CN104120136B

CN104120136B - 一种叶绿体铁转运基因NtPIC1及其应用

Info

Publication number: CN104120136B
Application number: CN201410225697.2A
Authority: CN
Inventors: 郭长虹; 龚勋; 于典司; 郭江涛; 王丹
Original assignee: Harbin Normal University
Current assignee: Harbin Normal University
Priority date: 2014-05-27
Filing date: 2014-05-27
Publication date: 2017-02-15
Anticipated expiration: 2034-05-27
Also published as: CN104120136A

Abstract

本发明公开了烟草（Nicotiana tabacum cv. SR‑1）叶绿体铁转运基因NtPIC1及其编码蛋白在叶绿体铁转运中的应用。该基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示；其对应的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示；它包含849bp的开放阅读框，编码282个氨基酸，预测的分子量为29.7kDa。其开放阅读框核苷酸序列在GeneBank上的登录号为KF640606。通过GFP融合蛋白细胞定位分析NtPIC1蛋白定位在叶绿体膜上。酵母功能互补实验证明该基因在酵母中的表达可有效的转运铁离子。本发明将所述基因NtPIC1导入到烟草中，获得了叶绿体高铁含量的转基因烟草，研究结果表明NtPIC1基因参与叶绿体铁转运及叶绿体的发育过程。

Description

一种叶绿体铁转运基因NtPIC1及其应用

技术领域

本发明涉及烟草叶绿体铁转运基因NtPIC1的克隆及其在烟草叶绿体铁转运中的应用，属于植物基因工程领域。

背景技术

铁是植物正常生命活动所必需的微量元素，位居植物必需微量元素的首位。铁参与多种生命活动代谢过程，包括光合作用，呼吸作用，叶绿素合成，是亚铁血红素和铁硫蛋白的重要成分。铁离子具有活跃的二价与三价的变化，是细胞内电子传递链所必需的组分。

尽管地壳中的铁丰度很高，但土壤中可利用的Fe²⁺由于受土壤溶液pH值及氧分压的影响会形成不可溶的Fe³⁺，从而限制了土壤中铁的有效性，也限制了地球表面的大量金属铁的可利用性。在许多国家的干旱、半干旱地区的石灰性土壤及盐碱土壤上广泛存在着植物缺铁问题。植物缺铁失绿症是一个世界性植物营养失调问题，也是植物营养学研究的热点之一。植物缺铁会导致叶绿素合成减少，光合速率降低，严重缺铁时叶绿素合成停止，新叶变黄，生物量大幅度下降。植物缺铁不仅影响植物的生长发育，也造成巨大的经济损失，而且影响动物和人类对铁的获取，从而导致许多缺铁性疾病的发生。人类铁营养的缺乏已经成为当今世界最为严重的营养缺素症之一。当人体由于某种原因不能摄入足量的铁营养时，就会引起如Wilson、Pakinson、Menken及贫血病（anemia）等许多生理功能异常疾病，危及患者智力和体能的发育及身体健康。

在高等植物中叶绿体是光合作用的位点，提供生命所必需的氧和碳。叶绿体含有叶肉细胞80%以上的铁，而类囊体膜上含有叶子中的60%的铁，叶绿体作为植物细胞中铁含量最丰富的系统，是金属铁离子主要的存在部位。因此，叶绿体中铁的吸收及利用与植物的生长和发育息息相关。第一个叶绿体铁转运基因PIC1首先在拟南芥中被发现，在其他物种中未见报道。铁离子转运在铁代谢过程中起关键作用，对植物生长、发育和抗逆性具有重要的意义。烟草（Nicotiana tabacum）作为世界上重要的经济作物，它的质量和产量受到铁的严重影响。对于烟草叶绿体铁转运基因的获得与研究将为从基因工程培育高效铁吸收品种提供重要的理论基础，具有深远的实践意义。

发明内容

本发明的目的是提供一个烟草（Nicotiana tabacum cv. SR-1）叶绿体铁转运基因NtPIC1及其在烟草叶绿体铁转运中的应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明通过RT-PCR的方法从烟草中克隆得到了NtPIC1基因的全长cDNA，该基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，其编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示。

