CN113817748B

CN113817748B - 一种玉米抗盐主效qtl及其应用

Info

Publication number: CN113817748B
Application number: CN202111151353.8A
Authority: CN
Inventors: 蒋才富; 王向峰; 王妍妍
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2021-09-29
Filing date: 2021-09-29
Publication date: 2023-02-24
Anticipated expiration: 2041-09-29
Also published as: CN113817748A

Abstract

本发明公开了一种玉米抗盐主效QTL及其应用。所述玉米抗盐主效QTL基因，其编码核苷酸序列为SEQ ID No.1所示的序列。针对此基因，鉴定了在抗感材料间存在差异的分子标记，该标记与玉米抗盐性连锁，可作为玉米抗盐分子标记，本发明还提供了检测该抗盐分子标记的引物、试剂盒和方法。本发明所述的QTL基因、分子标记、引物、试剂盒和方法可以应用于玉米的抗盐育种。

Description

一种玉米抗盐主效QTL及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及本发明涉及一种玉米抗盐主效QTL及其相关基因、分子标记与应用。

背景技术

盐碱胁迫在自然界中分布广泛，是对农业生产影响较大的非生物胁迫，已成为制约农业可持续发展的关键问题。近年来，全球盐碱化进程的加快进一步加重了盐碱对农业生产的威胁。我国是耕地受盐碱化危害较严重的国家之一，在北方耕地盐碱化较南方更为严重，而作为我国粮食生产的主产区，不断加剧的耕地盐碱化，势必威胁到粮食生产和粮食安全。因此如何开发利用大面积的盐碱地，合理应对盐碱胁迫对农业生产(尤其是主要作物生产)的负面影响，对维持我国农业生产的可持续发展有重要意义。

玉米对盐胁迫十分敏感(王丽燕，2005)，已有研究表明不同玉米自交系的抗盐能力存在显著差异，普遍认为这种差异是多种抗盐生理性状的综合体现，是多基因控制的数量性状 (Foolad and Jones，1993)。在此基础上，已有一些研究尝试通过转录组分析、蛋白质组分析及QTL分析来发掘相关基因(Zhang et al.,2015；Cui et al.,2015)，到目前为止有为数不多的玉米抗盐QTL被精细定位或克隆，这已然成为玉米抗盐分子标记开发和抗盐玉米培育的主要瓶颈。因此，克隆抗盐QTL基因,研究其介导抗盐的分子机制，开发用于抗盐玉米培育的分子标记已成为抗盐玉米改良的首要关键任务。

植物在受到盐胁迫时，其代谢活动会受到影响，分为两个阶段，首先是植物根系盐离子浓度过高导致渗透胁迫，植物吸水困难，导致植物的生理干旱。离子毒害是一个逐渐积累的过程，根系从土壤中吸收过量的Na⁺，同时K⁺吸收受阻，导致组织中K⁺/Na⁺比率失衡，最终导致离子毒害，因此维持Na⁺、K⁺浓度的稳态及K⁺/Na⁺比率平衡在植物抗盐能力形成过程中发挥着重要的作用(Zhu et al.,2002；Munns and Tester,2008；Jiang et al.,2012)。已有的研究结果表明，玉米在盐胁迫条件下生长时，不同玉米自交系叶片中积累的Na⁺浓度以及 K⁺/Na⁺比率存在显著差异(Zhao et al.,2010；Chen et al.,2016；)，但相关QTL基因只有极少数被精细定位/克隆(Zhang et al.,2017)，因此克隆调控玉米Na⁺、K⁺浓度以及K⁺/Na⁺比率的QTL基因对抗盐玉米的改良具有重要意义。

发明内容

为了克服现有技术不足，丰富调节手段，本发明的目的之一在于提供一种玉米抗盐QTL 基因，所述基因其编码核苷酸序列选自：

(a)SEQ ID No.1所示的序列；

(b)SEQ ID No.1所示的序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。

另一方面，本发明还提供了上述玉米抗盐QTL基因所编码的蛋白质，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。

对于上述玉米抗盐QTL基因，本发明的发明人发现两个亲本自交系3H-2和CIMBL45的抗盐性存在显著差异，以3H-2和CIMBL45F2群体为材料，本发明利用QTL分析及其它生物信息学手段，克隆了玉米抗盐QTL基因，命名为ZmESBL，该基因编码区长度为600bp(详细序列见SEQ ID No.1)，编码200个氨基酸(详细序列见SEQ ID No.2)。

