CN115873867B - 一种抗稻瘟病基因Pi69及其编码蛋白与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公布一种水稻抗稻瘟病基因Pi69及其编码蛋白与应用。所述抗稻瘟病基因Pi69的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明抗稻瘟病基因Pi69在田间病圃鉴定及采集自不同稻区的53个优势稻瘟病菌单孢菌株接种鉴定高抗稻瘟病，是抗病育种的优秀抗源；该基因Pi69通过基因的遗传转化获得的抗病植株及其后代的种子分析表明，基因Pi69可稳定遗传给后代。
Description
技术领域
本发明属于水稻抗病性分子生物技术，涉及植物基因工程技术领域，具体涉及稻瘟病抗性基因及其编码蛋白与应用。
背景技术
作物病害是引起作物产量损失的主要因子，随着世界人口的不断增长，改良作物病害的抗性水平以增加粮食产量，保障粮食安全显得尤为重要，水稻(Oryza sativa)是世界上最重要的粮食作物之一，全球约一半以上的人口以稻米作为主食，水稻也是我国粮食安全和农业可持续发展的重要战略资源；由稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引起的稻瘟病是世界水稻生产区危害最为严重的病害之一，全球约80多个水稻种植国的水稻均受到稻瘟病的危害，其对世界的粮食安全构成严重威胁[1-2]。生产实践证明，抗病品种的利用、选育和推广是水稻生产上控制该病最经济、有效和环境友好的防治措施，特别是广谱抗病基因用于抗病育种以解决品种的抗病性，已成为当前抗病育种中最为紧迫的问题，而抗病基因的发掘、研究和利用是有效开展抗病育种的基础和核心。
迄今，已从稻种中鉴定并定位了100多个稻瘟病抗性基因[3]，从1999年第一个稻瘟病抗性基因克隆以来，目前至少已克隆了28个稻瘟病抗性基因[4]。通过对这些抗病基因编码蛋白的结构发现，在已克隆的这些基因中，除Pid-2基因编码一个受体蛋白激酶，Pi21基因编码一个具有重金属结合域及富含脯氨酸结构域的未知蛋白和Ptr基因编码犰狳重复(armadillo repeat,ARM)结构及蛋白末端含有富含脯氨酸结构域的蛋白外，其它已克隆的基因均编码具有核苷酸结合位点和亮氨酸重复结构域(NBS-LRR)的蛋白[5]，NBS-LRR蛋白又可再分为蛋白N端具有TIR结构域或CC结构域的蛋白，即具有TIR-NBS-LRR或CC-NBS-LRR结构域的蛋白。进一步研究表明，植物抗病基因编码的NBS-LRR可直接与病原菌无毒基因编码的蛋白可发生直接或间接的互作，进而引起寄主的抗性反应。抗病基因的不断克隆，特别是具有不同结构类型抗病基因的克隆，将为进一步深入研究水稻的抗病机理，寻找实现抗病持久性的途径，为实现水稻抗病品种的可持续利用奠定基础。
参考文献：
1.Couch B C,Hohn L M.A multilocus gene genealogy concordant with hostpreference indicates segregation of a new species,Magnaporthe oryzae,fromM.grisea.Mycologia,2002,94:683-693
2.Kato H.Rice blast disease.Pesticide Outlook,2001,12:23-25
3.Ashikani S,Rafili MY,Shabanimofrad M,Ghasemzadeh A,Ravanfar SA,Latif MA(2016)Molecular progress on the mapping and cloning of functionalgenes for blast resistance in rice(Oryza sativa L.):current status and futureconsiderations.Crit Rev Biotechnol,36:353-367
4.Kalia S,Rathour R.Current status on mapping of genes for resistanceto leaf and neck-blast disease in rice.3Biotech,2019,9:209
5.Dangl JL and Jones JD.Plant pathogens and integrated defenceresponses to infection.Nature,2001，411:826-833
