CN114989276B - 与紫苏耐盐相关蛋白PfWRKY33及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公布了与紫苏耐盐相关蛋白PfWRKY33及其编码基因与应用。本发明提供一种蛋白，是如下(a)或(b)：(a)有序列表中序列2所示的氨基酸序列提供的蛋白质；(b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐盐有关的由序列2衍生的蛋白质。本发明的实验证明，本发明提供的PfWRKY33蛋白及其编码基因，将该基因导入丹参中，得到转基因丹参，研究发现转PfWRKY33基因的丹参耐盐性提高，说明该蛋白及其编码基因在提高植物耐盐性方面具有重要的应用价值。本发明将在植物领域中具有广阔的应用空间和市场前景。

Description

与紫苏耐盐相关蛋白PfWRKY33及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中与紫苏耐盐性相关蛋白PfWRKY33及其编码基因与应用。

背景技术

随着环境气候的变化，土地的不合理利用，人类对环境的破坏等因素，全球土壤盐渍化日益严重，盐胁迫已成为抑制植物生长发育的限制因素，是影响农业可持续发展的一个重要因子。当植物处于盐胁迫环境时，植物根系会吸收大量的Na⁺，在植物体内积累过量造成离子胁迫，从而降低植物的光合效率，损害植物的新陈代谢，抑制植物的生长发育。而植物在长期的生长进化过程中形成了一套自我保护机制，通过改变植物体内的生理生化环境，形成一种抗逆机制。盐胁迫环境下，植物首先通过渗透调节途径降低细胞水势，使细胞内水分向有利于细胞生长方向运输，确保植物生长。WRKY转录调控因子在植物逆境信号传递中起着重要的调控作用，能够参与调控抗逆相关基因的表达，从而提高植物的抗逆性。WRKY转录调控因子在植物组织中表达具有特异性，并且受低温、高温、干旱和病原菌等非生物胁迫诱导表达。已有研究结果表明干旱条件下水稻OsWRKY80基因在叶中的表达量显著增加；拟南芥中过量表达AtWRKY25或者AtWRKY33基因能够显著提高拟南芥的耐盐性。

发明内容

本发明的一个目的是提供与紫苏耐盐相关蛋白PfWRKY33及其编码基因与应用。

本发明提供的与紫苏耐盐相关的蛋白，名称为PfWRKY33，来源于紫苏(Perillafrutescens L.)，如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐盐性有关的由序列2衍生的蛋白质。

所述序列2由605个氨基酸残基组成。

所述编码上述蛋白的DNA分子也属于本发明的保护范围。

所述DNA分子是如下(1)-(3)中任一种的DNA分子：

(1)编码序列为序列表中序列1所示的DNA分子；

(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码植物耐盐性相关蛋白的DNA分子；

(3)与(1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码植物耐盐性相关蛋白的DNA分子。

所述序列1由1818碱基组成，其开放阅读框(ORF)为自5′末端起第1位-第1818位碱基，编码氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

含有所述与紫苏耐盐性相关蛋白的编码基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

所述重组表达载体是在载体pCambia1300-GFP的多克隆位点间插入所述编码基因得到的重组表达载体；

所述载体pCambia1300-GFP是通过包括如下步骤的方法得到的：

(1)将pCambia1300载体经过Sal I和Pst I双酶切，回收载体大片段；

(2)将GFP序列用PCR的方法扩增出来，上游引物5′端加Sal I酶切位点，下游引物5′端加Pst I酶切位点。构建到测序载体Zero Background pTOPO-Blunt Cloning Kit，经过Sal I和Pst I双酶切，回收包含GFP基因的片段；

(3)将步骤(1)中回收的载体大片段与步骤(2)中回收的包含GFP基因的片段连接，得到重组载体pCambia1300-GFP。

所述pCambia1300载体购自CAMBIA公司。

扩增所述与紫苏耐盐性相关蛋白的编码基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。

本发明所提供的培育转基因植物的方法，是将所述与耐盐性相关蛋白的编码基因导入目的植物中，得到耐盐性提高的转基因植物。

所述与紫苏耐盐性相关蛋白的编码基因是通过所述重组表达载体导入目的植物中。

所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物为丹参(Salviamiltiorrhiza Bge)。

