CN116606359A - 负向调控植物抗旱性的蛋白质及其编码基因与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了负向调控植物抗旱性的基因及其编码蛋白与应用。具体地公开了氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质GmPLATZ17及其编码基因GmPLATZ17在调控植物抗旱性中的应用。本发明通过对大豆GmPLATZ17基因进行基因敲除和基因编辑，得到了基因敲除植株GmPLATZ17‑RNAi和基因编辑植株gmplatz17。实验证明，与野生型大豆植株相比，基因敲除植株和基因编辑植株具有更高的存活率，各项生长和生理检测指标优良，显示出了更好的抗旱性，表明GmPLATZ17基因具有调控植物抗旱性的功能，通过抑制GmPLATZ17蛋白及其编码基因的表达可以显著提高植物的抗旱性能。

Description

负向调控植物抗旱性的蛋白质及其编码基因与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及负向调控植物抗旱性的蛋白质及其编码基因与应用。
背景技术
大豆(Glycine max(Linn.)Merr.)是一种重要的粮食作物和油料作物，其种子富含蛋白质，是世界上70％可食用蛋白质的来源，同时也是生物柴油的新兴原料。随着全球气候变化和自然灾害的频繁发生，大豆在生长发育过程中会受到各种环境胁迫的危害，尤其是干旱、高盐和低温等胁迫严重影响大豆的产量和品质，因此，研究大豆对逆境条件的应答与信号传导机制，提高大豆的抗逆性，成为大豆遗传研究及大豆品种改良的重要任务之一，培育抗逆新品种一直是农业可持续发展的重大需求。
非生物胁迫能够引起植物生理性状和新陈代谢的改变，影响植物的生长发育进程。在逆境胁迫下植物体内会产生一系列应答反应，伴随着许多生理生化及发育上的变化，明确作物对环境胁迫的反应机制，将为培育抗逆高产品种提供科学依据。除传统育种外，植物抗逆性研究已逐渐深入到细胞和分子水平，因此，挖掘抗逆相关基因，并将其应用于作物遗传育种，将成为改良作物某一抗逆性状的有效手段，对于培育抗逆新品种、提高作物的抗逆性具有重要的理论指导意义和实践应用价值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何调控植物的抗旱性，和/或，如何提高植物抗旱性。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质的应用，所述应用可为下述任一种：
D1)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在调控植物抗旱性中的应用；
D2)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在制备调控植物抗旱性的产品中的应用；
D3)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在培育抗旱性植物中的应用；
D4)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在制备培育抗旱性植物的产品中的应用；
D5)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在植物育种中的应用；
所述蛋白质名称为GmPLATZ17，可为下述任一种：
A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；
A2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。
为了使A1)中的蛋白质便于纯化或检测，可在由序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接标签蛋白。
所述标签蛋白包括但不限于：GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白、His6标签蛋白(His-tag)、MBP(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白、Flag标签蛋白、SUMO标签蛋白、HA标签蛋白、Myc标签蛋白、eGFP(增强型绿色荧光蛋白)、eCFP(增强型青色荧光蛋白)、eYFP(增强型黄绿色荧光蛋白)、mCherry(单体红色荧光蛋白)或AviTag标签蛋白。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码蛋白质GmPLATZ17的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质GmPLATZ17的核苷酸序列75％或75％以上同一性的核苷酸，只要编码蛋白质GmPLATZ17且具有蛋白质GmPLATZ17功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
本文中，调控所述蛋白质活性和/或含量的物质可为调控基因表达的物质，所述基因编码所述蛋白质GmPLATZ17。
上文中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的RNA转运进行的调控(也就是对所述基因的mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mRNA降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。
所述调控基因表达的物质具体可为B1)-B4)中任一所述的生物材料。
上述应用中，所述蛋白质可来源于大豆(Glycine max(Linn.)Merr.)。
本发明还提供了与所述蛋白质GmPLATZ17相关的生物材料的应用，所述应用可为下述任一种：
E1)与所述蛋白质GmPLATZ17相关的生物材料在调控植物抗旱性中的应用；
E2)与所述蛋白质GmPLATZ17相关的生物材料在制备调控植物抗旱性的产品中的应用；
E3)与所述蛋白质GmPLATZ17相关的生物材料在培育抗旱性植物中的应用；
