CN107699578B - 一种苎麻金属硫蛋白基因及其重组蛋白与应用 - Google Patents

一种苎麻金属硫蛋白基因及其重组蛋白与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种苎麻金属硫蛋白基因及其重组蛋白与应用，所述的苎麻金属硫蛋白基因为序列表SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述的苎麻金属硫蛋白为序列表SEQ ID NO.2所示氨基酸序列。本发明从草本植物苎麻体内克隆获得新的金属硫蛋白基因，构建重组表达工程菌株，通过表达纯化获得重组金属硫蛋白，该蛋白中含有12个半胱氨酸(Cys)，有丰富的巯基能螯合镉等重金属离子，在制备重金属螯合解毒剂、化工、医药、重金属污染耕地及农业面源污染治理等领域有广阔的应用前景。

Description

一种苎麻金属硫蛋白基因及其重组蛋白与应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种苎麻金属硫蛋白基因及其重组蛋白与应用。
背景技术
随着经济和工业的迅速发展，重金属在生态环境中的日益积累及不断扩散导致世界范围内重金属污染问题也日益突出。我国目前受镉、砷、铬、铅等重金属污染的耕地总面积达2000万hm2，受镉污染的耕地面积就接近1.33万hm2，给我国生态经济建设和可持续发展带来严峻的考验。金属硫蛋白(Metallothionein，MT)含有丰富的半胱氨酸残基(10-30％)，可以通过巯基簇的聚集螯合镉、铜、铅、锌等离子，是重金属离子的天然配体，因而通过金属硫蛋白分离生态环境的重金属具有重大的研究意义。
目前，MT的来源主要是从兔肝中提取，但是这种工艺复杂，产量非常低。有研究表明，植物金属硫蛋白在体外对重金属离子的结合能力也很强，因而利用基因工程的方法克隆表达植物金属硫蛋白是近年来的一个研究热点。如专利号为CN 103614386 A的“盐穗木金属硫蛋白基因及其重组蛋白与应用”中利用基因工程的方法获得一种盐穗木金属硫蛋白，其分子量为7.7kD，等电点为4.78，半胱氨酸含量为17.9％。又如专利号为CN 103937810A的“超富集植物龙葵金属硫蛋白基因(MT-L3)序列及其克隆方法”中利用基因工程的方法获得一种龙葵3型金属硫蛋白，其分子量为7.06kD，等电点为4.67，半胱氨酸含量为15.4％。以上专利中获得的金属硫蛋白存在着分子量较大，半胱氨酸含量低的缺陷，因而对重金属离子的结合能力有限。
发明内容
本发明的目的是提供一种苎麻金属硫蛋白基因(bnmtl)及其重组蛋白(BnMTL)与应用，该重组苎麻金属硫蛋白具有分子量小，半胱氨酸含量高，与重金属离子结合能力强的优势。
本发明提供的这种苎麻金属硫蛋白基因为序列表SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
本发明提供的这种重组苎麻金属硫蛋白为序列表SEQ ID NO.2所示氨基酸序列。
本发明这种制备重组苎麻金属硫蛋白的方法，包括以下步骤：
步骤一、合成序列表SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
步骤二、根据步骤一的核苷酸序列，构建pET-30a-bnmtl的重组载体以及相对应的重组表达基因工程菌；
步骤三、将步骤二获得的重组基因工程菌进行原核表达，并对获得的蛋白进行纯化，得到氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示重组苎麻金属硫蛋白。
所述步骤一的具体方法，包括以下步骤：
1)从苎麻根系样品中提取总RNA，并用反转录酶合成cDNA(互补脱氧核糖核酸)第一链；
2)以cDNA为模板，利用上游引物1和下游引物2进行PCR(聚合酶链式反应)扩增；
上游引物1：5’GGAATTCATGGGTTGCCCTTGTGGAAAC 3’
下游引物2：5’CAAGCTTTTGATTGCAAGAGCAGCTTGAG 3’
PCR的反应体系为：1ul cDNA模板，25ul 2×PrimerSTAR Max DNA Polymerase，2ul上游引物1，2ul下游引物2，补ddH2O(双蒸水)至总反应体系为50ul；PCR的反应条件为：①94℃，5min；②94℃，15s；③55℃，15s；④72℃，20s；⑤重复步骤②-④30个循环；⑥72℃，10min；