本发明所述的基因NtPIC1，其在GeneBank中的登录号为KF640606。

本发明提供的NtPIC1基因结构特性分析表明：NtPIC1基因cDNA全长为849bp,该基因编码282个氨基酸，蛋白分子量为29.7kDa，NtPIC1是疏水蛋白，含有基本的等电点，有四个跨膜结构域,包含70个氨基酸的叶绿体定位转运肽。经Southern blot 检测该基因在烟草中为单拷贝基因。将其氨基酸序列在NCBI中Blast分析，发现与AtPIC1（拟南芥，AY057510）相比,氨基酸同源性为60%。采用GFP融合蛋白细胞定位的方法，分析表明该基因定位在叶绿体膜上。酵母功能互补实验证明该基因在酵母中的表达可以有效的转运铁。

将本发明的烟草NtPIC1应用于叶绿体铁转运，具体为将含有本发明NtPIC1基因的植物表达载体导入到烟草中，培育筛选得到NtPIC1过表达植株转基因植物。

具体步骤为：1）将烟草叶绿体铁转运基因NtPIC1核苷酸序列置于CaMV35S 启动子之下，构建植物表达载体；2）将表达载体转入农杆菌LBA4404感受态细胞；3）利用2）获得的转化子转化烟草，获得转基因烟草植株。

通过Real-time PCR方法对NtPIC1在过表达转基因烟草中的表达量进行了检测。结果显示，所获得的转基因植株中NtPIC1的表达量显著提高。对获得的转基因烟草进行叶绿体铁含量和叶绿素含量的测定，经分析表明，转基因植株与野生型相比较，叶绿体铁含量和叶绿素含量显著升高，叶片颜色呈明显深绿色。并且通过叶绿体亚显微观察, NtPIC1过表达转基因植株的叶绿体中类囊体膜堆叠更加密集且含有大量的淀粉粒，反应了更强的光合作用。综上所述，本发明获得的NtPIC1是一个叶绿体铁转运蛋白，位于叶绿体膜上，不仅对铁在叶绿体中的转运及叶绿体的发育起到重要作用，还具有重要的经济价值。

本发明首次公开了一种烟草叶绿体铁转运基因NtPIC1，并获得了编码该基因的蛋白氨基酸序列，同时运用分子生物学及基因工程技术证实了烟草NtPIC1参与叶绿体铁转运及叶绿体的发育。同时基于此研究结果，为通过基因工程或分子育种提高叶绿体铁吸收利用和富集提供了必要的理论依据和技术支持，具有较大的应用前景。

附图说明

序列表SEQ ID NO:1是本发明克隆的NtPIC1基因的核苷酸序列，序列长度为849bp。

序列表SEQ ID NO:2是NtPIC1基因编码的氨基酸序列。

图1为NtPIC1蛋白的叶绿体膜定位结果。a-d表示GFP空载体转化原生质体；e-h表示GFP-NtPIC1融合蛋白定位在叶绿体膜上。

图2为表达NtPIC1的酵母转化株的异源功能互补结果。

图3为qRT-PCR分析过表达株系的NtPIC1表达量。

图4为转基因烟草表型及叶绿体铁含量和叶绿素含量的测定。a为转基因植株的表型；b为转基因植株叶绿体的铁含量；c为转基因植株的叶绿素含量。WT，烟草野生型；OX，过表达株系。

图5为转基因烟草叶绿体透射电镜显微观察。a-c野生型对照；d-f NtPIC1过表达植株。c，f分别是b，e中矩形部分的放大图像；S，淀粉颗粒。

具体实施方式

下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、一种烟草叶绿体铁转运基因NtPIC1全长cDNA克隆。

从NCBI数据库中（(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）搜索烟草的EST序列并保存，用数据库中已知的拟南芥AtPIC1序列在BioEdit软件中对保存的烟草EST序列文本文件进行Local Blast，这样就获得了烟草中PIC1基因EST序列。利用该序列设计引物，引物为：

NtPIC1-F1：5'-CGAACAAAACTAGCTATGCAAAC-3'；

NtPIC1-R1：5'-GACTCCCAATCACTTCATGC-3'。

具体流程如下：

RNA的提取：利用TRIZOL试剂盒提取烟草（Nicotiana tabacum cv. SR-1）幼叶RNA，反转录为cDNA，并以此cDNA为模板RT-PCR扩增NtPIC1全长序列。