E4)与所述蛋白质GmPLATZ17相关的生物材料在制备培育抗旱性植物的产品中的应用；
E5)与所述蛋白质GmPLATZ17相关的生物材料在植物育种中的应用；
所述生物材料可为下述B1)至B8)中的任一种：
B1)编码所述蛋白质GmPLATZ17的核酸分子；
B2)抑制或降低或沉默所述蛋白质GmPLATZ17的编码基因表达的核酸分子；
B3)含有B1)和/或B2)所述核酸分子的表达盒；
B4)含有B1)和/或B2)所述核酸分子的重组载体、或含有B3)所述表达盒的重组载体；
B5)含有B1)和/或B2)所述核酸分子的重组微生物、或含有B3)所述表达盒的重组微生物、或含有B4)所述重组载体的重组微生物；
B6)含有B1)和/或B2)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B3)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B7)含有B1)和/或B2)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B3)所述表达盒的转基因植物组织；
B8)含有B1)和/或B2)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B3)所述表达盒的转基因植物器官。
上述应用中，B1)所述核酸分子可为编码序列(CDS)是SEQ ID No.2的DNA分子或核苷酸序列是SEQ ID No.2的cDNA分子；B2)所述核酸分子可为核苷酸序列是SEQ ID No.3的DNA分子。
SEQ ID No.2所示的DNA分子(调控植物抗旱性的基因GmPLATZ17)编码氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质GmPLATZ17。
SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列为蛋白质GmPLATZ17的编码基因(GmPLATZ17基因)的核苷酸序列。本发明所述的蛋白质GmPLATZ17基因(GmPLATZ17基因)可以为任意能够编码蛋白质GmPLATZ17的核苷酸序列。考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。
B1)所述核酸分子还可包括在SEQ ID No.2所示核苷酸序列基础上经密码子偏好性改造得到的核酸分子。
所述核酸分子还包括与SEQ ID No.2所示的核苷酸序列一致性为95％以上且来源相同种属的核酸分子。
本文所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如gRNA、mRNA、siRNA、shRNA、sgRNA、miRNA或反义RNA。
本文所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或M13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、Ti质粒或病毒载体。具体可为Peasyblunt载体、载体pCAMBIA1302、载体pCAMBIA3301和/或Cas9/gRNA-vector(pVK005，北京唯尚立德生物科技有限公司)。
本文所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia)，欧文氏菌(Erwinia)，根癌农杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium)，产碱菌属(Alcaligenes)，假单胞菌属(Pseudomonas)，芽孢杆菌属(Bacillus)等。具体可为农杆菌GV3101、农杆菌K599和/或大肠杆菌感受态细胞TOP10。
所述重组载体具体可为重组载体Peasyblunt-GmPLATZ17、重组载体3301-GmPLATZ17、重组载体3301-GmPLATZ17-RNAi和/或重组载体Cas9-GmPLATZ17。
重组载体Peasyblunt-GmPLATZ17是使用平端克隆的方法，将核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2的DNA片段连接在Peasyblunt载体上，保持Peasyblunt载体的其他序列不变，得到的重组载体。
重组载体3301-GmPLATZ17是将pCAMBIA3301载体的Nco I和BstE II识别位点间的片段(小片段)替换为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2的DNA片段，保持pCAMBIA3301载体的其他序列不变，得到的重组表达载体。
重组载体3301-GmPLATZ17-RNAi是将pCAMBIA3301载体的Nco I和BstE II识别位点间的片段(小片段)替换为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.3的DNA片段，保持pCAMBIA3301载体的其他序列不变，得到的重组表达载体，即RNA干扰载体。
重组载体Cas9-GmPLATZ17是将GmPLATZ17的sgRNA靶点序列(5’-GGATTCACGGAGATGCCGCGAGG-3’，SEQ ID No.2的第68-90位)插入到Cas9/gRNA-vector质粒中，得到的重组表达载体，即编辑载体。
所述重组微生物具体可为重组农杆菌GV3101/1302-GmPLATZ17、重组农杆菌K599/3301-GmPLATZ17、重组农杆菌K599/3301-GmPLATZ17-RNAi和/或重组农杆菌GV3101/Cas9-GmPLATZ17。
重组农杆菌GV3101/1302-GmPLATZ17含有SEQ ID No.2所示的DNA分子，是将所述重组载体1302-GmPLATZ17导入农杆菌GV3101得到的重组菌。
重组农杆菌K599/3301-GmPLATZ17含有SEQ ID No.2所示的DNA分子，是将所述重组载体3301-GmPLATZ17导入农杆菌K599得到的重组菌。