本发明的目的还在于提供一种玉米抗盐主效QTL，其特征在于，该主效QTL位于1号染色体上274,480-274,484kb的位置。

为了筛选适合抗盐分子标记的DNA序列变异，发明人对3H-2和CIMBL45 F2群体中抗盐和盐敏感材料进行了基因组DNA混池测序，通过数据分析初步将候选区间，其位于1号染色体上，通过设计分子标记将候选基因精细定位于1号染色体一个约114kb的区间内，基于PCR 产物的测序验证和对转基因材料的表型分析，鉴定到一个抗感材料间存在差异的基因，将该基因命名为ZmESBL。该基因在盐敏感自交系CIMBL45中152位插入一个碱基导致蛋白翻译提前终止，进而影响自交系CIMBL45盐敏感性，与该基因连锁的核苷酸片段有小片段的插入缺失，适合用于分子标记。

本发明的目的也在于提供一种玉米抗盐相关的分子标记，所述分子标记表现为在上述抗盐QTL基因连锁片段的插入或缺失。

本发明还提供了用于检测权利上述分子标记的引物对，包括：引物对Ⅰ和引物对Ⅱ，所述引物对Ⅰ为引物ZmESBL-F1和引物ZmESBL-R1，所述引物对Ⅱ为引物ZmESBL-F2和引物 ZmESBL-R2；

所述引物ZmESBL-F1、ZmESBL-R1、ZmESBL-F2和ZmESBL-R2序列如下：

引物ZmESBL-F1：GGGTCCCTTTTATAGCCCCA(SEQ ID NO.5)；

引物ZmESBL-R1：AATGCACTTTCAGGTCGACG(SEQ ID NO.6)；

引物ZmESBL-F2：AGCTTGATGTACGAACGCAC(SEQ ID NO.7)；

引物ZmESBL-R2：CTGCTTTCCTCGCCCTTCATC(SEQ ID NO.8)。

利用上述引物对Ⅰ和引物对Ⅱ对玉米基因组进行PCR扩增，若分别得到250bp和307bp 的扩增片段，则所测玉米为抗盐型。

另一方面，本发明还提供了一种用于检测上述分子标记的试剂盒，包括上述的引物对。

进一步地，所述试剂盒还包括用于PCR扩增的酶和试剂，用利用上述引物对进行PCR扩增。

本发明的目的还在于提供一种检测玉米是否抗盐的方法，包括：

对待测玉米进行上述分子标记的检测，根据检测结果判断其是否抗盐。

上述方法中，所述方法包括：

利用上述引物对，或者上述试剂盒，以所述待测玉米基因组为模板进行PCR扩增，若分别得到250bp和307bp的扩增片段，则所测玉米为抗盐型。

另一方面，上述抗盐QTL基因、上述蛋白质、上述主效QTL、上述述的分子标记、上述引物对，上述试剂盒在玉米抗盐育种中的应用。

所述PCR扩增的酶、试剂和反应为本领域技术人员所熟知，可以根据《分子克隆》等工具书配制并设计条件，也可以使用现有市售的试剂盒产品。

扩增片段检测的方法同样为本领域技术人员熟知，优选琼脂糖凝胶电泳，也可视情况使用质谱、测序等方式。

本发明的有益效果

(1)本发明提供了一种新的玉米抗盐主效QTL，及其相关的抗盐QTL基因的核苷酸序列和其对应的蛋白质氨基酸序列，并且在此抗盐QTL基因两侧，鉴定到与玉米抗盐性连锁的片段，该片段的插入或缺失，可作为玉米抗盐分子标记。本发明还提供了一种用于检测本发明的玉米抗盐分子标记的引物对和试剂盒，以及检测玉米是否抗盐的方法。

由于玉米抗盐属数量性状遗传，表型分析耗时费力，上述的玉米抗盐主效QTL、抗盐QTL 基因及其蛋白质、分子标记、引物对和试剂盒都可以应用于玉米抗盐育种中，在玉米种子期间或子叶长出的早期阶段就可鉴定，省时而且准确，可以加速玉米抗盐品种选育进程。

附图说明

图1为为抗盐QTL基因的定位；其中(A)为基于3H-2/CIMBL45F2群体的QTL分析确定的抗盐主效QTL，及其相关基因ZmESBL的位置；(B)为利用F2群体对候选基因的精细定位；(C)为自交系3H-2和CIMBL45中此QTL基因的氨基酸序列。

