CN110904121A

CN110904121A - 易感基因sr30在改良农作物抗性中的应用

Info

Publication number: CN110904121A
Application number: CN201911298615.6A
Authority: CN
Inventors: 董莎萌; 黄杰; 彭倩; 王源超
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2019-12-17
Filing date: 2019-12-17
Publication date: 2020-03-24
Anticipated expiration: 2039-12-17
Also published as: CN110904121B

Abstract

本发明公开了易感基因SR30在改良农作物抗性中的应用，植物中保守的mRNA可变剪切因子SR30作为病害易感基因在改良作物抗性中的应用，属于植物分子生物学与植物遗传工程领域。沉默番茄中SR30可以显著增强番茄对致病疫霉菌的抗性，是一种理想的可用于改良作物抗性的易感基因。利用基因编辑技术在马铃薯、大豆、水稻、小麦和玉米等作物中敲除该基因，可以获得对多种病原菌的抗性能力，从而提高作物的田间抗病性。本发明可用于作物抗病性改良方面。

Description

易感基因SR30在改良农作物抗性中的应用

技术领域

本发明属于植物分子生物学与植物遗传工程领域，具体地说，本发明涉及可变剪切因子SR30作为易感基因在提高作物抗性中的应用。

背景技术

可变剪切是指同一种pre-mRNA通过不同的可变剪切方式产生不同mRNA的过程，在真核生物的生长发育过程中，绝大多数基因的pre-mRNA都需要经过5’端的加帽，3’端添加多聚腺苷酸尾巴以及内含子剪切等一系列加工过程才能产生成熟的mRNA^[1]。随着转录组高通量测序的快速发展，人们对可变剪切的认识和研究越来越多，在人类基因组中大约有95％的基因能发生可变剪切^[2]，在植物中有超过60％的基因会发生可变剪切^[3]。可变剪切能增加高等生物中基因表达的复杂程度以及提供蛋白质的多样性，在调控高等生物的生长、发育等生命活动过程中发挥着重要作用^[3]。

可变剪切过程是由可变剪切复合体来完成的，一般认为可变剪切复合体包括5个不同的小核核糖核蛋白(snRNPs:U1,U2,U4,U5,U6)以及200多种可变剪切因子^[4]。在20世纪90年代，科学家们在研究与剪切复合体互作的蛋白因子时，发现了SR蛋白可以参与mRNA的可变剪切过程^[5]，SR蛋白是植物中研究最为广泛和深入的一类剪切因子^[6]。据报道，拟南芥中的非典型SR蛋白SR45在拟南芥的幼苗期可以通过下调ABA的相关信号来负调控葡萄糖信号的传递过程^[7]；拟南芥中SR蛋白sr34b突变体会导致镉胁迫敏感性增加^[8]；水稻中SR蛋白SR40、SCL57和SCL25在调控磷元素的转运与分配中发挥着重要作用^[9]，这些研究表明，SR蛋白在植物应对外界的非生物胁迫过程中起着非常重要的作用。然而，SR蛋白在植物应对外界的生物胁迫以及在抗性过程中的作用机制目前还不清楚。番茄SR30作为SR蛋白家族中的一员，鲜有其在生物和非生物胁迫中的研究报道，并且其同源基因在大豆、马铃薯、水稻等作物中也高度保守，因此，研究SR30基因在植物中的抗性机制具有理论价值与实际应用价值。

随着现代农业的发展与进步，大量的化学农药被用于病害的防治过程，因此具有抗药性的病原菌在自然选择的条件下进行大量繁殖并逐渐成为超级菌株，严重威胁着农业生产；化学农药的大量使用也对环境造成了严重的污染，破坏了生态系统的平衡；近年来农药残留现象日益严重，食品安全问题也屡见不鲜，这些都严重危害着人类的健康生活。因此，利用基因编辑技术对植物中一些“不良基因”进行敲除，并且不会引入外源基因，从而达到去劣存优的目标，同时基因编辑技术也能够明显缩短育种年限，因此该技术在作物抗性改良的生产应用上更为安全和快捷。目前，CRISPR/Cas9基因编辑技术在植物中已日渐成熟，通过基因编辑技术敲除植物內源的易感基因SR30，从而提高植物对病原菌的抗性可以实现种质创新。因此，研究并利用抗性关键基因SR30对于植物抗病品种改良具有重要意义。

参考文献

[1]Chaudhary S,Jabre I,Reddy ASN,Staiger D,Syed NH.Perspective onAlternative Splicing and Proteome Complexity in Plants.Trends in plantscience 24,496-506(2019).

[2]Pan Q,Shai O,Lee LJ,Frey BJ,Blencowe BJ.Deep surveying ofalternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughputsequencing.Nature genetics 40,1413-1415(2008).

[3]Marquez Y,Brown JW,Simpson C,Barta A,Kalyna M.Transcriptome surveyreveals increased complexity of the alternative splicing landscape inArabidopsis.Genome research 22,1184-1195(2012).

[4]Wahl MC,Will CL,Luhrmann R.The spliceosome:design principles of adynamic RNP machine.Cell 136,701-718(2009).

[5]Fu XD,Maniatis T.Isolation of a complementary DNA that encodes themammalian splicing factor SC35.Science 256,535-538(1992).

[6]Reddy AS.Plant serine/arginine-rich proteins and their role inpre-mRNA splicing.Trends in plant science 9,541-547(2004).

[7]Carvalho RF,Carvalho SD,Duque P.The plant-specific SR45 proteinnegatively regulates glucose and ABA signaling during early seedlingdevelopment in Arabidopsis.Plant physiology 154,772-783(2010).

[8]Zhang W,Du B,Liu D,Qi X.Splicing factor SR34b mutation reducescadmium tolerance in Arabidopsis by regulating iron-regulated transporter 1gene.Biochemical and biophysical research communications 455,312-317(2014).

[9]Dong C,et al.Alternative Splicing Plays a Critical Role inMaintaining Mineral Nutrient Homeostasis in Rice(Oryza sativa).The Plant cell30,2267-2285(2018).

发明内容

本发明目的在于提供一种植物保守的mRNA剪切相关基因即可变剪切因子基因SR30。

本发明的另一目的在于提供上述可变剪切因子基因SR30编码的蛋白。

本发明的另一目的在于提供一种沉默上述可变剪切因子基因SR30的重组沉默载体及转化体。

本发明的又一目的在于提供上述可变剪切因子基因SR30在农业生产中的应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

可变剪切因子基因SR30作为病害易感基因在提高作物抗病性或提高抗病性作物育种中的应用。

上述的应用，沉默或敲除作物基因组中的可变剪切因子基因SR30能够提高作物的抗病性。

上述的可变剪切因子基因SR30为如下(1)或(2)：

(1)具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

(2)与SEQ ID NO.1相比具有至少60％以上的同源性的核苷酸序列；优选为，与SEQID NO.1相比具有至少70％以上的同源性的核苷酸序列；进一步优选为，与SEQ ID NO.1相比具有至少80％以上的同源性的核苷酸序列；更进一步优选为，与SEQ ID NO.1相比具有至少90％以上的同源性的核苷酸序列；最优选为，与SEQ ID NO.1相比具有至少95％以上的同源性的核苷酸序列。

上述的应用，构建重组载体用于沉默或敲除作物基因组中的可变剪切因子基因SR30；构建重组沉默载体的方法是将核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的SR30的特异性沉默片段插入到植物转化质粒中；所述的植物转化质粒优选为病毒沉默载体pTRV2。优选的，将SR30的特异性沉默片段插入到病毒沉默载体pTRV2的PstI酶切位点上得到载体pTRV2::SR30。

可变剪切因子基因SR30的特异性沉默片段、用于沉默可变剪切因子基因SR30的重组沉默载体或转化体在提高作物抗病性或提高抗病性作物育种中的应用。优选的，所述SR30基因特异性沉默片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述的重组沉默载体是将所述的特异性沉默片段插入到植物转化质粒中得到的；所述的植物转化质粒优选为病毒沉默载体pTRV2；所述的转化体由所述的重组沉默载体导入宿主细胞得到的；所述的宿主细胞优选大肠杆菌或农杆菌细胞。

可变剪切因子蛋白SR30作为负调控因子在提高作物抗病性或提高抗病性作物育种中的应用，该可变剪切因子蛋白SR30是如下(a)或(b)：

(a)由可变剪切因子基因SR30编码的蛋白；

(b)与所述可变剪切因子SR30的蛋白相比，在氨基酸序列上具有不小于60％相似性且能够作为负调控因子提高作物抗性的同源蛋白。

作为一种优选技术方案，所述的由可变剪切因子基因SR30编码的蛋白具有如SEQID NO：3所示的氨基酸序列，或者将SEQ ID NO：3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且能够作为负调控因子提高作物抗性的由SEQ ID NO：3衍生的蛋白；所述的与可变剪切因子SR30的蛋白相比，在氨基酸序列上具有不小于60％相似性且能够作为负调控因子提高作物抗性的同源蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示；或者将SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且能够作为负调控因子提高作物抗性的由SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8衍生的蛋白。

