JP2010136623A - 燃焼煙中のカルボニル類含量が低減されたタバコ属植物およびその作製法 - Google Patents

Abstract

【課題】植物の燃焼煙中のカルボニル類含量が低減された形質転換タバコ属植物を提供する。
【解決手段】デンプン生合成に関与する、特定のアミノ酸配列からなる４種のタンパク質の中、いずれかのタンパク質をコードする遺伝子の発現が抑制され、燃焼煙中のホルムアルデヒド、アクロレイン等のカルボニル類含量が低減される、タバコ属植物。および、該目的のために用いられるアンチセンス鎖等を含むベクター、それから得られるタバコ製品、さらにカルボニル類含量の低減方法。
【選択図】図１３

Description

本発明は、燃焼煙中のカルボニル類含量が低減されたタバコ属植物およびその作製法に関する。

タバコの燃焼煙中には様々な成分、例えばタール、ニコチン、カルボニル類などが含まれている。タール、ニコチンなどは、喫煙の満足感や香喫味に関連し、カルボニル類は、煙の刺激性に関連すると考えられている。従って、タール、ニコチンなどの量を相対的に高いレベルに保ったまま、カルボニル類の量を低減することか望まれる。

煙中カルボニル類を生成する原因物質の１つが、糖類である可能性が示唆されている。乾燥処理により葉タバコ中のデンプンは分解されて、糖類が生成することが知られている。植物のデンプン合成に関与する遺伝子は、例えばＡＤＰ−ｇｌｕｃｏｓｅ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ ｓｍａｌｌ ｓｕｂｕｎｉｔ（ＡＧＰＳ）遺伝子、葉緑体型Ｆｒｕｃｔｏｓｅ−１，６−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＦＢＰａｓｅ）遺伝子、葉緑体型Ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｓｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ（ＰＧＩ）遺伝子、ｉｓｏａｍｙｌａｓｅ遺伝子、Ｓｏｌｕｂｌｅ ｓｔａｒｃｈ ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＳＳＳ）遺伝子、Ｇｒａｎｕｌｅ ｂｏｕｎｄ ｓｔａｒｃｈ ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＧＢＳＳ）遺伝子、Ｂｒａｎｃｈｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ（ＢＥ）遺伝子などが知られている。

ＡＤＰ−ｇｌｕｃｏｓｅ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ ｓｍａｌｌ ｓｕｂｕｎｉｔ（ＡＧＰＳ）遺伝子は、デンプン合成の基質であるＡＤＰ−ｇｌｕｃｏｓｅを合成する反応を触媒する酵素：ＡＤＰ−ｇｌｕｃｏｓｅ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ（ＡＧＰａｓｅ）を構成するサブユニットの一つをコードしている。１９８８年Ｔｓａｎ−Ｐｉａｏ Ｌｉｎらによって、シロイヌナズナのａｄｇ１変異体では葉のデンプン含量が対照の１／４０以下に低下し、ＡＧＰａｓｅ ｌａｒｇｅ ｓｕｂｕｎｉｔ（ＡＧＰＬ）、ＡＧＰＳ両方のタンパク質の発現とＡＤＰ−ｇｌｕｃｏｓｅ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ（ＡＧＰａｓｅ）活性が検出限界以下であることが報告された（非特許文献１）。１９９８年Ｓｈｕｅ−Ｍｅｉ Ｗａｎｇらによってａｄｇ１変異体はＡＧＰＳ遺伝子の１アミノ酸置換変異によることが報告された（非特許文献２）。ＡＧＰＳ遺伝子を用いた遺伝子組換え実験例としては、１９９５年Ｋ．Ｌｅｉｄｒｅｉｔｅｒらによって、３５ＳプロモーターあるいはＳＴ−ＬＳ１プロモーター制御下でアンチセンスＡＧＰＳ遺伝子を発現させた形質転換ポテトにおいて、葉のＡＧＰａｓｅ活性を１／１０−１／１５に低下させることにより葉のデンプン含量が１／２−１／３に低下したことが報告された（非特許文献３）。１９８８年Ｓｃｈｕｃｈ Ｗｏｌｆｇａｎｇ Ｗａｌｔｅｒらによって、ＡＧＰａｓｅをコードする遺伝子のアンチセンスｍＲＮＡを発現させることにより、デンプン合成を抑制する植物を請求項に含む出願がなされている（特許文献１）。

葉緑体型Ｆｒｕｃｔｏｓｅ−１，６−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＦＢＰａｓｅ）は、植物の炭酸固定経路であるカルビン回路においてＦｒｕｃｔｏｓｅ−１，６−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＦＢＰ）をＦｒｕｃｔｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ｆ６Ｐ）に不可逆的に変換する反応を触媒することが知られており、１９８８年にＲａｉｎｅｓ ＣＡらによって小麦から初めて葉緑体型ＦＢＰａｓｅのｃＤＮＡが単離された（非特許文献４）。１９９４年にＪ．Ｋｏｓｓｍａｎｎらによって、３５Ｓプロモーター制御下においてアンチセンスＦＢＰａｓｅ ｃＤＮＡを導入したポテトの活性が野生株の１２％に低下した個体では、葉面積当たりのグルコース、フルクトース、ショ糖、デンプンの含量が低下したことが報告された（非特許文献５）。２００４年にＭ．Ｓａｈｒａｗｙらによって、３５Ｓプロモーター支配下でアンチセンス葉緑体型ＦＢＰａｓｅ ｃＤＮＡを導入したシロイヌナズナでは、活性が最大４１％低減したが葉の炭水化物含量（グルコース＋フルクトース＋ショ糖＋デンプン）は大きな低減はしなかったことが報告された（非特許文献６）。

葉緑体型ＰＧＩは、ＦＢＰａｓｅによりできたＦ６ＰをＧｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ｇ６Ｐ）に可逆的に変換する反応を触媒することが知られている。これまで葉緑体型ＰＧＩの欠損変異体は、Ｃｌａｒｋｉａ Ｘａｎｔｉａｎａ（１９８６年、非特許文献７）とシロイヌナズナ（２０００年、非特許文献８）について報告がある。前者の報告では葉緑体型ＰＧＩ活性が半減し、葉のデンプン含量が野生株の６０％に低減し、後者では各々野生株の２％、１．５％に低減した。遺伝子組換えにより葉緑体型ＰＧＩの発現を増減させた文献、特許等の報告はこれまでのところない。

ｉｓｏａｍｙｌａｓｅ遺伝子については、１９９５年にＭ．Ｇ．Ｊａｍｅｓらによってトウモロコシｓｕｇａｒｙ１変異体の原因遺伝子として植物のｉｓｏａｍｙｌａｓｅ遺伝子（ｉｓｏａｍｙｌａｓｅ１）が初めて単離された（非特許文献９）。２００４年Ｒ．Ｂｕｓｔｏｓらによって、３５Ｓプロモーター制御下でアンチセンスｉｓｏａｍｙｌａｓｅ（ｉｓｏａｍｙ１）ｃＤＮＡを導入したポテトの塊茎のデンプン含量が１０−２０％低下することが報告された（非特許文献１０）。２００５年Ｔ．Ｄｅｌａｔｔｅら（非特許文献１１）及びＦ．Ｗａｔｔｅｂｌｅｄら（非特許文献１２）によってシロイヌナズナのｉｓｏａｍｙ１欠損変異体では、葉のデンプンと可溶性グルカンを合わせた含量が野生株に比べて３０％程度減少したことが報告された。Ｉｓｏａｍｙ１はデンプン（アミロペクチン）のα−１，６結合の枝分かれを切断する反応を触媒するとともに、アミロペクチンの合成に重要であることが知られている。

一方、特許文献２〜８には、タバコ燃焼煙中のカルボニル類をフィルター等で除去する技術が開示されているが、これらのフィルターはタールやニコチンも除去するので好ましくない。

また、他の特許文献には、タバコ煙中のアルデヒド類を除去するためのアミノ酸の使用（特許文献９）、ホルムアルデヒドを選択除去するハイロドタルサイト類化合物を添加したフィルター（特許文献１０）、特異な吸着特性をもつ結晶性ゼオライトの利用（特許文献１１）、塩基性ポリペプチドを添加したフィルター（特許文献１２）が開示されており、たばこ製品の燃焼煙中に含まれる低級アルデヒドを特異的に低減する方法として、特異的吸着剤を添加したフィルターの利用が有効であると考えられる。

しかし、これらのような選択性の高い高機能フィルターは通気抵抗が増大してしまうという欠点がある。

従って、フィルターによらず、燃焼煙中のカルボニル類を低減すること、例えば燃焼煙中のカルボニル類を低減可能な葉タバコ原料の開発が望まれる。また、そのような葉たばこ原料を提供可能なタバコ新品種の開発は、たばこ産業上重要である。

非特許文献１３には、従来のタバコの燃焼煙中のカルボニル類の研究において、糖類をタバコ刻みに添加した場合にカルボニル類の発生量が増加することが報告されている。しかし、葉タバコ中の糖類の含量を減少させた場合、または糖類ではなく葉タバコ中のもうひとつの主要な非構造性炭水化物であるデンプン含量を低減させた場合、あるいは葉タバコ中の糖類とデンプンの総量つまり非構造性炭水化物含量（以下、「炭水化物」という。）を減少させた場合に、燃焼煙中のカルボニル類含量が減少するかどうかは未知である。

また、原料葉タバコ中の炭水化物含量には、収穫時の葉タバコ中の炭水化物含量と収穫後の乾燥法の両者が影響を及ぼす。前者では、タバコ品種、栽培時の気候条件、施肥条件、収穫時期などの違いによって、後者では、黄色種を中心に用いられる風火力乾燥を行うか、バーレー種を中心に用いられる自然乾燥を行うかによって、葉タバコ原料中の炭水化物含量が異なってくることが知られている。一般に、紙巻タバコの主要原料でありかつ香味原料である黄色種の原料葉タバコで糖やデンプンといった炭水化物含量が高く、バーレー種の原料葉タバコなどで葉タバコ中の炭水化物含量が低いことが知られている。また、黄色種の原料葉タバコは、バーレー種の原料葉タバコと比較して、煙中カルボニルの発生が多いことが知られている。

また、タバコの葉のデンプン、糖含量等を低減させた形質転換タバコについては、葉緑体型Ｔｒａｎｓｋｅｔｏｌａｓｅ（非特許文献１４）、Ｒｕｂｉｓｃｏ ｓｍａｌｌ ｓｕｂｕｎｉｔ（ＲｂｃＳ）（非特許文献１５）の発現を抑制させた例などが報告されている。前者では標的遺伝子発現を抑制することにより、生葉重当たりの葉中グルコース、ショ糖、デンプンが最大でコントロールの２０〜２５％程度に低減し、後者では、生葉重当たりの葉中デンプン、グルコース、フルクトース、ショ糖が各々コントロールの５〜３０％程度に減少したことが開示されている。

しかしながら、前者ではシュートの生葉重、長さが減少し、後者では強く生育が阻害され、葉タバコの原料になり得る形質転換植物ではないと考えられる。

英国特許出願第１９８８００２６３５６号 特開昭５９−０８８０７８号公報 特開昭５９−１５１８８２号公報 特開昭６０−０５４６６９号公報 特開平０９−１６８７３６号公報 特表２００２−５２８１０５号公報 特表２００２−５２８１０６号公報 特表２００３−５０５６１８号公報 米国特許第２９６８３０６号明細書 国際公開第２００３／０５６９４７号パンフレット 米国特許出願公開第２００５／０１３３０４７号明細書 特開２００６−３４１２７号 Ｔｓａｎ−Ｐｉａｏ Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．"Ａ Ｓｔａｒｃｈ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ Ｍｕｔａｎｔ ｏｆ Ａｒａｂｉｓｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ｗｉｔｈ Ｌｏｗ ＡＤＰ−ｇｌｕｃｏｓｅ Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｌａｃｋｓ Ｏｎｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｗｏ Ｓｕｂｕｎｉｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅ"Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ ８８．１１７５−１１８１（１９８８） Ｓｈｕｅ−Ｍｅｉ Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．"Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＤＧ１， ａｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｌｏｃｕｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ ＡＤＰＧ ｐｙｒｏｐｈｏｓｈｏｒｙｌａｓｅ ｓｍａｌｌ ｓｕｂｕｎｉｔ， ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｍａｌｌ ｓｕｂｕｎｉｔ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｌａｒｇｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ"Ｐｌａｎｔ Ｊ．１３（１）６３−７０（１９９８） Ｋｉｒｓｔｅｎ Ｌｅｉｄｒｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．"Ｌｅａｆ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔａｒｃｈ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｏｔａｔｏ Ｐｌａｎｔｓ Ｌｅａｄｓ ｔｏ ａｎ Ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ Ｐｈｏｔｏａｓｓｉｍｉｌａｔｅ Ｅｘｐｏｒｔ ｆｒｏｍ Ｓｏｕｒｃｅ Ｌｅａｖｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｌｉｇｈｔ Ｐｅｒｉｏｄ"Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３６（４）：６１５−６２４（１９９５） Ｒａｉｎｅｓ ＣＡ，Ｌｌｏｙｄ ＪＣ，Ｌｏｎｇｓｔａｆｆ Ｍ，Ｂｒａｄｌｅｙ Ｄ ａｎｄ Ｄｙｅｒ ＴＡ"Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ ｆｒｕｃｔｏｓｅ−１，６−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ： ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ａ ｍｏｓａｉｃ ｇｅｎｅ"Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：７９３１−７９４２（１９８８） Ｊ．Ｋｏｓｓｍａｎｎ，Ｕ．Ｓｏｎｎｅｗａｌｄ ａｎｄ Ｌ．Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ"Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｉｃ ｆｒｕｃｔｏｓｅ−１，６−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｏｔａｔｏ ｐｌａｎｔｓ ｉｍｐａｉｒｓ ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｐｌａｎｔ ｇｒｏｗｔｈ"Ｐｌａｎｔ Ｊ．６（５），６３７−６５０（１９９４） Ｍ．Ｓａｈｒａｗｙ，Ｃ．Ａｖｉｌａ，Ａ．Ｃｈｕｅｃａ，Ｆ．Ｍ．Ｃａｎｏｖａｓ ａｎｄ Ｊｕｌｉｏ Ｌｏｐｅｚ−Ｇｏｒｇｅ"Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｓｕｃｒｏｓｅ ｌｅｖｅｌ ａｎｄ ａｌｔｅｒｅｄ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｉｃ ｆｒｕｃｔｏｓｅ−１，６−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ"Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔ．５５（４０８）：２４９５−２５０３（２００４） Ｔ．Ｗ．Ａ．Ｊｏｎｅｓ，Ｌ．Ｄ．Ｇｏｔｔｌｉｅｂ ａｎｄ Ｅ．Ｐｉｃｈｅｒｓｋｙ"Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｅｎｚｙｍｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ Ｓｔａｒｃｈ Ｌｅｖｅｌ ｉｎ ａｎ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｍｕｔａｎｔ ｏｆ Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ Ｐｈｏｓｈｏｇｌｕｃｏｓｅ Ｉｓｏｍｅｒａｓｅ"Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ ８１：３６７−３７１（１９８６） Ｔ−Ｓ．Ｙｕ，Ｗ−Ｌ Ｌｕｅ，Ｓ−Ｍ．Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｊ．Ｃｈｅｎ"Ｍｕｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｐｌａｓｔｉｄ ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｓｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ ａｆｆｅｃｔｓ ｌｅａｆ ｓｔａｒｃｈ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｆｌｏｒａｌ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ"Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １２３：３１９−３２５（２０００） Ｍ．Ｇ．Ｊａｍｅｓ，Ｄ．Ｓ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ ａｎｄ Ａ．Ｍ Ｍｅｙｅｒｓ"Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｍａｉｚｅ Ｇｅｎｅ ｓｕｇａｒｙ１， ａ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ ｏｆ Ｓｔａｒｃｈ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｉｎ Ｋｅｒｎｅｌｓ"Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １７：４１７−４２９（１９９５） Ｒ．Ｂｕｓｔｏｓ，Ｂ．Ｆａｈｙ，Ｃ．Ｍ．Ｈｙｌｔｏｎ，Ｒ．Ｓｅａｌｅ，Ｎ．Ｍ．Ｎｅｂａｎｅ，Ａ．Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｃ．Ｍａｒｔｉｎ ａｎｄ Ａ．Ｍ．Ｓｍｉｔｈ"Ｓｔａｒｃｈ ｇｒａｎｕｌｅ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｉｓ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｂｙ ａ ｈｅｔｅｒｏｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ ｉｓｏａｍｙｌａｓｅ ｉｎ ｐｏｔａｏ ｔｕｂｅｒｓ"ＰＮＡＳ １０１（７）：２２１５−２２２０（２００４） Ｔｈｉｅｒｒｙ Ｄｅｌａｔｅ，Ｍａｒｔｉｎｅ Ｔｒｅｖｉｓａｎ，Ｍａｒｙ Ｌ．Ｐａｒｋｅｒ ａｎｄ Ｓａｍｕｅｌ Ｃ．Ｚｅｅｍａｎ"Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｍｕｔａｎｔｓ Ａｔｉｓａ１ ａｎｄ Ａｔｉｓａ２ ｈａｖｅ ｉｄｅｎｔｉｃａｌ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ ａｎｄ ｌａｃｋ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ ｉｓｏａｍｙｌａｓｅ， ｗｈｉｃｈ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｔｈｅ ｂｒａｎｃｈ ｐｏｉｎｔ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｙｌｏｐｅｃｔｉｎ ｄｕｒｉｎｇ ｓｔａｒｃｈ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ"Ｐｌａｎｔ Ｊ．４１：８１５−８３０（２００５） Ｆ．Ｗａｔｔｅｂｌｅｄ，Ｙ．Ｄｏｎｇ，Ｓ．Ｄｕｍｅｚ，Ｄ．Ｄｅｌｖａｌｌｅ，Ｖ．Ｐｌａｎｃｈｏｔ，Ｐ．Ｂｅｒｂｅｚｙ，Ｄ．Ｖｙａｓ，Ｐ．Ｃｏｌｏｎｎａ，Ｍ．Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ，Ｓ．Ｂａｌｌ ａｎｄ Ｃ．Ｄ’Ｈｕｌｓｔ"Ｍｕｔａｎｔ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ｌａｃｋｉｎｇ ａ Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｉｃ Ｉｓｏａｍｙｌａｓｅ Ａｃｃｕｍｕｌａｔｅ Ｐｈｙｔｏｇｌｙｃｏｇｅｎ ａｎｄ ａｎ Ａｂｎｏｒｍａｌ Ｆｏｒｍ ｏｆ Ａｍｙｌｏｐｅｃｔｉｎ"Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１３８（１）：１８４−１９５（２００５） Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ４４，（２００６）１７８９−１７９８，１７９９−１８２２ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ｖｏｌ１３，５３５−５５１（２００１） Ｐｌａｎｔ Ｊ．３０（６），６６３−６７７（２００２）

