CN108998472B

CN108998472B - 一种利用苎麻BnXTH1基因提高植物耐镉能力的方法

Info

Publication number: CN108998472B
Application number: CN201811035540.8A
Authority: CN
Inventors: 揭雨成; 马玉申; 邢虎成
Original assignee: Hunan Agricultural University
Current assignee: Hunan Agricultural University
Priority date: 2018-09-06
Filing date: 2018-09-06
Publication date: 2020-08-18
Anticipated expiration: 2038-09-06
Also published as: CN108998472A

Abstract

本发明公开了一种利用苎麻BnXTH1基因提高植物耐镉能力的方法，所述方法具体为将BnXTH1基因在拟南芥中过表达。实验证明，通过将BnXTH1基因在拟南芥体内过表达可明显提高拟南芥耐重金属镉能力。

Description

一种利用苎麻BnXTH1基因提高植物耐镉能力的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及苎麻BnXTH1基因在提高植物耐重金属镉能力的应用。

背景技术

镉(Cd²⁺)是最有害的重金属之一，过量的Cd²⁺会直接或间接干扰植物的光合作用、蒸腾作用和营养平衡等一系列生理过程，最终导致植物生长迟缓和死亡。植物为了在重金属污染土壤中生存和繁殖，进化出广泛的防御机制，包括金属排斥、主动外排、限制敏感组织的有毒金属分布、金属与细胞壁结合，有机分子的螯合作用的和液泡区室化，植物的细胞壁在重金属的耐性方面发挥重要作用。有相关文献报道，植物的细胞壁可以截留大部分的重金属镉，减少重金属镉进入细胞，起到“解毒”作用。苎麻也采取了同样的“解毒”策略，据报道约有48.2～61.9％的Cd分布在细胞壁上，30.2～38.1％的Cd分布在细胞质可溶性部分(包含液泡)，而细胞器中Cd含量很低。

半纤维素(hemicellulose)是细胞壁的组成成分，最近有研究表明半纤维素在细胞壁结合重金属中发挥重要作用。研究结果发现增加根系细胞壁中半纤维素的含量，可增加根系细胞壁中Cd²⁺的积累，还有研究表明半纤维素含量增加或减少与三七(Panaxnotoginseng)根细胞壁中Cd²⁺的增加或减少保持一致。另外有研究表明，根中大部分Cd²⁺固定在细胞壁的半纤维素1中，外源生长素可以通过刺激半纤维素1的合成和增加根细胞壁的镉固定能力来缓解拟南芥的镉毒性。

木葡聚糖是单子叶和双子叶植物壁中丰富的半纤维素，可以通过共价键交联纤维素微纤维以形成纤维素-木葡聚糖网络。该网络的修饰需要多种酶调节，木葡聚糖内转葡糖酶/水解酶(XTH)是其中重要的一种酶。XTH的基因家族已经在多种物种中被鉴定出来，例如拟南芥(33个)，番茄(25个)，水稻(29个)。最近的研究发现，XTH显示出具有参与重金属“解毒”新功能。

苎麻是种优质、高产、多年生的广泛栽培的纤维作物，具有很高的重金属镉的耐性能力。研究苎麻BnXTH1基因提高植物耐镉的应用，可以更加深入地揭示苎麻的耐镉性机理，为提高苎麻镉积累和耐受镉能力以及降低饲草作物中的镉改造提供理论基础。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明旨在提供一种利用苎麻BnXTH1基因提高植物耐镉能力的方法，经过实验表明，利用苎麻BnXTH1基因可以有效提高拟南芥的耐镉能力。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种利用苎麻BnXTH1基因提高植物耐镉能力的方法，所述方法具体为将BnXTH1基因在拟南芥中过表达。