RT-PCR反应：用KOD-plus DNA 聚合酶 (Toyobo)进行RT-PCR反应，反应程序：94℃预变性2min；94℃变性15sec；57℃退火30sec；68℃延伸50sec；25个循环；72℃延伸10min。将RT-PCR产物5'末端磷酸化，将磷酸化后的片段克隆到pBluescriptII sk+(Stratagene,California, USA)质粒载体中的EcoRV位点。重组质粒转化到大肠杆菌DH5α(Toyobo)中，将插入的核苷酸序列利用CEQ8000 DNA Sequencer(Beckman Coulter, California, USA)进行测序。

最终鉴定得到NtPIC1基因ORF的全长序列。NtPIC1基因cDNA全长为849bp,该基因编码282个氨基酸，蛋白分子量为29.7kDa，NtPIC1是疏水蛋白，含有基本的等电点，有四个跨膜结构域，包含70个氨基酸的叶绿体定位转运肽。经Southern blot 检测该基因在烟草中为单拷贝基因。将其氨基酸序列在NCBI中Blast分析，发现与AtPIC1（拟南芥，AY057510）相比,氨基酸同源性为60%。

实施例2、烟草叶绿体铁转运基因NtPIC1亚细胞定位。

一、载体构建

首先PCR获得含NtPIC1基因编码区全长的序列（不含终止子），所用引物为含有BamHI和SacI酶切位点：

NtPIC1-BamHI：CGCGGATCCATGCAAACTCTACTCTTG；

NtPIC1-SacI-1：CGAGCTCTGCAATCCTTGGTAC。

将PCR产物用SacI酶切，回收片段进行平滑处理：DNA 21µL，KOD 1.5µL，10×Blunting Buffer 4µL，H₂O 3.5µL。平滑反应条件：72℃保温5min，立即4℃冷却以停止平滑反应。酚氯仿回收平滑产物。然后再用BamHI酶切，用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，胶回收酶切产物；pBI221（Biovector）载体先用SmaI酶切，产生平末端，酚氯仿回收酶切产物；再用BamHI酶切，回收酶切产物。通过T4 DNA连接酶16℃保温连接PCR酶切产物与载体，过夜。将连接产物转入大肠杆菌中，得到转化子。提取转化子质粒，送去测序，得到NtPIC1-GFP表达载体。

二、原生质体瞬时转化

1、原生质体转化主要试剂如下：

酶解液：纤维素酶R10 0.2g、离析酶R10 (Yakult Honsha, Tokyo, Japan)0.015g、甘露醇1.09g、水7mL、0.3M KCl 1mL、0.3M MES 1mL（pH 5.7），以上药品混匀55℃加热10min，冷却至室温后加入0.15M CaCl₂ 1mL、1.5% BSA 1mL。

PEG溶液 (40%, v/v)：PEG4000 (Fluka, #81240) 1g、H₂O 0.75mL、0.8M甘露醇0.625mL、1M Ca(NO₃)₂ 或CaCl₂ 0.25mL。

W5溶液（pH 5.8）：NaCl 9.0g、CaCl₂ 18.4g、KCl 0.37g、葡萄糖0.9g、MES 0.3g，加入蒸馏水并用蒸馏水定容至1000mL。

