CN112375764B - 一种果实低酸调控基因MdMYB44及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种苹果果实低酸调控基因MdMYB44及其应用，通过QTL定位获得与苹果果实酸度性状相关的候选基因MdMYB44，克隆了该基因的完整编码区段，构建了超量表达载体和干扰载体，并利用转基因技术，验证了该基因的功能，揭示了该基因在果实苹果酸积累中的调控模式，有利于果实酸度调控的定向选择育种。同时鉴于苹果的童期长、遗传背景复杂等特点，该发明将会提高苹果育种效率，缩短育种年限，实现定向育种，利用其功能最终发现应用MdMYB4基因在苹果愈伤组织、果实和根中超量表达后其苹果酸含量显著下降，调控低酸。

Description

一种果实低酸调控基因MdMYB44及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种果实低酸调控基因MdMYB44及 其应用。
背景技术
苹果(Malus domestica Borkh.)营养丰富，经济价值高，是世界上重要的经 济作物之一，加强苹果新品种的选育与示范推广，利用转基因及分子生物学手段 对苹果品质性状进行遗传改良，满足不同地区、不同市场、不同人群对苹果的各 种需求，强化苹果产业的全球化发展，是苹果育种未来发展的必然趋势，苹果因 其遗传背景复杂、童期长和自交不亲和等特点严重制约了苹果遗传育种及新品种 的选育。因此通过生物技术手段，将苹果各性状相关基因转入苹果基因组中，有 利于定向选择育种，缩短育种年限。
苹果酸为苹果果实中的主要有机酸，占总酸含量的90％以上。有机酸参与了 果实自身各个代谢过程，是影响果实风味品质和加工品质的重要因素之一，对鲜 食品质、果汁加工品质、市场消费等具有重要的影响。因此，揭示苹果果实中的 有机酸的调控机制对提高和改善果实品质具有重要的意义。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷，发明通过QTL定位获得与苹果果实酸度性状相 关的候选基因MdMYB44，并利用转基因技术，将MdMYB44基因的超量表达载 体和干扰载体转入植株中，用于调控酸含量。
本发明提供了一种果实低酸调控基因MdMYB44，所述MdMYB44基因的核 苷酸序列如SEQIDNO.1所示。
进一步的，所述MdMYB44基因的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。
本发明还公开了一种调控基因MdMYB44通过克隆后，构建MdMYB44的 过表达和干扰载体，以苹果愈伤组织和果实为材料进行遗传转化，获得转基因低 酸性状苹果的应用。
本发明还公布了一种调控基因MdMYB44通过克隆后，构建MdMYB44过 表达载体转化番茄和异源过表达转化番茄获得转基因低酸性状番茄的应用。
进一步的，克隆所述基因MdMYB44的正向引物为： ATGGCTTCCACAAAGAAGGTG，反向引物为： CTACTCGATTCTACTAATCCCG。
进一步的，所述基因MdMYB44通过BSA-seq方法对苹果果实酸度性状进 行QTL定位获得，具体过程为：选择具有极端表型差异的亲本构建分离群体， 构建高酸和低酸的表型DNA混合池，进行测序分析获得。
进一步的，所述MdMYB44过表达载体构建的具体步骤为：
(1)目的片段的获得，根据基因的序列设计特异引物，并在引物两端加入 酶切位点，以克隆载体为模板，进行PCR扩增反应，获得带有酶切位点的 MdMYB44编码区扩增产物，即目的片段；
(2)目的片段的回收，将步骤(1)中带酶切位点的MdMYB44基因PCR 产物片段和载体pMDC83酶切，并分别回收酶切产物，然后将回收的MdMYB44 基因PCR产物片段和载体pMDC83进行连接；
(3)将步骤(1)中的目的片段连接到过表达载体PMDC83；
(4)将步骤(3)的连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，菌落PCR 鉴定阳性重组子；
(5)将步骤(4)构建好的表达载体转化农杆菌感受态EHA105，获得的工 程菌EHA105/PMDC83-MdMYB44用于转化苹果愈伤组织。
进一步的，所述步骤(1)中的克隆载体为pEASY-blunt，酶切位点为Pac1 和Asc1。
进一步的，将所述过表达载体和干扰载体转化苹果愈伤组织和注射苹果果 实，表明MdMYB44基因在过表达MdMYB44的转基因愈伤和瞬转果实中的苹 果酸含量显著低于转化空载体pMDC83。
