CN102002496B - 与光合作用相关的dna分子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与光合作用相关的DNA分子及其应用。本发明提供的DNA分子由如下DNA片段依次连接构成：DNA片段1、DNA片段2、DNA片段3、DNA片段4和DNA片段5；所述DNA片段1由驱动PEPC蛋白表达的启动子、PEPC蛋白的编码基因及终止子依次连接构成；所述DNA片段2由驱动PPDK蛋白表达的启动子、PPDK蛋白的编码基因及终止子依次连接构成；所述DNA片段2由驱动PPDK蛋白表达的启动子、PPDK蛋白的编码基因及终止子依次连接构成。本发明的实验证明，将多个C4途径关键酶基导入C3植物得到的转基因植物，其比野生型植物(C3植物)的光合效率高。对今后利用多基因转化技术提高作物光合效率的实践工作具有一定的借鉴意义。

Description

与光合作用相关的DNA分子及其应用

技术领域

本发明涉及一种与光合作用相关的DNA分子及其应用，尤其涉及一种DNA分子及其应用。

背景技术

植物的光合作用是指植物利用叶绿素，在可见光的照射下，将二氧化碳和水转化为有机物，并释放出氧气的生化过程。光合作用分为光反应和暗反应两个阶段。光反应在类囊体膜上进行，利用日光使水裂解，释放出氧气，并生成高能磷酸化合物(ATP)和还原型辅酶II(NADPH)。暗反应在基质中进行，利用光反应形成的ATP将CO₂还原为糖。最初人们根据光合作用中碳同化途经中CO₂固定的最初光合产物的不同，把高等植物分成C3植物、C4植物和景天酸(CAM)代谢途径植物。随着对植物光合途径的深入研究，人们发现一些植物既不属于C3植物，也不属于C4植物，故成为C3-C4中间型植物。这类植物大多具有不完整的Kranz结构，光呼吸要低于C3植物，在叶片中存在着较高的C4途径酶活性。菊科的黄顶菊属植株Flaveria和番杏科植物粟米草Mollugo中均发现了C3-C4中间型植物的存在。

C4植物的高光效能力与C4植物具有独特的叶片解剖结构、C4途径酶的功能和定位有着密切的关系。在叶片解剖结构方面，C4植物具有典型的“花环结构”(Kranz)，维管束的外侧具有一层近似环形整齐排列的叶肉细胞。C4植物叶片的维管束鞘薄壁细胞较大，其中含有许多较大的叶绿体，叶绿体没有基粒或基粒发育不良。而C3植物的维管束鞘薄壁细胞较小，不含或含有很少叶绿体。C4植物鞘细胞和叶肉细胞间有发达的胞间连丝，利于细胞间频繁的物质交流。C4植物中光合酶的功能和定位与C3植物不同。C4植物进化于C3植物，因此在C3植物中也存在着C4途径的各种关键酶，但在C3植物中表达水平较低而且组织特异性不同。C4途径是在两种不同的细胞中完成的，在叶肉细胞中PEPC固定CO₂，生成草酰乙酸，再还原为苹果酸，并转运到维管束鞘细胞中进行脱羧，释放出的CO₂经Calvin循环进行再固定。在CO₂浓缩和固定过程中涉及多种光合酶和转运器的参与，其中C4植物中主要光合作用酶如下：PEPC蛋白(J013001G17)、PPDK蛋白(J013134L02)、NADP-ME蛋白(J033092D06)、NADP-MDH蛋白(001-205-B06)、PPT蛋白(J033061B10)。

C4植物是从C3植物进化来的一种高光效种类，与C3植物相比，它们具有在高光强、高温及低CO₂浓度下保持高光效的能力。因此，若在C3植物中建立类似C4光合途径，将有可能实现改善C3植物的光合效率的目的。随着对植物C3和C4途径的深入研究以及植物基因工程的发展，利用转基因技术在C3植物中高效表达C4光合基因已经取得了一定的进展。

许多重要的粮食作物如水稻、小麦和马铃薯及经济作物烟草等都属于C3植物，由于光呼吸等原因，导致其光合速率一般都低于C4植物。随着世界人口的不断增多和可耕地面积的逐渐减少，合理的利用已有C4植物资源，加大开发干旱和半干旱地区资源，并通过对改善C3作物水稻使之具有C4植物的高光效特征，进而提高作物产量已成为了当务之急。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种DNA分子。

本发明提供的DNA分子由如下DNA片段依次连接构成：DNA片段1、DNA片段2、DNA片段3、DNA片段4和DNA片段5；

所述DNA片段1由驱动PEPC蛋白表达的启动子、PEPC蛋白的编码基因及终止子依次连接构成；

所述DNA片段2由驱动PPDK蛋白表达的启动子、PPDK蛋白的编码基因及终止子依次连接构成；

所述DNA片段3由驱动NADP-ME蛋白表达的启动子、NADP-ME蛋白的编码基因及终止子依次连接构成；

所述DNA片段4由驱动PPT蛋白表达的启动子、PPT蛋白的编码基因及终止子依次连接构成；

所述DNA片段5由由驱动NADP-MDH蛋白表达的启动子、NADP-MDH蛋白的编码基因及终止子依次连接构成。

所述DNA片段1、DNA片段2、DNA片段3、DNA片段4和DNA片段5中的各启动子相同或者不同；所述DNA片段1、DNA片段2、DNA片段3、DNA片段4和DNA片段5中的各终止子相同或者不同。

所述DNA片段1、DNA片段2、DNA片段3、DNA片段4和DNA片段5中的各启动子相同，所述各启动子均为CaMV35S；

所述DNA片段1、DNA片段2、DNA片段3、DNA片段4和DNA片段5中的各终止子相同，所述各终止子均为T-nos。

所述DNA分子为序列表中的序列1所示的核苷酸。

含有所述的DNA分子的重组表达载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒也是本发明保护的范围。

所述重组载体为pCDMAR-PKMHT-NptII，其为将所述的DNA分子整合到载体pCDMAR-key-NptII上得到的载体。

所述载体pCDMAR-key-NptII通过如下方法制备：

1)以质粒pYLTAC747N为模板，引物：5’-GGAATTCCaggatccaagcttgtcg-3’；5’-GCTCTAGAaaacactgatagtttaaac-3’进行PCR扩增，得到PCR产物即为含有loxP位点和归位内切酶I-Sce I的关键序列；