图2为抗盐QTL基因的遗传验证；其中(A) 为 pBUE - ZmESBL 载体结构示意图；(B) 为利用 CRSPR - Cas9 敲除后的基因和原基因序列的比较； (C)为在对照或盐处理条件下生长了2周的野生型和ZmESBL基因敲除植株(ZmESBL^crispr-1，ZmESBL^crispr-2)的生长情况；其中标尺大小为10cm。

图3为ZmESBL基因的结构示意图；

图4为ZmESBL基因全长编码序列PCR扩增的电泳图；其中1以来自B73幼苗的cDNA为模板，用ZmESBL特异的引物(ZmESBL-gene-F和ZmESBL-gene-R)进行扩增获得的PCR 产物(预期产物大小600bp)，M为聚合美公司DL2000 Marker。

图5为ZmESBL基因编码序列连接入T载体后的载体图谱；

图6为ZmESBL编码的蛋白定位及功能；其中(A)为pCAMBIA1300pesb1-GFP-ZmESBL载体结构示意图；(B)为在拟南芥根部GFP-ZmESBL的亚细胞定位；(C)为野生型与ZmESBL^crispr突变体凯氏带结构比较图。

图7为野生型与ZmESBL^crispr突变体凯氏带屏障功能比较图。

图8为盐处理后野生型与ZmESBL^crispr突变体根部中柱与中柱外部Na⁺含量比较图和对照或盐处理下野生型和ZmESBL^crispr突变体地上部Na⁺含量比较图；

图9为实施例3中以引物对I和II扩增3H-2和CIMBL45的结果。

具体实施方式

以下实施例中的方法中如无特别说明，所用的生化试剂均为市售试剂，所有的方法均为常规方法。

除特殊说明的之外，各实施例中所用的设备和试剂均常规市售可得。

实施例1玉米抗盐QTL基因的克隆及功能分析

本发明以3H-2/CIMBL45F2群体为材料，分别对F2群体中盐敏感和抗盐材料进行混池测序，通过QTL分析在1号染色体上定位了一个主效抗盐QTL区域，如图1A所示，在1号染色体上274,480-274,484kb的位置，位置根据玉米B73参考基因组V2确定。同时通过分子标记对候选基因进行精细定位，在此QTL候选区域鉴定到2个候选基因(图1B)，其中候选基因 2在自交系CIMBL45中有1bp缺失(图1C)，导致蛋白翻译提前终止，初步确定其为候选基因，命名为ZmESBL。

为了获得ZmESBL的突变体，发明人(1)设计了CRSPR-Cas9敲除靶点，如图1C所示；(2)用BsaI对含有靶点序列的PCR片段和pBUE411载体进行酶切、连接，连接产物转入大肠杆菌，用通用引物FD3/RD进行菌落PCR扩增，电泳检测有目的大小条带的菌落为阳性克隆，将对应的菌液送至北京三博远志生物技术有限责任公司测序，获得正确的pBUE411-ZmESBL载体(图2A)，将pBUE411-ZmESBL转入农杆菌EHA105；(3)通过幼胚侵染的方法获得转基因植株；(4)通过对包括靶点在内的基因片段进行PCR扩增、测序确定转基因阳性植株。最终获得了两个ZmESBL候选基因的敲除材料(命名为ZmESBL^crispr-1和ZmESBL^crispr-2)，并证明这两个突变体跟CIMBL45一样表现出盐敏感的表型，如图2C所示，表明ZmESBL基因敲除植株对盐胁迫更敏感，表现为植株矮小叶片发黄，说明该基因的确是抗盐QTL基因ZmESBL。

通过Gramene网站对ZmESBL基因结构进行预测，基因全长(从起始密码子到终止密码子) 600bp，只包含1个外显子，如图3所示。为了克隆ZmESBL全长编码序列，以生长7天的玉米自交系B73幼苗为材料，使用天根生化科技(北京)有限公司的植物总RNA提取试剂盒(Cat.#DP432)提取总RNA，并通过使用普洛麦格(北京)生物技术有限公司的M-MLV反转录酶进行反转录获得cDNA，用ZmESBL特异的引物(正向引物ZmESBL-gene-FATGCTCGCCAGGATCATCTTC,SEQ ID NO.3；反向引物ZmESBL-gene-RCTAATGGGCGATCAGCTGATC,SEQ ID NO.4)进行PCR扩增，获得了与预期大小(600bp)相符的产物，如图4所示。PCR扩增体系为50μl，包括：2×Super Multiplex PCR Mix 25μl；10μMPrimer ZmNC2-gene-F 2μl； 10μM Primer ZmNC2-gene-R2μl；DNA 1μl,ddH2O 20μl)。PCR扩增条件为：预变性 95℃2min,变性95℃30s,退火58℃30s,延伸72℃1min,由变性到延伸进行34个循环，最后延伸72℃5min。