重组农杆菌K599/3301-GmPLATZ17-RNAi含有SEQ ID No.3所示的DNA分子，是将所述重组载体3301-GmPLATZ17-RNAi导入农杆菌K599得到的重组菌。
重组农杆菌GV3101/Cas9-GmPLATZ17含有sgRNA靶点序列(GGATTCACGGAGATGCCGCGAGG，SEQ ID No.2的第68-90位)分子，是将所述重组载体Cas9-GmPLATZ17导入农杆菌GV3101得到的重组菌。
本发明还提供了一种培育抗旱性植物的方法，所述方法包括降低目的植物中所述蛋白质GmPLATZ17的含量和/或活性，得到抗旱性高于所述目的植物的抗旱性植物。
上述方法中，所述降低目的植物中所述蛋白质GmPLATZ17的含量和/或活性可通过降低目的植物中所述蛋白质GmPLATZ17的编码基因的表达量和/或活性实现。
上述方法中，所述降低目的植物中所述蛋白质GmPLATZ17的编码基因的表达量和/或活性可为利用基因突变、基因敲除、基因编辑或基因敲减技术使目的植物基因组中所述蛋白质GmPLATZ17的编码基因活性下降或失活。
上述方法中，所述利用基因编辑技术使目的植物基因组中所述蛋白质GmPLATZ17的编码基因活性下降或失活可为利用CRISPR/Cas9系统进行，所述CRISPR/Cas9系统包括表达靶向所述蛋白质GmPLATZ17的编码基因的sgRNA的载体，所述sgRNA的靶序列为SEQ IDNo.2的第68-90位。
在本发明的一个实施方案中，所述培育抗旱性植物的方法包括如下步骤：
(1)构建靶向编辑SEQ ID No.2的第68-90位的CRISPR/Cas9重组载体Cas9-GmPLATZ17；
(2)将步骤(1)构建的重组载体Cas9-GmPLATZ17导入目的植物(如大豆)中；
(3)经筛选和鉴定获得抗旱性高于所述目的植物的抗旱植物。
上述方法中，所述利用基因敲除技术使目的植物基因组中所述蛋白质GmPLATZ17的编码基因活性下降或失活可为利用RNA干扰载体进行，所述RNA干扰载体含有核苷酸序列是SEQ ID No.3的DNA分子。
在本发明的一个实施方案中，所述培育抗旱性植物的方法包括如下步骤：
(1)构建抑制靶基因GmPLATZ17表达的RNA干扰载体3301-GmPLATZ17-RNAi；
(2)将步骤(1)构建的RNA干扰载体3301-GmPLATZ17-RNAi导入目的植物(如大豆)中；
(3)经筛选和鉴定获得抗旱性高于所述目的植物的抗旱植物。
上述方法中，将RNA干扰载体或基因编辑载体导入所述受体植物(如大豆或拟南芥)，包括但不限于：通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
所述蛋白质GmPLATZ17，和/或，所述生物材料，和/或，所述核酸分子也在本发明的保护范围内。
本文中，所述植物可为G1)或G2)或G3)：
G1)单子叶植物或双子叶植物；
G2)豆科植物或十字花科植物；
G3)大豆或拟南芥。
本文中，所述植物可为作物(如农作物)。
本发明还提供了所述培育抗旱性植物的方法在创制抗旱性植物和/或植物育种中的应用。
所述植物育种可为作物(如大豆)抗旱性转基因育种。
本文所述调控植物抗旱性可为提高植物抗旱性或降低植物抗旱性。
所述GmPLATZ17蛋白或其编码基因在目的植物中的表达量和/或活性降低，植物的抗旱性提高。
本文中，所述抗旱性植物理解为不仅包含将所述GmPLATZ17基因敲除得到的第一代转基因植物，也包括其子代。所述抗旱性植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
本发明要求保护的培育抗旱性提高的转基因植物(抗旱性植物)的方法，可包括如下步骤：对受体植物(目的植物)中能够表达或调控GmPLATZ17蛋白的核酸分子进行抑制表达，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比抗旱性提高。
本文所述RNA干扰技术(RNA interference，RNAi)是指通过反义RNA与正义RNA形成的双链RNA特异性地抑制靶基因的转录后表达的现象，通过人为地引入与内源靶基因具有同源序列的双链RNA(dsRNA)，从而诱导内源靶基因的mRNA降解，达到阻止基因表达的目的。
本发明通过将来源于大豆(Glycine max(Linn.)Merr.)的调控植物抗旱性的GmPLATZ17基因导入到受体植物野生型拟南芥(WT，Col)中，得到了两个纯合的转GmPLATZ17基因拟南芥株系GmPLATZ17-1和GmPLATZ17-2。实验证明，与未转基因受体对照野生型拟南芥(WT，Col)相比，过表达GmPLATZ17基因的拟南芥转基因株系在干旱条件下的存活率显著低于野生型拟南芥(WT，Col)，表明GmPLATZ17基因的过表达可以显著降低植物的抗旱性。
本发明同时以大豆Williams 82为受体，构建了GmPLATZ17基因过表达的植株(GmPLATZ17-OE)和GmPLATZ17基因敲除的植株(GmPLATZ17-RNAi)，还构建了基因编辑植株gmplatz17。在干旱条件下，GmPLATZ17-RNAi植株表现出了很好的抗旱性，综合各项生长和生理检测指标结果表明，GmPLATZ17基因敲除的GmPLATZ17-RNAi植株具有更强的抗干旱能力。基因编辑植株gmplatz17的长势和存活率也都显著优于对照植株(受体对照Williams82)，综上，GmPLATZ17基因可以调控植物的干旱性，降低GmPLATZ17基因的表达量和/或活性(如基因敲除或基因编辑)可以显著提高植物的抗旱性。
本发明挖掘了在干旱胁迫条件下能够调控植物抗旱性的新基因，对于培育植物的抗旱新品种、提高植物的抗旱性具有重要的意义和应用价值。
附图说明
图1为转GmPLATZ17基因拟南芥抗旱性鉴定分析。其中图1中A为转基因拟南芥和WT在干旱处理后的表型，图1中B为干旱处理前后转基因和WT拟南芥的存活率，图1中C为干旱处理前后转基因和WT拟南芥中脯氨酸含量，图1中D为干旱处理前后转基因和WT拟南芥中丙二醛含量。
图2为转GmPLATZ17基因大豆毛状根植株中GmPLATZ17基因相对表达量的检测。