进一步的，所述基因MdMYB44通过负向调控Ma1、Ma10、MdVHA-A3、 MdVHA-D2的启动子活性来抑制苹果酸的转运，产生低酸性状。
与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：1、通过QTL定位获得与苹 果果实酸度性状相关的候选基因MdMYB44，克隆了该基因的完整编码区段，构 建了超量表达载体和干扰载体，并利用转基因技术，验证了该基因的功能；2、 本发明首次通过植物基因工程技术改变果实酸含量，发现应用MdMYB4基因在 苹果愈伤组织、果实和根中超量表达后其苹果酸含量显著下降，揭示了该基因在 果实苹果酸积累中的调控模式，有利于果实酸度调控的定向选择育种。
附图说明
图1为应用BSA-seq方法鉴定筛选候选基因MdMYB44的QTL定位图
图2为MdMYB44氨基酸序列核心结构域分析图。
图3A为MdMYB44转化苹果愈伤组织组织对比实验图。
图3B为MdMYB44基因在转基因愈伤中的表达量。
图3C为转基因愈伤中的苹果酸含量。
图4A为瞬时转化苹果‘Granny Smith’对比实验图。
图4B为MdMYB44基因在瞬转苹果‘Granny Smith’中的表达量。
图4C为瞬转苹果‘Granny Smith’中的苹果酸含量。
图5A为瞬时转化苹果‘RedFuji’的对比实验图。
图5B为MdMYB44基因在瞬转苹果‘RedFuji’中的表达量。
图5C为瞬转苹果‘RedFuji’中的苹果酸含量。
图6A为MdMYB44异源转化番茄的转基因番茄的对比实验图。
图6B为MdMYB44基因在转基因番茄果实中的表达量。
图6C为转基因番茄果实中的苹果酸含量。
图7A为BCECF荧光探针检测转基因愈伤原生质体在488nm和458nm处 的共聚焦显微图。
图7B为BCECF测定转基因愈伤的液泡pH值的柱形图。
图8A为MdMYB44-OVX转基因愈伤的RNA-seq分析和表达验证。A：转 基因愈伤的RNA-seq分析。
图8B为基于COG分析的差异基因功能注释。
图8C为Ma1、Ma10、MdVHA-A3和MdVHA-D2等基因在转基因愈伤中的 表达量。
图8D为Ma1、Ma10、MdVHA-A3和MdVHA-D2等基因在瞬时转化苹果果 实‘GrannySmith’中的表达量。
图8E为Ma1、Ma10、MdVHA-A3和MdVHA-D2等基因在瞬时转化苹果果 实‘RedFuji’中的表达量。
图9A为Y1H体外验证MdMYB44与Ma1、Ma10、MdVHA-A3和MdVHA-D2 的启动子互作。
图9B为ChIP-PCR体内验证MdMYB44与Ma1、Ma10、MdVHA-A3、 MdVHA-D2的启动子片段互作。
图9C为LUC荧光素酶系统体内验证MdMYB44抑制Ma1、Ma10、 MdVHA-A3、MdVHA-D2的启动子活性。
图10为MdMYB44基因功能模式图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的 实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无 特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均 设置三次重复实验，结果取平均值。苹果果肉的主要有机酸是苹果酸，通常情况 下，苹果果肉中，苹果酸占有机酸含量的90％(质量百分含量)以上。
实施例1、MdMYB44候选基因的鉴定
通过高效液相色谱(HPLC)确定作图群体的成熟苹果果肉中苹果酸的含量， 依据该苹果酸含量数据并应用BSA-seq方法进行QTL定位，成功将酸性状定位 于第8号染色体12.4-12.8Mbp区间，通过重测序SNP标记数据辅助，根据苹果 参考基因组基因功能注释和基因在果实中的表达情况，结合基因功能，确定 MdMYB44为候选基因(图1)，具体方法为：
一、测定果实苹果酸的含量，取极端高酸和极端低酸植株进行BSA-seq测 序分析
1、果实有机酸的提取采用水提法，步骤如下：
(1)称取5g果肉样品，加入10ml双蒸水，研磨成匀浆。
(2)研磨好的果浆75℃水浴30min后，12000rpm离心10min。
(3)将上清液转移至25ml容量瓶中，加入8ml双蒸水悬浮沉淀，75℃水 浴30min。
(4)12000rpm离心10min，合并上清液于25ml容量瓶，用双蒸水定容。