使用天根生化科技(北京)有限公司的凝胶回收试剂盒(Cat.#DP105-3)对PCR产物进行回收和纯化，用北京全式金生物技术有限公司的pEASY-Blunt Cloning Kit试剂盒对纯化后的产物进行T载体的连接(载体图谱见图5)，然后转入大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆，使用通用引物T7/SP6进行菌落PCR扩增，电泳检测有目的大小条带的菌落为阳性重组体，将对应的菌液送至北京三博远志生物技术有限责任公司测序，获得了600bp的ZmESBL编码序列，其核苷酸序列见SEQ ID No.1，对应的蛋白质的序列为SEQ ID No.2所示。

生物信息预测ZmESBL编码一个DIR家族蛋白，通过(1)用XbaI和HindIII对含有XbaI 和HindIII酶切位点的ZmESBL片段和改造过的pCAMBIA1300-pesb1-GFP载体进行双酶切，酶切片段通过T4连接酶连接，转入大肠杆菌，通过菌落PCR扩增筛选有目的条带的阳性克隆； (2)将对应的菌液送至北京三博远志生物技术有限责任公司测序，最终获得正确的pCAMBIA1300-pesb1-GFP-ZmESBL(图谱如图6A所示)；(3)将pCAMBIA1300-pesb1 -GFP-ZmESBL转入农杆菌GV3101，挑单克隆接种到25ml YEB液体培养基(含抗生素)在200 rpm，28℃摇床培养过夜；(4)将菌液转接到250ml YEB液体培养基(含抗生素)中，调 OD600到0.2，在200rpm,28℃摇床中培养至OD600到0.8；(5)将上述过夜培养菌液在常温，3500g下离心15min，收集菌体；(6)用

培养液重新悬浮沉淀的农杆菌细胞，调节浓度OD600至0.6左右；(7)将开花的拟南芥幼苗浸入培养液中，1min，避光培养24h； (8)待种子成熟后，收取种子，在含有潮霉素的MS培养基上筛选，将阳性植株移栽到土中，成熟后收取种子；(9)将种子播种于MS培养基上，培养5天，使用激光共聚焦显微镜拟南芥根部荧光表达情况。结果如图6B所示，GFP-ZmESBL定位在拟南芥根部内皮层凯氏带。

与此同时，通过碱性品红对野生型和ZmESBL^crispr突变体根部凯氏带进行染色确定突变体凯氏带结构有缺陷。具体实验流程为：(1)将玉米种于含有培养土的10cm培养盆中，萌发 4天；(2)将玉米根取出洗净，在体视显微镜下小心的去除部分皮层组织；(3)将除去部分皮层组织的根部浸泡在含有0.005％的碱性品红染液中，过夜染色；(4)染色后，将各部组织在去离子水中洗涤3次，每次5min；(5)在激光共聚焦显微镜下观察，激发光为561nm，发射光为591-649nm。如图6C所示，ZmESBL^crispr突变体凯氏带结构有明显缺陷，表现为凯氏带形成晚于野生型，且形成的凯氏带不连续。

同时，通过野生型和ZmESBL^crispr突变体PI吸收的差异确定ZmESBL^crispr突变体根部凯氏带功能有缺陷。具体实验流程为：(1)将玉米种于含有培养土的10cm培养盆中，萌发3天； (2)将玉米根取出洗净，在2μg/ml PI溶液中避光培养24h；(3)将过夜培养的根在水中漂洗2次；(4)用锋利的刀片将根部切成0.4mm的薄片；(5)在激光共聚焦显微镜下观察，激发光为561nm，发射光为591-649nm。如图7所示，ZmESBL^crispr突变体凯氏带功能有明显缺陷，在野生型凯氏带功能成熟的区域(PI不能通过内皮层凯氏带进入中柱)，ZmESBL^crispr突变体中柱中仍能检测到荧光信号。