图3为转GmPLATZ17基因大豆毛状根的抗旱性鉴定。其中图3中A为转基因大豆毛状根在干旱处理和复水后的表型，图3中B为转基因大豆毛状根在干旱处理前后的存活率，图3中C为干旱处理前后转基因大豆叶片的二氨基联苯胺(DAB)染色，图3中D为干旱处理前后转基因大豆叶片的硝基蓝四氮唑(NBT)染色，图3中E为干旱处理前后转基因大豆毛状根中超氧阴离子(O2 -)含量，图3中F为干旱处理前后转基因大豆毛状根中超氧化物歧化酶(SOD)含量。
图4为大豆gmplatz17编辑植株的抗旱性鉴定。其中图4中A为gmplatz17编辑和对照大豆植株在干旱处理后的表型，图4中B为gmplatz17编辑和对照大豆植株在干旱处理前后的存活率。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的大豆品种“Williams 82”和“中黄39”记载在下述文献中：姜静涵.大豆苗期耐盐机理研究及耐盐基因定位[D].中国农业科学院,2013.，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。
下述实施例中的野生型拟南芥(WT，Col)为哥伦比亚生态型拟南芥(Col-0)，购自SALK公司。
下述实施例中的根癌农杆菌GV3101和发根农杆菌K599购自北京拜尔迪生物技术公司。
下述实施例采用GraphPad Prism统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用Two-way ANOVA检验，P＜0.05(*)表示具有显著性差异，P＜0.01(**)表示具有极显著性差异。
实施例1、转录因子GmPLATZ17对拟南芥抗旱性的影响
本申请的发明人，从大豆品种“中黄39”中分离克隆出一个植物抗旱性相关蛋白基因，将其命名为GmPLATZ17基因。GmPLATZ17基因的编码序列(CDS)是SEQ ID No.2，编码氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质GmPLATZ17。
一、重组表达载体的构建
1、提取中黄39幼苗叶片的总RNA，反转录得到cDNA。
2、用上述步骤1中的cDNA作为模板，用特异性引物对大豆GmPLATZ17基因进行扩增，并回收PCR产物。序列表的SEQ ID No.2所示的基因即为GmPLATZ17基因，其开放阅读框(也是编码序列，CDS)如序列表的SEQ ID No.2所示。将序列表的SEQ ID No.2所编码的蛋白质命名为GmPLATZ17蛋白，其氨基酸序列如序列表的SEQ ID No.1所示。
GmPLATZ17基因的特异性扩增引物如下：
GmPLATZ17-F：5’-ACTCACCCATTGAGGCACAT-3’，
GmPLATZ17-R：5’-TGGGACCCAAACCCCAAAAG-3’。
3、将上述扩增并回收的PCR产物与Peasyblunt载体连接(pEASY-Blunt CloningKit，目录号CB101，全式金，北京)，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞TOP10，并涂布于含有50μg/L卡那霉素的固体LB培养基平板上，37℃过夜培养。对大肠杆菌的克隆菌落进行菌落PCR筛选，将阳性的克隆送入公司进行测序，挑选测序正确的单克隆菌落保存，并提取质粒，将序列正确的质粒命名为Peasyblunt-GmPLATZ17。
Peasyblunt-GmPLATZ17质粒是使用平端克隆的方法，将核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2的DNA片段连接在Peasyblunt载体上，保持Peasyblunt载体的其他序列不变，得到的重组载体。
4、以步骤3得到的质粒Peasyblunt-GmPLATZ17为模板，采用GmPLATZ17-1302F和GmPLATZ17-1302R组成的引物对(下划线为同源臂)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，并进行PCR产物胶回收。
GmPLATZ17-1302F：5’-GGACTCTTGACCATGGACATGGGCACAATGTTGGTGCC-3’，
GmPLATZ17-1302R：5’-GTCAGATCTACCCATGGGGAGCCAAAAGGTGCCCTAT-3’。
5、用限制性内切酶Ncol I酶切载体pCAMBIA1302，回收载体骨架。
6、将步骤4的PCR产物和步骤5的载体骨架利用In-Fusion(六合通，北京)酶进行连接，得到重组质粒1302-GmPLATZ17。根据测序结果，对重组质粒1302-GmPLATZ17进行结构描述如下：在载体pCAMBIA1302的Ncol I酶切位点插入了序列表的SEQ ID No.2所示的DNA分子。
二、转基因拟南芥的获得
1、将重组质粒1302-GmPLATZ17导入农杆菌GV3101，得到重组农杆菌GV3101/1302-GmPLATZ17。
2、将重组农杆菌菌液转至含50μg/L利福平和50μg/L卡那霉素的液体YEP培养基，28℃、220rpm振荡培养至OD600nm＝1.5-3.0。
3、完成步骤2后，收集菌体，4℃、4000g离心10min，用含10％蔗糖和0.02％silwet的水溶液稀释至OD600nm约为1.0，即为侵染液。
4、将种植于花盆中的哥伦比亚生态型拟南芥(Col-0)倒扣在盛有侵染液的容器中，使花序浸没于侵染液50s，然后取出花盆，侧放于托盘中，盖上黑色塑料布，24小时后揭开塑料布，直立放置花盆，进行正常的光照培养，收获种子，即为T0代拟南芥的种子。
5、将T0代拟南芥的种子播种于含40mg/L潮霉素的固体MS培养基平板上，培养得到的植株即为T1代拟南芥。
6、T1代拟南芥自交并收获种子，即为T1代拟南芥的种子。T1代拟南芥的种子培养得到的植株即为T2代拟南芥。T2代拟南芥自交并收获种子，即为T2代拟南芥的种子。T2代拟南芥的种子培养得到的植株即为T3代拟南芥。