含有可变剪切因子基因SR30的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在提高作物抗病性或提高抗病性作物育种中的应用。含有上述SR30基因的重组表达载体，优选为植物转化质粒，可以为表达载体PbinGFP2、pCambia等。优选的，该重组表达载体是将SR30基因的全长编码序列插入到植物表达载体PbinGFP2中酶切位点SmaI上得到的载体PbinGFP2::SR30。

一种提高作物抗病性的方法，该方法为沉默或敲除作物基因组中的可变剪切因子基因SR30能够提高作物的抗病性。

利用本发明中基因编码的氨基酸序列，可以设计和人工合成密码子优化的有利于在植物中表达的核苷酸序列。

上述的可变剪切因子基因SR30、上述的特异性沉默片段、上述的蛋白、上述的重组沉默载体、上述的转化体、上述的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌、针对SR30的转基因或者基因编辑材料在提高作物抗病性或提高抗病性作物育种中的应用。所述的作物优选为大豆、番茄、马铃薯、水稻、小麦、玉米、蔬菜、果树等农作物。所述的作物抗病性为作物对病原菌引起的病害的抗性，所述病原菌为能够侵染经济作物和主要粮食作物的致病菌等，可以为卵菌、真菌或细菌，如疫霉菌、稻瘟菌、镰刀菌和丁香假单胞菌等。

上述的可变剪切因子基因SR30在提高作物抗病性或提高抗病性作物育种中的应用，沉默或敲除作物基因组中的可变剪切因子基因SR30可以显著增强作物的抗病性，培育高抗病性的作物品种，还可以增加作物产量。尤其在大豆、番茄、马铃薯和水稻等作物中沉默或敲除该基因可以获得增强抗病性和/或增加产量的品种。

上述的可变剪切因子基因SR30、上述的特异性沉默片段、上述的蛋白、上述的重组沉默载体、上述的转化体、上述的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌、针对SR30的转基因或者基因编辑材料在增加作物产量中的应用。在作物中沉默或敲除SR30基因以后能增加作物产量，优选在大豆、番茄、马铃薯和水稻中等作物中沉默或敲除SR30基因能够获得增强抗病性和/或增加产量的品种。

本研究发现番茄可变剪切因子SR蛋白家族基因SR30参与植物-疫霉菌的互作过程。在烟草叶片上过表达SR30后接种不同疫霉菌(辣椒疫霉和烟草疫霉)，发现过表达SR30能促进不同疫霉菌的侵染。另外，在番茄中沉默內源的SR30基因，可以显著提高植物对疫霉菌的抗性。SR30基因对疫霉菌的抗病性起着非常重要的作用，对番茄中SR30的研究可带动许多其它植物(如大豆、马铃薯、水稻、小麦、玉米等)中SR蛋白家族基因的相关研究。这些研究能更好的阐明植物剪切因子对不同疫霉菌的抗病功能，为农作物的抗病品种选育提供优质的抗病基因资源。

本发明的有益效果：

本发明所述基因SR30编码的蛋白质通过干扰寄主的可变剪切过程从而增强植物抗病性。在番茄中沉默不会影响植物的生长性状，可以显著增强番茄对致病疫霉菌的抗病性。本发明可以运用在农作物抗病品种改良方面，有望提高作物对病原菌的抗病性，从而达到减药增产的目的。

附图说明

图1 pBinGFP2和pBinGFP2::SR30蛋白表达检测。Western blot检测对照GFP和SR30的蛋白表达量，检测抗体为anti-GFP。

图2过表达pBinGFP2和pBinGFP2::SR30的烟草叶片上接种辣椒疫霉后的发病症状。

图3过表达pBinGFP2和pBinGFP2::SR30的烟草叶片上接种辣椒疫霉后病斑面积的统计分析。

图4过表达pBinGFP2和pBinGFP2::SR30的烟草叶片上接种烟草疫霉后的发病症状。

图5过表达pBinGFP2和pBinGFP2::SR30的烟草叶片上接种烟草疫霉后病斑面积的统计分析。

图6实时荧光定量PCR检测番茄中SR30基因的沉默效率。其中pTRV2::GFP载体为阴性对照，SR34为SR30的同源基因，pTRV2::SR30载体能特异性沉默SR30，并没有沉默其同源基因SR34。

图7 pTRV2::GFP和pTRV2::SR30沉默的番茄叶片上接种致病疫霉后的发病症状。

图8 pTRV2::GFP和pTRV2::SR30沉默的番茄叶片上接种致病疫霉后病斑面积的统计分析。

具体实施方式

以下的实施例是为了更好地理解本发明专利，但并不限定于本发明专利。以下实施例中的实验方法，如无特殊的解释说明，均为常规的实验方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊的解释说明，均从日常试剂商店购买获得。本发明实施例中所涉及的所有引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

实施例1.pBinGFP2::SR30载体构建

(1)植物培养：番茄材料(Solanum lycopersicum)培养于温室(24℃/14h光照和22℃/10h黑暗)中，6-8周的叶片用于RNA提取。

(2)番茄总RNA提取：以番茄的叶片为材料，利用Invitrogen公司RNA提取试剂盒(Cat no.12183018A)提取番茄总RNA，随后用NanoDrop分光光度计测定RNA浓度。

(3)反转录产生第一链：取1μg RNA作为模板，利用Vazyme公司反转录试剂盒(R223-01)进行操作。取适量反应产物作为RT-PCR模板，用于后续SR30全长基因克隆。SR30全长基因PCR引物序列为：

上游引物：SEQ ID NO.9

(5’-TACAAGGGTACCCCCATGGGTCGTCTAAGTCGG-3’)

下游引物：SEQ ID NO.10

(5’-GGATCCGTCGACCCCCTATATAGCAATTCCCAG-3’),

(4)SR30全长基因的克隆：利用Vazyme公司2×

Max Master Mix(P515)配置50μL的反应体系(2×Phanta Max Master Mix 25μL，上下游引物各2μL，模板1μL，加水补充至50μL)，PCR扩增程序为95℃预变性3分钟，95℃变性15秒，58℃退火15秒，72℃延伸1分钟，30次循环，最后72℃延伸5分钟；待反应结束以后将PCR产物在琼脂糖凝胶上进行电泳分离，并切胶回收SR30的扩增产物，随后用NanoDrop分光光度计测定PCR产物浓度。

(5)pBinGFP2::SR30载体构建：利用SmaI酶切pBinGFP2空载体，并在琼脂糖凝胶上进行电泳分离，切胶回收后用NanoDrop分光光度计测定载体浓度。利用Vazyme公司单片段连接试剂盒(C112)将SR30的PCR产物连接到pBinGFP2载体上。随后将连接产物转入JM109大肠杆菌感受态细胞中，涂布在含卡纳(50μg/mL)抗性的LB平板上，37℃培养12-16小时后利用pBinGFP2的载体引物(SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12)进行菌落PCR验证，最后选取条带大小正确的菌落提取质粒送往上海生工生物工程公司进行测序，序列如SEQ ID NO.1所示。测序正确的质粒电击转化到GV3101农杆菌中，用于后续的烟草中过表达实验。

pBinGFP2的载体引物序列为：

上游引物：SEQ ID NO.11

(5’-AAGACCCCAACGAGAAGC-3’)

下游引物：SEQ ID NO.12

(5’-GAACCCTAATTCCCTTATCTG-3’)

实施例2.沉默载体pTRV2::SR30的构建

(1)番茄总RNA提取：以番茄的叶片为材料，利用Invitrogen公司RNA提取试剂盒(Cat no.12183018A)提取番茄总RNA，随后用NanoDrop分光光度计测定RNA浓度。

(2)反转录产生第一链：取1μg RNA作为模板，利用Vazyme公司反转录试剂盒(R223-01)进行操作。取适量反应产物作为RT-PCR模板，用于SR30基因沉默片段克隆。SR30基因沉默片段PCR引物序列为：

上游引物：SEQ ID NO.13

(5’-CGACAAGACCCTGCAAATTCTCTCGAGCATATA-3’)

下游引物：SEQ ID NO.14

(5’-GAGAAGAGCCCTGCACTATATAGCAATTCCCAG-3’),

(3)SR30基因沉默片段的克隆：利用Vazyme公司2×

Max Master Mix(P515)配置50μL的反应体系(2×Phanta Max Master Mix 25μL，上下游引物各2μL，模板1μL，加水补充至50μL)，PCR扩增程序为95℃预变性3分钟，95℃变性15秒，58℃退火15秒，72℃延伸20秒，30次循环，最后72℃延伸5分钟；待反应结束以后将PCR产物在琼脂糖凝胶上进行电泳分离，并切胶回收扩增的产物，随后用NanoDrop分光光度计测定PCR产物浓度。

