CN107805641B - 烟草14-3-3c基因的植物表达载体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种烟草14‑3‑3c基因植物表达载体及其应用，属于基因工程领域，本发明用烟草14‑3‑3c基因的cDNA构建植物表达载体pK2‑35S‑14‑3‑3c，并通过农杆菌介导转入植物中，使植物提高对甲醛(HCHO)的吸收和耐受能力，克服植物本身吸收耐受甲醛能力低的缺点；实验结果表明在烟草中过量表达14‑3‑3c基因，使烟草在4 mmol·L‑1液体甲醛胁迫下的叶绿素降解放缓，丙二醛(MDA)和过氧化氢(H2O2)积累也减缓，因此增强了烟草叶片对于甲醛的抗性的同时促进了烟草叶片对液体甲醛的吸收，说明过量表达14‑3‑3c转基因烟草对液体甲醛的抗性和吸收能力强于野生型。

Description

烟草14-3-3c基因的植物表达载体及其应用
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及烟草14-3-3c基因植物表达载体及其在制备吸收甲醛能力增强的转基因植物中的应用。
背景技术
甲醛(Formaldehyde, HCHO)被世界卫生组织列为具有致癌性的挥发性有机化合物(volatile organic compounds,VOCs)，它能够以气态、溶解态或结合态的形式存在于生物的体内或外环境中。水体中甲醛污染来自于化工和医药等行业在生产过程中产生的大量HCHO废水，如酚醛树脂的连续生产过程中产生的冷凝水和冲泵水中都含有高浓度的HCHO，在《GB 31571-2015石油化学工业污染物排放标准》中规定，废水的甲醛排放限值为1 mg·L-1，《GB 8978-1996污水综合排放标准》规定第二类污水允许的最高甲醛排放浓度为2 mg·L-1，《GB 3838-2002 地表水环境质量标准》则规定，集中式生活饮用水地表水源地的甲醛含量不得高于0.9 mg·L-1。此外，生物和医学领域用于标本防腐处理的甲醛溶液废水也是水体HCHO污染的来源。甲醛对人体有多方面的毒害作用且与人的许多疾病有一定相关性，它对皮肤、黏膜、肝脏、生殖系统以及神经系统等都表现出显著的毒害作用。外源性甲醛通过吸入或皮肤黏膜接触的方式进入人体，首先对皮肤和黏膜有一定刺激性和致敏性，低浓度液体甲醛会引起DNA断裂，高浓度的液体甲醛会明显引发DNA与蛋白质的交联作用。
14-3-3蛋白是真核生物细胞中一组高度保守的酸性二聚体蛋白质，最早在牛脑组织中被发现，二十多年后才相继从多种植物中被分离出来。植物中14-3-3蛋白已被证实广泛分布于细胞质、细胞核、线粒体基质、叶绿体基质和类囊体膜上。14-3-3蛋白为同源或异源二聚体，每个单体含有9个α-螺旋，两个反向平行的单体在空间上形成一个沟槽状结构，是靶蛋白的结合区，14-3-3蛋白通过与靶蛋白结合从而调节各种生命活动，N-末端和C-末端是14-3-3蛋白行使其功能的重要结构，不同14-3-3蛋白的N-末端、C-末端是高度变化的，N-末端在14-3-3蛋白二聚体的形成以及与靶蛋白结合中发挥着重要作用，C-末端则直接参与蛋白质-蛋白质间相互作用。14-3-3蛋白是植物细胞内蛋白质间相互作用的核心，广泛参与植物体内物质运输的调控、植物生长发育的调控、植物营养代谢的调控、植物细胞周期的调控，并参与植物的光信号途径。
发明内容
本发明的目的在于提供一种含有烟草14-3-3c基因的植物表达载体pk2-35S-14- 3-3c，同时提供该载体的构建方法，以及利用该载体制备快速吸收和耐受甲醛的转基因植物。
本发明所提供的载体含有烟草14-3-3c基因、CaMV35S强启动子，所述的14-3-3c基因的cDNA来源于烟草（Nicotiana tabacum），GenBank登录号为U91724.1。
上述载体中，用于构建所属植物表达载体的起始载体为pMD18-T(购于大连TaKaRa生物公司)，用于构建所属植物表达载体的最终载体为pK2GW7（购自FlandersInteruniversity Institute for Biotechnology，VIB）。
