CN115960855A - SlPRMT5基因及其蛋白在调控番茄果实成熟中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了SlPRMT5基因及其蛋白在调控番茄果实成熟中的应用。本发明的开放阅读框DNA序列如SEQ ID No.1所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明首次从番茄基因组中克隆到番茄SlPRMT5基因，并验证了其功能。利用植物转基因载体，将本发明番茄SlPRMT5基因过表达于番茄本体中，获得了番茄SlPRMT5过表达株系SlPRMT5‑OE1与SlPRMT5‑OE10。利用CRISPR/Cas9技术对SlPRMT5基因进行编辑，获得了在番茄本体内SlPRMT5基因功能缺失的突变体slprmt5。结果表明，与野生型相比，SlPRMT5基因过表达的番茄果实成熟时间提前，伴随着更高的乙烯释放速率、类胡萝卜素和番茄红素含量，而slprmt5果实的表型与之相反。可见，本发明番茄SlPRMT5基因在番茄果实成熟方面起着重要的作用，具有极大的经济作用育种应用前景和经济价值。

Description

SlPRMT5基因及其蛋白在调控番茄果实成熟中的应用

技术领域：

本发明属于生物技术领域，更具体地说，本发明涉及SlPRMT5基因及其蛋白在调控番茄果实成熟方面的应用。

背景技术：

果实成熟是园艺作物发育的重要阶段也是果实品质形成的关键时期。这个过程受到外界环境以及内部因素的影响。内部因素主要是包括转录、转录后、翻译、翻译后以及表观遗传水平等调控过程。蛋白精氨酸甲基化是真核生物中广泛存在且保守的蛋白质翻译后修饰方式之一，由蛋白精氨酸甲基转移酶(PRMTs)催化完成。动物中的研究表明，PRMTs通过催化多种RNA结合蛋白的精氨酸甲基化而参与调控细胞多种重要的生命过程。在高等植物中，PRMTs介导的生物学过程知之甚少，主要与开花、生物钟、自噬有关。迄今为止，未有蛋白精氨酸甲基化参与果实发育和成熟调控的报道。番茄重要的经济作物，因此研究番茄果实成熟衰老的机理将为研发保鲜技术以延长果实贮运期和降低采后损耗提供技术指导。

发明内容：

本发明的目的是提供一种番茄SlPRMT5基因及其蛋白在调控果实成熟过程中的应用。

本发明的第一个目的是提供番茄蛋白精氨酸甲基转移酶SlPRMT5，氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示；或如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸，但蛋白活性相同的氨基酸序列。

本发明的第二个目的是提供一种编码所述的番茄蛋白精氨酸甲基转移酶SlPRMT5的SlPRMT5基因，或所述的SlPRMT5基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；或为如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。

本发明的第三个目的是提供所述的番茄蛋白精氨酸甲基转移酶SlPRMT5或所述的SlPRMT5基因在调控番茄果实成熟、果实色素积累、果实乙烯释放或番茄遗传育种中的应用。

本发明的第四个目的是提供调控植物番茄蛋白精氨酸甲基转移酶SlPRMT5活性的物质或调控植物番茄蛋白精氨酸甲基转移酶SlPRMT5含量的物质在A1)-A5)中的应用。

A1)调控番茄果实成熟起始时间；

A2)培育果实早熟或晚熟的植物品种；

A3)制备延缓或促进果实成熟的产品；

A4)增加或减少植物果实色素含量以及乙烯释放速率等果实成熟相关指标的产品。

优选，所述的植物为双子叶植物、单子叶植物，或为茄科植物，或为番茄。

优选，所述调控植物番茄蛋白精氨酸甲基转移酶SlPRMT5活性或含量的物质为下述B1)至B9)中的任一种：

B1)编码所述番茄蛋白精氨酸甲基转移酶SlPRMT5的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、含有B2)所述表达盒的重组微生物或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；