2)用EcoR I和Xba I双酶切上述步骤1)的PCR产物，与同样酶酶切得到的去选择标记质粒pCDMAR-hyg连接，得到接受载体pCDMAR-key-hyg；

3)再用Xho I酶切质粒pCAMBIA2300，与同样酶酶切上述步骤2)质粒pCDMAR-key-hyg得到的载体片段连接，得到适用于双子叶植物的多基因接受载体pCDMAR-key-NptII。

本发明的另一个目的是提供一种培育光合效率提高的转基因植物方法。

本发明提供的方法为将所述的DNA分子导入目的植物，得到转基因植物；所述转基因植物光合效率高于所述目的植物。

所述的DNA分子通过所述的重组表达载体导入目的植物。

所述转基因植物光合效率高于所述目的植物体现在所述转基因植物的净光合速率高于所述目的植物。

所述目的植物为C3植物。

所述C3植物优选为C3光合类型双子叶植物，具体为烟草。

本发明的实验证明，将多个C4途径关键酶基导入C3植物得到的转基因植物，其比野生型植物(C3植物)的光合效率高。对今后利用多基因转化技术提高作物光合效率的实践工作具有一定的借鉴意义。

附图说明

图1为接受载体pCDMAR-key-NptII质粒图谱

图2为供给载体pYLVS-35nos的质粒图谱

图3为供给载体pYLSV-35nosf的质粒图谱

图4为水稻PEPC、PPDK、NADP-ME、NADP-MDH和PPT基因的克隆

图5为双T-DNA、多基因表达载体整合过程示意图

图6为双T-DNA、多基因植物表达载体pCDMAR-PKMHT-NptII的质粒图谱和酶切鉴定

图7为植物表达载体pCDMAR-PKMHT-NptII的PCR鉴定

图8为双T-DNA多基因植物表达载体在农杆菌中的稳定性鉴定

图9为烟草Xanthi在不同培养阶段的生长情况

图10为PCR检测T0代转基因烟草的共转化情况

图11为转质粒pCDMAR-PKMHT-NptII T1代烟草植株的Southern blot分析

图12为转质粒pCDMAR-PKMHT-NptII T1代转基因烟草中C4光合基因的表达分析

图13为转多基因烟草T1代植株净光合速率

图14为转多基因烟草T1代植株叶绿素荧光参数Fv/Fm的比较

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、双T-DNA、多基因植物表达载体pCDMAR-PKMHT-NptII的获得

1、双T-DNA多基因组装载体系统的建立

1)接受载体pCDMAR-key-NptII的构建

设计PCR引物：5’-GGAATTCCaggatccaagcttgtcg-3’；5’-GCTCTAGAaaacactgatagtttaaac-3’，以质粒pYLTAC747N(Lin，L.，Liu，Y.G.，Xu，X.，andLi，B.(2003).Efficient linking and transfer of multiple genes by a multigeneassembly and transformation vector system.Proc.Natl.Acad.Sci.100，5962-5967，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。)为模板，进行PCR扩增，得到PCR产物即为含有loxP位点和归位内切酶I-Sce I的关键序列。

用EcoR I和Xba I双酶切上述的PCR产物，并回收200bp的关键序列，与同样酶酶切得到的去选择标记质粒pCDMAR-hyg(谭登峰等，2008。可去除选择标记的DREB基因双T-DNA载体共转化玉米。四川农业大学学报，26(1)：15-19，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。)片段连接，得到适用于单子叶植物的接受载体pCDMAR-key-hyg。再用Xho I酶切质粒pCAMBIA2300(谢迎秋等，2000。棉花曲叶病毒互补链基因启动子功能区的缺失分析。中国科学C辑，30(5)：528-534，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。)，回收878bp的片段(新霉素磷酸转移酶基因)，与同样酶酶切得到的质粒pCDMAR-key-hyg载体片段连接，得到适用于双子叶植物的多基因接受载体pCDMAR-key-NptII。该载体的结构示意图如图1所示，其中，A为接受载体pCDMAR-key-NptII的质粒图谱：MAR，Matrixattachmentregion；LB，Left border；RB，Right border；NptII，neomycin phosphotransferase Ⅱ；B为接受载体pCDMAR-key-NptII限制性酶切图谱：1，λDNA/Hind III Marker；2，EcoRI；3，Hind III；4，BamH I+NcoI；5，Not I；6，1kb ladder。

2)供给载体pYLVS-35nos和pYLSV-35nosf的构建

用带有Sac I/Hind III酶切位点的引物5’-CGAGCTCGTCCCCAGATTAGCCTTTTC-3’和5’-CCCAAGCTTTCCCCCGTGTTCTCTCCAAATG-3’以质粒PBI121(chen et al.Complete sequenceof the binary vector pBI121 and its application in cloning T-DNA insertion fromtransgenic plantsMolecular Breeding，2003，11：287-293，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。)为模板，扩增CaMV35S序列酶切后回收846bp的CaMV35S片段，与经过同样酶切得到的质粒pYLSV(Lin，L.，Liu，Y.G.，Xu，X.，and Li，B.(2003).Efficientlinking and transfer of multiple genes by a multigene assembly and transformationvector system.Proc.Natl.Acad.Sci，100，5962-5967，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。)载体片段连接，得到质粒pYLSV-35S。

Sac I/Cla I酶切质粒pMD-stnos(用带有酶切位点Sac I和Cla的引物GAGCTCCccgatctagtaacatag和ATCGATGATCGTTCAAACATTTGG以质粒PBI121为模板扩增T-nos序列，连到pMD18-T simple(Takara，D103A)载体上)回收284bp的Tnos片段，插入质粒pYLSV-35S的Sac I/Cla I的位点，获得中间质粒pYLSV-35nos。通过Hind III/Cla I双酶切质粒pYLSV-35nos，回收CaMV35S-Tnos片段，插入到质粒pYLVS(Lin，L.，Liu，Y.G.，Xu，X.，andLi，B.(2003).Efficient linking and transfer of multiple genes by a multigeneassembly and transformation vector system.Proc.Natl.Acad.Sci，100，5962-5967.公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。)的Hind III和Cla I位点，获得了含有CaMV35S启动子和Tnos终止子的质粒pYLVS-35nos。该质粒的结构示意图见图2所示，其中(A)供给载体pYLVS-35nos的质粒图谱：Tnos，terminator of nopaline synthase；P-35s，promoter of CaMV35S；(B)供给载体pYLVS-35nos的限制性酶切图谱：1，1kbladder/1+2+3+4+5+6+8+10kb；2，Hind III+Kpn I；3，Pst I；4，Pst I+Sal I；5，I-Sce I+KpnI；6，PI-Sce I+Hind III。