进一步地，所述方法包括如下步骤：

S1、BnXTH1基因过表达载体的构建；

1.1)提取苎麻整株的总RNA，反转录为cDNA；

1.2)以步骤1.1)得到的cDNA为模板，采用引物BnXTH1-F和BnXTH1-R进行PCR扩增，得到带酶切位点的BnXTH1的开放阅读框；

BnXTH1-F:CCCCCGGGGACATAATGTGGTCGGAAGAT；

BnXTH1-R:CGAGCTCTCAATCCCAAGGGCTCAATG；

1.3)将表达载体pBI 121和BnXTH1片段进行酶切，酶切体系如下：

25℃反应10h后，65℃20min灭活内切酶，然后加入：

BamHI/SacI 1μL

10×NEB Buffer 1μL

ddH2O 8μL

37℃反应过夜，凝胶电泳胶回收目的PCR片段；

1.4)采用T4连接酶将步骤1.3)中得到的PCR片段与载体片段连接，具体体系如下：

25℃反应3h，进行大肠杆菌转化；

1.5)质粒提取：

将步骤1.4)中成功转化大肠杆菌采用质粒提取试剂盒进行质粒提取；

1.6)转化EHA105：

利用步骤1.5)提取得到的质粒进行农杆菌EHA105转化；

S2、对拟南芥进行农杆菌侵染转化：

2.1)接种农杆菌至含30mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的YEP液体培养基中，摇菌至OD＝1.2；

2.2)4℃离心收集菌体，加入含0.03％Silweet-77的1/2MS液体培养基重悬，使其OD＝0.8，得到农杆菌重悬液；

2.3)对拟南芥转化前，去掉角果与盛开的花；

2.4)将拟南芥的花序完全浸入步骤2.2)得到的农杆菌重悬液中50s，套上白色薄膜，外加黑色薄膜，斜置24h，1d后去薄膜，正常培养；7天后重复浸染一次，一月后收获种子低温烘干，放4℃条件下保存。

更进一步地，步骤1.6)的具体流程包括：

1.6.1)将2μL步骤1.5)提取得到的质粒加入到100μL EHA105感受态细胞中，轻弹混匀；

1.6.2)冰浴30min后，液氮速冻3min，再37℃水浴5min；

1.6.3)加入800μL无抗生素的LB培养基，200rpm、28℃震荡培养3h；

1.6.4)5000rpm离心5min，留100μL上清悬浮菌液，涂板到含利福平和卡那霉素的固体YEP培养基上，倒置28℃培养48h；

1.6.5)阳性克隆检测：挑取单菌落与10μL ddH₂O，混匀后，去2μL与25μL PCR体系，用目标基因R引物与pBI121 35S-F鉴定，剩下的混合液加入1mL含利福平和卡那霉素的YEP液体培养基中扩大培养，PCR鉴定正确的菌株甘油保存。

本发明的有益效果在于：实验证明，通过将BnXTH1基因在拟南芥体内过表达可明显提高拟南芥耐重金属镉能力。

附图说明

图1为本发明实施例1中，BnXTH1和其它物种XTH基因同源氨基酸序列比较示意图，其中，Bn:苎麻；Tc:可可；Md:苹果；Pt:毛果杨；Mt:苜蓿；At:拟南芥；

图2为本发明实施例2中对转BnXTH1基因的拟南芥PCR鉴定结构示意图；

图3为本发明实施例2中对转BnXTH1基因的拟南芥表型分析示意图，其中，所有数据显示为五次重复实验的平均值±SEX，*表示在p<0.05水平。

具体实施方式

以下将结合附图对本发明作进一步的描述，需要说明的是，以下实施例以本技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围并不限于本实施例。

实施例1

一、苎麻总RNA的提取及第一链cDNA的合成

采用多糖多酚RNA提取试剂盒提取苎麻(本实施例中采用湘苎3号)总RNA；然后取5μL总RNA，按照RLM-RACE试剂盒说明书3'RACE cDNA的方法合成3'RACE第一链cDNA。

