CN117737118A - 番茄cnr10基因在番茄株高调控中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学领域，具体涉及番茄CNR10基因在番茄株高调控中的应用。所述番茄CNR10基因为能够编码下述(a)或(b)蛋白质的核苷酸序列：(a)由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸序列且具有同样酶活性的由(a)衍生的蛋白质。本发明通过构建上述基因的超表达载体，并将其在番茄植株中进行超表达，发现CNR10基因超表达的植株，其节间距缩短，顶端生长受到抑制，植株变矮，从而得到该基因能够调控番茄株高，对于培育理想型株番茄品种具有重要的理论意义和实际应用价值。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及番茄CNR10基因在番茄株高调控中的应用。
背景技术
株高作为农作物最重要的农艺性状之一，会影响作物结构、土地利用、营养和生产管理等等，是育种家改良作物的重要目标。矮化株型有助于提高作物抵抗外界胁迫能力，并有提高种植密度、增加产量、利于机械化采收等众多优点。因此，对与番茄株高相关的基因进行研究，对于培育理想型株番茄品种具有重要的理论意义和实际应用价值。
发明内容
本发明通过超表达番茄CRN10基因发现，与野生型植株相比，转基因番茄植株节间距缩短，顶端发育受阻，出现矮化表型。
本发明的目的之一在于保护番茄CNR10基因在番茄株高调控中的应用，所述番茄CNR10基因为能够编码下述(a)或(b)蛋白质的核苷酸序列：(a)由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸序列且具有同样酶活性的由(a)衍生的蛋白质。
进一步，所述番茄CNR10基因编码区的核苷酸选自下述(a)或(b)中的任一种：(a)核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的DNA序列；(b)与(a)中的DNA序列具有90％以上同源性，且编码上述的蛋白质的核苷酸序列。
本发明的目的之二在于保护检测上述番茄CNR10基因的引物在筛选、培育矮化番茄植株中的应用。
本发明的目的之三在于保护含有上述番茄CNR10基因的生物材料，所述生物材料包括表达载体、工程菌、转基因植物细胞系、转基因植株组织、转基因植株器官。
进一步，所述工程菌为大肠杆菌、农杆菌。
本发明的目的还在于保护一种培育矮化番茄植株的方法，所述方法是超表达上述的番茄CNR10基因。
进一步，所述方法包括以下步骤：(1)构建CNR10基因的超量表达载体；(2)将所述超量表达载体转入农杆菌后浸染番茄外植体；(3)对浸染后的番茄外植物筛选后长出愈伤组织，经进一步培育得到植株矮化的番茄植株。
进一步，所述超量表达载体的骨架载体为pHellsgate8载体。
进一步，所述超量表达载体的构建方法如下：以番茄组织的总RNA反转录而成的cDNA为模板，采用扩增引物扩增CNR 10基因的ORF区域，获得目的基因片段；将上述目的基因片段连接至线性化的pHellsgate8载体上，转化后得到所述的超量表达载体。
进一步，所述扩增引物的序列为：CATTTGGAGAGGACACGCTCGAGACTATGAACCCCTCAGCTCAAC；TCTCATTAAAGCAGGACTCTAGACTC CAAATTAATCATCACAATCAC。
与现有技术相比，本发明的核心优势在于：通过超表达CNR10基因，发现了该基因与番茄植株的株高相关，超表达植株节间距缩短，顶端发育受阻，在视觉上表现为番茄植株矮化的表型，对于培育理想型株番茄品种具有重要的理论意义和实际应用价值。
附图说明
图1为转基因植株与AC野生植株的CNR10基因相对表达量结果；
图2为转基因植株与AC野生植株高度统计结果；
图3为转基因植株与AC野生植株第2-3花序之间距离统计图；
图4为转基因植株与AC野生植株株高表型图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。
以下各实施例，仅用于说明本发明，但不止用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。
