CN117088956A - BnARF22基因、蛋白及其在调控甘蓝型油菜株高中的应用 - Google Patents

BnARF22基因、蛋白及其在调控甘蓝型油菜株高中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及BnARF22基因、蛋白及其在调控甘蓝型油菜株高中的应用。本发明从甘蓝型油菜矮杆突变体M176中分离得到矮杆基因BnARF22。亚细胞定位的结果表明BnARF22定位于细胞核中。本发明构建了BnARF22过表达载体，转化甘蓝型油菜野生型中双11号。转基因阳性植株与对照中双11号相比，植株高度明显降低，分枝减少，开花期推迟3‑5天。本发明说明BnARF22能够控制油菜植株高度，对于油菜的矮杆育种具有重要的利用价值。

Description

BnARF22基因、蛋白及其在调控甘蓝型油菜株高中的应用
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及BnARF22基因、蛋白及其在调控甘蓝型油菜株高中的应用。
背景技术
甘蓝型油菜是我国的主要的油料作物之一，油菜籽含油量高，一般在40％左右。株高是重要的农艺性状之一，也是优良株型形成的基础，与作物产量密切相关。目前在全国推广的油菜品种植株高大，易于种植，但这也间接导致产量损失和收获困难。为了解决这些问题，油菜育种工作者对此做了相当多的工作来创建株高降低的甘蓝型油菜突变体，挖掘潜在的矮杆基因，并探索其在油菜育种中的应用。
株高的调控机制是非常复杂的，受到遗传因子、内外激素的调控，同时还受到周围环境的影响。继20世纪六七十年代作物上的第一次绿色革命之后，半矮秆水稻(semidwarf1，sd1)和中矮秆小麦(reduced height1，Rht1)被成功培育并应用到生产中，使得水稻和小麦的产量显著提高。株高降低不仅带来产量的提高，也使水稻和小麦抗倒伏和抗化肥能力提高，同时具有广泛的适应性和产量稳定性。Oscps1、GID2等是水稻中克隆得到的矮杆基因。小麦中定位到超过35个控制小麦株高相关的QTL/基因。矮杆材料的研究表明影响株高的植物激素主要包括赤霉素(gibberellin，GA)、油菜素内酯(brassinosteroid，BR)和生长素(auxin，IAA)。GA通过DELLA蛋白家族成员RGA和GAI实现对下胚轴伸长的控制。对拟南芥bin2(BR-INSENSTIVE 2)突变体的遗传分析表明，BR不敏感的矮杆表型是由于bin2基因中的一个半显性突变导致的。甘蓝型油菜中一个新的矮秆基因座DS-4编码Aux/IAA7蛋白，有助于提高油菜的抗倒伏能力。生长素信号关键基因的表达变化也会引起植株矮化。拟南芥中ARF7和ARF19双突变的植株表现出明显的矮化表型。但目前对于矮杆、晚开花的甘蓝型油菜研究较少。到目前为止，利用矮杆基因开展的油菜矮化育种并未取得显著性进展。现有的矮杆材料多数利用人工诱变或者自然突变鉴定到的矮杆突变体，比如bzh就是EMS诱变常规油菜品种“Primor”获得的矮杆突变体，ds-1和ds-2是EMS诱变小孢子后经染色体加倍产生的半矮秆突变体。但是这些突变材料在降低株高程度、影响机械化收割、株型和品质等方面不能做到很好的平衡，这在一定程度上限值了油菜株型改良上的应用。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供BnARF22基因、蛋白及其在调控甘蓝型油菜株高中的应用，转基因植株变矮，分枝数减少，同时延迟花期3-5天。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供一种甘蓝型油菜BnARF22蛋白，所述甘蓝型油菜BnARF22蛋白包含以下(1)、(2)中任一所述的氨基酸序列：
(1)如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；
(2)与SEQ ID NO.3所示氨基酸序列有90％以上同源性的序列。
本发明还提供一种甘蓝型油菜BnARF22基因，编码权利要求1所述甘蓝型油菜BnARF22蛋白，所述甘蓝型油菜BnARF22基因的全长基因组序列为以下(1)、(2)中任一所述的核苷酸序列：
(1)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
(2)任一核苷酸序列与SEQ ID NO.1所示序列有90％以上同源性且编码如SEQ IDNO.3所示氨基酸序列的DNA分子。
本发明还提供上述的蛋白或基因在调控甘蓝型油菜株高或开花期的应用。