MaMg溶液（pH 5.6）：1M MgCl₂ 1.5mL、MES 0.1g、甘露醇7.3g，加入蒸馏水并用蒸馏水定容至100mL。

2、原生质体瞬时转化具体操作如下：

MS培养基上萌发烟草（Nicotiana tabacum cv. SR-1）种子，取4周苗龄烟草的叶片，约90片，切成1mm宽的长条。准备好一个90mm培养皿，称1.82g D－甘露醇于20ml双蒸水中。培养皿的盖子用来切叶片。将切好的长条，置于甘露醇溶液中。可以一边切一边从植株上取。将切好的细条从甘露醇溶液中捞出，置于酶解液中。黑暗，23℃，40-50rpm酶解3小时。酶解液过100-200目的筛子，将过滤后的绿色混合物置于15mL离心管（直径约1cm）中，均分为两管。4℃，60g，15min。弃上清，沉淀用冰冷的W5溶液轻柔洗涤，每管4mL。4℃，100g，1min。弃上清，沉淀用冰冷的W5溶液轻柔洗涤，每管4mL。冰上放置30min。23℃，100g，1min。弃上清，每管沉淀用0.5mL MaMg重悬，即为得到的原生质体溶液。取约10-20ug GFP-NtPIC1质粒于1.5mL EP管中，加100uL提取的原生质体。用200uL枪头（剪去前端）轻柔混匀。加入110uLPEG/Ca²⁺ 溶液，轻柔混匀。放置20-30min。加入0.44mL W5溶液，来回颠倒混匀。23℃，100g，1min。弃上清，加1mL W5，混匀。上述混合液体置于六孔板内，23℃，弱光，孵育6-18小时。利用激光共聚焦扫描显微镜TCS-SP5 (Leica Lasertechnik GmbH, Heidelberg, Germany)进行荧光观察。

图1结果表明NtPIC1-GFP融合蛋白荧光信号在叶绿体边缘，说明NtPIC1蛋白定位在叶绿体膜上。

实施例3、烟草叶绿体铁转运基因NtPIC1功能分析。

一、酵母表达载体的构建

利用以下一对引物，在NtPIC1 5'和3'端分别引入BamHI，SacI酶切位点：

NtPIC1-BamHI：CGCGGATCCATGCAAACTCTACTCTTG；

NtPIC1-SacI-2：CGAGCTCTCATGCAATCCTTGGTAC。

将PCR产物用SacI酶切，回收片段进行平滑处理：DNA 21µL，KOD 1.5µL，10×Blunting Buffer 4µL，H₂O 3.5µL。平滑反应条件：72℃保温5min，立即4℃冷却以停止平滑反应。酚氯仿回收平滑产物。再用BamHI酶切，得到的PCR产物用1%凝胶电泳鉴定，胶回收。酵母表达载体pYES2.0（购自Invitrogen）先用NotI酶切，经过平滑处理（同上），再用BamHI酶切，胶回收酶切产物。将PCR酶切产物与载体通过T4 DNA连接酶16℃保温连接过夜，将连接产物转入大肠杆菌中，得到转化子。提取转化子质粒。经鉴定，得到含有NtPIC1基因的酵母表达载体。

二、酵母的转化及鉴定。

1、酵母转化主要试剂如下：

（1）1×PEG/LiAc：50％（w/v）PEG3350 8mL、10×TE buffer 1mL、10×LiAc 1mL。

（2）10×TE Buffer：100mM Tris-HCl、10mM EDTA，pH=7.5，121℃高压灭菌，室温保存。

（3）1×TE/LiAc：10×TE buffer 1mL、10×LiAc 1mL、ddH₂O.8mL。

（4）YPD培养基：1%酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖，若制固体培养基，加入2%琼脂粉。121℃，20min，高压灭菌。

注：葡萄糖，酵母膏,蛋白胨溶液混合后在高温下可能会发生化学反应，导致培养基成分变化，所以要分别灭菌后再混合。葡萄糖可以过滤除菌，也可以115℃，15min灭菌。

（5）SC-minaral medium培养基：参照pYES2.0 user Manual（Invitrogen，Cat.no.V825–20）。

2、酵母转化使用常规醋酸锂转化方法（参照clontech 《Yest ProtocolsHandbook》），构建好的酵母表达载体pYES-NtPIC1转化高亲和和低亲和铁转运的双突变体DEY1453（由中国农业大学，左元梅教授惠赠），和野生菌株BY4741（由浙江大学，郑绍健教授惠赠）。转化子在SC-minaral medium平板上进行筛选。28℃培养2天，挑取单克隆，进行菌落PCR鉴定。