通过Hind III/Cla I酶切质粒pYLSV-35nos，分别回收CaMV35S-Tnos片段(Klenow平端化)。pYLSV骨架通过Hind III酶切，Klenow平端化，CIAP去磷酸化。然后两者经T4 DNA连接酶环化后获得质粒pYLSV-35nosf(一个CaMV35S)。pYLSV-35nosf的结构示意图如图3所示，(A)供给载体pYLSV-35nosf的质粒图谱：Tnos，terminator of nopaline syynthase；P-35s，promoter of CaMV35S；(B)供给载体pYLSV-35nosf的限制性酶切图谱：1，DL2000，Marker/100+250+500+750+1000+2000+3000+5000bp；2，Sca I；3，Bgl II；4，Bgl II+SalI；5，Kpn I；6，Pst I+BamH I。

2、水稻C4光合基因的克隆

1)植物总RNA的提取

总RNA的提取按LiCl法进行，并稍加改进。取1.0g水稻两优2186(Oryza sativa LY2186，Song，et al.Comparative Transcriptional Profiling and Preliminary Study on HeterosisMechanism of Super-Hybrid Rice.Mol Plant.2010，1-14，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。)叶片于液氮中研磨成粉末状，转移到含2ml提取Buffer、2ml水饱和酚的7ml离心管中，剧烈振荡混匀1min后，置冰上2-3min；加入2ml氯仿/异戊醇(49∶1)混匀，4,000rpm 4℃离心10min；取上清，加入2ml 8M LiCl，冰上放置3h；10,000rpm 4℃离心10min，沉淀经70％乙醇洗涤两次后溶于1ml DEPC处理的水中，加入1倍体积的水饱和酚抽提一次，然后加入1/10体积的5M NaCl去除多糖；取上清，加入1倍体积的氯仿/异戊醇(49∶1)抽提一次，在上清中加入1/10体积的3M NaAc(pH4.5)，2倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀1h；10,000rpm离心10min，沉淀用70％乙醇洗涤一次，干燥后溶于适当体积DEPC处理的水中，得到总RNA，-70℃保存备用。

2)RT-PCR克隆水稻C4光合基因

(1)第一链的合成

先在每管中加入如下组分：上述得到的总RNA样品(3-5μg)、4μl oligo dT15(10μM)、RNase Inhibitor 4μl(40U/μl)，加DEPC处理的水至48μl，用手轻弹后稍离心，置65℃变性15min后立即置冰上冷却2min。

向每个冷却的样品管中加入下列组分，16μl 5×第一链反应缓冲液、8μl二硫苏糖醇(0.1M)，4μl dNTPs(10mM)。在42℃条件下反应2min后，加入4μl M-MLV反转录酶，然后在42℃反应1h，于72℃加热15min。将反转录产物cDNA第一链置于-20℃中备用。

(2)目的基因的扩增

以反转录出的cDNA第一链作为模板进行目的基因的克隆。20μl反应体系中包括：2×PCR GC buffer I 10μl，基因特异引物1μl(终浓度0.5-1pM)、dNTPs 1.6μl(终浓度200μM)、LA-Taq酶0.3μl(5U/μl)及cDNA第一链1μl作模板，用无菌双蒸水补足。

PCR反应条件如下：94℃预变性6min。

72℃继续延伸5min

PCR产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，采用AXYGEN公司的DNA凝胶回收试剂盒进行回收后，连接到测序载体pMD18-T(购自Takara公司，目录号为D101A)上进行序列测定。

基因特异引物序列如下：

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(PEPC)扩增引物：

Ppc1：5’-TTG CCC TCC AAT CTA TCT CCG-3’

Ppc2：5’-TAG CAT CGG CGA ACG TA-3’

扩增的目的片段为3,149bp。将该PCR产物与pMD18-T连接得到的质粒送去测序，结果为该PCR产物的基因具有序列表中序列1自5’末端第889-4037位核苷酸，命名为PEPC，该基因的编码区为序列1自5’末端第1054-3933位核苷酸，该基因编码的蛋白命名为PEPC，其genbank号为J013001G17。该质粒为将序列1自5’末端第889-4037位核苷酸与pMD18-T连接得到的质粒，命名为pMD18-PEPC。

丙酮酸磷酸双激酶基因(PPDK)扩增引物：

Ppdk1：5’-CGAATCTCTCTCCGATCCCAG，-3’

Ppdk2：5’-ACC TTT ATT CGA TTC TTC GTC GTC-3’

扩增的目的片段为3,147bp，将该PCR产物与pMD18-T连接得到的质粒送去测序，结果为该PCR产物的基因具有序列表中序列1自5’末端第5291-8437位核苷酸，命名为PPDK，该基因的编码区为序列1自5’末端第5358-8204位核苷酸，该基因编码的蛋白命名为PPDK，其genbank号为J013134L02。该质粒为将序列1自5’末端第5253-8437位核苷酸与pMD18-T连接得到的质粒，命名为pMD18-PPDK。

NADP苹果酸酶基因(NADP-ME)扩增引物：

Me1：5’-TAT ACC GGC CTC CTC CCT CCC ATT A-3’

Me2：5’-GGC GAC AAT GGC AAC ACA ACA TA-3’

扩增的目的片段为2,122bp，将该PCR产物与pMD18-T连接得到的质粒送去测序，结果为该PCR产物的基因具有序列表中序列1自5’末端第9651-11772位核苷酸，命名为NADP-ME，该基因的编码区为序列1自5’末端第9775-11691位核苷酸，该基因编码的蛋白命名为NADP-ME，其genbank号为J033092D06。该质粒为将序列1自5’末端第9651-11772位核苷酸插入到pMD18-T中得到的质粒，命名为pMD18-ME。