(4)pTRV2::SR30载体构建：利用PstI酶切pTRV2空载体，并在琼脂糖凝胶上进行电泳分离，切胶回收后用NanoDrop分光光度计测定载体浓度。利用Vazyme公司单片段连接试剂盒(C112)将SR30的沉默片段产物连接到pTRV2载体上。随后将连接产物转入JM109大肠杆菌感受态细胞中，涂布在含卡纳(50μg/mL)抗性的LB平板上，37℃培养12-16小时后利用pTRV2的载体引物(SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16)进行菌落PCR验证。最后选条带大小正确的菌落提取质粒送往上海生工生物工程公司进行测序，测序的序列如SEQ ID NO.2所示。测序正确的质粒电击转化到GV3101农杆菌中，用于后续番茄中SR30基因沉默。

pTRV2的载体引物序列为：

上游引物：SEQ ID NO.15

(5’-GATGGACATTGTTACTCAAG-3’)

下游引物：SEQ ID NO.16

(5’-CGAGAATGTCAATCTCGTAG-3’)

实施例3.在过表达SR30基因的烟草叶片上接种辣椒疫霉和烟草疫霉

(1)农杆菌培养：挑取转入pBinGFP2::SR30载体(序列如SEQ ID NO.19所示)的农杆菌，接种到试管中(液体LB：卡纳浓度50μg/mL，利福平浓度50μg/mL)进行培养，于摇床中(28℃，200rpm)培养12-16小时，再利用4000g离心2分钟收集菌体。随后用烟草缓冲液(组分：10mM MgCl₂,10mM MES,pH＝5.6,200μM AS)重悬菌体2次。最后用缓冲液稀释菌液，P19和pBinGFP2::SR30菌液按照1:1的比例混匀，最终浓度各为OD₆₀₀＝0.1。

(2)烟草中过表达SR30基因：选取生长4-6周的烟草，将配好的pBinGFP2::SR30和对照pBinGFP2空载体菌液分别左右注射到烟草叶片上，注射后的烟草于温室(24℃/16h光照和22℃/8h黑暗)培养36小时。

(3)SR30的蛋白检测：36小时以后收集注射的烟草叶片，将收集的烟草叶片放入研钵中，加入液氮速冻后反复研磨成粉末。随后将粉末加入1mL蛋白裂解液中(组分为：150mMNacl,50mM Tris-HCl,pH＝7.5,1.0％SDS,protease inhibitor)，反复震荡2-3分钟，12000rpm离心10分钟，吸取80μL的上清加入20μL的5倍蛋白上样缓冲液，沸水浴5-7分钟。接下来取10μL样品进行蛋白电泳分离，蛋白电泳结束后将蛋白转到PVDF膜上，转膜结束后先用5％脱脂牛奶孵育30-40分钟；随后加入1:5000稀释的GFP一抗(AT0028；Engibody)孵育3-5小时，再用PBST洗膜3次(每次间隔5分钟)；然后加入1:10000稀释的二抗(LI-COR,irdye800,926-32210)孵育30-40分钟，再用PBST洗膜3次(每次间隔5分钟)，最后进行扫膜拍照(图1)。

(4)发病症状拍照和病斑面积统计分析。注射pBinGFP2和pBinGFP2::SR30载体36小时后，收集注射的叶片接种辣椒疫霉和烟草疫霉，在接种2天后观察发病症状并拍照记录(图2，图4)，统计结果显示与阴性对照pBinGFP2相比，过表达SR30的烟草叶片在接种疫霉菌后病斑明显增大(图3，图5)，这些结果证实过表达SR30显著促进辣椒疫霉和烟草疫霉的侵染。

实施例4.在沉默SR30基因的番茄叶片上接种致病疫霉

(1)农杆菌培养：挑取转入pTRV2::SR30载体的农杆菌，接种到试管中(液体LB：卡纳浓度50μg/mL，利福平浓度50μg/mL)进行培养，在摇床上(28℃，200rpm)培养12-16小时，再利用4000g离心2分钟收集菌体。随后用烟草缓冲液(组分：10mM MgCl₂,10mM MES,pH＝5.6,200μM AS)重悬菌体2次。用缓冲液稀释菌液，将pTRV1和pTRV2::SR30(pTRV1和pTRV2::GFP作为阴性对照)菌液按照1:1的比例混匀，最终浓度各为OD₆₀₀＝0.3。

(2)番茄中沉默SR30基因：选取刚长出2片子叶的番茄小苗，将配好的菌液注射到番茄叶片上，注射后番茄于温室(24℃/14h光照和22℃/10h黑暗)生长4-6周。

(3)SR30基因的沉默效率检测：4-6周以后收集沉默的番茄叶片，将收集的叶片放入研钵中，加入液氮速冻后反复研磨成粉末。利用Invitrogen公司RNA提取试剂盒(Catno.12183018A)提取番茄总RNA，随后用NanoDrop分光光度计测定RNA浓度。再选取1μg RNA作为模板，利用Vazyme公司反转录试剂盒(R223-01)进行操作。取适量的反应产物作为qRT-PCR的模板，用于后续的实时荧光定量PCR检测实验(图6)。

SR30基因的定量检测引物序列为：

上游引物：SEQ ID NO.17

(5’-ACGGGCATCGCTTGCGAGTT-3’)

下游引物：SEQ ID NO.18

(5’-TGCCATGAGGCAGAAGACGGT-3’)

(4)沉默SR30基因的番茄叶片上接种致病疫霉的发病症状拍照和病斑面积统计分析。收集沉默SR30基因的番茄和对照番茄的叶片接种致病疫霉(每微升200游动孢子)，接种6天后观察发病症状并拍照记录结果，结果显示在沉默SR30基因的番茄叶片上致病疫霉侵染减弱(图7)。此外，统计结果也显示与阴性对照pTRV2::GFP相比，沉默SR30的番茄在接种致病疫霉后病斑明显减小(图8)，这些结果证实沉默SR30基因提高了番茄对致病疫霉菌的抗性。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 易感基因SR30在改良农作物抗性中的应用

<160> 19

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 780

<212> DNA

<213> 番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)

<400> 1

atgggtcgtc taagtcggac tatctacgtt ggaaatcttc ctggtgatat tcgggagaga 60

gaagtagaag atttgtttta caagtatggt cccattgtgg aaattgattt gaaagttcca 120

cctagaccac ctggttatgc gttcgtagag tttgaagatc ctcgtgatgc tgatgatgcc 180

attcgtgggc gtgatggcta tgactttgac gggcatcgct tgcgagttga acttgcacat 240

ggtgggcgag gatcatcatc atatgatcgc cacagtagtt acagtagtgc gagtcgcagt 300

ggactttcta ggcgctctga ctatcgcgta ctggtctctg gactaccgtc ttctgcctca 360

tggcaagact tgaaggatca tatgcgacga gctggagatg tctgcttctc tcaagttttc 420

cgagatcgtg acggtatgag agggattgtg gactatacca actatgatga tatgagatac 480

gcgataaaga aacttgatga ctctctgttt cgcaatcaat tctctcgagc atatattagg 540

gtggacaagt atgataagag gcatagctat tccaggagtc caagtccata caattctaga 600

agcagaagtt actcaagaag taggagtcct cgacgaagct acagcagcca gagcggaagt 660

gtatctccta ggggtaaata ctctcgtcgc tctgtgtcta tctcaccctc aagggctttt 720

tcccctgcgc tctctctttc aagatctggc ttccgcggcg atctgggaat tgctatatag 780

<210> 2

<211> 263

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aattctctcg agcatatatt agggtggaca agtatgataa gaggcatagc tattccagga 60

gtccaagtcc atacaattct agaagcagaa gttactcaag aagtaggagt cctcgacgaa 120

gctacagcag ccagagcgga agtgtatctc ctaggggtaa atactctcgt cgctctgtgt 180

ctatctcacc ctcaagggct ttttcccctg cgctctctct ttcaagatct ggcttccgcg 240

gcgatctggg aattgctata tag 263

<210> 3

<211> 259

<212> PRT

<213> 番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)