B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；

B8)促进或抑制番茄蛋白精氨酸甲基转移酶SlPRMT5的编码基因表达的核酸分子；

B9)含有B8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。

本发明的第五个目的是提供一种提前植物果实成熟起始时间的方法，包括，促进提高受体植物中SlPRMT5基因表达水平，提高受体植物中SlPRMT5蛋白的活性，提高受体植物中SlPRMT5蛋白质的含量，得到果实成熟起始时间提前的目的植物，实现果实成熟起始时间的提前。

本发明的第六个目的是提供一种增加植物果实色素含量并促进果实乙烯释放速率的方法，包括，促进提高受体植物中SlPRMT5基因表达水平，提高受体植物中SlPRMT5蛋白的活性，提高受体植物中SlPRMT5蛋白质的含量，得到果实类胡萝卜素与番茄红素含量增加，果实乙烯释放速率加强目的植物，实现果实色素含量与乙烯释放量的增加。

优选是将SlPRMT5基因连接至pBI-GFP载体，获得pBI-SlPRMT5-GFP重组载体，将所述pBI-SlPRMT5-GFP重组载体转化入农杆菌中，通过农杆菌介导的番茄外植体转化方法获得过表达SlPRMT5基因的番茄植株。

本发明的第七个目的是提供一种延迟番茄果实成熟的方法，包括：敲除受体植物中SlPRMT5基因，抑制受体植物中SlPRMT5基因或蛋白的表达，降低受体植物中SlPRMT5蛋白活性或蛋白的含量，得到与所述受体植物相比果实成熟延迟的目的植物，实现果实的晚熟。

本发明的第八个目的是提供一种减少植物果实色素含量并促进果实乙烯释放速率的方法，包括，敲除受体植物中SlPRMT5基因，抑制受体植物中SlPRMT5基因或蛋白的表达，降低受体植物中SlPRMT5蛋白活性或蛋白的含量，得到果实类胡萝卜素与番茄红素含量减少，果实乙烯释放速率减缓目的植物，实现果实色素含量与乙烯释放量的减少；

优选是在SlPRMT5基因序列的外显子处设计sgRNA，连接至pPTG-sgRNA-Cas9-AtU6-1载体，构建pPTG-SlPRMT5重组载体，将所述pPTG-SlPRMT5重组载体转化入农杆菌中，通过农杆菌介导的番茄外植体转化方法获得敲除SlPRMT5基因的番茄植株。

更优选，CRISPR/Cas9方法中sgRNA的靶序列为AGTTTACTGGTGAGTAGCAA TGG所示。

本发明具有如下有益效果：

(1)本发明首次从番茄基因组中克隆到番茄SlPRMT5基因，所述的番茄SlPRMT5基因具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列、或编码如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

(2)本发明提供了一种植物转基因过表达载体，将本发明番茄SlPRMT5基因过表达于其番茄本体中，获得了番茄SlPRMT5基因过表达株系。

(3)本发明提供了一种利用pPTG-sgRNA-Cas9-AtU6-1基因编辑载体，获得了在番茄本体内SlPRMT5基因2bp碱基删除的SlPRMT5基因功能缺失的突变体slprmt5。

(4)本发明还提供了番茄SlPPRMT5基因在调控果实成熟时间中的应用；SlPRMT5过表达的番茄果实成熟起始时间提前SlPPRMT5基因敲除则成熟起始时间延迟。

(5)本发明还提供了番茄SlPPRMT5基因在调控果实色素含量方面的应用，SlPPRMT5基因过表达的番茄果实色素含量增加，SlPPRMT5基因敲除果实色素含量较低。

(6)本发明还提供了番茄SlPPRMT5基因在调控果实乙烯释放速率的应用，SlPPRMT5基因过表达的番茄果实乙烯释放速率增加，SlPPRMT5基因敲除乙烯释放速率降低。