磷酸烯醇式丙酮酸转运蛋白基因(PPT)扩增引物：

Ppt1：5’-CAG CAA CTA CGG CTT CAA-3’

Ppt2：5’-TCC AAT CAG GCT CCA TAC A-3’

扩增的目的片段为959bp，将该PCR产物与pMD18-T连接得到的质粒送去测序，结果为该PCR产物的基因具有序列表中序列1自5’末端第13031-13989位核苷酸，命名为PPT，该基因的编码区为序列1自5’末端第13067-13862位核苷酸，该基因编码的蛋白命名为PPT，其genbank号为J033061B10(请提供)。该质粒为将序列1自5’末端第13031-13989位核苷酸插入到pMD18-T中得到的质粒，命名为pMD18-PPT。

苹果酸脱氢酶基因(NADP-MDH)扩增引物：

Mdh1：5’-CAA GCT CAG CCT GCC TAT CCA C-3’

Mdh2：5’-CCG TCG AAA ACC CCT GTG AAA TAA-3’

扩增的目的片段为1,387bp，将该PCR产物与pMD18-T连接得到的质粒送去测序，结果为该PCR产物的基因具有序列表中序列1自5’末端第15133-16519位核苷酸，命名为NADP-MDH，该基因的编码区为序列1自5’末端第15165-16466位核苷酸，该基因编码的蛋白命名为NADP-MDH，其genbank号为001-205-B06。该质粒为将序列1自5’末端第15133-16519位核苷酸插入到pMD18-T中得到的质粒，命名为pMD18-MDH。

以上5个基因扩增的产物进行电泳，结果见图4所示，其中，A-E分别为PEPC，PPKD，NADP-ME，NADP-MDH和PPT。

3、用于双子叶植物转化的C4光合基因中间载体的构建

1)质粒pYLVS-PEPC的构建

用Hind III/Sma I双酶切质粒pMD-PEPC，再进行Klenow平端化，回收3,181bp片段，与经过Sma I酶切得到的pYLVS-35nos载体片段连接，得到转化子。提取转化子的质粒送去测序，结果为该质粒为将序列表中序列1自5’末端第889-4037位核苷酸插入pYLVS-35nos载体的Sma I酶切位点间得到的质粒，命名为pYLVS-PEPC，其含有PEPC表达框(CaMV35S-PEPC-Tnos)。

2)质粒pYLSVf-PPDK的构建

用Nru I/Xba I双酶切质粒pMD-PPDK，再进行Klenow平端化，回收3,152bp片段，与经过Sma I酶切得到的pYLSV-35nos载体片段连接，得到转化子pYLSV-PPDK。Kpn I/Xba I双酶切质粒pYLSV-PPDK，回收3,152bp PPDK基因插入到质粒pYLSV-35nosf的Kpn I/XbaI位点，获得携有PPDK表达框(CaMV35S-PPDK-Tnos)的质粒pYLSVf-PPDK。其含有PPDK表达框(CaMV35S-PPDK-Tnos)。

3)质粒pYLVS-ME的构建

用Sal I/Xba I双酶切质粒pMD18-ME，再进行Klenow平端化，回收2,136bp片段，与经过Sma I酶切并去磷酸化处理的供体质粒pYLVS-35nos载体片段连接，得到转化子pYLVS-ME。

4)质粒pYLSVf-MP的构建

用Sal I/Xba I双酶切质粒pMD18-MDH，回收1387bp片段，与经过Sal I/Xba I酶切得到的pYLSVf-35nos载体片段连接，得到转化子pYLSVf-MDH。

以水稻两优2186(Oryza sativa LY2186)叶片cDNA为模板，带有BamH和KpnI酶切位点的引物对5’-CGGATCCCAGCAACTACGGCTTCAA-3’和5’-GGGGTACCTCCAATCAGGCTCCATAC-3’扩增PPT，回收酶切后连接到到用相同的酶消化的pYLSV-35nosf质粒上，得到重组质粒，然后以该重组质粒为模板用带有PstI酶切位点的引物5’-AACTGCAGGTCCCCAGATTAGCCT-3’和5’-AACTGCAGAATTCCCCGATCTAGTAA-3’扩增带有35S、PPT及T-nos的一段序列，将该扩增片段经Pst I酶切后回收片段与用Pst I消化的pYLSVf-MDH载体片段连接，得到具有NADP-MDH和PPT两个基因表达框的转化子pYLSVf-MP。

4、转化双子叶植物的C₄光合多基因植物表达载体的组装

双子叶植物多基因组装载体系统由一个接受载体pCDMAR-key-NptII和两个供给载体pYLVS-35nos和pYLSV-35nosf组成，在进行多基因整合之前，已经事先将水稻PEPC、PPDK、NADP-ME、NADP-MDH和PPT五个基因分别构建到这两个供给载体上，形成了中间载体pYLVS-PEPC、pYLSVf-PPDK、pYLVS-ME和pYLSVf-MP。将这些质粒依次同接受载体pCDMAR-key-NptII进行整合，构建成含有五个基因的双T-DNA多基因植物表达载体，具体整合过程如如图5所示，具体如下：

第一次整合的目的是将水稻PEPC基因引入接受载体pCDMAR-key-NptII，这需要通过中间载体pYLVS-PEPC与接受载体pCDMAR-key-NptII进行体内整合来实现，组装过程示意图见图5。首先将pYLVS-PEPC和接受载体pCDMAR-key-NptII按1∶5的摩尔比例共转化到表达Cre酶的大肠杆菌NS3529(蒋涨等，2006。通用型奶牛多位点基因打靶载体系统的构建。暨南大学学报(自然科学版)，27(3)：470-475，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。)感受态中，涂布在含有卡那霉素和氯霉素双抗板上进行筛选。此时双抗板上的克隆包含3种质粒：中间载体pYLVS-PEPC、接受载体pCDMAR-key-NptII和共整合质粒。然后随机挑取5-10个克隆提取质粒后混合，按不同浓度梯度稀释后转化到DH10B(上海雷浩信息科技有限公司，LHF0161)(不含有Cre酶)感受态中，通过筛选分离到共整合质粒pCDMAR-P-b，大量扩繁。

pCDMAR-P-b纯化后用I-Sce I切除pYLVS骨架，在T4 DNA连接酶的作用下利用人工合成的接头LS(gcggccgcttat)使其环化。通过上述操作后，去除了最初接受载体上的I-Sce I位点，便于以后步骤重复使用。将环化质粒转化到DH10B后，在含有氯霉素的培养基上对克隆进行敏感性鉴定，对不抗的克隆经Not I酶切筛选后，得到新质粒pCDMAR-P-NptII。质粒pCDMAR-P-NptII不含I-Sce I位点，但通过共整合引入了一个新的PI-Sce I位点，这个新形成的质粒，作为下一次整合的接受载体。