三、异源互补功能验证

具体操作如下：挑DEY1453和BY4741 YPD单菌落到SC培养基中，28℃过夜摇菌。向20mL新的SC培养基中加适量菌液，调节OD600值为0.2，接着摇4小时左右，取1mL菌液离心30S，去上清，加1mL10×TE涡旋混匀，离心30S，去上清，重复2遍后加1mL灭菌水重复洗两遍，最后加300µL灭菌水涡旋混匀，测定OD600值，用灭菌水将OD600值稀释调节为1，然后依次稀释10倍，得到OD600值分别为0.1,0.01,0.001浓度梯度的菌液，然后分别将该菌液依次点10µL于SC-ura-(分别含有0µM,10µM, 15µM, 20µM FeCl3)平板，放置30℃培养室,培养3-4天，比较酵母的生长情况。DEY1453（fet3fet4）是酵母铁吸收的低亲和系统FET4，以及高亲和系统FET3-FTR的基因发生了突变，但当外源相应基因pYES-NtPIC1转入并表达后可以弥补它们的功能，使得酵母能够生长。如图2所示，在不同浓度FeCl₃的培养基中，转入pYES-NtPIC1的fet3fet4酵母长势明显好于转入空载体pYES的fet3fet4酵母生长，说明NtPIC1能够有效转运铁。

实施例4、NtPIC1的应用。

一、表达载体的构建

重组过表达载体pBI121-NtPIC1的构建

利用含有BamHI，SacI酶切位点的引物：

NtPIC1-BamHI：5'-CGCGGATCCATGCAAACTCTACTCTTG-3'；

NtPIC1-SacI-2：5'-CGAGCTCTCATGCAATCCTTGGTAC-3'

扩增整个NtPIC1蛋白的cDNA片段，用1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。PCR产物序列进行鉴定然后用限制性内切酶BamHI和SacI双酶切上述PCR产物，回收酶切产物，将该酶切产物与经过同样酶切植物表达载体pBI121得到的载体骨架连接，得到连接产物。将连接产物转入大肠杆菌中，得到转化子。提取转化子质粒，送去测序，将该载体命名为pBI121-NtPIC1，得到重组表达载体。

二、转基因植物的获得及鉴定

1、转基因株系的获得

将重组过表达载体pBI121-NtPIC1经农杆菌介导的圆盘法转化转入烟草（Nicotiana tabacum cv. SR-1）中。

2、转基因烟草株系的NtPIC1基因荧光定量PCR（qRT-PCR）检测

将上述转基因烟草用qRT-PCR的方法进行检测，所用的引物为：

NtPIC1up：5'-GCAGCGGCTTTCGTTTCAGT-3'；

NtPIC1low：5'-CAGCAGCACCCATTCCCAGA-3'。

作为内参的GAPDH引物为：

GAPDHup：5'-GGAAAGTCCTACCAGCATTG-3'；

GAPDHlow：5'-ATCTATTGTCTCCCACGAAG-3'。

RNA的提取：用植物RNA抽提试剂盒（天根生化科技有限公司，上海）提取烟草总RNA，然后利用Revertra Ace（Toyobo）试剂盒反转录合成cDNA。

qRT-PCR体系：荧光定量qRT-PCR利用7300 Biosystem，根据SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa)说明书进行操作。反应体系：总体积20µL包括SYBR Premix ExTaq II 10µL；反转录cDNA 2µL；10µM的引物各0.8µL；水6.0µL；ROX Reference Dye (50x) 0.4µL。利用2^-△△CT方法计算表达量。

结果如图3所示，筛选出NtPIC1表达量显著升高的阳性过表达NtPIC1转基因烟草植株6个株系分别是OX1，OX11，OX13，OX19，OX30，OX33。

上述株系均为阳性转基因植物。分别选择其中的三个株系作为以下实验材料，过表达株系为OX1，OX13，OX33。

三、转基因株系的叶绿体铁含量及叶绿素含量的测定

1、叶绿体铁含量测定

所用试剂：

MCBI（pH 8.0）：0.3M甘露糖、50mM HEPES、2mM EDTA•2Na、β-巯基乙醇 348µL、0.6%PVP（聚乙烯吡咯烷酮）、0.1% BSA。

