CN115197959A - 阳光玫瑰葡萄pepck基因过表达载体及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种阳光玫瑰葡萄PEPCK基因过表达载体，所述过表达载体为将阳光玫瑰葡萄PEPCK基因的目的片段插入pCAMBIA1302原始载体的CaMV35S启动子和mgfp5荧光序列之间，且删除目的片段的终止密码子得到的pCAMBIA1302‑PEPCK过表达载体。本发明还提供了上述过表达载体的构建方法与应用，通过本发明的阳光玫瑰葡萄PEPCK基因过表达载体能有效地对阳光玫瑰葡萄的风味进行调控，具有较高的推广价值与商业价值。
Description
技术领域
本发明涉及植物基因工程领域，具体而言，涉及一种阳光玫瑰葡萄PEPCK基因过表达载体及其构建方法和应用。
背景技术
阳光玫瑰葡萄(Vitis labrusca×vinifera‘Shine Muscat’)是日本果树研究所用‘安芸津21号’与‘白南’杂交育成的新品种，属欧美杂交种，具有树势健壮，花芽分化好，抗病性强等优势。阳光玫瑰是目前国内市场上经济效益最高的鲜食葡萄品种，近年来其种植面积逐渐扩大至6.67万hm2以上，特别在南方地区得到大力推广，其水分需求量比其他品种大，在栽培过程中需保持水源充足。但‘阳光玫瑰’葡萄为晚熟品种，产量低，适合冷藏储存，受土壤、气候条件以及栽培管理的影响，其长势存在差异，而葡萄长势能够影响葡萄品质。
糖异生是植物体内重要的代谢途径，其主要功能为将各种非糖类物质转换为糖，PEPCK是糖异生代谢途径第一部分的关键调控因子，同时在许多浆果类型(包括西红柿、鹅莓、蓝莓和红浆果)的果肉中，PEPCK丰度在果实成熟过程中大量增加，表明在这类植物果实中糖类物质的累积主要受到PEPCK调控的糖异生途径的影响。
过表达是一项分子技术，其可以提升目的基因在规定的细胞组织中的表达水平，以实现调控细胞内源变化的可能，PEPCK途径已被证实是葡萄体内的重要糖异生途径，过表达阳光玫瑰葡萄PEPCK基因将会很大程度上实现阳光玫瑰葡萄的品质调控。由于江浙一带夏季常有梅雨季节，高温多雨弱光，不利于葡萄果实糖分积累，为了加大市场竞争力，实现阳光玫瑰品质调控是提高经济效益的一项重要手段，通过对阳光玫瑰葡萄PEPCK基过表达的研究能够调控阳光玫瑰葡萄的品质，而目前市面上对于该技术的研究仍处于不完善的阶段。
发明内容
本发明所要解决其中一个技术问题是，针对现有技术的不足，提供一种阳光玫瑰葡萄PEPCK基因过表达载体，从而填补目前对于阳光玫瑰葡萄PEPCK基因过表达研究上的空缺，为今后的分子实验和阳光玫瑰葡萄品质提高打下基础。
为解决上述问题，本发明提供了一种阳光玫瑰葡萄PEPCK基因过表达载体，所述过表达载体为将阳光玫瑰葡萄PEPCK基因的目的片段插入pCAMBIA1302原始载体的CaMV35S启动子和mgfp5荧光序列之间，且删除目的片段的终止密码子得到的pCAMBIA1302-PEPCK过表达载体。
本发明要解决的其中一个技术问题是：提供上述过表达载体的构建方法，以填补目前生物工程领域在阳光玫瑰葡萄PEPCK基因过表达载体构建上的技术空缺。
为解决上述问题，本发明提供了一种所述阳光玫瑰葡萄PEPCK基因过表达载体的构建方法，包括：通过克隆技术获得阳光玫瑰葡萄PEPCK基因，将所述阳光玫瑰葡萄PEPCK基因的目的片段插入pCAMBIA1302原始载体，实现pCAMBIA1302-PEPCK过表达载体的构建。
作为优选的方案，所述构建方法包括以下步骤：
S1：阳光玫瑰葡萄PEPCK基因的编码区的克隆：
S11：提取阳光玫瑰葡萄果肉的RNA，逆转录为cDNA，并将cDNA保存于-20℃冰箱中备用；
S12：从NCBI中搜索得到葡萄的PEPCK基因全长序列，选择其中的CDS编码区，设计引物PEPCK-F和PEPCK-R用于PCR扩增；