3)PCR产物经纯化回收后测序，得到如序列表SEQ ID NO.1所示碱基序列。
所述步骤二中，重组表达载体的载体骨架为pET-30a原核表达载体；重组表达工程菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。
所述步骤二的具体方法，包括以下步骤：
1)将得到的核苷酸序列与pET-30a原核表达载体分别进行双酶切，双酶切产物经纯化回收后与T4DNA连接酶进行连接，得到重组表达载体连接产物；
2)将重组表达载体连接产物与大肠杆菌感受态细胞(E.coli DH5α)混匀，放置在冰浴中30min，42℃水浴下90s，取出后再次冰浴5min；接着将其加入到LB(Luria-Bertani培养基)液体培养基，并在37℃，150rpm条件下，振荡培养1h；取菌液于含50mg/L卡那霉素的LB固体培养基，涂布均匀，在37℃过夜培养，获得克隆菌落；
3)挑取单克隆菌落接种于含卡那霉素的LB培养液中，并在37℃、250rpm条件振荡过夜，取菌液进行菌落PCR初步鉴定，将阳性菌液抽提质粒(pET-30a-bnmtl)、进一步酶切(EcoRI/HindIII)鉴定正确后送样测序，获得测序正确的重组工程菌株。
所述步骤三的具体方法，包括以下步骤：
1)将获得重组表达工程菌株单菌落接种于5ml含有浓度为50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃过夜培养；将过夜培养的菌液接种于200ml新鲜的含有50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm培养至OD 600达0.4-0.6后加入终浓度为1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导培养6h；诱导后的菌液经4℃，10000×g离心10min收集菌体；在预称重的离心管中用50mL的磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤沉淀，去除上清后称重，每克菌体湿重加入5mL的PBS缓冲液；冰浴超声波裂解菌体：300W，作用4s，间歇6s，重复100次为一个循环，共两个循环。于4℃，12000×g，离心10min，收集上清液；
2)将收集的上清液进行超声波破碎裂解后，用0.22um低吸附滤膜除去杂质，根据Bio-rad Ni+亲和层析系统说明书，配制相关缓冲液，过柱纯化目的蛋白，并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)与免疫印迹试验(western blot)检测，获得纯化的重组苎麻金属硫蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
所述重组苎麻金属硫蛋白在治理镉污染领域中的应用。
本发明的有益效果：
苎麻在矿区土壤中镉浓度高达789mg/kg时仍能良好生长，部分品种(系)镉富集系数和转运系数大于1，具有较强的重金属富集能力，本发明利用苎麻对重金属的富集能力，通过基因克隆技术得到了一种苎麻金属硫蛋白基因，然后通过对苎麻金属硫蛋白基因的原核表达与蛋白纯化得到了重组苎麻金属硫蛋白；重组苎麻金属硫蛋白氨基酸序列如表中SEQ ID NO.2所示，该蛋白分子量为4.4kD，等电点为5.34，含12个半胱氨酸，半胱氨酸含量达到了26％；与现有技术相比，本发明得到的重组苎麻金属硫蛋白具有分子量小，半胱氨酸含量高，与重金属结合力强的优势，在制备重金属螯合解毒剂、化工、医药、重金属污染耕地及农业面源污染治理等领域有广阔的应用前景。
附图说明
图1为实施例1中苎麻根系样品总RNA的提取图。
图2为实施例1苎麻金属硫蛋白基因bnmtl扩增电泳图；
图中：M是标准核酸分子量Marker DL2000；泳道1是大约141bp大小的基因片段。
图3为实施例1重组苎麻金属硫蛋白的表达与纯化图；
图中：M是标准蛋白质分子量marker；泳道1是经1mM IPTG诱导后的pET-30a-bnmtl/BL21重组菌株样品；泳道ck是经1mM IPTG诱导后的pET-30a/BL21对照菌株样品；泳道2是纯化的重组苎麻金属硫蛋白；泳道3是重组苎麻金属硫蛋白western blot验证。
图4为实施例2中大肠杆菌工程菌株对重金属镉的耐受图；