本发明还提供一种调控甘蓝型油菜株高的方法，构建BnARF22过表达载体，获得甘蓝型油菜矮杆植株；所述BnARF22的全长基因组序列如SEQ IDNo.1所示；所述BnARF22的全长cDNA序列如SEQ ID No.2所示。
本发明还提供一种调控甘蓝型油菜株高的方法，构建BnARF22过表达载体，获得甘蓝型油菜晚开花植株；所述BnARF22的全长基因组序列如SEQ IDNo.1所示；所述BnARF22的全长cDNA序列如SEQ ID No.2所示。
进一步的，所述BnARF22过表达载体由SEQ ID No.2所示的序列插入PBI121载体的CaMV35S启动子和OCS终止子之间获得。
进一步的，包括以下步骤：将SEQ ID No.2所示的序列插入PBI121载体的CaMV35S启动子和OCS终止子之间获得过表达载体，然后转化根癌农杆菌GV3101，获得的转基因工程菌转化甘蓝型油菜受体，筛选转化植株的后代。
进一步的，在基因克隆的上下游引物两端分别引入Kpn I和BamH I两种酶的同源序列构成新的引物；
上游引物P7：5’-TTCGAGCTCGGTACCATGGCGAGTGATCAAATCATG-3’；下游引物P8：5’-GACTCTAGAGGATCCCTAATTGTTGTTGACATCTGTGG-3’。
进一步的，检测引物为：
上游引物P9：7’-GAGGCTTACGCAGCAGGTCTCA-3’；
下游引物P10：5’-TTCAACATCAGATGTATCAGGC-3’。
进一步的，实时荧光定量PCR分析的引物序列为：
上游引物P11：5’-ATAAACGACATGCCATGGAATG-3’；
下游引物P12：5’-AAGATGTTGGTATGTTGCGTTC-3’。
本发明所述BnARF22定位于烟草叶肉细胞核。
本发明过表达BnARF22降低株高，分枝数减少，开花时间推迟3-5天。
本发明所述过表达BnARF22的方法是将来自于矮杆材料M176的BnARF22基因构建到PBI121过表达载体，然后转化甘蓝型油菜中双11号，筛选转基因阳性植株后即获得过表达BnARF22的甘蓝型油菜。
本发明所述植物过表达载体由SEQ ID No.2所示的序列插入PBI121载体的CaMV35S启动子和OCS终止子之间获得。
本发明所述含植物过表达载体的根癌农杆菌为GV3101。
过表达BnARF22在降低甘蓝型油菜株高中的应用。
一种获得矮杆、晚开花的甘蓝型油菜的方法，包括如下步骤：将SEQ IDNo.2所示的序列插入PBI121载体的CaMV35S启动子和OCS终止子之间获得过表达BnARF22的载体，然后转化根癌农杆菌GV3101，获得的转基因工程菌转化甘蓝型油菜中双11号受体，筛选转基因植株即获得矮杆、晚开花的甘蓝型油菜。
优选的，所述甘蓝型油菜受体为甘蓝型油菜典型品种中双11号。
有益效果
本发明提供了BnARF22基因的全长基因组和cDNA序列、蛋白序列等，并通过转化中双11号确认了BnARF22能够影响株高，转基因植株从原来的172cm降低到125cm，降低了27.3％，一次分枝数从9个减少到7个，同时花期延迟3-5天。
附图说明
图1为甘蓝型油菜BnARF22基因全长DNA和cDNA扩增的电泳图。
图2为BnARF22的基因结构。
图3为BnARF22的结构域分布。
图4为BnARF22与拟南芥AT1G34390.1等蛋白的多序列比对。
图5为BnARF22的亚细胞定位。
图6为转基因植株DNA水平的鉴定。
图7为转基因植株转录水平的鉴定。
图8为转基因植株开花期的表型。
具体实施方式
以下结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，按照相关产品生产说明书或者分子克隆实验指南进行。实施例采用的植物材料：甘蓝型油菜中双11号由中科院油料作物研究所提供。中双11号是已公开的双低、优良常规品种(审定编号为国审油2008030)。矮杆突变体材料M176为本实验通过EMS诱变创制。M176为本单位创制的双低、矮杆种质。
实施例1：BnARF22全长DNA和cDNA的克隆
一、甘蓝型油菜总DNA和总RNA的提取
取甘蓝型油菜M176的嫩叶，采用改良的CTAB法提取基因总DNA，采用1％的琼脂糖凝胶电泳法和紫外分光光度计评价DNA样品的浓度和质量。DNA样品保存与-20℃冰箱。在苗期收集中双11号和过表达BnARF22材料的叶片，采用TIANGEN公司的植物总RNA提取试剂盒提取RNA，用纯水溶解。样品用1％的琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计分别检测RNA的质量和纯度。电泳结果显示出RNA完整的的三条带(28S，18S，5S)，无明显降解和DNA污染，能够满足后续实验的要求。RNA样品保存在-80℃冰箱。
