，或者至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或100％或更多(诸如200％或300％或更多)的增加。
与对照相比较，表达中的降低可为约5％至约100％，或者至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或100％的降低，这包含转录活性或多核苷酸表达或多肽表达或其组合中的降低。
与对照相比较，表达中的降低可为约5％至约100％，或者至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或100％的降低。
本文描述的多核苷酸和重组构建体可用于调节本文描述的酶在目的植物物种(适当地，烟草)中的表达。
许多基于多核苷酸的方法可用于增加基因在植物和植物细胞中的表达。作为实例，可制备与待转化的植物兼容的构建体、载体或表达载体，其包括目的基因连同能够在植物中过表达所述基因的上游启动子。示例性启动子在本文中描述。在转化后且当生长在合适条件下时，所述启动子可驱动表达，以便调节(例如，降低)这种酶在植物或在其特定组织中的水平。在一个示例性实施方式中，生成携带本文所述一种或多种多核苷酸(或如本文描述的其任何组合)的载体，以在植物中过表达所述基因。所述载体携带位于转基因上游的合适启动子(例如花椰菜花叶病毒CaMV 35S启动子)，从而驱动所述转基因在植物的所有组织中的组成型表达。所述载体还携带抗生素抗性基因，以便对经转化的愈伤组织和细胞系赋予选择。
因此，多个实施方式涉及通过将多核苷酸的多个拷贝整合到植物基因组内，用于调节(例如，降低)本文所述的一种或多种多核苷酸(或如本文描述的其任何组合)的表达水平的方法，其包括：由重组多核苷酸编码的多肽可以是天然多肽，或对于细胞可以是异源的。
携带本文所述的一种或多种多核苷酸(或如本文描述的其任何组合)的突变等位基因的烟草植物可用于植物育种计划，以制备有用的品系、品种和杂种。特别地，可使所述突变等位基因基因渗入上述商业上重要的品种内。因此，本发明提供了用于植物育种的方法，其包括将如本文所述的突变型植物、非天然存在的植物或转基因植物与含有不同遗传同一性的植物进行杂交。所述方法还可包括将后代植物与另一植物杂交，且任选重复杂交直到获得具有期望的遗传性状或遗传背景的后代。此类育种方法发挥的一个目的是将期望的遗传性状引入其他品种、育种品系、杂种或栽培变种，尤其是具有商业利益的那些。另一个目的是便于在单一植物品种、品系、杂种或栽培变种中叠加不同基因的遗传修饰。考虑种内和种间交配。起于此类杂交的后代植物也称为育种品系，是本发明的非天然存在的植物的例子。
在一个实施方式中，本发明提供了用于生产非天然存在的烟草植物的方法，其包括：(a)将突变型或转基因烟草植物与第二烟草植物杂交，以获得后代烟草种子；(b)在植物生长条件下，使后代烟草种子生长，以获得非天然存在的烟草植物。该方法还可包括：(c)将非天然存在的烟草植物的上一代与自身或另一烟草植物杂交，以获得后代烟草种子；(d)在植物生长条件下，使步骤(c)的后代烟草种子生长，以获得另外的非天然存在的烟草植物；和(e)将(c)和(d)的杂交和生长步骤重复多次，以获得非天然存在的烟草植物的更多世代。该方法可任选包括在步骤(a)之前提供亲本植物的步骤，所述亲本植物包含得到表征且不同于突变型或转基因植物的遗传同一性。在一些实施方式中，取决于育种计划，杂交和生长步骤重复0至2次、0至3次、0至4次、0至5次、0至6次、0至7次、0至8次，0至9次或0至10次，以便生成非天然存在的烟草植物的世代。回交是此类方法的例子，其中后代与其亲本之一或与其亲本遗传相似的另一植物进行杂交，以便获得在下一代中具有更接近于亲本之一的遗传同一性的后代植物。用于植物育种、特别是烟草植物育种的技术，是众所周知的且可用于本发明的方法中。本发明还提供了通过这些方法产生的非天然存在的烟草植物。某些实施方式排除选择植物的步骤。
在本文所述方法的一些实施方式中，使用标准田间操作，在田间评估起因于育种和筛选变体基因的品系。包括原始未诱变亲本的对照基因型包括在内，并且按随机化的完全区组设计或其他适当的田间设计，将入选者(entry)排列于田间。对于烟草，使用标准的农学实践，例如将烟草收获、称量且取样，用于在烘烤之前和烘烤期间的化学及其他常见测试。执行数据的统计分析，以确认所选择品系与亲本品系之间的相似性。任选执行所选植物的细胞遗传学分析，以确认染色体组和染色体配对关系。
DNA指纹鉴定、单核苷酸多态性、微卫星标记或类似技术可用在标记辅助选择(MAS)的育种计划中，以如本文所述的，将基因的突变等位基因转移或培育到其他烟草内。例如，育种者可由含有突变等位基因的基因型与农学期望的基因型的杂交，而制备分离的群体。可使用本文所列出的技术之一，使用从基因组序列或其片段所开发的标记来筛选F2中的植物或回交世代。鉴定为具有突变等位基因的植物可以回交或自花授粉，以制备待筛选的第二群体。取决于预期遗传模式或所用MAS技术，有必要在每轮回交之前对所选择的植物进行自花授粉，以帮助鉴定期望的个体植物。可重复进行回交或其他育种操作，直到恢复轮回亲本的所需表型。
在育种计划中，成功的杂交获得能育的F1植物。所选择的F1植物可与亲本之一杂交，并且第一回交世代植物进行自花授粉，以产生再次筛选变体基因表达(例如，基因的无效版本)的群体。将回交、自花授粉和筛选的过程重复例如至少4次，直到最终筛选产生能育且与轮回亲本相当相似的植物。如果需要的话，这种植物进行自花授粉，并且随后再次筛选后代，以确认植物显示出变体基因表达。在一些实施方式中，在F2代的植物群体中筛选变体基因表达，例如，根据标准方法如通过使用具有引物的PCR方法，鉴定由于基因缺失而未能表达多肽的植物，所述引物基于本文所述的一种或多种多核苷酸(或如本文描述的其任何组合)的核苷酸序列信息。
阻止第一品种的雌性亲本植物(即，种子亲本)的自花授粉，允许来自第二品种的雄性亲本植物的花粉使雌性亲本植物受精，且允许F1杂种种子在雌性植物上形成。可通过在花发育早期阶段将花朵去雄，来阻止雌性植物的自花授粉。作为另外一种选择，可使用雄性不育的形式阻止在雌性亲本植物上的花粉形成。例如，通过细胞质雄性不育(CMS)或转基因雄性不育可产生雄性不育，其中转基因抑制小孢子和/或花粉形成、或自交不兼容。含有CMS的雌性亲本植物是特别有用的。在其中雌性亲本植物是CMS的实施方式中，从雄性能育植物收获花粉且人工应用于CMS雌性亲本植物的柱头，并且收获所得到的F1种子。
本文所述品种和品系可用于形成单杂交烟草F1杂种。在此类实施方式中，亲本品种的植物可生长为基本上同质的相邻群体，以便于雄性亲本植物与雌性亲本植物的天然异花授粉。通过常规方式选择性收获在雌性亲本植物上形成的F1种子。还可大批种植两个亲本植物品种，且收获由于自花授粉在雌性亲本上形成的F1杂种种子和在雄性亲本上形成的种子的掺和物。作为另外一种选择，可进行三系杂交，其中单杂交F1杂种用作雌性亲本，并且与不同的雄性亲本杂交。作为另一选择，可制备双杂交杂种，其中两个不同单杂交的F1后代进行自身杂交。
可在突变型、非天然存在的或转基因植物群体中，筛选或选择具有所需性状或表型的那些群体成员。例如，可在单一转化事件的后代群体中，筛选具有由其编码的一种或多种多肽的所需表达或活性水平的那些植物。物理和生物化学方法可用于鉴定表达或活性水平。这些包括用于检测多核苷酸的DNA分析或PCR扩增；用于检测RNA转录物的RNA印迹、S1RNA酶保护、引物延伸或RT-PCR扩增；用于检测多肽和多核苷酸的酶或核酶活性的酶促测定；以及检测多肽的蛋白质凝胶电泳、蛋白质印迹、免疫沉淀和酶联免疫测定。其他技术如原位杂交、酶染色和免疫染色以及酶测定也可用于检测多肽或多核苷酸的存在或表达或活性。
如本文所述的突变型、非天然存在的或转基因植物细胞和植物包含一种或多种重组多核苷酸、一种或多种多核苷酸构建体、一种或多种双链RNA、一种或多种缀合物或者一种或多种载体/表达载体。
无限制地，在表达或活性已根据本发明进行调节之前或之后，本文所述的植物可出于其他目的进行修饰。下列遗传修饰中的一种或多种可存在于突变型、非天然存在的或转基因植物中。在一个实施方式中，修饰涉及含氮代谢中间产物转化的一种或多种基因，导致当烘烤时，产生比对照植物或其部分更低水平的至少一种烟草特异性亚硝胺的植物或植物部分(例如叶或烟草)。如本文所描述，可进行修饰的基因的非限制性例子包含编码烟碱去甲基酶的基因，诸如CYP82E4、CYP82E5和CYP82E10，其参与烟碱向降烟碱的转化，并且在WO2006091194、WO2008070274、WO2009064771和PCT/US2011/021088中描述。在另一个实施方式中，修饰涉及重金属摄取或重金属转运的一种或多种基因，导致比不含一种或多种修饰的对照植物或其部分具有更低重金属含量的植物或植物部分(例如叶)。多药抗性相关蛋白质家族、阳离子扩散协助蛋白(CDF)家族、Zrt-,Irt样蛋白(ZIP)家族、阳离子交换剂(CAX)家族、铜转运蛋白(COPT)家族、重金属P型ATP酶家族(例如HMA，如WO2009074325中所述)、天然抗性相关巨噬细胞蛋白(NRAMP)同系物家族、以及参与重金属如镉转运的ATP结合盒(ABC)转运蛋白家族(例如MRP，如WO2012/028309中所述)。如本文使用的，术语重金属包括过渡金属。其他修饰的例子包括除草剂耐受性，例如，草甘膦是许多广谱除草剂的活性成分。通过转移aroA基因(来自鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和大肠杆菌(E.coli)的草甘膦EPSP合成酶)，已开发草甘膦抗性转基因植物。通过转化来自拟南芥属(Arabidopsis)的突变型ALS(乙酰乳酸合成酶)基因，已产生磺脲抗性植物。来自突变型绿穗苋(Amaranthus hybridus)的光系统II的OB蛋白已转移到植物内，以产生莠去津抗性转基因植物；并且通过掺入来自细菌肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)的bxn基因，已产生溴苯腈抗性转基因植物。另一示例性修饰导致对昆虫抗性的植物。苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)(Bt)毒素可提供延迟Bt抗性害虫出现的有效途径，如最近在绿花椰菜中所示，其中金字塔式的(pyramided)cry1Ac和cry1C Bt基因控制小菜蛾(diamondback moth)对任一单一蛋白质的抗性，且显著延迟抗性昆虫的进化。另一示例性修饰导致对由病原体(例如病毒、细菌、真菌)引起的疾病抗性的植物。已改造了表达Xa21基因(对白叶枯病的抗性)的植物，以及表达Bt融合基因和壳多糖酶基因(对三化螟的抗性和对鞘(sheath)的耐受性)两者的植物。另一示例性修饰导致改变的生殖能力，例如雄性不育。另一示例性修饰导致耐受非生物胁迫(例如，干旱、温度、盐度)的植物，并且通过转移来自拟南芥属的酰基甘油磷酸酶，已产生耐受的转基因植物；编码甘露醇脱氢酶和山梨糖醇脱氢酶的基因改善抗旱性，所述甘露醇脱氢酶和山梨糖醇脱氢酶涉及甘露醇和山梨糖醇合成。其他示例性修饰可导致具有改善的贮藏蛋白和油的植物、具有增强的光合效率的植物、具有延长的贮存期限的植物、具有增强的碳水化合物含量的植物以及对真菌抗性的植物；编码涉及生物碱生物合成的酶的植物。也可考虑这样的转基因植物，其中S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)和/或胱硫醚γ-合酶(CGS)的表达已被调节。
一种或多种此类性状可基因渗入来自另一烟草栽培品种的突变型、非天然存在的或转基因烟草植物，或可直接转化到其内。可通过本领域已知的任何植物育种方法，实现将一种或多种性状基因渗入本发明的突变型、非天然存在的或转基因烟草植物内，所述植物育种方法例如谱系育种、回交、双单倍体育种等(参见，Wernsman,E.A和Rufty，R.C.1987.第十七章Tobacco.第669-698页：Cultivar Development.Crop Species.W.H.Fehr(编辑)MacMillan Publishing Co,Inc.,New York,N.Y第761页)。如上所述的基于分子生物学的技术特别是RFLP和微卫星标记，可用于此类回交中，以鉴定与轮回亲本具有最高遗传同一性程度的后代。这允许加速生产与轮回亲本具有至少90％、优选至少95％、更优选至少99％遗传同一性的烟草品种，再更优选与轮回亲本遗传上相同的烟草品种，且还包括由供体亲本基因渗入的一种或多种性状。此类遗传同一性的确定可基于本领域已知的分子标记。
最后的回交世代可进行自交，以给出对于被转移的一种或多种核酸纯的育种后代。除转移的一种或多种性状(例如，一种或多种单基因性状)之外，所得到的植物一般具有本发明的突变型、非天然存在的或转基因烟草植物的基本上所有形态和生理特征。确切的回交方案将取决于被改变的性状，以确定合适的测试操作方案。虽然当被转移的性状是显性等位基因时，回交方法是简化的，但也可转移隐性等位基因。在这种情况下，可能有必要引入对后代的测试，以确定是否已成功转移所需性状。
多个实施方式提供了突变型植物、非天然存在的植物或转基因植物以及生物质，其中多核苷酸(或如本文描述的其任何组合)的表达水平被调节，以调节其中的硝酸盐和/或至少NNK含量。
此类植物特别是烟草植物的一部分，以及更特别地烟草植物的叶片和中脉，可掺入或用于制备多种消费品，包括但不限于气雾形成材料、气雾形成装置、吸烟物品、可抽吸物品、无烟产品和烟草产品。气雾形成材料的例子包括但不限于烟草组合物、烟草、烟草提取物、烟丝、切丝填料、烘烤的烟草、膨胀烟草、均质烟草、再造烟草和烟斗烟草。吸烟物品和可抽吸物品是气雾形成装置的类型。吸烟物品或可抽吸物品的例子包括但不限于香烟、小雪茄和雪茄。无烟产品的例子包括嚼烟和鼻烟。在某些气雾形成装置而不是燃烧中，烟草组合物或另一气雾形成材料被一个或多个电加热元件进行加热，以产生气雾。在加热气雾形成装置的另一类型中，通过将热从可燃性燃料元件或热源转移到物理上分开的气雾形成材料来产生气雾，所述气雾形成材料可位于热源之内、热源周围或热源下游。无烟烟草产品和多种含烟草的气雾形成材料可包含任何形式的烟草，包括沉积在其他成分上、混合于其他成分中、由其他成分包围或以其他方式与其他成分组合的干燥颗粒、碎片、小颗粒、粉末或浆料，所述其他成分采取任何形式，例如絮片、膜、卡(tab)、泡沫或珠。如本文使用的，术语“烟”用于描述一类气雾，其由吸烟物品如香烟、或通过燃烧气雾形成材料而产生。
在一个实施方式中，本发明还提供了来自本文所述的突变型、转基因和非天然存在的烟草植物的烘烤的植物材料。烘烤绿色烟叶的工艺是本领域技术人员已知的，并且包括但不限于空气烘烤、火烘烤、烟熏和日光烘烤。烘烤绿色烟叶的工艺取决于收获的烟草类型。例如，弗吉尼亚烟烤(淡色)烟草通常是烟道烘烤的，白肋烟草和某些深色品系通常是晾干的，且烟斗烟草、嚼烟和鼻烟通常是火烤的。
在另一个实施方式中，本发明描述了包括含有烟草的气雾形成材料的烟草产品，所述气雾形成材料包含来自本文所述的突变型烟草植物、转基因烟草植物或非天然存在的烟草植物的植物材料，例如叶，优选烘烤的叶。本文所述的烟草产品可以是混合的烟草产品，其还可包含未修饰的烟草。
当与源自非突变型、非天然存在的或非转基因的配对物的消费品相比较时，在这些可抽吸物品和无烟产品及其气雾中的烟碱量可低至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％和100％(诸如低约200％或300％)。
当与源自非突变型、非天然存在的或非转基因的配对物的消费品相比较时，在这些可抽吸物品和无烟产品及其气雾中的NNN量，可低至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％和100％，例如低约200％或300％。
当与源自非突变型、非天然存在的或非转基因的配对物的消费品相比较时，在这些可抽吸物品和无烟产品及其气雾中的烟碱量可低至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％和100％(诸如低约200％或300％)。与源自非突变型、非天然存在的或非转基因的配对物的消费品相比较，在这些可抽吸物品和无烟产品及其气雾中的烟碱量可大致相同。
当与源自非突变型、非天然存在的或非转基因的配对物的消费品相比较时，在这些可抽吸物品和无烟产品及其气雾中的总TSNA量，可低至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％和100％，例如低约200％或300％。
突变型、非天然存在的或转基因植物可具有在例如农业中的其他用途。例如，本文描述的突变型、非天然存在的或转基因植物可用于制备动物饲料和人食物产品。
培养本文所述的突变型植物、非天然存在的植物或转基因植物，并且从培养的植物中收集种子。来自本文所述植物的种子可通过本领域中已知的方式进行条件处理，且包装在包装材料中，以形成制造物品。包装材料例如纸和布是本领域众所周知的。种子的包装可带有描述其中种子的性质的标记，例如固定至包装材料的标签或标记、印刷在包装上的标记。
用于植物基因分型以鉴定、选择或育种的组合物、方法和试剂盒可包括检测多核苷酸样品中的多核苷酸(或如本文描述的其任何组合)存在的手段。相应地，本发明描述了组合物，其包含用于特异性扩增多核苷酸中的一种或多种的至少一部分的一个或多个引物，以及用于进行扩增或检测的任选的一个或多个探针和任选的一种或多种试剂。
相应地，本发明公开了基因特异性的寡核苷酸引物或探针，其包含对应于本文所述的一种或多种多核苷酸的约10个或更多个邻接多核苷酸。所述引物或探针可包含约15、20、25、30、40、45或50个或更多个邻接多核苷酸，或者由约15、20、25、30、40、45或50个或更多个邻接多核苷酸组成，所述引物或探针与本文所述的一种或多种多核苷酸杂交(例如，特异性地杂交)。约10至50个邻接核苷酸、约10至40个邻接核苷酸、约10至30个邻接核苷酸、或约15至30个邻接核苷酸，其可用于基因鉴定(例如，DNA杂交)、或分离(例如，细菌菌落或细菌噬菌体噬菌斑的原位杂交)、或基因检测(例如，作为核酸扩增或检测中的一个或多个扩增引物)的序列依赖性方法。可设计一个或多个特异性引物或探针，且用于扩增或检测一种或多种多核苷酸的部分或全部。作为具体例子，两个引物可用于聚合酶链反应方案中，以扩增编码核酸例如DNA或RNA的核酸片段。还可使用源自核酸序列的一个引物和第二引物(其与核酸序列上游或下游的序列杂交，所述序列诸如启动子序列、mRNA前体的3'末端或源自载体的序列)执行聚合酶链反应。可用于多核苷酸体外扩增的热和等温技术的例子是本领域众所周知的。样品可以是或可源自植物、植物细胞或植物材料，或者从如本文所述的植物、植物细胞或植物材料制备或衍生的烟草产品。
在另一个方面，本发明还提供了检测样品中本文所述的一种或多种多核苷酸(或如本文描述的其任何组合)的方法，其包括下述步骤：(a)提供包含或疑似包含多核苷酸的样品；(b)使所述样品与多个引物之一或一个或多个探针接触，用于特异性检测所述一种或多种多核苷酸的至少一部分；和(c)检测扩增产物的存在，其中所述扩增产物的存在指示样品中存在一种或多种多核苷酸。在进一步方面，本发明还提供了使用一个或多个引物或探针，用于特异性地检测一种或多种多核苷酸的至少一部分。本发明还提供了用于检测一种或多种多核苷酸的至少一部分的试剂盒，其包含用于特异性检测一种或多种多核苷酸的至少一部分的多个引物或探针之一。试剂盒可包含用于多核苷酸扩增(例如PCR)的试剂，或用于探针杂交检测技术(例如DNA印迹、RNA印迹、原位杂交或微阵列)的试剂。试剂盒可包含用于抗体结合检测技术(例如蛋白质印迹、ELISA、SELDI质谱法或测试条)的试剂。试剂盒可包含用于DNA测序的试剂。试剂盒可包括试剂和说明书，用于确定至少NNN含量及/或烟碱含量及/或总TSNA含量及/或降烟碱含量。适当地，试剂盒包括试剂和说明书，用于确定植物材料、经烘烤植物材料或经烘烤叶中的至少NNN含量及/或烟碱含量及/或总TSNA含量及/或降烟碱含量。
在一些实施方式中，试剂盒可包含用于所述方法中的一种或多种的说明书。所述试剂盒可用于遗传同一性确定、系统发育研究、基因分型、单倍体分型、谱系分析或植物育种，特别是共显性评分。
本发明还提供了对包含如本文所述的多核苷酸的植物、植物细胞或植物材料进行基因分型的方法。基因分型提供了区分染色体对的同源物的手段，并且可用于区分在植物群体中的分离子。分子标记方法可用于系统发育研究、表征作物品种之间的遗传关系、鉴定杂交或体细胞杂种、定位影响单基因性状的染色体节段、图位克隆和定量遗传研究。基因分型的具体方法可采用任意数目的分子标记分析技术，包括扩增片段长度多态性(AFLP)。AFLP是由核苷酸序列变异性引起的扩增片段之间的等位基因差异的产物。因此，本发明还提供了使用诸如AFLP分析这样的技术，来跟踪一种或多种基因或核酸、以及遗传连锁至这些基因或核酸的染色体序列的分离的手段。
在一个实施方式中，本发明还提供了来自本文所述的突变型、转基因和非天然存在的植物的烘烤的植物材料。例如，烘烤烟叶的工艺是本领域技术人员已知的，并且包括但不限于空气烘烤、火烘烤、烟熏和日光烘烤。烘烤绿色烟叶的工艺取决于收获的烟草类型。例如，弗吉尼亚烟烤(淡色)烟草通常是烟道烘烤的，白肋烟草和某些深色品系通常是晾干的，且烟斗烟草、嚼烟和鼻烟通常是火烤的。
在另一个实施方式中，本发明描述了烟草产品，其包括包含来自本文所述的突变型、转基因和非天然存在的植物的植物材料(例如叶，适当地烘烤的植物材料，例如烘烤的叶)的烟草产品，或通过本文所述的方法生产的烟草产品。本文所述的烟草产品还可包含未修饰的烟草。
在另一个实施方式中，本发明描述了烟草产品，其包含来自本文所述的突变型、转基因和非天然存在的植物的植物材料，优选叶，例如烘烤的叶。例如，所述植物材料可加入烟草产品内部或外部，并且因此在燃烧后释放期望的香气。根据此实施方式的烟草产品甚至可以是未修饰的烟草或经修饰的烟草。根据此实施方式的烟草产品甚至可源自突变型、转基因或非天然存在的植物，其在除了本文公开的基因之外的一种或多种基因中具有修饰。
本发明还在下文实例中描述，提供所述实例以更详细地描述本发明。这些实例阐述目前考虑用于进行本发明的优选方式，意欲举例说明而不是限制本发明。
实施
实例1
NND3表达水平的分析
为确定NND3的功能和其在烟碱转化中的作用，分析NND3的表达。为此目的，收获温室生长的N.烟草var.TN90的不同组织且经由定量PCR进行分析。
根据制造商的说明使用RNeasy Mini套件(Qiagen)进行RNA提取。将RNA样本稀释于水中以获得10μl最终体积的1μg RNA。然后用RQ1无RNase的DNase(Promega)进行DNase消化。使用RQ1DNase停止液(Promega)终止DNase反应。随即，进行反向转录酶(RT)反应以将RNA转化为互补DNA(cDNA)。对于RT反应，组合使用M-MLV反转录酶、RNase H Minus、PointMutant(Promega)与寡聚(dT)15引物。
使用Stratagene Mx3005P和对应的软件进行定量的即时PCR。对于每一靶向，根据M×3005P用户手册的准则设计不同的引物对。针对引物二聚体的形成和其在qPCR运行中的表现测试引物对。使用具有cDNA的五倍稀释的标准曲线测试其效率。排序PCR产品以便验证引物特异性地扩增其靶序列。由于不同的CYP82E基因在序列中是邻近的，因此引物设计是复杂的且所选择引物并非总是展示最佳效率。
效率的差异意指qPCR实验值为基因特异性且不表示绝对的表达值。因此，表达值中的比较是对各种组织间的每一基因有效而不是对基因间的每一基因有效。所采用的引物对和它们的效率列于表1中。在300nM的引物浓度下使用ABsolute Blue QPCR SYBR Greenlow ROX Mix(Thermo Scientific)。采用在qPCR中运行的95℃的变性温度，对于50个周期，最初持续15分钟，然后在每个周期中持续15秒，在60℃下15秒以供退火和在72℃下25秒以供延伸。将所有样本一式三份运行。此外，采用生物学一式三份。actin9基因(管家基因)的表达作为正规化子用于所有样本。
结果展示于图1中且证实CYP82E5和CYP82E10在绿叶中的表达。这些基因也高度表达于所测试的所有其它组织中。其呈现出非常类似的表达模式。在CYP82E4和NND3各自在花和根中呈现表达时，NND3在叶中未以可侦测水平表达，而CYP82E4唯一地在衰老叶子中呈现表达。对于引物特异性验证，纯化且排序PCR产物。含有NND3和CYP82E4的混合产物的根中针对NND3观测到较低信号，而来自花材料的产物仅含有NND3。
实例2
显示NND3针对功能性烟碱去甲基酶编码。
尽管所预测的蛋白质序列对已知的去甲基酶(诸如CYP82E4、CYP82E5和CYP82E10)表示高水平的同一性，不能从同一性推断它的功能，因为其已在细胞色素P450家族展示几个氨基酸差异足以改变或减轻基质特异性。
通过在烟草中的过度表达证实NND3的功能。为此目的，将过度表达构建体设计为在缺少功能性的CYP82E4、CYP82E5和CYP82E10基因的超低转换子白肋烟的植物背景下在MMV启动子的控制下编码待组成性地表达序列(SEQ ID NO:1)的NND3。
生成二十个独立的转基因株系。针对使用引物NND3_F6和NND3_R7(图2A)的NND3表达以及烟碱和降烟碱水平(图2B)分析转移至成熟植物的土壤和叶中初级转形体(T0)。分析五条控制线，其中bar和误差表示平均值和标准偏差。