S13：以cDNA为模板，利用PEPCK-F和PEPCK-R进行PCR扩增反应，得到PCR产物；将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，对目标条带进行回收，得到目的片段；将得到的目的片段连接Blunt载体，转入大肠杆菌感受态细胞；将转化后的大肠杆菌进行培养；挑取单菌落，完成克隆；
S2：pCAMBIA1302-PEPCK过表达载体的质粒设计：
S21：选定市售pCAMBIA1302原始载体的CaMV 35S启动子和mgfp5荧光序列之间的NcoⅠ酶切位点作为阳光玫瑰葡萄PEPCK基因的目的片段的引物插入位点，且删除目的片段的终止密码子，用SnapGene软件完成pCAMBIA1302-PEPCK过表达载体的质粒设计；
S22：根据设计好的pCAMBIA1302-PEPCK过表达载体序列，利用同源序列无缝克隆的原理，在阳光玫瑰葡萄PEPCK基因的目的片段的起始密码子前选择15-20个碱基序列，命名为第一序列，在阳光玫瑰葡萄PEPCK基因的目的片段删除的终止密码子后选择15-20个碱基序列，命名为第二序列；在阳光玫瑰葡萄PEPCK基因序列的头尾各选择15-20个碱基序列，分别命名为第三序列、第四序列，将所述的第一序列、第三序列拼接，将所述的第二序列、第四序列拼接，得到引物PEPCK-q-F和PEPCK-q-R；
S23：利用PEPCK-q-F和PEPCK-q-R对PEPCK基因的目的片段进行巢式PCR反应，将得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，对目标条带进行回收，得到含有与pCAMBIA1302载体同源序列的目的片段，为第一产物，放入-20℃冰箱内等待备用；然后用NcoI-HF对pCAMBIA1302质粒进行单酶切，获得线性化载体，对线性化载体进行琼脂糖凝胶电泳，对目标条带进行回收，得到第二产物，放入-20℃的环境下等待备用；将所述第一产物与所述第二产物遵循一步克隆法进行连接，连接后转化、涂板，获得阳性质粒，即得到pCAMBIA1302-PEPCK过表达载体的质粒。
作为优选的方案，所述步骤S12中，所述PEPCK-F和所述PPEPCK-R的序列如下：
PEPCK-F:ATGAAAATGGCAGGAAACGGA；
PEPCK-R:TTAGAAAGAAGATACCTTGTCCA。
作为优选的方案，所述步骤S13中，所述培养的条件为：在37℃的恒温箱内培养12h。
作为优选的方案，所述步骤S13中，所述挑取单菌落后还包括对单菌落进行PCR监测的步骤，包括：利用菌液PCR检测是否阳性克隆，若是，则对菌液进行序列测定，测序结果正确，即获得阳光玫瑰葡萄PEPCK基因的目的片段，若否，则重新进行克隆。
作为优选的方案，所述步骤S22中，所述PEPCK-q-F和PEPCK-q-R的序列如下：
PEPCK-q-F:ACACGGGGGACTCTTGACCAATGAAAATGGCAGGAAACGG；
PEPCK-q-R:TTTACTAGTCAGATCTACCAGAAAGAAGATACCTTGTCCA。
作为优选的方案，所述步骤S23中，所述巢式PCR反应的条件如下：PCR反应体系50μL：PEPCK 2μL、引物F/R 10μmol/L各1μL、2×Fast Pfu Master 25μL、ddH2O 21μL，PCR反应程序为：94℃1min30s；94℃20s，60℃20s，72℃1min，35个循环；72℃5min；4℃保温，得到PCR产物。
本发明要解决的另一个技术问题是，提供上述阳光玫瑰葡萄PEPCK基因过表达载体在调控阳光玫瑰葡萄口感风味中的应用，以解决目前在调控阳光玫瑰葡萄口感风味中的应用。