二、BnXTH1 3'RACE-PCR

根据苎麻转录组测序已知的BnXTH1基因片段设计3'RACE槽式引物：BnXTH1 3'RACE outer Primer：TGGTGTCGTTACCGCTTATT；BnXTH13'RACE inner Primer：ACAAAGTGCCAGTAAGGGTG。

然后根据RLM-RACE试剂盒说明书进行槽式PCR，PCR产物进行纯化回收，克隆测序。将所得片段与已知片段进行拼接，利用NCBI ORF finder确定BnXTH1完整的开放阅读框(序列为SEQ ID NO:1)，推导出编码氨基酸序列(序列为SEQ ID NO:2)。

SEQ ID NO:1

ATGGCCGCTTCTCGCTCTCTCTCCGAAGCGGCCGACCCGAAAGCCTCTTTCGAAGAAAATTTCGACATAATGTGGTCGGAAGATCACTTCACAACCTCCCAAGACGGGCAGATCTGGTACCTATCTCTAGACAATGAAACAGGTTGTGGATTCCAAACCAAGCAAAGGTACAGATTTGGTTGGTTCAGCATGAAGCTTAAGTTGGTGGGAGGCGACTCTGCTGGTGTCGTTA CCGCTTATTATATGTGTTCGGAAAACGGAGCCGGGCCGGAGCGGGACGAGTTAGATTTCGAGTTTTTGGGGAATAGGAGTGGACAGCCATATCTGATTCAGACAAATGTGTACAAGAATGGGACTGGTTCAAGAGAGATGAGGCATGTGCTTTGGTTTGACCCCACAGAAGACTATCATGTCTATTCAATCCTATGGAACCCCAAACAAATTGTGTTTTTTGTGGACAAAGTGCCAGTAAGGGTGTACAAGAACAATGGCAAAAGCAACAACTTCTTCCCAAATGAGAAGCCAATGTACTTGTTCTCAAGCATATGGAACGCCGACGATTGGGCCACGAGGGGTGGCCTCGAGAAGACGGATTGGAAAAAGGCGCCATTCATCTCATCCTACCAGGACTTCAGCGTCGACGCCTGCCAATGGGAGGATCCTTACCCTGCCTGCGTCTCCACCACGACCGACCACTGGTGGGACCAGTACAAGGCTTGGCACCTCTCCGATTCGCAGAAGCTAGACCATGCTTGGGTTCAACGGAACCTCGTGATCTACGACTATTGCAAGGACACTGAGCGCTTCCCGACTTTGCCAGAGGAGTGCTCATTGAGCCCTTGGGATTGA

SEQ ID NO:2

MAASRSLSEAADPKASFEENFDIMWSEDHFTTSQDGQIWYLSLDNETGCGFQTKQRYRFGWFSMKLKLVGGDSAGVVTAYYMCSENGAGPERDELDFEFLGNRSGQPYLIQTNVYKNGTGSREMRHVLWFDPTEDYHVYSILWNPKQIVFFVDKVPVRVYKNNGKSNNFFPNEKPMYLFSSIWNADDWATRGGLEKTDWKKAPFISSYQDFSVDACQWEDPYPACVSTTTDHWWDQYKAWHLSDSQKLDHAWVQRNLVIYDYCKDTERFPTLPEECSLSPWD

三、序列分析

经分析发现BnXTH1cDNA长度为1128bp，开放阅读框大小为849bp，预测编码282个氨基酸。发现BnXTH1蛋白具有典型的GH16_XET和Glyco_hydro_16结构域，属于XET_C超家族、LamG超家族与SKN1超家族。

将BnXTH1基因编码的氨基酸序列与其他物种的XTH氨基酸序列进行同源比较分析(图1)，发现与可可(EOY28613)、苹果(ACD03227)、毛果杨(XP_002304928)、苜蓿(KEH43921)、拟南芥(OAP11898)氨基酸序列相似性分别为87％、86％、87％、88％、83％。