在三次技术重复中进行表达分析。Bars和误差指示重复中的平均值和偏差(通过MxPro software,Stratagene来计算)。
因为未检测到信号，表达数据证实NND3不在TN90绿叶中表达。在不同的T0植物中测量的NND3表达水平因此与随时选择的NND3#3植物相关。在不同的植物的表达中观测到显著的变化。当在T0群中调查转基因表达时，这些结果是所期望的，因为每一植物是独立的转化事件的结果。因此，表达水平可根据转基因拷贝数或转基因的适当插入而在植物间大不相同。
在单次测量中针对烟碱或降烟碱分析相同的叶子样本。
通过HILIC-UPLC-UV/MS分析样本的烟碱和降烟碱含量。用MS检测量化降烟碱(pos.ESI；MRM模式；内部标准：降烟碱-d4)；使用在260nm处的烟碱UV检测。转化经计算为[降烟碱]/([降烟碱]+[烟碱])×100。
展示最高NND3表达的六个转基因株系(#10、#3、#16、#15、#17和#20)展现提高的烟碱转化。烟碱转化在TN90cyp82e4/cyp82e5/cyp82e10植物中是0.5％，且在MMV:NND3高表达线中增加到四倍。同样地，在呈现转基因的最低表达的植物中观测到与对照植物水平不可区分的较低水平的转化。
这些数据清楚地显示新鉴定的NND3基因编码功能性烟碱N-去甲基酶。
表1
用于NND3和相关CYP82E基因的表达分析的引物。
Figure BDA0001145126730000591
Figure BDA0001145126730000601
实例3
显示NND3沉默导致降低的烟碱转化
沉默的建构体设计为在缺少功能性的CYP82E4、CYP82E5和CYP82E10基因的超低转换子白肋烟植物背景下在MMV启动子的控制下组成性地表达。对于沉默的构建体，在由内含子序列(SEQ ID NO：4)分离的正向和反向方向上使用100bp序列。结果指示花中的NND3的沉默使得烟碱转化减少，其证实NND3酶不仅是功能性的，而且还有助于植物中的烟碱转化。
实例4
NND3在N.烟草var.斯特拉叶中在不同烘烤时间点的相对表达水平
NND3的相对表达水平和N.烟草变体中的相关的功能性CYP82E基因分析在不同烘烤时间点的斯特拉叶。从“绿”叶(上部叶位)中和收获期的成熟的“叶”(下部叶位)中采集样品。将叶子传送到空气烤房，且当烘烤开始(“0h”)时采集样品，随后12小时(“12h”)、24小时(“24h”)和48小时(“48h”)后再次采集样品。样本取自若干叶片的储备库。将两个池作为生物学重复(重复1(图3a)和重复2(图3b))分析。结果示于图3中。条状物表示三个技术重复的平均值±SD。由于不同的PCR效率，只能独立地且不能通过直接比较考虑不同CYP82E基因的表达水平。CYP82E5和CYP82E10在所有叶子样品中表达类似的程度。CYP82E4的表达在衰老叶子中激活且在烘烤条件下增加。在所有已分析条件下NND3不在叶子中表达。
在本文中引用的或描述的任何出版物提供了在本申请的提交日期之前公开的有关信息。本文中的陈述不应解释为承认：发明人丧失先于这样的公开的资格。在上面的说明书中提及的所有出版物通过引用并入本文。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明的各种修改和变化对于本领域技术人员是显而易见的。尽管已经结合具体优选实施方式描述了本发明，但应当理解，要求保护的发明不应当不适当地限于这样的具体实施方式。实际上，细胞生物学、分子生物学和植物生物学或有关领域的技术人员显而易见的用于实现本发明的所描述模式的不同改进意图在以下权利要求的范围内。
序列
SEQ ID NO:1(N.烟草TN90NND3-T基因的多核苷酸序列。内含子指示于小写字符中，编码序列加有下划线。启动和终止密码子以灰色突出显示。)
ATGGTTTTTCCCATAGAAGCCATTGTAGGACTAGTAACCTTCACATTTCTCTTCTACTTCCTATGGAC AAAAAAATCTCAAAAACCTTCAAAACCCTTACCACCGAAAATCCCCGGAGGATGGCCGGTAATTGGCCATCTTTTC CACTTCAATGACGACGGCAACGACCGTCCATTAGCTCGAAAACTCGGAGACTTAGCTGACAAATACGGCCCCGTTT TCACTTTTCGGCTAGGCCTTCCCCTTGTGTTAGTTGTAAGCAGTTACGAAGCTATAAAAGACTGTTTCTCTACAAA TGATGCCATTTTCTCTAATCGTCCAGCTTTTCTTTACGGCGAATACCTTGGCTACAATAATGCCATGCTATTTTTG GCAAATTACGGACCTTACTGGCGAAAAAATCGTAAATTAGTTATTCAGGAAGTTCTCTCAGCTAGTCGTCTCAAAA AATTCAAACACGTGAGATTCGCCAGAATTCAAACGAGCATTAAGAATTTATACACTCGAATTGATAGAAATTCGAG TACGATAAATTTAACTGATTGGTTAGAAGAATTGAATTTTGGTCTCATCGTGAAGATGATAGCTGGGAAAAATTAT GAATCCGGTAAAGGAGATGAACAAGTGGAGAGATTTAAGAAAGCGTTTAAGGATTTTATGATTATATCAATGGAGT TTGTGTTATGGGATGCATTTCCAATTCCATTATTTAAATGGGTGGATTTTCAAGGGCATGTTAAGGCTATGAAAAG GACATTTAAGGATATAGATTCTGTTTTTCAGAATTGGTTAGAGGAACATATTAACAAAAGAGAAAAAATGGAGGTT AATGCAGAAGGGAATGAACAAGATTTCATTGATGTGGTGCTTTCAAAAATGAGTAATGAATATCTTGGTGAAGGTT ACTCTCGTGATACTGTCATAAAAGCAACAGTTTTTgtaagttcatctgtcactcccgaattctgcttgaatgcagacaccgagttgcctttttattagactatctaaatattaaggatgattatatatagcaaaaatatagtaggatttctcgggctttgggatagaagaatattcatcattatataacttttgatggtaaaagatgagatctaacctcttataattgcccaaccacgttgatatatagaacaaaacctttttactcccattgagcataacgaaaatgaaagcaaagggacttcttctcttttttaggaaaaaaatctttgattgcttgttgaatatacattcatgtttttctttttctatttctaataataatggtgcttgaatcaggttgcgtgcctcgtgacttttgagaaaaaaaaacaaattcattagtataatgaggtgtgcatacttgacaactactatactaactagaacaaggttcggcagataatgacgctaacctacttttatattgaattatcatttgtatttaactgtattctattttgtccacagAGTTTGGTCTTGGATGCTGCGGACACAGTTGCTCTTCAC ATAAATTGGGGTATGGCATTACTGATCAACAATCAAAATGCCTTGAAGAAAGCACAAGAAGAGATAGACACAAAAGT TGGCAAGGATAGATGGGTAGAAGAGAGTGATATTAAGGATTTGGTGTACCTCCAAGCTATTGTTAAAGAAGTGTTAC GATTATATCCACCGGGACCTTTGTTAGTACCACATGAAAATATAGAGGATTGTGTTGTTAGTGGATATTACATTTCT AAAGGGACTAGACTATTCGCAAATGTTATGAAACTGCAGCGCGATCCTAAACTCTGGCCAAATCCTGATAATTTCGA TCCAGAGAGATTTGTCGCTGCAGGTATTGACTTTCGTGGTCAGCATTATGAGTATATCCCGTTTGGTTCTGGAAGAC GATCTTGTCCGGGGATGACTTATGCATTGCAAGTGGAACACTTAACAATGGCACATTTGATCCAGGGTTTCAATTAC AGCACTCCAAATGACGAGCCCTTGGATATGAAGGAAGGTGCAGGTATAACTATACGTAAGGTAAATCCCGTGGAAGT GATAATTATGCCTCGCCTGGCACCTGAGCTTTATTAA
SEQ ID NO:2(多核苷酸编码在MMV启动子的控制下在过度表达构建体中使用的NND3的序列)。
ATGGTTTTTCCCATAGAAGCCATTGTAGGACTAGTAACCTTCACATTTCTCTTCTACTTCCTATGGACAAAAAAATCTCAAAAACCTTCAAAACCCTTACCACCGAAAATCCCCGGAGGATGGCCGGTAATTGGCCATCTTTTCCACTTCAATGACGACGGCAACGACCGTCCATTAGCTCGAAAACTCGGAGACTTAGCTGACAAATACGGCCCCGTTTTCACTTTTCGGCTAGGCCTTCCCCTTGTGTTAGTTGTAAGCAGTTACGAAGCTATAAAAGACTGTTTCTCTACAAATGATGCCATTTTCTCTAATCGTCCAGCTTTTCTTTACGGCGAATACCTTGGCTACAATAATGCCATGCTATTTTTGGCAAATTACGGACCTTACTGGCGAAAAAATCGTAAATTAGTTATTCAGGAAGTTCTCTCAGCTAGTCGTCTCAAAAAATTCAAACACGTGAGATTCGCCAGAATTCAAACGAGCATTAAGAATTTATACACTCGAATTGATAGAAATTCGAGTACGATAAATTTAACTGATTGGTTAGAAGAATTGAATTTTGGTCTCATCGTGAAGATGATAGCTGGGAAAAATTATGAATCCGGTAAAGGAGATGAACAAGTGGAGAGATTTAAGAAAGCGTTTAAGGATTTTATGATTATATCAATGGAGTTTGTGTTATGGGATGCATTTCCAATTCCATTATTTAAATGGGTGGATTTTCAAGGGCATGTTAAGGCTATGAAAAGGACATTTAAGGATATAGATTCTGTTTTTCAGAATTGGTTAGAGGAACATATTAACAAAAGAGAAAAAATGGAGGTTAATGCAGAAGGGAATGAACAAGATTTCATTGATGTGGTGCTTTCAAAAATGAGTAATGAATATCTTGGTGAAGGTTACTCTCGTGATACTGTCATAAAAGCAACAGTTTTTAGTTTGGTCTTGGATGCTGCGGACACAGTTGCTCTTCACATAAATTGGGGTATGGCATTACTGATCAACAATCAAAATGCCTTGAAGAAAGCACAAGAAGAGATAGACACAAAAGTTGGCAAGGATAGATGGGTAGAAGAGAGTGATATTAAGGATTTGGTGTACCTCCAAGCTATTGTTAAAGAAGTGTTACGATTATATCCACCGGGACCTTTGTTAGTACCACATGAAAATATAGAGGATTGTGTTGTTAGTGGATATTACATTTCTAAAGGGACTAGACTATTCGCAAATGTTATGAAACTGCAGCGCGATCCTAAACTCTGGCCAAATCCTGATAATTTCGATCCAGAGAGATTTGTCGCTGCAGGTATTGACTTTCGTGGTCAGCATTATGAGTATATCCCGTTTGGTTCTGGAAGACGATCTTGTCCGGGGATGACTTATGCATTGCAAGTGGAACACTTAACAATGGCACATTTGATCCAGGGTTTCAATTACAGCACTCCAAATGACGAGCCCTTGGATATGAAGGAAGGTGCAGGTATAACTATACGTAAGGTAAATCCCGTGGAAGTGATAATTATGCCTCGCCTGGCACCTGAGCTTTATTAA
SEQ ID NO:3(N.烟草TN90NND3蛋白质序列的多肽序列)
MVFPIEAIVGLVTFTFLFYFLWTKKSQKPSKPLPPKIPGGWPVIGHLFHFNDDGNDRPLARKLGDLADKYGPVFTFRLGLPLVLVVSSYEAIKDCFSTNDAIFSNRPAFLYGEYLGYNNAMLFLANYGPYWRKNRKLVIQEVLSASRLKKFKHVRFARIQTSIKNLYTRIDRNSSTINLTDWLEELNFGLIVKMIAGKNYESGKGDEQVERFKKAFKDFMIISMEFVLWDAFPIPLFKWVDFQGHVKAMKRTFKDIDSVFQNWLEEHINKREKMEVNAEGNEQDFIDVVLSKMSNEYLGEGYSRDTVIKATVFSLVLDAADTVALHINWGMALLINNQNALKKAQEEIDTKVGKDRWVEESDIKDLVYLQAIVKEVLRLYPPGPLLVPHENIEDCVVSGYYISKGTRLFANVMKLQRDPKLWPNPDNFDPERFVAAGIDFRGQHYEYIPFGSGRRSCPGMTYALQVEHLTMAHLIQGFNYSTPNDEPLDMKEGAGITIRKVNPVEVIIMPRLAPELY
SEQ ID NO:4(多核苷酸在由在IPMS2基因中发现的内含子序列分离的正向和方向方向上使用NND3的100bp独特的序列排序RNAi构建体。内含子指示于小写字符中)。
GCGATCCTAAACTCTGGCCAAATCCTGATAATTTCGATCCAGAGAGATTTGTCGCTGCAGGTATTGAC TTTCGTGGTCAGCATTATGAGTATATCCCGTTtggtaacctttaatgtttaaccgttcacatttctaatatttacttatttgtaacatgtcgtcacgtgttagtttcattctttttatgaaccaaacatgcatgcaaagatatttttagatatttggacggcgagtgagatttgaaactaggaccgtttgcctgatacaatattaaaatatgtaaccattttatgtacaagtttaaactgttgatagtagcatattttttacttttatttaagtatactatattccaacaggtaagttaacAAC GGGATATACTCATAATGCTGACCACGAAAGTCAATACCTGCAGCGACAAATCTCTCTGGATCGAAATTATCAGGATT TGGCCAGAGTTTAGGATCGC
SEQ ID NO:5(CYP82E4烟碱去甲基酶的蛋白质序列)
Figure BDA0001145126730000631
Figure BDA0001145126730000641
SEQ ID NO:6(P38L变体CYP82E4烟碱去甲基酶的蛋白质序列)
Figure BDA0001145126730000652
Figure BDA0001145126730000661
SEQ ID NO:7(D171N变体CYP82E4烟碱去甲基酶的蛋白质序列)
Figure BDA0001145126730000662
Figure BDA0001145126730000671
Figure BDA0001145126730000681
SEQ ID NO:8(E201K变体CYP82E4烟碱去甲基酶的蛋白质序列)
Figure BDA0001145126730000682
Figure BDA0001145126730000691
Figure BDA0001145126730000701
SEQ ID NO:9(R169Q变体CYP82E4烟碱去甲基酶的蛋白质序列)
Figure BDA0001145126730000702
Figure BDA0001145126730000711
SEQ ID NO:10(G459R变体CYP82E4烟碱去甲基酶的蛋白质序列)
Figure BDA0001145126730000721
Figure BDA0001145126730000731
SEQ ID NO:11(T427I变体CYP82E4烟碱去甲基酶的蛋白质序列)
Figure BDA0001145126730000732
Figure BDA0001145126730000741
Figure BDA0001145126730000751
SEQ ID NO:12(V376M变体CYP82E4烟碱去甲基酶的蛋白质序列)
Figure BDA0001145126730000752
Figure BDA0001145126730000761
Figure BDA0001145126730000771
SEQ ID NO:13(W329Stop变体CYP82E4烟碱去甲基酶的蛋白质序列)
Figure BDA0001145126730000772
Figure BDA0001145126730000781
SEQ ID NO:14(K364N变体CYP82E4烟碱去甲基酶的蛋白质序列)
Figure BDA0001145126730000782
Figure BDA0001145126730000791
SEQ ID NO:15(P382S变体CYP82E4烟碱去甲基酶的蛋白质序列)
Figure BDA0001145126730000801
Figure BDA0001145126730000811
SEQ ID NO:16(P458S变体CYP82E4烟碱去甲基酶的蛋白质序列)
Figure BDA0001145126730000812
Figure BDA0001145126730000821
Figure BDA0001145126730000831
SEQ ID NO:17(CYP82E5烟碱去甲基酶的蛋白质序列)
Figure BDA0001145126730000832
Figure BDA0001145126730000841
Figure BDA0001145126730000851
SEQ ID NO:18(CYP82E5烟碱去甲基酶的P72L变体的蛋白质序列)
Figure BDA0001145126730000852
Figure BDA0001145126730000861
SEQ ID NO:19(CYP82E5烟碱去甲基酶的L143F变体的蛋白质序列)
Figure BDA0001145126730000862
Figure BDA0001145126730000871
Figure BDA0001145126730000881
SEQ ID NO:20(CYP82E5烟碱去甲基酶的S174L变体的蛋白质序列)
Figure BDA0001145126730000882
Figure BDA0001145126730000891
Figure BDA0001145126730000901
SEQ ID NO:21(CYP82E5烟碱去甲基酶的M224I变体的蛋白质序列)
Figure BDA0001145126730000902
Figure BDA0001145126730000911
SEQ ID NO:22(CYP82E5烟碱去甲基酶的P235S变体的蛋白质序列)
Figure BDA0001145126730000922
Figure BDA0001145126730000931
SEQ ID NO:23(CYP82E5烟碱去甲基酶的A410V变体的蛋白质序列)
Figure BDA0001145126730000932
Figure BDA0001145126730000941
Figure BDA0001145126730000951
SEQ ID NO:24(CYP82E5烟碱去甲基酶的W422Stop变体的蛋白质序列)
Figure BDA0001145126730000952
Figure BDA0001145126730000961
SEQ ID NO:25(CYP82E5烟碱去甲基酶的P449L变体的蛋白质序列)
Figure BDA0001145126730000962
Figure BDA0001145126730000971
Figure BDA0001145126730000981
SEQ ID NO:26(CYP82E10烟碱去甲基酶的蛋白质序列)
Figure BDA0001145126730000982
Figure BDA0001145126730000991
Figure BDA0001145126730001001
SEQ ID NO:27(CYP82E10烟碱去甲基酶的L148F变体的蛋白质序列)
Figure BDA0001145126730001002
Figure BDA0001145126730001011
Figure BDA0001145126730001021
SEQ ID NO:28(CYP82E10烟碱去甲基酶的G172R变体的蛋白质序列)
Figure BDA0001145126730001022
Figure BDA0001145126730001031
SEQ ID NO:29(CYP82E10烟碱去甲基酶的A344T变体的蛋白质序列)
Figure BDA0001145126730001032
Figure BDA0001145126730001041
Figure BDA0001145126730001051
SEQ ID NO:30(CYP82E10烟碱去甲基酶的A410T变体的蛋白质序列)
Figure BDA0001145126730001052
Figure BDA0001145126730001061
Figure BDA0001145126730001071
SEQ ID NO:31(CYP82E10烟碱去甲基酶的R417H变体的蛋白质序列)
Figure BDA0001145126730001072
Figure BDA0001145126730001081
SEQ ID NO:32(CYP82E10烟碱去甲基酶的P419S变体的蛋白质序列)
Figure BDA0001145126730001091
Figure BDA0001145126730001101
SEQ ID NO:33(CYP82E10烟碱去甲基酶的G79S变体的蛋白质序列)
Figure BDA0001145126730001102
Figure BDA0001145126730001111
Figure BDA0001145126730001121
SEQ ID NO:34(CYP82E10烟碱去甲基酶的P107S变体的蛋白质序列)
Figure BDA0001145126730001122
Figure BDA0001145126730001131
Figure BDA0001145126730001141
SEQ ID NO:35(CYP82E10烟碱去甲基酶的P382S变体的蛋白质序列)
Figure BDA0001145126730001142
Figure BDA0001145126730001151
序列表
<110> 菲利普莫里斯产品有限公司
<120> 植物中烟碱向降烟碱转化的减少
<130> P4362PC00
<150> EP 14167598.3
<151> 2014-05-08
<150> EP 14001645.2
<151> 2014-05-09
<160> 47
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 2088
<212> DNA
<213> 烟草
<400> 1
atggtttttc ccatagaagc cattgtagga ctagtaacct tcacatttct cttctacttc 60
ctatggacaa aaaaatctca aaaaccttca aaacccttac caccgaaaat ccccggagga 120
tggccggtaa ttggccatct tttccacttc aatgacgacg gcaacgaccg tccattagct 180
cgaaaactcg gagacttagc tgacaaatac ggccccgttt tcacttttcg gctaggcctt 240
ccccttgtgt tagttgtaag cagttacgaa gctataaaag actgtttctc tacaaatgat 300
gccattttct ctaatcgtcc agcttttctt tacggcgaat accttggcta caataatgcc 360
atgctatttt tggcaaatta cggaccttac tggcgaaaaa atcgtaaatt agttattcag 420
gaagttctct cagctagtcg tctcaaaaaa ttcaaacacg tgagattcgc cagaattcaa 480
