CN117230107B - 一种mRNA可变剪切-荧光素酶报告系统及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种mRNA可变剪切‑荧光素酶报告系统及其应用，该报告系统包含植物抗病基因Rpivnt1的可变剪切区域UNMA和荧光素酶报告基因LUC；通过将Rpivnt1基因的可变剪切区域UNMA和荧光素酶报告基因LUC连接在一起，构建出能有效筛选鉴定待测分子或基因是否通过植物mRNA可变剪切过程调控免疫反应的荧光素酶报告系统，有效地解决了鉴定待测分子或基因是否通过植物mRNA可变剪切过程调控免疫反应的问题，为发现和研究相关分子或基因功能提供了一种高效的报告系统工具和筛选方法。
Description
技术领域
本发明属于植物分子生物学领域，具体地说，本发明涉及一种荧光素酶报告系统及其应用，特别涉及一种特异性筛选分子或基因是否参与植物mRNA可变剪切过程的荧光素酶报告系统及其应用，可用于对外源分子或植物内源基因是否参与植物mRNA的可变剪切过程进行快速筛选。
背景技术
可变剪切（Alternative Splicing, AS）是指同一种前体mRNA（pre-mRNA）通过不同剪接方式产生不同mRNA的过程。真核生物绝大多数基因的pre-mRNA都需要经过一系列复杂的加工，如内含子剪切、 5’端加帽、3’端加尾等，才能产生成熟的mRNA以执行相关功能。通过可变剪切，同一个基因可以产生多种不同的mRNA，进而翻译成不同的蛋白质，从而增加高等生物中基因表达的复杂程度。近年不断改良的测序技术提供了更多证据表明，可变剪切在生物的环境适应和生长发育过程中发挥重要作用。据研究表明，可变剪切能够参与调控植物免疫反应。比如，可变剪切能调控植物细胞表面模式识别受体（PRRs）识别病原物相关分子模式（PAMPs）的敏感性，病原物中也存在效应分子干扰植物可变剪切进而抑制植物免疫反应的现象，植物一些抗病基因也需要发生可变剪切才能发挥功能。可变剪切在植物和病原微生物的相互作用中占据着重要地位，然而目前植物可变剪切的研究领域缺乏相关的mRNA可变剪切系统，这严重限制着植物中剪切相关蛋白的功能研究和植物中RNA可变剪切的作用机制研究。因此，开发一种新型的植物体内mRNA可变剪切报告系统是加速植物可变剪切作用机制研究的有效途径。
发明内容
本发明的目的在于提供一种mRNA可变剪切-荧光素酶报告系统及其应用。
本发明的另一目的在于提供一种mRNA可变剪切-荧光素酶报告系统的表达载体及其构建方法。
本发明的另一目的在于提供一种mRNA可变剪切-荧光素酶报告系统的转基因植物的培育方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
第一方面，本发明提供一种mRNA可变剪切-荧光素酶报告系统，该报告系统包含植物抗病基因Rpi-vnt1.1的可变剪切区域UNMA（一个在免疫激活下会发生RNA剪切的基因片段）和荧光素酶报告基因LUC；所述植物抗病基因Rpi-vnt1.1的可变剪切区域UNMA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述荧光素酶报告基因LUC的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，该mRNA可变剪切-荧光素酶报告系统的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
第二方面，本发明提供一种mRNA可变剪切-荧光素酶报告系统的表达载体，该表达载体是将所述的植物抗病基因Rpi-vnt1.1的可变剪切区域UNMA和荧光素酶报告基因LUC一起连接到植物表达载体pK7WGF2中，得到的表达载体pK7WGF2:UNMA-LUC，该载体适用于转化多种植物。
进一步的，上述表达载体的构建过程包括以下步骤：
（1）提取马铃薯的基因组DNA，利用如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物扩增出植物抗病基因Rpi-vnt1.1的可变剪切区域UNMA，获得如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
（2）利用如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的引物扩增出荧光素酶报告基因LUC，获得如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