取提取液，用0.45um滤膜过滤，用HPLC法测定苹果酸含量。
2、果实苹果酸含量的测定
采用高效液相色谱法(HPLC)，有机酸检测使用Waters 600色谱仪和Waters 2487紫外灯检测仪，检测波长为210nm，色谱柱采用反向的C18柱，规格为4.6 mm*250mm。流动相为0.01M的K2HPO4.3H2O溶液(PH＝2.6)。流速为0.6 mL/min，柱温28-30℃。
具体的检测步骤为：取上述步骤(4)中的滤液，采用Waters 600色谱仪和 Waters2487紫外灯检测仪检测苹果酸含量。
(1)色谱柱采用反向的C18柱，规格为4.6mm×150mm。
(2)流动相为0.01M的K2HPO4水溶液，用磷酸调pH值至2.6。
(3)柱温为30℃。流动相流速为0.5ml/min。
(4)苹果酸标准品：DL-Malicacid(240176-50G,Sigma-ALDRICH,USA)。
(5)苹果酸标准品的出峰位置为：保留时间6.5-7.0min。
(6)标准曲线方程为：y＝2132881.2915x-10004.2136；R2＝0.9988；X 代表浓度(mg/mL)、Y代表峰面积；苹果酸含量的单位为mg/g。
二、BSA-seq对苹果果实酸度进行QTL定位，鉴定与果实酸度相关的基因 MdMYB44
混合分组分析法(Bulked Segregation Analysis，BSA)，是一种通过分子标 记短时间内迅速检测到与控制目标性状基因紧密连锁的有效方式，在农艺作物中 用于数量性状定位的研究。BSA-seq，又称QTL-seq，是对高通量测序第二代测 序技术(nextgeneration sequencing，NGS)和BSA的综合利用来进行基因定位， 其过程为：选择具有极端表型差异的亲本构建分离群体，构建两个极端表型 DNA混合池，进行测序分析。
BSA-seq方法是通过对某一性状的两个极端分离群体(如高酸与低酸)DNA 池进行高深度测序，分析两池全基因组范围内等位基因型频率差异以确定是有 QTL存在，本发明通过对当前已有BSA-seq算法如SNP index、欧氏距离等进行 综合比较与改良后，将G值作为单个位点的基因型频率差异计算结果，为消除 背景干扰，进行全基因组滑窗分析，用G’值表示每一次滑窗内各位点G值的 平均值，以G’值大小作为苹果最适判断标准，G’值越大，染色体上该位置处 存在QTL的可能性就越大，不同性状、不同亲本所对应G’阈值不同。
取‘红玉’ב金冠’F1杂交后代个体连续三年或以上苹果酸含量比较稳 定的极端高酸个体和极端低酸个体。筛选出‘红玉’ב金冠’F1群体中极端 高酸(苹果酸含量>8mg/g)个体39株和极端低酸(苹果酸含量<4mg/g)个体 37株。分别进行DNA提取、浓度和质量检测、等量混合单株DNA(极端高酸 和极端低酸分别混合)，每个杂交群体分别构建两个极端混合池(极端高酸混合 池和极端低酸混合池)，DNA混合池测序由北京百迈客生物技术有限公司完成。 测序使用Illumina X10进行，测序深度大于30×。运用软件Burrows-WheelerAlignment software对测序reads数据进行分析。应用软件SAMtools software进 行测序深度分析。G’值估算2个极端混池中的碱基比例分布。
鉴定与果实酸度相关的基因为MdMYB44，所述基因MdMYB44的核苷酸序 列如SEQIDNO.1所示，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。MdMYB44基因ORF 全长为960bp，编码320个氨基酸，是典型的R2R3-MYB转录因子，属于第22 亚家族，含有1个与bHLH转录因子结合区域，并存在一个转录抑制区域：LxLxL 基序(图2)。
实施例2、苹果果实低酸调控基因MdMYB44的克隆
一、MdMYB44基因的克隆方法
1、苹果果实总RNA提取回复：克隆的基因片段在实施例1中已经有说明
(1)在2×CTAB提取液中加入2％的β-巯基乙醇，于65℃预热；
(2)在碾磨成粉末的苹果果肉样品中迅速加入预热好的CTAB提取液，涡 旋振荡混匀1～2min，65℃水浴20-30min，期间振荡摇匀2-3次；
(3)加入等体积CI(氯仿：异戊醇＝24：1)，振荡摇匀3-5min；
(4)4℃条件下12000rpm离心15-20min，取上清液，加入等体积CI， 振荡摇匀3-5min；
(5)4℃条件下12000rpm离心15-20min，取上清液，加入1/3体积的 10M LiCl混匀，于4℃沉淀10-16h；