上述耐盐性提高由增加脯氨酸含量和提高SOD活性体现。

本发明的实验证明，本发明提供了一种PfWRKY33蛋白及其编码基因，将该基因导入丹参中，得到过表达PfWRKY33基因的丹参植株，将转基因丹参植株进行扩繁培养一个月后，将转基因丹参植株进行盐胁迫处理，与对照相比，转基因丹参的耐盐性提高，具体体现在增加脯氨酸含量和提高SOD活性。因此，可以看出，PfWRKY33基因及其所编码的蛋白在植物非生物胁迫的过程中起着重要的作用。本发明所提供的PfWRKY33蛋白及其编码基因在提高植物耐盐研究中具有重要的应用价值。本发明将在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、与耐盐相关的蛋白及其编码基因的获得及功能验证

一、与耐盐相关的蛋白及其编码基因的获得

(一)紫苏(Perilla frutescens L.)PfWRKY33蛋白cDNA的克隆

实验材料：以紫苏为实验材料。

1、紫苏总RNA提取

取0.1g紫苏幼嫩叶片在液氮中研磨成粉状，加入2mL离心管，用TIANGEN的RNApreppure植物总RNA提取试剂盒(目录号：DP432)提取紫苏总RNA，试剂盒中包括：裂解液RL，去蛋白液RW1，漂洗液RW，RNase-Free ddH₂O，RNase-Free吸附柱CR3，RNase-Free过滤柱CS，DNase I，缓冲液RDD，RNase-Free离心管，RNase-Free收集管。取10μL于1.0％琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，另取2μL稀释至500μL，用紫外分光光度计检测其质量(OD260)和纯度(OD260/OD280)，提取的冀紫2号总RNA，经非变性胶琼脂糖凝胶电泳检测，28S和18S条带清晰，且二者亮度比值为1.5～2︰1，表明总RNA没有降解，所得mRNA符合实验要求，可用于紫苏PfWRKY33蛋白cDNA全长的克隆。

2、PfWRKY33蛋白cDNA的全长克隆

以本实验室构建的冀紫转录组数据进行PfWRKY33基因的引物设计，进行PfWRKY33蛋白cDNA的全长克隆。

(1)PfWRKY33蛋白cDNA的全长克隆

根据紫苏转录组数据库获得PfWRKY33基因的unigene序列，设计PfWRKY33基因的5′-端和3′-端引物进行PCR反应。引物序列如下：

引物1：5’ATGAGTGTTTTGCCGCATTTA 3’

引物2：5’TCAGTTTGCACTGACATGAACA 3’

PCR得到PfWRKY33基因ORF全长，回收后连接pTOPO-Blunt载体进行TA克隆，以M13F/M13R通用引物进行测序。

以上述提取的总RNA经QuantScript RT Kit(TIANGEN，Beijing)反转录为模板，用高保真的FastPfu酶，进行PCR扩增。琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，获得1818bp长度的扩增片段。

经过测序，该PCR产物具有序列表中序列1所示的核苷酸，该序列所示的基因命名为PfWRKY33，该基因的编码区为序列表中序列1自5’端第1-1818位核苷酸；序列表中序列1由1818个碱基组成；该基因编码的蛋白命名为PfWRKY33，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2；序列表中序列2由605个氨基酸残基组成。

二、紫苏PfWRKY33蛋白在提高植物耐盐性的应用

1、植物表达载体的构建

根据紫苏PfWRKY33蛋白cDNA的编码序列，设计扩增出完整编码序列的引物序列，正反向引物分别引入Kpn I和BamH I酶切位点，引物序列如下：

引物3：5’GGGGTACCATGAGTGTTTTGCCGCATTTA 3’(下划线部分为Kpn I酶切位点)，

引物4：5’CGGGATCCTCAGTTTGCACTGACATGAACA3’(下划线部分为BamH I酶切位点)。

以人工合成的序列表中序列2为模板，PCR扩增后，将产物连接到pTOPO-Blunt载体(购自北京艾德莱生物科技有限公司，产品目录号为CV16)上，命名为pTOPO-PfWRKY33载体，进行M13F/M13R的测序，保证紫苏PfWRKY33蛋白cDNA的阅读框及酶切位点的正确。