实施例2

本实施例提供了一种BnXTH1的转基因试验方法，具体来说是将BnXTH1基因在拟南芥中过表达，观察转基因拟南芥在不同重金属镉浓度下的表型变化。

1、BnXTH1基因过表达载体的构建

1)提取苎麻(本实施例中采用湘苎3号)整株的总RNA，反转录为cDNA；

2)以所述cDNA为模板，采用引物BnXTH1-F和BnXTH1-R进行PCR扩增，得到带酶切位点的BnXTH1的开放阅读框；

BnXTH1-F:CCCCCGGGGACATAATGTGGTCGGAAGAT；

BnXTH1-R:CGAGCTCTCAATCCCAAGGGCTCAATG。

3)将表达载体pBI 121和BnXTH1片段进行酶切，酶切体系如下：

25℃反应10h后，65℃20min灭活内切酶，向上述反应液加入：

BamHI/SacI 1μL

10×NEB Buffer 1μL

ddH2O 8μL

37℃反应过夜，凝胶电泳胶回收目的片段。

4)采用T4连接酶将酶切后的PCR片段与载体片段连接，具体体系如下：

25℃反应3h，进行大肠杆菌转化。

5)质粒提取及转化EHA105

将上述成功转化大肠杆菌采用质粒提取试剂盒说明进行质粒提取；然后进行农杆菌EHA105转化；

农杆菌EHA105转化采用如下方法：

a.将2μL提取得到的含目的基因的质粒加入到100μL EHA105感受态细胞中，轻弹混匀；

b.冰浴30min后，液氮速冻3min，再37℃水浴5min；

c.加入800μL无抗生素的LB培养基，200rpm、28℃震荡培养3h；

d.5000rpm离心5min，留100μL上清悬浮菌液，涂板到含Rif+Kan的固体YEP培养基上，倒置28℃培养48h；

e.阳性克隆检测：挑取单菌落与10μL ddH₂O，混匀后，去2μL与25μL PCR体系，用目标基因R引物与pBI121 35S-F鉴定，剩下的混合液加入1mL含Rif与Kan的YEP液体培养基中扩大培养，PCR鉴定正确的菌株甘油保存。

2、浸花法转化拟南芥

拟南芥进行农杆菌侵染转化的具体步骤如下：

1)接种农杆菌至含30mg/L利福平(Rifampicin)+50mg/L卡那霉素(Kanamycin)的YEP液体培养基中，摇菌至OD＝1.2；

2)4℃离心收集菌体，加入含0.03％Silweet-77的1/2MS液体培养基重悬，使其OD＝0.8；

3)拟南芥转化前，尽量去掉角果与盛开的花；

4)将花序完全浸入农杆菌重悬液中50s，套上白色薄膜，外加黑色薄膜，斜置24h，1d后去薄膜，正常培养。7天后重复浸染一次，一月后收获种子低温烘干，放4℃条件下保存。

3、转基因植株的鉴定

1)卡那霉素鉴定阳性植株

将拟南芥种子进行表面消毒，消毒方法为0.1％升汞消毒4min，无菌水洗4次，70％酒精消毒4min，无菌水洗4次。然后将种子播撒在含Kan的MS固体培养基上，经4℃春化2天后，放入植物培养箱培养。植物培养控制环境为16h光照/8h黑暗、周期为22℃/18℃。2周后挑取叶片翠绿根部发育正常的拟南芥幼苗，移入营养土中，继续培养收获下代种子。

2)PCR鉴定阳性植株

取未开花的初步鉴定阳性苗的叶片1～2片，采用CTAB法提取DNA，采用pBI 12135S-F：GACGCACAATCCCACTATCC与BnXTH1-test-R：ATGGCTGTCCACTCCTATTCC进行特异性PCR，鉴定阳性苗。

如图2所示，浸花法转化拟南芥后收获T0代种子，种子进行表面消毒后，平铺在含Kan的MS固体培养基上，经4℃春化2天后，放入植物培养箱培养，共得到22株阳性T1代转基因苗，移入营养钵中，并进行依次编号1～22，当苗长到足够大且为抽薹前，取初步鉴定阳性苗的叶片1～2片，提取DNA，经特异性PCR，鉴定发现6、11、12、20号苗无特异性条带，其余皆为转基因材料，对有特异条带的转BnXTH1基因拟南芥继续培养收获下一代。