（3）利用多片段重组的方法，将植物抗病基因Rpi-vnt1.1的可变剪切区域UNMA和荧光素酶报告基因LUC连接到植物表达载体pK7WGF2中，获得mRNA可变剪切-荧光素酶报告系统的表达载体pK7WGF2:UNMA-LUC；所述的mRNA可变剪切-荧光素酶报告系统的表达载体全序列为SEQ ID NO.4。
第三方面，本发明提供一种mRNA可变剪切-荧光素酶报告系统转基因植物的培育方法，将上述的表达载体pK7WGF2:UNMA-LUC在植物上进行稳定转化，通过抗性筛选和荧光素酶活性验证的方法获得稳定过表达mRNA可变剪切-荧光素酶报告系统的转基因植物。
第四方面，上述的mRNA可变剪切-荧光素酶报告系统，上述的表达载体，或者上述方法培育的转基因植物在快速筛选通过可变剪切过程调控免疫反应的植物诱抗分子和抗病元件中的应用也属于本发明的保护范围。
进一步的，上述的应用中所述快速筛选的方法为（1）或（2）：
（1）培育稳定过表达上述mRNA可变剪切-荧光素酶报告系统的转基因植物，向所述转基因植物的叶片上喷洒待测分子，通过检测荧光素酶活性来判断待测分子是否参与植物的可变剪切过程，实现待测分子是否参与植物可变剪切过程的快速筛选；
（2）培育稳定过表达上述mRNA可变剪切-荧光素酶报告系统的转基因植物，利用农杆菌介导的VIGS沉默技术，在所述转基因植物的叶片中沉默植物内源基因，通过检测荧光素酶活性来判断内源基因是否参与植物的可变剪切过程，实现基因是否参与植物可变剪切过程的快速筛选。
第五方面，本发明提供一种基于Rpi-vnt1.1可变剪切变化的分子或基因的筛选方法，该筛选方法为利用上述的mRNA可变剪切-荧光素酶报告系统筛选参与植物的mRNA可变剪切调控过程的分子或基因。进一步的，所述的筛选方法具体如上所述。
本发明所述的植物为双子叶植物或单子叶植物，所述的双子叶植物优选为烟草、番茄、辣椒、马铃薯，但不限于此。
在本发明的具体实施方式中，利用mRNA可变剪切-荧光素酶报告系统鉴定待测分子或基因是否参与植物的mRNA可变剪切调控过程，具体包括以下步骤；
(1) 采用上述的方法构建mRNA可变剪切-荧光素酶报告系统的表达载体pK7WGF2:UNMA-LUC；
(2)利用稳定转化的方法在本式烟草(N.benthamian)中过表达上述的mRNA可变剪切-荧光素酶报告系统，通过抗性筛选和荧光素酶活性验证的方法获得mRNA可变剪切-荧光素酶报告系统的稳定转基因烟草植物。
(3)待烟草长大后，进一步收取mRNA可变剪切-荧光素酶报告系统的稳定转基因烟草种子。
(4)直接在报告系统的烟草上共喷施待测分子和终浓度为1 mM的荧光素酶底物Luciferin，或利用农杆菌注射的方法，在报告系统的烟草幼苗上沉默植物内源基因，2周后选取沉默叶片，喷洒终浓度为1 mM的荧光素酶底物Luciferin，在Tanon 5200 Multi 全自动化学发光/荧光图像分析系统中检测荧光素酶的酶活，根据酶活数值的变化可判断待测分子或基因是否参与植物的mRNA可变剪切过程。
本发明提供的方法通过将Rpi-vnt1.1基因中发生可变剪切的UNMA序列和荧光素酶报告基因LUC的序列连接在一起，构建出能有效筛选鉴定待测分子或基因是否参与植物mRNA可变剪切过程的荧光素酶报告系统，有效地解决了鉴定待测分子或基因是否参与调控植物的mRNA可变剪切过程的问题，为发现和研究相关分子或基因功能提供了一种高效的报告系统工具和筛选方法。
本发明所述的待测分子为所有已报道和未报道的可能通过可变剪切过程调控免疫反应的化合物，例如短肽类的flg22和INF1、糖类的chitin等，但不限于此。
本发明技术方案的创新点为：①能够筛选小分子化合物，而不仅限于基因，且筛选时仅需喷施化合物、无需注射进植物叶片；②植物Luc荧光本底值为零，不需测定数值变化，仅需简单测定Luc荧光的有无即可完成筛选检测。而现有技术中公开的mRNA可变剪切-荧光素酶报告系统（201911298590X）存在本底值、需要测定Luc荧光强度的数值变化的技术问题。
本发明的有益效果：
本发明提供一种mRNA可变剪切-荧光素酶报告系统的转基因植物，直接在该报告系统的烟草叶片上喷施外源分子，或利用农杆菌介导的基因沉默技术在该报告系统的烟草叶片上沉默植物内源基因，通过荧光素酶活性的变化来判断待测分子或基因是否参与植物的可变剪切过程。本发明可以实现对待测分子或基因是否通过可变剪切过程调控免疫反应进行快速筛选，从而挖掘能够改良植物抗性的新型诱抗分子或调控元件。
附图说明
图1为RACE测序结果；结果显示马铃薯Rpi-vnt1.1基因在致病疫霉侵染过程中发生可变剪切。