本発明の目的は、タバコ属植物の乾燥葉の燃焼煙中のカルボニル類含量を低減させたタバコ属植物およびその作製法を提供することにある。

本発明者らは、通常タバコ栽培ではデンプンを成熟葉に蓄積させるが、これとは逆に、成熟葉のデンプンの蓄積量を例えば遺伝子組み換えにより低減させると、黄色乾燥した葉タバコ原料においてもタバコ煙中のカルボニル類の発生量が減少することを見出し、本発明を完成した。

本発明の特徴は、要約すると以下の通りである。
（１）以下の（ａ）〜（ｃ）に示すいずれかのタンパク質をコードするデンプン生合成に関与する遺伝子の発現が抑制され、燃焼煙中のカルボニル類含量が低減された、タバコ属植物。
（ａ）配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５および配列番号５６からなる群から選択されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５および配列番号５６からなる群から選択されたアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつデンプン生合成に関与するタンパク質
（ｃ）配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５および配列番号５６からなる群から選択されたアミノ酸配列に対して８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつデンプン生合成に関与するタンパク質
（２）前記遺伝子が、
（ｄ）配列番号４、配列番号７、配列番号８および配列番号１２からなる群から選択された塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号４、配列番号７、配列番号８および配列番号１２からなる群から選択された塩基配列に対して８５％以上の同一性を有し、かつデンプン生合成に関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｆ）配列番号４、配列番号７、配列番号８および配列番号１２からなる群から選択された塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつデンプン生合成に関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、または
（ｇ）配列番号４、配列番号７、配列番号８および配列番号１２からなる群から選択された塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつデンプン生合成に関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
を含む、（１）に記載のタバコ属植物。
（３）前記カルボニル類が、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、アセトン、アクロレイン、プロピオンアルデヒド、クロトンアルデヒド、メチルエチルケトンおよびブチルアルデヒドからなる群から選択される、（１）または（２）に記載のタバコ属植物。
（４）前記カルボニル類が、ホルムアルデヒドまたはアクロレインである、（３）に記載のタバコ属植物。
（５）（１）〜（４）のいずれかに記載のタバコ属植物の組織または細胞。
（６）前記組織が葉である、（５）に記載の組織または細胞。
（７）配列番号４に示す塩基配列、配列番号７に示す塩基配列、配列番号８に示す塩基配列、配列番号１２に示す塩基配列、それらの配列に対して９０％以上の同一性を有する塩基配列、およびそれらの塩基配列の２０塩基以上の部分配列からなる群から選択される塩基配列を含む、遺伝子発現抑制用ベクター。
（８）前記塩基配列の連続した２０塩基以上からなる塩基配列をアンチセンス方向に含む、（７）に記載のベクター。
（９）前記塩基配列のセンス鎖および該センス鎖に対合するアンチセンス鎖を含む、（７）に記載のベクター。
（１０）前記センス鎖およびアンチセンス鎖が、前記塩基配列の連続した２０塩基以上からなる、（９）に記載のベクター。
（１１）前記センス鎖とアンチセンス鎖の間にスペーサーを有する、（９）または（１０）に記載のベクター。
（１２）植物細胞内で作動可能なプロモーターを有する、（９）〜（１１）のいずれかに記載のベクター。
（１３）タバコ属植物の細胞または組織を、ＲＮＡ干渉法、アンチセンス法、遺伝子破壊法、人為的突然変異法、リボザイム法、共抑制法及び転写因子を用いた方法から選択されるいずれかの方法を用いて、（１）および（２）に定義された（ａ）〜（ｇ）のいずれかの遺伝子の発現を抑制し、植物体を再生することを含む、（１）〜（４）のいずれかに記載のタバコ属植物を作製する方法。
（１４）（７）〜（１２）のいずれかに記載のベクターを、植物細胞または組織に導入し、植物体を再生する、（１３）に記載の方法。
（１５）前記植物体を母本として後代を作出する、（１４）に記載の方法。
（１６）（１）〜（４）のいずれかに記載のタバコ属植物の後代であって、（１）または（２）に定義された（ａ）〜（ｇ）のいずれかの遺伝子の発現が抑制されたことを特徴とする、後代。
（１７）（１）〜（４）のいずれかに記載のタバコ属植物または（１６）に記載の後代の葉から作製されたタバコ製品。
（１８）タバコ属植物において、（１）または（２）に定義された（ａ）〜（ｇ）のいずれかの遺伝子の発現を抑制することを含む、タバコ属植物の燃焼煙中のカルボニル類含量を低減する方法。
（１９）前記遺伝子の発現の抑制を、ＲＮＡ干渉法、アンチセンス法、遺伝子破壊法、人為的突然変異法、リボザイム法、共抑制法及び転写因子を用いた方法からなる群から選択される方法によって行うことを含む、（１８）に記載の方法。
（２０）（７）〜（１２）のいずれかに記載のベクターを植物細胞または組織に導入する、（１８）または（１９）に記載の方法。

本発明によれば、葉たばこの原料となりうるタバコ植物および乾燥葉たばこにおいて、タバコの成熟葉のデンプンの蓄積を減少させて、乾燥葉の燃焼煙中のカルボニル類含量を低減するという格別の作用効果を提供することができる。

１．本発明のタバコ属植物
本発明のタバコ属植物は、
（ａ）配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５および配列番号５６からなる群から選択されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５および配列番号５６からなる群から選択されたアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつデンプン生合成に関与するタンパク質、または
（ｃ）配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５および配列番号５６からなる群から選択されたアミノ酸配列に対して８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつデンプン生合成に関与するタンパク質
をコードする遺伝子の発現が抑制されるか、または
（ｄ）配列番号４、配列番号７、配列番号８および配列番号１２からなる群から選択された塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号４、配列番号７、配列番号８および配列番号１２からなる群から選択された塩基配列に対して８５％以上の同一性を有し、かつデンプン生合成に関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｆ）配列番号４、配列番号７、配列番号８および配列番号１２からなる群から選択された塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつデンプン生合成に関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、または
（ｇ）配列番号４、配列番号７、配列番号８および配列番号１２からなる群から選択された塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつデンプン生合成に関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
を含む遺伝子の発現が抑制されることを特徴とする。

配列番号５３で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質は、ＡＧＰＳ（ＡＤＰ−ｇｌｕｃｏｓｅ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ ｓｍａｌｌ ｓｕｂｕｎｉｔ、完全長塩基配列：配列番号４）である。ＡＧＰＳは、デンプン合成の基質であるＡＤＰ−ｇｌｕｃｏｓｅを合成する反応を触媒する酵素：ＡＤＰ−ｇｌｕｃｏｓｅ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ（ＡＧＰａｓｅ）を構成する大、小のサブユニットのうち小サブユニットであり、ＡＧＰａｓｅはデンプン合成の基質であるＡＤＰ−ｇｌｕｃｏｓｅを供給する働きをしている。

配列番号５４で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質は、葉緑体型ＦＢＰａｓｅ（Ｆｒｕｃｔｏｓｅ−１，６−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、塩基配列：配列番号７）である。ＦＢＰａｓｅは、炭酸同化回路であるカルビン回路に必須の酵素であり、Ｆｒｕｃｔｏｓｅ−１，６−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＦＢＰ）を、デンプン合成への代謝経路の初発反応の基質であるＦｒｕｃｔｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ｆ６Ｐ）に不可逆的に変換する反応を触媒する。

配列番号５５で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質は、葉緑体型ＰＧＩ（Ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｓｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ、完全長塩基配列：配列番号８）である。ＰＧＩは、大気中の二酸化炭素を固定するカルビン回路からデンプン合成への代謝経路の初発反応である、ＦＢＰａｓｅによりできたＦ６ＰをＧｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ｇ６Ｐ）に可逆的に変換する反応を触媒する。

配列番号５６で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質は、ｉｓｏａｍｙ１（Ｉｓｏｍｅｒａｓｅ１、完全長塩基配列：配列番号１２）である。ｉｓｏａｍｙ１は、デンプンのうち、分枝を多く持つグルコースポリマーであるアミロペクチンのα−１，６結合の枝分かれを切断する反応を触媒するとともに、アミロペクチンの合成に重要であることが知られている。

上記４つのタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１つの発現を抑制すれば、デンプンおよび糖類（例えばショ糖、グルコースおよびフルクトース）の合成または蓄積が抑制され、炭水化物の総量が低減されることによって、タバコ燃焼煙中のカルボニル類を低減させることが可能である。また、ＡＧＰＳ、ＦＢＰａｓｅ、ＰＧＩおよびｉｓｏａｍｙ１に限らず、カルビン回路からデンプン合成への代謝経路に関与する少なくとも１つの遺伝子の発現を低減させることによっても、タバコ燃焼煙中のカルボニル類を低減させることが可能であると考えられる。

上記４つのタンパク質をそれぞれコードする遺伝子は、
（ａ）配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５および配列番号５６からなる群から選択されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５および配列番号５６からなる群から選択されたアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつデンプン生合成に関与するタンパク質
（ｃ）配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５および配列番号５６からなる群から選択されたアミノ酸配列に対して８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつデンプン生合成に関与するタンパク質
をコードする遺伝子を含み、デンプンを合成する代謝経路のうち、炭酸固定回路、炭酸固定回路からデンプン合成への代謝経路につながる分岐点、デンプン合成の基質合成、デンプンの構造修飾を含むアミロペクチンの合成にわたる一連のデンプン合成経路を代表している。

ここで、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列とは、配列番号５３、５４、５５または５６のアミノ酸配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が変異により欠失、または他のアミノ酸に置換、あるいは付加された配列をいう。変異は、人為的に導入された変異または天然に存在する変異でもよい。

また、配列番号５３、５４、５５または５６のアミノ酸配列に対して８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列は、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、９９％以上の同一性であることが望ましい。配列の同一性は、ＦＡＳＴＡ検索やＢＬＡＳＴ検索により決定することができる。

また、上記遺伝子は、
（ｄ）配列番号４、配列番号７、配列番号８および配列番号１２からなる群から選択された塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｅ）配列番号４、配列番号７、配列番号８および配列番号１２からなる群から選択された塩基配列に対して８５％以上の同一性を有し、かつデンプン生合成に関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｆ）配列番号４、配列番号７、配列番号８および配列番号１２からなる群から選択された塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつデンプン生合成に関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｇ）配列番号４、配列番号７、配列番号８および配列番号１２からなる群から選択された塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつデンプン生合成に関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
を含む。

ここで、１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列とは、配列番号４、７、８または１２に示す塩基配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個の塩基が変異により欠失、または他の塩基に置換、あるいは付加された配列をいう。変異は、人為的に導入された変異または天然に存在する変異でもよい。

配列番号４、７、８または１２に示す塩基配列に対して８５％以上の同一性を有する塩基配列は、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、９９％以上の同一性であることが望ましい。配列の同一性は、ＦＡＳＴＡ検索やＢＬＡＳＴ検索により決定することができる。

ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイズ可能であれば特に限定されないが、例えば、０．２５Ｍ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ７．２、７％ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１×デンハルト溶液からなる緩衝液中で６０℃、好ましくは６５℃、さらに好ましくは６８℃の条件下で１６〜２４時間ハイブリダイズさせ、さらに２０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ７．２、１％ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡからなる緩衝液中で６０℃、好ましくは６５℃、さらに好ましくは６８℃の条件下で１５分間の洗浄を２回実施する条件が好ましい。

上記４つのタンパク質をそれぞれコードする遺伝子の発現の抑制には、該遺伝子の転写の抑制およびタンパク質への翻訳の抑制が含まれ、遺伝子の発現の完全な停止のみならず発現の減少も含まれる。遺伝子が人為的または天然に変異、破壊されたり、あるいは各種遺伝子工学的手法、例えばＲＮＡ干渉法、アンチセンス法、リボザイム法、共抑制法、転写因子を用いた方法などを用いることにより、発現不能または抑制される。

上記4つのタンパク質をそれぞれコードする遺伝子の発現を抑制してもしなくても、結果的に活性を抑制することになれば、遺伝子の発現を抑制したことと同じ効果が達成される。例えば、人工的あるは自然に変異が生じた変異体を選抜することにより、活性に重要なアミノ酸部位が欠損あるいは置換した変異体を得ることができる。これらの変異体は遺伝子配列に欠損あるいは置換が生じているが、遺伝子発現及びタンパク質発現は正常である場合がある（Ｓｈｕｅ−Ｍｅｉ Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ １９９７，１１（５），１１２１−１１２６、Ｓｃｈｅｉｂｌｅ ＷＲ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔａ １９９７，２０３（３），３０４−３１９）。遺伝子組換えの手法を用いるとすれば、活性に重要なアミノ酸部位が欠損あるいは置換されるように配列を改変した遺伝子を植物内で高発現させることによって達成可能である。タンパク質が複数個で高次構造を形成することによって活性を持つ場合は、配列を改変した遺伝子から作られたタンパク質が内生タンパク質と高次構造を形成することにより、内生タンパク質同士の高次構造形成が阻害され、活性低下を引き起こすことが可能である（Ｊｏａｎｎａ Ｍ． Ｃｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ２００５，Ｐｌａｎｔ Ｊ．４１，５０１−５１１）。

本発明のタバコ属植物は、植物、特に乾燥された葉の燃焼煙中のカルボニル類が低減することを特徴とする。

たばこ製品の燃焼煙中には多種多様な成分が存在することが知られており（Ｇｒｅｅｎ ＣＲ． ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｒｅｃｅｎｔ Ａｄｖ． Ｔｏｂａｃｃｏ Ｓｃｉ．２２：１３１−３０４）、これら燃焼煙中の成分は複雑に関係しながら喫煙の満足感や香喫味に繋がると考えられている。特にカルボニル類は、煙の刺激性と関連すると考えられ、具体的には、例えばホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、アセトン、アクロレイン、プロピオンアルデヒド、クロトンアルデヒド、メチルエチルケトン、ブチルアルデヒドが挙げられる。本発明では、これらのカルボニル類、特にホルムアルデヒドとアクロレインの含量を有意に低減することができた。また、カルボニル類以外にも、炭素骨格を持つ化合物が低減する可能性が考えられ、そのような化合物として、例えばＨｙｄｒｏｑｕｉｎｏｎｅ、Ｒｅｓｏｒｃｉｎｏｌ、Ｃａｔｅｃｈｏｌ、Ｐｈｅｎｏｌ、ｍ，ｐ−Ｃｒｅｓｏｌ、ｏ−Ｃｒｅｓｏｌといった煙中フェノール化合物やベンツピレン、ＣＯが挙げられる。

また、煙中のカルボニル類の起源となる物質の１つに、タバコ属植物に含まれるデンプンがある。

タバコ属植物のデンプンは、葉の成熟過程において多量に蓄積されるが、そのデンプンは、一般的な植物に確認されている、日中一時的に葉に蓄えられ、夜間に分解される同化デンプンとは異なり、夜間に分解されないデンプンである（Ｎ．Ｋ．Ｍａｔｈｅｓｏｎら、１９６２年、１９６３年、Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．１５，４４５−４５８、Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．１６．７０−７６）。特にタバコ栽培においては花部を切除することから、葉における光合成産物の花部への転流が抑制されるために、成熟葉においては多量のデンプンが蓄積される。

タバコの葉は、乾燥（黄色種の場合は黄色乾燥）されて、製品の原料として使用されるが、この乾燥過程で、葉の内容成分が大きく変化し、例えばデンプンはショ糖、グルコース、フルクトースといった糖に分解されることが知られている。

本発明においては、デンプン＋ショ糖＋グルコース＋フルクトースの総量として低下していれば、個々のどの成分が低下してもタバコ燃焼煙中のカルボニル類を低減させることが可能である。デンプンと３糖（ショ糖＋グルコース＋フルクトース）に限らず、それ以外の糖を含めて非構造性炭水化物についても低減させることができればタバコ燃焼煙中のカルボニル類を低減させることが可能と考えられる。

一般に、たばこの燃焼煙中の成分の測定は、刻んだ乾燥葉たばこを巻紙で巻いたものをＩＳＯ準拠の喫煙条件等で自動喫煙させた煙を捕集して行うことができる。より簡便に、より少量のサンプルから燃焼煙中の成分を捕集、測定する方法として、熱分解による方法が報告されており（Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ．；４２，１４０９−１４１７）、その方法によりカルボニル類の測定が可能であるが（Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ４３，５５９−５６８．）、これに限定されない。

なお、本発明には、本発明のタバコ属植物の組織または細胞（例えば根、茎、葉、花、種子、胚、胚珠、子房、茎頂、約、花粉、カルス、プロトプラスト、懸濁培養細胞など）も包含される。