图中：A为含有苎麻金属硫蛋白基因的大肠杆菌重组菌株pET-32a-bnmtl/BL21在不同浓度镉离子胁迫下的生长曲线图；B为对照菌株BL21在不同浓度镉离子胁迫下的生长曲线图。
图5为实施例3重组菌株对镉离子的富集效果图。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明的具体实施方式作进一步说明，但本发明并不限于下述的实施例。
实施例1
苎麻金属硫蛋白基因为序列表SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；重组苎麻金属硫蛋白为序列表SEQ ID NO.2所示氨基酸序列。
一、合成序列表SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列
(1)苎麻根系样品总RNA的提取
苎麻根系样品总RNA的提取按照Promega公司RNA抽提试剂盒E.Z.N.A○RTotal RNAKit II(50)的说明书进行并略做修改。对于所用到的塑料器皿均用DEPC(焦碳酸二乙酯)水处理；玻璃器皿在180℃烘烤6h；其他所有的试剂也均用DEPC处理水配制，121℃高温灭菌20min
①取苎麻根系样品约100mg，用DEPC处理水洗净后放入到液氮预冷的研钵中立即加入液氮研磨成粉末；
②在液氮未挥发完之前立即加入1mL的RNA-SolvR○Reagent提取液继续研磨匀浆，并将匀浆转入经DEPC水处理过的1.5mL离心管中，加入0.2mL的氯仿，剧烈摇动离心管15s，静置5min；
③在4℃条件下，12000×g离心15min，溶液分为三层，下层为酚-氯仿液相，中间为一层白色的膜状物，上层为水相。将上层的水相移入另一个经DEPC处理过的1.5mL离心管中，加入其1/3体积的无水乙醇快速漩涡混合15s；
④取步骤③中的上层水相的混合溶液700μL加入收集柱中，室温，12000×g离心30-60s，弃去流出液；
⑤加入700μL RNA Wash Buffer洗涤液，室温，12000×g离心1min，弃去流出液，并重复该洗涤步骤一次；
⑥取经DEPC水处理过的1.5mL离心管置于收集柱上，加30-50μL的70℃预热的DEPC水，室温孵育5min，室温≥13000×g离心2min，所得RNA溶液经检测后置于-70℃冰箱保存备用。总RNA变性琼脂糖胶电泳结果如图1所示，可见清晰的28S、18S和5.8S特征性带型，表明RNA完整性较好，未发生明显降解。
(2)反转录合成苎麻根系样品cDNA
根据TAKARA公司反转录试剂盒Reverse Transcritase M-MLV说明书进行cDNA的第一链的合成。对于所用的试剂均用DEPC处理水配制，所有实验操作都于超净工作台中进行。
首先，在DEPC水处理过的0.2mL离心管中加入：总1μL RNA(100μg/mL)，1μL Oligo(dT)12-18(50μM)，5μL RNase free ddH2O，混匀并短暂离心后，在70℃温浴5min后立即置于冰上10min以上，短暂离心数秒使混合好的溶液全部聚集于离心管底部，并加入2μL 5×M-MLV Buffer，0.5μL dNTP Mix(10Mm)，0.25μL RNase Inhibitor(40U/μL)，0.25μL RTaseM-MLV(RNase H-)(200U/μL)。混匀后，42℃温浴60min，短暂离心，置于70℃保温15min后冰上冷却，得到的cDNA溶液用于PCR扩增。
(3)PCR反应扩增苎麻金属硫蛋白基因
以上述cDNA为模板，根据苎麻根系样品转录组测序unigene序列设计引物，引物中分别引入EcoRI与HindIII酶切位点，用于扩增苎麻金属硫蛋白基因cDNA序列。
上游引物：5’GGAATTCATGGGTTGCCCTTGTGGAAAC 3’
下游引物：5’CAAGCTTTTGATTGCAAGAGCAGCTTGAG 3’
PCR反应体系：1ul cDNA模板，25ul 2×PrimerSTAR Max DNA Polymerase,2ul引物1,2ul引物2，补ddH2O至总反应体系为50ul。反应程序：①94℃，5min；②94℃，15s；③55℃，15s；④72℃，20s；⑤重复步骤②-④30个循环；⑥72℃，10min；
取5μLPCR扩增产物加6×上样缓冲液，进行琼脂糖凝胶电泳检测。琼脂糖凝胶电泳检测结果参见图2，在约140bp左右有一亮带，与预期大小的苎麻金属硫蛋白基因片断141bp长度相一致。PCR产物送至测序公司测序。