<400> 3

Met Gly Arg Leu Ser Arg Thr Ile Tyr Val Gly Asn Leu Pro Gly Asp

1 5 10 15

Ile Arg Glu Arg Glu Val Glu Asp Leu Phe Tyr Lys Tyr Gly Pro Ile

20 25 30

Val Glu Ile Asp Leu Lys Val Pro Pro Arg Pro Pro Gly Tyr Ala Phe

35 40 45

Val Glu Phe Glu Asp Pro Arg Asp Ala Asp Asp Ala Ile Arg Gly Arg

50 55 60

Asp Gly Tyr Asp Phe Asp Gly His Arg Leu Arg Val Glu Leu Ala His

65 70 75 80

Gly Gly Arg Gly Ser Ser Ser Tyr Asp Arg His Ser Ser Tyr Ser Ser

85 90 95

Ala Ser Arg Ser Gly Leu Ser Arg Arg Ser Asp Tyr Arg Val Leu Val

100 105 110

Ser Gly Leu Pro Ser Ser Ala Ser Trp Gln Asp Leu Lys Asp His Met

115 120 125

Arg Arg Ala Gly Asp Val Cys Phe Ser Gln Val Phe Arg Asp Arg Asp

130 135 140

Gly Met Arg Gly Ile Val Asp Tyr Thr Asn Tyr Asp Asp Met Arg Tyr

145 150 155 160

Ala Ile Lys Lys Leu Asp Asp Ser Leu Phe Arg Asn Gln Phe Ser Arg

165 170 175

Ala Tyr Ile Arg Val Asp Lys Tyr Asp Lys Arg His Ser Tyr Ser Arg

180 185 190

Ser Pro Ser Pro Tyr Asn Ser Arg Ser Arg Ser Tyr Ser Arg Ser Arg

195 200 205

Ser Pro Arg Arg Ser Tyr Ser Ser Gln Ser Gly Ser Val Ser Pro Arg

210 215 220

Gly Lys Tyr Ser Arg Arg Ser Val Ser Ile Ser Pro Ser Arg Ala Phe

225 230 235 240

Ser Pro Ala Leu Ser Leu Ser Arg Ser Gly Phe Arg Gly Asp Leu Gly

245 250 255

Ile Ala Ile

<210> 4

<211> 287

<212> PRT

<213> 马铃薯(Solanum tuberosum)

<400> 4

Met Gly Arg Leu Ser Arg Thr Ile Tyr Val Gly Asn Leu Pro Gly Asp

1 5 10 15

Ile Arg Glu Arg Glu Val Glu Asp Leu Phe Tyr Lys Tyr Gly Pro Ile

20 25 30

Val Glu Ile Asp Leu Lys Val Pro Pro Arg Pro Pro Gly Tyr Ala Phe

35 40 45

Val Glu Phe Glu Asp Pro Arg Asp Thr Asp Asp Ala Ile Arg Gly Arg

50 55 60

Asp Gly Tyr Asp Phe Asp Gly Arg Arg Leu Arg Val Glu Leu Ala His

65 70 75 80

Gly Gly Arg Gly Ser Ser Ser Tyr Asp Arg His Ser Ser Tyr Ser Ser

85 90 95

Gly Ser His Gly Gly Phe Ser Arg Arg Ser Asp Tyr Arg Val Leu Val

100 105 110

Ser Gly Leu Pro Ser Ser Ala Ser Trp Gln Asp Leu Lys Asp His Met

115 120 125

Arg Arg Ala Gly Asp Val Cys Phe Ser Gln Val Phe Arg Asp Arg Asp

130 135 140

Gly Met Arg Gly Ile Val Asp Tyr Thr Asn Tyr Asp Asp Met Arg Tyr

145 150 155 160

Ala Ile Lys Lys Leu Asp Asp Ser Leu Phe Arg Asn Gln Phe Ser Arg

165 170 175

Ala Tyr Ile Arg Val Asp Lys Tyr Asp Lys Arg His Ser Tyr Ser Arg

180 185 190

Ser Pro Ser Pro Tyr Tyr Ser Arg Ser Arg Ser Tyr Ser Arg Ser Arg

195 200 205

Ser Pro Arg Arg Ser Tyr Ser Ser Gln Ser Gly Ser Val Ser Pro Arg

210 215 220

Gly Lys Tyr Ser Arg Arg Ser Val Ser Val Ser Pro Ser Arg Asp Phe

225 230 235 240

Ser Pro Ala Arg Cys His Ser Arg Ser Leu Ser Arg Ser Arg Ser Pro

245 250 255

Leu Ser Pro Pro Pro Arg Trp Arg His Gly Arg Ser Leu Ser Pro Ser

260 265 270

Arg Ser Arg Ser Leu Ser Tyr Ser Arg Ser Ser Gly Ile Ser Glu

275 280 285

<210> 5

<211> 276

<212> PRT

<213> 大豆(Glycine max (Linn.) Merr.)

<400> 5

Met Ser Gly Arg Ser Ser Arg Thr Ile Tyr Val Gly Asn Leu Pro Gly

1 5 10 15

Asp Val Arg Leu Arg Glu Val Glu Asp Leu Phe Tyr Lys Tyr Gly Pro

20 25 30

Ile Val Asp Ile Asp Leu Lys Ile Pro Pro Arg Pro Pro Gly Tyr Ala

35 40 45

Phe Val Glu Phe Glu Asp Ala Arg Asp Ala Glu Asp Ala Ile Gln Tyr

50 55 60

Arg Asp Gly Tyr Asn Phe Asp Gly Phe Arg Leu Arg Val Glu Leu Ala

65 70 75 80

His Gly Gly Arg Gly Tyr Ser Ser Ser Val Asp Arg Tyr Ser Ser Tyr

85 90 95

Ser Gly Gly Ser Gly Ser Arg Gly Val Ser Arg Arg Ser Asp Tyr Arg

100 105 110

Val Leu Val Thr Gly Leu Pro Pro Ser Ala Ser Trp Gln Asp Leu Lys

115 120 125

Asp His Met Arg Lys Ala Gly Asp Val Cys Phe Ser Gln Val Phe Arg

130 135 140

Glu Arg Gly Gly Met Thr Gly Ile Val Asp Tyr Thr Asn Tyr Asp Asp

145 150 155 160

Met Lys Tyr Ala Ile Arg Lys Leu Asp Asp Ser Glu Phe Arg Asn Ala

165 170 175

Phe Ser Arg Ala Phe Ile Arg Val Arg Glu Tyr Asp Arg Gly Tyr Ser

180 185 190

Arg Ser Pro Ser Arg Asp Ser Arg Arg Ser Tyr Ser Arg Ser Leu Ser

195 200 205

Arg Ser Pro Cys Ile Ser Arg Ser Arg Ser His Ser Arg Ser Arg Ser

210 215 220

His Ser Tyr Ser Asp Arg Ser Arg Ser Trp Ser Pro Lys Pro Lys His

225 230 235 240

Ser Arg Arg Ser Ile Ser Leu Ser Arg Lys Val Glu Gly Thr Met Leu

245 250 255

Lys Trp Ile Ala Ala Trp Pro Leu Asn Ile Gln Cys Ser Leu Gly Leu

260 265 270

Thr Leu Val Phe

275

<210> 6

<211> 286

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa L.)

<400> 6

Met Ser Arg Arg Trp Ser Arg Thr Ile Tyr Val Gly Asn Leu Pro Gly

1 5 10 15

Asp Ile Arg Glu Arg Glu Val Glu Asp Leu Phe Tyr Lys Tyr Gly Arg

20 25 30

Ile Val Asp Ile Asp Leu Lys Ile Pro Pro Arg Pro Pro Gly Tyr Ala

35 40 45

Phe Val Glu Phe Glu Asp Pro Arg Asp Ala Glu Glu Ala Cys Ala Gly

50 55 60

Arg Asp Gly Tyr Asn Phe Asp Gly His Arg Leu Arg Val Glu Pro Ala

65 70 75 80

His Gly Gly Arg Gly Asn Gly Gly Ser Ser Phe Asp Arg Pro Ser Asn

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Gly Arg Arg Gly Val Ser Arg His Ser Glu Tyr Arg

100 105 110

Val Leu Val Thr Gly Leu Pro Ser Ser Ala Ser Trp Gln Asp Leu Lys

115 120 125

Asp His Met Arg Lys Ala Gly Asp Val Cys Phe Ser Glu Val Tyr Arg

130 135 140

Glu Gly Gly Gly Thr Val Gly Ile Val Asp Tyr Thr Asn Tyr Asp Asp

145 150 155 160

Met Lys Tyr Ala Ile Lys Lys Leu Asp Asp Ser Glu Phe Arg Asn Ala

165 170 175

Phe Ser Lys Gly His Ile Arg Val Lys Glu Tyr Asp Gly Lys Arg Ala

180 185 190

Arg Ser Tyr Ser Arg Ser Arg Ser Pro Ser Arg Ser Arg Ser Lys Ser

195 200 205

Arg Ser Leu Ser Lys Ser Pro Arg Thr Arg Arg Ser Ala Ser Arg Ser

210 215 220

Arg Ser Arg Ser Arg Ser Val Ser Ser Arg Ser Arg Ser Ala Ser Lys

225 230 235 240

Gly Arg Ser Pro Ser Arg Ser Pro Ala Arg Ser Lys Ser Pro Asn Ala

245 250 255

Ser Pro Ala Asn Gly Glu Ala Ser Ser Pro Lys Lys Arg Ser Pro Ser

260 265 270

Arg Ser Pro Ser Arg Ser Arg Ser Pro Asp Ala Lys Ser Glu

275 280 285

<210> 7

<211> 285

<212> PRT

<213> 玉米(Zea mays L.)