第二次整合是通过中间载体pYLSVf-PPDK将PPDK基因引入接受载体pCDMAR-P-NptII。首先将pYLSVf-PPDK和接受载体pCDMAR-P-NptII按照1∶5的摩尔比例共转化到含有Cre重组酶基因的大肠杆菌NS3529感受态细胞中，涂在含有卡那霉素和氯霉素双抗平板上，双抗上生长的克隆包含三种类型的质粒：中间载体pYLSVf-PPDK、接受载体pCDMAR-P-NptII和共整合的质粒。通过混收双抗的菌落，提取混合质粒，通过稀释不同梯度来转化到不含有Cre重组酶基因的大肠杆菌DH10B中，使稳定的共整合质粒pCDMAR-PK-b得以分离，并大量繁殖。

pCDMAR-PK-b质粒进行纯化后用PI-Sce I切除pYLSV的骨架，然后通过T4 DNA连接酶把酶切过的整合质粒片段同人工合成的接头LV(gcggccgcgcac)连接成环状质粒，经过这一步骤后去除了PI-Sce I位点，便于以后操作中重复使用。将环化质粒转化到DH10B，先用含卡那霉素的培养基选择抗卡那霉素的克隆，再用含氯霉素的培养基对克隆进行敏感性鉴定，得到不抗氯霉素的克隆即为新质粒pCDMAR-PK-NptII。质粒pCDMAR-PK-NptII不含有PI-Sce I位点，但引入了一个新的归位内切酶I-Sce I识别位点。这个新质粒将作为下一步整合的接受载体。

第三次整合是通过中间载体pYLVS-ME将水稻NADP-ME基因引入接受载体pCDMAR-PK-NptII。首先将pYLVS-ME和pCDMAR-PK-NptII按照1∶5的摩尔比例共转化到表达Cre重组酶的大肠杆菌NS3529感受态中，然后在含有卡那霉素和氯霉素双抗平板上进行培养。通过混收双抗的菌落，提取混合质粒，通过稀释不同梯度来转化不含有Cre重组酶基因的大肠杆菌DH10B中，分离到稳定共整合质粒pCDMAR-PKM-b，并大量扩繁。

pCDMAR-PKM-b质粒经纯化后用归位内切酶I-Sce I切除pYLVS的骨架，然后利用T4 DNA连接酶把酶切过的整合载体同接头LS(gcggccgcttat)连接成环状质粒，这一步骤的目的是去除了I-Sce I位点，便于以后重复使用该位点。将环状质粒转化到DH10B，在含有卡那霉素的培养基上进行培养，再对克隆进行氯霉素敏感性鉴定，对不抗氯霉素的克隆经过Not I酶切鉴定得到新质粒pCDMAR-PKM-NptII。该质粒不含有I-Sce I位点，同时引入了一个新的归位内切酶PI-Sce I识别位点。这个新质粒将作为下一步整合的接受载体。

第四次整合是通过中间载体pYLSVf-MP将基因NADP-MDH和PPT引入到接受载体pCDMAR-PKM-NptII。首先将pYLSVf-MP和pCDMAR-PKM-NptII按照1∶10的摩尔比例一起转化到表达Cre重组酶的大肠杆菌NS3529感受态中，在含有卡那霉素和氯霉素筛的培养基上进行筛选。然后随机挑取10个克隆进行混合培养。通过提取混合质粒后，稀释成不同浓度梯度后转化到不含Cre重组酶的大肠杆菌DH10B感受态中，通过大量的筛选分离到共整合的质粒pCDMAR-PKMHT-b，经过Not I酶切鉴定得到新质粒pCDMAR-PKMHT-b，进行大量繁殖。

纯化pCDMAR-PKMHT-b用PI-Sce I酶切去除pYLSV骨架，然后用T4 DNA连接酶将酶切质粒和接头LV(gcggccgcgcac)连接成环状质粒。经过这一步骤后去除了PI-Sce I位点，并且失去了氯霉素抗性。将环化质粒再次转化到大肠杆菌DH10B感受态中，涂布在含有卡那霉素的培养基，并对长出的克隆进行氯霉素敏感性测验，保留氯霉素敏感的克隆以便做进一步的筛选。通过大量筛选获得新质粒pCDMAR-PKMHT-NptII。经过测序，载体pCDMAR-PKMHT-NptII为将序列表中序列1自5’末端第1-16802位核苷酸整合到载体pCDMAR-key-NptII上得到的载体。序列1也可人工合成。

序列1自5’末端第1-846位为驱动PEPC蛋白表达的CaMV35S启动子；自5’末端第4089-4338位为T-nos终止子；

序列1自5’末端第4430-5275位为驱动PPDK蛋白表达的CaMV35S启动子；自5’末端第8484-8733位为T-nos终止子；

序列1自5’末端第8781-9626位为驱动NADP-ME蛋白表达的CaMV35S启动子；自5’末端第11824-12073位为T-nos终止子；

序列1自5’末端第12165-13010位为驱动PPT蛋白表达的CaMV35S启动子；自5’末端第14019-14268位为T-nos终止子；

序列1自5’末端第14276-15121位为驱动NADP-MDH蛋白表达的CaMV35S启动子；自5’末端第16553-16802位为T-nos终止子。

整合后的pCDMAR-PKMHT-NptII的结构示意图如图6A所示，用一些限制酶进行酶切，结果如图6B所示，其中1，λDNA/HindIII Marker；2，I-Sce I；3，Xba I+Kpn I；4，SacI；5，1kb ladder；6，Not I；7，Spe I；8，Kpn I；9，DL2000Marker/100+250+500+750+1000+2000+3000+5000bp，从图中看出，载体pCDMAR-PKMHT-NptII构建正确。