图2为实时荧光定量验证马铃薯Rpi-vnt1.1基因在致病疫霉侵染过程中发生可变剪切：实时荧光定量PCR验证马铃薯Rpi-vnt1.1基因不同转录本（iso1:UNMA, iso2:NMA）的表达量在致病疫霉侵染马铃薯过程中发生显著变化。
图3为可变剪切-荧光素酶报告系统构建示意图：转录本UNMA蛋白翻译及表达正常，因此能利用荧光素酶的酶活强弱来进行定量检测；转录本NMA无法产生具有荧光素酶活性的蛋白，不能检测到荧光素酶的酶活；根据检测出的荧光素酶的酶活性高低，可以判断可变剪切的发生情况。
图4为报告系统转基因植物的荧光素酶活性检测：利用仪器检测UNMA- LUC报告系统的转基因植物的荧光素酶活性。
图5为可变剪切-荧光素酶报告系统的使用流程图。
图6为利用报告系统筛选免疫激活分子是否参与植物mRNA的可变剪切过程：利用可变剪切-荧光素酶报告系统筛选能够激活植物免疫的PAMP分子，根据荧光素酶的活性高低可以判断该PAMP分子是否参与植物mRNA的可变剪切过程。
图7为利用报告系统鉴定NbNTF6和NbBAK1参与植物mRNA的可变剪切过程的实验结果：NbNTF6和NbBAK1参与转基因烟草的可变剪切过程。
具体实施方式
以下实施例是为了更好地理解本发明，但并不限定本发明。以下实施例中所采用的实验方法，如无特殊说明，均为常规的实验方法。以下实施例中所用的试验材料等，如无特殊说明，均可从常规生化试剂公司购买。本发明实施例中所涉及引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
实施例1.验证致病疫霉菌侵染过程中，马铃薯Rpi-vnt1.1基因不同转录本表达量的变化
侵染样品总RNA提取：以马铃薯叶片为材料，利用致病疫霉JH19侵染马铃薯，选取侵染0 h、12 h、24 h的样品提取总RNA。总RNA的抽提采用诺唯赞公司FastPure®植物RNA提取试剂盒（RC411-01）按照说明书操作进行，并用NanoDrop分光光度计测定其RNA浓度。
反转录生成第一链：取l μg RNA作模板，根据诺唯赞公司HiScript®Ⅲ反转录试剂盒（R323-01）使用说明进行cDNA合成，最后定容至100 μL体系，取适量的反转录产物用于随后的实时荧光定量PCR检测。
UNMA引物序列：
上游引物：5’-ATGAATTATTGTGTTTACAAGACTTG-3’（SEQ ID NO.9）
下游引物：5’-AGTTTTTCACCCTTGAATC-3’（SEQ ID NO.10）
NMA引物序列：
上游引物：5’-AGCTAACAAAAGATGGCTGA-3’（SEQ ID NO.11）
下游引物：5’-AGTTTTTCACCCTTGAATC-3’（SEQ ID NO.10）
实时荧光定量PCR反应体系为：诺唯赞公司SYBR qPCR Master Mix（Q711-02）l0.4μL，上、下游引物各0.4μL，cDNA 2μL，ddH2O 6.8μL。
实时PCR反应程序：95℃预变性30sec；然后进入循环，95℃，5sec，60℃，34sec。扩增的循环数、熔解曲线及各样品的Ct值均由仪器自动给出。
结果显示，马铃薯Rpi-vnt1.1基因在致病疫霉侵染过程中发生可变剪切(图1)，Rpi-vnt1.1基因的不同转录本的表达量（UNMA/NMA）在致病疫霉JH19侵染马铃薯过程中发生显著变化(图2)。
实施例2.可变剪切-荧光素酶报告系统的构建：
提取马铃薯的基因组DNA，根据Rpi-vnt1.1的可变剪切序列设计引物扩增Rpi- vnt1.1的可变剪切区域UNMA序列，根据荧光素酶基因LUC序列设计引物扩增荧光素酶基因，构建可变剪切荧光素酶报告系统（图3）。
pK7WGF2:UNMA上游引物：5’-ATTCTAAGCTGACCTTTCTT-3’（SEQ ID NO.5）
pK7WGF2:UNMA下游引物：5’-TCCAGCTATTTCTATTGATT-3’（SEQ ID NO.6）
pK7WGF2:LUC上游引物：5’-ATGGAAGACGCCAAAAACAT-3’（SEQ ID NO.7）
pK7WGF2:LUC下游引物：5’-TTACACGGCGATCTTTCCGC-3’ （SEQ ID NO.8）
分别用SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8引物扩增Rpi- vnt1.1的可变剪切区域UNMA序列和荧光素酶基因LUC的序列。PCR设定程序为95℃预变性处理5分钟，95℃变性15 sec，58℃退火15 sec，72℃延伸1.5 min，循环35次，最后72℃延伸10min；PCR产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳分离，Rpi-vnt1.1的可变剪切区域UNMA和荧光素酶报告基因LUC的大小分别290 bp（如SEQ ID NO.1所示）和1653bp（如SEQ ID NO.2所示），切胶回收目的条带后用诺唯赞公司产物纯化试剂盒（DC301-01）进行回收。回收产物根据Vazyme公司多片段连接试剂盒（C115）说明书操作要求，连接到EcoRⅤ酶切的pK7WGF2载体上得到pK7WGF2:UNMA-LUC质粒（如SEQ ID NO.4所示）。