为了实现本发明的上述目的，本发明的技术方案如下：
1、植物表达载体的构建
（1）从GenBank中查找烟草14-3-3c基因的cDNA序列，并设计一对序列如下的引物；
上游引物 5' GTCGACTCTAAACATGGCGGTGGC3'（含有Sal I位点）；
下游引物 5' GATATCTCAATTTTTGGCTTCATCAGG3'（含有EcoR V位点）；
上游引物5’端添加Sal I（GTCGAC）酶切位点；下游引物5’端添加EcoR V（GATATC）酶切位点，以烟草第一链cDNA为模板扩增，得到14-3-3c基因的全长cDNA；
（2）回收并纯化14-3-3c全长基因cDNA片段，并将其连接到pMD18-T载体上，提取质粒DNA，通过PCR检测和酶切检测获得重组质粒pMD18-T-14-3-3c；
（3）构建入门克隆载体pENTR-2B-14-3-3c，用EcoR V和Sal I酶切pMD18-T-14-3- 3c和pENTR-2B，回收14-3-3c的cDNA片段，通过连接酶亚克隆到pENTR-2B，得到入门克隆载体pENTR-2B-14-3-3c；
（4）构建植物过表达载体pK2-35S-14-3-3c，通过Gateway技术的LR反应把14-3-3c亚克隆到植物表达载体pK2GW7中，获得14-3-3c基因的植物表达载体pK2-35S-14-3-3c。
本发明的植物表达载体对能实施转基因操作的植物都适用，如烟草、拟南芥、矮牵牛、非洲菊等，在本发明的实施中以烟草为例说明该表达载体的应用过程。
2、烟草的转化
采用电击转化法转化质粒pK2-35S-14-3-3c进入农杆菌C58C1（pMP90）感受态细胞，涂布在Spe平板上生长两天后，用菌落PCR检测质粒是否转化到农杆菌中。通过农杆菌介导的叶盘转化法制备烟草(Nicotiana tabacum cv.Xanthi)的无菌苗，然后通过组织培养获得小苗，筛选具有卡那霉素（Kan）抗性植株，将其转移到MS培养基（含有3 %蔗糖）上继续培养，从而获得无菌的转基因烟草植株。
3、14-3-3c基因转录水平的检测
为了检测目的基因14-3-3c基因在转基因烟草中的表达量，提取抗性苗RNA，利用14-3-3c基因上下游引物进行RT-PCR检测，筛选出14-3-3c基因表达量显著上调的烟草植株。
4、过量表达14-3-3c转基因烟草叶片对液体甲醛的吸收能力检测
使用4 mmol·L-1的甲醛溶液(含5 mmol·L-1 KHCO3、1% MES)，每个处理液加入2 g新鲜的烟草叶片，置于25℃/24 h (100 μmol·m-2·s-1)光照，摇床转速100 rpm进行HCHO胁迫处理, 在6、12、24、48和72 h时分别测定处理液中剩余HCHO的含量，处理完毕后分别从各实验组中取烟草叶片0.2 g，用液氮速冻后置于-80℃保存备用。
5、过量表达14-3-3c转基因烟草对液体甲醛的抗性检测
（1）叶绿素含量的测定：取上述实验中处理72 h后的烟草叶片，以预冷的无菌ddH2O冲洗叶片3~4次，纸巾吸干叶片表面残留的ddH2O，95%乙醇提取叶绿素，并以紫外分光光度法测定 665和 649 nm 处的吸光度A649 和A665，根据以下公式计算叶绿素a和b的含量。叶绿素a含量(mg·g-1) =13.95×A665–6.88×A649；叶绿素 b含量(mg·g-1)=24.96×A649–7.32×A665；
（2）丙二醛（MDA）和过氧化氢（H2O2）含量的测定：取4 mmol·L-1的液体甲醛胁迫处理48 h 的烟草叶片用于丙二醛（MDA）和过氧化氢（H2O2）含量的测定，其中MDA含量测定采用TBA方法，H2O2含量采用二甲酚橙法测定。
本发明优点：
本发明的重组载体pK2-35S-14-3-3c在转基因植株中的应用可提高植物对甲醛的吸收速率和抗性；实验结果表明在烟草中过量表达14-3-3c基因，使烟草在4 mmol·L-1液体甲醛胁迫下的叶绿素降解放缓，丙二醛(MDA)和过氧化氢(H2O2)积累也减缓，因此增强了烟草叶片对于甲醛的抗性的同时促进了烟草叶片对液体甲醛的吸收，说明过量表达14-3-3c转基因烟草对液体甲醛的抗性和吸收能力强于野生型。