将pCDMAR-PKMHT-NptII进行PCR鉴定，引物如表所示：

结果如图7所示，其中(A)植物表达载体pCDMAR-PKMHT-NptII引物位置示意图；(B)植物表达载体pCDMAR-PKMHT-NptII的PCR鉴定：1-5，PCR amplification of PEPC、PPDK、NADP-ME、NADP-MDH and PPT；7-11，PCR amplification using primer pairs of p1/p21、p10/p2、p15/p7、p16/p12 and p5/p6.6，12 stand for DL2000 Marker，从图中看出，载体pCDMAR-PKMHT-NptII有PEPC、PPDK、NADP-ME、NADP-MDH and PPT这五个基因，进一步证明载体构建正确为阳性。

5、农杆菌电击感受体的制备及细菌转化

将农杆菌EHA105(邵敏等，2004。转hrfAXoo基因水稻对白叶枯病的抗性。南京农业大学学报，27(4)：36-40，公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。)菌株从-70℃冰箱中取出，在含有利福霉素(50mg/L)的YEB固体培养基上连续转划活化2次，挑取单克隆接种于10ml YEB液体培养基中，于28℃、220rpm条件下振荡培养16-18h后按1％-2％的比例转接于500ml YEB培养基中，培养至OD600约0.5-0.6，4,000g离心10min收集菌体。用10％甘油重悬3次后，按每管40μl进行分装，-70℃保存备用。

参照BIO-RAD公司电穿孔仪的说明，将提取纯化好的pCDMAR-PKMHT-NptII质粒加入到农杆菌EHA105感受态中，置冰上5min后进行电击转化。电击条件为：1.8KV，4.5ms。电击后将菌体转入1ml SOC液体中，于28℃培养2h，取50μl涂于含有50mg/L卡那霉素和50mg/L利福霉素的YEB固体培养基上，于28℃培养2天。挑取单转化子转划于YEB培养基上，培养2天。挑取少量菌体28℃培养16h-18h后，取出少许加入适量甘油，-70℃保存备用，部分用来提取质粒进行完整性鉴定。

分别取转化农杆菌前的质粒pCDMAR-PKMHT-NptII、转化农杆菌后的质粒pCDMAR-PKMHT-NptII、从农杆菌提取质粒回激大肠杆菌的质粒pCDMAR-PKMHT-NptII的DNA各4μl，经Kpn I酶切1h后，在0.8％琼脂糖凝胶上电泳，以pCDMAR-PKMHTRB-NptII为对照，结果如图8所示，其中，1为构建pCDMAR-PKMHT-NptII的原始质粒，2为构建pCDMAR-PKMHT-NptII在农杆菌中的质粒，3为构建pCDMAR-PKMHT-NptII回激大肠杆菌的质粒；M，1kb ladder，从图中看出，三者酶切谱带一致，说明质粒在农杆菌中稳定存在。

将转化农杆菌后的质粒命名为EHA105/pCDMAR-PKMHT-NptII。

实施例2、转PKMHT烟草的获得和功能研究

一、转PKMHT烟草的获得

1、农杆菌介导的烟草遗传转化

1)烟草无菌苗的准备

取适量烟草(Nicotiana tabacum cv.Xanthi，王转梅等，2009。烟草品种Xanthi NN碱性β-1，3-葡聚糖酶基因的克隆与生物信息学分析。江苏农业科学，1：28-31，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。)种子用双蒸水37℃浸泡3-4h，用30％(质量百分含量)次氯酸钠水溶液灭菌8-10min，在超净台中用无菌水冲洗3-5遍，放在无菌滤纸上自然吹干，然后转接于MS培养基中25℃，光/暗周期为16/8h发芽。待子叶充分展开后，转移到培养瓶中继续培养，长至6-7片真叶时备用。

2)转化用农杆菌的准备

将农杆菌EHA105/pCDMAR-PKMHT-NptII在含有50mg/L卡那霉素的YEB固体培养基上划线，28℃避光培养至长出1mm大小的单菌落，挑取单菌落再次划线转接于同样抗性的固体培养基上，培养至生长旺盛期(约2天)。取少量菌体转接于20ml的含有相应抗生素的YEB液体培养基中，于28℃220rpm振荡培养过夜。次日以2％的接种量转接于20ml不含抗生素的YEB液体培养基中，并补加乙酰丁香酮至终浓度100μM/L。继续振荡培养3-4小时，到达对数生长中期时，用3倍以上体积的液体培养基稀释到肉眼稍见浑浊即可(OD600约0.1)，以备转化。

3)改良叶盘法转化烟草

选取完全展开的烟草无菌苗叶片，用直径为0.9cm打孔器制成叶盘，在菌液中浸泡10min。取出叶盘，用无菌滤纸吸干后，转入覆盖有一层无菌滤纸的共培养培养基，于25℃暗培养2-3天后，将叶盘转入继代培养基中。在继代培养基中光照培养(光/暗周期为16/8h)3天后，将叶盘转入筛选培养基。继续培养7-10天后，将叶盘转入再生培养基。15-20天后即可观察到叶片边缘长出愈伤或丛生再生芽，1个月左右叶片边缘的再生芽长至1-2cm，转入新的生根培养基中，待根充分发育后，将幼苗转至温室栽培，得到18株T0代转PKMHT烟草，具体生长情况见图9所示。

采用同样的方法将空载体pCDMAR-key-NptII转入野生型烟草中，得到转空载体烟草。

2、转基因植物的PCR检测

1)转基因植物基因组DNA的提取

(1)转基因植物微量基因组DNA的提取

从栽种在营养钵的T0代转PKMHT烟草分单株剪取少量叶片，置于放有钢珠的2ml的eppendorf管中，置液氮中冷冻5min后于打样机上粉碎；加入400μl CTAB提取液，于65℃温浴20min，然后用等体积氯仿抽提，10,000rpm离心6min；取上清于2倍体积无水乙醇中沉淀20min后，10,000rpm离心5min，用70％乙醇清洗沉淀2次，自然风干后溶于50μl超纯水中，4℃保存备用。

