CN103243114B - 一种融合基因及其所表达的蛋白和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种融合基因，具体的说，提供了一种转录因子基因SEQ ID NO.2与VP64基因融合形成的融合基因，融合基因中SEQ ID NO.2位于VP64基因的下游，通过SEQ ID NO.3连接，还提供了该融合基因所表达的融合蛋白SEQ ID NO.4，含该融合基因的载体及其构建方法，以及含该融合基因的转基因作物的生产方法。该融合基因具有明显的转录激活作用，可以增强转录因子的功能，延迟水稻开花抽穗时间，调控水稻种的生长发育，在生产中具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种转录因子基因Os11g01480与VP64基因融合形成的融合基因及其用途。
背景技术
水稻（Oryza sativa L.）是我国和全世界重要的粮食作物，是世界1/2以上人口的主食，也是一种重要的功能基因研究的模式植物，与其相关的遗传学和分子生物学研究一直倍受研究者的重视，转录水平的调控是基因表达调控的重要方式。在植物界中，能形成种子的植物约占植物总数的三分之二以上，作为重要的繁殖器官，种子同时也为人们提供食物来源，水稻就是其中的重要代表，其种子来源于受精后的胚珠。从分子生物学的角度来说，种子的发育和萌发是一个有次序的、选择性的基因表达过程，而转录因子在基因的精确调控中起到了关键性的作用。
植物MYB转录因子家族是功能多样，数量众多的转录因子家族之一，参与调控植物发育、代谢和生物与非生物胁迫反应等多种生理过程。拟南芥基因组测序后，全面对植物MYB基因家族进行了扫描和分类，目前随着分子生物学和遗传学的发展，已经在大豆、玉米、水稻、葡萄、杨树等多种植物物种中研究了MYB蛋白家族成员的功能。在控制MYB蛋白活性的调控机制、基因表达规律和靶标基因的研究发面取得了一定的进展。有报道介绍了MYB转录因子家族的分类、结构、生物功能以及调控机制。MYB结构域是一段约51-52个氨基酸的肽段，每隔18个氨基酸就规则性的间隔着色氨酸残基，它们参与了空间结构中疏水核心的形成。有时色氨酸残基会被某个芳香族氨基酸或疏水氨基酸所取代，尤其是在植物R2R3-MYB转录因子中，R2R3-MYB结构域的第一个色氨酸经常被亮氨酸、异亮氨酸或苯丙氨酸所取代。第一个色氨酸的C-末端通常是一族酸性氨基酸正是这些保守的氨基酸残基使MYB结构域折叠成螺旋-螺旋-转角-螺旋结构。
然而MYB家族DNA结合位点结构域功能研究较少，同时该家族对水稻抽穗期的研究及认识也很少，因此该转录因子的研究在理论上为进一步理解水稻开花抽穗期发育调控的分子机理提供了新的线索；在实践上也将为作物育种提供理论基础。
VP64是4个VP16功能域基序融合在一起组成的，是一类增强子。VP16最早在动物病毒基因中发现，现在已被广泛的应用到植物中，主要用于植物基因的转录控制的研究中，转录因子在体内的作用大体上可以分成两种：一种为转录增强子，另一种为转录抑制子。当转录因子和VP16功能域基序融合之后，转录因子的功能就会被增强，在转基因植株中就会出现更明显的表型变化。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种融合基因，该融合基因由转录因子Os11g01480基因（SEQ ID NO.2）与VP64基因融合形成，并通过SEQID NO.3连接，该融合基因用于激活转录，延迟水稻开花抽穗期和调控水稻种的生长发育。
为了实现本发明的这一目的，本发明提供了一种融合基因，包含VP64和SEQ ID NO.2，其中SEQ ID NO.2位于VP64的下游，通过连接序列SEQ ID NO.3相连。
本发明还提供了一种由上述融合基因表达得到的融合蛋白SEQID NO.4。
上述融合基因在激活转录，延迟水稻开花抽穗期或调控水稻种生长发育中的应用。
本发明还提供了一种载体，所述载体包含上述融合基因。
本发明提供一种上述载体的构建方法，该方法为：
（a）根据SEQ ID NO.2基因序列设计PCR扩增引物；
