CN110004172B - 一种利用苎麻BnXTH5基因提高植物镉敏感性的方法 - Google Patents
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Abstract
一种利用苎麻BnXTH5基因提高植物镉敏感性的方法,将苎麻BnXTH5基因在拟南芥中进行过表达。通过本发明方法可实现利用苎麻BnXTH5基因有效提高拟南芥的镉敏感性。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体涉及一种利用苎麻BnXTH5基因实现提高植物镉敏感性的方法。
背景技术
植物细胞壁是由半纤维素、纤维素、果胶等多糖及木质素等物质构成的动态变化结构,它不仅在植物生长发育起作用,而且起到对重金属物质的感知上发挥重要作用。当植物遭受重金属胁迫时,细胞壁优先感知胁迫,并自身吸附超过一半的重金属。细胞壁组分半纤维素在铝的毒性/耐受性中具有重要作用。木葡聚糖内转葡糖酶/水解酶(XTH)是一种重要的半纤维素修饰酶。XTH的基因家族已经在多种物种中被鉴定出来,例如拟南芥(33个)、番茄(25个)、水稻(29个)。按其蛋白质结构特征,可将XTH蛋白和编码它们的基因被分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ三类,Ⅰ和Ⅱ类XTH具有转糖基酶活性,Ⅲ类XTH具有水解酶活性。在拟南芥中发现XTH31 T-DNA插入突变体XTH31比野生型更耐Al,通过实验证明XTH31与Al的敏感性有关。
苎麻是种优质、高产、多年生的广泛栽培的纤维作物,具有很高的重金属镉的耐性能力。研究苎麻BnXTH5基因在植物敏感性的作用,揭示植物对镉敏感的机制,可以更加深入提高苎麻对重金属的耐性。
发明内容
针对现有技术的不足,本发明旨在提供一种利用苎麻BnXTH5基因提高植物镉敏感性的方法,实现利用苎麻BnXTH5基因有效提高拟南芥的镉敏感性。
为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
一种利用苎麻BnXTH5基因提高植物镉敏感性的方法,将苎麻BnXTH5基因在拟南芥中进行过表达。
进一步地,所述方法具体包括如下步骤:
S1、PCR扩增BnXTH5基因,并利用BamHI/SacI酶切位点将其克隆到PBI121载体上,得到BnXTH5基因过表达载体;
S2、利用EHA 105农杆菌通过浸花法转化拟南芥。
更进一步地,步骤S1中PCR扩增BnXTH5基因的具体过程为:
以BnXTH5 Forward primer、BnXTH5 Reversed primer为引物,苎麻湘苎3号cDNA为模板进行BnXTH5基因克隆,得到BnXTH5完整的开放阅读框;
PCR仪的程序为:95℃5min,94℃30s、60℃30s、72℃50s,40个循环,72℃7min;
引物BnXTH5 Forward primer、BnXTH5 Reversed primer序列如下:
BnXTH5 Forward primer:cgGGATCCATGGCATATCTTCAGGACAAAC;
BnXTH5 Reversed primer:cGAGCTCTCAATTGCACTCCGGAGGCAT。
进一步地,步骤S2的具体过程为:
将携带有步骤S1中得到的BnXTH5基因过表达载体的EHA105农杆菌摇菌至OD600=1.3,高速离心加入含0.03%Silweet-77的1/2MS液体培养基重悬得到重悬液,使其终浓度为OD=0.8;放置2h后,将未开放的拟南芥花序完全浸入重悬液中30s,斜置黑暗24h后,正常培养收获种子。
本发明的有益效果在于:通过实验证明,本发明方法通过将苎麻BnXTH5基因在拟南芥中进行过表达,有效提高了拟南芥的镉敏感性。
附图说明
图1为本发明实施例1中,BnXTH5和其它物种XTH基因同源氨基酸序列比较结果示意图,其中,Bn:苎麻;Mt:苜蓿;Pt:毛果杨;Tc:可可;Ag:芹菜;At:拟南芥;
图2为本发明实施例1中对苎麻BnXTH5蛋白与拟南芥XTH家族蛋白系统进化分析结果示意图;
图3为本发明实施例1中苎麻BnXTH5基因组织表达特异性示意图;
图4为本发明实施例1中对苎麻BnXTH5基因在镉胁迫下表达特征示意图,其中,所有数据显示为3次重复实验的平均值±SEX,不同字母表示在p<0.05水平;
图5为本发明实施例2中对转BnXTH5基因的拟南芥表型分析示意图,其中,所有数据显示为五次重复实验的平均值±SEX,*表示在p<0.05水平。
具体实施方式