7、对T2代拟南芥和抽样的T3代拟南芥进行PCR鉴定。如果某一T2代拟南芥及其自交获得的T3代拟南芥均为PCR鉴定阳性，该T2代拟南芥及其自交后代为1个纯合的转GmPLATZ17基因拟南芥株系。PCR鉴定引物为：5’-ATTTCATTTGGAGAGAACAC-3’和5’-GAATTTCCGCCACCCTCACT-3’，PCR鉴定阳性为以待鉴定的拟南芥植株的基因组DNA为模板，用该PCR鉴定引物进行PCR扩增，得到270bp的PCR产物。PCR鉴定了两个纯合的转GmPLATZ17基因拟南芥株系命名为：GmPLATZ17-1和GmPLATZ17-2。
三、拟南芥的耐旱性鉴定
待测种子为：GmPLATZ17-1株系T3代植株的种子、GmPLATZ17-2株系T3代植株的种子和野生型拟南芥Col-0的种子。其中，GmPLATZ17-1和GmPLATZ17-2株系均为纯合的转GmPLATZ17基因拟南芥株系。
干旱组(Drought)：将待测种子播种，从种子萌发开始计天数，20天后开始进行干旱处理(不再浇水)，同时拍照并统计存活率；
正常组(Control)：将待测种子播种，从种子萌发开始计天数，20天后继续正常浇水，然后拍照。
设置三次重复试验，每次重复试验中每种待测种子对6株植株进行观察统计。
结果见图1。图1中WT表示野生型拟南芥Col-0；OE-1表示GmPLATZ17-1株系的拟南芥；OE-2表示GmPLATZ17-2株系的拟南芥。
正常条件下，GmPLATZ17-1和GmPLATZ17-2株系的拟南芥长势与野生型拟南芥无差异。干旱处理后，野生型拟南芥的长势显著优于GmPLATZ17-1和GmPLATZ17-2株系的拟南芥，GmPLATZ17-1和GmPLATZ17-2株系的拟南芥的存活率显著低于野生型拟南芥。表明GmPLATZ17基因的过表达可以显著降低植物的抗旱性。
实施例2、转录因子GmPLATZ17对大豆毛状根植株的抗旱性影响
一、重组表达载体的构建
1、以实施例1中得到的质粒(Peasyblunt-GmPLATZ17)为模板，采用GmPLATZ17-3301F和GmPLATZ17-3301R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，并进行PCR产物胶回收。
GmPLATZ17-3301F：5’-GGACTCTTGACCATGATGGGCACAATGTTGGTGCC-3’，
GmPLATZ17-3301R：5’-ATTCGAGCTGGTCACCGGAGCCAAAAGGTGCCCTA-3’。
2、利用146bp的玉米醇脱氢酶内含子片段(SEQ ID No.3的第230-375位)、229bp的GmPLATZ17基因片段(SEQ ID No.3的第1-229位)及其反向互补序列(SEQ ID No.3的376-604位)，形成GmPLATZ17-RNAi片段，其具体序列信息参见序列表的SEQ ID No.3，将此序列在公司进行人工合成，并在序列两端加入Nco I和BstE II酶切位点。
3、用限制性内切酶Nco I和BstE II酶切载体pCAMBIA3301，回收载体骨架。
4、将步骤1的PCR产物和步骤2合成的片段分别与步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒3301-GmPLATZ17和3301-GmPLATZ17-RNAi。经公司测序正确后，提取阳性菌液质粒备用。
重组质粒3301-GmPLATZ17(即重组载体3301-GmPLATZ17)是将pCAMBIA3301载体的Nco I和BstE II识别位点间的片段(小片段)替换为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2的DNA片段，保持pCAMBIA3301载体的其他序列不变，得到的重组表达载体。
重组质粒3301-GmPLATZ17-RNAi(即重组载体3301-GmPLATZ17-RNAi)是将pCAMBIA3301载体的Nco I和BstE II识别位点间的片段(小片段)替换为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.3的DNA片段，保持pCAMBIA3301载体的其他序列不变，得到的重组表达载体，即RNA干扰载体。
构建的RNA干扰载体含有核苷酸序列是SEQ ID No.3的DNA分子，可通过RNA干扰技术使大豆基因组中GmPLATZ17蛋白质的编码基因的活性下降或失活。
SEQ ID No.3的前229位(第1-229位)和后229位(第376-604位)互为反向互补序列，由一段内含子序列连接，在细胞内转录后会形成发夹结构的双链RNA(dsRNA)，形成的dsRNA被Dicer酶降解成短的siRNA(小分子干扰RNA)，siRNA被解链成单链，其中反义链的siRNA与RISC(RNA诱导的沉默复合物)结合，并引导RISC到具有同源序列的内源mRNA分子上，降解靶mRNA，从而对靶基因GmPLATZ17的表达进行抑制。
二、转基因大豆毛状根植株的获得
1、将重组质粒3301-GmPLATZ17和3301-GmPLATZ17-RNAi分别转入发根农杆菌K599，得到含有重组质粒的农杆菌K599/3301-GmPLATZ17和K599/3301-GmPLATZ17-RNAi。
2、挑选生长状态一致，外形饱满的大豆Williams 82的种子，均匀播种于营养土中，每盆12粒，放于25℃、光周期14h光/10h暗、相对湿度60％的温室中生长5-7d，直至两片子叶完全长出。
3、将步骤1得到的农杆菌(K599/3301-GmPLATZ17和K599/3301-GmPLATZ17-RNAi)分别在含有卡纳霉素和链霉素的YEP固体培养基上划线，于28℃培养箱倒置培养3天。
4、用注射器小心挑取重组质粒的农杆菌菌落，将其注射进大豆Williams 82子叶节处，注射完成后用透明塑料杯盖上，使其保持较高的湿度有利于毛状根的生长，继续放于温室中黑暗生长一天，之后14h光/10h暗正常生长一周。
5、用营养土覆盖子叶节部位继续生长两周左右，直至长出毛状根。
6、剪去大豆幼苗的主根，将子叶节处新长出的毛状根埋在土里继续生长，得到转GmPLATZ17基因的大豆毛状根植株，即GmPLATZ17基因过表达的植株(GmPLATZ17-OE)和转GmPLATZ17-RNAi的大豆毛状根植株，即GmPLATZ17基因降低表达(GmPLATZ17基因敲除)的植株(GmPLATZ17-RNAi)。