（b）以水稻总cDNA为模板，进行PCR，获得SEQ ID NO.2全序列；
（c）第一轮PCR：用加部分adaptor attB接头的基因引物，进行PCR;
（d）第二轮PCR：用第一轮的PCR产物为模板，用完整的adaptorattB作为引物，进行PCR；
（e）将上一步PCR产物克隆连接到PDONER克隆载体上，经测序鉴定得到与目的基因完全相同的序列；
（f）通过LR反应将SEQ ID NO.2序列构建到其目地基因的N端融合了VP64的植物表达载体上，获得目的载体。
本发明还提供了一种延迟水稻开花抽穗期的方法，该方法包括使用上述载体转化水稻愈伤组织细胞，使得融合基因在水稻愈伤组织细胞中表达。
本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞是用上述载体转化的宿主细胞。
本发明还提供一种生产含有上述融合基因的转基因作物的方法，该方法包括：
（a）取作物成熟种子，脱壳，消毒，接种到诱导培养基上培养；
（b）采用农杆菌介导的方法将含有所述融合基因的载体转入作物愈伤组织中；
（c）用含诱导剂和农杆菌的AAM转化液进行转化；
（d）将转化后的材料进行共培养，脱菌，筛选，分化，生根，转基因苗的锻炼和移栽；
（e）用潮霉素筛选转基因作物。
上述步骤（a）中的脱壳方式为人工或者机械脱壳。
上述步骤（e）通过在种子萌发前用100mg/L潮霉素浸泡两天实现。
本发明所提供的转录因子基因Os11g01480是首次报道从水稻中分离并获得功能鉴定的MYB family protein家族基因，该基因编码的蛋白发挥转录因子作用，与VP64融合形成的融合基因具有以下优点：
（1）增强Os11g01480基因的功能，使相应的转基因植株出现更明显的表型变化，具有转录激活作用；
（2）该融合基因可以延迟水稻抽穗期，调控水稻种的生长发育；
（3）该融合基因可用于探究调控水稻开花抽穗期的重要因子，为理解调控水稻抽穗机理提供新线索，从而为寻找与抽穗相关的产量和品质等重要的经济性状奠定重要的理论价值，在生产中也具有重要意义。
附图说明
图1为本发明实施例1中nVP64-hyg-asRED载体图谱；
图2为本发明实施例1中ubi:VP64-Os11g01480载体图谱；
图3为本发明中检测转基因阳性水稻株系的PCR结果，其中，WT为野生型水稻“kitaake”，TF876为VP64-Os11g01480转基因水稻株系；
图4为本发明Western blot检测转基因阳性株系结果，其中WT为野生型水稻“kitaake”，TF876-1、TF876-2为VP64-Os11g01480转基因水稻株系；
图5为本发明转基因水稻株系和野生型水稻开花抽穗时间统计结果，其中WT为野生型水稻“kitaake”，TF876-1、TF876-2为VP64-Os11g01480转基因水稻株系。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1
Os11g01480基因的分离和植物表达载体构建
（1）在植物转录因子数据库中找到Os11g01480基因，根据其序列设计PCR扩增引物，以水稻总cDNA为模板，进行PCR，获得Os11g01480全序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;
（2）按照PrimeSTAR聚合酶扩增体系和反应程序进行PCR。此过程中包含两轮PCR，第一轮PCR的引物用加部分adaptor attB接头的基因引物，而第二轮的模板用第一轮的PCR产物，并且引物用完整的adaptor attB引物;
（3）将PCR产物克隆连接到PDONER克隆载体上，经测序鉴定得到与目的基因完全相同的序列;
（4）通过LR反应将Os11g01480构建到其目地基因的N端融合了VP64的植物表达载体pCambia1301（nVP64-hyg-asRED，图1）上，获得载体ubi：VP64-Os11g01480（图2）。
实施例2
生产转基因水稻植株的方法
（1）取水稻成熟种子，人工或者机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子经消毒之后接种到诱导培养基上；