以下将结合附图对本发明作进一步的描述,需要说明的是,本实施例以本技术方案为前提,给出了详细的实施方式和具体的操作过程,但本发明的保护范围并不限于本实施例。
实施例1 BnXTH5基因的获得
本实施例提供一种BnXTH5基因的获得方法,具体为:
对BnXTH5基因进行克隆,并利用Real-time PCR验证BnXTH5基因在苎麻组织中的表达部位及对重金属镉胁迫逆境的响应;具体过程为:
一、BnXTH5基因克隆及分析
根据苎麻转录组测序已知的BnXTH5基因片段设计引物:
BnXTH5 Forward primer:cgGGATCCATGGCATATCTTCAGGACAAAC;
BnXTH5 Reversed primer:cGAGCTCTCAATTGCACTCCGGAGGCAT;
以苎麻湘苎3号cDNA为模板进行基因克隆,得到BnXTH5基因完整的开放阅读框,序列为SEQ ID NO:1所示;推导出编码氨基酸序列,序列为SEQ ID NO:2所示。
SEQ ID NO:1
ATGGCATATCTTCAGGACAAACTTCTCTTCATTGTCCTCTCAGTCATGTGTGTGACTACATTTTCCGCCCGAGTTAGGCCTTACACGCCTCCGAGCGTTCCTCGCTTGACGGATCTCTTTCCTCACCTTCCTATCAGCAATGAATTCAACAACGTCTTTGGGGGCTCAAATATTAAGATCACTGGCAATGGATCAATAGCAACTCTTACTCTTGACAAAACCTCAGGATCTGGGATGGCCTCAAAAAATAAGTACTACTATGGATTTTTTAGTGCAGCAATTAAGCTACCATCTGGTCTCTCTCCAGGAGTTGTAGTGGCTTTCTATATGTCAAATGCAGATGTTTATCCTCACAACCACGACGAAATCGACATAGAATTACTCGGACACGACAAGAGAAAAAACTGGGCGTTTCAGACGAACATCTACGCGAACGGGAGCGTCAGCACCGGGAGAGAGGAGAAATTCTACCTCTGGTTTGATCCCACAGCAGAGCACCACCACTACACTATTCTCTGGAACAACCATCACATTGTGTTTTTGGTTGACAACATACCGGTGAGAGAGTTCCAGCGGAACAGCGCATACCCTTCCGTTTTCCCGTCGAAACCAATGTCGGTTTACGCGACGATATGGGACGGATCGCAGTGGGCGACGCACGGCGGGAAGTACCCCGTCAACTACAAGTACGCGCCGTTTGTGGTGTCGCTCACTGACGTTGAGATGAGCGGCTGCGTGGCGAACCCGACAGGCGCGTGTTCCAACAACAGCCCCGCGGGGATGGACCCCGTCGAGGGGCACGAGTTCGCCGCGCTGTCGAAAGAACAGCTCGCGGCGATGGATTGGGCCAGAAGGAAGCTCATGTTCTACTCTTATTGCAAGGACACTTCAAGGTTCAAAATCATGCCTCCGGAGTGCAATTGA
SEQ ID NO:2
MAYLQDKLLFIVLSVMCVTTFSARVRPYTPPSVPRLTDLFPHLPISNEFNNVFGGSNIKITGNGSIATLTLDKTSGSGMASKNKYYYGFFSAAIKLPSGLSPGVVVAFYMSNADVYPHNHDEIDIELLGHDKRKNWAFQTNIYANGSVSTGREEKFYLWFDPTAEHHHYTILWNNHHIVFLVDNIPVREFQRNSAYPSVFPSKPMSVYATIWDGSQWATHGGKYPVNYKYAPFVVSLTDVEMSGCVANPTGACSNNSPAGMDPVEGHEFAALSKEQLAAMDWARRKLMFYSYCKDTSRFKIMPPECN
将BnXTH5基因编码的氨基酸序列与苜蓿、毛果杨、可可、芹菜、拟南芥的XTH氨基酸序列进行同源比较分析,分析结果如图1所示,发现与苜蓿(XP_013445955)、毛果杨(XP_002304928)、可可(EOY16913)、芹菜(ABA54988)、拟南芥(OAP14557)氨基酸序列相似性分别为65%、70%、69%、64%、61%。
将BnXTH5基因编码的氨基酸和拟南芥的AtXTH家族的蛋白进行聚类分析,分析结果如图2所示,发现BnXTH5与AtXTH33为同源基因,即为拟南芥第Ⅲ类XTH蛋白,具有木葡聚糖水解酶活性。
二、BnXTH5基因在苎麻组织中的表达部位及对重金属镉胁迫逆境的响应:
湘苎3号在其快速生长期分别收取须根、茎、茎尖和叶片,在其生殖期分别收取雌花、雄花,用于BnXTH5基因的组织表达分析;株高、长势均匀一致的湘苎3号30d扦插苗,用1/2Hoagland营养液预培养7d后,进行200μmol/LCdCl2胁迫处理,胁迫处理0、2、4、6、8h后分别收取根、茎和叶,用于重金属镉胁迫逆境的响应研究。
以合成的普通第一链cDNA为模板进行扩增,反应体系为模板1μL、10μmol/L目标基因的上下游引物各0.5μL、2×transStart Top GREEN qPCR SuperMix 10μL、ddH2O 8μL。Bio-Rad CFX96定量PCR仪程序为:94℃30s,94℃5s、60℃30s、72℃10s,40个循环,加入熔断曲线。设置3个实验重复,用2-△△Ct法进行相对定量。实时定量PCR引物为:
BnXTH5-qPCR-F:TCTCTTCATTGTCCTCTCAGTCATGTG;
BnXTH5-qPCR-R:GAGTTGCTATTGATCCATTGCCAGTG。
如图3所示,发现该基因在花器官中表达较高,雌花的表达量最高为根中表达量的2.54倍,在叶片中表达量最低,为根中表达量的0.26倍。
如图4所示,在金属镉胁迫条件下,叶中的BnXTH5基因表达趋于上升的趋势,而在根和茎中趋于下降在逐步回升趋势,整体看BnXTH5基因在茎和根中表达呈现下调,与重金属镉逆境胁迫负相关。
实施例2苎麻BnXTH5基因提高植物镉敏感性的应用
本实施例提供了一种将苎麻BnXTH5基因在拟南芥中过表达的方法,观察转基因拟南芥在不同重金属镉浓度下的表型变化。
一、BnXTH5基因过表达载体的构建
扩增BnXTH5基因,利用BamHI/SacI酶切位点将其克隆到PBI121载体上,得到BnXTH5基因过表达载体,然后利用EHA 105农杆菌通过浸花法转化拟南芥。
1.扩增BnXTH5基因通过以下方式获得:
以苎麻湘苎3号cDNA为模板进行BnXTH5基因克隆,得到BnXTH5完整的开放阅读框。PCR仪程序为:95℃5min,94℃30s、60℃30s、72℃50s,40个循环,72℃7min;PCR引物序列如下:
BnXTH5 Forward primer:cgGGATCCATGGCATATCTTCAGGACAAAC;
BnXTH5 Reversed primer:cGAGCTCTCAATTGCACTCCGGAGGCAT;
2.浸花法转化拟南芥具体方法如下:
将携带有BnXTH5基因过表达载体的EHA105农杆菌摇菌至OD600=1.3,高速离心加入含0.03%Silweet-77的1/2MS液体培养基重悬,使其终浓度为OD=0.8。放置2h后,将未开放的拟南芥花序完全浸入重悬液中30s,斜置黑暗24h后,正常培养收获种子。
二、转BnXTH5基因T3代拟南芥抗重金属镉的鉴定
将野生型与转BnXTH5 T3代基因型拟南芥种子经表面消毒后,均分别播种于含有0、50、75μmol/L的CdCl2的MS固体培养基上,野生型与转BnXTH5 T3代基因型拟南芥各播种一侧,经4℃春化2天后,进行垂直培养2周。植物培养控制环境为16h光照/8h黑暗、周期为22℃/18℃。分别测量野生型与转BnXTH5 T3代基因型拟南芥根长及鲜重。
结果如图5所示,在镉浓度为0处理下,野生型与转BnXTH5 T3代基因型拟南芥长势较一致,在50μmol/L的CdCl2胁迫下,转BnXTH5 T3代基因型拟南芥植株较野生型拟南芥植株的根长缩短量达到显著性差异。结合苎麻在遭受重金属镉胁迫下的基因表达量,分析发现,在镉胁迫下苎麻通过降低BnXTH5表达量,减缓镉的毒害,说明BnXTH5基因与拟南芥的敏感性相关。
对于本领域的技术人员来说,可以根据以上的技术方案和构思,给出各种相应的改变和变形,而所有的这些改变和变形,都应该包括在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种利用苎麻BnXTH5基因提高植物镉敏感性的方法,其特征在于,将苎麻BnXTH5基因在拟南芥中进行过表达;所述苎麻BnXTH5基因的完整的开放阅读框序列如SEQ ID NO:1所示,编码氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示;
SEQ ID NO:1