<400> 7

Met Ser Arg Arg Trp Ser Arg Thr Ile Tyr Val Gly Asn Leu Pro Gly

1 5 10 15

Asp Ile Arg Glu Arg Glu Val Glu Asp Leu Phe Tyr Lys Tyr Gly Lys

20 25 30

Ile Val Asp Ile Asp Leu Lys Val Pro Pro Arg Pro Pro Gly Tyr Ala

35 40 45

Phe Val Glu Phe Glu Asp Pro Arg Asp Ala Glu Glu Ala Ile Ala Gly

50 55 60

Arg Asp Gly Tyr Asn Phe Asp Gly His Arg Leu Arg Val Glu Ala Ala

65 70 75 80

His Gly Gly Arg Gly Asn Ala Ser Ser His Asp Arg Ser Ser Gly Phe

85 90 95

Gly Gly Gly Gly Gly Ala Arg Arg Gly Val Ser Arg His Ser Glu Tyr

100 105 110

Arg Val Leu Val Thr Gly Leu Pro Ser Ser Ala Ser Trp Gln Asp Leu

115 120 125

Lys Asp His Met Arg Lys Ala Gly Asp Val Cys Phe Ser Glu Val Tyr

130 135 140

Arg Glu Gly Gly Gly Thr Val Gly Ile Val Asp Tyr Thr Asn Tyr Asp

145 150 155 160

Asp Met Lys Tyr Ala Ile Lys Lys Leu Asp Asp Thr Glu Phe Arg Asn

165 170 175

Ala Phe Gly Arg Ala Tyr Ile Arg Val Lys Glu Tyr Asn Gly Lys Arg

180 185 190

Gly Arg Ser Tyr Ser Arg Ser Arg Ser Pro Ser Arg Ser Tyr Ser Lys

195 200 205

Ser Arg Ser Pro Ser Lys Ser Pro Arg Thr Arg Arg Ser Ser Ser Arg

210 215 220

Ser Arg Ser Arg Ser Val Ser Ser Arg Ser Arg Ser Pro Ser Lys Gly

225 230 235 240

Arg Ser Pro Ser Arg Ser Pro Ala Arg Ser Lys Ser Pro Asn Val Ser

245 250 255

Pro Ala Asn Gly Glu Ala Ala Ser Pro Lys Lys Gln Ser Pro Asn Arg

260 265 270

Ser Pro Ser Gly Ser Arg Ser Pro Asp Ala Lys Pro Glu

275 280 285

<210> 8

<211> 284

<212> PRT

<213> 小麦(Triticum aestivum L.)

<400> 8

Met Ser Arg Arg Trp Ser Arg Thr Ile Tyr Val Gly Asn Leu Pro Gly

1 5 10 15

Asp Ile Arg Glu Arg Glu Val Glu Asp Leu Phe Tyr Lys Tyr Gly Arg

20 25 30

Ile Val Glu Ile Asp Leu Lys Val Pro Pro Arg Pro Pro Gly Phe Ala

35 40 45

Phe Val Glu Phe Glu Asp Pro Arg Asp Ala Glu Asp Ala Ile His Gly

50 55 60

Arg Asp Gly Tyr Asn Phe Asp Gly Asn Arg Leu Arg Val Glu Leu Ala

65 70 75 80

His Gly Gly Arg Ala Asn Ser Ser Ser Leu Pro Asn Ser Tyr Gly Gly

85 90 95

Gly Gly Arg Arg Gly Gly Val Ser Arg His Thr Glu Tyr Arg Val Leu

100 105 110

Val Thr Gly Leu Pro Ser Ser Ala Ser Trp Gln Asp Leu Lys Asp His

115 120 125

Met Arg Lys Ala Gly Asp Val Cys Phe Ser Glu Val Tyr Arg Glu Gly

130 135 140

Gly Gly Thr Ile Gly Ile Val Asp Tyr Thr Asn Tyr Asp Asp Met Lys

145 150 155 160

Tyr Ala Ile Arg Lys Leu Asp Asp Thr Glu Phe Lys Asn Ala Phe Ser

165 170 175

Arg Ala Pro Ile Arg Val Lys Glu Tyr Ala Gly Lys Ser Ser Arg Ser

180 185 190

Tyr Ser Arg Ser Arg Ser Arg Ser Arg Ser Gly Ser Tyr Ser Arg Ser

195 200 205

Pro Ser Pro Lys Lys Lys Pro Ser Arg Arg Ser Ala Ser Arg Ser Arg

210 215 220

Ser Arg Ser Val Ser Ser His Ser Arg Ser Pro Ser Lys Glu Arg Ser

225 230 235 240

Pro Ser Arg Ser Pro Ala Lys Ser Arg Ser Pro Val Ala Ala Ser Pro

245 250 255

Val Val Asn Gly Glu Ala Ala Ser Pro Lys Arg Asp Pro Ser Lys Ser

260 265 270

Pro Ser Arg Ser Arg Ser Pro Asp Ala Lys Ser Glu

275 280

<210> 9

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tacaagggta cccccatggg tcgtctaagt cgg 33

<210> 10

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggatccgtcg accccctata tagcaattcc cag 33

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aagaccccaa cgagaagc 18

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gaaccctaat tcccttatct g 21

<210> 13

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cgacaagacc ctgcaaattc tctcgagcat ata 33

<210> 14

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gagaagagcc ctgcactata tagcaattcc cag 33

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gatggacatt gttactcaag 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cgagaatgtc aatctcgtag 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