２．遺伝子発現抑制用ベクター
本発明の遺伝子発現抑制用ベクターは、
（ａ）配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５および配列番号５６からなる群から選択されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５および配列番号５６からなる群から選択されたアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつデンプン生合成に関与するタンパク質、または
（ｃ）配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５および配列番号５６からなる群から選択されたアミノ酸配列に対して８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつデンプン生合成に関与するタンパク質
をコードする遺伝子、あるいは
（ｄ）配列番号４、配列番号７、配列番号８および配列番号１２からなる群から選択された塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号４、配列番号７、配列番号８および配列番号１２からなる群から選択された塩基配列に対して８５％以上の同一性を有し、かつデンプン生合成に関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｆ）配列番号４、配列番号７、配列番号８および配列番号１２からなる群から選択された塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつデンプン生合成に関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、または
（ｇ）配列番号４、配列番号７、配列番号８および配列番号１２からなる群から選択された塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつデンプン生合成に関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
の発現を抑制するための核酸分子を適当なベクターに挿入したものである。

本発明のベクターは、例えば、配列番号４に示す塩基配列、配列番号７に示す塩基配列、配列番号８に示す塩基配列、配列番号１２に示す塩基配列、それらの配列に対して９０％以上の同一性を有する塩基配列、およびそれらの塩基配列の２０塩基以上の部分配列からなる群から選択される塩基配列を含む。このようなベクターとして、アンチセンスベクターまたはＲＮＡ干渉誘導ベクターなどがある。

アンチセンスベクターとは、アンチセンス法にて上記４つのタンパク質（ＡＧＰＳ、ＦＢＰａｓｅ、ＰＧＩ、ｉｓｏａｍｙ１）のいずれかをコードする遺伝子、その変異体または相同体の発現を抑制する核酸分子を含むベクターをいう。相同体とは、上記４つのタンパク質のいずれかをコードする遺伝子に対応する遺伝子であって、タバコ属植物品種間で、またはタバコ属植物以外の植物で、異なる塩基配列を有する遺伝子をいう。

アンチセンス法とは、目的遺伝子から転写されたｍＲＮＡと相補的なアンチセンスＲＮＡを発現させて、該アンチセンスＲＮＡを目的遺伝子と相補的に結合させ、目的遺伝子の転写を妨げ、その結果として該遺伝子の発現を抑制する方法をいう。具体的には、植物で機能するプロモーターの下流に、上記４つのタンパク質のいずれかをコードする遺伝子、その変異体または相同体、あるいはそれらの断片をアンチセンス方向につないで植物細胞または組織に導入すると、上記ｍＲＮＡと相補的なアンチセンスＲＮＡを産生することができる。

アンチセンスベクターに導入する上記４つのタンパク質のいずれかをコードする遺伝子、その変異体または相同体の発現を抑制する核酸分子は、例えば、上記４つのタンパク質のいずれかをコードする遺伝子の塩基配列（配列番号４、７、８または１２）の全長のアンチセンス核酸分子であってもよいが、それらの塩基配列に対して９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、９９％以上の同一性を有する配列のアンチセンス核酸分子でもよく、これらの核酸分子の塩基配列中の連続した２０塩基以上から全長未満、好ましくは１００塩基以上から全長未満、より好ましくは５００塩基以上から全長未満からなる塩基配列を有するアンチセンス核酸分子でもよい。通常用いられるアンチセンスＤＮＡの長さは５ｋｂよりも短く、好ましくは２．５ｋｂよりも短い（参考文献：特開昭６０−２３２０９２、特開２０００−２３６８５）。

ＲＮＡ干渉誘導ベクターは、ＲＮＡ干渉の引き金となるｄｓＲＮＡ（２本鎖ＲＮＡ、ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ＲＮＡ）の鋳型となるＤＮＡ（以下トリガーという）を含むベクターである。該ベクターを用いて細胞内で形成されたｄｓＲＮＡは、２本鎖ＲＮＡ特異的なＲＮａｓｅ（Ｄｉｃｅｒ）により約２１〜２５塩基のｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）に切断され、その後、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ）の一部として複合体を形成し、標的ｍＲＮＡを相同性により認識・分解する。

植物のＲＮＡ干渉では、ヘアピン型ｄｓＲＮＡとして発現するベクターが好適に利用される。これは例えば十数〜数十塩基または数十〜数百塩基のリンカー（スペーサー）配列の両端にＩＲ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｒｅｐｅａｔ：逆位反復）となるようにＲＮＡ干渉トリガーを配置し、植物体内で高発現するプロモーターによりヘアピン型ｄｓＲＮＡを転写し、細胞内でｓｉＲＮＡを産生するシステムである。また、ｓｉＲＮＡ発現システムには上記のようなヘアピンタイプのほか、タンデムタイプもある。タンデムタイプでは、２つのプロモーターからセンスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡが転写され、細胞内でハイブリダイズしてｓｉＲＮＡが産生される。トリガーの配列は、例えば、配列番号４、７、８または１２の塩基配列またはそれらの配列に対して９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、９９％以上の同一性を有する配列の連続した２０塩基以上、好ましくは１００塩基以上、さらに好ましくは２００塩基以上を含む塩基配列およびその相補配列が用いられる（参考文献：ＷＯ１９９９／５３０５０、ＷＯ１９９９／３２６１９Ａ、ＷＯ２００１／７５１６４Ａ、Ｃｈｕａｎｇ ＣＦ＆Ｍｅｙｅｒｏｗｉｔｚ ＥＭ：Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９７：４９８５，２０００）。

本発明において用いるＲＮＡ干渉誘導ベクターとしては、配列番号４、７、８または１２に示す塩基配列のセンス鎖とそのセンス鎖に相補的なアンチセンス鎖を、スペーサー（ループを形成する配列）をはさんでＩＲ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｒｅｐｅａｔ：逆位反復）となるように同一のベクターに含むものが好ましい。例えば、配列番号１４および３（ＡＧＰＳ）、配列番号１７および７（ＦＢＰａｓｅ）、配列番号１９および２２（ＰＧＩ）、配列番号２５および１１（ｉｓｏａｍｙ１）の塩基配列を、それぞれベクターに含めることができる。

ここで、ベクターとしては、アグロバクテリウムを介して植物に目的遺伝子を導入することができる、ｐＢＩ系、ｐＰＺＰ系、ｐＳＭＡ系のベクターなどが好適に用いられる。特に、バイナリーベクター系（ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ２２１、ｐＢＩ２１１３、ｐＢＩ１０１．２等）、または中間ベクター系（ｐＬＧＶ２３Ｎｅｏ、ｐＮＣＡＴ等）のプラスミドが好ましい。バイナリーベクターはＴ−ＤＮＡ領域の右側ボーダー（ＲＢ）と左側ボーダー（ＬＢ）を含み、両ボーダー間に目的遺伝子とともにプロモーターや植物選抜マーカーなどのエレメントを含むことができ、通常、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）およびアグロバクテリウムにおいて複製可能なシャトルベクターで、バイナリーベクターを保持するアグロバクテリムを植物に感染させると、ベクター上にあるＬＢ配列とＲＢ配列より成るボーダー配列で囲まれた部分のＤＮＡを植物核ＤＮＡに組み込むことが可能である（ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，１０（３），６９７−７０４（１９９１））。一方、ｐＵＣ系のベクターは、植物に遺伝子を直接導入することができ、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ９等が挙げられる。また、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、インゲンマメモザイクウイルス（ＢＧＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）等の植物ウイルスベクターも用いることができる。

バイナリーベクター系プラスミドを用いる場合、上記のバイナリーベクターの境界配列（ＬＢ、ＲＢ）間に、目的遺伝子を挿入し、この組換えベクターを大腸菌中で増幅する。次いで、増幅した組換えベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンスＣ５８、ＬＢＡ４４０４、ＥＨＡ１０１、ＥＨＡ１０５等に、凍結融解法、エレクトロポレーション法等に導入し、該アグロバクテリウムを植物の形質転換に用いる。

また、上記の方法以外にも、三者接合法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２：８７１１（１９８４））によって、目的遺伝子を含む植物感染用アグロバクテリウムを調製することができる。すなわち、目的遺伝子を含むプラスミドを保有する大腸菌、ヘルパープラスミド（例えば、ｐＲＫ２０１３等）を保有する大腸菌、およびアグロバクテリウムを混合培養し、リファンピシリンおよびカナマイシンを含む培地上で培養することにより植物感染用の接合体アグロバクテリウムを得ることができる。

ベクターに目的遺伝子を挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。

また、ベクターには、目的遺伝子のほかに、例えばプロモーター、ターミネーター、ポリＡ付加シグナル、選抜マーカー遺伝子などを配置することができる。

プロモーターとしては、植物体内または植物細胞において機能し、植物の特定の組織内あるいは特定の発育段階において発現を導くことのできるＤＮＡであれば、植物由来のものでなくてもよい。具体例としては、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター（Ｐｎｏｓ）、トウモロコシ由来ユビキチンプロモーター、イネ由来のアクチンプロモーター、タバコ由来ＰＲタンパク質プロモーター等が挙げられる。

ターミネーターとしては、植物体内または植物細胞において機能し、プロモーターにより転写された遺伝子の転写を終結できる配列であればよく、例えば、ノパリン合成酵素（ＮＯＳ）遺伝子のターミネーター、オクトピン合成酵素（ＯＣＳ）遺伝子のターミネーター、ＣａＭＶ ３５Ｓ ターミネーター等が挙げられる。

選抜マーカー遺伝子としては、例えば、薬剤耐性遺伝子（テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子など）、蛍光または発光レポーター遺伝子（ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニターゼ（ＧＵＳ）、グリーンフルオレッセンスプロテイン（ＧＦＰ）など）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＰＴ ＩＩ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼなどの酵素遺伝子が挙げられる。

また、選抜マーカー遺伝子は、上記のように目的遺伝子とともに同一のプラスミドに連結させて組換えベクターを調製してもよいが、あるいは、選抜マーカー遺伝子をプラスミドに連結して得られる組換えベクターと、目的遺伝子をプラスミドに連結して得られる組換えベクターとを別々に調製してもよい。別々に調製した場合は、各ベクターを宿主にコトランスフェクト（共導入）する。

本発明で使用可能なバイナリーベクターの構築例は、後述の実施例１に示されている。即ち、２個のｌｏｘＰを含むプラスミドｐＤＮＲ−１（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）のｌｏｘＰ間に３５Ｓプロモーター、ＮＯＳターミネーターを挿入したプラスミドｐＳＰ１０２（図３）を作製し、ＮＯＳターミネーターと３５Ｓプロモーターの間にＲＮＡｉのトリガーとなる２種の目的ＤＮＡ断片を間にスペーサーを挟んで互いに逆向きに配置するようにトリガーを挿入し（図４、プラスミドｐＳＰ１０２＿ＡＧＰＳ）、このＲＮＡｉヘアピン型ｄｓＲＮＡ発現カセットを、Ｃｒｅ−ｌｏｘ組換え（米国特許第６，４１０，３１７号）によって、プラスミドｐＳＰ１０６（図５）に組み換えて、バイナリーベクターｐＳＰ１０６＿ＡＧＰＳ（図６）を作製することができる。同様に、プラスミドｐＳＰ１０２＿ＦＢＰ（図１７）、ｐＳＰ１０２＿ＰＧＩ（図２５）およびｐＳＰ１０２＿ｉｓｏａｍｙ１（図３４）を作製することができる。

２個のトリガーは、互いに向き合う方向でもよいし、あるいは互いに背を向け合う方向でもよい。またスペーサーの配列は、ヘアピンを形成する配列であればいかなるものでもよいが、例えばｒａｓ遺伝子配列、イントロン配列を例示することができ、そのサイズは例えば数十〜数百ベース程度である。

３．本発明のタバコ属植物の作製方法
本発明のタバコ属植物の作製方法は、タバコ属植物の細胞または組織を、ＲＮＡ干渉法、アンチセンス法、遺伝子破壊法、人為的突然変異法、リボザイム法、共抑制法及び転写因子を用いる方法から選択されるいずれかの方法を用いて、上記（ａ）〜（ｃ）のタンパク質をコードする遺伝子および（ｄ）〜（ｇ）のいずれかの遺伝子の発現を抑制し、植物体を再生することを含む。

タバコ属植物は、例えば、ニコチアナ・トメントシフォルミス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔｏｍｅｎｔｏｓｉｆｏｒｍｉｓ）、ニコチアナ・シルベストリス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）、ニコチアナ・ルスティカ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｒｕｓｔｉｃａ）、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）、ニコチアナ・プルムバギニフォリア（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｐｌｕｍｂａｇｉｎｉｆｏｌｉａ）、ハナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｘ ｓａｎｄｅｒａｅ）、マルバタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｒｕｓｔｉｃａ）などが挙げられ、特に限定されないが、ニコチアナ・タバカムが好ましい。また品種については、紙巻製品の主原料となる黄色種、紙巻製品の緩和料となるバーレー種、葉巻たばこの原料に用いられる葉巻種、オリエント地域で栽培され独自の香気を持つオリエント種、たばこ種子が日本に伝来して以来、各地の気候風土に適応し分化した在来種を含む。

また本発明のタバコ属植物を作製するための植物材料としては、植物体および植物組織（例えば根、茎、葉、種子、胚、胚珠、子房、茎頂、葯、花粉等）やその切片、細胞、カルス、それを酵素処置して細胞壁を除いたプロプラスト、懸濁培養細胞等の植物培養細胞が挙げられる。

上記遺伝子の発現を抑制するには、種々の遺伝子工学的手法を用いることができ、特に限定されないが、たとえばＲＮＡ干渉法、アンチセンス法、遺伝子破壊法、人為的突然変異法、リボザイム法、共抑制法及び転写因子を用いる方法を挙げることができる。

ＲＮＡ干渉法は、上記ＲＮＡ干渉誘導ベクター、または、例えば配列番号４、７、８もしくは１２に示されるポリヌクレオチドあるいは配列番号４、７、８もしくは１２と９０％以上同一性を有するポリヌクレオチドに相同な２重鎖ＲＮＡ（その中の連続した例えば約１５〜３５塩基の２重鎖ＲＮＡが好ましい）を植物細胞または組織に導入して行うことができる。

また、アンチセンス法は、例えば上記アンチセンスベクターを植物細胞または組織に導入することにより、行うことができる。

これらのベクターを導入するには、例えばアグロバクテリウム法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、ＰＥＧ−リン酸カルシウム法、リポソーム法、マイクロインジェクション法が挙げられ、特に限定されないが、アグロバクテリウム法が好ましい。アグロバクテリウム法を用いる場合は、プロトプラストを用いる場合、培養細胞を用いる場合、組織片（葉片、カルスなど）を用いる場合がある。

プロトプラストを用いる場合は、Ｔｉプラスミドをもつアグロバクテリウムと共存培養する方法、スフェロプラスト化したアグロバクテリウムと融合する方法（スフェロプラスト法）、培養細胞を用いる場合は、Ｔｉプラスミドをもつアグロバクテリウムと共存培養する方法、組織片を用いる場合は、対象植物の無菌培養葉片（リーフディスク）に感染させる方法やカルスに感染させる等により行うことができる。

遺伝子が植物体に組み込まれたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法、ウェスタンブロッティング法等により行うことができる。例えば、形質転換植物体からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲを行った後は、増幅産物について電気泳動を行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ液等により染色し、そして増幅産物を１本のバンドとして検出し、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光または酵素反応等により増幅産物を確認したり、リアルタイムＰＣＲで比較Ｃｔ法を用いて増幅率に基づいたＤＮＡの定量を行ってもよい。

あるいは、上述の種々のレポーター遺伝子を目的遺伝子の下流域に連結したベクターを作製し、該ベクター導入したアグロバクテリムを用いて上記と同様にして植物を形質転換させ、該レポーター遺伝子の発現を測定することにより確認してもよい。

遺伝子破壊法は、各種トランスポゾン、Ｔ−ＤＮＡなどを用いて行うことができる。
トランスポゾンを利用した遺伝子破壊は、トランスポゾンのゲノムへの遺伝子挿入機構を利用した方法である。特に内在性のトランスポゾンを用いる方法は、非組換え体として、一度に多数の遺伝子破壊系統を作出することができる点で優れている。タバコ属植物のトランスポゾンの例はレトロトランスポゾン（ＬＴＲ−ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ）Ｔｔｏ１が知られており、Ｔｔｏ１を用いた遺伝子破壊法が報告されている（Ｐｌａｎｔ Ｊ．２８，３０７−３１７，２００１．、ＷＯ００／０７１６９９）。

Ｔ−ＤＮＡを利用した遺伝子破壊は、標的遺伝子の中に薬剤耐性遺伝子などの外来遺伝子を組込み、これを右ボーダー（ＲＢ）と左ボーダー（ＬＢ）の間に挿入したＴ−ＤＮＡベクターを作製し、アグロバクテリウム法にてタバコ属植物を形質転換する方法である。

人為的突然変異法は、例えば、各種放射線（電磁波、紫外線、Ｘ線、γ線、粒子線、中性子線、α線、β線など）を植物に照射することにより、また各種変異原性化学物質（アルキル化剤、核酸塩基アナログ、アジ化ナトリウムなど）で処理することにより、行うことができる。

共抑制法は、アンチセンス法が標的とする遺伝子のアンチセンス配列を導入、発現させるのに対し、センス配列を導入、発現させることにより、センス配列に相同な遺伝子の発現を抑制する方法である（Ｓｍｙｔｈ ＤＲ：Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ ７：Ｒ７９３，１９９７，Ｍａｒｔｉｅｎｓｓｅｎ Ｒ：Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ ６：８１０，１９９６）。一般的に、アンチセンス法に比べて遺伝子発現抑制程度が高く、ＲＮＡ依存型ＲＮＡポリメラーゼで導入遺伝子の２本鎖ＲＮＡが形成された後は、ＲＮＡｉと同様のメカニズムでＲＮＡの分解が起こると考えられている。共抑制に用いる遺伝子は、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列の同一性を有する。また、配列の同一性は上述した手法により決定できる。