acgagcatta agaatttata cactcgaatt gatagaaatt cgagtacgat aaatttaact 540
gattggttag aagaattgaa ttttggtctc atcgtgaaga tgatagctgg gaaaaattat 600
gaatccggta aaggagatga acaagtggag agatttaaga aagcgtttaa ggattttatg 660
attatatcaa tggagtttgt gttatgggat gcatttccaa ttccattatt taaatgggtg 720
gattttcaag ggcatgttaa ggctatgaaa aggacattta aggatataga ttctgttttt 780
cagaattggt tagaggaaca tattaacaaa agagaaaaaa tggaggttaa tgcagaaggg 840
aatgaacaag atttcattga tgtggtgctt tcaaaaatga gtaatgaata tcttggtgaa 900
ggttactctc gtgatactgt cataaaagca acagtttttg taagttcatc tgtcactccc 960
gaattctgct tgaatgcaga caccgagttg cctttttatt agactatcta aatattaagg 1020
atgattatat atagcaaaaa tatagtagga tttctcgggc tttgggatag aagaatattc 1080
atcattatat aacttttgat ggtaaaagat gagatctaac ctcttataat tgcccaacca 1140
cgttgatata tagaacaaaa cctttttact cccattgagc ataacgaaaa tgaaagcaaa 1200
gggacttctt ctctttttta ggaaaaaaat ctttgattgc ttgttgaata tacattcatg 1260
tttttctttt tctatttcta ataataatgg tgcttgaatc aggttgcgtg cctcgtgact 1320
tttgagaaaa aaaaacaaat tcattagtat aatgaggtgt gcatacttga caactactat 1380
actaactaga acaaggttcg gcagataatg acgctaacct acttttatat tgaattatca 1440
tttgtattta actgtattct attttgtcca cagagtttgg tcttggatgc tgcggacaca 1500
gttgctcttc acataaattg gggtatggca ttactgatca acaatcaaaa tgccttgaag 1560
aaagcacaag aagagataga cacaaaagtt ggcaaggata gatgggtaga agagagtgat 1620
attaaggatt tggtgtacct ccaagctatt gttaaagaag tgttacgatt atatccaccg 1680
ggacctttgt tagtaccaca tgaaaatata gaggattgtg ttgttagtgg atattacatt 1740
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<210> 2
<211> 1554
<212> DNA
<213> 烟草
<400> 2
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cgaaaactcg gagacttagc tgacaaatac ggccccgttt tcacttttcg gctaggcctt 240
ccccttgtgt tagttgtaag cagttacgaa gctataaaag actgtttctc tacaaatgat 300
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<210> 3
<211> 517
<212> PRT
<213> 烟草
<400> 3
Met Val Phe Pro Ile Glu Ala Ile Val Gly Leu Val Thr Phe Thr Phe
1 5 10 15
Leu Phe Tyr Phe Leu Trp Thr Lys Lys Ser Gln Lys Pro Ser Lys Pro
20 25 30
Leu Pro Pro Lys Ile Pro Gly Gly Trp Pro Val Ile Gly His Leu Phe
35 40 45
His Phe Asn Asp Asp Gly Asn Asp Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly
50 55 60
Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Pro Val Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu
65 70 75 80
Pro Leu Val Leu Val Val Ser Ser Tyr Glu Ala Ile Lys Asp Cys Phe
85 90 95
Ser Thr Asn Asp Ala Ile Phe Ser Asn Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly
100 105 110
Glu Tyr Leu Gly Tyr Asn Asn Ala Met Leu Phe Leu Ala Asn Tyr Gly
115 120 125
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Val Ile Gln Glu Val Leu Ser
130 135 140
Ala Ser Arg Leu Lys Lys Phe Lys His Val Arg Phe Ala Arg Ile Gln
145 150 155 160
Thr Ser Ile Lys Asn Leu Tyr Thr Arg Ile Asp Arg Asn Ser Ser Thr
165 170 175
Ile Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu Ile Val
180 185 190
Lys Met Ile Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gln
195 200 205
Val Glu Arg Phe Lys Lys Ala Phe Lys Asp Phe Met Ile Ile Ser Met
210 215 220
Glu Phe Val Leu Trp Asp Ala Phe Pro Ile Pro Leu Phe Lys Trp Val
225 230 235 240
Asp Phe Gln Gly His Val Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp Ile
245 250 255
Asp Ser Val Phe Gln Asn Trp Leu Glu Glu His Ile Asn Lys Arg Glu
260 265 270
Lys Met Glu Val Asn Ala Glu Gly Asn Glu Gln Asp Phe Ile Asp Val
275 280 285
Val Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Gly Glu Gly Tyr Ser Arg
290 295 300
Asp Thr Val Ile Lys Ala Thr Val Phe Ser Leu Val Leu Asp Ala Ala
305 310 315 320
Asp Thr Val Ala Leu His Ile Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu Ile Asn
325 330 335
Asn Gln Asn Ala Leu Lys Lys Ala Gln Glu Glu Ile Asp Thr Lys Val
340 345 350
Gly Lys Asp Arg Trp Val Glu Glu Ser Asp Ile Lys Asp Leu Val Tyr
355 360 365
Leu Gln Ala Ile Val Lys Glu Val Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro
370 375 380
Leu Leu Val Pro His Glu Asn Ile Glu Asp Cys Val Val Ser Gly Tyr
385 390 395 400
Tyr Ile Ser Lys Gly Thr Arg Leu Phe Ala Asn Val Met Lys Leu Gln
405 410 415
Arg Asp Pro Lys Leu Trp Pro Asn Pro Asp Asn Phe Asp Pro Glu Arg
420 425 430
Phe Val Ala Ala Gly Ile Asp Phe Arg Gly Gln His Tyr Glu Tyr Ile
435 440 445
Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly Met Thr Tyr Ala Leu
450 455 460
Gln Val Glu His Leu Thr Met Ala His Leu Ile Gln Gly Phe Asn Tyr
465 470 475 480
Ser Thr Pro Asn Asp Glu Pro Leu Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly Ile
485 490 495
Thr Ile Arg Lys Val Asn Pro Val Glu Val Ile Ile Met Pro Arg Leu
500 505 510
Ala Pro Glu Leu Tyr
515
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<211> 469
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：多核苷酸序列，在正向和反向上使用100bp单一序列NND3的RNAi构建体，其由IPMS2基因中发现的内含子序列分离
<400> 4
gcgatcctaa actctggcca aatcctgata atttcgatcc agagagattt gtcgctgcag 60
gtattgactt tcgtggtcag cattatgagt atatcccgtt tggtaacctt taatgtttaa 120
ccgttcacat ttctaatatt tacttatttg taacatgtcg tcacgtgtta gtttcattct 180
ttttatgaac caaacatgca tgcaaagata tttttagata tttggacggc gagtgagatt 240
tgaaactagg accgtttgcc tgatacaata ttaaaatatg taaccatttt atgtacaagt 300
ttaaactgtt gatagtagca tattttttac ttttatttaa gtatactata ttccaacagg 360
taagttaaca acgggatata ctcataatgc tgaccacgaa agtcaatacc tgcagcgaca 420
aatctctctg gatcgaaatt atcaggattt ggccagagtt taggatcgc 469
<210> 5
<211> 517
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：CYP82E4烟碱去甲基酶的蛋白质序列
<400> 5
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50 55 60
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65 70 75 80
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145 150 155 160
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165 170 175
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Asp Phe Gln Gly His Val Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp Ile
245 250 255
Asp Ser Val Phe Gln Asn Trp Leu Glu Glu His Ile Asn Lys Arg Glu
260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
Asp Thr Val Ala Leu His Ile Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu Ile Asn
325 330 335
Asn Gln Lys Ala Leu Thr Lys Ala Gln Glu Glu Ile Asp Thr Lys Val
340 345 350
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355 360 365
Leu Gln Ala Ile Val Lys Glu Val Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro
370 375 380
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Ala Pro Glu Leu Tyr
515
<210> 6
<211> 517
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：P38L变体CYP82E4烟碱去甲基酶的蛋白质序列
<400> 6
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1 5 10 15
Leu Phe Phe Phe Leu Trp Thr Lys Lys Ser Gln Lys Pro Ser Lys Pro
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145 150 155 160
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165 170 175
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245 250 255
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Lys Met Glu Val Asn Ala Glu Gly Asn Glu Gln Asp Phe Ile Asp Val
275 280 285
Val Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Gly Glu Gly Tyr Ser Arg
290 295 300
Asp Thr Val Ile Lys Ala Thr Val Phe Ser Leu Val Leu Asp Ala Ala
305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
Gly Lys Asp Arg Trp Val Glu Glu Ser Asp Ile Lys Asp Leu Val Tyr
355 360 365
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370 375 380
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515
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<211> 517
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：D171N变体CYP82E4烟碱去甲基酶的蛋白质序列
<400> 7
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1 5 10 15
Leu Phe Phe Phe Leu Trp Thr Lys Lys Ser Gln Lys Pro Ser Lys Pro
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Leu Pro Pro Lys Ile Pro Gly Gly Trp Pro Val Ile Gly His Leu Phe
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100 105 110
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115 120 125
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Val Ile Gln Glu Val Leu Ser
130 135 140
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Phe Lys His Val Arg Phe Ala Arg Ile Gln
145 150 155 160
Ala Ser Ile Lys Asn Leu Tyr Thr Arg Ile Asn Gly Asn Ser Ser Thr
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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245 250 255
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325 330 335
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355 360 365
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370 375 380
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500 505 510
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515
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<211> 517
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：E210K变体CYP82E4烟碱去甲基酶的蛋白质序列
<400> 8
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1 5 10 15
Leu Phe Phe Phe Leu Trp Thr Lys Lys Ser Gln Lys Pro Ser Lys Pro
20 25 30
Leu Pro Pro Lys Ile Pro Gly Gly Trp Pro Val Ile Gly His Leu Phe
35 40 45
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100 105 110
Asp Tyr Leu Gly Tyr Asn Asn Ala Met Leu Phe Leu Ala Asn Tyr Gly
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225 230 235 240
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245 250 255
Asp Ser Val Phe Gln Asn Trp Leu Glu Glu His Ile Asn Lys Arg Glu
260 265 270
Lys Met Glu Val Asn Ala Glu Gly Asn Glu Gln Asp Phe Ile Asp Val
275 280 285
Val Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Gly Glu Gly Tyr Ser Arg
290 295 300
Asp Thr Val Ile Lys Ala Thr Val Phe Ser Leu Val Leu Asp Ala Ala
305 310 315 320
Asp Thr Val Ala Leu His Ile Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu Ile Asn
325 330 335
Asn Gln Lys Ala Leu Thr Lys Ala Gln Glu Glu Ile Asp Thr Lys Val
340 345 350
Gly Lys Asp Arg Trp Val Glu Glu Ser Asp Ile Lys Asp Leu Val Tyr
355 360 365
Leu Gln Ala Ile Val Lys Glu Val Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro
370 375 380
Leu Leu Val Pro His Glu Asn Val Glu Asp Cys Val Val Ser Gly Tyr
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435 440 445
Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly Met Thr Tyr Ala Leu
450 455 460
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500 505 510
Ala Pro Glu Leu Tyr
515
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<211> 517
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：R169Q变体CYP82E4烟碱去甲基酶的蛋白质序列
<400> 9
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Leu Phe Phe Phe Leu Trp Thr Lys Lys Ser Gln Lys Pro Ser Lys Pro
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Leu Pro Pro Lys Ile Pro Gly Gly Trp Pro Val Ile Gly His Leu Phe
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Ile Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu Ile Val
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Val Glu Arg Phe Lys Lys Ala Phe Lys Asp Phe Met Ile Leu Ser Met
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Glu Phe Val Leu Trp Asp Ala Phe Pro Ile Pro Leu Phe Lys Trp Val
225 230 235 240
Asp Phe Gln Gly His Val Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp Ile