附图说明
图1为烟草14-3-3c基因TA克隆示意图；
图2为14-3-3c植物过量表达载体pK2-35S-14-3-3c构建示意图；
图3为过量表达14-3-3c转基因烟草转录水平检测结果；以野生型烟草的cDNA为对照模板（WT），kc1~kc5为经抗生素筛选出的转基因烟草株系；
图4为过量表达14-3-3c烟草叶片对液体甲醛的吸收示意图；
图5为4 mmol·L-1液体甲醛胁迫72 h后WT和转基因烟草叶绿素含量的变化情况；
图6为4 mmol·L-1液体甲醛胁迫48 h后WT和转基因烟草叶片MDA（A）和H2O2（B）含量的变化情况。
具体实施方式
试剂与仪器：
试剂主要分为分子生物学实验试剂、植物遗传转化所需的培养基以及转基因植物鉴定和检测所需的各种试剂。限制性内切酶EcoR V和Sal I、Taq DNA聚合酶、反转录酶、RNA酶抑制剂、dNTP、质粒提取试剂盒等为宝生物工程有限公司(大连)产品，TRIzoL ReagentRNA提取试剂盒、Gateway LR clonase Enzyme Mix kit购自Invitrogen公司；其余试剂均为国产分析纯。
仪器均为分子生物学以及基因工程实验室常用仪器。
所有引物序列均在硕擎生物公司合成。
本发明实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1：14-3-3c基因cDNA的PCR扩增及TA克隆
从GenBank中查找烟草14-3-3c基因的CDS序列，并设计一对序列如下的引物：
上游引物 5' GTCGACTCTAAACATGGCGGTGGC3'（含有Sal I位点）；
下游引物 5' GATATCTCAATTTTTGGCTTCATCAGG3'（含有EcoR V位点）
上游引物5’端添加Sal I（GTCGAC）酶切位点；下游引物5’端添加EcoR V（GATATC）酶切位点，以烟草第一链cDNA为模板扩增，得到14-3-3c基因的全长cDNA。
用TRIzoL Reagent（Invitrogen）从烟草叶片中提取总RNA，取植物嫩叶约0.1 g，加入1mL 的TRIzoL提取液在研钵中研磨，室温静置5 min后移入离心管，再加入0.2 mL氯仿，振荡混匀，离心15 min（12000 rpm），转移上清液至新管，加入0.5 mL异丙醇，混匀室温放置10 min，4℃离心10min（12000 rpm），弃上清，沉淀用75％乙醇1 mL清洗，4℃离心5 min（7500 rpm），弃乙醇真空干燥沉淀或自然晾干，用20μl焦碳酸二乙酯（DEPC）处理水溶解RNA。使用M-MuLV Reverse Transcriptase Kit（TaKaRa）进行cDNA的合成，取植物总RNA约0.1~5μg，oligo(dT) 50 ng，10 mmol·L-1 dNTP mix 1μl，用DEPC处理水补足至10μl，混匀后，短暂离心将之收集于管底，置于65℃加热5 min，冰浴10 min，加入反应混合物9 μl（5×reaction buffer 4 μl，25 mmol·L-1 MgCl2 4μl，0.1 mol·L-1 DTT 2μl，RNA酶抑制剂1μl），将上述混合物混匀，短暂离心将之收集于管底，25℃保温2 min，加入1μlM-MuLVReverse Transcriptase，将上述混合物混匀，短暂离心将之收集于管底，25℃保温20 min，然后42℃保温70 min，合成cDNA。
TA克隆载体pMD18-T-14-3-3c的构建（图1），以野生型烟草cDNA为模板，先使用烟草18S内参检测cDNA反转录效果以确定模板的浓度，接着扩增14-3-3c基因CDS编码区，使用上述引物进行扩展，根据基因大小按1k bp/1 min的标准确定延伸时间，通过梯度PCR确定退火温度。PCR体系（20μl）：(1) 94℃，预变性5 min；(2) 94℃，30 s； (3) 55℃，45 s；(4)72℃，1 min；(5) 72℃，10 min； 从(2) ~ (4)设置31个循环；