リボザイムとは触媒活性を有するＲＮＡ分子の総称であるが、特に本明細書ではＲＮＡを部位特異的に切断するよう設計されたＲＮＡ分子のことを指す。リボザイムには、グループＩイントロン型やＲＮａｓｅ Ｐに含まれるＭ１ＲＮＡのように４００ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる４０ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（小泉誠および大塚栄子：蛋白質核酸酵素，３５：２１９１，１９９０）。標的を切断できるように設計されたリボザイムは、植物細胞中で転写されるように、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターなどのプロモーターおよび転写終結配列に連結される。このとき、転写されたＲＮＡの５’端や３’端に余分な配列が付加されていると、リボザイムの活性が失われることがあるが、こういった場合は、転写されたリボザイムを含むＲＮＡからリボザイム部分だけを正確に切り出すために、リボザイム部分の５’側や３’側にシスに働く別のトリミングリボザイム を配置させることも可能である（Ｔａｉｒａ Ｋ，ｅｔ ａｌ：Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ ３：７３３，１９９０、Ｄｚｉａｎｏｔｔ ＡＭ ＆ Ｂｕｊａｒｓｋｉ ＪＪ：Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６：４８２３，１９８９、Ｇｒｏｓｓｈａｎｓ ＣＡ ＆ ＣｅｃｈＴＲ：Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９：３８７５，１９９１、Ｔａｉｒａ Ｋ， ｅｔ ａｌ：Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９：５１２５，１９９１）。また、このような構成単位をタンデムに並べ、標的遺伝子内の複数の部位を切断できるようにすることで、より効果を高めることもできる（Ｙｕｙａｍａ Ｎ， ｅｔ ａｌ：Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １８６：１２７１，１９９２）。このように、リボザイムを用いて本発明における標的遺伝子の転写産物を特異的に切断することで、該遺伝子の発現を抑制することができる。

転写因子を用いる方法は、標的遺伝子の発現を調節する転写因子の発現を増減させることにより、間接的に標的遺伝子の発現を増減させる方法である。転写因子は標的遺伝子のプロモーター領域の特定配列（シスエレメント）に結合することにより、当該遺伝子の発現をコントロールする。例えば、転写因子を発現させることによって、代謝遺伝子の遺伝子発現を抑制することが可能である（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２００６ ６２：８０９−８２３）。

上記遺伝子工学的手法において植物組織または細胞を材料とした場合は、得られた植物組織または細胞から既知の組織培養法により器官または個体を再生させればよい。このような操作は、植物細胞から植物体への再生方法として一般的に知られている方法により、当業者であれば容易に行うことができる。植物細胞から植物体への再生については、例えば、以下のように行うことができる。

まず、形質転換の対象とする植物材料として植物組織またはプロトプラストを用いた場合、これらを無機要素、ビタミン、炭素源、エネルギー源としての糖類、植物生長調節物質（オーキシン、サイトカイニン等の植物ホルモン）等を加えて滅菌したカルス形成用培地中で培養し、不定形に増殖する脱分化したカルスを形成させる（以下「カルス誘導」という）。このように形成されたカルスをオーキシン等の植物生長調節物質を含む新しい培地に移しかえて更に増殖（継代培養）させる。

カルス誘導は寒天等の固型培地で行い、継代培養は例えば液体培養で行うと、それぞれの培養を効率良くかつ大量に行うことができる。次に、上記の継代培養により増殖したカルスを適当な条件下で培養することにより器官の再分化を誘導し（以下、「再分化誘導」という）、最終的に完全な植物体を再生させる。再分化誘導は、培地におけるオーキシンやサイトカイニン等の植物生長調節物質、炭素源等の各種成分の種類や量、光、温度等を適切に設定することにより行うことができる。かかる再分化誘導により、不定胚、不定根、不定芽、不定茎葉等が形成され、更に完全な植物体へと育成させる。

なお、本発明の方法により作製されたタバコ属植物は、形質転換処理を施した再分化当代である「Ｔ０世代」のほか、Ｔ０世代の植物を母本として、その植物の種子から得られた後代である「Ｔ１世代」、薬剤選抜あるいはサザン法等による解析によりトランスジェニックであることが判明した「Ｔ１世代」植物の花を自家受粉して得られる次世代（Ｔ２世代）などの後代植物をも含むものとする。

これらのタバコ属植物、またはその葉をタバコ製品の原料として、シガレット、パイプタバコ、葉巻などの各種タバコ製品を製造することができる。

また、本発明のタバコ属植物でタバコ製品を製造することにより、シガレット製造に関わる重要な因子である葉たばこ原料の膨こう性に係る効果も期待できる。膨こう性とは、填充効果を表す刻みの圧縮特性であって、紙巻たばこの製造作業においては原料使用量を左右する重要な性質である。１ｇ当たりの容積で表される、試料の物性を示す一つの指標であり、一定の試料重量に対して、一定の時間及び負荷条件を与えた場合の容積である。例えば、膨こう性が高ければ、１本のシガレットを製造するために必要な原料使用量が少なくて済む。１本当たりに充填する原料が少なければ、１本当たりに発生する燃焼煙中成分の低減も期待できる。タバコの乾物重に占める炭水化物の割合は高いため、炭水化物を低減させたタバコは膨こう性が高いと考えられる。

以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものではない。

［実施例１］ＡＤＰ−ｇｌｕｃｏｓｅ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ ｓｍａｌｌ ｓｕｂｕｎｉｔ （ＡＧＰＳ）
（１）遺伝子の単離
全ＲＮＡおよびＰＣＲクローニングに用いる鋳型の調製は以下の通り行った。

鉢上げ後約二ヶ月のタバコ品種（つくば１号）から、直径約１０ｍｍのリーフディスクをポンチで打ち抜き、ＲＮＡｌａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ社）中で保存したものをＲＮＡ調製の材料とした。全ＲＮＡはＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて抽出し、さらに、Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてＰＣＲクローニングの鋳型となる逆転写反応産物を得た。

ＡＤＰ−ｇｌｕｃｏｓｅ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ ｓｍａｌｌ ｓｕｂｕｎｉｔ（ＡＧＰＳ）をコードする既知のｍＲＮＡ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｌ４１１２６、Ｘ６１１８６）を基に、配列番号１（ＡＧＰＳ＿Ｆ３）および配列番号２（ＡＧＰＳ＿Ｒ１）に示す特異的なオリゴプライマーを設計して化学合成した。

ＡＧＰＳ遺伝子断片のクローニングは、配列番号１のプライマーと配列番号２のプライマーの組み合わせを用いて、上述の逆転写反応産物を鋳型にし、９５℃２分の後、９５℃３０秒、６５℃２分で３５サイクル、７２℃でさらに１０分反応させるＰＣＲ増幅により得た。ＰＣＲには、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ （ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）およびＧｅｎｅＡｍｐＴＭ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いた。ＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲルで電気泳動したところ、約５００ｂｐのバンドが確認できた。

次に、ＰＣＲ産物をクローニングベクターｐＣＲ ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ（登録商標、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ社）に挿入し、大腸菌ＴＯＰ１０に形質転換してＬＢ（５０ｍｇ／ｌアンピシリンを含む）寒天培地上で培養した。さらに、得られたコロニーの約１０個をＬＢ（５０ｍｇ／ｌアンピシリンを含む）液体培地中で終夜培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてプラスミドＤＮＡを精製し、シークエンス解析の鋳型とした。シークエンス解析は，ＢｉｇＤｙｅ^ＴＭ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）および３７００ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、キットおよび装置の指示書に従って行った。このようにして配列番号３（ＡＧＰＳ＿Ｆ３Ｒ１）に示す５１５塩基からなるＤＮＡ断片を含むプラスミドｐＣＲ４＿ＡＧＰＳ＿Ｆ３Ｒ１を得た。また、ＡＧＰＳ遺伝子の完全長クローンも出願人保有のｃＤＮＡライブラリーから相同性検索により得ることができた。完全長ｃＤＮＡクローンＮＧＲＬ００７８＿１＿Ｂ０４は、上述の配列番号３の完全長と考えられる配列番号４に示すｃＤＮＡを含んでいた。

（２）ベクター構築
逆向反復配列を含むＤＮＡ構造物の構築には、ｐＵＣ１８のＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ間を改変し、マルチクローニングサイト２（ＭＣＳ２）、スペーサー配列、マルチクローニングサイト１（ＭＣＳ１）の順で配置したｐＳＰ１０４（図１）を利用した。すなわち、図１に示す様にして、ｐＳＰ１０４のＭＣＳ１にフラグメント１を挿入し、次に、ＭＣＳ２にフラグメント１と相補なフラグメント２を導入することにより、行った。ＡＧＰＳ遺伝子に相同であるフラグメント１（配列番号１４）は、まず、ＢａｍＨＩ認識配列を付与した配列番号１５（ＡＧＰＳ＿Ｆ＿ＢａｍＨＩ）と配列番号１６（ＡＧＰＳ＿Ｒ＿ＳｐｈＩ）に示すプライマーを用いて、９５℃２分の後、９５℃３０秒、６０℃２分で３０サイクル、７２℃でさらに１０分反応させることによって得たＰＣＲ産物を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳｐｈＩを用いて消化することによって調製した（図２）。フラグメント２は、配列番号３（ＡＧＰＳ＿Ｆ３Ｒ１）と同一の配列を含んでおり、プラスミドｐＣＲ４＿ＡＧＰＳ＿Ｆ３Ｒ１を制限酵素ＮｏｔＩおよびＰｓｔＩを用いて消化することによって調製した（図２）。このようにして作製したフラグメント１（配列番号１４）およびフラグメント２（配列番号３）を、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳｐｈＩで二重消化したｐＳＰ１０４のＭＣＳ１に挿入し、さらに、フラグメント２を制限酵素ＮｏｔＩおよびＰｓｔＩで二重消化したＭＣＳ２に挿入することによって、ＡＧＰＳ遺伝子の部分配列が逆向反復となるＤＮＡ構造物を含むプラスミドｐＳＰ１０４＿ＡＧＰＳ＿ＦＲを構築した。

上記のようにして構築した逆向反復配列を含むＤＮＡ構造物を植物で発現させるための発現カセットの構築は、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ組換えのためのドナーベクターｐＤＮＲ−１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）のＨｉｎｄＩＩＩ認識部位およびＥｃｏＲＩ認識部位の間に、３５Ｓプロモーター、マルチクローニングサイト（ＸｈｏＩ、ＮａｅＩ、ＳｐｈＩ、ＳａｃＩ）、ＮＯＳターミネーターの順で挿入したｐＳＰ１０２（図３）を用いて行った。すなわち、プラスミドｐＳＰ１０４＿ＡＧＰＳ＿ＦＲを制限酵素ＸｈｏＩおよびＳｐｈＩで二重消化することによって得た、逆向反復配列を含むＤＮＡ構造物をｐＳＰ１０２のＸｈｏＩ−ＳｐｈＩ間に挿入し、プラスミドｐＳＰ１０２＿ＡＧＰＳ（図４）を作製した。

上記のようにして構築した、プラスミドｐＳＰ１０２＿ＡＧＰＳ上の発現カセットを含む２個のｌｏｘＰ間の断片を、Ｃｒｅ−ｌｏｘ組換え（Ｓａｕｅ，１９９４，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：５２１−５２７；Ａｂｒｅｍｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：１５０９−１５１４）を利用してバイナリーベクターｐＳＰ１０６（図５）上のｌｏｘＰ部位に載せ替えることにより、バイナリーベクターｐＳＰ１０６＿ＡＧＰＳを作製した（図６）。前記バイナリーベクターｐＳＰ１０６（図５）は、ｐＢＩ１２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）のＨｉｎｄＩＩＩ認識部位にｐｒｏＫ−ｌｏｘＰ断片（Ｃｒｅａｔｏｒ Ａｃｃｅｐｔｏｒ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を導入し、さらに、ＧＵＳ遺伝子をＧＦＰ遺伝子に置換して作製したものである。また、Ｃｒｅ−ｌｏｘ組換えはＣｒｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用い、その指示書に従って行った。

（３）形質転換および閉鎖系温室での栽培
１） アグロバクテリウム法を用いた形質転換
温室で４号素焼き鉢に移植してから約１０日目のつくば１号の最上位展開葉より採取した葉を、有効塩素１％の次亜塩素酸ナトリウム溶液（Ｔｗｅｅｎ ２０を数滴／Ｌ加える）で約５分間表面殺菌を行い、滅菌水で３回洗浄した後、メスを用いて約５ｍｍ角の葉片を調製した。この葉片と各コンストラクトを導入したＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ約１０^８細胞とをＭｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇの無機塩類とシュークロース３０ｇ／Ｌから成る液体培地中で約４８時間共存培養を行った。なお、コントロール（トリガーとスペーサーを含まず、ＧＦＰ遺伝子とｎｐｔ ＩＩ遺伝子のみ発現させるベクターを使用）も同時並行して共存培養を行う。その後、葉片をセフォタキシム２５０ｍｇ／Ｌ及びカルベニシリン２５０ｍｇ／Ｌを含む滅菌水で３回洗浄し、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇの無機塩類、シュークロース３０ｇ／Ｌ、インドール酢酸０．３ｍｇ／Ｌ、６−（γ，γ−ｄｉｍｅｔｙｌａｌｌｙｌ−ａｍｉｎｏ）ｐｕｒｉｎｅ １０ｍｇ／Ｌ、カナマイシン１００ｍｇ／Ｌ、セフォタキシム２５０ｍｇ／Ｌ、カルベニシリン２５０ｍｇ／Ｌ、及びゲランガム０．３％を含む一次選抜培地（ｐＨ５．８）に置床した。

培養約２週間後、カナマイシン耐性を示すカルス様の細胞塊をＭｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇの１／２無機塩類、シュークロース１５ｇ／Ｌ、カナマイシン１００ｍｇ／Ｌ、セフォタキシム２５０ｍｇ／Ｌ及びゲランガム０．３％を含む二次選抜培地（ｐＨ ５．８）に置床した。

２） ＧＦＰタンパク質発現個体の選抜・順化
二次選抜培地にてカナマイシン耐性を示すカルス様の細胞塊を約３週間培養した後、再分化した茎葉のＧＦＰ蛍光をアマシャム社Ｆｌｏｕｒ Ｉｍａｇｅｒで測定した。ＧＦＰ蛍光が観察された個体を再び二次選抜培地（プラントボックス）に置床した。培養３週間後、発根した形質転換タバコを閉鎖系温室内で４号素焼き鉢に移植し、１週間ビニール袋をかけて順化を行った。

３） 閉鎖系温室内での栽培
形質転換タバコは、４号素焼き鉢（約０．５リットル鉢用肥土／鉢）に移植後、自然光のもと冷房装置およびボイラー装置を用いて昼夜温度が約２３℃に調節された閉鎖系温室内で栽培した。鉢用肥土は土：堆肥：赤玉土（大）、赤玉土（小）：バーミキュライト＝３：４：１：１：１の組成の肥土１００リットル当たりバーレーＳ６２５（肥料）１ｋｇを混合したものを使用した。また、夏季期間中（８月〜９月）は自然日長条件では花芽誘導が大幅に遅れるため短日処理を行った。短日処理は、２２℃、８時間日長条件に設定された短日処理室内に植物体を移動し、そこで約１ヶ月間栽培して行った。

４） 閉鎖系温室内で栽培中の形質転換体のＧＦＰ蛍光測定
閉鎖系温室にて約１ヶ月間栽培を行った形質転換タバコの最上位展開葉から、内径１４ｍｍの金属パンチを用いて葉片のサンプリングを行い、アマシャム社Ｆｌｏｕｒ Ｉｍａｇｅｒを用いてＧＦＰ蛍光の測定を行った。

以上の操作により、ＧＦＰ蛍光タンパク質が発現している１４個体（３２Ａ−０１〜１４）の形質転換タバコ（Ｔ０世代）を得た。コントロールとしてトリガーとスペーサーを含まないベクターを形質転換したタバコを６個体（３２Ｃ−１〜６）得た。これらの個体は以下の解析に用いた。

（４）Ｔ０世代の解析
１） ＡＧＰＳ形質転換体のヨード染色
閉鎖系温室に移植後７９日目の形質転換タバコ２個体（３２Ａ−１、３２Ａ−２）及びコントロール（３２Ｃ−１、２）の、下から数えて９枚目の葉から１５枚目の葉までを内径１２ｍｍ金属パンチを用いてサンプリングを行い、８０％エタノール中で約２時間脱色を行った。脱色後、ヨード染色溶液（ｌｕｇｏｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ｓｉｇｍａ社）中で５日間染色を行った後、水で葉片を洗浄し観察を行った。ヨード染色を行った結果、下から９〜１５枚目の葉のラミナにおいて３２Ａ−１、２の両者ともコントロールに比べて着色程度が弱く、アミロース含量が低下していることが示唆された（図７）。

２） リアルタイムＰＣＲによる遺伝子発現確認
リアルタイムＰＣＲ（Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３９：７５−８５）により標的遺伝子の発現確認を行った。

鉢上げ後約１ヶ月後の形質転換タバコの緑葉から直径約１０ｍｍのリーフディスクを打ち抜き、ＲＮＡｌａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ社）中で保存したものを用いて以下の通り解析を行った。ＲＮＡはＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて抽出し、さらに、Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて逆転写反応を行った。この逆転写反応液の一部をリアルタイムＰＣＲに供試した。リアルタイムＰＣＲに用いるＴａｑＭａｎ（登録商標、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ）ｐｒｉｍｅｒとＰｒｏｂｅはＰｒｉｍｅｒＥｘｐｒｅｓｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて設計し、シグマアルドリッチジャパン株式会社ライフサイエンス事業部に受託合成を依頼した。β−ａｃｔｉｎに対してはｐｒｉｍｅｒ（配列番号３７、３８）とＰｒｏｂｅ（配列番号３９）、ＡＧＰＳに対してはｐｒｉｍｅｒ（配列番号４０、４１）とＰｒｏｂｅ（配列番号４２）を用いた。ＡＧＰＳリアルタイムＰＣＲはＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて行い、キット添付の「ＴａｑＭａｎプローブを用いたＤｕｐｌｅｘリアルタイム定量ＰＣＲ」プロトコールに従い、７５００リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）上で９５℃１５分の後、９４℃１分、６０℃１分で４５サイクル反応させることによって行った。比較Ｃｔ法（Ｕｓｅｒ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ＃２，ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により解析した。リアルタイムＰＣＲによりＡＧＰＳのｍＲＮＡ発現量を調査したところ、１４個体のうち１０個体はコントロールの２０％以下に低減していることが確認できた（図８）。