245 250 255
Asp Ser Val Phe Gln Asn Trp Leu Glu Glu His Ile Asn Lys Arg Glu
260 265 270
Lys Met Glu Val Asn Ala Glu Gly Asn Glu Gln Asp Phe Ile Asp Val
275 280 285
Val Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Gly Glu Gly Tyr Ser Arg
290 295 300
Asp Thr Val Ile Lys Ala Thr Val Phe Ser Leu Val Leu Asp Ala Ala
305 310 315 320
Asp Thr Val Ala Leu His Ile Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu Ile Asn
325 330 335
Asn Gln Lys Ala Leu Thr Lys Ala Gln Glu Glu Ile Asp Thr Lys Val
340 345 350
Gly Lys Asp Arg Trp Val Glu Glu Ser Asp Ile Lys Asp Leu Val Tyr
355 360 365
Leu Gln Ala Ile Val Lys Glu Val Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro
370 375 380
Leu Leu Val Pro His Glu Asn Val Glu Asp Cys Val Val Ser Gly Tyr
385 390 395 400
His Ile Pro Lys Gly Thr Arg Leu Phe Ala Asn Val Met Lys Leu Gln
405 410 415
Arg Asp Pro Lys Leu Trp Ser Asp Pro Asp Thr Phe Asp Pro Glu Arg
420 425 430
Phe Ile Ala Thr Asp Ile Asp Phe Arg Gly Gln Tyr Tyr Lys Tyr Ile
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485 490 495
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500 505 510
Ala Pro Glu Leu Tyr
515
<210> 10
<211> 517
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：G459R变体CYP82E4烟碱去甲基酶的蛋白质序列
<400> 10
Met Leu Ser Pro Ile Glu Ala Ile Val Gly Leu Val Thr Phe Thr Phe
1 5 10 15
Leu Phe Phe Phe Leu Trp Thr Lys Lys Ser Gln Lys Pro Ser Lys Pro
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Leu Pro Pro Lys Ile Pro Gly Gly Trp Pro Val Ile Gly His Leu Phe
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Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Val Ile Gln Glu Val Leu Ser
130 135 140
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Phe Lys His Val Arg Phe Ala Arg Ile Gln
145 150 155 160
Ala Ser Ile Lys Asn Leu Tyr Thr Arg Ile Asp Gly Asn Ser Ser Thr
165 170 175
Ile Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu Ile Val
180 185 190
Lys Met Ile Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gln
195 200 205
Val Glu Arg Phe Lys Lys Ala Phe Lys Asp Phe Met Ile Leu Ser Met
210 215 220
Glu Phe Val Leu Trp Asp Ala Phe Pro Ile Pro Leu Phe Lys Trp Val
225 230 235 240
Asp Phe Gln Gly His Val Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp Ile
245 250 255
Asp Ser Val Phe Gln Asn Trp Leu Glu Glu His Ile Asn Lys Arg Glu
260 265 270
Lys Met Glu Val Asn Ala Glu Gly Asn Glu Gln Asp Phe Ile Asp Val
275 280 285
Val Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Gly Glu Gly Tyr Ser Arg
290 295 300
Asp Thr Val Ile Lys Ala Thr Val Phe Ser Leu Val Leu Asp Ala Ala
305 310 315 320
Asp Thr Val Ala Leu His Ile Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu Ile Asn
325 330 335
Asn Gln Lys Ala Leu Thr Lys Ala Gln Glu Glu Ile Asp Thr Lys Val
340 345 350
Gly Lys Asp Arg Trp Val Glu Glu Ser Asp Ile Lys Asp Leu Val Tyr
355 360 365
Leu Gln Ala Ile Val Lys Glu Val Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro
370 375 380
Leu Leu Val Pro His Glu Asn Val Glu Asp Cys Val Val Ser Gly Tyr
385 390 395 400
His Ile Pro Lys Gly Thr Arg Leu Phe Ala Asn Val Met Lys Leu Gln
405 410 415
Arg Asp Pro Lys Leu Trp Ser Asp Pro Asp Thr Phe Asp Pro Glu Arg
420 425 430
Phe Ile Ala Thr Asp Ile Asp Phe Arg Gly Gln Tyr Tyr Lys Tyr Ile
435 440 445
Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser Cys Pro Arg Met Thr Tyr Ala Leu
450 455 460
Gln Val Glu His Leu Thr Met Ala His Leu Ile Gln Gly Phe Asn Tyr
465 470 475 480
Arg Thr Pro Asn Asp Glu Pro Leu Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly Ile
485 490 495
Thr Ile Arg Lys Val Asn Pro Val Glu Leu Ile Ile Ala Pro Arg Leu
500 505 510
Ala Pro Glu Leu Tyr
515
<210> 11
<211> 517
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：T427I变体CYP82E4烟碱去甲基酶的蛋白质序列
<400> 11
Met Leu Ser Pro Ile Glu Ala Ile Val Gly Leu Val Thr Phe Thr Phe
1 5 10 15
Leu Phe Phe Phe Leu Trp Thr Lys Lys Ser Gln Lys Pro Ser Lys Pro
20 25 30
Leu Pro Pro Lys Ile Pro Gly Gly Trp Pro Val Ile Gly His Leu Phe
35 40 45
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Val Ile Gln Glu Val Leu Ser
130 135 140
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Phe Lys His Val Arg Phe Ala Arg Ile Gln
145 150 155 160
Ala Ser Ile Lys Asn Leu Tyr Thr Arg Ile Asp Gly Asn Ser Ser Thr
165 170 175
Ile Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu Ile Val
180 185 190
Lys Met Ile Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gln
195 200 205
Val Glu Arg Phe Lys Lys Ala Phe Lys Asp Phe Met Ile Leu Ser Met
210 215 220
Glu Phe Val Leu Trp Asp Ala Phe Pro Ile Pro Leu Phe Lys Trp Val
225 230 235 240
Asp Phe Gln Gly His Val Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp Ile
245 250 255
Asp Ser Val Phe Gln Asn Trp Leu Glu Glu His Ile Asn Lys Arg Glu
260 265 270
Lys Met Glu Val Asn Ala Glu Gly Asn Glu Gln Asp Phe Ile Asp Val
275 280 285
Val Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Gly Glu Gly Tyr Ser Arg
290 295 300
Asp Thr Val Ile Lys Ala Thr Val Phe Ser Leu Val Leu Asp Ala Ala
305 310 315 320
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450 455 460
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465 470 475 480
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515
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<211> 517
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：V376M变体CYP82E4烟碱去甲基酶的蛋白质序列
<400> 12
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180 185 190
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225 230 235 240
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260 265 270
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325 330 335
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515
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：W329Stop变体CYP82E4烟碱去甲基酶的蛋白质序列
<400> 13
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325
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<211> 517
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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515
<210> 15
<211> 517
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：P382S变体CYP82E4烟碱去甲基酶的蛋白质序列
<400> 15
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130 135 140
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165 170 175
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180 185 190
Lys Met Ile Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gln
195 200 205
Val Glu Arg Phe Lys Lys Ala Phe Lys Asp Phe Met Ile Leu Ser Met
210 215 220
Glu Phe Val Leu Trp Asp Ala Phe Pro Ile Pro Leu Phe Lys Trp Val
225 230 235 240
Asp Phe Gln Gly His Val Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp Ile
245 250 255
Asp Ser Val Phe Gln Asn Trp Leu Glu Glu His Ile Asn Lys Arg Glu
260 265 270
Lys Met Glu Val Asn Ala Glu Gly Asn Glu Gln Asp Phe Ile Asp Val
275 280 285
Val Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Gly Glu Gly Tyr Ser Arg
290 295 300
Asp Thr Val Ile Lys Ala Thr Val Phe Ser Leu Val Leu Asp Ala Ala
305 310 315 320
Asp Thr Val Ala Leu His Ile Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu Ile Asn
325 330 335
Asn Gln Lys Ala Leu Thr Lys Ala Gln Glu Glu Ile Asp Thr Lys Val
340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
Leu Leu Val Pro His Glu Asn Val Glu Asp Cys Val Val Ser Gly Tyr
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435 440 445
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485 490 495
Thr Ile Arg Lys Val Asn Pro Val Glu Leu Ile Ile Ala Pro Arg Leu
500 505 510
Ala Pro Glu Leu Tyr
515
<210> 16
<211> 517
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：P458S变体CYP82E4烟碱去甲基酶的蛋白质序列
<400> 16
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Leu Phe Phe Phe Leu Trp Thr Lys Lys Ser Gln Lys Pro Ser Lys Pro
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Leu Pro Pro Lys Ile Pro Gly Gly Trp Pro Val Ile Gly His Leu Phe
35 40 45
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100 105 110
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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Val Glu Arg Phe Lys Lys Ala Phe Lys Asp Phe Met Ile Leu Ser Met
210 215 220
Glu Phe Val Leu Trp Asp Ala Phe Pro Ile Pro Leu Phe Lys Trp Val
225 230 235 240
Asp Phe Gln Gly His Val Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp Ile
245 250 255
Asp Ser Val Phe Gln Asn Trp Leu Glu Glu His Ile Asn Lys Arg Glu
260 265 270
Lys Met Glu Val Asn Ala Glu Gly Asn Glu Gln Asp Phe Ile Asp Val
275 280 285
Val Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Gly Glu Gly Tyr Ser Arg
290 295 300
Asp Thr Val Ile Lys Ala Thr Val Phe Ser Leu Val Leu Asp Ala Ala
305 310 315 320
Asp Thr Val Ala Leu His Ile Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu Ile Asn
325 330 335
Asn Gln Lys Ala Leu Thr Lys Ala Gln Glu Glu Ile Asp Thr Lys Val
340 345 350
Gly Lys Asp Arg Trp Val Glu Glu Ser Asp Ile Lys Asp Leu Val Tyr
355 360 365
Leu Gln Ala Ile Val Lys Glu Val Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro
370 375 380
Leu Leu Val Pro His Glu Asn Val Glu Asp Cys Val Val Ser Gly Tyr
385 390 395 400
His Ile Pro Lys Gly Thr Arg Leu Phe Ala Asn Val Met Lys Leu Gln
405 410 415
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465 470 475 480
Arg Thr Pro Asn Asp Glu Pro Leu Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly Ile
485 490 495
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500 505 510
Ala Pro Glu Leu Tyr
515
<210> 17
<211> 517
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：CYP82E5烟碱去甲基酶的蛋白质序列
<400> 17
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Leu Pro Pro Lys Ile Pro Gly Gly Trp Pro Val Ile Gly His Leu Phe
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180 185 190
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210 215 220
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275 280 285
Val Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Asp Glu Gly Tyr Ser Arg
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325 330 335
Asn Gln His Ala Leu Lys Lys Ala Gln Glu Glu Ile Asp Lys Lys Val
340 345 350
Gly Lys Glu Arg Trp Val Glu Glu Ser Asp Ile Lys Asp Leu Val Tyr
355 360 365
Leu Gln Ala Ile Val Lys Glu Val Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro
370 375 380
Leu Leu Val Pro His Glu Asn Val Glu Asp Cys Val Val Ser Gly Tyr
385 390 395 400
His Ile Pro Lys Gly Thr Arg Leu Phe Ala Asn Val Met Lys Leu Gln
405 410 415
Arg Asp Pro Lys Leu Trp Ser Asn Pro Asp Lys Phe Asp Pro Glu Arg
420 425 430
Phe Phe Ala Asp Asp Ile Asp Tyr Arg Gly Gln His Tyr Glu Phe Ile
435 440 445
Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly Met Thr Tyr Ala Leu
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Gln Ala Glu His Leu Thr Ile Ala His Leu Ile Gln Gly Phe Asn Tyr
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485 490 495
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500 505 510
Ala Pro Glu Leu Tyr
515
<210> 18
<211> 517
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：P72L变体CYP82E5烟碱去甲基酶的蛋白质序列
<400> 18