实施例2玉米抗盐QTL基因ZmESBL两侧有小片段的插入缺失与玉米抗盐性连锁

通过Illumina测序平台对3H-2和CIMBL45构建的F2群体中盐敏感和抗盐材料的基因组 DNA进行混池测序(测序在北京诺禾致源科技股份有限公司完成)，比对盐敏感材料和抗盐材料的全基因组测序数据，发现在盐敏感材料中，ZmESBL基因的左侧有小片段的插入缺失与玉米盐敏感性连锁，如图所示。根据全基因组测序数据，发明人设计了2对引物ZmESBL-F1/ZmESBL-R1和ZmESBL-F2/ZmESBL-R2。引物序列为：

引物ZmESBL-F1：GGGTCCCTTTTATAGCCCCA(SEQ ID NO.5)；

引物ZmESBL-R1：AATGCACTTTCAGGTCGACG(SEQ ID NO.6)；

引物ZmESBL-F2：AGCTTGATGTACGAACGCAC(SEQ ID NO.7)；

引物ZmESBL-R2：CTGCTTTCCTCGCCCTTCATC(SEQ ID NO.8)。

以ZmESBL-F1/ZmESBL-R1和ZmESBL-F1/ZmESBL-R1为引物，分别以3H-2和CIMBL45的基因组DNA为模板，使用PCR扩增50μl体系，包括2×Super Multiplex PCR Mix 25μl,10μM Primer ZmESBL-F1/ZmESBL-R1 2.5μl,10μM Primer ZmESBL-F1/ZmESBL-R1 2.5μl,DNA 2.0μl,ddH2O 18μl；PCR程序：预变性95℃2min,变性95℃30s,退火58℃30 s,延伸72℃30s,由变性到延伸进行34个循环，最后延伸72℃5min)，将PCR产物进行 4％琼脂糖凝胶电泳。

实施例3玉米抗盐QTL基因ZmESBL两侧小片段的插入缺失作为分子标记

因为基因ZmESBL的插入仅存在于盐敏感玉米自交系CIMBL45中，它导致抗盐基因ZmESBL 的蛋白翻译提前终止，影响其功能发挥，进而影响自交系的盐敏感性，因此ZmESBL-InDel插入可以用于判断个体是否抗盐的分子标记。

利用基于ZmESBL的连锁片段设计的引物ZmESBL-F1(正向)和ZmESBL-R1(反向),以及基于ZmESBL的连锁片段设计的引物ZmESBL-F2(正向)ZmESBL-R2(反向)，以上述四条引物组成引物对Ⅰ(ZmESBL-F1/ZmESBL-R1)和引物对Ⅱ(ZmESBL-F2/ZmESBL-R2)。以引物对Ⅰ和Ⅱ为引物，分别以抗盐玉米自交系3H-2和盐敏感玉米自交系CIMBL45的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR体系20μl：2×Super Multiplex PCR Mix 10μl,10μM Primer ZmESBL-F1/ZmESBL-F2 1μl,10μM Primer ZmESBL-R1/ZmESBL-R2 1μl,DNA 1μl,ddH2O 7μl。 PCR程序：预变性95℃2min,变性95℃30s,退火58℃30s,延伸72℃30s,由变性到延伸进行34个循环，最后延伸72℃5min。分别以3H-2和CIMBL45总DNA为模板，以引物对Ⅰ进行 PCR扩增，将PCR产物进行4％琼脂糖凝胶进行电泳，电泳结果表明3H-2的条带低于CIMBL45的条带；分别以3H-2和CIMBL45总DNA为模板，以引物对Ⅱ进行PCR扩增，将PCR产物进行4％琼脂糖凝胶进行电泳，电泳结果表明3H-2的条带高于CIMBL45的条带(两种条带的大小分别为250bp 和307bp)，如图9所示。因此，以引物对Ⅰ和Ⅱ可以用于玉米抗盐分子辅助育种，把基于引物对Ⅰ和Ⅱ的抗盐分子标记命名为ZmSTL1。其中各引物的序列为：

引物ZmESBL-F1：GGGTCCCTTTTATAGCCCCA(SEQ ID NO.5)；

引物ZmESBL-R1：AATGCACTTTCAGGTCGACG(SEQ ID NO.6)；

引物ZmESBL-F2：AGCTTGATGTACGAACGCAC(SEQ ID NO.7)；引物ZmESBL-R2：CTGCTTTCCTCGCCCTTCATC(SEQ ID NO.8)。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 一种玉米抗盐主效QTL及其应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 600