作为优选的方案，所述应用包括以下步骤：将pCAMBIA1302-PEPCK过表达载体通过农杆菌介导侵染阳光玫瑰葡萄花絮，实现阳光玫瑰葡萄PEPCK基因的过表达，以此调控阳光玫瑰葡萄果实中的糖酸含量，从而对阳光玫瑰葡萄口感风味进行调控，获得口感风味上佳的阳光玫瑰葡萄新品种。
本发明具有如下优点：
(1)本发明构建得到阳光玫瑰葡萄PEPCK基因的pCAMBIA1302PEPCK过表达载体，该载体拥有过表达PEPCK基因的能力，通过过表达PEPCK基因，直接调控阳光玫瑰葡萄果实中的糖酸含量，使阳光玫瑰葡萄果实在高温多雨弱光条件下也能收获高品质的葡萄，葡萄果实品质的提高也能提高果农的经济收入，在葡萄多品种的竞争中脱颖而出。本发明为过表达PEPCK基因，实现阳光玫瑰葡萄果实品质调控奠定基础。
(2)本发明在构建阳光玫瑰葡萄PEPCK基因的pCAMBIA1302 PEPCK过表达载体过程中没有采用传统的插入多克隆位点(MCS)，这是因为多克隆位点不一定会被表达，也不会具有荧光属性，具有不确定与不实用性。本发明根据pCAMBIA1302质粒本身的属性设计过表达位点，将阳光玫瑰葡萄PEPCK基因的目的片段插入点设计在pCAMBIA1302质粒的CaMV 35S启动子和mgfp5荧光序列之间，该设计方案不同于传统的载体设计，可更直接地得到希望的过表达结果。
附图说明
图1为阳光玫瑰葡萄PEPCK基因编码区的琼脂糖电泳图；
图2为pCAMBIA1302质粒单酶切的琼脂糖电泳图；
图3为pCAMBIA1302-PEPCK过表达载体的质粒验证琼脂糖电泳图；
图4为阳光玫瑰葡萄PEPCK基因的目的片段的引物插入位点示意图；
图5为pCAMBIA1302-PEPCK过表达载体的质粒验证测序图；
图6为pCAMBIA1302质粒图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细的说明。
本发明提供了一种阳光玫瑰葡萄PEPCK基因过表达载体，所述过表达载体为将阳光玫瑰葡萄PEPCK基因的目的片段插入pCAMBIA1302原始载体的CaMV35S启动子和mgfp5荧光序列之间，且删除目的片段的终止密码子得到的pCAMBIA1302-PEPCK过表达载体。
本发明还提供了上述过表达载体的构建方法，以填补目前生物工程领域在阳光玫瑰葡萄PEPCK基因过表达载体构建上的技术空缺。
为解决上述问题，本发明提供了一种所述阳光玫瑰葡萄PEPCK基因过表达载体的构建方法，包括：通过克隆技术获得阳光玫瑰葡萄PEPCK基因，将所述阳光玫瑰葡萄PEPCK基因的目的片段插入pCAMBIA1302原始载体，实现pCAMBIA1302-PEPCK过表达载体的构建。
优选的，所述构建方法包括以下步骤：
S1：阳光玫瑰葡萄PEPCK基因的编码区的克隆：
S11：提取阳光玫瑰葡萄果肉的RNA，逆转录为cDNA，并将cDNA保存于-20℃冰箱中备用；
S12：从NCBI中搜索得到葡萄的PEPCK基因全长序列，选择其中的CDS编码区，设计引物PEPCK-F和PEPCK-R用于PCR扩增；
S13：以cDNA为模板，利用PEPCK-F和PEPCK-R进行PCR扩增反应，得到PCR产物；将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，对目标条带进行回收，得到目的片段；将得到的目的片段连接Blunt载体，转入大肠杆菌感受态细胞；将转化后的大肠杆菌进行培养；挑取单菌落，完成克隆；
S2：pCAMBIA1302-PEPCK过表达载体的质粒设计：
S21：选定市售pCAMBIA1302原始载体的CaMV 35S启动子和mgfp5荧光序列之间的NcoⅠ酶切位点作为阳光玫瑰葡萄PEPCK基因的目的片段的引物插入位点，且删除目的片段的终止密码子，用SnapGene软件完成pCAMBIA1302-PEPCK过表达载体的质粒设计；