CNR10基因ORF序列：ATGAACCCCTCAGCTCAACCAGCTTACGGT GAAAAACCTATGACTGGTGTTCCCGTGCCGGGCCAATTTCAAGCTAATCATCCCGGAAATTGGTCTACTGGGCTTTGTGATTGTTTCTCTGATATCTCGAGTTGTTGTTTAACTTGCTGGTGTCCATGTATTACATTTGGACAAATTGCTGAAATTGTCGACAAAGGAACAGTTTCTTGTGGTGCAAGTGGAGCTTTATATTTTTTAATAGAAGCATTAACAGGATGTGGATGTATTTATTCATGTTTTTATCGTACAAAAATGAGAAAACAATACATGTTACCAGAAAGCCCTTGTGGGGACTGTTTGCTTCATTTTTGTTGTGAATGTTGTGCTTTATGCCAAGAACATCGTGAACTCAAACATCGTGGATATGACATGTCTATTGGTTGGCAAGGAAATATGGATAACCAAAATGGAGGAATAGCAATGGCTCCAGGAGTTCAAGGAGGAATGACTCGATAA(SEQ ID NO:1)；
其编码的蛋白质的氨基酸序列为:MNPSAQPAYGEKPMTGVPVPGQF QANHPGNWSTGLCDCFSDISSCCLTCWCPCITFGQIAEIVDKGTVSCGASG ALYFLIEALTGCGCIYSCFYRTKMRKQYMLPESPCGDCLLHFCCECCALC QEHRELKHRGYDMSIGWQGNMDNQNGGIAMAPGVQGGMTR(SEQ ID NO:2)。
实施例1CNR10基因超表达载体的构建
采用引物FW：CATTTGGAGAGGACACGCTCGAGACTATGAACCCCT CAGCTCAAC和RV：TCTCATTAAAGCAGGACTCTAGACTCCAAATTAA TCATCACAATCAC，以栽培番茄Ailsa Craig(简称AC，购自番茄遗传中心TGRC)各个组织的总RNA反转录而成的cDNA为模板克隆CNR10基因，得到目的片段。其中，PCR扩增体系如下表1所示，扩增程序如下表2所示：
表1PCR扩增体系
表2PCR扩增程序
扩增后切胶回收目的片段。使用使用X-hoI和X-baI对pHellsgate8载体进行双酶切，切胶回收线性化载体。对回收的目的片进行段和线性化载体进行同源重组。对插入片段和线性载体的浓度调整，最适线性化载体使用量为0.02倍的线性化载体的碱基对数，最适插入片段使用量为0.04倍插入片段的碱基对数，单位为ng。根据使用量和测量的浓度可以计算出需要使用的体积。在10μL体系中，加入2μL的5X CE II Buffer、1μL的Exnase II、计算好的插入片段和线性化载体，剩余的使用ddH2O补齐。按顺序加好各种反应液之后轻轻吸打混匀，然后置于PCR仪中反应37℃、30mim进行同源重组。
将连接产物转入大肠杆菌，将测序结果正确的大肠杆菌单克隆进行扩繁，使用DNA小量法提取试剂盒提取质粒，得到CNR10基因的超量表达载体CNR10-pHellsgate8。
实施例2遗传转化
CNR10基因超量表达载体的遗传转化，包括以下步骤：将构建好的测序正确的重组载体转入农杆菌感受态(C58)中备用；使用含有CNR10-pHe llsgate8载体的农杆菌侵染番茄品种AC的子叶外植体；侵染后的外植体暗培养；筛选外植体，直至长出愈伤组织；愈伤继代至长出生长点；将长出的生长点转入生根培养基中；生根后的植株移栽到营养土中生长，使用测序引物进行PCR检测，PCR产物条带符合CNR10基因长度大小，得到阳性转基因系。
植株阳性检测、大肠杆菌阳性检测、农杆菌阳性检测均使用taq-PCR检测，采用引物对进行阳性植株和克隆进行检测，使用测序引物对对阳性克隆进行测序，测序引物的上游引物序列为：ACGCACAATCCCACTATCCTTC；下游引物序列为：TCTCATTAAAGCAGGACTCTAGACTCCAAATTAATCAT CACAATCAC。taq-PCR检测体系如下表3所示，反应程序如下表4所示：
表3taq-PCR体系
表4taq-PCR程序