发明内容
为了解决现有技术存在的常规杂交育种中由于遗传连锁造成的基因连锁累赘，现有的稻瘟病抗性基因中大部分基因均存在抗谱窄，在常规育种中难以获得抗病性好、其它综合农艺性状又优良的新品种的技术问题以及克服抗性容易丧失的问题，本发明提供一种稻瘟病抗性基因Pi69及其编码蛋白、应用和制备方法。
本发明采取以下技术方案：
本发明提供一种水稻抗稻瘟病基因Pi69，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明提供的所述水稻抗稻瘟病基因Pi69的cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
本发明还提供所述cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的水稻抗稻瘟病基因Pi69的编码蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。所述的抗稻瘟病基因Pi69编码的蛋白的氨基酸序列共计1479个氨基酸，包含2个主要的结构域：即NBS和LRR区域，其中293-591aa为保守的NBS区域，C-末端为富含亮氨酸的LRR重复区域(592-1479aa)，其亮氨酸含量(147of888)为16.6％。
本发明还提供扩增核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的抗稻瘟病基因Pi69的专用引物，所述专用引物由PCR扩增抗稻瘟病基因Pi69的5’端短片段的引物对和3’端长片段引物对组成，PCR扩增抗稻瘟病基因Pi69的5’端短片段的引物对为正向引物Pi69-KpnI-Fw和反向引物106Rv，所述正向引物Pi69-KpnI-Fw的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，反向引物106Rv的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；PCR扩增抗稻瘟病基因Pi69的3’端长片段引物对为正向引物106Fw和反向引物Pi69-SalI-Rv，所述正向引物106Fw的核苷酸序列如SEQ IDNO:9所示，反向引物Pi69-SalI-Rv的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。
本发明还提供核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的抗稻瘟病基因Pi69的制备方法：该方法通过化学合成方法得到所述的抗稻瘟病基因Pi69或以抗性供体非洲栽培稻渗入系IL106的基因组DNA为模板，分别通过扩增抗稻瘟病基因Pi69的5’端短片段的引物对正向引物Pi69-KpnI-Fw和反向引物106Rv，以及扩增抗稻瘟病基因Pi69的3’端长片段引物对正向引物106Fw和反向引物Pi69-SalI-Rv，进行PCR扩增，得到具有294bp的重叠区的5’端短片段和3’端长片段两个片段，并通过酶切、连接获得含有完整基因全长的抗稻瘟病基因Pi69。
本发明还提供核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的水稻抗稻瘟病基因Pi69在水稻抗稻瘟病分子育种中的应用。
进一步，所述的在水稻抗稻瘟病分子育种中的应用是将抗稻瘟病基因Pi69转入到感病的水稻品种中，得到具有稻瘟病抗性的水稻品种或水稻材料。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
1.本发明的抗稻瘟病基因Pi69来源于非洲栽培稻，而非洲栽培稻(O.glaberrima)有许多抗生物胁迫和非生物胁迫的优异种质资源，通过田间病圃鉴定及采集自不同稻区的53个优势稻瘟病菌单孢菌株苗期温室内接种鉴定发现本发明的抗稻瘟病基因Pi69高抗稻瘟病，是抗病育种的优秀抗源。
2.本发明的抗稻瘟病基因Pi69由于来源于非洲栽培稻，其与亚洲栽培稻的基因组差异很大，利用传统育种方法难以转育成功，利用已克隆的Pi69基因转入到感病的水稻品种中，可以获得新的抗病水稻品种。
3.本发明提供的抗稻瘟病基因Pi69可利用转化技术将其转移到感病水稻品种中，通过基因的转化，可以极大地缩短育种所需的周期。
4.利用转化技术将本发明提供的抗稻瘟病基因Pi69转移到感病水稻品种中，可避免传统育种技术中存在靶标基因与其它控制不良性状基因的连锁累赘带来的问题。