ATGGCATATCTTCAGGACAAACTTCTCTTCATTGTCCTCTCAGTCATGTGTGTGACTACATTTTCCGCCCGAGTTAGGCCTTACACGCCTCCGAGCGTTCCTCGCTTGACGGATCTCTTTCCTCACCTTCCTATCAGCAATGAATTCAACAACGTCTTTGGGGGCTCAAATATTAAGATCACTGGCAATGGATCAATAGCAACTCTTACTCTTGACAAAACCTCAGGATCTGGGATGGCCTCAAAAAATAAGTACTACTATGGATTTTTTAGTGCAGCAATTAAGCTACCATCTGGTCTCTCTCCAGGAGTTGTAGTGGCTTTCTATATGTCAAATGCAGATGTTTATCCTCACAACCACGACGAAATCGACATAGAATTACTCGGACACGACAAGAGAAAAAACTGGGCGTTTCAGACGAACATCTACGCGAACGGGAGCGTCAGCACCGGGAGAGAGGAGAAATTCTACCTCTGGTTTGATCCCACAGCAGAGCACCACCACTACACTATTCTCTGGAACAACCATCACATTGTGTTTTTGGTTGACAACATACCGGTGAGAGAGTTCCAGCGGAACAGCGCATACCCTTCCGTTTTCCCGTCGAAACCAATGTCGGTTTACGCGACGATATGGGACGGATCGCAGTGGGCGACGCACGGCGGGAAGTACCCCGTCAACTACAAGTACGCGCCGTTTGTGGTGTCGCTCACTGACGTTGAGATGAGCGGCTGCGTGGCGAACCCGACAGGCGCGTGTTCCAACAACAGCCCCGCGGGGATGGACCCCGTCGAGGGGCACGAGTTCGCCGCGCTGTCGAAAGAACAGCTCGCGGCGATGGATTGGGCCAGAAGGAAGCTCATGTTCTACTCTTATTGCAAGGACACTTCAAGGTTCAAAATCATGCCTCCGGAGTGCAATTGA
SEQ ID NO:2
MAYLQDKLLFIVLSVMCVTTFSARVRPYTPPSVPRLTDLFPHLPISNEFNNVFGGSNIKITGNGSIATLTLDKTSGSGMASKNKYYYGFFSAAIKLPSGLSPGVVVAFYMSNADVYPHNHDEIDIELLGHDKRKNWAFQTNIYANGSVSTGREEKFYLWFDPTAEHHHYTILWNNHHIVFLVDNIPVREFQRNSAYPSVFPSKPMSVYATIWDGSQWATHGGKYPVNYKYAPFVVSLTDVEMSGCVANPTGACSNNSPAGMDPVEGHEFAALSKEQLAAMDWARRKLMFYSYCKDTSRFKIMPPECN。
2.根据权利要求1所述的利用苎麻BnXTH5基因提高植物镉敏感性的方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:
S1、PCR扩增BnXTH5基因,并利用BamHI/SacI酶切位点将其克隆到PBI121载体上,得到BnXTH5基因过表达载体;
S2、利用EHA 105农杆菌通过浸花法转化拟南芥。
3.根据权利要求2所述的利用苎麻BnXTH5基因提高植物镉敏感性的方法,其特征在于,步骤S1中PCR扩增BnXTH5基因的具体过程为:
以BnXTH5 Forward primer、BnXTH5 Reversed primer为引物,苎麻湘苎3号cDNA为模板进行BnXTH5基因克隆,得到BnXTH5完整的开放阅读框;
PCR仪的程序为:95℃5min,94℃30s、60℃30s、72℃50s,40个循环,72℃7min;
引物BnXTH5 Forward primer、BnXTH5 Reversed primer序列如下:
BnXTH5 Forward primer:cgGGATCCATGGCATATCTTCAGGACAAAC;
BnXTH5 Reversed primer:cGAGCTCTCAATTGCACTCCGGAGGCAT。
4.根据权利要求2所述的利用苎麻BnXTH5基因提高植物镉敏感性的方法,其特征在于,步骤S2的具体过程为:
将携带有步骤S1中得到的BnXTH5基因过表达载体的EHA105农杆菌摇菌至OD600=1.3,离心加入含0.03%Silweet-77的1/2MS液体培养基重悬得到重悬液,使其终浓度为OD=0.8;放置2h后,将未开放的拟南芥花序完全浸入重悬液中30s,斜置黑暗24h后,正常培养收获种子。
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GR01 | Patent grant | ||
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