CN112481296B - 一种利用苎麻BnXTH2基因提高辣椒抗寒能力的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用BnXTH2基因提高植物抗寒能力的方法，所述方法具体为将BnXTH2基因在辣椒中异源表达。实验证明，通过将BnXTH2基因在辣椒体内异源表达可明显提高辣椒抗寒能力。

Description

一种利用苎麻BnXTH2基因提高辣椒抗寒能力的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种利用苎麻BnXTH2基因提高辣椒抗寒能力的方法。

背景技术

辣椒(Capsicum anmuum L.)是一种重要的喜温性蔬菜,在北方保护地种植面积较大,但由于冬季温度低,光照弱,影响了北方地区辣椒的生产。苗期越冬易受突然寒流低温(0℃以下)霜冻或早春阴雨低温(0℃以上)的冷害,严重影响辣椒的生长、早期产量和商品性。急需一种增强辣椒抗寒冬的一种技术。

近期的研究发现XTH5/7过表达(oxXTH5、ox XTH7)转基因植物在低温处理下植株存活率实验发现，过表达XTH基因能够促进辣椒细胞壁中半纤维素的积累从而增强植株抗冻性。番茄XTH3基因也发现与植物抗寒性相关。

利用BnXTH2基因增强辣椒抗寒能力，可以有效解决辣椒抗寒的问题。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明旨在提供一种利用苎麻BnXTH2基因提高辣椒抗寒能力的方法，经过实验表明，利用苎麻BnXTH2基因可以有效提高辣椒的抗寒能力。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种利用苎麻BnXTH2基因提高辣椒抗寒能力的方法，所述方法具体为将苎麻BnXTH2基因在辣椒中过表达。

进一步地，所述方法包括如下步骤：

S1、BnXTH2基因过表达载体的构建；

1.1)提取整株的总RNA并反转录为cDNA；

1.2)以步骤1.1)得到的cDNA为模板，采用引物BnXTH2-F和BnXTH2-R进行PCR扩增，得到带酶切位点的BnXTH2的开放阅读框；

BnXTH2-F:CGGGATCCATGAGATCATCATCAAGTAGT；

BnXTH2-R:CGAGCTCCTAGTAGCCAGCGAGGCACT；

1.3)将表达载体pBI 121和BnXTH2片段进行酶切，酶切体系如下：

37℃反应过夜，凝胶电泳胶回收目的PCR片段；

1.4)采用T4连接酶将步骤1.3)中得到的PCR片段与载体片段连接，具体体系如下：

16℃反应过夜，进行大肠杆菌转化；

1.5)质粒提取：

将步骤1.4)中成功转化大肠杆菌采用质粒提取试剂盒进行质粒提取；

1.6)转化EHA105：

利用步骤1.5)提取得到的质粒进行农杆菌EHA105转化；

S2、对辣椒进行农杆菌侵染转化及组织培养：

2.1)接种农杆菌至含Rif+Kan的YEP液体培养基中，摇菌至OD＝1.5；

2.2)4℃离心后加入含0.3％AS的1/2MS液体培养基重悬，使其OD＝0.5；

2.3)将辣椒带子叶胚轴下胚轴进行农杆菌浸染后共培养2d后，转移至MS+6-BA3mg/L+NAA 0.8mg/L+Tim 300mg/L+Kan100mg/L愈伤培养基上，每14d更换培养基直至长出丛生芽；

2.4)将丛生芽转移至生根培养基1/2MS+IBA 0.7mg/L+Tim 300mg/L+Kan100mg/L，直至长出1cm左右根系，移入营养钵中正常养护，收获种子，待收获种子低温烘干，4℃保存。

S3、转BnXTH2基因辣椒抗寒冻能力鉴别

将野生型与转BnXTH2基因T3代辣椒种子浸种催芽后播种于营养土中，15℃正常条件下培养到2-3片叶的幼苗期，将幼苗分别在(5士l)℃,(10士l)℃,(15士l)℃(对照)下处理,第5d和第10d分别取样测定抗坏血酸及MDA含量。具体地说，不同低温处理后第5d测定幼苗的MDA含量低温处理第5d,转基因株系在(5士1)℃MDA的含量比非转基因株系低28.72％；转基因株系在(5士1)℃抗坏血酸含量的含量比非转基因株系高58.72％，因此可以判定BnXTH2基因在辣椒体内表达可明显提高辣椒抗寒能力。