5.本发明通过基因转化获得的抗病植株及其后代的种子，可通过常规有性杂交的方式将基因Pi69稳定遗传给后代。
6.本发明提供的抗稻瘟病基因Pi69具有广谱抗稻瘟病的特点，利用该基因育成的抗稻瘟病新品种可大面积进行种植。
序列表中SEQ ID NO:1所示的是抗稻瘟病基因Pi69的核苷酸序列，其核苷酸序列中碱基第1-1378位置是第一外显子，第1486-5447位置是第二外显子，第6148-6303位置是第三外显子，第6515-7241位置是第四外显子。
序列表中SEQ ID NO:2所示的是SEQ ID NO:4所示的抗稻瘟病基因Pi69的cDNA核苷酸序列编码蛋白的氨基酸序列。
序列表中SEQ ID NO:3所示的是抗稻瘟病基因Pi69的启动子核苷酸序列。
序列表中SEQ ID NO:4所示的是抗稻瘟病基因Pi69的cDNA核苷酸序列。
序列表中SEQ ID NO:5所示的是扩增抗稻瘟病基因Pi69的cDNA核苷酸序列的正向引物Pi69cDNA-Fw的核苷酸序列。
序列表中SEQ ID NO:6所示的是扩增抗稻瘟病基因Pi69c的DNA核苷酸序列的反向引物Pi69cDNA-Rv的核苷酸序列。
序列表中SEQ ID NO:7所示的是扩增抗稻瘟病基因Pi69的5’端短片段的正向引物Pi69-KpnI-Fw的核苷酸序列。
序列表中SEQ ID NO:8所示的是扩增抗稻瘟病基因Pi69的5’端短片段的反向引物106Rv的核苷酸序列。
序列表中SEQ ID NO:9所示的是扩增抗稻瘟病基因Pi69的3’端长片段的正向引物106Fw的核苷酸序列。
序列表中SEQ ID NO:10所示的是扩增抗稻瘟病基因Pi69的3’端长片段的反向引物Pi69-Sal 1-Rv的核苷酸序列。
序列表中SEQ ID NO:11所示的是潮霉素基因分子鉴定正向引物hptFw的核苷酸序列。
序列表中SEQ ID NO:12所示的是潮霉素基因分子鉴定反向引物hptRv的核苷酸序列。
序列表中SEQ ID NO:13所示的是扩增基因Pi69的分子鉴定正向引物Pi69SPFw的核苷酸序列。
序列表中SEQ ID NO:14所示的是扩增基因Pi69的分子鉴定反向引物Pi69SPRv的核苷酸序列。
附图说明
图1：图1中上图是利用稻瘟病菌株09BSH-10-5A接种抗稻瘟病供体非洲栽培稻渗入系IL106、转基因感病受体品种滇粳优1号和随机取样的T0代转基因阳性转化植株的表型反应图。第1条叶片是含有抗稻瘟病基因Pi69的抗性供体非洲栽培稻渗入系IL106的叶片，第2条叶片是转基因感病受体品种滇粳优1号的叶片，第3-7条叶片是随机取样的转基因T0代的不同阳性植株。图1中下图是潮霉素基因分子鉴定正向引物hptFw和反向引物hptRv对水稻T0代转基因植株的DNA为模板进行PCR扩增的扩增产物在1％琼脂糖凝胶中的鉴定电泳图；其中泳道M：2000bp分子量标记(DL2000)，泳道P1300-Pi69为pCAMBIA1300Asc I-Pi69质粒为模板的PCR产物扩增结果，泳道1为非洲栽培稻渗入系IL106基因组DNA为模板的PCR产物扩增结果，泳道2为转化受体品种滇粳优1号基因组DNA为模板的PCR产物扩增结果，泳道3-7为与图1中上图对应的T0代转基因植株表型鉴定后的基因组DNA为模板进行筛选标记潮霉素基因的PCR扩增结果。
图2：图2中上图是利用稻瘟病菌株09BSH-10-5A接种抗稻瘟病供体非洲栽培稻渗入系IL106、转基因感病受体品种滇粳优1号和随机取样的T1代转基因植株的表型反应图。第1条叶片是含有抗稻瘟病基因Pi69的抗性供体非洲栽培稻渗入系IL106的叶片，第2条叶片是感病受体品种滇粳优1号的叶片，第3-11条叶片是随机取样的转基因T1代不同植株。图2中下图是抗稻瘟病基因Pi69分子鉴定正向引物Pi69SPFw和反向引物Pi69SPRv对转基因T1代植株DNA为模板的PCR扩增产物电泳图。M：2000bp分子量标记(DL2000)，泳道1为抗稻瘟病基因Pi69供体非洲栽培稻渗入系IL106，泳道2为感病受体转化品种滇粳优1号，泳道3-11为图2中上图对应的T1代转基因植株表型鉴定后的基因组DNA为模板的扩增结果，其中泳道3、4、6为转基因T1代感病植株的基因组DNA为模板的扩增结果，5、7-11为转基因Pi69的T1代抗病植株的基因组DNA为模板的扩增结果。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的实施方式不限于此。
若未特别说明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规技术手段。实施例阐述了基因Pi69的分离克隆、功能特征及分子和表型互补鉴定实验；通过转基因策略进行遗传转化，使感病的水稻品种在转入基因Pi69后获得的转基因材料具有广谱抗稻瘟病的特征。