S22：根据设计好的pCAMBIA1302-PEPCK过表达载体序列，利用同源序列无缝克隆的原理，在阳光玫瑰葡萄PEPCK基因的目的片段的起始密码子前选择15-20个碱基序列，命名为第一序列，在阳光玫瑰葡萄PEPCK基因的目的片段删除的终止密码子后选择15-20个碱基序列，命名为第二序列；在阳光玫瑰葡萄PEPCK基因序列的头尾各选择15-20个碱基序列，分别命名为第三序列、第四序列，将所述的第一序列、第三序列拼接，将所述的第二序列、第四序列拼接，得到引物PEPCK-q-F和PEPCK-q-R；
S23：利用PEPCK-q-F和PEPCK-q-R对PEPCK基因的目的片段进行巢式PCR反应，将得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，对目标条带进行回收，得到含有与pCAMBIA1302载体同源序列的目的片段，为第一产物，放入-20℃冰箱内等待备用；然后用NcoI-HF对pCAMBIA1302质粒进行单酶切，获得线性化载体，对线性化载体进行琼脂糖凝胶电泳，对目标条带进行回收，得到第二产物，放入-20℃的环境下等待备用；将所述第一产物与所述第二产物遵循一步克隆法进行连接，连接后转化、涂板，获得阳性质粒，即得到pCAMBIA1302-PEPCK过表达载体的质粒。
优选的，所述步骤S12中，所述PEPCK-F和所述PPEPCK-R的序列如下：
PEPCK-F:ATGAAAATGGCAGGAAACGGA；
PEPCK-R:TTAGAAAGAAGATACCTTGTCCA。
优选的，所述步骤S13中，所述培养的条件为：在37℃的恒温箱内培养12h。
优选的，所述步骤S13中，所述挑取单菌落后还包括对单菌落进行PCR监测的步骤，包括：利用菌液PCR检测是否阳性克隆，若是，则对菌液进行序列测定，测序结果正确，即获得阳光玫瑰葡萄PEPCK基因的目的片段，若否，则重新进行克隆。
优选的，所述步骤S22中，所述PEPCK-q-F和PEPCK-q-R的序列如下：
PEPCK-q-F:ACACGGGGGACTCTTGACCAATGAAAATGGCAGGAAACGG；
PEPCK-q-R:TTTACTAGTCAGATCTACCAGAAAGAAGATACCTTGTCCA。
优选的，所述步骤S23中，所述巢式PCR反应的条件如下：PCR反应体系50μL：PEPCK2μL、引物F/R 10μmol/L各1μL、2×Fast Pfu Master 25μL、ddH2O 21μL，PCR反应程序为：94℃1min30s；94℃20s，60℃20s，72℃1min，35个循环；72℃5min；4℃保温，得到PCR产物。
本发明还提供了上述阳光玫瑰葡萄PEPCK基因过表达载体在调控阳光玫瑰葡萄口感风味中的应用，以解决目前在调控阳光玫瑰葡萄口感风味中的应用。
优选的，所述应用包括以下步骤：将pCAMBIA1302-PEPCK过表达载体通过农杆菌介导侵染阳光玫瑰葡萄花絮，实现阳光玫瑰葡萄PEPCK基因的过表达，以此调控阳光玫瑰葡萄果实中的糖酸含量，从而对阳光玫瑰葡萄口感风味进行调控，获得口感风味上佳的阳光玫瑰葡萄新品种。
以下结合具体的用量和材料对上述方案进行说明：
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例：
一种阳光玫瑰葡萄PEPCK基因过表达载体，该过表达载体为将阳光玫瑰葡萄PEPCK基因的目的片段插入pCAMBIA1302原始载体的CaMV 35S启动子和mgfp5荧光序列之间得到的pCAMBIA1302-PEPCK过表达载体。
阳光玫瑰葡萄PEPCK基因的pCAMBIA1302-PEPCK过表达载体的构建方法，通过克隆技术获得阳光玫瑰葡萄PEPCK基因，将阳光玫瑰葡萄PEPCK基因的目的片段插入设计好的pCAMBIA1302原始载体的可实现过表达的位点，实现pCAMBIA1302-PEPCK过表达载体的构建，具体包括以下步骤：