三、转空载体大豆的获得
用pCAMBIA3301载体代替重组质粒3301-GmPLATZ17，按照步骤二进行操作，得到转空载体大豆植株(EV-control)。
四、检测GmPLATZ17基因的相对表达量
完成步骤二或步骤三后，取大豆叶片，提取总RNA并反转录得到cDNA，以cDNA为模板进行qRT-PCR，采用Actin基因作为内参基因，检测GmPLATZ17基因的相对表达量。
用于检测GmPLATZ17基因的引物如下：
RT-GmPLATZ17-F：5’-AGGCATCAACAATGGAGGGT-3’，
RT-GmPLATZ17-R：5’-CTTGCGTTTGAAGCAGGTGG-3’。
用于检测Actin基因的引物如下：
Actin-F：5’-ACATTGTTCTTAGTGGTGGCT-3’，
Actin-R：5’-CTGTTGGAAGGTGCTGAG-3’。
结果见图2。
转GmPLATZ17基因大豆(GmPLATZ17-OE)中GmPLATZ17基因的表达量是转空载体大豆(EV-control)的1.5倍，而转GmPLATZ17-RNAi大豆(GmPLATZ17-RNAi)中GmPLATZ17基因的表达量明显降低。
五、转基因大豆编辑植株的获得
利用基因编辑技术使目的植物基因组中蛋白质GmPLATZ17的编码基因活性下降或失活可利用CRISPR/Cas9系统进行，CRISPR/Cas9系统包括表达靶向蛋白质GmPLATZ17的编码基因的sgRNA的载体，设计sgRNA的靶序列为SEQ ID No.2的第68-90位。
构建基因编辑载体的步骤如下：
1、根据sgRNA的靶序列，设计下面的oligo引物，并进行合成。
gRNA-F：5’-TTGGGATTCACGGAGATGCCGCG-3’，
gRNA-R：5’-CGCGGCATCTCCGTGAATCCCAA-3’。
2、将合成的oligo引物分别稀释到10uM，按5uL gRNA-F、5uL gRNA-R和15uL H2O的比例混合，95℃3分钟，然后自然冷却至室温，形成oligo二聚体。
3、将步骤2得到的oligo二聚体和植物Cas9/gRNA质粒构建试剂盒(北京唯尚立德生物科技有限公司)中的Cas9/gRNA Vector、Solution、Solution2按照1：1：1：的比例混匀，16℃反应2h。
4、将10uL步骤3的产物加入刚解冻的TOP10感受态细胞中进行转化。经公司测序正确后，提取阳性菌液质粒备用，构建的基因编辑载体命名为Cas9-GmPLATZ17。
将重组质粒Cas9-GmPLATZ17导入农杆菌GV3101，得到含有重组质粒的农杆菌GV3101/Cas9-GmPLATZ17。具体步骤如下：
1、将含有重组质粒的农杆菌GV3101/Cas9-GmPLATZ17接种于YEP液体培养基中，28℃、3000rpm培养约18小时。
2、将步骤1获得的菌液划线于YEP固体培养基(含50μg/L链霉素及50μg/L卡那)中，28℃培养约2天。
3、将大豆种子(Williams 82)经氯气消毒8小时，然后均匀播种于灭菌的B5培养基内，培养至胚根形成。
4、完成步骤2后，然后将大豆子叶以及子叶节以下的胚根切除，然后培养至大豆愈伤组织长出，用含有重组载体的农杆菌GV3101(GV3101/Cas9-GmPLATZ17)侵染愈伤组织，经过培养后得到gmplatz17编辑大豆。
5、对T1代大豆和抽样的T2代大豆进行PCR鉴定。如果某一T1代及其产生的T2代大豆均为PCR鉴定突变，该T1代大豆及其后代为纯和的转GmPLATZ17基因大豆编辑植株，得到的编辑植株命名为gmplatz17。
六、大豆毛状根植株的抗旱性鉴定
待测植株为：步骤二得到的GmPLATZ17过表达植株(GmPLATZ17-OE)、GmPLATZ17干扰植株(GmPLATZ17-RNAi)、以及步骤三得到的转空载体大豆植株(EV-control)。
对生长良好的上述植株进行控水处理，观察表型，当各株系之间出现明显生长差异时进行复水，复水6天后统计存活率，并在处理前及处理过程中对其拍照。设置三次重复试验，每次重复试验中每种待测株系为5株植株进行观察统计。同时测定处理后的存活率、叶片染色观察、超氧阴离子自由基(O2 -)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性等各项生长和生理指标。
结果见图3。
正常条件下，GmPLATZ17-OE、GmPLATZ17-RNAi和EV-control植株生长无差异。干旱处理后，GmPLATZ17-OE植株生长受阻最严重，其次是空载体对照，GmPLATZ17-RNAi植株表现出抗旱性(图3中A)。
对干旱处理后各株系植株存活率进行统计显示，GmPLATZ17基因敲除的GmPLATZ17-RNAi植株的存活率显著高于GmPLATZ17基因过表达的GmPLATZ17-OE植株和空载体对照EV-control植株(图3中B)。
图3中C和D是DAB和NBT染色，以检测活性氧(ROS，reaction oxygen species)的水平，DAB着色代表H2O2积累水平，NBT着色代表O2 -积累水平。在正常的生长条件下，所有植株叶片均表现出很低的H2O2和O2 -积累，干旱处理后，在所有植株叶片中均观察到ROS积累的增多，其中在GmPLATZ17-RNAi植株中的ROS积累水平最低。
GmPLATZ17-RNAi植株的超氧阴离子自由基(O2 -)含量显著低于GmPLATZ17-OE植株和空载体对照EV-control植株(图3中E)，GmPLATZ17-RNAi植株的SOD酶活性显著高于GmPLATZ17-OE植株和空载体对照EV-control植株(图3中F)。
综合各项生长和生理检测指标结果表明，GmPLATZ17基因敲除的GmPLATZ17-RNAi植株具有更强的抗干旱能力。
七、大豆编辑植株的抗旱性鉴定
待测植株为：步骤五得到的gmplatz17编辑和受体Williams 82大豆植株(CK)。
对待测植株进行控水处理，具体处理方法：称取相同质量的土，播种相同粒数的编辑大豆和受体对照。待幼苗生长至四叶期后，进行控水处理。停止灌溉1-2周后观察其表型，待差异显著时统计存活率。设置三次重复试验，每次重复试验中每种待测株系为5株植株进行观察统计。