MCBII（pH 8.0）：0.32M甘露糖、0.5mM HEPES、2mM EDTA-2Na。

具体操作如下：

取1.0g新鲜叶片，用剪刀将其剪碎，研磨成匀浆，加入5mL预冷提取缓冲液MCBI，匀浆搅拌直到成为均匀的混合物。用4层纱布过滤掉残渣，收集滤过液。200g 4℃离心1min，弃沉淀。转移上清至干净的管中，3000g离心7min，弃上清。每管加入2mL MCBI重悬，轻轻地上下颠倒混匀，避免气泡，可用枪将沉淀吸打混匀。小心地将悬液平铺在500µL 40% Percoll溶液上。缓慢贴管壁加入，分层。3000g 4℃离心6min，小心去上清，用枪头吸净深绿色物质并将其转移至干净的管中。加入等体积 MCBI，3000g 4℃离心1min。弃上清，向沉淀中加入1mL MCBII 溶液，溶解沉淀，即获得完整的叶绿体溶液。在获得的1mL叶绿体溶液里，加入95%的乙醇4mL，2000r/min处理5min，A652测定其叶绿素含量。然后取1mL加入1mL邻二氮杂菲和1mL对苯二酚处理半个小时，A510测定总铁含量。（单位g*ug(chl)^-1g(FW)^-1）。

Chl=A652*（26/34.5）*5

叶绿体铁含量（g*ug(chl)^-1g(FW)^-1)=（A510+0.00069）/(0.0975*FW*chl)

注：全部为冰上操作

2、参照《现代植物生理学实验指南》，采用丙酮法测定烟草的叶绿素含量：

（1）叶绿素提取：称取叶片0.1g，剪碎后液氮研磨，粉末转移至大离心管中，1mL80%丙酮洗研钵，重复2-3次，直至研钵无色，洗液均转至大离心管中，13000rpm，离心3min，取上清至15mL离心管，避光保存。沉淀再加1mL 80%丙酮吹打混匀，13000rpm，离心3min，取上清，重复此步骤直至沉淀为白色。

（2）样品测定：混匀上述上清，测量体积，取3ml，紫外分光光度计645nm和663nm下分别测量其吸光值，80%丙酮做空白对照。

（3）结果计算：Ca=12.72×A663－2.59×A645；C_b=22.88×A645－4.67×A663；Ca+b=8.02×A663+20.21×A645

叶绿素含量(mg/g•FW)=色素浓度(mg/L)×提取液总量(mL)×10^-3/样品鲜重(g)

如图4所示，过表达NtPIC1转基因烟草叶绿体铁含量和叶绿素含量显著高于野生型。说明NtPIC1参与叶绿体铁的转运。并且从表型上观察发现，NtPIC1过表达植株的叶片呈现深绿色。

四、叶绿体亚显微结构分析

具体操作如下：

分别取野生烟草和转基因烟草叶片，切成横切面为小于0.5mm的细长条；通过抽真空浸泡在2.5％戊二醛中固定，清洗后，再用1％锇酸后固定；经常规方法用系列乙醇脱水后，用Epon812树脂包埋，超薄切片；经醋酸铀和柠檬酸铅双重染色；于Hitachi H7650FA(100kV TEM, http://www.hitachi-hta.com)透射电镜观察、拍照。

结果如图5：NtPIC1过表达植株的叶肉细胞中含有大量的叶绿体并且类囊体片层结构堆叠更加密集，叶绿体中含有大的淀粉颗粒，间接反映了NtPIC1过表达植株的光合作用更强。这些说明NtPIC1影响了叶绿体的发育。