３） ＡＤＰ−ｇｌｕｃｏｓｅ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ（ＡＧＰａｓｅ）活性測定
（ｉ）タンパク質抽出
予め生重量（ＦＷ）を測定したラミナ（鉢上げ後約１ヶ月半後の形質転換タバコから採取）を液体窒素で粉砕した。ＦＷ１ｇ当たり２〜３ｍｌの抽出バッファーＡ（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ；ｐＨ７．５、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に最終濃度２ｍＭ ＤＴＴ、４％（Ｗ／Ｖ）ＰＶＰ−４０、１ｘ ｃｏｍｐｌｅｔｅ（ロッシュ・ダイアグノスティックス株式会社）を添加して乳鉢と乳棒で磨砕抽出した。磨砕液を２ｍｌエッペンチューブに回収し、１５０００ｒｐｍ（２００００ｇ）で１０分間４℃の条件で遠心した。上清を回収して抽出液とした。それを氷上に置き、すぐに活性測定を行った。
（ｉｉ）タンパク質定量
牛血清アルブミン（ＦｒａｃｔｉｏｎＶ、ｓｉｇｍａ社）をスタンダードとして、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法によりプロテインアッセイ染色液（ＢｉｏＲａｄ社）を用いて行った。
（ｉｉｉ）ＡＧＰａｓｅ活性測定
抽出液を用いて１ｍｌの反応系で活性を測定した。Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １４，２１９１−２２１３，２００２を参考に、以下の通り行った。

最終濃度が５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ；ｐＨ７、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ β−Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ ａｄｅｎｉｎｅ ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（β−ＮＡＤ）、１０μＭ Ｇｌｕｃｏｓｅ−１，６−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ｇ１，６Ｐ）、２．５ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＮａＰＰｉ）、１Ｕ ｐｈｏｓｈｏｇｌｕｃｏｍｕｔａｓｅ（ＰＧＭ）、１Ｕ ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（Ｇ６ＰＤＨ；ｆｒｏｍ Ｌ．ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、５ｍＭ ＤＴＴとなるようにプレミックスを調製し、３４０ｎｍの吸光度（Ａ３４０）をブランクとした。抽出液を５０μｌ添加して２５℃でＡ３４０を測定、最終濃度２ｍＭとなるようにＡＤＰ−ｇｌｕｃｏｓｅを添加して再度２５℃でＡ３４０を測定した。ＡＤＰ−ｇｌｕｃｏｓｅ添加前後のＡ３４０の差を活性とし、ＮＡＤＨのモル吸光係数６２２０から活性を算出した。

形質転換タバコ９個体とコントロール３個体のＡＧＰａｓｅ活性を測定したところ、コントロール３個体の平均で０．１１３Ｕ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎに対して、形質転換タバコ９個体のうち７個体で活性は検出限界以下にまで低減したことが確認された（表１）。

４） 抗ＡＧＰＳ抗体を用いたウエスタンブロットによるタンパク質発現確認
（ｉ）抗ＡＧＰＳ抗体の作製
Ｎ末端−Ｃｙｓ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｌａ−Ｃ末端（配列番号５２）の合成ペプチドの合成、ＫＬＨキャリアコンジュケーション、ウサギを用いたポリクローナル抗体の作製は日本バイオサービスに委託して行った。抗血清の一部は合成ペプチドを用いたアフィニティーカラムで精製し、精製抗体を得た。
（ｉｉ）ウエスタンブロット
活性測定用に抽出したタンパク質８μｇをアクリルアミド濃度１０％のｅ−パジェル（株式会社アトー）を用いて、常法によりＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥしたゲルはトランスファーバッファー（４８ｍＭ Ｔｒｉｓ、３９ｍＭ ｇｌｙｃｉｎｅ、１．３ｍＭ ＳＤＳ）で、２０分間室温で振とうして平衡化した。セミドライブロッティング装置：トランスブロットＳＤ（ＢｉｏＲａｄ社）でトランスファーバッファーを用いて電圧１５Ｖで３０分間ＰＶＤＦ膜にブロットした。ブロッティング以後の操作はバンドの検出までＥＣＬプラス（アマシャムバイオサイエンス社）のマニュアルに従って行った。バンドの検出はＥＣＬミニカメラを用いて行った。１次抗体は精製抗体を用い、ＴＢＳバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ・Ｃｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）に０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．５−１％スキムミルクとなるように加えたＴＢＳバッファー（以下ＴＢＳ−Ｔ−ＳＫという）で１０００倍に希釈して４℃、一晩反応した。２次抗体はヤギ抗ウサギＨＲＰ標識抗体（Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ社）もしくはＡｎｔｉ−ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｒａｂｉｔ、Ｇｏａｔ−ｐｏｌｙ、ＨＲＰ（ＫＰＬ社）をＴＢＳ−Ｔ−ＳＫで１００００〜５００００倍に希釈して室温で２時間反応させた。形質転換タバコ９個体とコントロール３個体のＡＧＰＳタンパク質発現を調査したところ、コントロールでは発現が確認されたが、形質転換タバコ９個体すべてにおいて検出限界以下であった（図９）。活性測定の結果と合わせて、ＡＧＰＳの遺伝子発現抑制した個体においては、ＡＧＰＳタンパク質の発現が低減するとともに、ＡＧＰａｓｅ活性として低減していることが確認された。

５） 炭水化物含量の定量
（ｉ）サンプル調製、粉砕
鉢上げ後約２ヶ月後の形質転換タバコから、少し色落ちを開始した中位葉の半葉（中骨を含まないラミナ）を午後に採取し、７０℃で熱風乾燥した。この試料をマルチビーズショッカー専用チューブ（安井機器）に入れ、マルチビーズショッカー（安井機器ＭＢ３０１）を用いて３，０００ｒｐｍ、３０ｓｅｃ粉砕した。
（ｉｉ）可溶性糖抽出、デンプン可溶化
粉砕したラミナ粉末２０ｍｇを量って１５ｍｌチューブに入れ、８０％エタノール（ｖ／ｖ）１ｍｌに懸濁した後、遠心分離（１，７８０ｇ、５ｍｉｎ、ＴＯＭＹ ＬＸ−１３０）により上清を回収し可溶性糖画分とした。遠心分離後の残渣を６０℃で乾燥後、３ｍｌジメチルスルホキシドおよび０．７５ｍｌ塩酸（８Ｎ）を加え、ウォーターバスにより８０℃、３０ｍｉｎ加水分解を行った。空冷後、０．７５ｍｌ水酸化ナトリウム（８Ｎ）および０．５ｍｌ酢酸ナトリウム（２Ｎ、ｐＨ４．５）を加え懸濁した後、遠心分離（１，７８０ｇ、５ｍｉｎ、ＴＯＭＹ ＬＸ−１３０）により上清を回収しデンプン画分とした。
（ｉｉｉ）定量
可溶性糖およびデンプンの測定は、Ｆ−ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ社、Ｎｏ．１０２０７７４８０３５およびＮｏ．１０７１６２６００３５）を用いて、添付のマニュアルに従って行った。吸光度（Ａ３４０）の測定は９６穴プレート対応のプレートリーダー（Ｗａｋｏ社、ＳＰＥＣＴＲＡ ＦＬＵＯＲ）を用いた。測定は２反復実施し、２回の平均値をデンプンおよび３糖含量（Ｇｌｃ、Ｆｒｕ、Ｓｕｃの合計量）とした。デンプンおよび３糖含量の評価は、乾物重量あたりの百分率で行った。形質転換タバコの６個体とコントロール６個体についてデンプン＋３糖（ショ糖＋グルコース＋フルクトース）を炭水化物として含量を定量したところ、形質転換タバコの６個体全てにおいてコントロール比１５％以下となった（図１０）。つまり、ＡＧＰＳの遺伝子発現、タンパク質発現およびＡＧＰＳａｓｅ活性が低減した形質転換タバコでは、炭水化物（デンプン＋３糖）が大きく低減することが確認された。図１０のコントロールの値は６個体の平均値、エラーバーはその標準偏差（ＳＤ）で示した。また棒グラフのバーの白の部分はデンプン、斜線部分は３糖を示す。

（５）Ｔ１世代の解析
１）Ｈｏｍｏ、Ｈｅｍｉ、Ｎｕｌｌ接合体の選抜
Ｔ０世代の形質転換タバコを自家受粉してＴ１種子を得た。得られたＴ１種子をＭｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇの１／２無機塩類、シュークロース１５ｇ／Ｌおよびゲランガム０．３％を含む播種培地（ｐＨ５．８）に無菌播種し、播種後９日目に幼苗から葉片を切り出して一次選抜培地に置床した。約２週間後、葉片からカナマイシン耐性のカルス様細胞塊が誘導されたか否かによって、カナマイシン分離比検定を行った。カナマイシン耐性：カナマイシン感受性が３：１に分離した系統は導入遺伝子が１遺伝子座に挿入された候補として、再び播種培地に無菌播種を行った。播種後９日目にアマシャム社のＦｌｏｕｒ Ｉｍａｇｅｒを用いて幼苗のＧＦＰ蛍光を測定し、ＧＦＰ蛍光が観察される個体：ＧＦＰ蛍光が観察されない個体が３：１に分離する事を確認し、導入遺伝子が１遺伝子座に挿入されたとみなした。一方、ＧＦＰ蛍光強度でもってＧＦＰ遺伝子に関してＨｏｍｏ接合体（導入遺伝子を両方の相同染色体上に持つ）、Ｈｅｍｉ接合体（導入遺伝子を相同染色体の片方のみに持つ）、あるいはＮｕｌｌ接合体（導入遺伝子を染色体上に持たない）であるかが判別できる事が知られている。そこで今回ＧＦＰ蛍光が観察された系統（Ｔ１植物）の内、ＧＦＰ蛍光強度が２パターンに明確に分離し、かつ、ＧＦＰ蛍光強度が強い個体：ＧＦＰ蛍光強度が弱い個体が１：２に分離した系統を選抜した。そして、ＧＦＰ蛍光が強い個体を導入遺伝子に関してＨｏｍｏ接合体（以下、ＡＧＰＳ−Ｈｏとする）とみなし、ＧＦＰ蛍光が弱い個体を導入遺伝子に関してＨｅｍｉ接合体（以下、ＡＧＰＳ−Ｈｅとする）とみなし、ＧＦＰ蛍光が観察されない個体を導入遺伝子に関してＮｕｌｌ接合体（以下、ＡＧＰＳ−Ｎｕとする）とみなした。Ｔ１世代の形質転換タバコの解析には、上記で選抜した系統の内、Ｔ０世代においてＡＧＰＳ遺伝子発現、タンパク質発現、ＡＧＰａｓｅ活性及び炭水化物含量の低減程度が高かった３系統（３２Ａ−２、３２Ａ−３、３２Ａ−７）のＡＧＰＳ−Ｈｏ、ＡＧＰＳ−Ｈｅ、ＡＧＰＳ−Ｎｕを用いた。尚、Ｔ１世代においてＨｏｍｏ、Ｈｅｍｉ、Ｎｕｌｌ接合体とみなしたそれぞれの個体から自家受粉を行ったＴ２種子を採種し、Ｔ１世代と同様にカナマイシンおよびＧＦＰ蛍光による分離比検定も行った。その結果、Ｔ１世代における判別結果は全て正しかった事を確認している。

２） 栽培
播種培地上で選抜されたそれぞれのＡＧＰＳ−Ｈｏ、ＡＧＰＳ−Ｈｅ、ＡＧＰＳ−Ｎｕを再び播種培地に移植して約１ヵ月後、閉鎖系温室で４号素焼き鉢に移植して栽培を行った。尚、栽培条件はＴ０世代の形質転換タバコと同様である。

３） リアルタイムＰＣＲによる遺伝子発現確認
上記で選抜を行った３系統（３２Ａ−２、３２Ａ−３、３２Ａ−７）について、ＡＧＰＳ−Ｈｏ、ＡＧＰＳ−Ｈｅ、ＡＧＰＳ−Ｎｕ各３個体をＴ０世代と同様に解析を行った。調査した３系統ともＡＧＰＳ−Ｎｕに比べてＡＧＰＳ−Ｈｏ、ＡＧＰＳ−Ｈｅでは２０％以下の発現量であり、Ｔ１世代においても遺伝子発現抑制効果が確認された（図１１）。つまり、遺伝子発現抑制効果は後代に遺伝することが確認された。図１１の値は各々３個体の平均値であり、エラーバーは標準偏差（ＳＤ）を示す。

４） 炭水化物含量の定量
Ｔ１世代において遺伝子発現抑制程度が高かった３２Ａ−７のＡＧＰＳ−Ｈｏ、ＡＧＰＳ−Ｎｕ各３個体について、下位から１６葉位〜２７葉位の１２枚について調査した。発蕾期の生殖生長期の個体を用い、下位の白化した過熟葉から上位の未熟な緑葉までを午後に一斉採取し、７０℃で熱風乾燥した試料を用いて、炭水化物の定量を行った。定量方法はＴ０世代の解析と同様に行った。下位から１６枚目〜２７枚目の１２葉位について調査したところ、ＡＧＰＳ−Ｈｏ、ＡＧＰＳ−Ｈｅでは全葉位において炭水化物（デンプン＋３糖）含量がＡＧＰＳ−Ｎｕに比べて大きく低減していた（図１２）。よって、形質転換タバコでは葉位を問わず炭水化物含量が低下することが確認された。図１２の各値は一部欠損データがある場合を除き、３個体の平均値で示し、エラーバーは標準偏差（ＳＤ）を示す。

５） 煙中ホルムアルデヒドおよびアクロレインの解析
（ｉ）サンプル調製
炭水化物含量の定量に用いた熱風乾燥後の試料の一部を、４０℃、９５％相対湿度（ＲＨ）で２時間調湿し、シュレッダーを用いてタバコ刻の調製を行った。最後にタバコ刻を２５℃、６０％ＲＨの部屋で１週間以上調湿し、熱分解試験に用いるサンプルとした。
（ｉｉ）熱分解装置
熱分解装置として、石英管をリアクターとする赤外線イメージ炉（Ｕｌｖａｃ−Ｒｉｋｏ Ｉｎｃ．）を用いた。キャリヤーガスとしては１００％の窒素ガスを用いて、流量はＳＥＣ−Ｂ４０ ｍａｓｓ ｆｌｏｗ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ（Ｈｏｒｉｂａ Ｓｔｅｃ Ｉｎｃ．）を用いて１０００ｍｌ／ｍｉｎに調製した。サンプルとしてはタバコ刻１５０ｍｇを用いて、石英管の中央に１２．５ｍｍの幅に詰めた。１分間キャリアーガスで石英管内の空気を置換した後、室温から１６．７℃／ｓの割合で温度を８００℃まで上昇させ、８００℃で５秒間温度を固定した。この温度制御に関しては、ＴＰＣ−１０００ ｐｒｏｇｒａｍ ｔｅｍｐｅｒａｒｕｒｅ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ（Ｕｌｖａｃ−Ｒｉｋｏ Ｉｎｃ．）を用いた。熱分解により生成した煙は、１００ｍｌの２，４−ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒａｚｉｎｅ溶液を含むインピンジャーと４４ｎｍフィルター（Ｈｅｉｎｒ．Ｂｏｒｇｗａｌｄｔ Ｔｅｃｈｎｉｋ）に捕集した。上記の手法は鳥飼ら（Ｋ．Ｔｏｒｉｋａｉ，Ｓ．Ｙｏｓｈｉｄａ ａｎｄ Ｈ． Ｔａｋａｈａｓｈｉ“Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ， ａｔｍｏｓｐｈｅｒｅ ａｎｄ ｐＨ ｏｎ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｍｏｋｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｏｂａｃｃｏ ｐｙｒｏｌｙｓｉｓ” Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ４２：１４０９−１４１７（２００４））の方法に従った。なお２，４−ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒａｚｉｎｅ溶液は、２，４−ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒａｚｉｎｅ（水分５０％含有品）９．５１０７ｇを秤量し、アセトニトリル５００ｍＬに溶解させ、６０％過塩素酸２．８ｍＬを加えて混合した後、超純水を加えて１Ｌの水溶液とした。
（ｉｉｉ）煙中ホルムアルデヒドおよびアクロレインの定量
煙を捕集した２，４−ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒａｚｉｎｅ溶液（インピンジャー）を７０分間室温で静置した。また、煙を捕集した４４ｎｍフィルターは４０分間室温で静置した後、３０ｍｌの２，４−ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒａｚｉｎｅを加えて３０分間振とうさせた。そして最後に両者を混合し、２，４−ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒａｚｉｎｅ混合溶液を調製した。この２，４−ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒａｚｉｎｅ混合溶液とＴｒｉｚｍａ ｂａｓｅ溶液を２：３の割合で混合し、０．４５μｍ ｐｏｌｙｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｅｔｈｙｌｅｎｅメンブレンフィルターでろ過した後、高速液体クロマトグラフィーによる分析を行った。上記手法は鳥飼ら（２００４）の方法に従った。また高速液体クロマトグラフィーによる分析方法は、Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｎａｄａ法（Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｍａｄｅ ｂｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（Ｃａｎａｄａ）、１９９９年１２月３１日、Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｎｏ．Ｔ−１０４）に準拠した。なおＴｒｉｚｍａ ｂａｓｅ溶液は、Ｔｒｉｚｍａ ｂａｓｅを０．４ｇ秤量し、超純水４０ｍＬに溶解させ、アセトニトリルを加えて２００ｍＬの水溶液とした。