本发明的有益效果在于：实验证明，通过将BnXTH2基因在辣椒体内过表达可明显提高辣椒抗寒能力。

具体实施方式

以下对本发明作进一步的描述，需要说明的是，以下实施例以本技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围并不限于本实施例。

实施例1

一、总RNA的提取及第一链cDNA的合成

采用RNA提取试剂盒提取辣椒总RNA；然后取5μL总RNA，

根据转录组测序BnXTH2基因片段克隆BnXTH2完整的ORF(序列为SEQ ID NO:1)，推导出编码氨基酸序列(序列为SEQ ID NO:2)。

二、序列分析

经分析发现BnXTH2 cDNA长开放阅读框大小为870bp，预测编码289个氨基酸。发现BnXTH2蛋白具有典型的GH16_XET和Glyco_hydro_16结构域，属于XET_C超家族、LamG超家族与SKN1超家族。

实施例2

本实施例提供了一种BnXTH2的转基因试验方法，具体来说是将BnXTH2基因转导到辣椒中，观察转基因辣椒在低温下的表型变化。

1、BnXTH2基因过表达载体的构建

S1、BnXTH2基因过表达载体的构建；

1.1)提取整株的总RNA并反转录为cDNA；

1.2)以步骤1.1)得到的cDNA为模板，采用引物BnXTH2-F和BnXTH2-R进行PCR扩增，得到带酶切位点的BnXTH2的开放阅读框；

BnXTH2-F:CGGGATCCATGAGATCATCATCAAGTAGT；

BnXTH2-R:CGAGCTCCTAGTAGCCAGCGAGGCACT；

1.3)将表达载体pBI 121和BnXTH2片段进行酶切，酶切体系如下：

37℃反应过夜，凝胶电泳胶回收目的PCR片段；

1.4)采用T4连接酶将步骤1.3)中得到的PCR片段与载体片段连接，具体体系如下：

PCR片段1μL

pBI 121 4μL

5×T4 DNA Ligase Buffer 2μL

T4 DNA Ligase 1μL

ddH2O 2μL

16℃反应过夜，进行大肠杆菌转化；

1.5)质粒提取：

将步骤1.4)中成功转化大肠杆菌采用质粒提取试剂盒进行质粒提取；

1.6)转化EHA105：

利用步骤1.5)提取得到的质粒进行农杆菌EHA105转化；

S2、对辣椒进行农杆菌侵染转化及组织培养：

2.1)接种农杆菌至含Rif+Kan的YEP液体培养基中，摇菌至OD＝1.5；

2.2)4℃离心后加入含0.3％AS的1/2MS液体培养基重悬，使其OD＝0.5；

2.3)将辣椒带子叶胚轴下胚轴进行农杆菌浸染后共培养2d后，转移至MS+6-BA3mg/L+NAA 0.8mg/L+Tim 300mg/L+Kan100mg/L愈伤培养基上，每14d更换培养基直至长出丛生芽；

2.4)将丛生芽转移至生根培养基1/2MS+IBA 0.7mg/L+Tim 300mg/L+Kan100mg/L，直至长出1cm左右根系，移入营养钵中正常养护，收获种子，待收获种子低温烘干，4℃保存。

2.5)转BnXTH2基因T3代辣椒抗寒的鉴定

将野生型与转BnXTH2基因T3代辣椒种子浸种催芽后播种于营养土中，15℃正常条件下培养到2-3片叶的幼苗期，将幼苗分别在(5士l)℃,(10士l)℃,(15士l)℃(对照)下处理,第5d和第10d分别取样测定抗坏血酸及MDA含量。