(6)4℃条件下12000rpm离心20-30min，弃上清，沉淀用75％的乙醇 充分洗涤；后4℃条件下12000rpm离心3-5min，弃上清，沉淀用75％的乙 醇重复洗涤一次；
(7)去上清液，瞬时离心，用移液枪轻轻吸干液体，通风橱中吹干5-10min， 使乙醇完全挥发掉；用42uLDEPC水溶解RNA沉淀，-70℃保存。
2、RNA纯化(去除RNA中的DNA)
(1)在离心管中加入：
Figure BDA0002763348370000061
Figure BDA0002763348370000071
(2)在37℃条件下消化0.5-1h；
(3)加入550μl DEPC水，轻轻混匀，再加入600ul CI，振荡摇匀3-5min；
(4)4℃条件下12000rpm离心15-20min，取上清液，加入2倍体积无 水乙醇，-70℃沉淀30min-1h；
(5)4℃条件下12000rpm离心20-30min，弃上清，沉淀用75％的乙醇 洗涤，重复1次；
(6)去上清液，瞬时离心，用移液枪轻轻吸干液体，通风橱中吹干5-10min， 使管壁上残留的乙醇完全挥发掉；用适量无RNase的DEPC水溶解RNA沉淀， -70℃超低温冰箱保存备用。
3、cDNA第一链的合成
(1)在0.2mL离心管中加入以下试剂
RNA 2μg
Oligo dT 5μL
DEPC水补充至总体积 30μL
(2)70℃，10min，再冰上放置2min；
(3)再在离心管中依次加入以下试剂：
MV-MLV Transcriptase 2μL
10×MV-MLV Transcriptase Buffer 5μL
dNTP(10μM) 2.5μL
RNase Inhibitor 1μL
DEPC水补充至总体积 50μL
于42℃条件下1h，85℃5min，后放在冰上终止第一链合成，获得cDNA。
4、cDNA的验证
用内参基因EF-1α通过PCR扩增来验证cDNA的完整性。EF-1α引物F：ATTCAAGTATGCCTGGGTGC
EF-1α引物R：CAGTCAGCCTGTGATGTTCC
(1)PCR混液体系如下：
Figure BDA0002763348370000072
Figure BDA0002763348370000081
(2)混匀后顺离，在PCR仪中进行以下反应：
Figure BDA0002763348370000082
(3)用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。
5.实时荧光定量PCR(qPCR)定量检测基因表达
用Primer 5.0设计基因荧光定量引物。反应体系如下：表格中的所述引物为MdMYB44的定量检测引物
MdMYB44定量引物F：ATCGCTCAGCCTTTCCCTTC
MdMYB44定量引物R：TCTCGCTGTTCTGGTTGCTC
SYBR Premix Ex Taq 10μL
ROX Reference Dye Π 0.4μL
MdMYB44定量引物F 0.4μlL
MdMYB44定量引物R 0.4μL
cDNA 2.0μL
ddH<sub>2</sub>O 6.8μL
总体积 20μL
EF-1a做对照基因，测定仪器为ABI7500定量PCR仪(ABI 7500Real-Time PCRSystem，ABI，USA)。定量引物如上文所述，每个样品进行三次重复。
6、克隆基因
PCR反应体系如下表：下表中的引物为克隆MdMYB44编码区(ORF)全长 的引物
MdMYB44克隆引物F：ATGGCTTCCACAAAGAAGGTG
MdMYB44克隆引物R：CTACTCGATTCTACTAATCCCG
KOD-FX高保真酶 1μL
2×KOD-buffer 25μL
dNTP(2mM) 10μL
MdMYB44克隆引物F(10μM) 1.5μL
MdMYB44克隆引物R(10μM) 1.5μL
模版 2μL
ddH<sub>2</sub>O补充至总体积 50μL
将PCR反应体系于PCR扩增仪(Bio-Rad)中开始PCR反应。反应结束之 后，用1.0％-2.0％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增的条带是否为目的条带。然后将正 确的条带进行切胶回收。
7、PCR扩增产物的回收纯化
PCR产物的纯化用胶回收纯化试剂盒(北京全式金生物有限公司)，具体 操作步骤如下：
(1)将切下的含有目的条带的胶块用3倍体积的溶胶缓冲液溶解；