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Leu Pro Pro Lys Ile Pro Gly Gly Trp Pro Val Ile Gly His Leu Phe
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50 55 60
Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Leu Val Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu
65 70 75 80
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165 170 175
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195 200 205
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210 215 220
Glu Phe Val Leu Trp Asp Ala Phe Pro Ile Pro Leu Phe Lys Trp Val
225 230 235 240
Asp Phe Gln Gly His Val Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp Ile
245 250 255
Asp Ser Val Phe Gln Asn Trp Leu Glu Glu His Val Lys Lys Arg Glu
260 265 270
Lys Met Glu Val Asn Ala Gln Gly Asn Glu Gln Asp Phe Ile Asp Val
275 280 285
Val Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Asp Glu Gly Tyr Ser Arg
290 295 300
Asp Thr Val Ile Lys Ala Thr Val Phe Ser Leu Val Leu Asp Ala Ala
305 310 315 320
Asp Thr Val Ala Leu His Met Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu Ile Asn
325 330 335
Asn Gln His Ala Leu Lys Lys Ala Gln Glu Glu Ile Asp Lys Lys Val
340 345 350
Gly Lys Glu Arg Trp Val Glu Glu Ser Asp Ile Lys Asp Leu Val Tyr
355 360 365
Leu Gln Ala Ile Val Lys Glu Val Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro
370 375 380
Leu Leu Val Pro His Glu Asn Val Glu Asp Cys Val Val Ser Gly Tyr
385 390 395 400
His Ile Pro Lys Gly Thr Arg Leu Phe Ala Asn Val Met Lys Leu Gln
405 410 415
Arg Asp Pro Lys Leu Trp Ser Asn Pro Asp Lys Phe Asp Pro Glu Arg
420 425 430
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435 440 445
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Gln Ala Glu His Leu Thr Ile Ala His Leu Ile Gln Gly Phe Asn Tyr
465 470 475 480
Lys Thr Pro Asn Asp Glu Pro Leu Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly Leu
485 490 495
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500 505 510
Ala Pro Glu Leu Tyr
515
<210> 19
<211> 517
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：CYP82E5烟碱去甲基酶的L143F变体的蛋白质序列
<400> 19
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Leu Pro Pro Lys Ile Pro Gly Gly Trp Pro Val Ile Gly His Leu Phe
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50 55 60
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500 505 510
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515
<210> 20
<211> 517
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：CYP82E5烟碱去甲基酶的S174L变体的蛋白质序列
<400> 20
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
Val Glu Arg Phe Arg Lys Ala Phe Lys Asp Phe Ile Ile Leu Ser Met
210 215 220
Glu Phe Val Leu Trp Asp Ala Phe Pro Ile Pro Leu Phe Lys Trp Val
225 230 235 240
Asp Phe Gln Gly His Val Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp Ile
245 250 255
Asp Ser Val Phe Gln Asn Trp Leu Glu Glu His Val Lys Lys Arg Glu
260 265 270
Lys Met Glu Val Asn Ala Gln Gly Asn Glu Gln Asp Phe Ile Asp Val
275 280 285
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500 505 510
Ala Pro Glu Leu Tyr
515
<210> 21
<211> 517
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：CYP82E5烟碱去甲基酶的M224I变体的蛋白质序列
<400> 21
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1 5 10 15
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515
<210> 22
<211> 517
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：CYP82E5烟碱去甲基酶的P235S变体的蛋白质序列
<400> 22
Met Val Ser Pro Val Glu Ala Ile Val Gly Leu Val Thr Leu Thr Leu
1 5 10 15
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Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Val Ile Gln Glu Val Leu Ser
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145 150 155 160
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225 230 235 240
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245 250 255
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275 280 285
Val Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Asp Glu Gly Tyr Ser Arg
290 295 300
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325 330 335
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340 345 350
Gly Lys Glu Arg Trp Val Glu Glu Ser Asp Ile Lys Asp Leu Val Tyr
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Leu Gln Ala Ile Val Lys Glu Val Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro
370 375 380
Leu Leu Val Pro His Glu Asn Val Glu Asp Cys Val Val Ser Gly Tyr
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405 410 415
Arg Asp Pro Lys Leu Trp Ser Asn Pro Asp Lys Phe Asp Pro Glu Arg
420 425 430
Phe Phe Ala Asp Asp Ile Asp Tyr Arg Gly Gln His Tyr Glu Phe Ile
435 440 445
Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly Met Thr Tyr Ala Leu
450 455 460
Gln Ala Glu His Leu Thr Ile Ala His Leu Ile Gln Gly Phe Asn Tyr
465 470 475 480
Lys Thr Pro Asn Asp Glu Pro Leu Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly Leu
485 490 495
Thr Ile Arg Lys Val Asn Pro Val Glu Val Thr Ile Thr Ala Arg Leu
500 505 510
Ala Pro Glu Leu Tyr
515
<210> 23
<211> 517
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：CYP82E5烟碱去甲基酶的A410V变体的蛋白质序列
<400> 23
Met Val Ser Pro Val Glu Ala Ile Val Gly Leu Val Thr Leu Thr Leu
1 5 10 15
Leu Phe Tyr Phe Leu Trp Pro Lys Lys Phe Gln Ile Pro Ser Lys Pro
20 25 30
Leu Pro Pro Lys Ile Pro Gly Gly Trp Pro Val Ile Gly His Leu Phe
35 40 45
Tyr Phe Asp Asp Asp Gly Asp Asp Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly
50 55 60
Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Pro Val Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu
65 70 75 80
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Ser Thr Asn Asp Ala Ile Phe Ser Asn Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly
100 105 110
Glu Tyr Leu Gly Tyr Ser Asn Ala Met Leu Phe Leu Thr Lys Tyr Gly
115 120 125
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Val Ile Gln Glu Val Leu Ser
130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
Lys Met Ile Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gln
195 200 205
Val Glu Arg Phe Arg Lys Ala Phe Lys Asp Phe Ile Ile Leu Ser Met
210 215 220
Glu Phe Val Leu Trp Asp Ala Phe Pro Ile Pro Leu Phe Lys Trp Val
225 230 235 240
Asp Phe Gln Gly His Val Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp Ile
245 250 255
Asp Ser Val Phe Gln Asn Trp Leu Glu Glu His Val Lys Lys Arg Glu
260 265 270
Lys Met Glu Val Asn Ala Gln Gly Asn Glu Gln Asp Phe Ile Asp Val
275 280 285
Val Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Asp Glu Gly Tyr Ser Arg
290 295 300
Asp Thr Val Ile Lys Ala Thr Val Phe Ser Leu Val Leu Asp Ala Ala
305 310 315 320
Asp Thr Val Ala Leu His Met Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu Ile Asn
325 330 335
Asn Gln His Ala Leu Lys Lys Ala Gln Glu Glu Ile Asp Lys Lys Val
340 345 350
Gly Lys Glu Arg Trp Val Glu Glu Ser Asp Ile Lys Asp Leu Val Tyr
355 360 365
Leu Gln Ala Ile Val Lys Glu Val Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro
370 375 380
Leu Leu Val Pro His Glu Asn Val Glu Asp Cys Val Val Ser Gly Tyr
385 390 395 400
His Ile Pro Lys Gly Thr Arg Leu Phe Val Asn Val Met Lys Leu Gln
405 410 415
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Phe Phe Ala Asp Asp Ile Asp Tyr Arg Gly Gln His Tyr Glu Phe Ile
435 440 445
Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly Met Thr Tyr Ala Leu
450 455 460
Gln Ala Glu His Leu Thr Ile Ala His Leu Ile Gln Gly Phe Asn Tyr
465 470 475 480
Lys Thr Pro Asn Asp Glu Pro Leu Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly Leu
485 490 495
Thr Ile Arg Lys Val Asn Pro Val Glu Val Thr Ile Thr Ala Arg Leu
500 505 510
Ala Pro Glu Leu Tyr
515
<210> 24
<211> 421
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：CYP82E5烟碱去甲基酶的W422Stop变体的蛋白质序列
<400> 24
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Leu Pro Pro Lys Ile Pro Gly Gly Trp Pro Val Ile Gly His Leu Phe
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Glu Tyr Leu Gly Tyr Ser Asn Ala Met Leu Phe Leu Thr Lys Tyr Gly
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Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Val Ile Gln Glu Val Leu Ser
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Ala Ser Arg Leu Glu Lys Leu Lys His Val Arg Phe Gly Lys Ile Gln
145 150 155 160
Thr Ser Ile Lys Ser Leu Tyr Thr Arg Ile Asp Gly Asn Ser Ser Thr
165 170 175
Ile Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu Ile Val
180 185 190
Lys Met Ile Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gln
195 200 205
Val Glu Arg Phe Arg Lys Ala Phe Lys Asp Phe Ile Ile Leu Ser Met
210 215 220
Glu Phe Val Leu Trp Asp Ala Phe Pro Ile Pro Leu Phe Lys Trp Val
225 230 235 240
Asp Phe Gln Gly His Val Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp Ile
245 250 255
Asp Ser Val Phe Gln Asn Trp Leu Glu Glu His Val Lys Lys Arg Glu
260 265 270
Lys Met Glu Val Asn Ala Gln Gly Asn Glu Gln Asp Phe Ile Asp Val
275 280 285
Val Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Asp Glu Gly Tyr Ser Arg
290 295 300
Asp Thr Val Ile Lys Ala Thr Val Phe Ser Leu Val Leu Asp Ala Ala
305 310 315 320
Asp Thr Val Ala Leu His Met Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu Ile Asn
325 330 335
Asn Gln His Ala Leu Lys Lys Ala Gln Glu Glu Ile Asp Lys Lys Val
340 345 350
Gly Lys Glu Arg Trp Val Glu Glu Ser Asp Ile Lys Asp Leu Val Tyr
355 360 365
Leu Gln Ala Ile Val Lys Glu Val Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro
370 375 380
Leu Leu Val Pro His Glu Asn Val Glu Asp Cys Val Val Ser Gly Tyr
385 390 395 400
His Ile Pro Lys Gly Thr Arg Leu Phe Ala Asn Val Met Lys Leu Gln
405 410 415
Arg Asp Pro Lys Leu
420
<210> 25
<211> 517
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：CYP82E5烟碱去甲基酶的P449L变体的蛋白质序列
<400> 25
Met Val Ser Pro Val Glu Ala Ile Val Gly Leu Val Thr Leu Thr Leu
1 5 10 15
Leu Phe Tyr Phe Leu Trp Pro Lys Lys Phe Gln Ile Pro Ser Lys Pro
20 25 30
Leu Pro Pro Lys Ile Pro Gly Gly Trp Pro Val Ile Gly His Leu Phe
35 40 45
Tyr Phe Asp Asp Asp Gly Asp Asp Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly
50 55 60
Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Pro Val Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu
65 70 75 80
Pro Leu Val Leu Val Val Ser Ser Tyr Glu Ala Val Lys Asp Cys Phe
85 90 95
Ser Thr Asn Asp Ala Ile Phe Ser Asn Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly
100 105 110
Glu Tyr Leu Gly Tyr Ser Asn Ala Met Leu Phe Leu Thr Lys Tyr Gly
115 120 125
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Val Ile Gln Glu Val Leu Ser
130 135 140
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Leu Lys His Val Arg Phe Gly Lys Ile Gln
145 150 155 160
Thr Ser Ile Lys Ser Leu Tyr Thr Arg Ile Asp Gly Asn Ser Ser Thr
165 170 175
Ile Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu Ile Val
180 185 190
Lys Met Ile Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gln
195 200 205
Val Glu Arg Phe Arg Lys Ala Phe Lys Asp Phe Ile Ile Leu Ser Met
210 215 220
Glu Phe Val Leu Trp Asp Ala Phe Pro Ile Pro Leu Phe Lys Trp Val
225 230 235 240
Asp Phe Gln Gly His Val Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp Ile
245 250 255