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 1

atgctcgcca ggatcatctt ctgcgtcgtc gtcgccgccg ccgtcctcgc cgtcgtcctc 60

cttgccaccg tctccccgct gccgcaccgg tcgggcagcc gcaagggcgc tgcaggccag 120

cgcaccttca cggtgtacat ccatcccacg gcatcgacag ccgtgcggca ggagcaagcc 180

caagggcgcc ggcaagaagc gagcgcgctg gtgttccacc accggatgac ggcggggccg 240

gagagcgcgt cgagggccgt cggcgcggcc tctgggtttc tgctcccggc gggcgagcgg 300

ggtagtgccg tggcgtcggt gttcgacacg gtgcacctga cgttcgacgg cagcgccggg 360

ctgtccggca gtctctgcgt cgaggcgagc aacgagaagg cgcgccgggc cgcgagacgc 420

cggcacggcg gggaggagga ggaggtgctg cgagtggtgg gcggcactgg cgcgttctcg 480

ttcgcgcgag ggcatgccgt cctgcggggg cagtggtccc gccccggcgc cacggcggcg 540

gcgcttcttc ttgagctgag cattttctct gctgagagtg atcagctgat cgcccattag 600

<210> 2

<211> 199

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 2

Met Leu Ala Arg Ile Ile Phe Cys Val Val Val Ala Ala Ala Val Leu

1 5 10 15

Ala Val Val Leu Leu Ala Thr Val Ser Pro Leu Pro His Arg Ser Gly

20 25 30

Ser Arg Lys Gly Ala Ala Gly Gln Arg Thr Phe Thr Val Tyr Ile His

35 40 45

Pro Thr Ala Ser Thr Ala Val Arg Gln Glu Gln Ala Gln Gly Arg Arg

50 55 60

Gln Glu Ala Ser Ala Leu Val Phe His His Arg Met Thr Ala Gly Pro

65 70 75 80

Glu Ser Ala Ser Arg Ala Val Gly Ala Ala Ser Gly Phe Leu Leu Pro

85 90 95

Ala Gly Glu Arg Gly Ser Ala Val Ala Ser Val Phe Asp Thr Val His

100 105 110

Leu Thr Phe Asp Gly Ser Ala Gly Leu Ser Gly Ser Leu Cys Val Glu

115 120 125

Ala Ser Asn Glu Lys Ala Arg Arg Ala Ala Arg Arg Arg His Gly Gly

130 135 140

Glu Glu Glu Glu Val Leu Arg Val Val Gly Gly Thr Gly Ala Phe Ser

145 150 155 160

Phe Ala Arg Gly His Ala Val Leu Arg Gly Gln Trp Ser Arg Pro Gly

165 170 175

Ala Thr Ala Ala Ala Leu Leu Leu Glu Leu Ser Ile Phe Ser Ala Glu

180 185 190

Ser Asp Gln Leu Ile Ala His

195

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 3

atgctcgcca ggatcatctt c 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 4

ctaatgggcg atcagctgat c 21

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 5

gggtcccttt tatagcccca 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 6

aatgcacttt caggtcgacg 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 7

agcttgatgt acgaacgcac 20

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 8

ctgctttcct cgcccttcat c 21

Claims

1.用于检测玉米抗盐相关的分子标记的引物组，其特征在于，所述引物组包括：引物对Ⅰ和引物对Ⅱ；所述引物对Ⅰ为引物ZmESBL-F1和引物ZmESBL-R1，所述引物对Ⅱ为引物ZmESBL-F2和引物ZmESBL-R2；所述引物ZmESBL-F1、ZmESBL-R1、ZmESBL-F2和ZmESBL-R2的序列如下：

引物ZmESBL-F1：GGGTCCCTTTTATAGCCCCA；

引物ZmESBL-R1：AATGCACTTTCAGGTCGACG；

引物ZmESBL-F2：AGCTTGATGTACGAACGCAC；

引物ZmESBL-R2：CTGCTTTCCTCGCCCTTCATC。

2.一种用于检测玉米抗盐相关的分子标记的试剂盒，其特征在于，包括根据权利要求1所述的引物组。

3.一种检测玉米是否抗盐的方法，其特征在于，所述方法包括：

利用根据权利要求1所述的引物组，或者根据权利要求2所述的试剂盒，以所述待测玉米基因组DNA为模板进行PCR扩增；如果引物对Ⅰ和引物对Ⅱ分别得到250bp和307bp的扩增片段，则所测玉米为抗盐型。