用Kpn I和BamH I酶切表达载体pCambia1300-GFP，回收载体大片段，同时，用KpnI和BamH I酶切载体pTOPO-PfWRKY33，回收约1.8kb中间片段，将回收的载体大片段与约1.8kb中间片段连接，得到目的质粒。将目的质粒转化大肠杆菌DH5a(购自北京全式金生物技术有限公司，产品目录号为CD201-01)，37℃培养20h，进行重组载体的PCR分析和酶切鉴定，并进行测序验证。测序结果表明，在载体pCambia1300-GFP的Kpn I和BamH I酶切位点间插入了序列表中序列2自5′端第1位-第1818位所示的序列，说明重组载体构建正确，将重组载体命名为pC1300-PfWRKY33。

所述pCambia1300-GFP载体是通过包括如下步骤的方法得到的：

(1)将pCambia1300载体(购自CAMBIA公司)经过Sal I和Pst I双酶切，回收载体大片段；

(2)将GFP序列用PCR的方法扩增出来，上游引物5′端加Sal I酶切位点，下游引物5′端加·I酶切位点。构建到测序载体Zero Background pTOPO-Blunt，经过Sal I和Pst I双酶切，回收包含GFP基因的片段；

(3)将步骤(1)中回收的载体大片段与步骤(2)中回收的包含GFP基因的片段连接，得到重组载体pCambia1300-GFP。

2、植物表达载体转化农杆菌

(1)从-80℃低温冰箱中取出200μL EHA105感受态细胞(购自北京全式金生物技术有限公司)，置冰上融化，加入1μg上述步骤1得到的植物表达载体pC1300-PfWRKY33，混匀。

(2)液氮冷冻1min，37℃温育5min。

(3)加入800μL LB液体培养基，28℃培养2-6h。

(4)取100μL菌液至LB固体培养基上(含100μg/mL利福平(Rif)、50μg/mL卡那霉素(Kan))，涂布均匀，将培养皿封口。倒置培养皿28℃培养2d。

(5)取PCR鉴定呈阳性的单菌落，接种到含有100μg/mL Rif、50μg/mL Kan的LB液体培养基中，28℃培养30h至对数生长期，取适量农杆菌用液体MS培养基稀释50倍备用，即得到导入pC1300-PfWRKY33载体的农杆菌菌液。

3、转PfWRKY33基因的丹参遗传转化及再生

用农杆菌介导的方法将PfWRKY33的cDNA的编码序列导入到丹参中。具体方法如下：

(1)取经过继代培养4-6周的丹参无菌苗叶片，在超净台中切下5×5的丹参叶盘(去掉主叶脉)，悬浮于上述步骤2制备好的EHA105/pC1300-PfWRKY33农杆菌菌液中，10分钟后将侵染后的丹参叶盘接种培养在固体培养基(1.0mg/L 6-BA、0.1mg/L NAA的MS)上，28℃黑暗共培养3天。

(2)将共培养3天后的丹参叶盘用含有500mg/L Car、1.0mg/L 6-BA、0.1mg/L NAA的MS液体培养基洗涤2次后，将丹参叶盘转至含有1.0mg/L6-BA、0.1mg/L NAA、100mg/L Kam的固体MS培养基上进行选择培养，培养条件为28℃，每天13小时、3000lx的光照。培养4-6周后将丹参不定芽转移到含有1.0mg/L 6-BA、0.1mg/L NAA、100mg/L Kam的1/2MS培养基进行不定根诱导，培养条件为为28℃，每天13小时、3000lx的光照。4-8周后行成完整的再生植株，得到拟转PfWRKY33基因的丹参植株。