<110> 哈尔滨师范大学

<120> 一种叶绿体铁转运基因NtPIC1及其应用

<130>

<160>

<210> 1

<211> 849

<212> DNA

<213> 烟草（Nicotiana tabacum）

<400> 1

atgcaaactc tactcttgcc gtcggctcac tccgtcaccg gcagtgcgcc atcagctctt 60

tcctcggccg gaaaaccatg tcggcataat ttccttggac gccaaattac cctaatttct 120

tcgccctcat cattatcttt atctccctta aagacaaagc ctctttcttt gccccagttt 180

agtctcataa acaaacggtc cagaatatta gcttctgctc ccctttctcc accctacact 240

tccccaaatg acgagtctga aaaagctaaa ttagctcagg ttgcgaaaag actacagaat 300

actgcaaggt acttcaagag attgggtagt ctagggtttt ggggacagct ggtatgtacg 360

cttgttgctg cggtgatcct ttcattttct gttgttatta cggggaatat tacatctccc 420

ttcacattct actcaactgc gggtggaatt gcagcggctt tcgtttcagt tttttggtca 480

ttcggctata ttcgcttgtc tgaaaagctt cggaggacag ctaatgagcc ttcaaaggct 540

cctcctcgtg ctgacgttgt gaaaagcttg aagaatggaa tagtggtgaa ccttctggga 600

atgggtgctg ctgtacttgg catgcaagca actgtcggat cgttggtggc taaggctctt 660

accacctcag ctaatccata tagtattact cctggaagta gccccgtgct tgctttggat 720

gtatttctgg ttcaggcatc agcaaatact atcgttgcac actttctagg tctagtattc 780

tcattggagc tgttgcgctc tgtcaccttg ccaccttcag aaggcattcc ggtaccaagg 840

attgcatga 849

<210> 2

<211> 282

<212> PRT

<213> 烟草（Nicotiana tabacum）

<400> 2

Met Gln Thr Leu Leu Leu Pro Ser Ala His Ser Val Thr Gly Ser Ala

1 5 10 15

Pro Ser Ala Leu Ser Ser Ala Gly Lys Pro Cys Arg His Asn Phe Leu

20 25 30

Gly Arg Gln Ile Thr Leu Ile Ser Ser Pro Ser Ser Leu Ser Leu Ser

35 40 45

Pro Leu Lys Thr Lys Pro Leu Ser Leu Pro Gln Phe Ser Leu Ile Asn

50 55 60

Lys Arg Ser Arg Ile Leu Ala Ser Ala Pro Leu Ser Pro Pro Tyr Thr

65 70 75 80

Ser Pro Asn Asp Glu Ser Glu Lys Ala Lys Leu Ala Gln Val Ala Lys

85 90 95

Arg Leu Gln Asn Thr Ala Arg Tyr Phe Lys Arg Leu Gly Ser Leu Gly

100 105 110

Phe Trp Gly Gln Leu Val Cys Thr Leu Val Ala Ala Val Ile Leu Ser

115 120 125

Phe Ser Val Val Ile Thr Gly Asn Ile Thr Ser Pro Phe Thr Phe Tyr

130 135 140

Ser Thr Ala Gly Gly Ile Ala Ala Ala Phe Val Ser Val Phe Trp Ser

145 150 155 160

Phe Gly Tyr Ile Arg Leu Ser Glu Lys Leu Arg Arg Thr Ala Asn Glu

165 170 175

Pro Ser Lys Ala Pro Pro Arg Ala Asp Val Val Lys Ser Leu Lys Asn

180 185 190

Gly Ile Val Val Asn Leu Leu Gly Met Gly Ala Ala Val Leu Gly Met

195 200 205

Gln Ala Thr Val Gly Ser Leu Val Ala Lys Ala Leu Thr Thr Ser Ala

210 215 220

Asn Pro Tyr Ser Ile Thr Pro Gly Ser Ser Pro Val Leu Ala Leu Asp

225 230 235 240

Val Phe Leu Val Gln Ala Ser Ala Asn Thr Ile Val Ala His Phe Leu

245 250 255

Gly Leu Val Phe Ser Leu Glu Leu Leu Arg Ser Val Thr Leu Pro Pro

260 265 270

Ser Glu Gly Ile Pro Val Pro Arg Ile Ala

275 280

Claims

1.一种烟草叶绿体铁转运基因NtPIC1，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的烟草叶绿体铁转运基因NtPIC1，其特征在于：该核苷酸序列编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示。

3.含有权利要求1所述基因的表达载体。

4.按照权利要求3所述的表达载体，其特征在于：该表达载体是植物表达载体pBI121-NtPIC1及酵母表达载体pYES2.0-NtPIC1；其中，所述的NtPIC1核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。

5.权利要求1所述基因在烟草叶绿体铁转运中的应用。

6.根据权利要求5所述应用，其特征在于：构建所述烟草NtPIC1基因的过表达载体并转化烟草，获得叶绿体铁含量升高的转基因烟草。