Asp Ser Val Phe Gln Asn Trp Leu Glu Glu His Val Lys Lys Arg Glu
260 265 270
Lys Met Glu Val Asn Ala Gln Gly Asn Glu Gln Asp Phe Ile Asp Val
275 280 285
Val Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Asp Glu Gly Tyr Ser Arg
290 295 300
Asp Thr Val Ile Lys Ala Thr Val Phe Ser Leu Val Leu Asp Ala Ala
305 310 315 320
Asp Thr Val Ala Leu His Met Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu Ile Asn
325 330 335
Asn Gln His Ala Leu Lys Lys Ala Gln Glu Glu Ile Asp Lys Lys Val
340 345 350
Gly Lys Glu Arg Trp Val Glu Glu Ser Asp Ile Lys Asp Leu Val Tyr
355 360 365
Leu Gln Ala Ile Val Lys Glu Val Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro
370 375 380
Leu Leu Val Pro His Glu Asn Val Glu Asp Cys Val Val Ser Gly Tyr
385 390 395 400
His Ile Pro Lys Gly Thr Arg Leu Phe Ala Asn Val Met Lys Leu Gln
405 410 415
Arg Asp Pro Lys Leu Trp Ser Asn Pro Asp Lys Phe Asp Pro Glu Arg
420 425 430
Phe Phe Ala Asp Asp Ile Asp Tyr Arg Gly Gln His Tyr Glu Phe Ile
435 440 445
Leu Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly Met Thr Tyr Ala Leu
450 455 460
Gln Ala Glu His Leu Thr Ile Ala His Leu Ile Gln Gly Phe Asn Tyr
465 470 475 480
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485 490 495
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500 505 510
Ala Pro Glu Leu Tyr
515
<210> 26
<211> 517
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：CYP82E10烟碱去甲基酶的蛋白质序列
<400> 26
Met Val Ser Pro Val Glu Ala Ile Val Gly Leu Val Thr Leu Thr Leu
1 5 10 15
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35 40 45
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50 55 60
Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Pro Val Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu
65 70 75 80
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85 90 95
Ser Thr Asn Asp Ala Ile Phe Ser Asn Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly
100 105 110
Glu Tyr Leu Gly Tyr Asn Asn Ala Met Leu Phe Leu Thr Lys Tyr Gly
115 120 125
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Val Ile Gln Glu Val Leu Cys
130 135 140
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Leu Lys His Val Arg Phe Gly Glu Ile Gln
145 150 155 160
Thr Ser Ile Lys Asn Leu Tyr Thr Arg Ile Asp Gly Asn Ser Ser Thr
165 170 175
Ile Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu Ile Val
180 185 190
Lys Met Ile Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gln
195 200 205
Val Glu Arg Phe Arg Lys Ala Phe Lys Asp Phe Ile Ile Leu Ser Met
210 215 220
Glu Phe Val Leu Trp Asp Ala Phe Pro Ile Pro Leu Phe Lys Trp Val
225 230 235 240
Asp Phe Gln Gly His Val Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp Ile
245 250 255
Asp Ser Val Phe Gln Asn Trp Leu Glu Glu His Val Lys Lys Lys Glu
260 265 270
Lys Met Glu Val Asn Ala Glu Gly Asn Glu Gln Asp Phe Ile Asp Val
275 280 285
Val Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Asp Glu Gly Tyr Ser Arg
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<220>
<223> 合成序列：CYP82E10烟碱去甲基酶的L148F变体的蛋白质序列
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Glu Phe Val Leu Trp Asp Ala Phe Pro Ile Pro Leu Phe Lys Trp Val
225 230 235 240
Asp Phe Gln Gly His Val Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp Ile
245 250 255
Asp Ser Val Phe Gln Asn Trp Leu Glu Glu His Val Lys Lys Lys Glu
260 265 270
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275 280 285
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305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
Arg Asp Pro Lys Leu Trp Ser Asn Pro Asp Lys Phe Asp Pro Glu Arg
420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
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485 490 495
Thr Ile Arg Lys Val Asn Pro Ile Glu Val Val Ile Thr Pro Arg Leu
500 505 510
Thr Pro Glu Leu Tyr
515
<210> 28
<211> 517
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：CYP82E10烟碱去甲基酶的G172R变体的蛋白质序列
<400> 28
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165 170 175
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195 200 205
Val Glu Arg Phe Arg Lys Ala Phe Lys Asp Phe Ile Ile Leu Ser Met
210 215 220
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225 230 235 240
Asp Phe Gln Gly His Val Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp Ile
245 250 255
Asp Ser Val Phe Gln Asn Trp Leu Glu Glu His Val Lys Lys Lys Glu
260 265 270
Lys Met Glu Val Asn Ala Glu Gly Asn Glu Gln Asp Phe Ile Asp Val
275 280 285
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<211> 517
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：CYP82E10烟碱去甲基酶的A344T变体的蛋白质序列
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165 170 175
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210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
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325 330 335
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420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
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485 490 495
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500 505 510
Thr Pro Glu Leu Tyr
515
<210> 30
<211> 517
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：CYP82E10烟碱去甲基酶的A410T变体的蛋白质序列
<400> 30
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1 5 10 15
Leu Phe Tyr Phe Ile Arg Thr Lys Lys Ser Gln Lys Pro Ser Lys Pro
20 25 30
Leu Pro Pro Lys Ile Pro Gly Gly Trp Pro Val Ile Gly His Leu Phe
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50 55 60
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100 105 110
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115 120 125
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Val Ile Gln Glu Val Leu Cys
130 135 140
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Leu Lys His Val Arg Phe Gly Glu Ile Gln
145 150 155 160
Thr Ser Ile Lys Asn Leu Tyr Thr Arg Ile Asp Gly Asn Ser Ser Thr
165 170 175
Ile Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu Ile Val
180 185 190
Lys Met Ile Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gln
195 200 205
Val Glu Arg Phe Arg Lys Ala Phe Lys Asp Phe Ile Ile Leu Ser Met
210 215 220
Glu Phe Val Leu Trp Asp Ala Phe Pro Ile Pro Leu Phe Lys Trp Val
225 230 235 240
Asp Phe Gln Gly His Val Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp Ile
245 250 255
Asp Ser Val Phe Gln Asn Trp Leu Glu Glu His Val Lys Lys Lys Glu
260 265 270
Lys Met Glu Val Asn Ala Glu Gly Asn Glu Gln Asp Phe Ile Asp Val
275 280 285
Val Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Asp Glu Gly Tyr Ser Arg
290 295 300
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340 345 350
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370 375 380
Leu Leu Val Pro His Glu Asn Val Glu Asp Cys Val Val Ser Gly Tyr
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405 410 415
Arg Asp Pro Lys Leu Trp Ser Asn Pro Asp Lys Phe Asp Pro Glu Arg
420 425 430
Phe Phe Ala Ala Asp Ile Asp Phe Arg Gly Gln His Tyr Glu Phe Ile
435 440 445
Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly Met Thr Tyr Ala Met
450 455 460
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465 470 475 480
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485 490 495
Thr Ile Arg Lys Val Asn Pro Ile Glu Val Val Ile Thr Pro Arg Leu
500 505 510
Thr Pro Glu Leu Tyr
515
<210> 31
<211> 517
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：CYP82E10烟碱去甲基酶的R417H变体的蛋白质序列
<400> 31
Met Val Ser Pro Val Glu Ala Ile Val Gly Leu Val Thr Leu Thr Leu
1 5 10 15
Leu Phe Tyr Phe Ile Arg Thr Lys Lys Ser Gln Lys Pro Ser Lys Pro
20 25 30
Leu Pro Pro Lys Ile Pro Gly Gly Trp Pro Val Ile Gly His Leu Phe
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Tyr Phe Asp Asp Asp Ser Asp Asp Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly
50 55 60
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Ser Thr Asn Asp Ala Ile Phe Ser Asn Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly
100 105 110
Glu Tyr Leu Gly Tyr Asn Asn Ala Met Leu Phe Leu Thr Lys Tyr Gly
115 120 125
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Val Ile Gln Glu Val Leu Cys
130 135 140
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Leu Lys His Val Arg Phe Gly Glu Ile Gln
145 150 155 160
Thr Ser Ile Lys Asn Leu Tyr Thr Arg Ile Asp Gly Asn Ser Ser Thr
165 170 175
Ile Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu Ile Val
180 185 190
Lys Met Ile Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gln
195 200 205
Val Glu Arg Phe Arg Lys Ala Phe Lys Asp Phe Ile Ile Leu Ser Met
210 215 220
Glu Phe Val Leu Trp Asp Ala Phe Pro Ile Pro Leu Phe Lys Trp Val
225 230 235 240
Asp Phe Gln Gly His Val Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp Ile
245 250 255
Asp Ser Val Phe Gln Asn Trp Leu Glu Glu His Val Lys Lys Lys Glu
260 265 270
Lys Met Glu Val Asn Ala Glu Gly Asn Glu Gln Asp Phe Ile Asp Val
275 280 285
Val Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Asp Glu Gly Tyr Ser Arg
290 295 300
Asp Thr Val Ile Lys Ala Thr Val Phe Ser Leu Val Leu Asp Ala Ala
305 310 315 320
Asp Thr Val Ala Leu His Met Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu Ile Asn
325 330 335
Asn Gln His Ala Leu Lys Lys Ala Gln Glu Glu Ile Asp Lys Lys Val
340 345 350
Gly Lys Asp Arg Trp Val Glu Glu Ser Asp Ile Lys Asp Leu Val Tyr
355 360 365
Leu Gln Thr Ile Val Lys Glu Val Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro
370 375 380
Leu Leu Val Pro His Glu Asn Val Glu Asp Cys Val Val Ser Gly Tyr
385 390 395 400
His Ile Pro Lys Gly Thr Arg Leu Phe Ala Asn Val Met Lys Leu Gln
405 410 415
His Asp Pro Lys Leu Trp Ser Asn Pro Asp Lys Phe Asp Pro Glu Arg
420 425 430
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450 455 460
Gln Val Glu His Leu Thr Ile Ala His Leu Ile Gln Gly Phe Asn Tyr
465 470 475 480
Lys Thr Pro Asn Asp Glu Pro Leu Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly Leu
485 490 495
Thr Ile Arg Lys Val Asn Pro Ile Glu Val Val Ile Thr Pro Arg Leu
500 505 510
Thr Pro Glu Leu Tyr
515
<210> 32
<211> 517
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：CYP82E10烟碱去甲基酶的P419S变体的蛋白质序列
<400> 32
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100 105 110
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Ala Ser Arg Leu Glu Lys Leu Lys His Val Arg Phe Gly Glu Ile Gln
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165 170 175
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195 200 205
Val Glu Arg Phe Arg Lys Ala Phe Lys Asp Phe Ile Ile Leu Ser Met
210 215 220
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245 250 255
Asp Ser Val Phe Gln Asn Trp Leu Glu Glu His Val Lys Lys Lys Glu
260 265 270
Lys Met Glu Val Asn Ala Glu Gly Asn Glu Gln Asp Phe Ile Asp Val
275 280 285
Val Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Asp Glu Gly Tyr Ser Arg
290 295 300
Asp Thr Val Ile Lys Ala Thr Val Phe Ser Leu Val Leu Asp Ala Ala
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Asp Thr Val Ala Leu His Met Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu Ile Asn
325 330 335
Asn Gln His Ala Leu Lys Lys Ala Gln Glu Glu Ile Asp Lys Lys Val