本发明揭示了番茄SlPRMT5基因及其蛋白在调控番茄果实成熟起始时间、果实色素积累以及果实乙烯释放方面的功能特征，为进一步理解蛋白精氨酸甲基转移酶在番茄成熟方面的作用提供理论基础，为番茄果实新品种培育提供了潜在有价值的基因资源及重要指导意义。

附图说明：

图1为番茄SlPPRMT5基因过表达载体构建与阳性植株的鉴定，(a)过表达SlPRMT5-GFP融合蛋白载体构建示意图；(b)SlPRMT5在野生型(WT)以及过表达植株(OE-SlPRMT5-1同SlPRMT5-OE1，OE-SlPRMT5-10同SlPRMT5-OE10，)的转录水平检测；(c)SlPRMT5-GFP蛋白表达水平检测；

图2为番茄基因slprmt5突变体植株载体构建与SlPPRMT5基因功能突变植株的鉴定，(a)设计SlPRMT5基因的CRISPER/Cas9靶位点示意图；(b)野生型(WT)与第96以及第128号slprmt5株系第一条sgRNA1(红色下划线)序列比对图；(c)野生型(WT)与第96以及第128号slprmt5株系第二条sgRNA2(红色下划线)序列比对图；(d)SlPRMT5基因中所处的第二条sgRNA2发生2bp“GC”碱基删除后的蛋白序列与原始蛋白序列比对图；

图3为不同基因型番茄果实的成熟表型分析，(a)野生型、SlPRMT5过表达(SlPRMT5-OE1、SlPRMT5-OE10)以及slprmt5突变体果实成熟表型观察；(b)不同基因型果实从花全开到破色期的成熟时间；

图4为不同基因型番茄果实的色素含量分析，(a)叶绿素；(b)类胡萝卜素；(c)番茄红素，SlPRMT5-OE为过表达植株，slprmt5为敲除植株；

图5为不同基因型番茄果实乙烯释放量分析，SlPRMT5-OE为过表达植株，slprmt5为敲除植株。

具体实施方式：

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

在本发明中，英文缩略词的含义如下：

BR：破色期

CR:CRISPR的缩写，表示基因编辑

IAA：吲哚乙酸

IBA：吲哚丁酸

WT：野生型

WB：Western blot

MG：绿熟期

ZT：玉米素

2，4-D：2，4-苯氧乙酸

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清晰，结合以下实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明，实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用到的引物，均在首次出现时标明，其后所用相同引物，均以首次标明的内容相同；

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

下述实施例中所使用材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径获得。

下述实施例中所用仪器、设备等，如无特殊说明，均为本领域常规仪器、设备。

下述实施例中番茄(Solanum lycopersicum Mill.cv.Ailsa-Craig)为AV6纯系，以下简称为野生型番茄，来自本实验室。

实施例1:

SlPRMT5基因过表达载体的构建与阳性植株的鉴定

从番茄基因组中获得番茄SlPRMT5基因序列，如SEQ ID NO.1所示。以过表达载体构建引物SlPMRT5-pBI-GFP-F：GGGGACTCTAGAGGATCCATGACGCTTGGAGAAAGGCAA GGAG，SlPMRT5-pBI-GFP-R：CTGACCACCCGGGGATCCCAATCCAACCCAGTATGAGCG ACCA为引物，以番茄cDNA为模板，将带有过表达载体酶切位点序列的番茄SlPRMT5基因克隆出来，并通过同源重组的方法插入到pBI121-GFP载体中构建成pBI121-SlPRMT55-GF P重组过表达载体。将在重组过表达载体导入DH5α大肠杆菌中，并送公司测序，确定番茄SlPRMT5基因插入到pBI121-GFP载体中。pBI-SlPRMT5-GFP重组质粒构建参考文献“Jiang et al.Redox regulation ofthe NOR transcription factor is involved in the regulation of fruitripeningin tomato,Plant Physiology,2020,183(2):671-685.”中所述方法进行，只是将基因替换为SlPRMT5(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)。