炭水化物低減効果のみられた３系統（３２Ａ−２、３２Ａ−３、３２Ａ−７）について、各３個体の上位葉（下位から１８〜２４枚目）を用いて測定した。調査した３系統とも、ＡＧＰＳ−ＨｏにおいてＡＧＰＳ−Ｎｕに比べてホルムアルデヒドとアクロレインの両方の有意な減少が確認された（図１３のＡおよびＢ）。ホルムアルデヒドはＡＧＰＳ−Ｎｕの２５〜３０％程度に、アクロレインはＡＧＰＳ−Ｎｕの５５〜７０％程度に減少した。よって、タバコ燃焼煙中のホルムアルデヒド、アクロレインといった煙中カルボニル類が低減することが確認された。図１３の各値は３２Ａ−２ＡＧＰＳ−Ｈｏのみ２個体、それ以外は３個体の平均値で示し、エラーバーは標準偏差を示す。

６） 植物体の形態
過去に報告のある、タバコの葉のデンプン、糖含量等を低減させた形質転換タバコ（非特許文献２，３）では生育異常が報告されている。それに対して、鉢上げ約１ヶ月後において、ＡＧＰＳ−Ｈｏ、ＡＧＰＳ−Ｈｅ（Ｔ１世代）はＡＧＰＳ−Ｎｕと同様な生育を示した（図４１）。収穫期においてもＡＧＰＳ−Ｈｏ、ＡＧＰＳ−Ｈｅ（Ｔ１世代）はＡＧＰＳ−Ｎｕと同様な生育を示したことから、本形質転換タバコは、生育異常を伴わずに特異的に炭水化物を低減できる点で、優れていると考えられる。

（６）Ｔ２世代の解析
１） 栽培
Ｔ１世代の解析に用いた１系統について、ＡＧＰＳ−ＨｏとＡＧＰＳ−Ｎｕを栽培した。温室において市販の播種用肥土に播種し、２０日後に仮植用肥土に移植した。肥土は土：堆肥：赤玉土（小）：バーミキュライト＝３：４：２：１の組成の肥土１００リットル当たり、苗床専用肥料５００ｇと過リン酸石灰３５０ｇを混合したものを使用した。温室で自然光のもと空調装置を用いて２３℃で栽培を行った。仮植１９日後に６号鉢（外径２００ｍｍ、高さ１６０ｍｍ）に移植し、１２時間日長、温度は明期２６℃／暗期１８℃、相対湿度６０％で収穫まで人工光形グロースキャビネット：コイトトロン（ＫＧＢＨ−２４１６ＳＨＬ Ｐ１型）内で栽培した。鉢用肥土は土：堆肥：赤玉土（大）：赤玉土（小）：桐生砂：バーミキュライト＝２．５：４：１：１：１．５：１の組成の肥土１１０リットル当たりバーレーＳ６２５（肥料）１ｋｇを混合したものを使用した。発蕾が確認された時期に心止め（花部の切除）を行った。２枚の子葉を含めて下から数えて２４枚目と２５枚目の間で心止めを行った。

２） 黄色乾燥
ＳＰＡＤメーター（コニカミノルタ社）の測定値が１０〜２０の収穫適期に葉を収穫し、プログラム乾燥機で黄色乾燥を行った。この黄色乾燥を行った試料は、以下の炭水化物定量、煙中ホルムアルデヒド及びアクロレインの解析に用いた。黄色乾燥条件は表２に示した。

３） 炭水化物定量
方法はＴ１世代の解析と同様に行った。下位から１３枚目の葉位のラミナを用いて、３２Ａ−７（Ｔ２世代）のＡＧＰＳ−Ｈｏ２個体、ＡＧＰＳ−Ｎｕ５個体について測定したところ、ＡＧＰＳ−ＨｏではＡＧＰＳ−Ｎｕに比べて炭水化物（デンプン＋３糖）含量が顕著に低減することが確認された（図１４）。Ｔ１世代の解析結果と比べると、黄変乾燥を行ったことによりデンプンの割合が減少して３糖の割合が増加した。これは黄変乾燥により、ＡＧＰＳ−Ｈｏ、ＡＧＰＳ−Ｎｕともデンプンが分解して３糖が生成したからと考えられる。

４） 煙中ホルムアルデヒドおよびアクロレインの解析
方法はＴ１世代の解析と同様に行った。炭水化物定量を行った試料について調査したところ、ＡＧＰＳ−ＨｏにおいてＡＧＰＳ−Ｎｕに比べてホルムアルデヒドとアクロレインの両方に有意な減少が確認された（図１５のＡおよびＢ）。ホルムアルデヒドはＡＧＰＳ−Ｎｕの２３％、アクロレインはＡＧＰＳ−Ｎｕの５５％であった。黄変乾燥の有無に依らず、ＡＧＰａｓｅ活性を低減させた形質転換タバコではホルムアルデヒド、アクロレインといった煙中カルボニル類の低減が確認された。図１５のＡＧＰＳ−Ｈｏは２個体の平均値、ＡＧＰＳ−Ｎｕは４個体の平均値で示し、エラーバーは標準偏差（ＳＤ）を示す。

［実施例２］葉緑体型Ｆｒｕｃｔｏｓｅ−１，６−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ （ＦＢＰａｓｅ）
（１）遺伝子の単離
葉緑体型 Ｆｒｕｃｔｏｓｅ−１，６−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＦＢＰａｓｅ）をコードする既知のｍＲＮＡ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦ１３４０５１．１）を基に、配列番号５（ＦＢＰ＿Ｆ２）および配列番号６（ＦＢＰ＿Ｒ１）に示す特異的なオリゴプライマーを設計して化学合成した。ＦＢＰａｓｅ遺伝子の部分長ＤＮＡ断片は、ＡＧＰＳ遺伝子断片のクローニングと同様にして行い、配列番号７（ＦＢＰ＿Ｆ２Ｒ１）に示すＤＮＡ断片を含むプラスミドｐＣＲ４＿ＦＢＰ＿Ｆ２Ｒ１を得た。

（２）ベクター構築
ＦＢＰａｓｅ遺伝子に相同であるフラグメント１（配列番号１７）は、まず、ＳｐｈＩ認識配列を付与した配列番号１８（ＦＢＰ＿Ｆ＿ＳｐｈＩ）と配列番号６（ＦＢＰ＿Ｒ１）に示すプライマーを用いて得たＰＣＲ産物を制限酵素ＳｐｈＩおよびｐＳＰ１０４のＭＣＳ１の制限酵素ＢａｍＨＩと同一の粘着末端を生成する制限酵素ＢｇｌＩＩを用いて消化することによって調製した（図１６）。フラグメント２は、配列番号７（ＦＢＰ＿Ｆ２Ｒ１）と同一の配列を含んでおり、プラスミドｐＣＲ４＿ＦＢＰ＿Ｆ２Ｒ１を制限酵素ＮｏｔＩおよびＰｓｔＩを用いて消化することによって調製した（図１６）。このようにして作製したフラグメント１（配列番号１７）およびフラグメント２をＡＧＰＳ遺伝子の場合と同様にして、ＦＢＰａｓｅ遺伝子の部分配列が逆向反復となるＤＮＡ構造物を含むプラスミドｐＳＰ１０４＿ＦＢＰ＿ＦＲを構築した。さらに、ＡＧＰＳ遺伝子の場合と同様にして、発現カセットのドナーベクターｐＳＰ１０２＿ＦＢＰ（図１７）およびバイナリーベクターｐＳＰ１０６＿ＦＢＰを構築した。

（３）形質転換および閉鎖系温室での栽培
方法は実施例１と同様に行った。
ＧＦＰ蛍光タンパク質が発現している２０個体（２９Ａ−１〜１６、２９Ｐ−１〜４）の形質転換タバコ（Ｔ０世代）を得た。コントロールとしてトリガーとスペーサーを含まないベクターを形質転換したタバコを６個体（２９Ｃ−１〜６）得た。これらの個体は以下の解析に用いた。

（４）Ｔ０世代の解析
１） リアルタイムＰＣＲによる遺伝子発現確認
リアルタイムＰＣＲに用いたＦＢＰａｓｅのｐｒｉｍｅｒ（配列番号４３、４４）とＰｒｏｂｅ（配列番号４５）は別途設計したが、それ以外の方法は実施例１と同様に行った。リアルタイムＰＣＲによりＦＢＰａｓｅのｍＲＮＡ発現量を調査したところ、形質転換タバコ２０個体のうち１５個体はコントロール６個体平均の２％以下に低減していることを確認した（図１８）。

２）ＦＢＰａｓｅ活性測定
（ｉ）タンパク質抽出
予め生重量（ＦＷ）を測定したラミナ（鉢上げ後約１ヶ月後の形質転換タバコの緑葉から採取）を液体窒素で粉砕した。ＦＷ１ｇ当たり３ｍｌの抽出バッファーＡ（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ；ｐＨ７．５、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に最終濃度２ｍＭ ＤＴＴ、４％（Ｗ／Ｖ）ＰＶＰ−４０、１ｘ ｃｏｍｐｌｅｔｅ（ロッシュ・ダイアグノスティックス株式会社）を添加して乳鉢と乳棒で磨砕抽出した。磨砕液を２ｍｌエッペンチューブに回収し、１５０００ｒｐｍ（２００００ｇ）で１０分間４℃の条件で遠心した。上清を回収し、予めカラムバッファーＡ（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ：ｐＨ７．５、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ ＤＴＴ）２５ｍｌで平衡化したＰＤ１０カラムに２．５ｍｌアプライし、３．５ｍｌのカラムバッファーＡで溶出して脱塩を行った。
（ｉｉ）タンパク質定量
牛血清アルブミン（ＦｒａｃｔｉｏｎＶ、ｓｉｇｍａ社）をスタンダードとして、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法によりプロテインアッセイ染色液（ＢｉｏＲａｄ社）を用いて行った。
（ｉｉｉ）活性測定
Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９８４）７６：４９−５４を参考にし、脱塩抽出液を用いて１ｍｌの反応系で以下の通り測定した。最終濃度が１００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ；ｐＨ７．５、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．５ｍＭ β−Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ ａｄｅｎｉｎｅ ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（β−ＮＡＤＰ）、２Ｕ ｈｅｘｏｓｅＰ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ、１Ｕ Ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（Ｇ６ＰＤＨ；ｆｒｏｍ ｙｅａｓｔ）となるようにプレミックスを調製し、脱塩抽出液５０μｌを加えて２５℃でＡ３４０を測定した。最終濃度０．５ｍＭとなるようにＦｒｕｃｔｏｓｅ−１，６−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ｆ１，６Ｐ）を添加して再度２５℃でＡ３４０を測定し、Ｆ１，６Ｐ添加前後のＡ３４０の差を活性とした。ＮＡＤＰＨのモル吸光係数６２２０から活性を算出した。

形質転換タバコ４個体とコントロール３個体のＦＢＰａｓｅ活性を測定したところ、形質転換タバコ４個体の平均はコントロール３個体の平均の１／２以下であった（表３）。緑葉のＦＢＰａｓｅ活性は細胞質型と葉緑体型の両方からなり、細胞質型の活性が全体の約半分を占めているという報告（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９８８ ８６，６６７−６７１）があることから、葉緑体型の活性はほとんどないことが推測された。

３） 抗ＦＢＰａｓｅ抗体を用いたウエスタンブロットによるタンパク質発現確認
（ｉ）抗ＦＢＰａｓｅ抗体の作製
抗原の作製に向けて、キット：ｐＭＡＬ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）のｐＭＡＬ−ｃ２Ｘ Ｖｅｃｔｏｒへの各遺伝子断片の挿入することにより、ｍａｌｔｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＢＰ）と各遺伝子産物との融合タンパク質を生産するベクターを構築した。

ｐＭＡＬ−ｃ２Ｘ Ｖｅｃｔｏｒへ挿入するＦＢＰａｓｅ遺伝子の断片は、上述のプラスミドｐＣＲ４＿ＦＢＰ＿Ｆ２Ｒ１を鋳型として、ＳａｃＩ認識配列を付与した配列番号２８（ＦＢＰ＿ｐＭＡＬ＿Ｆ＿ＳｃａＩ）に示すプライマーと、ＭｌｕＩ認識配列を付与した配列番号２９（ＦＢＰ＿ｐＭＡＬ＿Ｒ＿ＭｕｎＩ）に示すプライマーの組み合わせを用いて得たＰＣＲ産物を制限酵素ＳｃａＩおよびＭｌｕＩを用いて消化することによって調製した。このようにして得た断片をｐＭＡＬ−ｃ２Ｘ ＶｅｃｔｏｒのＳｃａＩ認識部位と制限酵素ＭｌｕＩと同一の粘着末端を形成する制限酵素ＥｃｏＲＩの認識部位に挿入することによって、ｍａｌｔｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＢＰ）と配列番号３０に示すＦＢＰａｓｅ部分アミノ酸配列との融合タンパク質を生産するｐＭＡＬ＿ＦＢＰを作製した。

ＤＨ５α−Ｔ１ Ｍａｘｅｆｆｉｅｎｃｙ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、ｐＭＡＬ＿ＦＢＰをヒートショック法により形質転換した。アンピシリン耐性大腸菌から、キットマニュアルに従って、ＩＰＴＧによりＭＢＰ融合タンパク質を誘導発現した。ただし、２５℃で８〜９時間発現誘導を行った。超音波ホモジナイザー（ＢＲＡＮＳＯＮ／ＳＯＮＩＦＩＥＲ２５０）を用い、Ｏｕｔｐｕｔ ｃｏｎｔｒｏｌ：８−１０、Ｄｕｔｙ ｃｙｃｌｅ：９０で１分間処理−１分間氷上のサイクルで５〜１０回行って溶菌させた。キットマニュアルに従って、アミロース樹脂を用いてＭＢＰ融合タンパク質を精製した。精製したＭＢＰ融合タンパク質を抗原として、（株）シバヤギに委託してウサギの抗血清を得た。

（ｉｉ）ウエスタンブロット
活性測定用に抽出したタンパク質１０μｇを用い、１次抗体として抗血清をＴＢＳ−Ｔ−ＳＫで１００００倍に希釈して使用した以外は実施例１と同様に行った。

形質転換タバコ１０個体とコントロール３個体のＦＢＰａｓｅタンパク質発現を調査したところ、コントロールでは発現が確認されたが、形質転換タバコ９個体では検出限界以下であった（図１９）。活性測定結果と合わせて考えると、形質転換タバコではＦＢＰａｓｅタンパク質発現が大きく低減することによって、葉緑体型ＦＢＰａｓｅ活性が大きく低減したと考えられた。

４） 炭水化物含量の定量
方法は、鉢上げ後約１ヶ月後の形質転換タバコの葉を使用した点を除き、実施例１と同様に行った。形質転換タバコ６個体とコントロール６個体についてデンプン＋３糖（ショ糖＋グルコース＋フルクトース）を炭水化物として含量を定量したところ、形質転換タバコ６個体全てにおいてコントロールに比べて顕著に減少していた（図２０）。つまり、ＦＢＰの遺伝子発現、タンパク質発現、活性が低減したタバコでは、炭水化物（デンプン＋３糖）の含量が大きく低減することが確認された。図２０のコントロールの値は６個体の平均値、エラーバーはその標準偏差（ＳＤ）を示す。棒グラフのバーの白部分はデンプン、斜線の部分は３糖を示す。

（５）Ｔ１世代の解析
１） Ｈｏｍｏ、Ｈｅｍｉ、Ｎｕｌｌ接合体の選抜
方法は実施例１と同様に行った。導入遺伝子に関してＨｏｍｏ接合体を以下ＦＢＰ−Ｈｏとし、Ｈｅｍｉ接合体を以下ＦＢＰ−Ｈｅとし、Ｎｕｌｌ接合体を以下ＦＢＰ−Ｎｕとした。Ｔ１世代の形質転換タバコの解析には、Ｔ０世代においてＦＢＰ遺伝子発現、タンパク質発現、ＦＢＰ活性及び炭水化物含量の低減程度が高かった３系統（２９Ａ−５、２９Ａ−７、２９Ａ−１０）のＦＢＰ−Ｈｏ、ＦＢＰ−Ｈｅ、ＦＢＰ−Ｎｕを用いた。尚、Ｔ１世代においてＨｏｍｏ、Ｈｅｍｉ、Ｎｕｌｌ接合体とみなしたそれぞれの個体から自家受粉を行ったＴ２種子を採種し、Ｔ１世代と同様にカナマイシンおよびＧＦＰ蛍光による分離比検定も行った。その結果、Ｔ１世代における判別結果は全て正しかった事を確認している。

２） 栽培
方法は実施例１と同様に行った。

３） リアルタイムＰＣＲによる遺伝子発現確認
上記で選抜した３系統（２９Ａ−５、２９Ａ−７、２９Ａ−１０）について、ＦＢＰ−Ｈｏ、ＦＢＰ−Ｈｅ、ＦＢＰ−Ｎｕ各２個体をＴ０世代と同様に解析を行った。調査した３系統ともＦＢＰ−ＮｕＦＢＰ−Ｈｏ、ＦＢＰ−Ｈｅ、ではＦＢＰ−Ｎｕの１０％以下の発現量であり、Ｔ１世代においても遺伝子発現抑制効果が確認された（図２１）。つまり、遺伝子発現抑制効果は後代に遺伝することが確認された。図２１の各値は２個体の平均値で示した。

４） 炭水化物含量の定量
方法は実施例１と同様に行った。２９Ａ−７について、各２個体の下位から１８枚目〜２９枚目の１２葉位（コントロールとしては大きさが遺伝子組換え体と同程度の非形質転換体を用い、同様な葉位の１２枚）について調査したところ、ＦＢＰ−Ｈｏ、ＦＢＰ−Ｈｅでは全葉位において炭水化物（デンプン＋３糖）含量が非形質転換体に比べて大きく低減していた（図２２）。よって、葉位を問わず炭水化物含量が低下することが確認された。図２２の各値は欠損データを除き、２個体の平均値で示した。