结果见图4。
干旱处理后，对照植株(CK)出现严重的萎蔫，而gmplatz17编辑大豆植株的长势优于对照(CK)，gmplatz17编辑大豆植株的存活率显著高于对照(CK)。
综上，GmPLATZ17基因可以调控植物的干旱性，降低GmPLATZ17基因的表达量和/或活性(如基因敲除或基因编辑)可以提高植物的抗旱性。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院作物科学研究所
<120> 负向调控植物抗旱性的蛋白质及其编码基因与应用
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 208
<212> PRT
<213> 大豆（Glycine max）
<400> 1
Met Gly Thr Met Leu Val Pro Pro Trp Leu Glu Pro Leu Leu Asn Thr
1 5 10 15
Ser Phe Phe Asn Val Cys Arg Ile His Gly Asp Ala Ala Arg Ser Glu
20 25 30
Cys Asn Met Phe Cys Leu Asp Cys Asn Glu Asn Ala Phe Cys Phe Tyr
35 40 45
Cys Arg Ser Ser Lys His Lys Asp His Gln Val Ile Gln Ile Arg Arg
50 55 60
Ser Ser Tyr His Asp Val Val Arg Val Ala Glu Ile Gln Lys Val Leu
65 70 75 80
Asp Ile Ser Gly Val Gln Thr Tyr Val Ile Asn Ser Ala Arg Val Leu
85 90 95
Phe Leu Asn Glu Arg Pro Gln Pro Lys Ser Gly Lys Gly Val Ala His
100 105 110
Ile Cys Glu Ile Cys Gly Arg Ser Leu Leu Asp Pro Phe Arg Phe Cys
115 120 125
Ser Leu Gly Cys Lys Leu Val Gly Ile Lys Arg Asn Gly Asp Ala Ser
130 135 140
Phe Thr Leu Asp Ala Lys Asn Glu Ala Ser Thr Met Glu Gly Met Ser
145 150 155 160
Arg Arg Ser Val Ser Ser Arg His His Gln Glu Glu Glu Leu Arg Glu
165 170 175
Gly Ser Gln Gln Asp Met Tyr Pro Ala Thr Pro Ser Pro Pro Ala Ser
180 185 190
Asn Ala Arg Arg Arg Lys Gly Ile Pro His Arg Ala Pro Phe Gly Ser
195 200 205
<210> 2
<211> 627
<212> DNA
<213> 大豆（Glycine max）
<400> 2
atgggcacaa tgttggtgcc accatggctt gagccactcc taaacacatc cttcttcaat 60
gtgtgtcgga ttcacggaga tgccgcgagg agcgaatgta acatgttttg tctcgactgc 120
aatgagaatg cgttttgctt ctattgccgt tcctcaaaac acaaggatca ccaagtcatt 180
cagatacgga gatcttcgta tcacgatgta gtgagggtgg cggaaattca gaaagtgttg 240
gacattagtg gagttcaaac atatgtgatc aacagtgcca gagttttgtt tctgaatgag 300
aggcctcaac caaagtctgg aaaaggagta gctcacattt gtgagatttg tggaagaagc 360
ctcttggacc catttcgctt ctgttctttg gggtgtaagc ttgtaggaat aaagagaaat 420
ggggatgcaa gttttacttt ggatgctaaa aatgaggcat caacaatgga gggtatgtca 480
aggagatcgg tttcttcaag acatcatcaa gaagaagaat tgcgtgaagg ctcacaacaa 540
gacatgtacc cggccacacc ttctccacct gcttcaaacg caaggagaag aaaagggatt 600
cctcataggg caccttttgg ctcctaa 627
<210> 3
<211> 604
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 3
cttgagccac tcctaaacac atccttcttc aatgtgtgtc ggattcacgg agatgccgcg 60
aggagcgaat gtaacatgtt ttgtctcgac tgcaatgaga atgcgttttg cttctattgc 120
cgttcctcaa aacacaagga tcaccaagtc attcagatac ggagatcttc gtatcacgat 180
gtagtgaggg tggcggaaat tcagaaagtg ttggacatta gtggagttcg atccgatcga 240
aaaacgggag tctgccccta agacagataa gccgccaaga aggcgcaagt caaccgcgag 300
ttgttgtatc atatctactg acaaagatca caaatgggat ggctgattag ataccttggc 360