(2)将溶解完全并冷却后的溶胶液转移至离心吸附柱中，离心弃废液；
(4)加入650-700μL的WB漂洗液，离心弃废液，重复一次；
(5)空柱离心1-2min，去漂洗液；
(7)在离心吸附柱上加入适量(30-50μL)洗脱缓冲液EB；
(8)离心弃吸附柱，获得PCR纯化产物。
8、目的片度连接反应
将目的基因连接到克隆载体pEASY-blunt上，反应体系如下：
胶回收产物 4μL
pEASY-blunt 1μL
总体积 5μL
混匀后，25℃条件下连接10-30min。具体连接时间按照全式金公司说明书 操作。将连接产物转化入大肠杆菌感受态DH5a，并涂布于相应的抗性筛选培养 基上，于37℃恒温培养箱中倒置培养12-16h。挑取菌落PCR鉴定为阳性的单克 隆，来进行测序。各种序列测序分析由上海生工生物技术服务有限公司完成。
实施例3、苹果果实低酸调控基因MdMYB44的应用
MdMYB44基因序列分析，MdMYB44基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所 示，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。MdMYB44基因ORF全长为960bp，编码 320个氨基酸，是典型的R2R3-MYB转录因子，属于第22亚家族，含有1个与 bHLH转录因子结合区域，并存在一个转录抑制区域：LxLxL基序(图2)。
一、MdMYB44基因过表达载体和干扰载体的构建
1.MdMYB44过表达载体构建
(1)目的片段的获得
根据MdMYB44基因的序列设计特异引物，并在引物两端加入合适的酶切 位点(MdMYB44-ORF-F-Pac1：CCTTAATTAAATGGCTTCCACAAAGAAGGTG；
MdMYB44-ORF-R-Asc1：TTGGCGCGCCACTCGATTCTACTAATCCCG) 以已经构建的克隆载体pEASY-MdMYB44为模板(实施例2中8部分)，进行 PCR扩增反应，获得带有酶切位点Pac1和Asc1的MdMYB44编码区扩增产物。
(2)目的片段的回收
将步骤(1)中带酶切位点的MdMYB44基因PCR产物片段和载体pMDC83 用Pac1和Asc1酶切，并分别回收酶切产物，然后将回收的MdMYB44基因PCR 产物片段和载体pMDC83进行连接，并转化大肠杆菌感受态细胞。
(3)将步骤(1)中的目的片段连接到过表达载体PMDC83
反应体系如下：
T4 DNA Ligase 1μL
10xT4 Buffer 1μL
载体 2μL
目的片段 6μL
总体积 10μL
16℃反应过夜(16-24h)。
(4)将步骤(3)的连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，菌落PCR 鉴定阳性重组子。
(5)将步骤(4)构建好的表达载体转化农杆菌感受态EHA105，获得工程 菌EHA105/EHA105/PMDC83-MdMYB44，用于转化苹果愈伤组织。
2.MdMYB44干扰载体构建
所用干扰载体为：pFGC5941，正向片段(219bp)，反向片段(219bp)。选 取的酶切位点为：AscI/NcoI和XbaI/PacI。将构建好的载体转话入大肠杆菌 DH5α感受态，提阳性克隆菌体的质粒，转化农杆菌EHA105，获得工程菌 EHA105/pFGC5941-RNAiMdMYB44，用于转化苹果愈伤组织。
二、MdMYB44基因的遗传转化功能验证
过表达和干扰载体转化苹果愈伤组织和注射苹果果实：构建MdMYB44的 过表达和干扰载体，以苹果愈伤组织和果实为材料进行遗传转化。愈伤组织的培 养条件为：25℃的黑暗培养，培养基为MS基本培养基加入1.0mg L-1 2,4-D和 1.0mg L-1 6-BA，每2-3周继代一次。注射苹果果实时，取成熟前一个月的苹果 果实(‘红富士’和‘澳洲青苹’)，农杆菌抽真空注射苹果果实，并于注射后 8d取样；将构建的过表达载体35S:MYB44和RNAi干扰载体RNAi:MYB44转 化苹果愈伤组织(图3A)和注射苹果果实‘Granny Smith’(图4A)和‘RedFuji’(图5A)。