(3)用CTAB法提取拟转基因丹参植株和丹参对照植株的基因组DNA。用常规方法进行PCR检测，所使用的PfWRKY33基因引物为：引物1：5’ATGAGTGTTTTGCCGCATTTA 3’，引物2：5’TCAGTTTGCACTGACATGAACA 3’。在0.2mL Eppendorf离心管中加入10×PCR buffer 2μL、4dNTP(10mol/L)1μL、引物(10μmol/L)均为1μL、模板DNA(50ng/μL)2μL、Taq DNA聚合酶1μL，加H₂O至总体积20μL。反应程序为94℃变性4min，58℃复性1min，72℃延伸2min，共35个循环。电泳检测扩增结果见图1(泳道TL1-泳道TL6为转化PfWRKY33基因的丹参拟转基因植株)，从图中可见，泳道TL1，TL2、TL3扩增出1818bp的目标条带，表明PfWRKY33基因已经整合到丹参的基因组中，并证明这些再生植株为转基因植株。将经鉴定为转基因的丹参植株扩繁，进行耐盐性鉴定及相关生理指标的测定。

4、转基因丹参耐盐性鉴定

4.1表型鉴定

将3株过表达PfWRKY33基因的丹参植株和对照丹参接种在含有100mM NaCl的培养基上(MS+IBA 0.5mg/L+NAA 0.2mg/L)进行扩繁培养4周后(图2)，如图2所示，盐胁迫下，转PfWRKY33基因丹参的生长发育状态和生根情况优于对照丹参，鉴定结果表明过量表达PfWRKY33基因能够提供丹参的耐盐性。

4.2脯氨酸含量测定

脯氨酸是植物应对盐胁迫的主要渗透调节物质，通过合成脯氨酸等有机物质来调节植物逆境下水势平衡，减少盐胁迫对植物的伤害。因此，脯氨酸可以作为植物耐盐性的生化指标。

将转基因丹参和对照继代于含有100mM NaCl的培养基上(MS+IBA 0.5mg/L+NAA0.2mg/L)进行盐胁迫培养，28℃，每天13h、3000lux光照下胁迫培养4周后，取叶片测定脯氨酸含量，实验重复3次。

1.仪器与试剂

(1)仪器

紫外分光光度计、天平、离心机、研钵、烧杯、容量瓶、试管、移液器、水浴锅、漏斗、滤纸等。

(2)试剂与配方

脯氨酸、茚三酮、冰醋酸、磷酸、磺基水杨酸、甲苯

酸性茚三酮溶液：将1.25g茚三酮溶于30mL冰醋酸和20mL 6mM磷酸中，搅拌加热(70℃)溶解，4℃冰箱保存。

3％磺基水杨酸：3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100mL。

2.实验方法

(1)标准曲线的绘制

1)在分析天平上准确称取25mg脯氨酸，倒入烧杯中，用蒸馏水溶解，然后倒入250mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每毫升含脯氨酸100μg。

2)不同脯氨酸浓度的配置：取6个50mL容量瓶，分别加入0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL脯氨酸原液，蒸馏水定容至50mL刻度，摇匀，配置后的脯氨酸浓度分别为1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL、6μg/mL。

3)分别吸取2mL不同溶度的脯氨酸标准液、2mL冰醋酸和2mL酸性茚三酮溶液，混合后沸水浴中加热30min。

4)上述混合液冷却后准确加入4mL甲苯，振荡30s静置，使色素全部转至甲苯溶液中。

5)用移液器吸取脯氨酸甲苯溶液中至比色杯中，用甲苯溶液做空白对照，在520nm波长下进行比色。

6)标准曲线的绘制：以吸光度值为纵坐标，脯氨酸含量为横坐标，绘制脯氨酸标准曲线，结果见图3。

(2)样品测定

1)脯氨酸的提取：准确称取盐胁迫出来的丹参材料各0.5g，分别置于大试管中，加入5mL3％的磺基水杨酸溶液，在沸水中提取10min，期间不断晃动，冷却后过滤于干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。

2)吸取2mL提取液于干净的试管中，加入2mL冰醋酸和2mL酸性茚三酮溶液中，沸水浴加热30min，溶液即呈红色。

3)将上述冷却后的溶液加入4mL甲苯，振荡30s后静置，取上层溶液于10mL离心管中，在3000r/min下离心5min。

4)用移液器轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯为空白对照，在风光光度计520nm波长下进行吸光值测定。

5)在脯氨酸标准曲线上计算出待测样品脯氨酸的含量，计算公式如下：

脯氨酸含量(μg/g)＝(C×V1/V2)/W

C—标准曲线C值(μg)

V1—提取液总体积(mL)

V2—测定液体积(mL)