将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，随后转化的感受态涂布在壮观霉素抗性的LB平板（含壮观霉素50μg/mL）上，37℃培养箱中培养12 -16小时后利用载体引物(SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13)菌落PCR验证阳性克隆并摇菌。按照诺唯赞公司质粒提取试剂盒（DC201-01）操作，提取阳性克隆的pK7WGF2:UNMA-LUC质粒送往生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，测序引物序列为SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13。测序正确的质粒交给未米生物科技（江苏）有限公司在本氏烟草（N.benthamian）上进行稳定转化，最终获得稳定过表达的pK7WGF2:UNMA-LUC的转基因烟草植物（图4）。
实施例3.利用可变剪切-荧光素酶报告系统研究待测分子或基因是否参与植物可变剪切过程。
按照图5的操作流程，选取生长4-6周的烟草，同时喷洒已报道能够激活植物免疫的PAMP分子flg22与荧光素酶底物（Luciferin；catalogue no.7903；Biovision，USA），对照组同时喷洒ddH2O与荧光素酶底物，然后放入Tanon 5200 Multi 全自动化学发光/荧光图像分析系统中检测荧光素酶的活性，共进行三次独立的实验。结果发现，与对照组相比，flg22处理后60min内样品荧光素酶活性显著上升，表明flg22参与植物mRNA的可变剪切过程（图6）。
根据文献报道（王帅帅. 致病疫霉富含半胱氨酸类效应蛋白PC2诱导茄科植物免疫反应的分子机制研究[D].南京农业大学,2020.；Zhenchuan M,Tianqiao S,Lin Z, etal. A Phytophthora sojae Glycoside Hydrolase 12 Protein Is a Major VirulenceFactor during Soybean Infection and Is Recognized as a PAMP[J]. The Plantcell,2015,27(7).）将免疫相关基因NbNTF6和NbBAK1的沉默片段插入到pTRV2载体中，形成TRV2:NbNTF6和TRV2:NbBAK1的沉默载体，挑取转入TRV1、TRV2:NbNTF6和TRV2:NbBAK1的农杆菌，接种到试管中（液体 LB:壮观霉素浓度为50ug/mL，利福平浓度为50ug/mL）进行培养，于摇床中（28℃, 200rpm）培养12-16小时，再利用4000g离心2-3分钟收集菌体。随后用烟草缓冲液（10 mMMgCl2, 10mM MES, pH=5.6, 200uM AS）重悬菌体2次，最终配制成OD600为TRV1/TRV2:NbNTF6=0.5/0.5，TRV1/TRV2:NbBAK1=0.5/0.5的菌液。选取生长至四叶期（2-3周）的烟草，将配好的TRV1/TRV2:NbNTF6和TRV1/TRV2:NbBAK1菌液注射到烟草叶片上，每个样品注射三株不同的烟草幼苗，注射后的烟草于温室（24℃/16h 光照和22℃/8h黑暗）中培养。沉默后的烟草幼苗继续生长 2-3周后，取下叶片，按照图5的操作流程，同时喷洒荧光素酶底物（Luciferin；catalogue no.7903；Biovision，USA）和flg22/荧光素酶底物混合液，然后放入Tanon 5200 Multi 全自动化学发光/荧光图像分析系统中检测荧光素酶的活性，共进行三次独立的实验。结果发现，与未沉默的转基因烟草相比，沉默NbNTF6和NbBAK1后的转基因烟草荧光素酶活性减弱，表明NbNTF6和NbBAK1参与转基因烟草的可变剪切过程，证明该系统可以用于筛选通过可变剪切过程调控免疫反应的抗性相关基因（图7）。
Claims (10)