结果表明：MdMYB44基因在过表达MdMYB44(MYB44-OVX1,2,3)的 转基因愈伤(图3B)和瞬转果实‘Granny Smith’(图4B)和‘Red Fuji’ (图5B)中的表达量显著高于对照P83(转化空载体pMDC83，P83-1,2,3)， 而在干扰MdMYB44(MYB44-RNAi1,2,3)的转基因愈伤和瞬转果实中的表达 量低于对照P5941(转化空载体pFGC5941，P5941-1,2,3)。过表达35S:MYB44 的转基因愈伤(图3C)和瞬转果实‘Granny Smith’(图4C)和‘Red Fuji’ (图5C)中的苹果酸含量显著低于对照P83，而干扰RNAi:MYB44的转基因 愈伤和瞬转果实中的苹果酸含量高于对照P5941。以上结果说明MdMYB44负向 调控苹果酸的积累，与低酸紧密关联。
将过表达载体35S:MYB44转化番茄，在番茄中异源过表达MdMYB44(图 6A)。结果表明：MdMYB44基因在过表达MdMYB44(MYB44-OVX1,2,3) 的转基因番茄中的表达量显著高于对照P83(图6B)。过表达35S:MYB44的转 基因番茄中的苹果酸含量显著低于对照P83(图6C)。以上结果说明MdMYB44 负向调控苹果酸的积累，与低酸紧密关联。
用2',7'-二-(2-羧乙基)-5(6)-羧基荧光素(BCECF)测定转基因愈伤的液泡pH值。35S:MYB44转基因愈伤的pH值为6.46，显著低于对照空载体P83转基因 愈伤(5.13)；RNAi:MYB44转基因愈伤的pH值为4.59，显著高于对照空载体 P5941转基因愈伤(5.15)(图7A和图7B)。高pH值代表低H+浓度，说明 MdMYB44与低酸紧密关联，调控低酸。
三、MdMYB44基因调控低酸性状的通路解析
通过对过表达MdMYB44的转基因愈伤进行RNA-seq分析(图8A、8B)， 筛选到4个在MYB44-OVX和P83转基因愈伤中显著差异表达的苹果酸转运蛋 白基因：Ma1、Ma10、MdVHA-A3和MdVHA-D2。qRT-PCR验证在过表达 MYB44-OVX的转基因愈伤和瞬转果实中Ma1、Ma10、MdVHA-A3和 MdVHA-D2的表达量极显著下降，而在干扰RNAi:MYB44的转基因愈伤和瞬转 果实中的表达量显著上升(图8C、8D、8E)。说明MdMYB44可能通过抑制 Ma1、Ma10、MdVHA-A3和MdVHA-D2基因的表达负向调控苹果酸的积累。
四、MdMYB44与Ma1、Ma10、MdVHA-A3和MdVHA-D2等启动子的互 作验证。
PlantCARE预测Ma1、Ma10、MdVHA-A3和MdVHA-D2基因启动子区含 有MYB44的核心结合元件MYB-CORE：CNGTTR。通过酵母单杂交(Y1H) 实验体外验证MdMYB44与苹果酸转运蛋白基因Ma1、Ma10、MdVHA-A3和 MdVHA-D2的启动子互作(图9A)；通过ChIP-PCR体内验证MdMYB44与 Ma1、Ma10、MdVHA-A3、MdVHA-D2的启动子片段互作(图9B)；LUC荧 光素酶系统(图9C)体内验证MdMYB44抑制Ma1、Ma10、MdVHA-A3、 MdVHA-D2的启动子活性。这部分内容证实MdMYB44通过负向调控Ma1、 Ma10、MdVHA-A3、MdVHA-D2的启动子活性来抑制苹果酸的转运，从而产生 低酸性状(图10)。
本发明通过QTL定位获得与苹果果实酸度性状相关的候选基因MdMYB44， 克隆了该基因的完整编码区段，构建了超量表达载体和干扰载体，并利用转基因 技术，验证了该基因的功能，揭示了该基因在果实苹果酸积累中的调控模式，有 利于果实酸度调控的定向选择育种(图10)，同时鉴于苹果的童期长、遗传背 景复杂等特点，该发明将会提高苹果育种效率，缩短育种年限，实现定向育种。
以上所述，仅是本发明的实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制， 任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围情况下，利用上述揭 示的方法内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，均属于权利要求书 保护的范围。
序列表
<110> 青岛农业大学
<120> 一种果实低酸调控基因MdMYB44及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 960
<212> DNA
<213> 苹果果实低酸调控基因(MdMYB44)
<400> 1
atggcttcca caaagaaggt ggtggatcgg ataaagggtc catggagccc cgaggaggac 60