将测序正确的pBI121-SlPRMT55-GFP重组过表达载体转入农杆菌GV3101中，并以番茄子叶为外植体，在无菌条件下将带有pBI121-SlPRMT55-GFP重组过表达载体的农杆菌侵染番茄子叶。侵染农杆菌后的番茄子叶首先在含有1mg/L 2,4-D的愈伤组织诱导培养基KCMS中诱导愈伤组织形成；KCMS愈伤组织诱导培养基配方为：4.4g/L MS，30g/L蔗糖，0.09mg/mL VB1，200mM AS，1mg/mL 2,4-D，0.1mg/mL KT，6.6g/L琼脂，然后在含有1mg/L ZT+0.1mg/L IAA的T21培养基中诱导愈伤组织再分化出芽，T21培养基配方为：4.4g/L MS，30g/L蔗糖，6.6g/L琼脂，200mg/mL Ti，1mg/mL ZT，0.1mg/mL IAA，1mL有机物，75mg/mL卡那霉素，最后在含有1mg/L IBA的MS固体培养基中诱导芽长出根而形成完整的植株。将转基因植株移栽至混合培养土(V泥炭土：V蛭石＝3:1)中，待转基因苗成活后即可进行过表达阳性植株的鉴定。愈伤组织和植株的培养条件是(25±1)℃、光照时间16h/8h(L/D)、光照强度1500～2000lx。

过表达植株鉴定结果如图1所示，即对所获得的植株进行如下检测：(1)RT-qPCR检测SlPRMT5转录水平。以野生型植株叶片为对照，随机选择初步确定为阳性植株的株系1号与10号的检测SlPRMT5的转录水平。由图1可知，随机抽查的待测植株1号(SlPRMT5-OE1)与10号植株(SlPRMT5-OE10)的SlPRMT5的转录水平均的高于野生型植株的3倍以上，由此可认为这些植株为超表达阳性植株。(2)为了检测SlPRMT5的蛋白表达水平，以野生型果实为参考，用变性法提取过表达植株果实的总蛋白进行WB检测，结果发现，随机选取的1与10号植株能够出现100kDa左右出现SlPRMT5-GFP蛋白特异条带，而野生型的植株则没有条带。

实施例2:

SlPRMT5基因敲除植株的构建与鉴定

将番茄SlPRMT5基因序列于网站http://crispor.tefor.net/中进行最优的sgRNA选择，选择的两条sgRNA序列(sgRNA1：AAAGTACTGCGGAGTTGAAA CGG；sgRNA2：AGTTTACTGGTGAGTAGCAA TGG)。并将该sgRNA插入到CRIPSR/CAS9基因编辑系统中(该基因编辑系统由中国科学院华南植物园刘义飞博士赠送给本专利的发明人)，获得番茄SlPRMT5基因编辑的敲除载体。具体是以质粒pHLW-sgRNA-tRNA-HF为模板，以CR-PRMT5-F和CR-PRMT5-R为引物(CR-PRMT5-F：GGTCTCTTGCAAAAGTACTGCGGAGTTGAAAGTTT CAGAGCTATGCTGGA；CR-PRMT5-R：GGTCTCTAAACTTGCTACTCACCAGTAAACTTG CACCAGCCGGGAATCGA)进行PCR扩增，回收并纯化得到两端带有BsaI酶切位点、同时含有两个靶标序列的片段，然后将上述片段与载体pPTG-sgRNA-Cas9-AtU6-1混合，使用Bs aI限制性内切酶和T4 DNA连接酶进行循环酶切连接反应，得到pPTG-SlPRMT5重组载体。载体pHLW-sgRNA-tRNA-HF和pPTG-sgRNA-Cas9-AtU6-1由中国科学院华南植物园刘义飞博士赠送给本专利的发明人。pPTG-SlPRMT5重组载体构建根据文献“Wang et al.Optimize d paired-sgRNA/Cas9 cloning and expressioncassette triggers high-efficiency multiplex geno me editing inkiwifruit.Plant Biotechnology Journal,2018(16):1424–1433.中所述方法进行，只是sgRNA替换为针对SlPRMT5基因的sgRNA。采用与重组过表达载体相似的方式，于入DH5Α大肠杆菌中并测序确定敲除载体构建是否成功，并将构建成功的基因敲除载体pPTG-SlPRMT5重组载体转入农杆菌GV3101中，用以侵染番茄子叶。借助组织培养的方法(与番茄SlPRMT5基因过表达植株构建的方法相同)获得了番茄SlPRMT5基因编辑的转基因植株。取待测植株的叶片基因组DNA，并在目标序列附近设计引物并PCR目标片段，鉴定引物序列如下方的SlPRMT5基因的鉴定引物序列。通过测序的手段检测目标片段有无编辑。结果如图2所示，通过序列比对发现第一条sgRNA1没有发生编辑，第二条sgRNA2出现了编辑。最终获得了2株碱基删除的转基因植株(slprmt5-96和slprmt5-128)，但编辑方式只有一种，为“GC”2个碱基出现了删除。对该2bp删除的基因序列翻译成蛋白序列发现：提前出现了终止密码子，蛋白翻译提前终止，而无法形成完整的SlPRMT5蛋白，说明获得了番茄SlPRMT5基因功能缺失的突变体SlPRMT5。