本文中所称“抗病”均是指抗稻瘟病，所称“感病”均是指感稻瘟病。所述水稻抗稻瘟病基因Pi69简称：基因Pi69或Pi69基因。非洲栽培稻渗入系IL106简称：IL106。PCR指聚合酶链式反应(英文：Polymerase Chain Reaction)。
实施例涉及的生物材料：
非洲栽培稻渗入系IL106和稻瘟病菌株09-BSH-10-5A在非专利文献“Dong etal.，Identification and Fine Mapping of Pi69(t)，a New Gene Conferring Broad-Spectrum Resistance Against Magnaporthe oryzae From Oryza glaberrima Steud，Frontiers in Plant Science，2020，11:1190.doi:10.3389/fpls.2020.01190)”公开，所述非洲栽培稻渗入系IL106和稻瘟病菌株09-BSH-10-5A申请人有保存，按我国法律法规相关规定自本专利申请日起20年内申请人可提供，申请人联系地址：云南省昆明市盘龙区北京路2238号，云南省农业科学院农业环境资源研究所，邮编：650205。
实施列中涉及的粳稻品种滇粳优1号和pCAMBIA1300AscI载体以及各种试剂等材料均为市售。
为了实施基因Pi69的克隆，本申请人项目组前期已经完成了该基因精细定位的研究工作(参见Dong et al.，Identification and Fine Mapping of Pi69(t)，a New GeneConferring Broad-Spectrum Resistance Against Magnaporthe oryzae From Oryzaglaberrima Steud，Frontiers in Plant Science，2020，11:1190.doi:10.3389/fpls.2020.01190)。
实施例1稻瘟病抗性基因Pi69的分析和确定
一、基因Pi69候选基因分析
在基因Pi69前期精细定位的基础上，利用与基因紧密连锁的标记，以日本晴的基因组为参考序列，设计引物并结合基因组步移(genome walking)的方法，获得了抗性供体非洲栽培稻渗入系IL106中基因Pi69所在区域的序列信息，利用softberry平台(http://www.softberry.com)，对本申请人课题组获得的IL106靶标区域的序列进行靶标区域基因的注释分析，发现在靶标区域含有11个预测的候选基因(Pi69-1,Pi69-2,Pi69-3,Pi69-4,Pi69-5,Pi69-6,Pi69-7,Pi69-8,Pi69-9,Pi69-10,Pi69-11)。根据基因注释的序列信息，设计引物并采用RT-PCR分析表明，11个候选基因仅有Pi69-5基因表达，其它10个基因均不表达，因而将基因Pi69的候选基因确定为Pi69-5。
二、基因Pi69的全长cDNA序列的获得
利用Trizol试剂，从非洲栽培稻渗入系IL106的幼叶提取总RNA，并用PowerscriptII transcriptase(Takara公司)逆转录合成第一链cDNA，采用cDNA末端快速扩增(rapidamplification of cDNA end,RACE)技术分别获得IL106中Pi69-5的3’和5’cDNA序列，并根据3’和5’cDNA的序列信息设计PCR引物，设计正向引物Pi69cDNA-Fw(其碱基序列如SEQ IDNO:5所示)和反向引物Pi69cDNA-Rv(其碱基序列如SEQ ID NO:6所示)，扩增获得Pi69基因的全长cDNA序列信息；基因Pi69的cDNA序列如SEQ ID NO:4所示，得到基因Pi69的cDNA序列为6223kb。其PCR扩增反应条件如下：总反应体系50μl，含有10μl5×Supper Pfx HFBuffer，0.5μl高保真Taq酶Supper Pfx DNA Polymerase，4μldNTP(2.5μM each)，2μl正向引物Pi69cDNA-Fw(10μM)，2μl反向引物Pi69cDNA-Rv(10μM)，2μl cDNA模板，并补足双蒸灭菌水至50μl。PCR反应条件为98℃预变性2min；循环内98℃变性10s，65℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；最终72℃延伸10min，12℃保存。PCR扩增产物在1％的琼脂糖凝胶中电泳检测后进行测序分析，获得基因Pi69的全长cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