gaagcgttac agaatctggt caagaactac ggcccgagaa actggtcgct gatcagcaag 120
tcgattcccg gtagatccgg caagtcttgc cgtctgcggt ggtgcaacca actttctccg 180
gaggtggagc accgcccctt cagtcctgaa gaggacgaca ccataatccg ggcccacgcc 240
cggttcggaa acaagtgggc caccatcgcc cggctgctca acggccggac cgataacgcc 300
ataaagaacc actggaactc cacgcttaag cgcaaaagct cctccatgtc ggaagatttg 360
agctccgacg tccaggccca cccgccgcac aaacgatccg ccagcgtcgg cgccgttccg 420
gttacgggtc tctatttcaa ccccggtagc ccgtccggat ccgatttgag cgattcgagc 480
ttgcccggcg gtgtgtctcc gtcgtctcaa gttttcactc cctttgcgag acccctacct 540
ccacccattg ctctgccgcc gatggaggcc gtgacatcgg ctatggccgt tgatccgccc 600
acatcgctca gcctttccct tcccggatcc gaatcgtgtg atgggtcgag tcatatggcg 660
tccggattcg gaaccaattc gattgtcggg cccgcccaga ttgtacagca agcgccagag 720
gtaacagctc caccgcgggc ggttgggttg ccgccagcgc cgcgtcagag caaccagaac 780
agcgagacgg ggcacgatca gcagtttttc agctcggagt tcctggatat gatgcaggag 840
atgatcagga aggaggtgag gaactacatg acggggattg agcagaaggg gctgtgcatg 900
cacaccgaag ccatccgaaa cgccgtcgta aagcgtatcg ggattagtag aatcgagtag 960
<210> 2
<211> 319
<212> PRT
<213> 苹果果实低酸调控基因(MdMYB44)
<400> 2
Met Ala Ser Thr Lys Lys Val Val Asp Arg Ile Lys Gly Pro Trp Ser
1 5 10 15
Pro Glu Glu Asp Glu Ala Leu Gln Asn Leu Val Lys Asn Tyr Gly Pro
20 25 30
Arg Asn Trp Ser Leu Ile Ser Lys Ser Ile Pro Gly Arg Ser Gly Lys
35 40 45
Ser Cys Arg Leu Arg Trp Cys Asn Gln Leu Ser Pro Glu Val Glu His
50 55 60
Arg Pro Phe Ser Pro Glu Glu Asp Asp Thr Ile Ile Arg Ala His Ala
65 70 75 80
Arg Phe Gly Asn Lys Trp Ala Thr Ile Ala Arg Leu Leu Asn Gly Arg
85 90 95
Thr Asp Asn Ala Ile Lys Asn His Trp Asn Ser Thr Leu Lys Arg Lys
100 105 110
Ser Ser Ser Met Ser Glu Asp Leu Ser Ser Asp Val Gln Ala His Pro
115 120 125
Pro His Lys Arg Ser Ala Ser Val Gly Ala Val Pro Val Thr Gly Leu
130 135 140
Tyr Phe Asn Pro Gly Ser Pro Ser Gly Ser Asp Leu Ser Asp Ser Ser
145 150 155 160
Leu Pro Gly Gly Val Ser Pro Ser Ser Gln Val Phe Thr Pro Phe Ala
165 170 175