本实施方式中获得的苎麻金属硫蛋白基因cDNA全长141bp，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA，该序列无内含子，具有完整的开放阅读框，编码46个氨基酸；具体核苷酸序列如下：
ATG GGT TGC CCT TGT GGA AAC AAC TGT CAA TGT GGA AGC TCT TGT GCT TGTGGA GGA AAC TCC CAT ACT GCT ACT GAA CCT AGT GGA TGC AAT TGT GGA CCA AAT TGCTCA TGT GGC TCA AGC TGC TCT TGC AAT CAA TAA。
二、构建pET-30a-bnmtl的重组载体以及相对应的重组表达基因工程菌
将PCR扩增产物纯化回收后与pET-30a原核表达载体分别进行双酶切，双酶切产物纯化回收后采用T4DNA连接酶16℃过夜连接，得到重组表达载体连接产物。连接体系为：2ul苎麻金属硫蛋白基因双酶切回收产物，6ul pET-30a双酶切回收产物，1ul 10×T4DNA连接酶buffer，1ul T4DNA连接酶。
将构建好的重组表达载体连接产物与50μL大肠杆菌感受态细胞(E.coli DH5α)混匀，冰浴30min，然后42℃水浴90s，迅速取出后再次冰浴5min；然后再加入600μL LB液体培养基，37℃，150rpm振荡培养1h；取200ul菌液于LB固体培养基(含卡那霉素50mg/L)上均匀的涂布，37℃过夜培养，得到克隆菌落。
挑取单克隆菌落接种于2ml LB(含卡那霉素)培养液中37℃、250rpm振荡过夜，取1uL菌液进行菌落PCR初步鉴定，将阳性菌液抽提质粒(pET-30a-bnmtl)、进一步酶切(EcoRI/HindIII)鉴定正确后送样测序。测序正确的工程菌株进行诱导表达实验或加甘油至终浓度为10％，-70℃保存。
三、重组苎麻金属硫蛋白的原核表达与蛋白纯化
将提取的质粒pET-30a-bnmtl 5μL转化感受态细胞E.coli BL21，将含重组质粒的阳性克隆于37℃复壮培养。取上述复壮培养后的种子液按1:100比例接种于新鲜的LB(含卡那霉素50mg/L)培养液中，37℃振荡培养至OD600值为0.4-0.6，然后加IPTG至终浓度为1mM，37℃诱导6h后，取3mL菌液室温12000×g离心1min，收集菌体，弃去上清液；用200μL的1×PBS裂解液悬浮菌体，加50μL的5×SDS-PAGE上样Buffer重悬菌体沉淀，沸水加热5min，12000×g离心5min后取上清进行SDS-PAGE与western blot检测。
将检测后的pET30a-bnmtl/BL21重组工程菌株接种于10mL的LB(含卡那霉素50mg/L)液体培养基中，37℃，240rpm振荡过夜，按1:50比例接种于1000mL的LB(含卡那霉素100mg/L)液体培养基中，37℃培养至吸光值OD600为0.4-0.6，加入IPTG诱导重组蛋白的大量表达，诱导结束后10000×g离心10min收集菌体；在预称重的离心管中用50mL的PBS洗涤沉淀，去除上清后称重，每克菌体湿重加入5mL的PBS缓冲液；冰浴超声波裂解菌体：300W，作用4s，间歇6s，重复100次为一个循环，共两个循环；4℃，12000×g，离心10min，回收上清液，并用0.22um的吸附滤膜除去杂质，根据Bio-rad Ni+亲和层析系统说明书，配制相关缓冲液，过柱纯化目的蛋白，并进行SDS-PAGE检测。SDS-PAGE电泳及western检测结果参见附图3。M是标准蛋白质分子量marker；泳道1是经1mM IPTG诱导后的pET-30a-bnmtl/BL21重组菌株样品；泳道ck是经1mM IPTG诱导后的pET-30a/BL21对照菌株样品；泳道2是纯化的重组苎麻金属硫蛋白；泳道3是重组苎麻金属硫蛋白western blot验证。
获得的苎麻金属硫蛋白氨基酸序列包括46个氨基酸残基，分子量为4.4kD，等电点为5.34，含有12个半胱氨酸，半胱氨酸含量为26％，其具体序列为：
Met Gly Cys Pro Cys Gly Asn Asn Cys Gln Cys Gly Ser Ser Cys Ala CysGly Gly Asn Ser His Thr Ala Thr Glu Pro Ser Gly Cys Asn Cys Gly Pro Asn CysSer Cys Gly Ser Ser Cys Ser Cys Asn Gln。