二、甘蓝型油菜cDNA第一链的合成
将上述1中所提取的RNA等量混合后，使用Takara公司的PrimeScriptTM1st StrandcDNA Synthesis Kit按照其说明书进行反转录，反转录产物保存于-20℃冰箱备用。
三、甘蓝型油菜BnARF22全长DNA和cDNA的克隆
以提取的DNA为模板，上游引物P1：5’-CAGAGGTTGCTTTGTTGCCTGA-3’(SEQ IDNO.4)和下游引物P2：5’-CAGTGCAGTAGCAACTACACCA-3’(SEQ ID NO.5)；以反转录的cDNA为模板，上游引物P3：5’-ATGGCGAGTGATCAAATCATG-3’(SEQ ID NO.6)，下游引物P4：5’-CTAATTGTTGTTGACATCTGGTGG-3’(SEQ ID NO.7)，分别扩增BnARF22全长DNA和cDNA序列。用KOD酶(TOYOBO，Japan)进行PCR扩增。PCR反应体系按照该酶的说明书进行加样，反应程序为94℃预变性2min，然后按照94℃：15s；52℃：30s；68℃：3min程序设置35个循环。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳显示与预期的大小一致。经过胶回收、连接克隆载体转化大肠杆菌、PCR与测序鉴定，确定了BnARF22的全长DNA为3063bp(图1)，命名为BnARF22DNA，序列如SEQ IDNO.1所示；确定了BnARF22全长cDNA，长度为1623bp(图1)，将其命名为BnARF22mRNA，序列如SEQ ID NO.2所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
实施例2、BnARF22基因的生物信息学分析
利用http://gsds.gao-lab.org/在线网站分析BnARF22的基因结构；通过https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi网站提进行蛋白质的结构分析。BnARF22全长DNA为3063bp，含有13个外显子和12个内含子(图2)。全长cDNA长度为1623bp，编码540个氨基酸残基。BnARF22蛋白与拟南芥的同源蛋白AT1G34390.1等ARF蛋白氨基酸序列进行比对，发现BnARF22具有ARF蛋白的两个典型的结构域：DNA binding domain、Middledomain和Carboxy-terminal dimerization domain(图3和图4)。
实施例3：BnARF22的亚细胞定位分析
以克隆得到的BnARF22全长cDNA质粒为模板，设计带有酶切位点的引物进行扩增目的片段。其中上游引物为P5：5’-GAACGATAGGGTACCATGGCGAGTGATCAAATCATG-3’(SEQ IDNO.8)，下游引物P6：5’-GCTCACCATGGATCCATTGTTGTTGACATCTGGTGG-3’
(SEQ ID NO.9)。同时用双酶(Kpn I和Sal I，Takara)酶切质粒pCAMBIA1305-GFP。使用同源重组ClonExpress IIOne Step Cloning Kit(Vazyme，Nanjing)将胶回收的目的基因片段和酶切的质粒片段连接。反应体系参照该酶的说明书。重组质粒转化大肠杆菌后进行菌液检测和测序验证。
取一管(100μl)农杆菌GV3101(唯地生物)感受态细胞于冰上融化，加入4μl 35S::BnARF22-GFP重组质粒，轻柔混匀后置于冰上5min，放入液氮中冷冻5min，之后迅速放入37℃水浴锅中水浴5min，再冰浴2min后加入700μl不含抗生素的YEB液体培养基，28℃、200rpm震荡培养3-4h后，将菌液均匀涂在含有50μg/ml卡那霉素和50μg/ml利福平的YEB固体培养基上，28℃倒置培养48h，挑取单克隆进行PCR检测。保存阳性农杆菌备用。
取200μl上述阳性农杆菌菌液加入20mL含有50μg/mL卡那霉素和50μg/ml利福平的YEB液体培养基中，28℃、200rpm震荡培养12-16h；取1ml菌液至100ml新鲜的含有50μg/mL卡那霉素和50μg/ml利福平的YEB液体培养基，同源震荡培养8-12h至OD600在0.8-1.2左右。4000rpm离心5min，弃上清，用10mM MES、10mM MgCl2、100μM AS配置的悬浮液悬浮2次，使OD600＝0.5，黑暗条件下静置1-3h备用。提前一天给烟草浇透水，通过注射器将菌液注射到烟草叶片下表皮中，23℃黑暗培养24h后取出正常培养，本实验中以空载pCAMBIA1305-GFP农杆菌为对照。使用激光共聚焦显微镜观察对照组合实验组烟草叶片表皮细胞发出荧光的位置并拍照。图5的结果显示对照组GFP空载在烟草叶肉细胞的细胞膜、细胞核中均有荧光，本发明的BnARF22定位于烟草叶肉细胞的细胞核。