SlPRMT5基因的鉴定引物序列

sgRNA1-F:ATGACGCTTGGAGAAAGGCAAGG

sgRNA1-R：GTAATGTCGACAGCCTGAGTG

sgRNA2-F：GTATATCTATCTATGCTTGGC

sgRNA2-R：GGATTCTTTCCACCTAGTTCG

实施例3:

SlPRMT5对果实成熟的影响

为了探究SlPRMT5对果实成熟。将野生型、SlPRMT5过表达以及敲除植株在同一时间播种并移栽到一起，观察并记录果实成熟时间。结果如下图3所示，与野生型植株的果实相比，SlPRMT5过表达的植株果实较野生型提前2-3d成熟，而SlPRMT5敲除后果实成熟时间延迟。另外，值得注意的是，SlPRMT5敲除植株的果实在破色6-7d后仍有部分果皮不能完全转红，呈斑驳的绿色斑(白色箭头所示)且果实体积较小。

实施例4:

果实色素含量检测

以野生型番茄果实为对照，分别取绿熟期(MG)、破色期(BR)以及破色7天(BR+7d)的转基因番茄果实，在液氮中充分研磨成粉末。用天平称量0.6g粉末溶于正己烷、丙酮和乙醇，并以体积比为1：1：1的比例将它们混合制成的提取液中。37℃避光条件震荡30MIN充分提取色素。然后量取10mL的水，与上一步骤的液体充分混匀，在25℃条件下1500rpm离心10min，使果实残渣与色素充分分离，选取上层的色素溶液即可进行相关色素含量的检测。使用分光光度计(UVMINI-1240，岛津，日本)测定样品在波长为450、502、645和663NM的下的吸光值，然后按照如下的公式分别计算叶绿素、类胡萝卜素和番茄红素的含量。每个样品重复测量3次。叶绿素含量(μg g^-1FW)＝(20.2×OD₆₄₅+8.2×OD₆₆₃)×样品体积(ML)÷样品质量(G)；类胡萝卜素含量(μg g^-1FW)＝4×OD450×样品体积(ML)÷样品质量(G)；番茄红素含量(μg g^-1FW)＝3.12×OD₅₀₂×样品体积(ML)÷样品质量(G)。

结果发现如图4所示，SlPRMT5突变体(敲除植株slprmt5)果实的叶绿素含量在MG、BR及BR+7d时期均高于野生型。类胡萝卜素和番茄红素含量在破色期时开始出现明显差异，在BR+7d时期中类胡萝卜素与番茄红色素均低于于野生型。相反地，SlPRMT5过表达植株(SlPRMT5-OE)的类胡萝卜素和番茄红素则是高于野生型。可知，SlPRMT5影响番茄果实成熟过程中的叶绿素降解和类胡萝卜素以及番茄红素的合成。