W—样品质量(g)

表1过表达PfWRKY33基因丹参与对照的脯氨酸含量

4.3SOD活性测定

超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)是植物体内存在的一种抗氧化金属酶，能够催化超氧阴离子自由基歧化生成氧和过氧化氢，是植物逆境胁迫下的重要生理生化指标。

将转基因丹参和对照继代于含有100mM NaCl的培养基上(MS+IBA 0.5mg/L+NAA0.2mg/L)进行盐胁迫培养，28℃，每天13h、3000lux光照下胁迫培养4周后，取叶片测定脯氨酸含量，实验重复3次。

1.仪器与试剂

(1)仪器

酶标仪、天平、离心机、研钵、烧杯、容量瓶、试管、移液器。

(2)试剂与配方

磷酸、EDTA、甲硫氨酸、氯化硝基四氮唑蓝(NBT)、核黄素

50mM pH7.8的磷酸缓冲液(PBS)，含0.1m mol/l EDTA

220mM甲硫氨酸(Met)：称3.2824g甲硫氨酸，用50mM pH7.8的磷酸缓冲液定溶至100ml(

1.25mM氯化硝基四氮唑蓝(NBT)溶液：称NBT 0.102g，用50mM pH7.8的磷酸缓冲液(PBS)溶解定容至100mL

0.033mM核黄素：称2.52mg用PBS溶解定容至200mL(遮光保存)。

2.酶液制备

称取植物组织0.5g先加入2.5mL PBS，研磨匀浆后，再加入2.5ml PBS混匀，4℃下10000r/min离心15min,上清液即为粗酶液。取部分上清液经适当稀释后用于酶活性测定。

3.酶活性测定

取10mL离心管，按下表加入试剂

(4)将上述试剂混匀后，对照1至于暗处，对照2、对照3和样品一起置于4000lx日光灯下，28℃反应20min。

(5)SOD活性测定：在560nm波长下测定反应液的吸光值，以不照光的对照1作参比，对照2和对照3均值为对照，分别测定待测样品的吸光值。

SOD活性单位是以抑制NBT光化还原的50％为一个酶活性单位表示。可按下式计算SOD活性：

SOD活性(U/g)＝(ODC-ODS)×V1/ODC×0.5×FW×V2

式中SOD活性以每g鲜重酶单位表示；

ODC——对照的光吸收值；

ODS——样品管的光吸收值；

V1——样品液总体积(mL)；

FW——样品鲜重(g)；

V2——测定时样品用量(mL)。

表2过表达PfWRKY33基因丹参与对照的SOD活性测定

经4.2、4.3脯氨酸含量和SOD活性测定显示，过量表达PfWRKY33基因能够增加脯氨酸含量和提高SOD活性，从而提高丹参的耐盐性，说明PfWRKY33蛋白及其编码的基因能够调控植物的抗逆性，尤其是提高植物的耐盐性。

附图说明

图1为转基因植株的PCR检测。

图2为盐胁迫下转PfWRKY33基因的丹参植株和对照。

图3为脯氨酸标准曲线。

序列表

<110> 湖南文理学院 河北省农林科学院经济作物研究所

<120> 与紫苏耐盐相关蛋白PfWRKY33及其编码基因与应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1818

<212> DNA

<213> 紫苏(perilla frutescens crispa)