实施例4：BnARF22基因过表达载体的构建与遗传转化
一、BnARF22基因过表达载体的构建
使用限制性内切酶Kpn I和BamH I(Takara公司)酶切植物过表达载体PBI121，通过1％的凝胶电泳回收线性化的载体片段。在基因克隆的上下游引物两端分别引入Kpn I和BamH I两种酶的同源序列构成新的引物(上游引物P7：5’-TTCGAGCTCGGTACCATGGCGAGTGATCAAATCATG-3’(SEQ ID NO.10)，下游引物P8：5’-GACTCTAGAGGATCCCTAATTGTTGTTGACATCTGTGG-3’(SEQ ID NO.11))，通过PCR扩增获得带有与线性化载体两端同源的目的基因片段。利用ClonExpress IIOne Step Cloning Kit试剂盒(Vazyme，Nanjing)将目的基因片段与线性化的载体连接，反应体系参考说明书进行。37℃反应30min后将连接产物转化大肠杆菌，挑取单克隆进行菌液PCR检测，将阳性单克隆送测序做进一步验证。测序的结果与基因克隆的结果一致，表明BnARF22基因成功插入过表达载体PBI121中，将重组的载体命名为35S::BnARF22。
二、农杆菌介导法转化油菜
将实施例3中构建的35S::BnARF22载体用冻融法转化农杆菌GV3101感受态细胞，加入700μl YEB液体培养基震荡培养3h，简短离心收集菌体，涂布于含有Kan和Rif抗生素的固体YEB平板上。28℃，倒置培养约48h，挑取农杆菌单克隆，进行PCR检测和测序验证。将测序正确的农杆菌单克隆转移至400ml含50μg/mL利福平和50μg/mL卡那霉素的YEB液体培养基中，28℃，振荡培养至OD600于0.8-1.0之间，4℃条件下5000rpm离心15min，收集沉淀并使用1/2MS液体培养基悬浮菌体。浸花时加入终浓度为0.01mg/L6-BA和0.05％Silwet-L-77。以中双11号为受体材料，泡花之前，摘除已经盛开的花，将剩余的花蕾放入制备好的农杆菌悬浮液中。根据温度和天气情况，5～7天浸染一次，一共3次。待油菜成熟后收集种子，记为T0代。
三、转基因油菜的鉴定
转基因阳性株的鉴定：将收获的T0代转基因种子播种于南京农业大学白马基地，在3～5叶期时采集油菜叶片提取DNA，电泳检测DNA质量后用于PCR检测的模板。PCR使用2×easy mix(Vazyme，Nanjing)，体系和程序按照说明书进行设计。过表达载体转化的材料DNA分子检测使用的上游引物来自于载体上的35S启动子序列(上游引物P9：7’-GAGGCTTACGCAGCAGGTCTCA-3’(SEQ ID NO.12))，下游引物来自于目的基因的序列(引物序列P10：5’-TTCAACATCAGATGTATCAGGC-3’
(SEQ ID NO.13))。筛选到的阳性材料进行常规田间管理(图6)，开花期套袋自交，收集种子备用。记为T1代。在人工气候培养箱中进行加代实验。以表型和基因型一致的T3代阳性单株为材料进行后续实验。
对转基因材料的基因表达水平进行分析。参考https://brassica.biodb.org/数据库的定量引物(上游引物P11：5’-ATAAACGACATGCCATGGAATG-3’
(SEQ ID NO.14)和下游引物P12：5’-AAGATGTTGGTATGTTGCGTTC-3’)(SEQ IDNO.15)，进行实时荧光定量PCR分析BnARF22基因在中双11号和基因材料中的表达水平。在进行实时荧光PCR之前，对设计的定量引物和内参基因BnActin引物(上游引物P13：5’-ATTCAGCCCCTTGTTTGTG-3’(SEQ ID NO.16)和下游引物P14：5’-GTAAGCGTCTTTTTGACCCAT-3’
(SEQ ID NO.17))进行检测，分析引物的最适合退火温度(60℃)，根据Ct值，适当将模板cDNA稀释相同倍数。在Bio-Rad CFX96实时荧光定量PCR仪上进行qRT-PCR，采用SuperReal PreMix Plus(TIANGEN)试剂盒，参考说明书的两步法进行qRT-PCR反应。分析转基因材料与中双11号材料中BnARF22基因的表达水平差异。qRT-PCR的结果表明在转基因材料中，BnARF22基因的表达水平明显高于对照组(图7)。两种材料在相同条件下培养，在苗期、开花期、成熟期观察株高差异，并拍照。遗传转化的结果表明，35S驱动的BnARF22过表达转基因单株株高明显降低，与预期的表型一致(图8)。转基因植株从原来的172cm降低到125cm，降低了27.3％，一次分枝数从9个减少到7个，同时花期延迟3-5天。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的优选实施方式。应当指出，本技术领域的技术人员在本发明的基础上所做的等同替代或者改进，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