结果如表1所示，不同低温处理后第5d测定幼苗的MDA含量低温处理第5d,转基因株系在(5士1)℃MDA的含量比非转基因株系低28.72％。转基因株系在(5士1)℃抗坏血酸含量的含量比非转基因株系高58.72％。结果如下表所示，表明转基因植株提高了抗寒性。

表1 BnXTH2基因辣椒与非转基因辣椒生理生化指标

对于本领域的技术人员来说，可以根据以上的技术方案和构思，给出各种相应的改变和变形，而所有的这些改变和变形，都应该包括在本发明权利要求的保护范围之内。

序列表

<110> 湖南农业大学

<120> 一种利用BnXTH2基因提高植物抗寒能力的方法

<130> 123

<141> 2020-11-30

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 870

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

atgagatcat catcaagtag tgtattgtta gctattatta ttattggttg ttattggttt 60

gtctcagtgt tgggacgacc agccactttt caagaggact tcagggtcac atggtccgac 120

tcccatctca ggcaaatcga aggtggcagt gccattcagc tagtccttga ccaatcctca 180

ggatgtgggt tttcttcgaa gaaacggtac ttgtttgggc gtgtgagcat gaagatcaag 240

ctcatccccg gtgactctgc agggacagtc actgcctttt atatgaactc ggacaccgac 300

acaattcgcg acgagttgga cttcgagttc ttgggcaacc ggagcggcca gccgtacacg 360

gtgcagacta acatcttcgc tcatgggaag ggcgacagag agcaaagggt caacctttgg 420

tttgaccctt cggcggctta ccacacttac actataatgt ggacccaccg caggattaca 480

ttccttgtgg acgatgtgcc cataagggtt tacaaaaaca atgaggcaaa gggaattccc 540

taccctctcc accagcccat ggggatctac tcaaccctat gggaagccga cgactgggcg 600

acgcgcggcg gcctcgagaa gatcaactgg agcaaggccc cgtttttcgc ctactacaag 660

gacttcgaca tcgagggctg ccccgtccct ggccccgcaa actgcgcctc caaccccgcc 720

aattggtggg agggaccggc ttaccaaggc ctcagcgcca tcgaggcccg ccgctacaag 780

tgggtccgga tgtaccacat gatctacgac tactgcaccg ataagtcgcg gtaccccgtg 840

cccccgccgg agtgcctcgc tggctactag 870

<210> 2

<211> 289

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 2

Met Arg Ser Ser Ser Ser Ser Val Leu Leu Ala Ile Ile Ile Ile Gly

1 5 10 15

Cys Tyr Trp Phe Val Ser Val Leu Gly Arg Pro Ala Thr Phe Gln Glu

20 25 30

Asp Phe Arg Val Thr Trp Ser Asp Ser His Leu Arg Gln Ile Glu Gly

35 40 45

Gly Ser Ala Ile Gln Leu Val Leu Asp Gln Ser Ser Gly Cys Gly Phe

50 55 60

Ser Ser Lys Lys Arg Tyr Leu Phe Gly Arg Val Ser Met Lys Ile Lys

65 70 75 80

Leu Ile Pro Gly Asp Ser Ala Gly Thr Val Thr Ala Phe Tyr Met Asn

85 90 95

Ser Asp Thr Asp Thr Ile Arg Asp Glu Leu Asp Phe Glu Phe Leu Gly

100 105 110

Asn Arg Ser Gly Gln Pro Tyr Thr Val Gln Thr Asn Ile Phe Ala His

115 120 125