<400> 1

atgagtgttt tgccgcattt aaaaagtcgt cttgatgtca agcaagagaa aaattcctgc 60

atagtgcctg aggaagaacc aagtaattta ttgcagaaac agaattctga gaccagaaac 120

cgtacatcat ttttggacaa ggcctcccca gcagctgaac aagaacagta caagttgcat 180

cagaaacaaa gctctggtgt cacacatgtt tttcgagaaa cgcgtggaga agaaagtatt 240

tggccatgta agactgaaaa tgagaaggat tcagatatgt tgaagcaaat accaaattca 300

aatccagtca ttcctttaca atctgatcca cctcttgtat ctcatgttat ggtagaattt 360

tctaaaatct cgaaggatca gcctgctgat ttgcacttga gccagaacgc tgattttgga 420

gtgaaaacat cttcaatatg tgacggagaa agaactacta aaaagaggga gatggtggca 480

gatacttcac ttcccatgca aagtgtcaat ggggtgcctg gttcacagtc caacgaacag 540

atgctgattc agtcctctca acctggaaaa gttttggaga aattgcagcc tagacggaac 600

ccagatgctg gaggttgtag ttcccagatt gatcaagtaa tcattagatc gggtcactct 660

gaaaaaaatt ctgtcgtacc aaaagaagaa cctcaacctg ataattcaca ggctagacag 720

cgcatacatg ctataaatca tgcattacag agcaaagaag aaaaagttac tgatacgaaa 780

ggacagttag tctcgcagaa tttggttcaa gcatcaagtt tgagcattgg agtggctgta 840

cctcaacctg gtcaagacag ctactcatat gcaacaaagt tcgagaaagt ggagaaattg 900

cagcctagga gaaaccttga ccctgtagtt caagaatcac aatctgatgc tggaagcact 960

ccctcgaaag tatctgacaa aggattagat gatggctata actggaggaa atatggacag 1020

aagctggtaa aaggaaacaa atttgttcga agctattaca aatgtactta ccccagttgc 1080

caggctaaaa agcaagtaga gagatcacac gatgggtgta aatcagatat caactacctt 1140

ggggttcatc atcatcagaa accacagcag agtccccaag tgactactac ttttcaagtg 1200

agaacaccag agatgcccat tgcatctaca tcaagaacca atgctgagtt gatcactaag 1260

gatgctggtt cagatcaaca tatggcacct acagaagcct cacctcaatc aactgttgga 1320

agaagtgctg atggtttgtc agtagcagtt tcctgttcaa ataatgaaac taaggatcta 1380

gatgattgcc cagatcctaa acgacagaaa agagacgtgt gttctgcaga tgatgatgcg 1440

gtgaatagat ctaattctga ttcacggcat gttgttcaaa ctttgagtga agttgatttg 1500

gtcaatgatg gataccggtg gcgtaaatat gggcagaaat tggtaaaagg caatcctaac 1560

ccaaggagtt actacaggtg ttcaaacgca ggctgcccgg ttaagaaaca cgtcgaaaga 1620

gcttcacacg atccaaaact agtcattacg acgtatgaag gaaaacatga tcacgacatt 1680

cccacttcca ggactgtaag ccaaagcaca gctagaggtg attctaacat gatgagccca 1740

aatggtgact caagttccaa acgtgaagat aacagtcccg tttcgctaga aatggctgtt 1800

catgtcagtg caaactga 1818

<210> 2

<211> 605

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

MET Ser Val Leu Pro His Leu Lys Ser Arg Leu Asp Val Lys Gln Glu Lys Asn Ser Cys

5 10 15 20

Ile Val Pro Glu Glu Glu Pro Ser Asn Leu Leu Gln Lys Gln Asn Ser Glu Thr Arg Asn

25 30 35 40

Arg Thr Ser Phe Leu Asp Lys Ala Ser Pro Ala Ala Glu Gln Glu Gln Tyr Lys Leu His

45 50 55 60

Gln Lys Gln Ser Ser Gly Val Thr His Val Phe Arg Glu Thr Arg Gly Glu Glu Ser Ile

65 70 75 80

Trp Pro Cys Lys Thr Glu Asn Glu Lys Asp Ser Asp MET Leu Lys Gln Ile Pro Asn Ser

85 90 95 100

Asn Pro Val Ile Pro Leu Gln Ser Asp Pro Pro Leu Val Ser His Val MET Val Glu Phe

105 110 115 120