PCR产物经胶回收和凝胶电泳后进行TA克隆，TA克隆体系（10 μl）：pMD18-TVector 0.5μl (25 ng)，Insert DNA 4.5μl (约150 ng)，Solution I 5μl，于16℃金属浴8h，采用热刺激转化法将TA克隆质粒转化DH 5α，经37℃、200 rpm/50 min培养后，室温11000rpm 离心5 min，再涂布与含AMP抗性LB培养基中，37℃培养8 h。挑取6-8个单菌落，接种到含AMP液体LB培养基中培养8 h，提取质粒经EcoR V和Sal I双酶切和PCR检测正确，提取质粒DNA送硕擎生物公司测序分析， DNAMAN软件基因序列和蛋白质序列正确后用于后续载体构建。
实施例2：14-3-3c入门克隆载体pENTR-2B-14-3-3c和植物过表达载体pK2-35S-14-3-3c的构建
将实施例1中TA克隆并测序和比对成功的pMD18-T-14-3-3c与实验室之前检验正确的pENTR-2B空载进行EcoR V和Sal I双酶并割胶回收，并将14-3-3c基因回收片段，通过连接酶亚克隆到pENTR-2B上获得入门克隆载体pENTR-14-3-3c，植物表达载体的构建通过Gateway LR reaction技术来构建植物过表达载体pK2-35S-14-3-3c，LR反应质粒需通过质粒纯化试剂盒进行纯化，转化成功后的重组载体需要通过Spe(壮观霉素)的抗性LB培养基进行筛选。构建策略如图2所示，植物表达载体会通过T-DNA插入的方式，重组整合到烟草基因组中，并表达14-3-3c基因，过表达载体pK2-35S-14-3-3c含有组成型强启动子CaMV 35S，从而获得过量表达14-3-3c基因的转基因烟草植株。
实施例3：农杆菌浸染烟草及转基因烟草的培养与筛选
使用叶盘转化法，以根癌农杆菌C58C1（pMP90）为媒介，转染烟草15~20 min，浸染成功后的烟草外植体，放置于MS1培养基（含3%蔗糖）黑暗条件下共培养48 h，再转移至MS4（含3%蔗糖、50 μg·mL-1卡那霉素和100μg·mL-1 头孢霉素）发芽培养基上分化愈伤组织并诱导出芽，25℃/24 h (100 μmol·m-2·s-1)光照培养约25 d 后，转染成功的外植体会分化出转基因小苗，剪取小苗并继代与MS（含2%蔗糖、50μg·mL-1卡那霉素和100μg·mL-1头孢霉素）琼脂糖培养基中进行传代培养一次，以抑制农杆菌生长，以后传代则可以在无抗性的生根培养基MS琼脂糖培养基中培养。
实施例4：过量表达14-3-3c转基因烟草转录水平检测
待传代培养的转基因小苗生长成熟后，分别剪取2份各0.1g 烟草叶片材料，掷于液氮中冷冻并于-80℃保存，用于RT-PCR检测采用TRI-zol法对烟草RNA进行提取，通过PCR进行检测。
在所检测的5株14-3-3c过量表达转基因烟草中（图3），kc1、kc2和kc3相较于WT烟草都出现了上调表达，其中kc1烟草的14-3-3c基因上调表达最为显著，kc3和kc2次之，最终选择kc1用于作为下一步实验的材料。
实施例5：过量表达14-3-3c转基因烟草对液体甲醛吸收能力的测定
甲醛可与Nash试剂（醋酸氨：15%，冰醋酸：0.3%，乙酰丙酮：0.2%）发生化学反应产生有颜色的物质，该物质的最大吸收波长为410 nm，因此可以制备标准曲线，根据HCHO-Nash标准曲线即可计算出反应液中甲醛的含量，利用该方法可以测定植物对甲醛的吸收速率。
使用4 mmol·L-1的甲醛溶液(含5 mmol·L-1 KHCO3、1% MES)，每个处理液加入2 g新鲜的烟草叶片，置于25℃/24 h (100μmol·m-2·s-1)光照，摇床转速100 rpm进行HCHO胁迫处理；在6、12、24、48和72 h时分别测定处理液中剩余HCHO的含量，处理完毕后分别从各实验组中取烟草叶片0.2 g，用液氮速冻后置于-80℃保存备用。