三、基因Pi69的序列及其cDNA序列分析
通过基因Pi69的cDNA(其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示)与基因Pi69的基因组序列(其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示)的比较分析，基因Pi69的基因组序列含有三个内含子和四个外显子，其第一外显子为第1-1378bp，第二外显子为第1486-5447bp，第三外显子为第6148-6303bp，第四外显子为第6515-7241bp；在cDNA序列中，基因Pi69的编码区为第895-5334bp，编码区序列长度为4440bp；基因Pi69的cDNA序列编码一个由1479个氨基酸组成的蛋白(编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)。
实施例2抗稻瘟病基因Pi69的遗传转化互补验证实验
一、稻瘟病目的抗性基因Pi69的分段扩增及获取
以抗病供体亲本非洲栽培稻渗入系IL106的基因组DNA为模板，分2段PCR扩增Pi69基因全长，利用正向引物Pi69-KpnI-Fw(核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示)和反向引物Pi69-SalI-Rv(核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示)，以及在基因内部设计的1条正向引物106Fw(核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示)及1条反向引物106Rv(核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示)扩增包含基因Pi69自身启动子的序列(2段扩增出来的序列有294bp的重叠，且在重叠区带有一个适宜的酶切位点，该限制性内切酶不能切割载体)；5’端短片段PCR扩增反应及其条件如下：总反应体系25μL，金牌Mix(gree)22μL(市售)，10μM正向引物Pi69-KpnI-Fw 1μL,10μM反向引物106Rv 1μL,10ng/μL模板非洲栽培稻渗入系IL106的DNA 1μL；PCR反应条件为：95℃预变性3min；循环内98℃变性10s，65℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；最终72℃延伸5min；PCR扩增产物在1％的琼脂糖凝胶中电泳检测。3’端长片段PCR扩增反应及其条件如下：总反应体系25μL，金牌Mix(gree)22μL，10μM正向引物106Fw 1μL,10μM反向引物Pi69-SalI-Rv 1μL,10ng/μL模板DNA 1μL；PCR反应条件为：95℃预变性3min；循环内98℃变性10s，65℃退火30s，72℃延伸5min，共35个循环；最终72℃延伸5min，PCR扩增产物在1％的琼脂糖凝胶中电泳检测。分别对Pi69基因扩增出来的短片段和长片段产物进行测序分析，得基因Pi69的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
二、构建表达载体
(一)克隆载体pCAMBIA1300AscI的酶切
用NEB(NEB公司)的限制性内切酶Sal I和Kpn I对载体pCAMBIA1300AscI(市售)进行双酶切处理，处理方法如下：Sal I酶切缓冲液(NEB3.1)5μL，pCAMBIA1300AscI载体5μL，限制性内切酶Sal I 1μL，限制性内切酶Kpn I 1μL，并加入双蒸馏水补足为50μL的反应液，在37℃酶切40min，然后利用回收试剂盒进行片段的纯化，获得含有Sal I和Kpn I双酶切的pCAMBIA1300AscI载体。
(二)目的基因的酶切
1.用NEB的限制性内切酶Kpn I和BssH II对Pi69基因5’端短片段(实施例2步骤一获取的)进行双酶切处理，处理方法如下：Kpn I酶切缓冲液(NEB3.1)5μL，Pi69基因5’端短片段27μL，限制性内切酶Kpn I 1μL，并加入双蒸馏水补足为50μL的反应液，在37℃酶切20min后，再加入限制性内切酶BssH II 1μL，在50℃酶切20min，然后利用回收试剂盒进行片段的纯化，获得含有Kpn I和BssH II双酶切的Pi69基因5’端短片段，并分别进行DNA浓度的定量。