S1：阳光玫瑰葡萄PEPCK基因的编码区的克隆：
S11：利用RNA提取试剂盒(天根，中国)提取阳光玫瑰葡萄去皮果肉的RNA，获得RNA后采用NanoDrop2000微量核酸蛋白分析仪(Thermo Fisher，USA)测定RNA浓度，采用DYCP-31BN型琼脂糖水平电泳仪分析RNA完整性，阳光玫瑰葡萄PEPCK基因编码区的琼脂糖电泳图见图1；使用cDNA合成试剂盒(近岸，中国)将提取的RNA逆转录为cDNA，并将cDNA保存于-20℃冰箱中备用；
S12：从NCBI中搜索得到葡萄的PEPCK基因全长序列，选择其中的CDS编码区，利用Primer 5.0设计引物PEPCK-F和PEPCK-R并合成，用于PCR扩增，其序列分别为：
PEPCK-F:ATGAAAATGGCAGGAAACGGA；
PEPCK-R:TTAGAAAGAAGATACCTTGTCCA；
S13：以cDNA为模板，采用PCR技术，利用PEPCK-F和PEPCK-R进行PCR扩增反应：使用2×Fast Pfu Master Mix(近岸，中国)对PEPCK进行扩增，PCR反应体系(50μL)为：cDNA 2μL、引物F/R(10μmol/L)各1μL、2×Fast Pfu Master 25μL、ddH2O 21μL，PCR反应程序为：94℃1min30s；94℃20s，60℃20s，72℃1min，35个循环；72℃5min；4℃保温，得到PCR产物；将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，使用EasyPure Quick Gel Extraction Kit试剂盒(全是金，中国)对目标条带进行回收，得到目的片段；将得到的目的片段连接Blunt载体，转入大肠杆菌感受态细胞；将转化后的大肠杆菌在37℃恒温箱培养12h；挑取单菌落，利用菌液PCR检测是否阳性克隆，若是，则对菌液进行序列测定，测序结果正确后即获得阳光玫瑰葡萄PEPCK基因的目的片段；
S2：pCAMBIA1302-PEPCK过表达载体的质粒设计：
S21：使用Snapgene软件进行设计，选定市售pCAMBIA1302原始载体的CaMV35S启动子和mgfp5荧光序列之间的位置作为阳光玫瑰葡萄PEPCK基因的目的片段的引物插入位点，插入位点示意图见图4；
S22：使用PCR一步定向克隆试剂盒(近岸，中国)完成实验：根据设计好的pCAMBIA1302-PEPCK过表达载体序列，利用同源序列无缝克隆的原理，第一步，在阳光玫瑰葡萄PEPCK基因的目的片段的起始密码子前选择10-15个碱基序列，在阳光玫瑰葡萄PEPCK基因的目的片段删除的终止密码子后选择10-15个碱基序列；第二步，在阳光玫瑰葡萄PEPCK基因的目的片段的头尾各选择15-20个碱基序列，与第一步中选择的碱基序列各自拼接后得到引物PEPCK-q-F和PEPCK-q-R，其序列分别为：
PEPCK-q-F:ACACGGGGGACTCTTGACCAATGAAAATGGCAGGAAACGG；
PEPCK-q-R:TTTACTAGTCAGATCTACCAGAAAGAAGATACCTTGTCCA；
S23：利用PEPCK-q-F和PEPCK-q-R对PEPCK基因的目的片段进行巢式PCR反应：PCR反应体系(50μL)：PEPCK 2μL、引物F/R(10μmol/L)各1μL、2×Fast Pfu Master 25μL、ddH2O21μL，PCR反应程序为：94℃1min30s；94℃20s，60℃20s，72℃1min，35个循环；72℃5min；4℃保温，得到PCR产物；将得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，对目标条带进行回收，得到含有与pCAMBIA1302载体同源序列的目的片段，为第一产物，放入-20℃冰箱内等待备用；