340 345 350
Gly Lys Asp Arg Trp Val Glu Glu Ser Asp Ile Lys Asp Leu Val Tyr
355 360 365
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Leu Leu Val Pro His Glu Asn Val Glu Asp Cys Val Val Ser Gly Tyr
385 390 395 400
His Ile Pro Lys Gly Thr Arg Leu Phe Ala Asn Val Met Lys Leu Gln
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Arg Asp Ser Lys Leu Trp Ser Asn Pro Asp Lys Phe Asp Pro Glu Arg
420 425 430
Phe Phe Ala Ala Asp Ile Asp Phe Arg Gly Gln His Tyr Glu Phe Ile
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Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly Met Thr Tyr Ala Met
450 455 460
Gln Val Glu His Leu Thr Ile Ala His Leu Ile Gln Gly Phe Asn Tyr
465 470 475 480
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485 490 495
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500 505 510
Thr Pro Glu Leu Tyr
515
<210> 33
<211> 517
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：CYP82E10烟碱去甲基酶的G79S变体的蛋白质序列
<400> 33
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Val Ile Gln Glu Val Leu Cys
130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
Lys Met Ile Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gln
195 200 205
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210 215 220
Glu Phe Val Leu Trp Asp Ala Phe Pro Ile Pro Leu Phe Lys Trp Val
225 230 235 240
Asp Phe Gln Gly His Val Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp Ile
245 250 255
Asp Ser Val Phe Gln Asn Trp Leu Glu Glu His Val Lys Lys Lys Glu
260 265 270
Lys Met Glu Val Asn Ala Glu Gly Asn Glu Gln Asp Phe Ile Asp Val
275 280 285
Val Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Asp Glu Gly Tyr Ser Arg
290 295 300
Asp Thr Val Ile Lys Ala Thr Val Phe Ser Leu Val Leu Asp Ala Ala
305 310 315 320
Asp Thr Val Ala Leu His Met Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu Ile Asn
325 330 335
Asn Gln His Ala Leu Lys Lys Ala Gln Glu Glu Ile Asp Lys Lys Val
340 345 350
Gly Lys Asp Arg Trp Val Glu Glu Ser Asp Ile Lys Asp Leu Val Tyr
355 360 365
Leu Gln Thr Ile Val Lys Glu Val Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro
370 375 380
Leu Leu Val Pro His Glu Asn Val Glu Asp Cys Val Val Ser Gly Tyr
385 390 395 400
His Ile Pro Lys Gly Thr Arg Leu Phe Ala Asn Val Met Lys Leu Gln
405 410 415
Arg Asp Pro Lys Leu Trp Ser Asn Pro Asp Lys Phe Asp Pro Glu Arg
420 425 430
Phe Phe Ala Ala Asp Ile Asp Phe Arg Gly Gln His Tyr Glu Phe Ile
435 440 445
Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly Met Thr Tyr Ala Met
450 455 460
Gln Val Glu His Leu Thr Ile Ala His Leu Ile Gln Gly Phe Asn Tyr
465 470 475 480
Lys Thr Pro Asn Asp Glu Pro Leu Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly Leu
485 490 495
Thr Ile Arg Lys Val Asn Pro Ile Glu Val Val Ile Thr Pro Arg Leu
500 505 510
Thr Pro Glu Leu Tyr
515
<210> 34
<211> 517
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：CYP82E10烟碱去甲基酶的P107S变体的蛋白质序列
<400> 34
Met Val Ser Pro Val Glu Ala Ile Val Gly Leu Val Thr Leu Thr Leu
1 5 10 15
Leu Phe Tyr Phe Ile Arg Thr Lys Lys Ser Gln Lys Pro Ser Lys Pro
20 25 30
Leu Pro Pro Lys Ile Pro Gly Gly Trp Pro Val Ile Gly His Leu Phe
35 40 45
Tyr Phe Asp Asp Asp Ser Asp Asp Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly
50 55 60
Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Pro Val Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu
65 70 75 80
Pro Leu Val Leu Val Val Ser Ser Tyr Glu Ala Ile Lys Asp Cys Phe
85 90 95
Ser Thr Asn Asp Ala Ile Phe Ser Asn Arg Ser Ala Phe Leu Tyr Gly
100 105 110
Glu Tyr Leu Gly Tyr Asn Asn Ala Met Leu Phe Leu Thr Lys Tyr Gly
115 120 125
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Val Ile Gln Glu Val Leu Cys
130 135 140
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Leu Lys His Val Arg Phe Gly Glu Ile Gln
145 150 155 160
Thr Ser Ile Lys Asn Leu Tyr Thr Arg Ile Asp Gly Asn Ser Ser Thr
165 170 175
Ile Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu Ile Val
180 185 190
Lys Met Ile Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gln
195 200 205
Val Glu Arg Phe Arg Lys Ala Phe Lys Asp Phe Ile Ile Leu Ser Met
210 215 220
Glu Phe Val Leu Trp Asp Ala Phe Pro Ile Pro Leu Phe Lys Trp Val
225 230 235 240
Asp Phe Gln Gly His Val Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp Ile
245 250 255
Asp Ser Val Phe Gln Asn Trp Leu Glu Glu His Val Lys Lys Lys Glu
260 265 270
Lys Met Glu Val Asn Ala Glu Gly Asn Glu Gln Asp Phe Ile Asp Val
275 280 285
Val Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Asp Glu Gly Tyr Ser Arg
290 295 300
Asp Thr Val Ile Lys Ala Thr Val Phe Ser Leu Val Leu Asp Ala Ala
305 310 315 320
Asp Thr Val Ala Leu His Met Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu Ile Asn
325 330 335
Asn Gln His Ala Leu Lys Lys Ala Gln Glu Glu Ile Asp Lys Lys Val
340 345 350
Gly Lys Asp Arg Trp Val Glu Glu Ser Asp Ile Lys Asp Leu Val Tyr
355 360 365
Leu Gln Thr Ile Val Lys Glu Val Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Pro
370 375 380
Leu Leu Val Pro His Glu Asn Val Glu Asp Cys Val Val Ser Gly Tyr
385 390 395 400
His Ile Pro Lys Gly Thr Arg Leu Phe Ala Asn Val Met Lys Leu Gln
405 410 415
Arg Asp Pro Lys Leu Trp Ser Asn Pro Asp Lys Phe Asp Pro Glu Arg
420 425 430
Phe Phe Ala Ala Asp Ile Asp Phe Arg Gly Gln His Tyr Glu Phe Ile
435 440 445
Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly Met Thr Tyr Ala Met
450 455 460
Gln Val Glu His Leu Thr Ile Ala His Leu Ile Gln Gly Phe Asn Tyr
465 470 475 480
Lys Thr Pro Asn Asp Glu Pro Leu Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly Leu
485 490 495
Thr Ile Arg Lys Val Asn Pro Ile Glu Val Val Ile Thr Pro Arg Leu
500 505 510
Thr Pro Glu Leu Tyr
515
<210> 35
<211> 517
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：CYP82E10烟碱去甲基酶的P382S变体的蛋白质序列
<400> 35
Met Val Ser Pro Val Glu Ala Ile Val Gly Leu Val Thr Leu Thr Leu
1 5 10 15
Leu Phe Tyr Phe Ile Arg Thr Lys Lys Ser Gln Lys Pro Ser Lys Pro
20 25 30
Leu Pro Pro Lys Ile Pro Gly Gly Trp Pro Val Ile Gly His Leu Phe
35 40 45
Tyr Phe Asp Asp Asp Ser Asp Asp Arg Pro Leu Ala Arg Lys Leu Gly
50 55 60
Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Pro Val Phe Thr Phe Arg Leu Gly Leu
65 70 75 80
Pro Leu Val Leu Val Val Ser Ser Tyr Glu Ala Ile Lys Asp Cys Phe
85 90 95
Ser Thr Asn Asp Ala Ile Phe Ser Asn Arg Pro Ala Phe Leu Tyr Gly
100 105 110
Glu Tyr Leu Gly Tyr Asn Asn Ala Met Leu Phe Leu Thr Lys Tyr Gly
115 120 125
Pro Tyr Trp Arg Lys Asn Arg Lys Leu Val Ile Gln Glu Val Leu Cys
130 135 140
Ala Ser Arg Leu Glu Lys Leu Lys His Val Arg Phe Gly Glu Ile Gln
145 150 155 160
Thr Ser Ile Lys Asn Leu Tyr Thr Arg Ile Asp Gly Asn Ser Ser Thr
165 170 175
Ile Asn Leu Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu Asn Phe Gly Leu Ile Val
180 185 190
Lys Met Ile Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Asp Glu Gln
195 200 205
Val Glu Arg Phe Arg Lys Ala Phe Lys Asp Phe Ile Ile Leu Ser Met
210 215 220
Glu Phe Val Leu Trp Asp Ala Phe Pro Ile Pro Leu Phe Lys Trp Val
225 230 235 240
Asp Phe Gln Gly His Val Lys Ala Met Lys Arg Thr Phe Lys Asp Ile
245 250 255
Asp Ser Val Phe Gln Asn Trp Leu Glu Glu His Val Lys Lys Lys Glu
260 265 270
Lys Met Glu Val Asn Ala Glu Gly Asn Glu Gln Asp Phe Ile Asp Val
275 280 285
Val Leu Ser Lys Met Ser Asn Glu Tyr Leu Asp Glu Gly Tyr Ser Arg
290 295 300
Asp Thr Val Ile Lys Ala Thr Val Phe Ser Leu Val Leu Asp Ala Ala
305 310 315 320
Asp Thr Val Ala Leu His Met Asn Trp Gly Met Ala Leu Leu Ile Asn
325 330 335
Asn Gln His Ala Leu Lys Lys Ala Gln Glu Glu Ile Asp Lys Lys Val
340 345 350
Gly Lys Asp Arg Trp Val Glu Glu Ser Asp Ile Lys Asp Leu Val Tyr
355 360 365
Leu Gln Thr Ile Val Lys Glu Val Leu Arg Leu Tyr Pro Ser Gly Pro
370 375 380
Leu Leu Val Pro His Glu Asn Val Glu Asp Cys Val Val Ser Gly Tyr
385 390 395 400
His Ile Pro Lys Gly Thr Arg Leu Phe Ala Asn Val Met Lys Leu Gln
405 410 415
Arg Asp Pro Lys Leu Trp Ser Asn Pro Asp Lys Phe Asp Pro Glu Arg
420 425 430
Phe Phe Ala Ala Asp Ile Asp Phe Arg Gly Gln His Tyr Glu Phe Ile
435 440 445
Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly Met Thr Tyr Ala Met
450 455 460
Gln Val Glu His Leu Thr Ile Ala His Leu Ile Gln Gly Phe Asn Tyr
465 470 475 480
Lys Thr Pro Asn Asp Glu Pro Leu Asp Met Lys Glu Gly Ala Gly Leu
485 490 495
Thr Ile Arg Lys Val Asn Pro Ile Glu Val Val Ile Thr Pro Arg Leu
500 505 510
Thr Pro Glu Leu Tyr
515
<210> 36
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物NND3_F1
<400> 36
ttgatccagg gtttcaatta cagc 24
<210> 37
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物 NND3_R2
<400> 37
aacgtaccaa attagaaaaa cgtgtacc 28
<210> 38
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物E4_F1
<400> 38
ttttcagaat tggttagagg aacatattaa t 31
<210> 39
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物E4_R1
<400> 39
tgtgtctatc tcttcttgtg ctttcg 26
<210> 40
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物E5_F1
<400> 40
agagattctt cgctgatgat attgactac 29
<210> 41
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物E5_R1
<400> 41
ccgtaattgt cacttctaca ggatttact 29
<210> 42
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物E10_F2
<400> 42
gctgatattg actttcgtgg tcaa 24
<210> 43
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物E10_R2
<400> 43
gcgaggcgta attaccactt ctat 24
<210> 44
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物PQ0014_F
<400> 44
ctattctccg ctttggactt ggca 24
<210> 45
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物PQ0014_R
<400> 45
aggacctcag gacaacggaa acg 23
<210> 46
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物NND3_F6
<400> 46
aattttggtc tcatcgtgaa gatgata 27
<210> 47
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物NND3_R7
<400> 47
tcactctctt ctacccatct atccttg 27

Claims (48)

1.一种包含重组构建体的转基因烟草植物细胞，其中所述重组构建体包含与其中烟碱N-去甲基酶的表达未降低的对照烟草植物细胞相比，抑制烟碱N-去甲基酶的表达的多核苷酸，其中所述烟碱N-去甲基酶包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽。
2.根据权利要求1所述的转基因烟草植物细胞，其中所述烟草植物细胞包括降低所述烟碱N-去甲基酶的表达或活性的一或多个突变。
3.根据权利要求2所述的转基因烟草植物细胞，其包括编码CYP82E4烟碱去甲基酶的基因中的一或多个突变，其中所述突变使得所述CYP82E4烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱。
4.根据权利要求3所述的转基因烟草植物细胞，其中所述CYP82E4烟碱去甲基酶选自由SEQ ID NOs:12至SEQ ID NO:16或其两者或多于两者的组合组成的群组。
5.根据权利要求4所述的转基因烟草植物细胞，其中所述突变引起对所述CYP82E4烟碱去甲基酶的修改且在选自由SEQ ID NO:5的氨基酸残基329、364、376、382及458或其两者或多于两者的组合组成的群组的位置处发生。
6.根据权利要求5所述的转基因烟草植物细胞，其中所述突变选自由以下各者组成的群组：a)用终止密码子替换SEQ ID NO:5的位置329处的色氨酸残基；b)用天冬酰胺替换SEQID NO:5的位置364处的赖氨酸残基；c)用蛋氨酸替换SEQ ID NO:5的位置376处的缬氨酸残基；d)用丝氨酸替换SEQ ID NO:5的位置382处的脯氨酸残基；d)用丝氨酸替换SEQ ID NO:5的位置458处的脯氨酸残基；和e)其两者或多于两者的任何组合。
7.根据权利要求2所述的转基因烟草植物细胞，其包括编码CYP82E5烟碱去甲基酶的基因中的一或多个突变，其中所述突变 使得所述CYP82E5烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱。
8.根据权利要求7所述的转基因烟草植物细胞，其中所述CYP82E5烟碱去甲基酶选自SEQ ID NO:24至SEQ ID NO:25或其组合。
9.根据权利要求8所述的转基因烟草植物细胞，其中所述突变引起对所述CYP82E5烟碱去甲基酶的修改且在SEQ ID NO:17的氨基酸残基422或449或其组合处发生。
10.根据权利要求9所述的转基因烟草植物细胞，其中所述突变选自由以下各者组成的群组：a)用终止密码子替换SEQ ID NO:17的位置422处的色氨酸残基；b)用亮氨酸替换SEQID NO:17的位置449处的脯氨酸残基；和c)其组合。
11.根据权利要求3所述的转基因烟草植物细胞，其包括编码CYP82E5烟碱去甲基酶的基因中的一或多个突变，其中所述突变 使得所述CYP82E5烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱。