2.用NEB的限制性内切酶Sal I和BssH II对Pi69基因3’端长片段(实施例2步骤一获取的)进行双酶切处理，处理方法如下：Sal I酶切缓冲液(NEB3.1)5μL，Pi69基因3’端长片段27μL，限制性内切酶Sal I 1μL，并加入双蒸馏水补足为50μL的反应液，在37℃酶切20min后，再加入限制性内切酶BssH II 1μL，在50℃酶切20min，然后利用回收试剂盒进行片段的纯化，获得含有Sal I和BssH II双酶切的Pi69基因的3’端长片段，并进行DNA浓度的定量。
(三)连接反应及获得阳性克隆
利用T4连接酶进行目标片段和载体的连接，连接缓冲液(10×T4 ligationbuffer)4μL，双酶切后的pCAMBIA1300AscI载体3μL[实施例2步骤二(一)获得的]，双酶切的Pi69基因的5’端短片段5μL[实施例2步骤二(二)1.获得的]，双酶切的Pi69基因的3’端长片段25μL[实施例2步骤二(二)2.获得的]，T4连接酶0.5μL，然后双蒸水补足20μL，在反应条件为循环内10℃3min，16℃3min和18℃1min，在共45个循环的PCR仪中完成反应后，用无水乙醇沉淀连接产物，即获得重组表达载体pCAMBIA1300Asc1-Pi69，并将其电激转化到大肠杆菌DH10B中，获得阳性克隆(pCAMBIA1300Asc1-Pi69)并进行测序分析，基因Pi69序列如SEQID NO:1所示。
三、水稻愈伤组织的遗传转化及转基因植株的获得
采用农杆菌介导的遗传转化法(Hiei Y,Ohta S,Komari T,et al.Efficienttransformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequenceanalysis of the boundaries of the T-DNA.The Plant Journal,1994,6:271-282)开展Pi69基因的遗传转化实验，将获得的含有pCAMBIA1300AscI-Pi69的质粒转化到农杆菌菌株EHA105感受态细胞中，并进一步用农杆菌浸染感稻瘟病的水稻品种滇粳优1号，通过抗性愈伤组织筛选、分化，获得转基因植株。
四、转基因植株的分子鉴定及抗病表型鉴定
(一)转基因T0代植株的潮霉素B基因分子鉴定
获得的转基因植株利用遗传转化载体pCAMBIA1300AscI上携带的潮霉素B基因序列引物对：正向引物hptFw(其碱基序列如SEQ ID NO:11所示)和反向引物hptRv(其碱基序列如SEQ ID NO:12所示)进行鉴定，提取转基因植株叶片的DNA作为模板，进行PCR扩增鉴定，PCR总反应体系20μL，含有2×ES Taq Master Mix 10μL,PCR扩增正向引物及反向引物分别为1μL(各10μM)，转基因植株提取的基因组DNA 1μL(10ng)，并补足双蒸灭菌水至20μL；PCR扩增反应条件为：95℃预变形3min，循环内95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环，72℃延伸7min。PCR扩增结束后，取3μL PCR产物在1％琼脂糖凝胶中电泳(电压120V，30分钟，Dured染色)，通过凝胶成像系统观察电泳胶图，确定转基因阳性植株。经过PCR扩增鉴定，共获得21株转基因阳性植株。部分鉴定电泳图见图1，扩增出550bp带型的是含有Pi69基因的阳性转基因植株，未扩增出带型的是非洲栽培稻渗入系IL106和感病受体材料滇粳优1号。
(二)转基因T0代植株的表型鉴定
利用对受体品种滇粳优1号致病的稻瘟病菌株09BSH-10-5A接种抗病亲本IL106、感病亲本滇粳优1号和获得的21株转基因植株，表型鉴定结果发现，21株T0代转基因植株均表现为抗病。部分T0代转基因植株电泳鉴定图对应的植株叶片表型如图1所示。
(三)转基因T1代植株的分子及表型鉴定
1.转基因的T1代植株的分子鉴定