实施例2
一种苎麻金属硫蛋白重组转化工程菌对镉离子的耐性分析
将转入苎麻金属硫蛋白重组质粒的大肠杆菌工程菌株BL21按1:50比例接种到LB液体培养基中(含卡那霉素50mg/L)培养；当吸光值OD600约为0.2时，加入终浓度为1mM的IPTG诱导30分钟，然后再分别加入终浓度为50mg/L,100mg/L,200mg/L的氯化镉溶液，37℃，200rpm震荡培养，每隔一小时检测菌液OD600值。对照组为未转入苎麻金属硫蛋白基因的大肠杆菌对照菌株。实验结果如图4所示，A为未转入苎麻金属硫蛋白基因的大肠杆菌对照菌株(pET-30a/BL21)，B为转入苎麻金属硫蛋白基因的重组菌株(pET-30a-bnmtl/BL21)。转入苎麻金属硫蛋白基因的大肠杆菌重组菌株在含镉离子的培养基中生长速率明显高于对照，能耐受高浓度的镉离子胁迫(200mg/L)。
实施例3
一种苎麻金属硫蛋白重组转化工程菌对镉离子的富集效果
将转入苎麻金属硫蛋白重组质粒的大肠杆菌工程菌株BL21按1:50比例接种到LB液体培养基中(含卡那霉素50mg/L)培养；当OD600值为0.2时，加入终浓度为1mM的IPTG诱导30分钟，然后再加入终浓度为100mg/L的氯化镉溶液，37℃，200rpm震荡培养6小时后收集菌体；取0.1g菌体加入到陶瓷坩埚中，于马弗炉中500℃加热8小时，冷区至室温后再在陶瓷坩埚中加入5ml硝酸/氯酸混合液(HNO3:HClO4＝3:4)；再次加热(100℃)至没有碳残留物可见时加入10ml浓度为8.3％的盐溶液溶解残留物，采用火焰原子吸收光谱法测定溶解液中镉离子含量。对照组为转入pET-30a质粒大肠杆菌BL21菌株和未转入质粒载体的大肠杆菌BL21菌株。大肠杆菌菌体对重金属镉的富集效果如图5所示，转入苎麻金属硫蛋白基因的重组大肠杆菌菌株对镉的富集效果明显高于对照组。
本发明克隆获得的苎麻金属硫蛋白是一种新型小分子植物重金属螯合蛋白，由46个氨基酸残基组成，其中含12个半胱氨酸，对重金属离子镉有较强的结合能力。本发明提供的重组苎麻金属硫蛋白在医药、化工、重金属螯合解毒剂、镉污染耕地修复等领域具有广阔的应用前景。
SEQ ID NO.1
<110> 中国农业科学院麻类研究所
<120> 一种苎麻金属硫蛋白基因及其重组蛋白与应用
<130> 2010
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 141
<212> DNA
<213> 苎麻
<400> 1
atgggttgcc cttgtggaaa caactgtcaa tgtggaagct cttgtgcttg tggaggaaac 60
tcccatactg ctactgaacc tagtggatgc aattgtggac caaattgctc atgtggctca 120
agctgctctt gcaatcaata a 141
SEQ ID NO.2
<210> 2
<211> 46
<212> PRT
<213> 苎麻
<400> 2
Met Gly Cys Pro Cys Gly Asn Asn Cys Gln Cys Gly Ser Ser Cys Ala Cys Gly Gly
1 5 10 15
Asn Ser His Thr Ala Thr Glu Pro Ser Gly Cys Asn Cys Gly Pro Asn Cys Ser Cys Gly
20 25 30 35
Ser Ser Cys Ser Cys Asn Gln
40 45

Claims (8)

1.一种苎麻金属硫蛋白基因，其特征在于，苎麻金属硫蛋白基因为序列表SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
2.一种重组苎麻金属硫蛋白，其特征在于，所述的苎麻金属硫蛋白为序列表SEQ IDNO.2所示氨基酸序列。
3.一种根据权利要求2所述的重组苎麻金属硫蛋白的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、合成序列表SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