实施例5:

乙烯释放速率分析

随机选择野生型、SlPRMT5过表达以及SlPRMT5突变体不同成熟时期的果实放置于180mL的密封盒中，室温放置4h后用20mL的注射器取15mL乙烯，并采用排水法将这15mL的乙烯平均转移至体积为10mL的西林瓶中，用封口膜封好倒扣放置以备用。采集完气体的果实用天平称量它们的重量并用排水法测量每个果实的体积并记录，用于换算乙烯释放速率时后用。每个处理重复3次。在乙烯检测前，需要绘制乙烯标准曲线。即：将乙烯标准品稀释成一定浓度梯度后，将不同浓度的乙烯标准品注入气相色谱仪(GC-7890A，安捷伦，美国)中进行乙烯含量检测，根据峰面积换算以获得标准曲线。吸取1mL收集到的乙烯，将该乙烯置于气相色谱中进行分析，获得相应峰图。最后以乙烯标准曲线为依据，测出样品中的乙烯含量。均一化果实的重量、体积以及闷乙烯的时间，计算得出番茄果实乙烯释放速率。

具体公式为：乙烯释放速率(μl·kg^-1·h^-1)＝(C×V×1000)/(果实重量×果实体积)。式中C:标准曲线换算得到的乙烯浓度，其计算公式为：乙烯浓度＝(检测峰面积+1.6883)/(2×1000)；V:闷气体积，其计算公式为V＝闷气盒体积-果实体积

结果如图5所示，果实的乙烯释放速率最大值是在破色期，而在破色期至红熟期之间，乙烯释放速率降低。在破色期，SlPRMT5过表达植株(SlPRMT5-OE)的果实乙烯释放速率高于野生型，而SlPRMT5突变体(敲除植株slprmt5)的乙烯释放速率低于野生型，表明SlPRMT5过表达促进了果实乙烯的释放，进而加速了果实的成熟。