Ser Lys Ile Ser Lys Asp Gln Pro Ala Asp Leu His Leu Ser Gln Asn Ala Asp Phe Gly

125 130 135 140

Val Lys Thr Ser Ser Ile Cys Asp Gly Glu Arg Thr Thr Lys Lys Arg Glu MET Val Ala

145 150 155 160

Asp Thr Ser Leu Pro MET Gln Ser Val Asn Gly Val Pro Gly Ser Gln Ser Asn Glu Gln

165 170 175 180

MET Leu Ile Gln Ser Ser Gln Pro Gly Lys Val Leu Glu Lys Leu Gln Pro Arg Arg Asn

185 190 195 200

Pro Asp Ala Gly Gly Cys Ser Ser Gln Ile Asp Gln Val Ile Ile Arg Ser Gly His Ser

205 210 215 220

Glu Lys Asn Ser Val Val Pro Lys Glu Glu Pro Gln Pro Asp Asn Ser Gln Ala Arg Gln

225 230 235 240

Arg Ile His Ala Ile Asn His Ala Leu Gln Ser Lys Glu Glu Lys Val Thr Asp Thr Lys

245 250 255 260

Gly Gln Leu Val Ser Gln Asn Leu Val Gln Ala Ser Ser Leu Ser Ile Gly Val Ala Val

265 270 275 280

Pro Gln Pro Gly Gln Asp Ser Tyr Ser Tyr Ala Thr Lys Phe Glu Lys Val Glu Lys Leu

285 290 295 300

Gln Pro Arg Arg Asn Leu Asp Pro Val Val Gln Glu Ser Gln Ser Asp Ala Gly Ser Thr

305 310 315 320

Pro Ser Lys Val Ser Asp Lys Gly Leu Asp Asp Gly Tyr Asn Trp Arg Lys Tyr Gly Gln

325 330 335 340

Lys Leu Val Lys Gly Asn Lys Phe Val Arg Ser Tyr Tyr Lys Cys Thr Tyr Pro Ser Cys

345 350 355 360

Gln Ala Lys Lys Gln Val Glu Arg Ser His Asp Gly Cys Lys Ser Asp Ile Asn Tyr Leu

365 370 375 380

Gly Val His His His Gln Lys Pro Gln Gln Ser Pro Gln Val Thr Thr Thr Phe Gln Val

385 390 395 400

Arg Thr Pro Glu MET Pro Ile Ala Ser Thr Ser Arg Thr Asn Ala Glu Leu Ile Thr Lys

405 410 415 420

Asp Ala Gly Ser Asp Gln His MET Ala Pro Thr Glu Ala Ser Pro Gln Ser Thr Val Gly

425 430 435 440

Arg Ser Ala Asp Gly Leu Ser Val Ala Val Ser Cys Ser Asn Asn Glu Thr Lys Asp Leu

445 450 455 460

Asp Asp Cys Pro Asp Pro Lys Arg Gln Lys Arg Asp Val Cys Ser Ala Asp Asp Asp Ala

465 470 475 480

Val Asn Arg Ser Asn Ser Asp Ser Arg His Val Val Gln Thr Leu Ser Glu Val Asp Leu

485 490 495 500

Val Asn Asp Gly Tyr Arg Trp Arg Lys Tyr Gly Gln Lys Leu Val Lys Gly Asn Pro Asn

505 510 515 520

Pro Arg Ser Tyr Tyr Arg Cys Ser Asn Ala Gly Cys Pro Val Lys Lys His Val Glu Arg

525 530 535 540

Ala Ser His Asp Pro Lys Leu Val Ile Thr Thr Tyr Glu Gly Lys His Asp His Asp Ile

545 550 555 560

Pro Thr Ser Arg Thr Val Ser Gln Ser Thr Ala Arg Gly Asp Ser Asn MET MET Ser Pro

565 570 575 580

Asn Gly Asp Ser Ser Ser Lys Arg Glu Asp Asn Ser Pro Val Ser Leu Glu MET Ala Val

585 590 595 600

His Val Ser Ala Asn

605

Claims (9)

1.一种蛋白，是由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因的编码序列为序列表中序列1所示的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体、表达盒。

5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于：载体为将权利要求1所述蛋白的编码基因插入表达载体中，得到表达权利要求1所述蛋白的重组载体。

6.扩增权利要求2或3所述基因全长的引物对。

7.权利要求1所述蛋白、权利要求2或3所述基因或权利要求4所述重组载体、表达盒在调控植物耐盐性的应用；所述植物为丹参。

8.一种培育转基因植物的方法，为将权利要求1所述蛋白的编码基因导入目的植物组织，获得转基因植物，所述转基因植物耐盐性高于所述目的植物，所述目的植物为丹参。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述组织为叶片；

权利要求1所述蛋白的编码基因通过权利要求4或5所述的重组载体导入目的植物。

Images