５） 煙中ホルムアルデヒドおよびアクロレインの解析
方法は実施例１と同様に行った。２９Ａ−５、２９Ａ−７、２９Ａ−１０のＴ１世代、各２個体について上位葉（下位から２３から２７枚目）を用いて調査したところ、ＦＢＰ−Ｈｏにおいて非形質転換体に比べてホルムアルデヒドとアクロレインの減少が確認された（図２３）。３系統の平均でホルムアルデヒド、アクロレインは各々非形質転換体の３８％、７４％に減少した。よって、形質転換タバコにおいては燃焼煙中のホルムアルデヒド、アクロレインといった煙中カルボニル類が低減することが確認された。図２３の各値は２個体の平均値で示した。

［実施例３］葉緑体型Ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｓｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ （ＰＧＩ）
（１）遺伝子の単離
葉緑体型 ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｓｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ（ＰＧＩ）遺伝子の完全長ｃＤＮＡクローンは出願人保有のｃＤＮＡライブラリーから相同性検索により得ることができた（ＮＧＲＬ００１５＿１＿Ｂ１１）。配列番号８に完全長ｃＤＮＡ配列を示す。

（２）ベクター構築
フラグメント１は、ＰＧＩ遺伝子に相同な同一の配列であり（配列番号１９）、完全長ＰＧＩ遺伝子をコードするＮＧＲＬ００１５＿１＿Ｂ１１クローンを鋳型として、下記に示すＰＧＩ＿Ｆ＿ＢａｍＩプライマー（配列番号２０）とＰＧＩ＿Ｒ＿ＳｐｈＩプライマー（配列番号２１）の組み合わせを用いて得たＰＣＲ産物を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳｐｈＩを用いて消化することによって調製した（図２４）。フラグメント２（配列番号２２）は、フラグメント１はと同様に、ＰＧＩ＿Ｆ＿ＮｏｔＩプライマー（配列番号２３）とＰＧＩ＿Ｒ３プライマー（配列番号２４）の組み合わせを用いて得たＰＣＲ産物をプライマーに付与したＮｏｔＩ認識部位および完全長ｃＤＮＡ配列の１２２９塩基目に存在するＰｓｔＩ認識部位を制限酵素消化することによって調製した（図２４）。このようにして作製したフラグメント１（配列番号１９）およびフラグメント２（配列番号２２）を、ＡＧＰＳ遺伝子の場合と同様にして、ＰＧＩ遺伝子の部分配列が逆向反復となるＤＮＡ構造物を含むプラスミドｐＳＰ１０４＿ＰＧＩ＿ＦＲを構築した。さらに、ＡＧＰＳ遺伝子の場合と同様にして、発現カセットのドナーベクターｐＳＰ１０２＿ＰＧＩ（図２５）およびバイナリーベクターｐＳＰ１０６＿ＰＧＩを構築した。

（３）形質転換および閉鎖系温室での栽培
方法は実施例１と同様に行った。ＧＦＰ蛍光タンパク質が発現している２０個体（３４Ａ−０１〜０９、３４Ｐ−０１〜１１）の形質転換タバコ（Ｔ０世代）を得た。コントロールとしてトリガーとスペーサーを含まないベクターを形質転換したタバコを６個体（３４Ｃ−０１〜０６）得た。これらの個体は以下の解析に用いた。

（４）Ｔ０世代の解析
１） リアルタイムＰＣＲによる遺伝子発現確認
リアルタイムＰＣＲに用いたＰＧＩのｐｒｉｍｅｒ（配列番号４６、４７）とＰｒｏｂｅ（配列番号４８）は別途設計したが、それ以外の方法は実施例１と同様に行った。リアルタイムＰＣＲによりＰＧＩのｍＲＮＡ発現量を調査したところ、形質転換タバコ２０個体のうち１０個体はコントロール６個体平均の１０％以下であった（図２６）。
２） ＰＧＩ活性測定
（ｉ）タンパク質抽出
予め生重量（ＦＷ）を測定したラミナ（鉢上げ後約１．５ヶ月後の形質転換タバコの緑葉から採取）を液体窒素で粉砕した。ＦＷ１ｇ当たり３ｍｌのＰＧＩ用抽出バッファー：０．１Ｍ Ｂｉｃｉｎｅ−ＮａＯＨ：ｐＨ８．５、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ ＤＴＴ、１ｘ ｃｏｍｐｌｅｔｅ（ロッシュ・ダイアグノスティックス株式会社）、４％ ＰＶＰＰ（ｐｏｌｙ（ｖｉｎｙｌｐｏｌｙｐｒｒｏｌｉｄｏｎｅ））を添加して乳鉢と乳棒で磨砕抽出した。磨砕液を２ｍｌエッペンチューブに回収し、１５０００ｒｐｍ（２００００ｇ）で１０分間４℃の条件で遠心した。上清を回収して、氷上に置き、すぐに活性測定を行った。
（ｉｉ）タンパク質定量
牛血清アルブミン（ＦｒａｃｔｉｏｎＶ、ｓｉｇｍａ社）をスタンダードとして、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法によりプロテインアッセイ染色液（ＢｉｏＲａｄ社）を用いて行った。
（ｉｉｉ）活性測定
Ｐｌａｎｔａ（１９９４）１９４：９５−１０１を参考にし、１ｍｌの反応系で、最終濃度５０ｍＭ Ｂｉｃｉｎｅ−ＮａＯＨ：ｐＨ８．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．５ｍＭ β−Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ ａｄｅｎｉｎｅ ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（β−ＮＡＤ）、１Ｕ／ｍｌ Ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（Ｇ６ＰＤＨ；ｆｒｏｍ Ｌ．ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）となるようにｐｒｅｍｉｘを調製し、サンプル２５μｌ加え、＋／−１ｍＭ Ｆｒｕｃｔｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ｆ６Ｐ）でＡ３４０を２５℃で測定し、ＮＡＤＨのモル吸光係数６２２０から活性を算出した。形質転換タバコ８個体とコントロール３個体のＰＧＩ活性を測定したところ、形質転換タバコ８個体の平均はコントロール３個体の平均の４０％程度であった（表４）。

（ｉｖ）ＰＧＩ活性染色
可溶性タンパク質３０μｇをアクリルアミド濃度７．５％のｅ−パジェル（株式会社アトー）を用いて、常法によりＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥを行った。ＰＧＩ活性染色はＩｓｏｚｙｍｅｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ、ＰａｒｔＡ ｐ４９５−４９６を参考に行った。電気泳動後のゲルを、最終濃度５０ｍＭ Ｂｉｃｉｎｅ−ＮａＯＨ：ｐＨ８．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５ｍＭ Ｆ６Ｐ、０．２ｍｇ／ｍｌ ＭＴＴ（３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−ｔｈｉａｚｏｌｙｌ）２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｉｌｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）、５０ｍｇ／ｍｌ Ｐｈｅｎａｚｉｎｅ ｍｅｔｈｏｓｕｌｆａｔｅ（ＰＭＳ）、１ｍＭ β−ＮＡＤ、０．６Ｕ／ｍｌ Ｇ６ＰＤＨ（ｆｒｏｍ Ｌ．ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）の反応液中で３７℃、６０分間暗所で振とうした。

活性染色の結果、形質転換タバコ８個体ではコントロールでは検出された葉緑体型ＰＧＩバンドはほとんど検出されないが、細胞質型ＰＧＩバンドはコントロールと同様に検出された（図２７）。これらの結果から、形質転換タバコでは葉緑体型ＰＧＩ活性が特異的に抑制されていることが示された。

３） 炭水化物含量の定量
方法は、鉢上げ後約１．５ヶ月後の形質転換タバコの葉を使用した点を除いて、実施例１と同様に行った。ＰＧＩのｍＲＮＡ発現レベルがコントロールの１／８以下に減少した５個体とコントロール６個体についてデンプン＋３糖（ショ糖＋グルコース＋フルクトース）を炭水化物として含量を定量したところ、形質転換タバコ５個体全てにおいてコントロールに比べて顕著に減少していた（図２８）。つまり、ＰＧＩの遺伝子発現、活性が低減したタバコでは炭水化物（デンプン＋３糖）の含量が大きく低減することが確認された。図２８のコントロールは６個体の平均値で示し、エラーバーは標準偏差（ＳＤ）を示す。棒グラフのバーの白の部分はデンプン、斜線の部分は３糖を示す。

（５）Ｔ１世代の解析
１）Ｈｏｍｏ、Ｈｅｍｉ、Ｎｕｌｌ接合体の選抜
方法は実施例１と同様に行った。導入遺伝子に関してＨｏｍｏ接合体を以下ＰＧＩ−Ｈｏとし、Ｈｅｍｉ接合体を以下ＰＧＩ−Ｈｅとし、Ｎｕｌｌ接合体を以下ＰＧＩ−Ｎｕとした。Ｔ１世代の形質転換タバコの解析には、Ｔ０世代においてＰＧＩ遺伝子発現、ＰＧＩ活性及び炭水化物含量の低減程度が高かった２系統（３４Ａ−６、３４Ａ−８）のＰＧＩ−Ｈｏ、ＰＧＩ−Ｈｅ、ＰＧＩ−Ｎｕを用いた。尚、Ｔ１世代においてＨｏｍｏ、Ｈｅｍｉ、Ｎｕｌｌ接合体とみなしたそれぞれの個体から自家受粉を行ったＴ２種子を採種し、Ｔ１世代と同様にカナマイシンおよびＧＦＰ蛍光による分離比検定も行った。その結果、Ｔ１世代における判別結果は全て正しかった事を確認している。

２） 栽培
方法は実施例１と同様に行った。

３） リアルタイムＰＣＲによる遺伝子発現確認
上記で選抜した２系統（３４Ａ−６、３４Ａ−８）について、ＰＧＩ−Ｈｏ、ＰＧＩ−Ｈｅ、ＰＧＩ−Ｎｕ各３個体をＴ０世代と同様に解析を行った。調査した２系統ともＰＧＩ−Ｈｏ、ＰＧＩ−ＨｅではＰＧＩ−Ｎｕの１０％以下の発現量であり、Ｔ１世代においても遺伝子発現抑制効果が確認された（図２９）。つまり、遺伝子発現抑制効果は後代に遺伝することが確認された。図２９の各値は３個体の平均値で示し、エラーバーは標準偏差（ＳＤ）を示す。

４） 抗ＰＧＩ抗体を用いたウエスタンブロットによるタンパク質発現確認
（ｉ）抗ＰＧＩ抗体の作製
ｐＭＡＬ−ｃ２Ｘ Ｖｅｃｔｏｒへ挿入するＰＧＩ遺伝子の断片は、上述の完全長クローン００１５＿１＿Ｂ１１を鋳型として、ＳｃａＩ認識配列を付与した配列番号３１（ＰＧＩ＿ｐＭＡＬ＿Ｆ＿ＳｃａＩ）に示すプライマーとＥｃｏＲＩ認識配列を付与した配列番号３２（ＰＧＩ＿ｐＭＡＬ＿Ｒ＿ＥｃｏＲＩ）に示すプライマーの組み合わせを用いて得たＰＣＲ産物を制限酵素ＨｐａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化することによって調製した。このようにして得た断片をｐＭＡＬ−ｃ２Ｘ ＶｅｃｔｏｒのＳｃａＩ認識部位とＥｃｏＲＩの認識部位に挿入することによって、ｍａｌｔｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＢＰ）と配列番号３３に示すＰＧＩ部分アミノ酸配列との融合タンパク質を生産するｐＭＡＬ＿ＰＧＩを作製した。

実施例２と同様に大腸菌で発現させ、ＭＢＰ融合タンパク質を精製した。このＭＢＰ融合タンパク質を抗原として旭テクノグラス株式会社に委託した。
（ｉｉ）タンパク質抽出
緑葉のラミナから直径約１０ｍｍのリーフディスク２〜３枚を打ち抜き、予め抽出バッファーＡを２００〜３００μｌ分注したマルチビーズショッカー専用２ｍｌチューブに入れて液体窒素で凍結させた。メタルコーンを入れて２２００ｒｐｍ、３０〜６０秒間マルチビーズショッカー処理を行った。１００００ｒｐｍ、４℃、５分間遠心した上清を新しいチューブにとり、再度１５０００ｒｐｍ、４℃、５分間遠心した上清をウエスタンブロット、タンパク質定量に用いた。

（ｉｉｉ）ウエスタンブロット
実施例２と同様に行った。

調査した２系統（３４Ａ−６、３４Ａ−８）ともＰＧＩ−Ｎｕにおいては確認されたタンパク質の発現はＰＧＩ−Ｈｏ、ＰＧＩ−Ｈｅでは確認できなかった（図３０）。Ｔ０世代の解析において、葉緑体型ＰＧＩ活性が特異的に低減したのは、葉緑体型ＰＧＩタンパク質の発現が低減したことによることが確認された。

５） 炭水化物含量の定量
方法は実施例１と同様に行った。３４Ａ−８（Ｔ１世代）について、下位から１６枚目〜２７枚目の１２葉位について調査したところ、ＰＧＩ−Ｈｏ、ＰＧＩ−Ｈｅでは全葉位において炭水化物（デンプン＋３糖）含量がＰＧＩ−Ｎｕに比べて大きく低減していた（図３１）。よって、形質転換タバコでは葉位を問わず炭水化物含量が低下することが確認された。図３１の各値は一部欠損データがある場合を除き、３個体の平均値、エラーバーは標準偏差（ＳＤ）で示した。

６） 煙中ホルムアルデヒドおよびアクロレインの解析
方法は実施例１と同様に行った。３４Ａ−６、３４Ａ−８（Ｔ１世代）の各３個体について上位葉（下位から１９〜２３枚目）を用いて調査したところ、ＰＧＩ−ＨｏはＰＧＩ−Ｎｕに比べて燃焼煙中のホルムアルデヒドが有意に低減し、アクロレインもＰＧＩ−ＨｏではＰＧＩ−Ｎｕに比べて低い傾向が確認された（図３２）。平均値としては最大で、各々ＰＧＩ−Ｎｕの７０％、７８％に低減した。よって、ＰＧＩの遺伝子発現、タンパク質発現、活性が低減したタバコ燃焼煙中のホルムアルデヒド、アクロレインといった煙中カルボニル類が低減することが確認された。図３２の各値は３個体の平均値、エラーバーは標準偏差（ＳＤ）で示した。

７） 植物体の形態
過去に報告のある、タバコの葉のデンプン、糖含量等を低減させた形質転換タバコ（非特許文献２、３）では生育異常が報告されている。それに対して、鉢上げ約１ヶ月後において、ＰＧＩ−Ｈｏ、ＰＧＩ−Ｈｅ（Ｔ１世代）はＰＧＩ−Ｎｕと同様な生育を示した（図４２）。収穫期においてもＰＧＩ−Ｈｏ、ＰＧＩ−Ｈｅ（Ｔ１世代）はＰＧＩ−Ｎｕと同様な生育を示したことから、本形質転換タバコは、生育異常を伴わずに特異的に炭水化物を低減できる点で、優れていると考えられる。

［実施例４］ｉｓｏａｍｙｌａｓｅ １
（１）遺伝子の単離
Ｉｓｏａｍｙｌａｓｅ １（ｉｓｏａｍｙ１）をコードする既知のｍＲＮＡ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＹ１３２９９６）を基に、配列番号９（ｉｓｏａｍｙ１＿Ｆ１）および配列番号１０（ｉｓｏａｍｙ１＿Ｒ２）に示す特異的なオリゴプライマーを設計して化学合成した。ｉｓｏａｍｙ１遺伝子断片のクローニングは、配列番号９のプライマーと配列番号１０のプライマーの組み合わせを用いて、ＡＧＰＳ遺伝子断片のクローニングと同様にして行い、配列番号１１（ｉｓｏａｍｙ１＿Ｆ１Ｒ２）に示す１１９７塩基からなるＤＮＡ断片を含むプラスミドｐＣＲ４＿ｉｓｏａｍｙ１＿Ｆ１Ｒ２を得た。

また、ｉｓｏａｍｙ１遺伝子の２種の完全長クローンも出願人保有のｃＤＮＡライブラリーから相同性検索により得ることができた。出願人保有のｃＤＮＡライブラリーとは、つくば１号の完全長ｃＤＮＡクローンを個別に単離し、末端配列情報とともに整理したものである。完全長ｃＤＮＡクローンＧＲ００７６＿３＿Ｆ１１は、上述の配列番号１１の完全長と考えられる、配列番号１２に示すｃＤＮＡを含んでおり、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＹ１３２９９６と９２％の相同性が認められた。このほかに、配列番号１２およびＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＹ１３２９９６と９７％および９１％の相同性を持つ、配列番号１３に示す配列を含む完全長ｃＤＮＡクローンＧＲ００１６＿２＿Ｅ０１も得ることができた。

（２）ベクター構築
ｉｓｏａｍｙ１遺伝子に相同であるフラグメント１（配列番号２５）は、まず、ｐＣＲ４＿ｉｓｏａｍｙ１＿Ｆ１Ｒ２を鋳型としてＳｐｈＩ認識配列を付与した配列番号２６（ｉｓｏａｍｙ１＿Ｆ＿ＢａｍＨＩ）と配列番号２７（ｉｓｏａｍｙ１＿Ｒ＿ＳｐｈＩ）に示すプライマーを用いて増幅したＰＣＲ産物を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳｐｈＩを用いて消化することによって調製した（図３３）。フラグメント２は、配列番号１１（ｉｓｏａｍｙ１＿Ｆ１Ｒ２）と同一の配列を含んでおり、プラスミドｐＣＲ４＿ｉｓｏａｍｙ１＿Ｆ１Ｒ２を制限酵素ＮｏｔＩおよびＰｓｔＩを用いて消化することによって調製した（図３３）。このようにして作製したフラグメント１（配列番号２５）およびフラグメント２を、ＡＧＰＳ遺伝子の場合と同様にして、ｉｓｏａｍｙ１遺伝子の部分配列が逆向反復となるＤＮＡ構造物を含むプラスミドｐＳＰ１０４＿ｉｓｏａｍｙ１＿ＦＲを構築した。さらに、ＡＧＰＳ遺伝子の場合と同様にして、発現カセットのドナーベクターｐＳＰ１０２＿ｉｓｏａｍｙ１（図３４）およびバイナリーベクターｐＳＰ１０６＿ｉｓｏａｍｙ１を構築した。