步骤二、根据步骤一的核苷酸序列，构建pET-30a-bnmtl重组载体以及相对应的重组表达基因工程菌；
步骤三、将步骤二获得的重组基因工程菌进行原核表达，并对获得的蛋白进行纯化，得到氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示苎麻金属硫蛋白。
4.根据权利要求3所述的一种重组苎麻金属硫蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤一的具体方法，包括以下步骤：
1)从苎麻根系样品中提取总RNA，并用反转录酶合成cDNA第一链；
2)以cDNA为模板，利用上游引物1和下游引物2进行PCR扩增；
上游引物1：5’GGAATTCATGGGTTGCCCTTGTGGAAAC 3’
下游引物2：5’CAAGCTTTTGATTGCAAGAGCAGCTTGAG3’
PCR的反应体系为：1ul cDNA模板，25ul 2×PrimerSTAR Max DNA Polymerase，2ul上游引物1，2ul下游引物2，补ddH2O至总反应体系为50ul；PCR的反应条件为：①94℃，5min；②94℃，15s；③55℃，15s；④72℃，20s；⑤重复步骤②-④30个循环；⑥72℃，10min；
3)PCR产物经纯化回收后测序，得到如序列表SEQ ID NO.1所示核苷酸序列。
5.根据权利要求3所述的一种重组苎麻金属硫蛋白的制备方法，其特征在于，步骤二中，重组表达载体的载体骨架为pET-30a原核表达载体；重组表达工程菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。
6.根据权利要求3所述的一种重组苎麻金属硫蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤三的具体方法，包括以下步骤：
1)将获得重组表达工程菌株单菌落接种于5ml含50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃过夜培养；将过夜培养的菌液接种于200ml新鲜的含50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm培养至OD 600达0.4-0.6后加入终浓度为1mM的IPTG诱导培养6h；诱导后的菌液经4℃，10000×g离心10min收集菌体；在预称重的离心管中用50mL的PBS洗涤沉淀，去除上清后称重，每克菌体湿重加入5mL的PBS缓冲液；冰浴超声波裂解菌体：300W，作用4s，间歇6s，重复100次为一个循环，共两个循环；于4℃，12000×g，离心10min，收集上清液；
2)将收集的上清液进行超声波破碎裂解后，用0.22um低吸附滤膜除去杂质，根据Bio-rad Ni+亲和层析系统说明书，配制相关缓冲液，过柱纯化目的蛋白，并进行SDS-PAGE与western blot检测，获得纯化的重组苎麻金属硫蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
7.根据权利要求3-5中的任意一项所述的一种重组苎麻金属硫蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤二的具体方法，包括以下步骤：
1)将得到的核苷酸序列与pET-30a原核表达载体分别进行双酶切，双酶切产物经纯化回收后与T4 DNA连接酶进行连接，得到重组表达载体连接产物；
2)将重组表达载体连接产物与大肠杆菌感受态细胞-E.coli DH5α混匀，放置在冰浴中30min，42℃水浴下90s，取出后再次冰浴5min；接着将其加入到LB液体培养基，并在37℃，150rpm条件下，振荡培养1h；取菌液于含50mg/L卡那霉素的LB固体培养基，涂布均匀，在37℃过夜培养，获得克隆菌落；
3)挑取单克隆菌落接种于含卡那霉素的LB培养液中，并在37℃、250rpm条件振荡过夜，取菌液进行菌落PCR初步鉴定，将阳性菌液抽提质粒-pET-30a-bnmtl、进一步酶切EcoRI/HindIII鉴定正确后送样测序，获得测序正确的重组工程菌株。
8.一种根据权利要求3所述的重组苎麻金属硫蛋白的制备方法制备得到的重组苎麻金属硫蛋白在治理镉污染领域中的应用。
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