1.一种mRNA可变剪切-荧光素酶报告系统，其特征在于，该报告系统包含植物抗病基因Rpi-vnt1.1的可变剪切区域UNMA和荧光素酶报告基因LUC；所述植物抗病基因Rpi-vnt1.1的可变剪切区域UNMA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述荧光素酶报告基因LUC的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，该mRNA可变剪切-荧光素酶报告系统的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。
2.一种mRNA可变剪切-荧光素酶报告系统的表达载体，其特征在于，该表达载体是将权利要求1中所述的植物抗病基因Rpi-vnt1.1的可变剪切区域UNMA和荧光素酶报告基因LUC一起连接到植物表达载体pK7WGF2中，得到的表达载体pK7WGF2:UNMA-LUC。
3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，其构建过程包括以下步骤：
（1）提取马铃薯的基因组DNA，利用如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物扩增出植物抗病基因Rpi-vnt1.1的可变剪切区域UNMA，获得如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
（2）利用如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的引物扩增出荧光素酶报告基因LUC，获得如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
（3）利用多片段重组的方法，将植物抗病基因Rpi-vnt1.1的可变剪切区域UNMA和荧光素酶报告基因LUC连接到植物表达载体pK7WGF2中，获得mRNA可变剪切-荧光素酶报告系统的表达载体pK7WGF2:UNMA-LUC。
4.一种mRNA可变剪切-荧光素酶报告系统转基因植物的培育方法，其特征在于，将权利要求2或3中所述的表达载体pK7WGF2:UNMA-LUC在植物上进行稳定转化，通过抗性筛选和荧光素酶活性验证的方法获得稳定过表达mRNA可变剪切-荧光素酶报告系统的转基因植物。
5.权利要求1所述的mRNA可变剪切-荧光素酶报告系统在快速筛选待测分子或基因是否调控植物Rpi-vnt1.1 mRNA可变剪切过程中的应用。
6.权利要求2所述的表达载体在快速筛选待测分子或基因是否调控植物Rpi-vnt1.1mRNA可变剪切过程中的应用。
7.权利要求4所述方法培育的转基因植物在快速筛选待测分子或基因是否调控植物Rpi-vnt1.1 mRNA可变剪切过程中的应用。
8.根据权利要求5、6或7所述的应用，其特征在于，所述快速筛选的方法为（1）或（2）：
（1）培育稳定过表达权利要求1所述mRNA可变剪切-荧光素酶报告系统的转基因植物，向所述转基因植物的叶片上喷洒待测分子，通过检测荧光素酶活性来判断待测分子是否参与植物的可变剪切过程，实现待测分子是否参与植物可变剪切过程的快速筛选；
（2）培育稳定过表达权利要求1所述mRNA可变剪切-荧光素酶报告系统的转基因植物，利用农杆菌介导的VIGS沉默技术，在所述转基因植物的叶片中沉默植物内源基因，通过检测荧光素酶活性来判断内源基因是否参与植物的可变剪切过程，实现基因是否参与植物可变剪切过程的快速筛选。
9.一种基于Rpi-vnt1.1可变剪切变化的分子或基因的筛选方法，其特征在于，利用权利要求1所述的mRNA可变剪切-荧光素酶报告系统筛选参与植物的Rpi-vnt1.1 mRNA可变剪切调控过程的分子或基因。
10.根据权利要求9所述的筛选方法，其特征在于，该筛选方法为（1）或（2）：
（1）培育稳定过表达权利要求1所述mRNA可变剪切-荧光素酶报告系统的转基因植物，向所述转基因植物的叶片上喷洒待测分子，通过检测荧光素酶活性来判断待测分子是否参与植物的可变剪切过程，实现待测分子是否参与植物可变剪切过程的快速筛选；
（2）培育稳定过表达权利要求1所述mRNA可变剪切-荧光素酶报告系统的转基因植物，利用农杆菌介导的VIGS沉默技术，在所述转基因植物的叶片中沉默植物内源基因，通过检测荧光素酶活性来判断内源基因是否参与植物的可变剪切过程，实现基因是否参与植物可变剪切过程的快速筛选。