（３）形質転換および閉鎖系温室での栽培
方法は実施例１と同様に行った。ＧＦＰ蛍光タンパク質が発現している２０個体（２５Ａ−１〜２０）の形質転換タバコ（Ｔ０世代）を得た。コントロールとしてトリガーとスペーサーを含まないベクターを形質転換したタバコを６個体（２５Ｃ−１〜６）得た。これらの個体は以下の解析に用いた。

（４）Ｔ０世代の解析
１） リアルタイムＰＣＲによる遺伝子発現確認
リアルタイムＰＣＲに用いたｉｓｏａｍｙ１のｐｒｉｍｅｒ（配列番号４９、５０）とＰｒｏｂｅ（配列番号５１）は別途設計したが、それ以外の方法は実施例１と同様に行った。リアルタイムＰＣＲによりｉｓｏａｍｙ１のｍＲＮＡ発現量を調査したところ、形質転換タバコ２０個体のうち１７個体はコントロール６個体平均の１０％以下と顕著な低減が確認された（図３５）。
２） 抗ｉｓｏａｍｙ１抗体を用いたウエスタンブロットによるタンパク質発現確認
（ｉ）抗ｉｓｏａｍｙｌ１抗体の作製
ｐＭＡＬ−ｃ２Ｘ Ｖｅｃｔｏｒへ挿入するｉｓｏａｍｙ１遺伝子の断片は、上述のプラスミドｐＣＲ４＿ ｉｓｏａｍｙ１＿Ｆ１Ｒ２を鋳型として、ＨｐａＩ認識配列を付与した配列番号３４（ｉｓｏａｍｙ１＿ｐＭＡＬ＿Ｆ＿ＨｐａＩ）に示すプライマーとＨｉｎｄＩＩＩ認識配列を付与した配列番号３５（ｉｓｏａｍｙ１＿ｐＭＡＬ＿Ｒ＿ＨｉｎｄＩＩＩ）に示すプライマーの組み合わせを用いて得たＰＣＲ産物を制限酵素ＨｐａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化することによって調製した。このようにして得た断片をｐＭＡＬ−ｃ２Ｘ ＶｅｃｔｏｒのＨｐａＩ認識部位とＨｉｎｄＩＩＩの認識部位に挿入することによって、ｍａｌｔｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＢＰ）と配列番号３６に示すｉｓｏａｍｙ１部分アミノ酸配列との融合タンパク質を生産するｐＭＡＬ＿ｉｓｏａｍｙ１を作製した。
実施例２と同様に大腸菌発現、ＭＢＰ融合タンパク質の精製を行い、精製タンパク質を抗原として、（株）シバヤギに委託してウサギの抗血清を得た。
（ｉｉ）タンパク質抽出、（ｉｉｉ）タンパク質定量
実施例３と同様に行った。
（ｉｖ）ウエスタンブロット
タンパク質３０μｇを用いて、１次抗体として抗血清をＴＢＳ−Ｔ−ＳＫで５０００倍に希釈して用いた点を除き、実施例１と同様に行った。

ｍＲＮＡ発現量がコントロールの１０％以下に低減したことが確認された形質転換タバコ７個体とコントロール２個体のｉｓｏａｍｙ１タンパク質発現を調査したところ、形質転換タバコ７個体ではほとんど検出限界以下であり、コントロールに比べて顕著に発現レベルが低かった（図３６）。遺伝子組換えタバコではｍＲＮＡに加えてタンパク質の発現量も低減していることが確認された。

３） 炭水化物含量の定量
方法は実施例１と同様に行った。形質転換タバコ６個体とコントロール６個体についてデンプン＋３糖（ショ糖＋グルコース＋フルクトース）を炭水化物として含量を定量したところ、形質転換タバコ６個体全てにおいてコントロールに比べて有意に減少していた（図３７）。つまり、ｉｓｏａｍｙ１遺伝子発現、タンパク質発現が低減した形質転換タバコでは炭水化物（デンプン＋３糖）の含量が大きく低減することが確認された。図３７のコントロールは６個体の平均値で示し、エラーバーは標準偏差（ＳＤ）を示す。棒グラフのバーの白の部分はデンプン、斜線の部分は３糖を示す。

（５）Ｔ１世代の解析
１）Ｈｏｍｏ、Ｈｅｍｉ、Ｎｕｌｌ接合体の選抜
方法は実施例１と同様に行った。導入遺伝子に関してＨｏｍｏ接合体を以下ｉｓｏａｍｙ１−Ｈｏとし、Ｈｅｍｉ接合体を以下ｉｓｏａｍｙ１−Ｈｅとし、Ｎｕｌｌ接合体を以下ｉｓｏａｍｙ１−Ｎｕとした。Ｔ１世代の形質転換タバコの解析には、Ｔ０世代においてｉｓｏａｍｙ１遺伝子発現、タンパク質発現、及び炭水化物含量の低減程度が高かった３系統（２５Ａ−６、２５Ａ−１５、２５Ａ−１６）のｉｓｏａｍｙ１−Ｈｏ、ｉｓｏａｍｙ１−Ｈｅ、ｉｓｏａｍｙ１−Ｎｕを用いた。尚、Ｔ１世代においてＨｏｍｏ、Ｈｅｍｉ、Ｎｕｌｌ接合体とみなしたそれぞれの個体から自家受粉を行ったＴ２種子を採種し、Ｔ１世代と同様にカナマイシンおよびＧＦＰ蛍光による分離比検定も行った。その結果、Ｔ１世代における判別結果は全て正しかった事を確認している。

２） 栽培
方法は実施例１と同様に行った。

３） 抗ｉｓｏａｍｙ１抗体を用いたウエスタンブロットによるタンパク質発現確認
抽出タンパク質を１０μｇ用いた以外はＴ０世代の解析と同様に行った。２系統（２５Ａ−６、２５Ａ−１５）のｉｓｏａｍｙ１−Ｈｏ、ｉｓｏａｍｙ１−Ｎｕ各２個体についてｉｓｏａｍｙ１タンパク質の発現確認を行ったところ、ｉｓｏａｍｙ１−Ｈｏではほとんど検出限界以下であり、ｉｓｏａｍｙ１−Ｎｕに比べて顕著な発現レベルの低減が確認された（図３８）。タンパク質発現抑制効果は後代に遺伝することが確認された。

２） 炭水化物含量の定量
方法は、鉢上げ後約１．５ヶ月後の形質転換タバコの葉を使用した点を除き、実施例１と同様に行った。２５Ａ−１５（Ｔ１世代）について、下位から１２枚目〜２２枚目の１１葉位について調査したところ、ｉｓｏａｍｙ１−Ｈｏ、ｉｓｏａｍｙ１−Ｈｅでは全葉位において炭水化物（デンプン＋３糖）含量がｉｓｏａｍｙ１−Ｎｕに比べて低減していた（図３９）。よって、形質転換タバコでは葉位を問わず炭水化物含量が低下することが確認された。図３９の各値は一部欠損データがある場合を除いて各３個体の平均値で示し、エラーバーは標準偏差（ＳＤ）を示す。

３） 煙中ホルムアルデヒドの解析
方法は実施例１と同様に行った。２５Ａ−６、２５Ａ−１５、２５Ａ−１６（Ｔ１世代）の各３個体について上位葉（下位から１９〜２２枚目）を用いて調査したところ、ｉｓｏａｍｙ１−Ｈｏにおいてｉｓｏａｍｙ１−Ｎｕに比べてホルムアルデヒドの有意な減少が確認された（図４０）。最も低減がみられた系統ではｉｓｏａｍｙ１−Ｎｕの５０％以下であった。よって、形質転換タバコでは燃焼煙中のホルムアルデヒドといった煙中カルボニル類が低減することが確認された。図４０の各値は３個体の平均値で示し、エラーバーは標準偏差（ＳＤ）を示す。

４） 植物体の形態
過去に報告のある、タバコの葉のデンプン、糖含量等を低減させた形質転換タバコ（非特許文献２、３）では生育異常が報告されている。それに対して、鉢上げ約１ヶ月後において、ｉｓｏａｍｙ１−Ｈｏ、ｉｓｏａｍｙ１−Ｈｅ（Ｔ１世代）はｉｓｏａｍｙ１−Ｎｕと同様な生育を示した（図４３）。収穫期においてもｉｓｏａｍｙ１−Ｈｏ、ｉｓｏａｍｙ１−Ｈｅ（Ｔ１世代）はｉｓｏａｍｙ１−Ｎｕと同様な生育を示したことから、本形質転換タバコは、生育異常を伴わずに特異的に炭水化物を低減できる点で、優れていると考えられる。

本発明は、燃焼煙中のカルボニル類が低減された葉タバコを提供することが可能である。

ベクターｐＳＰ１０４の構造を示す。 ＰＣＲ増幅されたフラグメント１および２を示す。 ベクターｐＳＰ１０２の構造を示す。 プラスミドｐＳＰ１０２＿ＡＧＰＳの構造を示す。 バイナリーベクターｐＳＰ１０６の構造を示す。 バイナリーベクターｐＳＰ１０６＿ＡＧＰＳの構造を示す。 ＡＧＰＳ発現抑制形質転換体のヨード染色を示す。 ＡＧＰＳ発現抑制形質転換体のＴ０世代のＡＧＰＳのｍＲＮＡ発現量を示す。 ＡＧＰＳ発現抑制形質転換体のＴ０世代のＡＧＰＳタンパク質の発現を示す。 ＡＧＰＳ発現抑制形質転換体のＴ０世代の炭水化物含量を示す。 ＡＧＰＳ発現抑制形質転換体のＴ１世代のＡＧＰＳのｍＲＮＡ発現量を示す。 ＡＧＰＳ発現抑制形質転換体のＴ１世代の炭水化物含量を示す。 Ａは、ＡＧＰＳ発現抑制形質転換体のＴ１世代の煙中ホルムアルデヒド量を示す。Ｂは、ＡＧＰＳ発現抑制形質転換体のＴ１世代の煙中アクロレイン量を示す。 ＡＧＰＳ発現抑制形質転換体のＴ２世代の炭水化物含量を示す。 Ａは、ＡＧＰＳ発現抑制形質転換体のＴ２世代の煙中ホルムアルデヒド量を示す。Ｂは、ＡＧＰＳ発現抑制形質転換体のＴ２世代の煙中アクロレイン量を示す。 ＰＣＲ増幅されたフラグメント１および２を示す。 ドナーベクターｐＳＰ１０２＿ＦＢＰの構造を示す。 ＦＢＰａｓｅ発現抑制形質転換体のＴ０世代のＦＢＰａｓｅのｍＲＮＡ発現量を示す。 ＦＢＰａｓｅ発現抑制形質転換体のＴ０世代のＦＢＰａｓｅタンパク質の発現を示す。 ＦＢＰａｓｅ発現抑制形質転換体のＴ０世代の炭水化物含量を示す。 ＦＢＰａｓｅ発現抑制形質転換体のＴ１世代のＦＢＰａｓｅのｍＲＮＡ発現量を示す。 ＦＢＰａｓｅ発現抑制形質転換体のＴ１世代の炭水化物含量を示す。 Ａは、ＦＢＰａｓｅ発現抑制形質転換体のＴ１世代の煙中ホルムアルデヒド量を示す。Ｂは、ＦＢＰａｓｅ発現抑制形質転換体のＴ１世代の煙中アクロレイン量を示す。 ＰＣＲ増幅されたフラグメント１および２を示す。 ドナーベクターｐＳＰ１０２＿ＰＧＩの構造を示す。 ＰＧＩ発現抑制形質転換体のＴ０世代のＰＧＩのｍＲＮＡ発現量を示す。 ＰＧＩ発現抑制形質転換体のＴ０世代のＰＧＩ活性染色を示す。 ＰＧＩ発現抑制形質転換体のＴ０世代の炭水化物含量を示す。 ＰＧＩ発現抑制形質転換体のＴ１世代のＰＧＩのｍＲＮＡ発現量を示す。 ＰＧＩ発現抑制形質転換体のＴ１世代のＰＧＩタンパク質の発現を示す。 ＰＧＩ発現抑制形質転換体のＴ１世代の炭水化物含量を示す。 Ａは、ＰＧＩ発現抑制形質転換体のＴ１世代の煙中ホルムアルデヒド量を示す。Ｂは、ＰＧＩ発現抑制形質転換体のＴ１世代の煙中アクロレイン量を示す。 ＰＣＲ増幅されたフラグメント１および２を示す。 ドナーベクターｐＳＰ１０２＿ｉｓｏａｍｙ１の構造を示す。 ｉｓｏａｍｙ１発現抑制形質転換体のＴ０世代のｉｓｏａｍｙ１のｍＲＮＡ発現量を示す。 ｉｓｏａｍｙ１発現抑制形質転換体のＴ０世代のｉｓｏａｍｙ１タンパク質の発現を示す。 ｉｓｏａｍｙ１発現抑制形質転換体のＴ０世代の炭水化物含量を示す。 ｉｓｏａｍｙ１発現抑制形質転換体のＴ１世代のｉｓｏａｍｙ１タンパク質の発現を示す。 ｉｓｏａｍｙ１発現抑制形質転換体のＴ１世代の炭水化物含量を示す。 ｉｓｏａｍｙ１発現抑制形質転換体のＴ１世代の煙中ホルムアルデヒド量を示す。 ＡＧＰＳ発現抑制形質転換体のＴ１世代の形態を示す。 ＰＧＩ発現抑制形質転換体のＴ１世代の形態を示す。 ｉｓｏａｍｙ１発現抑制形質転換体のＴ１世代の形態を示す。

Claims (20)

1. 以下の（ａ）〜（ｃ）に示すいずれかのタンパク質をコードするデンプン生合成に関与する遺伝子の発現が抑制され、燃焼煙中のカルボニル類含量が低減された、タバコ属植物。
   （ａ）配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５および配列番号５６からなる群から選択されたアミノ酸配列からなるタンパク質
   （ｂ）配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５および配列番号５６からなる群から選択されたアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつデンプン生合成に関与するタンパク質
   （ｃ）配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５および配列番号５６からなる群から選択されたアミノ酸配列に対して８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつデンプン生合成に関与するタンパク質
2. 前記遺伝子が、
   （ｄ）配列番号４、配列番号７、配列番号８および配列番号１２からなる群から選択された塩基配列からなるポリヌクレオチド、
   （ｅ）配列番号４、配列番号７、配列番号８および配列番号１２からなる群から選択された塩基配列に対して８５％以上の同一性を有し、かつデンプン生合成に関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
   （ｆ）配列番号４、配列番号７、配列番号８および配列番号１２からなる群から選択された塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつデンプン生合成に関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、または
   （ｇ）配列番号４、配列番号７、配列番号８および配列番号１２からなる群から選択された塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつデンプン生合成に関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
   を含む、請求項１に記載のタバコ属植物。
3. 前記カルボニル類が、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、アセトン、アクロレイン、プロピオンアルデヒド、クロトンアルデヒド、メチルエチルケトンおよびブチルアルデヒドからなる群から選択される、請求項１または２に記載のタバコ属植物。
4. 前記カルボニル類が、ホルムアルデヒドまたはアクロレインである、請求項３に記載のタバコ属植物。
5. 請求項１〜４のいずれか１項に記載のタバコ属植物の組織または細胞。
6. 前記組織が葉である、請求項５に記載の組織または細胞。
7. 配列番号４に示す塩基配列、配列番号７に示す塩基配列、配列番号８に示す塩基配列、配列番号１２に示す塩基配列、それらの配列に対して９０％以上の同一性を有する塩基配列、およびそれらの塩基配列の２０塩基以上の部分配列からなる群から選択される塩基配列を含む、遺伝子発現抑制用ベクター。
8. 前記塩基配列の連続した２０塩基以上からなる塩基配列をアンチセンス方向に含む、請求項７に記載のベクター。
9. 前記塩基配列のセンス鎖および該センス鎖に対合するアンチセンス鎖を含む、請求項７に記載のベクター。
10. 前記センス鎖およびアンチセンス鎖が、前記塩基配列の連続した２０塩基以上からなる、請求項９に記載のベクター。
11. 前記センス鎖とアンチセンス鎖の間にスペーサーを有する、請求項９または１０に記載のベクター。
12. 植物細胞内で作動可能なプロモーターを有する、請求項９〜１１のいずれか１項に記載のベクター。
13. タバコ属植物の細胞または組織を、ＲＮＡ干渉法、アンチセンス法、遺伝子破壊法、人為的突然変異法、リボザイム法、共抑制法及び転写因子を用いた方法から選択されるいずれかの方法を用いて、請求項１および２に定義された（ａ）〜（ｇ）のいずれかの遺伝子の発現を抑制し、植物体を再生することを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のタバコ属植物を作製する方法。
14. 請求項７〜１２のいずれか１項に記載のベクターを、植物細胞または組織に導入し、植物体を再生する、請求項１３に記載の方法。
15. 前記植物体を母本として後代を作出する、請求項１４に記載の方法。
16. 請求項１〜４のいずれか１項に記載のタバコ属植物の後代であって、請求項１または２に定義された（ａ）〜（ｇ）のいずれかの遺伝子の発現が抑制されたことを特徴とする、後代。
17. 請求項１〜４のいずれか１項に記載のタバコ属植物または請求項１６に記載の後代の葉から作製されたタバコ製品。
18. タバコ属植物において、請求項１または２に定義された（ａ）〜（ｇ）のいずれかの遺伝子の発現を抑制することを含む、タバコ属植物の燃焼煙中のカルボニル類含量を低減する方法。
19. 前記遺伝子の発現の抑制を、ＲＮＡ干渉法、アンチセンス法、遺伝子破壊法、人為的突然変異法、リボザイム法、共抑制法及び転写因子を用いた方法からなる群から選択される方法によって行うことを含む、請求項１８に記載の方法。
20. 請求項７〜１２のいずれか１項に記載のベクターを植物細胞または組織に導入する、請求項１８または１９に記載の方法。

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