Arg Pro Leu Pro Pro Pro Ile Ala Leu Pro Pro Met Glu Ala Val Thr
180 185 190
Ser Ala Met Ala Val Asp Pro Pro Thr Ser Leu Ser Leu Ser Leu Pro
195 200 205
Gly Ser Glu Ser Cys Asp Gly Ser Ser His Met Ala Ser Gly Phe Gly
210 215 220
Thr Asn Ser Ile Val Gly Pro Ala Gln Ile Val Gln Gln Ala Pro Glu
225 230 235 240
Val Thr Ala Pro Pro Arg Ala Val Gly Leu Pro Pro Ala Pro Arg Gln
245 250 255
Ser Asn Gln Asn Ser Glu Thr Gly His Asp Gln Gln Phe Phe Ser Ser
260 265 270
Glu Phe Leu Asp Met Met Gln Glu Met Ile Arg Lys Glu Val Arg Asn
275 280 285
Tyr Met Thr Gly Ile Glu Gln Lys Gly Leu Cys Met His Thr Glu Ala
290 295 300
Ile Arg Asn Ala Val Val Lys Arg Ile Gly Ile Ser Arg Ile Glu
305 310 315

Claims (7)

1.一种果实低酸调控基因MdMYB44的应用，其特征在于：通过克隆基因MdMYB44，构建MdMYB44过表达载体转化番茄，并异源过表达转化番茄，获得酸含量显著降低的转基因低酸性状番茄的应用，所述MdMYB44基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述MdMYB44基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的果实低酸调控基因MdMYB44的应用，其特征在于：克隆所述基因MdMYB44的正向引物为：ATGGCTTCCACAAAGAAGGTG，反向引物为：CTACTCGATTCTACTAATCCCG。
3.根据权利要求1所述的果实低酸调控基因MdMYB44的应用，其特征在于：所述基因MdMYB44通过BSA-seq方法对苹果果实酸度性状进行QTL定位获得，具体过程为：选择具有极端表型差异的亲本构建分离群体，构建高酸和低酸的表型DNA混合池，进行测序分析获得。
4.根据权利要求1所述的果实低酸调控基因MdMYB44的应用，其特征在于：所述MdMYB44过表达载体构建的具体步骤为：
(1)目的片段的获得，根据基因的序列设计特异引物，并在引物两端加入酶切位点，以克隆载体为模板，进行PCR扩增反应，获得带有酶切位点的MdMYB44编码区扩增产物，即目的片段；
(2)目的片段的回收，将步骤(1)中带酶切位点的MdMYB44基因PCR产物片段和载体pMDC83酶切，并分别回收酶切产物，然后将回收的MdMYB44基因PCR产物片段和载体pMDC83进行连接；
(3)将步骤(1)中的目的片段连接到过表达载体PMDC83；
(4)将步骤(3)的连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，菌落PCR鉴定阳性重组子；
(5)将步骤(4)构建好的表达载体转化农杆菌感受态EHA105，获得的工程菌EHA105/PMDC83-MdMYB44用于转化苹果愈伤组织。
5.根据权利要求4所述的果实低酸调控基因MdMYB44的应用，其特征在于：所述步骤(1)中的克隆载体为pEASY-blunt，酶切位点为Pac1和Asc1。
6.根据权利要求1所述的果实低酸调控基因MdMYB44的应用，其特征在于：将所述过表达载体和干扰载体转化苹果愈伤组织和注射苹果果实，表明MdMYB44基因在过表达MdMYB44的转基因愈伤和瞬转果实中的苹果酸含量显著低于转化空载体pMDC83。
7.根据权利要求1所述的果实低酸调控基因MdMYB44的应用，其特征在于：所述基因MdMYB44通过负向调控Ma1、Ma10、MdVHA-A3、MdVHA-D2的启动子活性来抑制苹果酸的转运，产生低酸性状。
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