ctcccagatc gattcgaact ccactaatgt ccaacacttt ctgaatttcc gccaccctca 420
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aacggcaata gaagcaaaac gcattctcat tgcagtcgag acaaaacatg ttacattcgc 540
tcctcgcggc atctccgtga atccgacaca cattgaagaa ggatgtgttt aggagtggct 600
caag 604

Claims (10)

1.蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质的应用，其特征在于，所述应用为下述任一种：
D1)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在调控植物抗旱性中的应用；
D2)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在制备调控植物抗旱性的产品中的应用；
D3)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在培育抗旱性植物中的应用；
D4)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在制备培育抗旱性植物的产品中的应用；
D5)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在植物育种中的应用；
所述蛋白质为下述任一种：
A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；
A2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述蛋白质来源于大豆。
3.与权利要求1或2中所述蛋白质相关的生物材料的应用，其特征在于，所述应用为下述任一种：
E1)与权利要求1或2中所述蛋白质相关的生物材料在调控植物抗旱性中的应用；
E2)与权利要求1或2中所述蛋白质相关的生物材料在制备调控植物抗旱性的产品中的应用；
E3)与权利要求1或2中所述蛋白质相关的生物材料在培育抗旱性植物中的应用；
E4)与权利要求1或2中所述蛋白质相关的生物材料在制备培育抗旱性植物的产品中的应用；
E5)与权利要求1或2中所述蛋白质相关的生物材料在植物育种中的应用；
所述生物材料为下述B1)至B8)中的任一种：
B1)编码权利要求1或2中所述蛋白质的核酸分子；
B2)抑制或降低或沉默权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因表达的核酸分子；
B3)含有B1)和/或B2)所述核酸分子的表达盒；
B4)含有B1)和/或B2)所述核酸分子的重组载体、或含有B3)所述表达盒的重组载体；
B5)含有B1)和/或B2)所述核酸分子的重组微生物、或含有B3)所述表达盒的重组微生物、或含有B4)所述重组载体的重组微生物；
B6)含有B1)和/或B2)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B3)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B7)含有B1)和/或B2)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B3)所述表达盒的转基因植物组织；
B8)含有B1)和/或B2)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B3)所述表达盒的转基因植物器官。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，B1)所述核酸分子为编码序列(CDS)是SEQID No.2的DNA分子或核苷酸序列是SEQ ID No.2的cDNA分子；B2)所述核酸分子为核苷酸序列是SEQ ID No.3的DNA分子。
5.一种培育抗旱性植物的方法，其特征在于，所述方法包括降低目的植物中权利要求1或2中所述蛋白质的含量和/或活性，得到抗旱性高于所述目的植物的抗旱性植物。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述降低目的植物中权利要求1或2中所述蛋白质的含量和/或活性通过降低目的植物中所述蛋白质的编码基因的表达量和/或活性实现。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述降低目的植物中所述蛋白质的编码基因的表达量和/或活性为利用基因突变、基因敲除、基因编辑或基因敲减技术使目的植物基因组中权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因活性下降或失活。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述利用基因编辑技术使目的植物基因组中权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因活性下降或失活是利用CRISPR/Cas9系统进行，所述CRISPR/Cas9系统包括表达靶向所述蛋白质的编码基因的sgRNA的载体，所述sgRNA的靶序列为SEQ ID No.2的第68-90位。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述利用基因敲除技术使目的植物基因组中权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因活性下降或失活是利用RNA干扰载体进行，所述RNA干扰载体含有核苷酸序列是SEQ ID No.3的DNA分子。
10.权利要求1或2中所述的蛋白质，和/或，权利要求3中所述的生物材料，和/或，权利要求4中所述的核酸分子。
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