测序片段拼接结果为：GTACTTCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATT TGGAGAGGACACGCTCGAGACTATGAACCCCTCAGCTCAACCAGCTTACGGTGAAAAACCTATGACTGGTGTTCCCGTGCCGGGCCAATTTCAAGCTAATCATCCCGGAAATTGGTCTACTGGGCTTTGTGATTGTTTCTCTGATATCTCGAGTTGTTGTTTAACTTGCTGGTGTCCATGTATTACATTTGGACAAATTGCTGAAATTGTCGACAAAGGAACAGTTTCTTGTGGTGCAAGTGGAGCTTTATATTTTTTAATAGAAGCATTAACAGGATGTGGATGTATTTATTCATGTTTTTATCGTACAAAAATGAGAAAACAATACATGTTACCAGAAAGCCCTTGTGGGGACTGTTTGCTTCATTTTTGTTGTGAATGTTGTGCTTTATGCCAAGAACATCGTGAACTCAAACATCGTGGATATGACATGTCTATTGGTTGGCAAGGAAATATGGATAACCAAAATGGAGGAATAGCAATGGCTCCAGGAGTTCAAGGAGGAATGACTCGATAAATATTGGATTTTATTTATATTAATAATAATTATAAAAAAATTTGAATTTGTGTAGTGTGATTATATTTAATTTTGATGATGAAATTAATTGTGATTGTGATGATTAATTTGGAGTCTAGAGTCCTGCTTTAATGAGATATGCGAGACGCCTATGATCGCATGATATTTGCTTTCAATTCTGTTGTGCACGTTGTAAAAAACCTGAGCATGTGTAGCTCAGATCCTTACCGCCGGTTTCGGTTCATTCTAATGAATATATCACCCGTTACTATCGTATTTTTATGAATAATATTCTCCGTTCAATTTACTGATTGTACCCTACTACTTATATGTACAATATTAAAATGAAAACAATATATTGTGCTGAATAGGTTTATAGCGACATCTATGATAGAGCGCCACAATAACAAACAATTGCGTTTTATTATTACAAATCCAA。
实施例3结果分析
(1)CNR10基因表达情况分析
取转基因植株的幼嫩茎尖组织，进行RNA提取。对阳性转基因株系(CNR10-OE-1、CNR10-OE-3和CNR10-OE-7)中的CNR10基因进行表达量检测。表达量检测步骤包括RNA提取、反转录及基因表达量检测。
其中，RNA提取方法如下：液氮研磨后，取0.2g左右的样品至液氮冷冻后的2.0mL离心管中，加入1mL Trizol颠倒后静置抽提5分钟。加入200μL氯仿，剧烈颠倒抽提15s，常温放置3min，4℃、12000r/min离心15min。吸取400μL上清转移至新的1.5ml离心管中(为保证RNA纯度可适当减少吸取的上清液量)，加入等体积冰冷异丙醇(-20℃冰箱保存)，轻柔颠倒混匀，后置于-20℃10min，4℃、12000r/min离心10min。弃掉上清液，加入1mL 75％乙醇(DEPC水稀释)，悬浮沉淀，12000r/min离心1min，吸弃上清(可再重复1次上述步骤，以提高提取RNA纯度)，将离心管放置于通风厨中风干5-10min，加入40μL左右(根据所提RNA量调整)DEPC水溶解。琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，吸光度法测定RNA浓度后，放置于-80℃储存备用。
RNA反转录步骤如下：根据RNA样品浓度，将RNA样品统一稀释到特定的浓度，利用反转录试剂盒进行反转录，反转录过程如下：在RNase-free离心管中配制如下混合液：4XgDNA wiper Mix 4μL、Oligo(dT)23VN(50μM)1μL、Random hexamers(50ng/μl)1μL、总RNA或者带polyA的RNA 10pg-5μg、RNase-free ddH2O定容到16μL。移液器吸打混匀，离心后置于PCR仪中42℃2min。之后在上述混合液中加入2μl的10X RT Mix和2μl的HiScript IIEnzyme Mix，移液器吸打混匀离心后置于PCR仪，PCR仪设置反应程序：50℃，15min；85℃，2min，反应程序结束后产物可直接用于qPCR反应，或放-20℃保存。
按如下程序及SYBR mix体系测定CNR10的相对表达量，所选内参基因为Solyc11g005330，基因相对表达量测试按本领域常规检测方法。反应体系如下表5所示，表5中SYBR mix体系如表6所示：
表5反应体系
表6SYBE mis体系
表格中Q_FW和Q_RV分别为表达量检测引物的上游引物、下游引物。其中，内参基因Solyc11g005330的表达量检测引物为：
Q_FW:GTCCTCTTCCAGCCATCCA；