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Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013151058A1 (ja) * | 2012-04-03 | 2013-10-10 | 独立行政法人国立成育医療研究センター | miR-140の発現を制御するDNA及び該DNAを利用した薬剤のスクリーニング方法 |
| WO2018112356A1 (en) * | 2016-12-16 | 2018-06-21 | Two Blades Foundation | Late blight resistance genes and methods of use |
| CN110904121A (zh) * | 2019-12-17 | 2020-03-24 | 南京农业大学 | 易感基因sr30在改良农作物抗性中的应用 |
| CN110938650A (zh) * | 2019-12-17 | 2020-03-31 | 南京农业大学 | 一种mRNA可变剪切-荧光素酶报告系统及其应用 |
| CN114937473A (zh) * | 2022-07-20 | 2022-08-23 | 中日友好医院(中日友好临床医学研究所) | 基于多基因突变特征的vte风险评估模型、构建方法及应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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-
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Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013151058A1 (ja) * | 2012-04-03 | 2013-10-10 | 独立行政法人国立成育医療研究センター | miR-140の発現を制御するDNA及び該DNAを利用した薬剤のスクリーニング方法 |
| WO2018112356A1 (en) * | 2016-12-16 | 2018-06-21 | Two Blades Foundation | Late blight resistance genes and methods of use |
| CN110904121A (zh) * | 2019-12-17 | 2020-03-24 | 南京农业大学 | 易感基因sr30在改良农作物抗性中的应用 |
| CN110938650A (zh) * | 2019-12-17 | 2020-03-31 | 南京农业大学 | 一种mRNA可变剪切-荧光素酶报告系统及其应用 |
| CN114937473A (zh) * | 2022-07-20 | 2022-08-23 | 中日友好医院(中日友好临床医学研究所) | 基于多基因突变特征的vte风险评估模型、构建方法及应用 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| Phytophthora Effectors Modulate Genome-wide Alternative Splicing of Host mRNAs to Reprogram Plant Immunity;Huang J 等;《Mol Plant》;第13卷(第10期);第1470-1484页 * |
| R/Avr gene expression study of Rpi-vnt1.1 transgenic potato resistant to the Phytophthora infestans clonal lineage EC-1;Roman, M.L 等;《Plant Cell Tiss Organ Cult》;第131卷;第259–268页 * |
| Rpi-vnt1.1, a Tm-2(2) homolog from Solanum venturii, confers resistance to potato late blight;Foster SJ 等;《 Mol Plant Microbe Interact》;第22卷(第5期);第589-600页 * |
| 马铃薯与致病疫霉互作研究进展与展望;田峰奇 等;《植物保护》;第49卷(第5期);第89-110+126页 * |
| 马铃薯广谱抗病受体Rpi-vnt1.1识别致病疫霉的分子机制研究;高楚云;《中国博士学位论文全文数据库农业科技辑》(第4期);第D046-16页 * |
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