用NcoI-HF对pCAMBIA1302质粒进行单酶切(Biolabs，美国，具体操作详见说明书)，获得线性化载体，对线性化载体进行琼脂糖凝胶电泳(pCAMBIA1302质粒单酶切的琼脂糖电泳图见图2)，对目标条带进行回收，得到第二产物，放入-20℃冰箱内等待备用；
通过一步克隆说明书将第一产物与第二产物遵循一步克隆法进行连接，连接后转化、涂板，获得阳性质粒，即为pCAMBIA1302-PEPCK过表达载体的质粒。其中，测序所用引物为p-F和p-R，其序列分别为：
p-F：TTACGACTCAATGACAAGAAGAAAA
p-R：GTTTTCCGTATGTTGCATCACCTTC
引物p-F和p-R可以验证目的片段是否已经与质粒进行连接，也可以进行测序看到完整结果。得到的pCAMBIA1302-PEPCK过表达载体的质粒验证琼脂糖电泳图见图3，质粒验证测序见图5，pCAMBIA1302质粒图见图6。上述阳光玫瑰葡萄PEPCK基因过表达载体可应用于调控阳光玫瑰葡萄成熟期。具体地，将pCAMBIA1302-PEPCK过表达载体通过农杆菌介导转入阳光玫瑰葡萄果肉细胞后，实现阳光玫瑰葡萄PEPCK基因的过表达，以此调控阳光玫瑰葡萄果实中的糖酸含量，获得口感风味上佳的阳光玫瑰葡萄新品种，在与其他品种葡萄的竞争中脱颖而出，获得更高的商品价值。
虽然本公开披露如上，但本公开的保护范围并非仅限于此。本领域技术人员，在不脱离本公开的精神和范围的前提下，可进行各种变更与修改，这些变更与修改均将落入本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种阳光玫瑰葡萄PEPCK基因过表达载体，其特征在于，所述过表达载体为将阳光玫瑰葡萄PEPCK基因的目的片段插入pCAMBIA1302原始载体的CaMV35S启动子和mgfp5荧光序列之间，且删除目的片段的终止密码子得到的pCAMBIA1302-PEPCK过表达载体。
2.一种权利要求1所述阳光玫瑰葡萄PEPCK基因过表达载体的构建方法，其特征在于，包括：通过克隆技术获得阳光玫瑰葡萄PEPCK基因，将所述阳光玫瑰葡萄PEPCK基因的目的片段插入pCAMBIA1302原始载体，实现pCAMBIA1302-PEPCK过表达载体的构建。
3.根据权利要求2所述阳光玫瑰葡萄PEPCK基因过表达载体的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：
S1：阳光玫瑰葡萄PEPCK基因的编码区的克隆：
S11：提取阳光玫瑰葡萄果肉的RNA，逆转录为cDNA，并将cDNA保存于-20℃冰箱中备用；
S12：从NCBI中搜索得到葡萄的PEPCK基因全长序列，选择其中的CDS编码区，设计引物PEPCK-F和PEPCK-R用于PCR扩增；
S13：以cDNA为模板，利用PEPCK-F和PEPCK-R进行PCR扩增反应，得到PCR产物；将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，对目标条带进行回收，得到目的片段；将得到的目的片段连接Blunt载体，转入大肠杆菌感受态细胞；将转化后的大肠杆菌进行培养；挑取单菌落，完成克隆；
S2：pCAMBIA1302-PEPCK过表达载体的质粒设计：
S21：选定市售pCAMBIA1302原始载体的CaMV 35S启动子和mgfp5荧光序列之间的NcoⅠ酶切位点作为阳光玫瑰葡萄PEPCK基因的目的片段的引物插入位点，且删除目的片段的终止密码子，用SnapGene软件完成pCAMBIA1302-PEPCK过表达载体的质粒设计；