Q-RV:ACCACTGAGCACAATGTTACCG。
CNR10基因的表达量检测引物为：
Q_FW:ACTATGAACCCCTCAGCTCAAC；
Q_RV:ACAAAGCCCAGTAGACCAAT。
检测结果如图1所示，转入CNR10-pHellsgate8载体的番茄植株相较于对照野生株(AC)，其CNR10基因的相对表达量大幅度提高，具体测试结果如表7所示：
表7CNR10基因的相对表达量测试结果
(2)株高和花序间距离统计
对CNR10基因超量表达植株的株高和2～3花序之间距离进行统计，结果如图2、3、4及下表8、9所示：
表8番茄植株株高统计结果
表9番茄植株2～3花序之间距离统计结果
由上述结果可知，CNR10超量表达的植株高度相较于AC植株明显降低，视觉上出现明显矮化表型。
在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.番茄CNR10基因在番茄株高调控中的应用，其特征在于，所述番茄CNR10基因为能够编码下述(a)或(b)蛋白质的核苷酸序列：
(a)由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸序列且具有同样酶活性的由(a)衍生的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述番茄CNR10基因编码区的核苷酸选自下述(a)或(b)中的任一种：
(a)核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的DNA序列；
(b)与(a)中的DNA序列具有90％以上同源性，且编码权利要求1所述的蛋白质的核苷酸序列。
3.检测权利要求1中所述番茄CNR10基因的引物在筛选、培育矮化番茄植株中的应用。
4.含有权利要求1中所述番茄CNR10基因的生物材料，其特征在于，所述生物材料包括表达载体、工程菌、转基因植物细胞系、转基因植株组织、转基因植株器官。
5.根据权利要求4所述的生物材料，其特征在于，所述工程菌为大肠杆菌、农杆菌。
6.一种培育矮化番茄植株的方法，其特征在于，所述方法是超表达权利要求1中所述的番茄CNR10基因。
7.根据权利要求6所述的培育矮化番茄植株的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)构建CNR10基因的超量表达载体；
(2)将所述超量表达载体转入农杆菌后浸染番茄外植体；
(3)对浸染后的番茄外植物筛选后长出愈伤组织，经进一步培育得到植株矮化的番茄植株。
8.根据权利要求7所述的培育矮化番茄植株的方法，其特征在于，所述超量表达载体的骨架载体为pHellsgate8载体。
9.根据权利要求8所述的培育矮化番茄植株的方法，其特征在于，所述超量表达载体的构建方法如下：
以番茄组织的总RNA反转录而成的cDNA为模板，采用扩增引物扩增CNR 10基因的ORF区域，获得目的基因片段；
将上述目的基因片段连接至线性化的pHellsgate8载体上，转化后得到所述的超量表达载体。
10.根据权利要求9所述的培育矮化番茄植株的方法，其特征在于，所述扩增引物的序列为：CATTTGGAGAGGACACGCTCGAGACTATGAACCCC TCAGCTCAAC；TCTCATTAAAGCAGGACTCTAGACTCCAAATTAATCAT CACAATCAC。
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| CN202311786531.3A CN117737118A (zh) | 2023-12-22 | 2023-12-22 | 番茄cnr10基因在番茄株高调控中的应用 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311786531.3A Pending CN117737118A (zh) | 2023-12-22 | 2023-12-22 | 番茄cnr10基因在番茄株高调控中的应用 |
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2023
- 2023-12-22 CN CN202311786531.3A patent/CN117737118A/zh active Pending
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