(2)转基因植物大量基因组DNA的提取

采用CTAB法大量提取植物基因组DNA(Murray and Thompson，1980)。取1.0g T0代转PKMHT烟草的幼嫩叶片，于液氮中快速研磨成粉末状，转移至7ml离心管中，加入3ml 65℃预热的CTAB提取液，充分混匀，65℃保温30-40min，不时轻轻振荡以免成团。向管中加入3ml氯仿/异戊醇(24∶1)，充分振荡使其成为乳白色。室温下10,000rpm离心10min，将上清移到新的洁净的7ml离心管中。为了使提取的基因组DNA更加纯净，加入3ml氯仿/异戊醇(24∶1)，10,000rpm离心10min，小心吸出上清液于另一干净的7ml离心管中，加入2/3体积的预冷的异丙醇，缓慢转动混匀离心管，-20℃放置1小时以上。用枪头挑出成团的DNA，放入1.5ml eppendorf管中，加入1ml 70％的乙醇洗涤2-3次，无水乙醇洗涤1次后自然吹干，加入0.1ml TE溶解。取1μl DNA样品于0.8％琼脂糖凝胶电泳，于紫外分光光度计上测定DNA的浓度和纯度，4℃保存备用。

2)T0代转PKMHT烟草的PCR检测

以提取T0代转PKMHT烟草的微量DNA作为PCR模板，利用引物对NptII-1：5’-aatataatattttattttctccc-3’/NptII-2：5’-ATGGCTAAAATGAGAATATCACC-3’和Pc-1：5’AGGTATCCGAGGACGACAAGC 3’/Pc-2：5’CGTCTCCTCGATGTCGGACT 3’对已分析卡那霉素抗性的植株进行PCR检测。30μl反应体系中包括：10×PCR buffer 3μl、基因特异引物1μl(终浓度0.5-1pM)，dNTPs 2μl(终浓度200μM)、rTaq酶0.3μl(1.5U)及DNA模板，用无菌双蒸水补足。

PCR反应条件如下：94℃预变性6min，

72℃继续延伸10min

取出5μl PCR扩增产物在1.2％琼脂糖凝胶上进行电泳检测。以pCDMAR-PKMHT-NptII构建质粒为阳性对照，以野生型烟草和转空载体烟草为负对照。

结果如图10所示，M，DL2000marker；P为阳性对照(pCDMAR-PKMHT-NptII)；ck，野生型烟草；T4-T93为T0代转PKMHT烟草的不同株系；从图中看出，在转化载体pCDMAR-PKMHT-NptII获得的10个转基因株系及阳性对照均扩增到了预期的774bp的NptII特异条带和355bp的PEPC特异条带，而野生型烟草未扩增到目的条带。

野生型烟草和转空载体烟草的结果无显著差异。

3、Southern blot分析

收获T0代转PKMHT烟草不同株系的种子，得到T1代转PKMHT烟草不同株系；

提取T1代编号为T4-31，T4-35，T4-52，T4-67，T4-75转PKMHT烟草的基因组DNA，进行XhoI和Hind III酶切，酶切体系为40μl，取15μg DNA加限制性内切酶120U 37℃酶切过夜，然后取2-3μl酶切反应物进行电泳检测酶解情况。酶切完全的DNA在0.8％的琼脂凝胶中恒压(1.3V/cm)电泳10-12h，0.25N的HCl中脱嘌呤10min。碱变性后，真空转移(5Hg)至Hybond N+(Amersham)尼龙膜。转移完毕后，将膜浸泡于2×SSC中5min，然后80℃真空烘2h，用保鲜膜包好于4℃保存备用。在杂交过程中，首先将准备好的尼龙膜放入杂交管中，然后加入10ml的65℃预热的杂交液，65℃杂交炉中预杂交5h以上。

探针采用随机引物标记法，标记总体积为25μl：取2μl探针(约15-30ng目的基因片段PEPC，PPDK，NADP-ME，NADP-MDH或PPT作为探针)加入eppendorf管，加去离子水7μl，100℃变性5min后，迅速冰浴10min。随后参照同位素标记试剂盒(Promega)使用方法，依次加入标记buffer(含dATP、dGTP、dTTP)、BSA、Klenow酶及α-32P-dCTP(同位素)，混匀后于25℃下反应1h以上(在同位素室进行操作)。

在标记好的探针中加入75μl去离子水，混匀后加入等体积的0.4N NaOH混匀后室温放置5-8min。将变性好的探针加入预杂交管中混匀，65℃杂交炉中杂交过夜。杂交结束后，将杂交液倒入废液桶中。杂交膜依次用2×SSC(含0.1％SDS)，1×SSC(含0.1％SDS)，在杂交炉中65℃各洗脱约10-15min以洗去背景。膜洗完毕后，用滤纸吸干膜表面的水分，保鲜膜包好，用FX分子磷屏成像系统检测系统检测杂交信号。杂交过的尼龙膜在0.1N NaOH中轻轻振荡10-20min，再放入加有0.5％SDS的容器中煮沸数分钟以洗脱探针供下次杂交使用。以野生型烟草和转空载体烟草为对照。

结果如图11所示，P为阳性对照：pCDMAR-PKMHT-NptII用Xho I酶切得到的片段为基因NptII的阳性对照；pCDMAR-PKMHT-NptII用Hind III酶切得到的片段为分别作为PEPC，PPDK，NADP-ME，NADP-MDH和PPT的阳性对照；ck为野生型烟草，T4-31，T4-35，T4-52，T4-67，T4-75分别为编号为T4-31，T4-35，T4-52，T4-67，T4-75的T1代转PKMHT烟草的基因组。从图中看出，在所检测的5株T1代转基因烟草T4-31，T4-35，T4-52，T4-67，T4-75中均能杂出与阳性对照大小一致的条带，证实了NptII、PEPC、PPDK、NADP-ME、NADP-MDH和PPT基因整合在了烟草的基因组中，处于连锁遗传状态，能够在世代间稳定遗传。野生型烟草未检测到任何信号。