序列表
SEQ ID NO.1
SEQ ID NO.2
SEQ ID NO.3

Claims (10)

1.一种甘蓝型油菜BnARF22蛋白，其特征在于，所述甘蓝型油菜BnARF22蛋白包含以下(1)、(2)中任一所述的氨基酸序列：
(1)如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；
(2)与SEQ ID NO.3所示氨基酸序列有90％以上同源性的序列。
2.一种甘蓝型油菜BnARF22基因，其特征在于，编码权利要求1所述甘蓝型油菜BnARF22蛋白，所述甘蓝型油菜BnARF22基因的全长基因组序列为以下(1)、(2)中任一所述的核苷酸序列：
(1)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
(2)任一核苷酸序列与SEQ ID NO.1所示序列有90％以上同源性且编码如SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的DNA分子。
3.权利要求1所述的蛋白或权利要求2所述的基因在调控甘蓝型油菜株高或开花期的应用。
4.一种调控甘蓝型油菜株高的方法，其特征在于，构建BnARF22过表达载体，获得甘蓝型油菜矮杆植株；所述BnARF22的全长基因组序列如SEQ IDNo.1所示；所述BnARF22的全长cDNA序列如SEQ ID No.2所示。
5.一种调控甘蓝型油菜株高的方法，其特征在于，构建BnARF22过表达载体，获得甘蓝型油菜晚开花植株；所述BnARF22的全长基因组序列如SEQ ID No.1所示；所述BnARF22的全长cDNA序列如SEQ ID No.2所示。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述BnARF22过表达载体由SEQ IDNo.2所示的序列插入PBI121载体的CaMV35S启动子和OCS终止子之间获得。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：将SEQ IDNo.2所示的序列插入PBI121载体的CaMV35S启动子和OCS终止子之间获得过表达载体，然后转化根癌农杆菌GV3101，获得的转基因工程菌转化甘蓝型油菜受体，筛选转化植株的后代。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在基因克隆的上下游引物两端分别引入Kpn I和BamH I两种酶的同源序列构成新的引物；
上游引物P7：5’-TTCGAGCTCGGTACCATGGCGAGTGATCAAATCATG-3’；下游引物P8：5’-
GACTCTAGAGGATCCCTAATTGTTGTTGACATCTGTGG-3’。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，检测引物为：
上游引物P9：7’-GAGGCTTACGCAGCAGGTCTCA-3’；
下游引物P10：5’-TTCAACATCAGATGTATCAGGC-3’。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，实时荧光定量PCR分析的引物序列为：
上游引物P11：5’-ATAAACGACATGCCATGGAATG-3’；
下游引物P12：5’-AAGATGTTGGTATGTTGCGTTC-3’。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117625655A (zh) * 2023-12-07 2024-03-01 贵州大学 一种调控植物开花时间、株高和主花序长度的新基因及其用途
CN117887732A (zh) * 2024-01-18 2024-04-16 湖北师范大学 BnARF14基因及其蛋白在提高植物粒重性状中的应用

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