由图4可知，在0~12 h期间，WT与kc1烟草叶片对液体甲醛的吸收效率相当，24~72h期间kc1烟草叶片的甲醛吸收效率均显著好于WT，在72 h时kc1对4 mmol·L-1的液体甲醛吸收效率相较WT提高约10%。
实施例6：过量表达14-3-3c转基因烟草对液体甲醛抗性的检测
（1）叶绿素含量的测定：HCHO溶液处理烟草叶片结束后用预冷无菌蒸馏水冲洗叶片3~4次，纸巾吸干叶片表面残留的蒸馏水，95%乙醇提取叶绿素，紫外分光光度法测定665nm和649 nm处的光吸收值A665和A649，根据以下公式计算叶绿素a和b的含量。叶绿素a含量(mg·g-1) =13.95×A665–6.88×A649；叶绿素b含量(mg·g-1)=24.96×A649–7.32×A665。
由图5可知，与未用液体HCHO处理的对照（CK）相比，4 mmol·L-1HCHO处理72 h后各WT和kc1实验组烟草叶片中叶绿素a叶绿素b含量均出现了显著下降，但kc1烟草叶片中的叶绿素a含量略高于WT，叶绿素含量b则显著高于WT，为WT烟草的1.3倍。
（2）取4 mmol·L-1液体甲醛处理48 h后的叶片0.5 g用液氮速冻后充分研磨，This-HCl缓冲液（1 mol·L-1，pH 7.5）充分抽提，抽提液可用于可溶性糖以及各项氧化胁迫相关生理指标的测定及分析。丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸法测定，在0.4 mL含有0.6% TBA（硫代巴比妥酸）20% TCA（三氯乙酸）的溶液中加入0.4 mL抽提液，沸水浴15 min后即刻置于冰上冷却。(12000 rpm/10 min)，读上清液的吸光值OD532和OD450。代入公式中：MDA浓度（µmol·L-1）= 6.45∙OD532-0.56∙OD450计算 MDA浓度；过氧化氢（H2O2）含量测定采用二甲酚橙法，用ddH2O水配制试剂A（3.3 mmol·L-1 FeSO4，3.3 mmol·L-1 (NH4)2SO4，412.5mmol·L-1 H2SO4）与试剂B（165 µmol·L-1二甲酚橙，165 mmol·L-1山梨醇）。使用前将试剂A与试剂B按照1：10的比例混合后成工作试剂。此工作试剂和H2O2待测液按照2：1的比例混合后，水浴30℃显色30 min后，测定其560 nm处光吸收值OD560，参照标准曲线y=0.1734x-0.0055（x：H2O2浓度（mg/mL），y：OD560，R2=0.9995）计算H2O2含量。
由图6A可以看出，在未遭受HCHO胁迫的CK中，烟草叶片的MDA含量较低，4 mmol·L-1 液体HCHO处理48 h后WT和kc1烟草叶片中MDA的含量均有一定升高，其中WT升高为CK的1.6倍， kc1的MDA含量约为对照组1.2倍，显著低于WT烟草。
由图6B可知，在液体HCHO处理48 h后，WT和kc1烟草叶片中H2O2含量出现了不同程度的升高，WT的H2O2含量升高为CK的1.4倍，kc1则约为CK的约1.2倍，显著低于WT。
序列表
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<120> 烟草14-3-3c基因的植物表达载体及其应用
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gtcgactcta aacatggcgg tggc 24
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial）
<400> 2
gatatctcaa tttttggctt catcagg 27

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1.含有烟草14-3-3c基因的植物表达载体pK2-35S-14-3-3c在制备吸收甲醛能力增强的转基因烟草中的应用，所述烟草14-3-3c基因的GenBank登录号为U91724.1，载体含有CaMV35S强启动子。
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