（2）选择外观良好，生长力好的水稻愈伤组织为受体材料，采用农杆菌介导的方法将载体ubi:VP64-Os11g01480转入水稻愈伤组织中，用含诱导剂和农杆菌的AAM转化液进行转化；
（3）转化后的材料经过共培养、脱菌、筛选、分化、生根、转基因苗的锻炼和移栽；
（4）用潮霉素（Hygromycin）筛选转基因水稻，种子萌发前用100mg/L潮霉素浸泡两天。
实施例3
转基因水稻的鉴定
为了检测Os11g01480基因是否整合进入水稻基因组DNA，提取了野生型和转基因水稻叶子DNA，从基因两端的植物表达载体上设计一段引物进行PCR鉴定转基因植株。通过PCR结果发现（图3），转基因水稻均扩增出目的条带，而野生型水稻中无此目的条带，初步确定Os11g01480基因已通过农杆菌介导的方法插入到水稻基因组中，PCR产物经测序结果分析是目的基因序列。
利用VP64抗体可以鉴定目的基因是否在转基因水稻中表达，随机取野生型和两株不同的转基因水稻叶子（命名为TF876-1和TF876-2）作为材料，用Western blot技术在蛋白质水平上鉴定，经过SDS-PAGE蛋白电泳，免疫印记之后，免疫荧光反应，Western blot鉴定结果（图4）表明转基因植株杂交出目的蛋白，而野生型植株未杂交出目的蛋白。
实施例4
转基因水稻表型分析
将转基因水稻和野生型亲本水稻于夏季种植于北京当地，随机选取野生型和两株不同的转基因水稻作为观察对象，从播种至抽穗统计开花时间，转基因VP64-Os11g01480水稻株系抽穗期比野生型水稻抽穗期显著延长2周时间(图5)。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (9)
1.一种用于激活转录，延迟水稻抽穗期的融合基因，其特征在于，由VP64和SEQ ID NO.2通过连接序列SEQ ID NO.3相连而融合形成，其中SEQ ID NO.2位于VP64基因的下游。
2.一种由权利要求1所述的融合基因表达得到的融合蛋白SEQID NO.4。
3.权利要求1所述的融合基因在激活转录，延迟水稻抽穗期中的应用。
4.一种载体，所述载体包含权利要求1所述的融合基因。
5.一种权利要求4所述载体的构建方法，该方法为：
(a)根据SEQ ID NO.2基因序列设计PCR扩增引物；
(b)以水稻总cDNA为模板，进行PCR，获得SEQ ID NO.2全序列；
(c)第一轮PCR：用加部分adaptor attB接头的基因引物，进行PCR；
(d)第二轮PCR：用第一轮的PCR产物为模板，用完整的adaptorattB作为引物，进行PCR；
(e)将上一步PCR产物克隆连接到PDONER克隆载体上，经测序鉴定得到与目的基因完全相同的序列；
(f)通过LR反应将SEQ ID NO.2序列构建到其目的基因的N端融合了VP64的植物表达载体上，获得目的载体。
6.一种延迟水稻抽穗期的方法，该方法包括使用权利要求4所述载体转化水稻愈伤组织细胞，使得所述融合基因在水稻细胞中表达。
7.一种生产含有权利要求1所述融合基因的转基因作物的方法，该方法包括：
(a)取作物成熟种子，脱壳，消毒，接种到诱导培养基上培养；
(b)采用农杆菌介导的方法将含有所述融合基因的载体转入作物愈伤组织中；
(c)用含诱导剂和农杆菌的AAM转化液进行转化；
(d)将转化后的材料进行共培养，脱菌，筛选，分化，生根，转基因苗的锻炼和移栽；
(e)用潮霉素筛选转基因作物。
8.根据权利要求7所述的生产方法，其特征在于，所述步骤(a)中的脱壳方式为人工或者机械脱壳。
9.根据权利要求7所述的生产方法，其特征在于，所述步骤(e)通过在种子萌发前用100mg/L潮霉素浸泡两天实现。
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| 水稻MYB cDNA的克隆和表达分析;陈俊等;《植物生理与分子生物学学报》;20021231;第28卷(第4期);267-274 * |
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