acgggcatcg cttgcgagtt 20

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tgccatgagg cagaagacgg t 21

<210> 19

<211> 15010

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

tgagcgtcgc aaaggcgctc ggtcttgcct tgctcgtcgg tgatgtactt caccagctcc 60

gcgaagtcgc tcttcttgat ggagcgcatg gggacgtgct tggcaatcac gcgcaccccc 120

cggccgtttt agcggctaaa aaagtcatgg ctctgccctc gggcggacca cgcccatcat 180

gaccttgcca agctcgtcct gcttctcttc gatcttcgcc agcagggcga ggatcgtggc 240

atcaccgaac cgcgccgtgc gcgggtcgtc ggtgagccag agtttcagca ggccgcccag 300

gcggcccagg tcgccattga tgcgggccag ctcgcggacg tgctcatagt ccacgacgcc 360

cgtgattttg tagccctggc cgacggccag caggtaggcc gacaggctca tgccggccgc 420

cgccgccttt tcctcaatcg ctcttcgttc gtctggaagg cagtacacct tgataggtgg 480

gctgcccttc ctggttggct tggtttcatc agccatccgc ttgccctcat ctgttacgcc 540

ggcggtagcc ggccagcctc gcagagcagg attcccgttg agcaccgcca ggtgcgaata 600

agggacagtg aagaaggaac acccgctcgc gggtgggcct acttcaccta tcctgcccgg 660

ctgacgccgt tggatacacc aaggaaagtc tacacgaacc ctttggcaaa atcctgtata 720

tcgtgcgaaa aaggatggat ataccgaaaa aatcgctata atgaccccga agcagggtta 780

tgcagcggaa aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg 840

gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt 900

atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag 960

gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt 1020

gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta 1080

ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt 1140

cagtgagcga ggaagcggaa gagcgccaga aggccgccag agaggccgag cgcggccgtg 1200

aggcttggac gctagggcag ggcatgaaaa agcccgtagc gggctgctac gggcgtctga 1260

cgcggtggaa agggggaggg gatgttgtct acatggctct gctgtagtga gtgggttgcg 1320

ctccggcagc ggtcctgatc aatcgtcacc ctttctcggt ccttcaacgt tcctgacaac 1380

gagcctcctt ttcgccaatc catcgacaat caccgcgagt ccctgctcga acgctgcgtc 1440

cggaccggct tcgtcgaagg cgtctatcgc ggcccgcaac agcggcgaga gcggagcctg 1500

ttcaacggtg ccgccgcgct cgccggcatc gctgtcgccg gcctgctcct caagcacggc 1560

cccaacagtg aagtagctga ttgtcatcag cgcattgacg gcgtccccgg ccgaaaaacc 1620

cgcctcgcag aggaagcgaa gctgcgcgtc ggccgtttcc atctgcggtg cgcccggtcg 1680

cgtgccggca tggatgcgcg cgccatcgcg gtaggcgagc agcgcctgcc tgaagctgcg 1740

ggcattcccg atcagaaatg agcgccagtc gtcgtcggct ctcggcaccg aatgcgtatg 1800

attctccgcc agcatggctt cggccagtgc gtcgagcagc gcccgcttgt tcctgaagtg 1860

ccagtaaagc gccggctgct gaacccccaa ccgttccgcc agtttgcgtg tcgtcagacc 1920

gtctacgccg acctcgttca acaggtccag ggcggcacgg atcactgtat tcggctgcaa 1980

ctttgtcatg cttgacactt tatcactgat aaacataata tgtccaccaa cttatcagtg 2040

ataaagaatc cgcgcgttca atcggaccag cggaggctgg tccggaggcc agacgtgaaa 2100

cccaacatac ccctgatcgt aattctgagc actgtcgcgc tcgacgctgt cggcatcggc 2160

ctgattatgc cggtgctgcc gggcctcctg cgcgatctgg ttcactcgaa cgacgtcacc 2220

gcccactatg gcattctgct ggcgctgtat gcgttggtgc aatttgcctg cgcacctgtg 2280

ctgggcgcgc tgtcggatcg tttcgggcgg cggccaatct tgctcgtctc gctggccggc 2340

gccagatctg gggaaccctg tggttggcat gcacatacaa atggacgaac ggataaacct 2400

tttcacgccc ttttaaatat ccgattattc taataaacgc tcttttctct taggtttacc 2460

cgccaatata tcctgtcaaa cactgatagt ttgtgaacca tcacccaaat caagtttttt 2520

ggggtcgagg tgccgtaaag cactaaatcg gaaccctaaa gggagccccc gatttagagc 2580

ttgacgggga aagccggcga acgtggcgag aaaggaaggg aagaaagcga aaggagcggg 2640

cgccattcag gctgcgcaac tgttgggaag ggcgatcggt gcgggcctct tcgctattac 2700

gccagctggc gaaaggggga tgtgctgcaa ggcgattaag ttgggtaacg ccagggtttt 2760

cccagtcacg acgttgtaaa acgacggcca gtgaattgtt aattaagaat tcgagctcct 2820

tgcatgcctg caggtcaaca tggtggagca cgacacactt gtctactcca aaaatatcaa 2880

agatacagtc tcagaagacc aaagggcaat tgagactttt caacaaaggg taatatccgg 2940

aaacctcctc ggattccatt gcccagctat ctgtcacttt attgtgaaga tagtggaaaa 3000

ggaaggtggc tcctacaaat gccatcattg cgataaagga aaggccatcg ttgaagatgc 3060

ctctgccgac agtggtccca aagatggacc cccacccacg aggagcatcg tggaaaaaga 3120

agacgttcca accacgtctt caaagcaagt ggattgatgt gataacatgg tggagcacga 3180

cacacttgtc tactccaaaa atatcaaaga tacagtctca gaagaccaaa gggcaattga 3240

gacttttcaa caaagggtaa tatccggaaa cctcctcgga ttccattgcc cagctatctg 3300

tcactttatt gtgaagatag tggaaaagga aggtggctcc tacaaatgcc atcattgcga 3360

taaaggaaag gccatcgttg aagatgcctc tgccgacagt ggtcccaaag atggaccccc 3420

acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga cgttccaacc acgtcttcaa agcaagtgga 3480

ttgatgtgat atctccactg acgtaaggga tgacgcacaa tcccactatc cttcgcaaga 3540

cccttcctct atataaggaa gttcatttca tttggagagg acctcgagaa ttctcaacac 3600

aacatataca aaacaaacga atctcaagca atcaagcatt ctacttctat tgcagcaatt 3660

taaatcattt cttttaaagc aaaagcaatt ttctgaaaat tttcaccatt tacgaacgat 3720

agccatggtg agcaagggcg aggagctgtt caccggggtg gtgcccatcc tggtcgagct 3780

ggacggcgac gtaaacggcc acaagttcag cgtgtccggc gagggcgagg gcgatgccac 3840

ctacggcaag ctgaccctga agttcatctg caccaccggc aagctgcccg tgccctggcc 3900

caccctcgtg accaccctga cctacggcgt gcagtgcttc agccgctacc ccgaccacat 3960

gaagcagcac gacttcttca agtccgccat gcccgaaggc tacgtccagg agcgcaccat 4020

cttcttcaag gacgacggca actacaagac ccgcgccgag gtgaagttcg agggcgacac 4080

cctggtgaac cgcatcgagc tgaagggcat cgacttcaag gaggacggca acatcctggg 4140

gcacaagctg gagtacaact acaacagcca caacgtctat atcatggccg acaagcagaa 4200

gaacggcatc aaggtgaact tcaagatccg ccacaacatc gaggacggca gcgtgcagct 4260

cgccgaccac taccagcaga acacccccat cggcgacggc cccgtgctgc tgcccgacaa 4320

ccactacctg agcacccagt ccgccctgag caaagacccc aacgagaagc gcgatcacat 4380

ggtcctgctg gagttcgtga ccgccgccgg gatcactctc ggcatggacg agctgtacaa 4440

gggtaccccc atgggtcgtc taagtcggac tatctacgtt ggaaatcttc ctggtgatat 4500

tcgggagaga gaagtagaag atttgtttta caagtatggt cccattgtgg aaattgattt 4560

gaaagttcca cctagaccac ctggttatgc gttcgtagag tttgaagatc ctcgtgatgc 4620

tgatgatgcc attcgtgggc gtgatggcta tgactttgac gggcatcgct tgcgagttga 4680

acttgcacat ggtgggcgag gatcatcatc atatgatcgc cacagtagtt acagtagtgc 4740

gagtcgcagt ggactttcta ggcgctctga ctatcgcgta ctggtctctg gactaccgtc 4800

ttctgcctca tggcaagact tgaaggatca tatgcgacga gctggagatg tctgcttctc 4860

tcaagttttc cgagatcgtg acggtatgag agggattgtg gactatacca actatgatga 4920

tatgagatac gcgataaaga aacttgatga ctctctgttt cgcaatcaat tctctcgagc 4980

atatattagg gtggacaagt atgataagag gcatagctat tccaggagtc caagtccata 5040

caattctaga agcagaagtt actcaagaag taggagtcct cgacgaagct acagcagcca 5100

gagcggaagt gtatctccta ggggtaaata ctctcgtcgc tctgtgtcta tctcaccctc 5160

aagggctttt tcccctgcgc tctctctttc aagatctggc ttccgcggcg atctgggaat 5220

tgctatatag ggggtcgacg gatcctctag atgaactaga gtccgcaaaa atcaccagtc 5280

tctctctaca aatctatctc tctctatttt tctccagaat aatgtgtgag tagttcccag 5340

ataagggaat tagggttctt atagggtttc gctcatgtgt tgagcatata agaaaccctt 5400

agtatgtatt tgtatttgta aaatacttct atcaataaaa tttctaattc ctaaaaccaa 5460

aatccagtga caagcttggc gcgccagctt ggcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt 5520

gtgaaattgt tatccgctca caattccaca caacatacga gccggaagca taaagtgtaa 5580

agcctggggt gcctaatgag tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc 5640

tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag 5700

aggcggtttg cgtattgggc caaagacaaa agggcgacat tcaaccgatt gagggaggga 5760

aggtaaatat tgacggaaat tattcattaa aggtgaatta tcaccgtcac cgacttgagc 5820

catttgggaa ttagagccag caaaatcacc agtagcacca ttaccattag caaggccgga 5880

aacgtcacca atgaaaccat cgatagcagc accgtaatca gtagcgacag aatcaagttt 5940

gcctttagcg tcagactgta gcgcgttttc atcggcattt tcggtcatag cccccttatt 6000

agcgtttgcc atcttttcat aatcaaaatc accggaacca gagccaccac cggaaccgcc 6060

tccctcagag ccgccaccct cagaaccgcc accctcagag ccaccaccct cagagccgcc 6120

accagaacca ccaccagagc cgccgccagc attgacagga ggcccgatct agtaacatag 6180

atgacaccgc gcgcgataat ttatcctagt ttgcgcgcta tattttgttt tctatcgcgt 6240

attaaatgta taattgcggg actctaatca taaaaaccca tctcataaat aacgtcatgc 6300

attacatgtt aattattaca tgcttaacgt aattcaacag aaattatatg ataatcatcg 6360

caagaccggc aacaggattc aatcttaaga aactttattg ccaaatgttt gaacgatcgg 6420

ggatcatccg ggtctgtggc gggaactcca cgaaaatatc cgaacgcagc aagatatcgc 6480

ggtgcatctc ggtcttgcct gggcagtcgc cgccgacgcc gttgatgtgg acgccgggcc 6540

cgatcatatt gtcgctcagg atcgtggcgt tgtgcttgtc ggccgttgct gtcgtaatga 6600

tatcggcacc ttcgaccgcc tgttccgcag agatcccgtg ggcgaagaac tccagcatga 6660

gatccccgcg ctggaggatc atccagccgg cgtcccggaa aacgattccg aagcccaacc 6720

tttcatagaa ggcggcggtg gaatcgaaat ctcgtgatgg caggttgggc gtcgcttggt 6780

cggtcatttc gaaccccaga gtcccgctca gaagaactcg tcaagaaggc gatagaaggc 6840

gatgcgctgc gaatcgggag cggcgatacc gtaaagcacg aggaagcggt cagcccattc 6900

gccgccaagc tcttcagcaa tatcacgggt agccaacgct atgtcctgat agcggtccgc 6960

cacacccagc cggccacagt cgatgaatcc agaaaagcgg ccattttcca ccatgatatt 7020

cggcaagcag gcatcgccat gggtcacgac gagatcatcg ccgtcgggca tgcgcgcctt 7080

gagcctggcg aacagttcgg ctggcgcgag cccctgatgc tcttcgtcca gatcatcctg 7140

atcgacaaga ccggcttcca tccgagtacg tgctcgctcg atgcgatgtt tcgcttggtg 7200

gtcgaatggg caggtagccg gatcaagcgt atgcagccgc cgcattgcat cagccatgat 7260

ggatactttc tcggcaggag caaggtgaga tgacaggaga tcctgccccg gcacttcgcc 7320

caatagcagc cagtcccttc ccgcttcagt gacaacgtcg agcacagctg cgcaaggaac 7380

gcccgtcgtg gccagccacg atagccgcgc tgcctcgtcc tgcagttcat tcagggcacc 7440

ggacaggtcg gtcttgacaa aaagaaccgg gcgcccctgc gctgacagcc ggaacacggc 7500

ggcatcagag cagccgattg tctgttgtgc ccagtcatag ccgaatagcc tctccaccca 7560

agcggccgga gaacctgcgt gcaatccatc ttgttcaatc atgcgaaacg atccagatcc 7620

ggtgcagatt atttggattg agagtgaata tgagactcta attggatacc gaggggaatt 7680

tatggaacgt cagtggagca tttttgacaa gaaatatttg ctagctgata gtgaccttag 7740

gcgacttttg aacgcgcaat aatggtttct gacgtatgtg cttagctcat taaactccag 7800

aaacccgcgg ctgagtggct ccttcaacgt tgcggttctg tcagttccaa acgtaaaacg 7860

gcttgtcccg cgtcatcggc gggggtcata acgtgactcc cttaattctc cgctcatgat 7920

cagattgtcg tttcccgcct tcagtttgtg ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc 7980

ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata gtggactctt gttccaaact ggaacaacac 8040