3)转BnXTH1基因T3代拟南芥抗重金属镉的鉴定

将野生型与转BnXTH1T3代基因型拟南芥种子经表面消毒后，播种与含有0、50、75μmol/L的CdCl₂的MS固体培养基上，野生型与转BnXTH1基因型拟南芥各播种一侧，经4℃春化2天后，进行垂直培养2周。植物培养控制环境为16h光照/8h黑暗、周期为22℃/18℃。分别测量野生型与转BnXTH1基因型拟南芥根长及鲜重。

结果如图3，在未施镉的处理下，转基因型与野生型拟南芥长势较一致，WT根长为5.16cm，每株拟南芥苗的鲜重约为2.25mg。转BnXTH1基因型拟南芥根长为5.22cm，每株拟南芥苗的鲜重约为2.38mg。可见，在50μmol/L的CdCl₂胁迫下，WT根长缩短了33.72％，而转BnXTH1基因型只有12.64％，达到显著性差异。鲜重的差异也达到显著水平。在75μmol/L的CdCl₂胁迫下，WT根长为缩短了0.96cm，而转BnXTH1基因型根长为1.64cm，达到显著性差异。说明BnXTH1基因的过表达可提高拟南芥的镉耐性和产量。

对于本领域的技术人员来说，可以根据以上的技术方案和构思，给出各种相应的改变和变形，而所有的这些改变和变形，都应该包括在本发明权利要求的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖南农业大学

<120> 一种利用苎麻BnXTH1基因提高植物耐镉能力的方法

<130> 123

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 849

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 1

atggccgctt ctcgctctct ctccgaagcg gccgacccga aagcctcttt cgaagaaaat 60

ttcgacataa tgtggtcgga agatcacttc acaacctccc aagacgggca gatctggtac 120

ctatctctag acaatgaaac aggttgtgga ttccaaacca agcaaaggta cagatttggt 180

tggttcagca tgaagcttaa gttggtggga ggcgactctg ctggtgtcgt taccgcttat 240

tatatgtgtt cggaaaacgg agccgggccg gagcgggacg agttagattt cgagtttttg 300

gggaatagga gtggacagcc atatctgatt cagacaaatg tgtacaagaa tgggactggt 360

tcaagagaga tgaggcatgt gctttggttt gaccccacag aagactatca tgtctattca 420

atcctatgga accccaaaca aattgtgttt tttgtggaca aagtgccagt aagggtgtac 480

aagaacaatg gcaaaagcaa caacttcttc ccaaatgaga agccaatgta cttgttctca 540

agcatatgga acgccgacga ttgggccacg aggggtggcc tcgagaagac ggattggaaa 600

aaggcgccat tcatctcatc ctaccaggac ttcagcgtcg acgcctgcca atgggaggat 660

ccttaccctg cctgcgtctc caccacgacc gaccactggt gggaccagta caaggcttgg 720

cacctctccg attcgcagaa gctagaccat gcttgggttc aacggaacct cgtgatctac 780

gactattgca aggacactga gcgcttcccg actttgccag aggagtgctc attgagccct 840

tgggattga 849

<210> 2

<211> 282

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 2

Met Ala Ala Ser Arg Ser Leu Ser Glu Ala Ala Asp Pro Lys Ala Ser

1 5 10 15

Phe Glu Glu Asn Phe Asp Ile Met Trp Ser Glu Asp His Phe Thr Thr

20 25 30

Ser Gln Asp Gly Gln Ile Trp Tyr Leu Ser Leu Asp Asn Glu Thr Gly

35 40 45

Cys Gly Phe Gln Thr Lys Gln Arg Tyr Arg Phe Gly Trp Phe Ser Met

50 55 60

Lys Leu Lys Leu Val Gly Gly Asp Ser Ala Gly Val Val Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Tyr Met Cys Ser Glu Asn Gly Ala Gly Pro Glu Arg Asp Glu Leu Asp