SEQ ID NO.1番茄SlPRMT5开放阅读框序列

ATGACGCTTGGAGAAAGGCAAGGAGATGAGAAAAATGACTCAAAGTACTGCGGAGTTG

AAACGGAGTTCAATGATGACATGCCTCAACTTCTCTCCCTCAACATTCATGGAGGATTCG

ACTTTGTTGTCGCACCATTGATGGATCCTGCTTACAGGCCTAGTTTACTGGTGAGTAGCA

ATGGTGGATCTGGGGTTCTTCCATTCGCTGGGTCAGACTTGGTGCTAAGCCCTTCCCAAT

GGAGTAGTCATGTTGTTGGTAAAATTAGCTCATGGCTTGACTTGGATTCTGAGGATGAAA

TGTTTCGGAGGGATTCTGAGATTACTTTGAAACAAGAAATAGCCTGGGCTTCTCACCTTT

CACTGCAGGCCTGTCTTCTTCCTGCACCCAAGGGAGTGACCTGTGCTAATTATGCTAGAT

GTGTGAATCAAATTCTACAGAATCTAAGCAATATGCAGTTGTGGCTAAGAATTCCATTGG

AGAAATCTGATGATGATGAAGATAGAAGTCCTAACTCTATGGGTGAAGAACATAGAGATT

CATGGGAAATGTGGAACTCATTCCGCACTCTCGGTGAACATCACAGTCAGCTTTCAGTT

GCTCTTGATATTTTATCCTCATTACCCTCTGTGAATTCACTTGCGCGGTGGTTTGGGGAGC

CTGTTAGAGCTGCTATAATTAATTCCAATTCTTTTCTCACCAATGCCCGTGGCTACCCCTG

TTTGTCAAAACGACACCAAAATCTATTGACGGATTTTTTCAATCACTCAATTCAGATAGT

CATCTCTGGACAGCAAATGCAGAATTTCCCCACGGGAACTTCAGTGTCAAATTCTCACA

GTAGTAATAATCAAAGTGAGGGTGTTGAGGGCATGCAGCGACATCCGCTAAGGTCATAC

CTGGACTACATTGCTTATTTATACCAGAAGATGGATCCACTTCCTGAACAAGAACGCTTT

GAGCTTGGTTATAGGGATTACTTACAGTCTCCCTTACAGCCTCTCATGGACAATTTGGAG

GCCCAAACTTATGAAACATTTGAGAAAGATACGACCAAGTACATACAGTATCAAAGAGC

AGTTGCGAAAGCTTTAGTGGACAGGGTTCCAGATGAAAAGGCATCTACAATCACTACTG

TCTTGATGGTTGTTGGGGCTGGACGTGGGCCTCTTGTCAGAGCTTCATTGCAGGCTGCT

GAAGAGACTGGACGCAAGTTGAAAGTTTATGCTGTCGAGAAAAATCCAAATGCAATCGT

CACCCTACATAGCTTACTAAAGATTGAGGGCTGGGAAAAACTTGTCACCATAGTTTCAA

GTGACATGCGCTGCTGGGATGCTCCTGAGAAAGCTGATATTTTGGTTAGTGAATTGCTTG

GGTCATTTGGAGACAATGAGCTGTCACCTGAGTGTCTTGATGGTGCTCAAAGATTCCTG

AAAGAAGACGGAATTTCAATTCCATCATCGTATACAAGTTTTTTCCAGCCTGTGACTGCT

TCCAAATTATACAATGATATCAAATCTCACAAAGATCTTGTGCACTTCGAAACTGCTTATG

TTGTCAAGTTCCACCGTGTAGCAAGGCTTACTTCTCCTCAACCAGTCTTTACATTCAATC

ATCCGGAGGACTCAAATAGGAAAAGCAATCACCGGTATACAAAGCTACGATTTGAGATA

CCCACTGACACTGGATCAGCCCTGGTTCATGGTTTTGCTGGTTATTTTGATGCTGTACTTT

ACAAAGATGTTCATCTTGGTATTGAACCATCAACAGCAACACCTAACATGTTCAGCTGGT

TCCCTATATTTTTCCCATTGCGAACACCTATGTGTGTTCAACCGGGTATTCCTCTAGAAGT

TCATATTTGGCGTTGTTGTGGTATTTCAAAGGTTTGGTACGAGTGGGGCGTGACTTCTCC

CAGCTCATCTCCTATACACAACTGCAATGGTCGCTCATACTGGGTTGGATTGTAASEQ ID NO.2番茄SlPRMT5氨基酸序列

MTLGERQGDEKNDSKYCGVETEFNDDMPQLLSLNIHGGFDFVVAPLMDPAYRPSLLVSS

NGGSGVLPFAGSDLVLSPSQWSSHVVGKISSWLDLDSEDEMFRRDSEITLKQEIAWASHLSL

QACLLPAPKGVTCANYARCVNQILQNLSNMQLWLRIPLEKSDDDEDRSPNSMGEEHRDSW

EMWNSFRTLGEHHSQLSVALDILSSLPSVNSLARWFGEPVRAAIINSNSFLTNARGYPCLSK

RHQNLLTDFFNHSIQIVISGQQMQNFPTGTSVSNSHSSNNQSEGVEGMQRHPLRSYLDYIAY

LYQKMDPLPEQERFELGYRDYLQSPLQPLMDNLEAQTYETFEKDTTKYIQYQRAVAKALV

DRVPDEKASTITTVLMVVGAGRGPLVRASLQAAEETGRKLKVYAVEKNPNAIVTLHSLLKI

EGWEKLVTIVSSDMRCWDAPEKADILVSELLGSFGDNELSPECLDGAQRFLKEDGISIPSSY

TSFFQPVTASKLYNDIKSHKDLVHFETAYVVKFHRVARLTSPQPVFTFNHPEDSNRKSNHRY

TKLRFEIPTDTGSALVHGFAGYFDAVLYKDVHLGIEPSTATPNMFSWFPIFFPLRTPMCVQPGI

PLEVHIWRCCGISKVWYEWGVTSPSSSPIHNCNGRSYWVGL

Claims (10)