S22：根据设计好的pCAMBIA1302-PEPCK过表达载体序列，利用同源序列无缝克隆的原理，在阳光玫瑰葡萄PEPCK基因的目的片段的起始密码子前选择15-20个碱基序列，命名为第一序列，在阳光玫瑰葡萄PEPCK基因的目的片段删除的终止密码子后选择15-20个碱基序列，命名为第二序列；在阳光玫瑰葡萄PEPCK基因序列的头尾各选择15-20个碱基序列，分别命名为第三序列、第四序列，将所述的第一序列、第三序列拼接，将所述的第二序列、第四序列拼接，得到引物PEPCK-q-F和PEPCK-q-R；
S23：利用PEPCK-q-F和PEPCK-q-R对PEPCK基因的目的片段进行巢式PCR反应，将得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，对目标条带进行回收，得到含有与pCAMBIA1302载体同源序列的目的片段，为第一产物，放入-20℃冰箱内等待备用；然后用NcoI-HF对pCAMBIA1302质粒进行单酶切，获得线性化载体，对线性化载体进行琼脂糖凝胶电泳，对目标条带进行回收，得到第二产物，放入-20℃的环境下等待备用；将所述第一产物与所述第二产物遵循一步克隆法进行连接，连接后转化、涂板，获得阳性质粒，即得到pCAMBIA1302-PEPCK过表达载体的质粒。
4.根据权利要求3所述阳光玫瑰葡萄PEPCK基因过表达载体的构建方法，其特征在于，所述步骤S12中，所述PEPCK-F和所述PPEPCK-R的序列如下：
PEPCK-F:ATGAAAATGGCAGGAAACGGA；
PEPCK-R:TTAGAAAGAAGATACCTTGTCCA。
5.根据权利要求3所述阳光玫瑰葡萄PEPCK基因过表达载体的构建方法，其特征在于，所述步骤S13中，所述培养的条件为：在37℃的恒温箱内培养12h。
6.根据权利要求3所述阳光玫瑰葡萄PEPCK基因过表达载体的构建方法，其特征在于，所述步骤S13中，所述挑取单菌落后还包括对单菌落进行PCR监测的步骤，包括：利用菌液PCR检测是否阳性克隆，若是，则对菌液进行序列测定，测序结果正确，即获得阳光玫瑰葡萄PEPCK基因的目的片段，若否，则重新进行克隆。
7.根据权利要求3所述阳光玫瑰葡萄PEPCK基因过表达载体的构建方法，其特征在于，所述步骤S22中，所述PEPCK-q-F和PEPCK-q-R的序列如下：
PEPCK-q-F:ACACGGGGGACTCTTGACCAATGAAAATGGCAGGAAACGG；
PEPCK-q-R:TTTACTAGTCAGATCTACCAGAAAGAAGATACCTTGTCCA。
8.根据权利要求3所述阳光玫瑰葡萄PEPCK基因过表达载体的构建方法，其特征在于，所述步骤S23中，所述巢式PCR反应的条件如下：PCR反应体系50μL：PEPCK 2μL、引物F/R 10μmol/L各1μL、2×Fast Pfu Master 25μL、ddH2O 21μL，PCR反应程序为：94℃1min30s；94℃20s，60℃20s，72℃1min，35个循环；72℃5min；4℃保温，得到PCR产物。
9.权利要求1所述阳光玫瑰葡萄PEPCK基因过表达载体在调控阳光玫瑰葡萄口感风味中的应用。
10.根据权利要求9所述阳光玫瑰葡萄PEPCK基因过表达载体在调控阳光玫瑰葡萄口感风味中的应用，其特征在于，包括以下步骤：将pCAMBIA1302-PEPCK过表达载体通过农杆菌介导侵染阳光玫瑰葡萄花絮，实现阳光玫瑰葡萄PEPCK基因的过表达，以此调控阳光玫瑰葡萄果实中的糖酸含量，从而对阳光玫瑰葡萄口感风味进行调控，获得口感风味上佳的阳光玫瑰葡萄新品种。
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