经过T0代转基因植株繁育自交后，获得T1代种子，并对获得的T1代群体进行共分离分析实验，对转基因的T1代植株进行分子鉴定；以T1代水稻群体的基因组DNA为模板，Pi69基因内部的分子鉴定正向引物Pi69SPFw(其碱基序列如SEQ ID NO:13)和反向引物Pi69SPRv(其碱基序列如SEQ ID NO:14)进行PCR扩增，PCR总反应体系20μL，含有2×ES Taq MasterMix 10μL,PCR扩增正向引物及反向引物分别为1μL(各10μM)，T1代转基因植株提取的基因组DNA 1μL(10ng)，并补足双蒸灭菌水至20μL；PCR扩增反应条件为：95℃预变形3min，循环内95℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸70s，共35个循环，72℃延伸5min。PCR扩增结束后，取2μL PCR产物在1％琼脂糖凝胶中电泳(电压120V，30分钟，Dured染色)，通过凝胶成像系统观察电泳胶图，扩增产物在1％琼脂糖凝胶中电泳检测，随机获取的T1代植株电泳图如图2所示，扩增出1050bp带型的是含有Pi69基因的纯合或杂合转基因植株，未扩增出带型的泳道2、3、4、6对应的叶片是不含有Pi69基因的感病植株。
2.转基因的T1代植株的表型鉴定
利用稻瘟病菌株09BSH-10-5A接种抗病亲本IL106、感病亲本滇粳优1号和转基因的T1代植株，结果表明：含有转基因Pi69的T1代植株表现抗病，而不含转基因Pi69的植株表现感病，随机获取的T1代转基因植株电泳鉴定图对应的植株叶片表型如图2所示，其抗性表现型与抗性基因型表现出共分离的特性，亦即，基因Pi69可以通过转化的方式转入到感病品种中，并通过育种的选拔，获得纯合的抗病植株，应用于水稻抗病育种。
Claims (7)
1.一种水稻抗稻瘟病基因Pi69，其特征在于，所述水稻抗稻瘟病基因Pi69的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种水稻抗稻瘟病基因Pi69，其特征在于，所述水稻抗稻瘟病基因Pi69的cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
3.权利要求2所述的水稻抗稻瘟病基因Pi69的编码蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
4.扩增权利要求1所述的抗稻瘟病基因Pi69的专用引物，其特征在于，所述专用引物由PCR扩增抗稻瘟病基因Pi69的5’端短片段的引物对和3’端长片段引物对组成，PCR扩增抗稻瘟病基因Pi69的5’端短片段的引物对为正向引物Pi69-KpnI-Fw和反向引物106Rv，所述正向引物Pi69-KpnI-Fw的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，反向引物106Rv的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；PCR扩增抗稻瘟病基因Pi69的3’端长片段引物对为正向引物106Fw和反向引物Pi69-SalI-Rv，所述正向引物106Fw的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示，反向引物Pi69-SalI-Rv的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。
5.权利要求1所述的抗稻瘟病基因Pi69的制备方法：其特征在于，通过化学合成方法得到所述的抗稻瘟病基因Pi69或以抗性供体非洲栽培稻渗入系IL106的基因组DNA为模板，通过权利要求4所述的专用引物扩增得到具有294bp的重叠区的5’端短片段和3’端长片段两个片段，并通过酶切、连接获得含有完整基因全长的抗稻瘟病基因Pi69。
6.权利要求1所述的水稻抗稻瘟病基因Pi69在水稻抗稻瘟病分子育种中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，将抗稻瘟病基因Pi69转入到感病的水稻品种中，得到具有稻瘟病抗性的水稻品种或水稻材料。
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| "Identification and Fine Mapping of Pi69(t), a New Gene Conferring Broad-Spectrum Resistance Against Magnaporthe oryzae From Oryza glaberrima Steud";Liying Dong等;《Frontiers in Plant Science》;第11卷(第1190期);1-8 * |
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