85 90 95

Phe Glu Phe Leu Gly Asn Arg Ser Gly Gln Pro Tyr Leu Ile Gln Thr

100 105 110

Asn Val Tyr Lys Asn Gly Thr Gly Ser Arg Glu Met Arg His Val Leu

115 120 125

Trp Phe Asp Pro Thr Glu Asp Tyr His Val Tyr Ser Ile Leu Trp Asn

130 135 140

Pro Lys Gln Ile Val Phe Phe Val Asp Lys Val Pro Val Arg Val Tyr

145 150 155 160

Lys Asn Asn Gly Lys Ser Asn Asn Phe Phe Pro Asn Glu Lys Pro Met

165 170 175

Tyr Leu Phe Ser Ser Ile Trp Asn Ala Asp Asp Trp Ala Thr Arg Gly

180 185 190

Gly Leu Glu Lys Thr Asp Trp Lys Lys Ala Pro Phe Ile Ser Ser Tyr

195 200 205

Gln Asp Phe Ser Val Asp Ala Cys Gln Trp Glu Asp Pro Tyr Pro Ala

210 215 220

Cys Val Ser Thr Thr Thr Asp His Trp Trp Asp Gln Tyr Lys Ala Trp

225 230 235 240

His Leu Ser Asp Ser Gln Lys Leu Asp His Ala Trp Val Gln Arg Asn

245 250 255

Leu Val Ile Tyr Asp Tyr Cys Lys Asp Thr Glu Arg Phe Pro Thr Leu

260 265 270

Pro Glu Glu Cys Ser Leu Ser Pro Trp Asp

275 280

Claims

1.一种利用苎麻BnXTH1基因提高植物耐镉能力的方法，其特征在于，所述方法具体为将BnXTH1基因在拟南芥中进行过表达；所述BnXTH1基因的完整的开放阅读框如SEQ ID NO:1所示，编码氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.根据权利要求1所述的利用苎麻BnXTH1基因提高植物耐镉能力的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

S1、BnXTH1基因过表达载体的构建；

1.1)提取苎麻整株的总RNA，反转录为cDNA；

BnXTH1-F:CCCCCGGGGACATAATGTGGTCGGAAGAT；

BnXTH1-R:CGAGCTCTCAATCCCAAGGGCTCAATG；

1.3)将表达载体pBI 121和BnXTH1片段进行酶切，酶切体系如下：

25℃反应10h后，65℃20min灭活内切酶，然后加入：

BamHI/SacI 1μL

10×NEB Buffer 1μL

ddH2O 8μL

37℃反应过夜，凝胶电泳胶回收目的PCR片段；

25℃反应3h，进行大肠杆菌转化；

1.5)质粒提取：

1.6)转化EHA105：

利用步骤1.5)提取得到的质粒进行农杆菌EHA105转化；

S2、对拟南芥进行农杆菌侵染转化：

2.3)对拟南芥转化前，去掉角果与盛开的花；

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1.6)的具体流程包括：

1.6.2)冰浴30min后，液氮速冻3min，再37℃水浴5min；

1.6.3)加入800μL无抗生素的LB培养基，200rpm、28℃震荡培养3h；

1.6.5)阳性克隆检测：挑取单菌落与10μL ddH₂O，混匀后，取2μL与25μL PCR体系，用目标基因R引物与pBI121 35S-F鉴定，剩下的混合液加入1mL含利福平和卡那霉素的YEP液体培养基中扩大培养，PCR鉴定正确的菌株甘油保存；

所述pBI121 35S-F为：

pBI 121 35S-F：GACGCACAATCCCACTATCC；

所述目标基因R引物为：

BnXTH1-test-R：ATGGCTGTCCACTCCTATTCC。