1.番茄蛋白精氨酸甲基转移酶SlPRMT5，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；或如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸，但蛋白活性相同的氨基酸序列。

2.一种编码权利要求1所述的番茄蛋白精氨酸甲基转移酶SlPRMT5的SlPRMT5基因，或所述的SlPRMT5基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；或为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。

3.权利要求1所述的番茄蛋白精氨酸甲基转移酶SlPRMT5或权利要求2所述的SlPRMT5基因在调控番茄果实成熟、果实色素积累、果实乙烯释放或番茄遗传育种中的应用。

4.调控植物番茄蛋白精氨酸甲基转移酶SlPRMT5活性的物质或调控植物番茄蛋白精氨酸甲基转移酶SlPRMT5含量的物质在A1)-A5)中的应用。

A1)调控番茄果实成熟起始时间；

A2)培育果实早熟或晚熟的植物品种；

A3)制备延缓或促进果实成熟的产品；

A4)增加或减少植物果实色素含量以及乙烯释放速率等果实成熟相关指标的产品。

5.根据权利要求4中所述的应用，其特征在于，所述的植物为双子叶植物、单子叶植物，或为茄科植物，或为番茄。

6.根据权利要求4或5中所述的应用，其特征在于，所述调控植物番茄蛋白精氨酸甲基转移酶SlPRMT5活性或含量的物质为下述B1)至B9)中的任一种：

B1)编码所述番茄蛋白精氨酸甲基转移酶SlPRMT5的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、含有B2)所述表达盒的重组微生物或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；

B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；

B8)促进或抑制番茄蛋白精氨酸甲基转移酶SlPRMT5的编码基因表达的核酸分子；

B9)含有B8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。

7.一种提前植物果实成熟起始时间的方法或增加植物果实色素含量并促进果实乙烯释放速率的方法，其特征在于，包括，促进提高受体植物中权利要求2所述的SlPRMT5基因表达水平、提高受体植物中权利要求1所述的番茄蛋白精氨酸甲基转移酶SlPRMT5的活性或提高受体植物中番茄蛋白精氨酸甲基转移酶SlPRMT5的含量，得到果实成熟起始时间提前的目的植物，实现果实成熟起始时间的提前或增加植物果实色素含量和增加果实乙烯释放速率。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，包括：将SlPRMT5基因连接至pBI121-GFP载体，获得pBI-SlPRMT5-GFP重组载体，将所述pBI-SlPRMT5-GFP重组载体转化入农杆菌中，通过农杆菌介导的番茄外植体转化方法获得过表达SlPRMT5基因的番茄植株。

9.一种延迟番茄果实成熟的方法或减少植物果实色素含量并减少果实乙烯释放速率的方法，其特征在于，包括：敲除受体植物中SlPRMT5基因、抑制受体植物中权利要求2所述的SlPRMT5基因或其编码蛋白的表达或降低受体植物中权利要求1所述的番茄蛋白精氨酸甲基转移酶SlPRMT5的活性或蛋白的含量，得到与所述受体植物相比果实成熟延迟的目的植物，实现果实的晚熟或减少植物果实色素含量和减少果实乙烯释放速率。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，在SlPRMT5基因序列的外显子处设计sgRNA，连接至pPTG-sgRNA-Cas9-AtU6-1载体，构建pPTG-SlPRMT5重组载体，将所述pPTG-SlPRMT5重组载体转化入农杆菌中，通过农杆菌介导的番茄外植体转化方法获得敲除SlPRMT5基因的番茄植株，优选，所述的sgRNA的靶序列如SEQ ID No.4所示。

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