野生型烟草和转空载体烟草结果无显著差异。

4、转基因植物中外源基因的转录检测

TRIzol Regent试剂盒法提取植物总RNA：参照产品说明书进行，取0.4g T1代转KMHT烟草幼嫩的叶片，在液氮中迅速研磨成粉末状，加入3ml提取液，快速振荡混匀，于室温下放置10分钟；然后加入0.6ml氯仿，于振荡器上混匀1-2分钟后，室温放置10分钟；4℃，12,000rpm离心15分钟，取上清置于新的7ml管中，加入1.5ml异丙醇，混匀后置于室温沉淀10分钟后，4℃，12,000rpm离心10分钟，分别用预冷的75％乙醇和无水乙醇各洗涤沉淀，于超净工作台中自然干燥后，溶于100μl DEPC处理的水中，-70℃保存备用。利用DNase I处理提取的总RNA，以去除RNA中微量的基因组DNA。

取5μg经DNase I处理后的总RNA，利用M-MLV反转录酶进行反转录合成cDNA第一链，具体操作按照产品说明。具体步骤为：在RNase-free的0.2ml eppendorf管中加入5μg总RNA、4μl oligodT15、2μl RNasin，用DEPC水补足到36μl，混匀后于65℃变性15分钟，立即置冰上2分钟。加入5μl反应缓冲液、3μl dNTP mix(10mM)、2μl M-MLV反转录酶(400U)，轻轻吸打混匀，42℃反应60分钟，于70℃灭活5分钟。反转录完成后，通过扩增烟草ACTIN基因(OsActin-1：5’-TCATGAAGATCCTGACGGAG-3’；OsActin-2：5’-AACAGCTCCTCTTGGCTTAG-3’)的cDNA检测是否存在基因组DNA以及调整PCR反应所需模板的量。

在RT-PCR进行前要进行PCR预实验，以确定cDNA用量和PCR循环数，确保PCR扩增处在线性范围内。20μl反应体系中包括：10μl GC buffer I(2×)、基因特异引物(10mM)各0.5μl、1.0μl dNTP(2.5mM)、0.5U LA-Taq酶，用DEPC水补足20μl。PCR反应条件根据不同的引物对及产物大小进行调整。PCR扩增结束后取出5μl产物在1.2％琼脂糖凝胶上进行电泳检测。

结果如图12所示，图12为RT-PCR的鉴定图，其中，CK为野生型烟草，T4-31，T4-35，T4-52，T4-67，T4-75为编号为T4-31，T4-35，T4-52，T4-67，T4-75的T1代转基因烟草。从图中看出T1代转PKMHT烟草(T4株系)中，PEPC、PPDK、NADP-ME、NADP-MDH和PPT基因均有表达，其中NADP-MDH和PPT基因表达水平较高，而PEPC、PPDK和NADP-ME表达水平较低。

二、转基因植物功能研究

1、转基因植物光合特性的测定

光合特性测定于中国科学院遗传与发育生物学研究所日光温室内进行。参试材料选取生长长势一致的T1代转PKMHT烟草株系进行。其中选取该株系的5个单株的后代进行测定，盆栽编号为T4-31，T4-35，T4-52，T4-67，T4-75。以3株野生型烟草和3株转空载体烟草作为对照。实验重复三次，结果取平均值。

净光合速率(Pn)的测定：采用美国产LI-COR 6400TX便携式光合作用测定仪于烟草盛花期测定最上一片完全展开叶。于晴天条件下采用开路系统进行测定，通过通风来调节温室的温度，使其保持在24℃-27℃。人工光源强度为1000μmol·m^-2·s^-1，人工提供的CO₂浓度为400μmol·mol^-1，温度设定为25℃。测定时间为上午9:00-11:00。如图13所示，编号为T4-31，T4-35，T4-52，T4-67，T4-75的T1代转PKMHT烟草净光合速率平均值(T4)高达20.03μmol·m^-2·s^-1，野生型烟草的净光合速率平均值(CK)为18.92μmol·m^-2·s^-1，转基因烟草比野生型烟草相比提高了5.86％。

野生型烟草和转空载体烟草无显著差异。

2、转基因植物叶绿素荧光参数Fv/Fm的测定

叶绿素荧光参数Fv/Fm测定于中国科学院遗传与发育生物学研究所日光温室内进行。参试材料选取生长长势一致的T1代转PKMHT烟草株系进行。其中选取该株系的5个单株的后代进行测定，盆栽编号为T4-31，T4-35，T4-52，T4-67，T4-75。以野生型烟草和转空载体烟草作为对照。以5株野生型烟草和5株转空载体烟草作为对照。实验重复三次，结果取平均值。

叶绿素荧光参数Fv/Fm：采用美国产LI-COR 6400TX便携式光合作用测定仪于烟草盛花期测定最上一片完全展开叶。测定前用叶夹将待测叶片夹住进行暗适应30min后进行测量。

结果如图14所示：T1代转PKMHT烟草株系(编号为T4-31，T4-35，T4-52，T4-67，T4-7T1代转PKMHT烟草的平均值，T4)和野生型烟草(5株平均值，CK)的叶绿素荧光参数Fv/Fm分别为0.838和0.830，可以看出，T1代转PKMHT烟草株系同野生型烟草相比没有显著差异，这说明所转化的这些基因对烟草PSII的参数Fv/Fm没有显著影响。

野生型烟草和转空载体烟草无显著差异。

净光合速率和叶绿素荧光参数Fv/Fm为光合效率参数。

Claims (8)

1.一种DNA分子，为序列表中的序列1所示的核苷酸。

2.含有权利要求1所述的DNA分子的重组表达载体。

3.含有权利要求1所述的DNA分子的重组菌。

4.含有权利要求1所述的DNA分子的转基因细胞系。

5.含有权利要求1所述的DNA分子的表达盒。

6.一种培育光合效率提高的转基因植物方法，为将权利要求1所述的DNA分子导入目的植物，得到转基因植物；所述转基因植物光合效率高于所述目的植物；

所述目的植物为烟草。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：权利要求1所述的DNA分子通过权利要求2所述的重组表达载体导入目的植物。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述转基因植物光合效率高于所述目的植物体现在所述转基因植物的净光合速率高于所述目的植物。

Images