12.根据权利要求11所述的转基因烟草植物细胞，其中所述CYP82E5烟碱去甲基酶选自SEQ ID NO:24至SEQ ID NO:25或其组合。
13.根据权利要求12所述的转基因烟草植物细胞，其中所述突变引起对所述CYP82E5烟碱去甲基酶的修改且在SEQ ID NO:17的氨基酸残基422或449或其组合处发生。
14.根据权利要求13所述的转基因烟草植物细胞，其中所述突变选自由以下各者组成的群组：a)用终止密码子替换SEQ ID NO:17的位置422处的色氨酸残基；b)用亮氨酸替换SEQ ID NO:17的位置449处的脯氨酸残基；和c)其组合。
15.根据权利要求2所述的转基因烟草植物细胞，其包括编码CYP82E10烟碱去甲基酶的基因中的一或多个突变，其中所述突变使得所述CYP82E10烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱。
16.根据权利要求15所述的转基因烟草植物细胞，其中所述CYP82E10烟碱去甲基酶选自由SEQ ID NO:32至SEQ ID NO:35或其两者或多于两者的组合组成的群组。
17.根据权利要求16所述的转基因烟草植物细胞，其中所述突变引起对所述CYP82E10烟碱去甲基酶的修改且在选自由SEQ ID NO:26的氨基酸残基79、107、382、419或其两者或多于两者的组合组成的群组的位置处发生。
18.根据权利要求17所述的转基因烟草植物细胞，其中所述突变选自由以下各者组成的群组：a)用丝氨酸替换SEQ ID NO:26的位置79处的甘氨酸残基；b)用丝氨酸替换SEQ IDNO:26的位置107处的脯氨酸残基；c)用丝氨酸替换SEQ ID NO:26的位置382处的脯氨酸残基；d)用丝氨酸替换SEQ ID NO:26的位置419处的脯氨酸残基；和e)其任何组合。
19.根据权利要求3所述的转基因烟草植物细胞，其包括编码CYP82E10烟碱去甲基酶的基因中的一或多个突变，其中所述突变使得所述CYP82E10烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱。
20.根据权利要求19所述的转基因烟草植物细胞，其中所述CYP82E10烟碱去甲基酶选自由SEQ ID NO:32至SEQ ID NO:35或其两者或多于两者的组合组成的群组。
21.根据权利要求20所述的转基因烟草植物细胞，其中所述突变引起对所述CYP82E10烟碱去甲基酶的修改且在选自由SEQ ID NO:26的氨基酸残基79、107、382、419或其两者或多于两者的组合组成的群组的位置处发生。
22.根据权利要求21所述的转基因烟草植物细胞，其中所述突变选自由以下各者组成的群组：a)用丝氨酸替换SEQ ID NO:26的位置79处的甘氨酸残基；b)用丝氨酸替换SEQ IDNO:26的位置107处的脯氨酸残基；c)用丝氨酸替换SEQ ID NO:26的位置382处的脯氨酸残基；d)用丝氨酸替换SEQ ID NO:26的位置419处的脯氨酸残基；和e)其任何组合。
23.根据权利要求7所述的转基因烟草植物细胞，其包括编码CYP82E10烟碱去甲基酶的基因中的一或多个突变，其中所述突变使得所述CYP82E10烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱。
24.根据权利要求23所述的转基因烟草植物细胞，其中所述CYP82E10烟碱去甲基酶选自由SEQ ID NO:32至SEQ ID NO:35或其两者或多于两者的组合组成的群组。
25.根据权利要求24所述的转基因烟草植物细胞，其中所述突变引起对所述CYP82E10烟碱去甲基酶的修改且在选自由SEQ ID NO:26的氨基酸残基79、107、382、419或其两者或多于两者的组合组成的群组的位置处发生。
26.根据权利要求25所述的转基因烟草植物细胞，其中所述突变选自由以下各者组成的群组：a)用丝氨酸替换SEQ ID NO:26的位置79处的甘氨酸残基；b)用丝氨酸替换SEQ IDNO:26的位置107处的脯氨酸残基；c)用丝氨酸替换SEQ ID NO:26的位置382处的脯氨酸残基；d)用丝氨酸替换SEQ ID NO:26的位置419处的脯氨酸残基；和e)其任何组合。
27.根据权利要求2所述的转基因烟草植物细胞，其进一步包括：
(i)编码CYP82E4烟碱去甲基酶的基因中的一或多个突变，其中所述突变使得所述CYP82E4烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱；及
(ii)编码CYP82E5烟碱去甲基酶的基因中的一或多个突变，其中所述突变使得所述CYP82E5烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱；及
(iii)编码CYP82E10烟碱去甲基酶的基因中的一或多个突变，其中所述突变使得所述CYP82E10烟碱去甲基酶的表达减少或功能减弱。
28.根据权利要求27所述的转基因烟草植物细胞，其中所述CYP82E4烟碱去甲基酶选自由SEQ ID NOs:12至SEQ ID NO:16或其两者或多于两者的组合组成的群组。
29.根据权利要求28所述的转基因烟草植物细胞，其中所述突变引起对所述CYP82E4烟碱去甲基酶的修改且在选自由SEQ ID NO: 5的氨基酸残基329、364、376、382和458或其两者或多于两者的组合组成的群组的位置处发生。
30.根据权利要求29所述的转基因烟草植物细胞，其中所述突变选自由以下各者组成的群组：a)用终止密码子替换SEQ ID NO:5的位置329处的色氨酸残基；b)用天冬酰胺替换SEQ ID NO:5的位置364处的赖氨酸残基；c)用蛋氨酸替换SEQ ID NO:5的位置376处的缬氨酸残基；d)用丝氨酸替换SEQ ID NO:5的位置382处的脯氨酸残基；d)用丝氨酸替换SEQ IDNO:5的位置458处的脯氨酸残基；5组成的群组；和e)其两者或多于两者的任何组合。
31.根据权利要求27所述的转基因烟草植物细胞，其中所述CYP82E5烟碱去甲基酶选自SEQ ID NO:24至SEQ ID NO:25或其组合。
32.根据权利要求31所述的转基因烟草植物细胞，其中所述突变引起对所述CYP82E5烟碱去甲基酶的修改且在SEQ ID NO:17的氨基酸残基422或449或其组合处发生。
33.根据权利要求32所述的转基因烟草植物细胞，其中所述突变选自由以下各者组成的群组：a)用终止密码子替换SEQ ID NO:17的位置422处的色氨酸残基；b)用亮氨酸替换SEQ ID NO:17的位置449处的脯氨酸残基；17；和c)其组合。
34.根据权利要求27所述的转基因烟草植物细胞，其中所述CYP82E10烟碱去甲基酶选自由SEQ ID NO:32至SEQ ID NO:35或其两者或多于两者的组合组成的群组。
35.根据权利要求34所述的转基因烟草植物细胞，其中所述突变引起对所述CYP82E10烟碱去甲基酶的修改且在选自由SEQ ID NO:26的氨基酸残基79、107、382、419或其两者或多于两者的组合组成的群组的位置处发生。
36.根据权利要求35所述的转基因烟草植物细胞，其中所述突变选自由以下各者组成的群组：a)用丝氨酸替换SEQ ID NO:26的位置79处是甘氨酸残基；b)用丝氨酸替换SEQ IDNO:26的位置107处的脯氨酸残基；c)用丝氨酸替换SEQ ID NO:26的位置382处的脯氨酸残基；d)用丝氨酸替换SEQ ID NO:26的位置419处的脯氨酸残基；和e)其任何组合。
37.根据权利要求2所述的转基因烟草植物细胞，其进一步包括：
(i)编码CYP82E4烟碱去甲基酶的基因中的一或多个突变、编码CYP82E5烟减去甲基酶的基因中的一或多个突变和编码CYP82E10烟碱去甲基酶的基因中的一或多个突变，其中所述CYP82E4烟碱去甲基酶包括示于SEQ ID NO:13(W329Stop)中的序列，所述CYP82E5烟碱去甲基酶包括示于SEQ ID NO:24(W422Stop)中的序列，且所述CYP82E10烟碱去甲基酶包括示于SEQ ID NO:33(G79S)中的序列；或
(ii)编码CYP82E4烟碱去甲基酶的基因中的一或多个突变、编码CYP82E5烟碱去甲基酶的基因中的一或多个突变和编码CYP82E10烟碱去甲基酶的基因中的一或多个突变，其中所述CYP82E4烟碱去甲基酶包括示于SEQ ID NO:13(W329Stop)中的序列，所述CYP82E5烟碱去甲基酶包括示于SEQ ID NO:24(W422Stop)中的序列，且所述CYP82E10烟碱去甲基酶包括示于SEQ ID NO:34(P107S)中的序列；或
(iii)编码CYP82E4烟碱去甲基酶的基因中的一或多个突变、编码CYP82E5烟碱去甲基酶的基因中的一或多个突变和编码CYP82E10烟碱去甲基酶的基因中的一或多个突变，其中所述CYP82E4烟碱去甲基酶包括示于SEQ ID NO:中的序列13(W329Stop)中的序列，所述CYP82E5烟碱去甲基酶包括示于SEQ ID NO:24(W422Stop)中的序列，且所述CYP82E10烟碱去甲基酶包括示于SEQ ID NO:35(P382S)中的序列；
(iv)编码CYP82E4烟碱去甲基酶的基因中的一或多个突变，编码CYP82E5烟碱去甲基酶的基因中的一或多个突变和编码CYP82E10 烟碱去甲基酶的基因中的一或多个突变，其中所述CYP82E4烟碱去甲基酶包括示于SEQ ID NO:中的序列13(W329Stop)中的序列，所述CYP82E5烟碱去甲基酶包括示于SEQ ID NO:24(W422Stop)中的序列，且所述CYP82E10烟碱去甲基酶包括示于SEQ ID NO:32(P419S)中的序列。
38.根据权利要求2-37中任一项所述的转基因烟草植物细胞，其中所述突变是杂合或纯合突变。
39.根据权利要求1-37中任一项所述的转基因烟草植物细胞，其中所述植物细胞具有小于1％的烟碱向降烟碱转化。
40.一种烘烤的植物物质，其包括来自包含根据权利要求1-37中任一项所述的转基因烟草植物细胞的转基因烟草植物的生物质、种子、茎、花或叶。
41.一种烟草产品，其包括根据权利要求1至37中任一项所述的转基因烟草植物细胞,或根据权利要求40所述的烘烤的植物物质。
42.一种用于制备具有降低水平的降烟碱及/或NMN的烟草植物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)用重组构建体转化烟草植物，其中所述重组构建体包含抑制烟碱N-去甲基酶的表达的多核苷酸，其中所述烟碱N-去甲基酶包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽；和
(b)测量所述转基因烟草植物中降烟碱及/或NNN的水平，其中所述转基因烟草植物中的降烟碱及/或NNN水平相比于对照烟草植物的降低表示所述突变型烟草植物中的降烟碱及/或NNN水平已降低。
43.根据权利要求42所述的方法，其中还包括在步骤(a)之后烘烤所述烟草植物物质。
44.根据权利要求42或43所述的方法，其中步骤(b)中的所述烟草植物是突变型烟草植物。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述突变型烟草植物包括一或多个其它烟碱N-去甲基酶基因中的一或多个突变。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述突变型烟草植物具有在由CYP82E4、CYP82E5或CYP82E10组成的群组或其两者或更多者的组合的基因中的一或多个其它突变。
47.一种用于产生经烘烤植物物质或花的方法，所述经烘烤植物物质或花与对照植物物质相比在其中具有降低水平的降烟碱水平或与对照植物物质相比在其中具有降低水平的至少NNN或其组合，所述方法包括以下步骤：
(a)提供包含根据权利要求1-37中任一项所述的转基因烟草植物细胞或根据权利要求11所述的植物物质；
(b)自其收获植物物质；及
(c)烘烤所述植物物质一段时间，使得至少降烟碱或NNN的水平低于对照经烘烤植物物质。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述经烘烤植物物质是经烘烤的叶。
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Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106636146B (zh) * 2017-02-16 2019-09-13 云南省烟草农业科学研究院 一种降低尼古丁转化率的cyp82e5基因突变体及其应用
US11046969B2 (en) * 2017-05-24 2021-06-29 Epiplanta Biotech Ltd. Transgenic plant and the method for producing the same
WO2018222667A1 (en) * 2017-05-31 2018-12-06 22Nd Century Limited, Llc Genome editing methods for producing low-nicotine tobacco products
CN111726983A (zh) * 2017-12-07 2020-09-29 肯塔基大学研究基金会 bZIP转录因子调节烟碱向降烟碱的转化
CN108192900B (zh) * 2018-01-16 2021-11-30 西南大学 烟草烟碱去甲基化酶基因cyp82e4的编辑失活载体及其应用
AR115023A1 (es) 2018-03-28 2020-11-18 Philip Morris Products Sa Modulación del contenido de azúcar reductor en una planta
EP3775224A1 (en) 2018-03-28 2021-02-17 Philip Morris Products S.a.s. Modulating amino acid content in a plant
CN108424921B (zh) * 2018-04-20 2021-04-20 云南省烟草农业科学研究院 一种降低尼古丁转化率的cyp82e10基因错义突变体m594及其应用
US11384361B2 (en) 2018-07-26 2022-07-12 Altria Client Services Llc Compositions and methods based on PMT engineering for producing tobacco plants and products having altered alkaloid levels
EP3830251A1 (en) * 2018-08-02 2021-06-09 Antidote Therapeutics, Inc. Novel nicotine degrading enzyme variants
WO2020141062A1 (en) 2018-12-30 2020-07-09 Philip Morris Products S.A. Modulation of nitrate levels in plants via mutation of nitrate reductase
US20220348944A1 (en) 2019-10-01 2022-11-03 Philip Morris Products S.A. Modulating reducing sugar content in a plant (inv)
WO2021063863A1 (en) 2019-10-01 2021-04-08 Philip Morris Products S.A. Modulating sugar and amino acid content in a plant (sultr3)
WO2021113337A1 (en) * 2019-12-03 2021-06-10 Altria Client Services Llc Compositions and methods for producing tobacco plants and products having altered alkaloid levels
US11331020B2 (en) 2020-02-06 2022-05-17 Trustees Of Boston University Enzyme-based electrochemical nicotine biosensor
WO2021221752A2 (en) 2020-02-06 2021-11-04 Trustees Of Boston University High throughput assay for identifying microbial redox enzymes
JP7210806B2 (ja) * 2020-04-17 2023-01-23 日本たばこ産業株式会社 低アルカロイド含量のタバコ属植物体およびその製造方法
CN111505158B (zh) * 2020-05-09 2022-09-23 云南省烟草农业科学研究院 一种基于孵化处理的尼古丁转化烟株色质快速筛查方法
WO2023036691A1 (en) 2021-09-10 2023-03-16 Philip Morris Products S.A. Modulating alkaloid profiles in nicotiana tabacum
CN113980978B (zh) * 2021-11-22 2023-12-26 云南中烟工业有限责任公司 一种烟草烟碱转运蛋白相关的基因及其应用
WO2023117661A1 (en) 2021-12-20 2023-06-29 Philip Morris Products S.A. Increasing anatabine in tobacco leaf by regulating methyl putrescine oxidase
WO2023117701A1 (en) 2021-12-21 2023-06-29 Philip Morris Products S.A. Modulation of nicotine production by alteration of nicotinamidase expression or function in plants
CN114540382B (zh) * 2022-02-18 2023-07-18 贵州省烟草科学研究院 烟草镉转运基因NtPLA1及应用
WO2024079137A1 (en) 2022-10-13 2024-04-18 Philip Morris Products S.A. Increasing leaf biomass and nitrogen use efficiency by regulating ntp2

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7884263B2 (en) * 2005-02-23 2011-02-08 North Carolina State University Alteration of tobacco alkaloid content through modification of specific cytochrome P450 genes
CN102858983A (zh) * 2010-01-15 2013-01-02 北卡罗来纳州立大学 最小化烟草中去甲烟碱合成的组合物和方法

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5810020A (en) 1993-09-07 1998-09-22 Osmotek, Inc. Process for removing nitrogen-containing anions and tobacco-specific nitrosamines from tobacco products
US6202649B1 (en) 1996-12-02 2001-03-20 Regent Court Technologies Method of treating tobacco to reduce nitrosamine content, and products produced thereby
IL133583A (en) 1997-06-20 2003-06-24 Regent Court Technologies Method of treating tobacco to reduce nitrosamine content, and products produced thereby
US7700851B2 (en) * 2001-11-13 2010-04-20 U.S. Smokeless Tobacco Company Tobacco nicotine demethylase genomic clone and uses thereof
BRPI0717355B1 (pt) 2006-10-13 2018-01-16 North Carolina State University Método para obtenção de uma planta transgênica de nicotina, método para obtenção de uma semente; construto de ácido nucléico recombinante; método de redução da conversão de nicotina em nornicotina em uma planta de nicotina
RU2324737C1 (ru) * 2006-10-18 2008-05-20 Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук (СО РАН) Способ получения трансгенных растений табака с повышенным содержанием пролина
US8319011B2 (en) 2006-12-15 2012-11-27 U.S. Smokeless Tobacco Company Llc Tobacco plants having reduced nicotine demethylase activity
BRPI0820042B1 (pt) * 2007-11-12 2020-05-19 North Carolina State University método de obtenção de uma planta de tabaco, ou célula ou parte desta, tendo níveis reduzidos de nornicotina, produto de tabaco, método para fabricar um produto de tabaco, polinucleotídeo isolado, cassete de expressão, polipetpídeo isolado e método de obtenção de uma planta, ou parte de planta desta, do gênero nicotiana
CN104131030A (zh) 2007-12-13 2014-11-05 菲利普莫里斯生产公司 就减少的镉转运进行修饰的转基因植物、衍生产物和相关方法
US7883371B1 (en) 2009-07-22 2011-02-08 Hon Hai Precision Ind. Co., Ltd. Electrical connector with improved contact footprints
JP6388474B2 (ja) 2010-09-03 2018-09-12 フィリップ・モーリス・プロダクツ・ソシエテ・アノニム 植物中の重金属の削減

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7884263B2 (en) * 2005-02-23 2011-02-08 North Carolina State University Alteration of tobacco alkaloid content through modification of specific cytochrome P450 genes
CN102858983A (zh) * 2010-01-15 2013-01-02 北卡罗来纳州立大学 最小化烟草中去甲烟碱合成的组合物和方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NCBI Reference Sequence: XM_016644847.1;GenBank;《GenBank》;20160503;第1-2页 *

Also Published As

Publication number Publication date
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