Gly Lys Gly Asp Arg Glu Gln Arg Val Asn Leu Trp Phe Asp Pro Ser

130 135 140

Ala Ala Tyr His Thr Tyr Thr Ile Met Trp Thr His Arg Arg Ile Thr

145 150 155 160

Phe Leu Val Asp Asp Val Pro Ile Arg Val Tyr Lys Asn Asn Glu Ala

165 170 175

Lys Gly Ile Pro Tyr Pro Leu His Gln Pro Met Gly Ile Tyr Ser Thr

180 185 190

Leu Trp Glu Ala Asp Asp Trp Ala Thr Arg Gly Gly Leu Glu Lys Ile

195 200 205

Asn Trp Ser Lys Ala Pro Phe Phe Ala Tyr Tyr Lys Asp Phe Asp Ile

210 215 220

Glu Gly Cys Pro Val Pro Gly Pro Ala Asn Cys Ala Ser Asn Pro Ala

225 230 235 240

Asn Trp Trp Glu Gly Pro Ala Tyr Gln Gly Leu Ser Ala Ile Glu Ala

245 250 255

Arg Arg Tyr Lys Trp Val Arg Met Tyr His Met Ile Tyr Asp Tyr Cys

260 265 270

Thr Asp Lys Ser Arg Tyr Pro Val Pro Pro Pro Glu Cys Leu Ala Gly

275 280 285

Tyr

Claims (3)

1.一种利用苎麻BnXTH2基因提高辣椒抗寒能力的方法，其特征在于，所述方法具体为将BnXTH2基因在辣椒中进行过表达，其中，所述BnXTH2基因的完整的开放阅读框如SEQ IDNO:1所示，编码氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.根据权利要求1所述的利用苎麻BnXTH2基因提高辣椒抗寒能力的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

S1、BnXTH2基因过表达载体的构建；

1.1)提取植物整株的总RNA，反转录为cDNA；

1.2)以步骤1.1)得到的cDNA为模板，采用引物BnXTH2-F和BnXTH2-R进行PCR扩增，得到带酶切位点的BnXTH2的开放阅读框；

BnXTH2-F:CGGGATCCATGAGATCATCATCAAGTAGT；

BnXTH2-R:CGAGCTCCTAGTAGCCAGCGAGGCACT；

1.3)将表达载体pBI 121和BnXTH2片段进行酶切，酶切体系如下：

37℃反应过夜，凝胶电泳胶回收目的PCR片段；

1.4)采用T4连接酶将步骤1.3)中得到的PCR片段与载体片段连接，具体体系如下：

16℃反应过夜，进行大肠杆菌转化；

1.5)质粒提取：

将步骤1.4)中成功转化大肠杆菌采用质粒提取试剂盒进行质粒提取；

1.6)转化EHA105：

利用步骤1.5)提取得到的质粒进行农杆菌EHA105转化；

S2、对辣椒进行农杆菌侵染转化：

2.1)接种农杆菌至含30mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的YEP液体培养基中，摇菌至OD＝1.0；

2.2)4℃离心收集菌体，加入1/2MS液体培养基重悬，使其OD＝0.5，得到农杆菌重悬液；

2.3)将辣椒带柄子叶浸入农杆菌重悬液中20min后，20度下共培养2d转移至愈伤及分化培养基为：MS+0.6mg/L IAA+5.0mg/L 6-BA+300mg/LTim+100mg/L Kan，每2周更换一次培养基；

2.4)待长出丛生芽后移入芽伸长培养基为：

Ms+0.8mg/L IAA+2.0mg/L6-BA+2.0mg/LGA3 300mg/LTim+300mg/L Kan

2.5)后移入生根培养基1/2MS+0.5mg/LIAA，生根待根长为1cm左右后移入营养土中正常培养收获辣椒种子。

3.根据权利要求2所述的利用苎麻BnXTH2基因提高辣椒抗寒能力的方法，其特征在于，还包括转BnXTH2基因辣椒抗寒冻能力鉴别；其中，将野生型与转BnXTH2基因T3代辣椒种子浸种催芽后播种于营养土中，15℃正常条件下培养到2-3片叶的幼苗期，将幼苗分别在(5±l)℃,(10±l)℃,(15±l)℃下处理,其中，在(15±l)℃下处理作为对照，第5d和第10d分别取样测定抗坏血酸及MDA含量；

不同低温处理后第5d测定幼苗的MDA含量低温处理第5d,转基因株系在(5±1)℃MDA的含量比非转基因株系低28.72％；转基因株系在(5±1)℃抗坏血酸含量的含量比非转基因株系高58.72％。