tcaaccctat ctcgggctat tcttttgatt tataagggat tttgccgatt tcggaaccac 8100

catcaaacag gattttcgcc tgctggggca aaccagcgtg gaccgcttgc tgcaactctc 8160

tcagggccag gcggtgaagg gcaatcagct gttgcccgtc tcactggtga aaagaaaaac 8220

caccccagta cattaaaaac gtccgcaatg tgttattaag ttgtctaagc gtcaatttgt 8280

ttacaccaca atatatcctg ccaccagcca gccaacagct ccccgaccgg cagctcggca 8340

caaaatcacc actcgataca ggcagcccat cagtccggga cggcgtcagc gggagagccg 8400

ttgtaaggcg gcagactttg ctcatgttac cgatgctatt cggaagaacg gcaactaagc 8460

tgccgggttt gaaacacgga tgatctcgcg gagggtagca tgttgattgt aacgatgaca 8520

gagcgttgct gcctgtgatc aaatatcatc tccctcgcag agatccgaat tatcagcctt 8580

cttattcatt tctcgcttaa ccgtgacagg ctgtcgatct tgagaactat gccgacataa 8640

taggaaatcg ctggataaag ccgctgagga agctgagtgg cgctatttct ttagaagtga 8700

acgttgacga tatcaactcc cctatccatt gctcaccgaa tggtacaggt cggggacccg 8760

aagttccgac tgtcggcctg atgcatcccc ggctgatcga ccccagatct ggggctgaga 8820

aagcccagta aggaaacaac tgtaggttcg agtcgcgaga tcccccggaa ccaaaggaag 8880

taggttaaac ccgctccgat caggccgagc cacgccaggc cgagaacatt ggttcctgta 8940

ggcatcggga ttggcggatc aaacactaaa gctactggaa cgagcagaag tcctccggcc 9000

gccagttgcc aggcggtaaa ggtgagcaga ggcacgggag gttgccactt gcgggtcagc 9060

acggttccga acgccatgga aaccgccccc gccaggcccg ctgcgacgcc gacaggatct 9120

agcgctgcgt ttggtgtcaa caccaacagc gccacgcccg cagttccgca aatagccccc 9180

aggaccgcca tcaatcgtat cgggctacct agcagagcgg cagagatgaa cacgaccatc 9240

agcggctgca cagcgcctac cgtcgccgcg accccgcccg gcaggcggta gaccgaaata 9300

aacaacaagc tccagaatag cgaaatatta agtgcgccga ggatgaagat gcgcatccac 9360

cagattcccg ttggaatctg tcggacgatc atcacgagca ataaacccgc cggcaacgcc 9420

cgcagcagca taccggcgac ccctcggcct cgctgttcgg gctccacgaa aacgccggac 9480

agatgcgcct tgtgagcgtc cttggggccg tcctcctgtt tgaagaccga cagcccaatg 9540

atctcgccgt cgatgtaggc gccgaatgcc acggcatctc gcaaccgttc agcgaacgcc 9600

tccatgggct ttttctcctc gtgctcgtaa acggacccga acatctctgg agctttcttc 9660

agggccgaca atcggatctc gcggaaatcc tgcacgtcgg ccgctccaag ccgtcgaatc 9720

tgagccttaa tcacaattgt caattttaat cctctgttta tcggcagttc gtagagcgcg 9780

ccgtgcgtcc cgagcgatac tgagcgaagc aagtgcgtcg agcagtgccc gcttgttcct 9840

gaaatgccag taaagcgctg gctgctgaac ccccagccgg aactgacccc acaaggccct 9900

agcgtttgca atgcaccagg tcatcattga cccaggcgtg ttccaccagg ccgctgcctc 9960

gcaactcttc gcaggcttcg ccgacctgct cgcgccactt cttcacgcgg gtggaatccg 10020

atccgcacat gaggcggaag gtttccagct tgagcgggta cggctcccgg tgcgagctga 10080

aatagtcgaa catccgtcgg gccgtcggcg acagcttgcg gtacttctcc catatgaatt 10140

tcgtgtagtg gtcgccagca aacagcacga cgatttcctc gtcgatcagg acctggcaac 10200

gggacgtttt cttgccacgg tccaggacgc ggaagcggtg cagcagcgac accgattcca 10260

ggtgcccaac gcggtcggac gtgaagccca tcgccgtcgc ctgtaggcgc gacaggcatt 10320

cctcggcctt cgtgtaatac cggccattga tcgaccagcc caggtcctgg caaagctcgt 10380

agaacgtgaa ggtgatcggc tcgccgatag gggtgcgctt cgcgtactcc aacacctgct 10440

gccacaccag ttcgtcatcg tcggcccgca gctcgacgcc ggtgtaggtg atcttcacgt 10500

ccttgttgac gtggaaaatg accttgtttt gcagcgcctc gcgcgggatt ttcttgttgc 10560

gcgtggtgaa cagggcagag cgggccgtgt cgtttggcat cgctcgcatc gtgtccggcc 10620

acggcgcaat atcgaacaag gaaagctgca tttccttgat ctgctgcttc gtgtgtttca 10680

gcaacgcggc ctgcttggcc tcgctgacct gttttgccag gtcctcgccg gcggtttttc 10740

gcttcttggt cgtcatagtt cctcgcgtgt cgatggtcat cgacttcgcc aaacctgccg 10800

cctcctgttc gagacgacgc gaacgctcca cggcggccga tggcgcgggc agggcagggg 10860

gagccagttg cacgctgtcg cgctcgatct tggccgtagc ttgctggacc atcgagccga 10920

cggactggaa ggtttcgcgg ggcgcacgca tgacggtgcg gcttgcgatg gtttcggcat 10980

cctcggcgga aaaccccgcg tcgatcagtt cttgcctgta tgccttccgg tcaaacgtcc 11040

gattcattca ccctccttgc gggattgccc cgactcacgc cggggcaatg tgcccttatt 11100

cctgatttga cccgcctggt gccttggtgt ccagataatc caccttatcg gcaatgaagt 11160

cggtcccgta gaccgtctgg ccgtccttct cgtacttggt attccgaatc ttgccctgca 11220

cgaataccag cgaccccttg cccaaatact tgccgtgggc ctcggcctga gagccaaaac 11280

acttgatgcg gaagaagtcg gtgcgctcct gcttgtcgcc ggcatcgttg cgccacatct 11340

aggtactaaa acaattcatc cagtaaaata taatatttta ttttctccca atcaggcttg 11400

atccccagta agtcaaaaaa tagctcgaca tactgttctt ccccgatatc ctccctgatc 11460

gaccggacgc agaaggcaat gtcataccac ttgtccgccc tgccgcttct cccaagatca 11520

ataaagccac ttactttgcc atctttcaca aagatgttgc tgtctcccag gtcgccgtgg 11580

gaaaagacaa gttcctcttc gggcttttcc gtctttaaaa aatcatacag ctcgcgcgga 11640

tctttaaatg gagtgtcttc ttcccagttt tcgcaatcca catcggccag atcgttattc 11700

agtaagtaat ccaattcggc taagcggctg tctaagctat tcgtataggg acaatccgat 11760

atgtcgatgg agtgaaagag cctgatgcac tccgcataca gctcgataat cttttcaggg 11820

ctttgttcat cttcatactc ttccgagcaa aggacgccat cggcctcact catgagcaga 11880

ttgctccagc catcatgccg ttcaaagtgc aggacctttg gaacaggcag ctttccttcc 11940

agccatagca tcatgtcctt ttcccgttcc acatcatagg tggtcccttt ataccggctg 12000

tccgtcattt ttaaatatag gttttcattt tctcccacca gcttatatac cttagcagga 12060

gacattcctt ccgtatcttt tacgcagcgg tatttttcga tcagtttttt caattccggt 12120

gatattctca ttttagccat ttattatttc cttcctcttt tctacagtat ttaaagatac 12180

cccaagaagc taattataac aagacgaact ccaattcact gttccttgca ttctaaaacc 12240

ttaaatacca gaaaacagct ttttcaaagt tgttttcaaa gttggcgtat aacatagtat 12300

cgacggagcc gattttgaaa ccacaattat gggtgatgct gccaacttac tgatttagtg 12360

tatgatggtg tttttgaggt gctccagtgg cttctgtgtc tatcagctgt ccctcctgtt 12420

cagctactga cggggtggtg cgtaacggca aaagcaccgc cggacatcag cgctatctct 12480

gctctcactg ccgtaaaaca tggcaactgc agttcactta caccgcttct caacccggta 12540

cgcaccagaa aatcattgat atggccatga atggcgttgg atgccgggca acagcccgca 12600

ttatgggcgt tggcctcaac acgattttac gtcacttaaa aaactcaggc cgcagtcggt 12660

aacctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac 12720

cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc 12780

gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc 12840

ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca 12900

cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc 12960

tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg 13020

ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct 13080

ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata accgtattac cgcctttgag tgagctgata 13140

ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc 13200

gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc atagtaacct 13260

cgcgcataca gccgggcagt gacgtcatcg tctgcgcgga aatggacgaa cagtggggct 13320

atgtcggggc taaatcgcgc cagcgctggc tgttttacgc gtatgacagt ctccggaaga 13380

cggttgttgc gcacgtattc ggtgaacgca ctatggcgac gctggggcgt cttatgagcc 13440

tgctgtcacc ctttgacgtg gtgatatgga tgacggatgg ctggccgctg tatgaatccc 13500

gcctgaaggg aaagctgcac gtaatcagca agcgatatac gcagcgaatt gagcggcata 13560

acctgaatct gaggcagcac ctggcacggc tgggacggaa gtcgctgtcg ttctcaaaat 13620

cggtggagct gcatgacaaa gtcatcgggc attatctgaa cataaaacac tatcaataag 13680

ttggagtcat tacccaatta tgatagaatt tacaagctat aaggttattg tcctgggttt 13740

caagcattag tccatgcaag tttttatgct ttgcccattc tatagatata ttgataagcg 13800

cgctgcctat gccttgcccc ctgaaatcct tacatacggc gatatcttct atataaaaga 13860

tatattatct tatcagtatt gtcaatatat tcaaggcaat ctgcctcctc atcctcttca 13920

tcctcttcgt cttggtagct ttttaaatat ggcgcttcat agagtaattc tgtaaaggtc 13980

caattctcgt tttcatacct cggtataatc ttacctatca cctcaaatgg ttcgctgggt 14040

ttatcgcacc cccgaacacg agcacggcac ccgcgaccac tatgccaaga atgcccaagg 14100

taaaaattgc cggccccgcc atgaagtccg tgaatgcccc gacggccgaa gtgaagggca 14160

ggccgccacc caggccgccg ccctcactgc ccggcacctg gtcgctgaat gtcgatgcca 14220

gcacctgcgg cacgtcaatg cttccgggcg tcgcgctcgg gctgatcgcc catcccgtta 14280

ctgccccgat cccggcaatg gcaaggactg ccagcgctgc catttttggg gtgaggccgt 14340

tcgcggccga ggggcgcagc ccctgggggg atgggaggcc cgcgttagcg ggccgggagg 14400

gttcgagaag ggggggcacc ccccttcggc gtgcgcggtc acgcgcacag ggcgcagccc 14460

tggttaaaaa caaggtttat aaatattggt ttaaaagcag gttaaaagac aggttagcgg 14520

tggccgaaaa acgggcggaa acccttgcaa atgctggatt ttctgcctgt ggacagcccc 14580

tcaaatgtca ataggtgcgc ccctcatctg tcagcactct gcccctcaag tgtcaaggat 14640

cgcgcccctc atctgtcagt agtcgcgccc ctcaagtgtc aataccgcag ggcacttatc 14700

cccaggcttg tccacatcat ctgtgggaaa ctcgcgtaaa atcaggcgtt ttcgccgatt 14760

tgcgaggctg gccagctcca cgtcgccggc cgaaatcgag cctgcccctc atctgtcaac 14820

gccgcgccgg gtgagtcggc ccctcaagtg tcaacgtccg cccctcatct gtcagtgagg 14880

gccaagtttt ccgcgaggta tccacaacgc cggcggccgc ggtgtctcgc acacggcttc 14940

gacggcgttt ctggcgcgtt tgcagggcca tagacggccg ccagcccagc ggcgagggca 15000

accagcccgg 15010

Claims

1.可变剪切因子基因SR30作为病害易感基因在提高作物抗病性或提高抗病性作物育种中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，沉默或敲除作物基因组中的可变剪切因子基因SR30能够提高作物的抗病性。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的可变剪切因子基因SR30为如下(1)或(2)：

(1)具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

(2)与SEQ ID NO.1相比具有至少60％以上的同源性的核苷酸序列；优选为，与SEQ IDNO.1相比具有至少70％以上的同源性的核苷酸序列；进一步优选为，与SEQ ID NO.1相比具有至少80％以上的同源性的核苷酸序列；更进一步优选为，与SEQ ID NO.1相比具有至少90％以上的同源性的核苷酸序列；最优选为，与SEQ ID NO.1相比具有至少95％以上的同源性的核苷酸序列。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，构建重组载体用于沉默或敲除作物基因组中的可变剪切因子基因SR30；构建重组沉默载体的方法是将核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的SR30的特异性沉默片段插入到植物转化质粒中；所述的植物转化质粒优选为病毒沉默载体pTRV2。

5.可变剪切因子基因SR30的特异性沉默片段、用于沉默可变剪切因子基因SR30的重组沉默载体或转化体在提高作物抗病性或提高抗病性作物育种中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述SR30基因特异性沉默片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述的重组沉默载体是将所述的特异性沉默片段插入到植物转化质粒中得到的；所述的植物转化质粒优选为病毒沉默载体pTRV2；所述的转化体由所述的重组沉默载体导入宿主细胞得到的；所述的宿主细胞优选大肠杆菌或农杆菌细胞。

7.可变剪切因子蛋白SR30作为负调控因子在提高作物抗病性或提高抗病性作物育种中的应用，其特征在于，该可变剪切因子蛋白SR30是如下(a)或(b)：

(a)由可变剪切因子基因SR30编码的蛋白；

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的由可变剪切因子基因SR30编码的蛋白具有如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，或者将SEQ ID NO：3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且能够作为负调控因子提高作物抗性的由SEQID NO：3衍生的蛋白；

所述的与可变剪切因子SR30的蛋白相比，在氨基酸序列上具有不小于60％相似性且能够作为负调控因子提高作物抗性的同源蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示；或者将SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且能够作为负调控因子提高作物抗性的由SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8衍生的蛋白。

9.含有可变剪切因子基因SR30的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在提高作物抗病性或提高抗病性作物育种中的应用。

10.一种提高作物抗病性的方法，其特征在于该方法为沉默或敲除作物基因组中的可变剪切因子基因SR30能够提高作物的抗病性。