CN110872592B

CN110872592B - 烟草酰基糖酰基转移酶基因NtASAT2及其编码蛋白及其应用

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Publication number: CN110872592B
Application number: CN201911217249.7A
Authority: CN
Inventors: 常爱霞; 王元英; 杨爱国; 陈铭; 李洋洋; 陈彪; 张玉; 罗成刚; 任民; 冯全福
Original assignee: Tobacco Research Institute of CAAS
Current assignee: Tobacco Research Institute of CAAS
Priority date: 2019-12-03
Filing date: 2019-12-03
Publication date: 2024-02-09
Anticipated expiration: 2039-12-03
Also published as: CN110872592A

Abstract

本发明公开了烟草酰基糖酰基转移酶基因NtASAT2及其编码蛋白及其在蔗糖酯生物合成中的应用，其编码的蛋白可以在较安全的醋酸铵缓冲液中调控蔗糖二酯的合成，整个蔗糖酯生物催化反应均在醋酸铵缓冲液中进行，除了蔗糖，酰基‑COA以及催化的NtASAT1～NtASAT2蛋白外，没有其他物质加入。整个催化反应体系与以往大多数蔗糖酯合成方法中底物或溶剂需用有毒试剂相比，安全性高，反应底物简单，体系产物相对单一，所有产物均为蔗糖酯，易于后续分离及利用。因此，NtASAT2基因及其蛋白在蔗糖酯生物合成中具有较好的应用价值和前景。

Description

烟草酰基糖酰基转移酶基因NtASAT2及其编码蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及烟草酰基糖酰基转移酶基因及其编码蛋白及其在蔗糖酯生物合成中的应用。

背景技术

蔗糖酯是一类重要的生物表面活性剂，由于其分子结构中含有强亲水性的蔗糖基团和亲油性的脂肪酸基团，所以它具有很强的表面活性，对油和水有良好的乳化作用。由于蔗糖酯的亲水亲油平衡值(HLB)不随温度而变化，其H LB值范围比较宽，既能作W/O型乳化剂，又可以作O/W型乳化剂。蔗糖酯具有良好的乳化、分散、增溶、渗透、起泡、粘度调节、防止老化、抗菌等性能，同时它无毒，尤其对人体安全、无刺激性、可降解，不会造成环境污染，因而其被广泛应用于食品、医药、化工、化妆品、石油开采、水果保鲜、纺织品及农业等行业。蔗糖酯是联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)推荐使用的食品添加剂和药用原料，我国也于20世纪80年代批准使用。

关于蔗糖酯的合成方法，主要包括酰氯酯化法、直接脱水法、酯交换法以及微生物法等4种。酰氯酯化法因需毒性较大的含氮有机化合物作溶剂,使该法生产的产品很难达到食品、化妆品和药品用标准的要求,因此目前较多的用于蔗糖酯杀虫剂的生产。直接脱水法是在强酸(对甲苯磺酸)为催化剂,极性非质子有机溶剂DMF作为溶剂的条件下进行,该法过程简单,易于操作,但DMF毒性大,产品难于纯化,且酸性条件下蔗糖容易分解,导致产率低。酯交换法包括溶剂法和无溶剂法，其中溶剂法由于溶剂有毒,易在成品中残留,精制成食品级设备投资大,生产成本高,所以到目前为止溶剂法在工业上基本已被淘汰。无溶剂法由于需要在很高的温度下使反应物达到熔融的状态，易产生焦化，使产品质量难以得到保证。微生物法也称酶催化法,随着生物工程技术的发展,人们发现某些微生物可催化合成蔗糖酯，酶催化法也主要包括有溶剂和无溶剂两种。与传统的化学方法相比,酶催化法具有催化活性高,反应温和,选择性强等优点。酶法合成的蔗糖酯不仅具有乳化润湿和增容等表面活性而且具有抗肿瘤的性能。但是有溶剂酶催化法，仍然存在溶剂具有毒性的问题，在食品和化妆品等领域的应用受限。由于糖酯具有多种医疗、保健功能,深入研究开发有着广阔的市场前景和发展潜力。并且它在食品工业中的应用前景已为人们所认识。因此，无溶剂酶催化以及探寻新的酶催化方法，已经成为蔗糖酯合成的一个发展方向。

发明内容

本发明的目的是提出了一种烟草酰基糖酰基转移酶基因NtASAT2及其编码蛋白及其在蔗糖酯生物合成中的应用，其编码的蛋白可以在较安全的醋酸铵缓冲液中调控蔗糖二酯的合成。

本发明的技术方案是这样实现的：一种烟草酰基糖酰基转移酶基因NtASAT2，所述烟草酰基糖酰基转移酶基因NtASAT2的核苷酸序列如SEQ ID NO:7。

进一步，基因NtASAT2编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:8。

进一步，烟草酰基糖酰基转移酶基因NtASAT2的克隆前引物的序列如SEQ ID NO:9，该基因的克隆后引物序列如SEQ ID NO:10。

进一步，载有基因NtASAT2的单克隆重组质粒的制备方法如下：以普通烟草(N.tabacum)腺毛cDNA为模板，利用基因NtASAT2的克隆引物进行PCR扩增，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收基因的目的条带，将基因片段连接到克隆载体，加连接产物于大肠杆菌感受态中，冰浴，冰浴完成后，放入水浴锅中热激，然后再次冰浴后，加入液体培养基摇床孵育，离心后去除部分上清液，剩余菌液涂布固体培养基，培养箱中培养，挑选白色单克隆菌，利用载体引物扩增验证，验证阳性的克隆送去测序，获得测序正确、载有基因NtASAT2的单克隆重组质粒载体。

进一步，基因NtASAT2表达载体构建所用引物P-NtASAT2_F以及P-NtASAT2_R，其中P-NtASAT2_F的序列为SEQ ID NO:11；P-NtASAT2_R的序列为SEQ ID NO:12。

进一步，基因NtASAT2表达载体构建方法如下：获得的NtASAT2的阳性单克隆质粒载体为模板，以P-NtASAT2_F与P-NtASAT2_R为引物进行扩增，回收的目的基因片段，将目的基因片段与同源重组酶混合，将连接产物转化感受态，培养，菌落PCR鉴定，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，分别挑选1-3个阳性克隆进行测序，测序正确的单菌落菌株过夜培养，离心收集菌体，提取质粒。

进一步，基因NtASAT2的蛋白表达方法如下：将质粒转化大肠杆菌感受态，菌种活化、小体系诱导表达及条件筛选，根据小体系表达情况，选择最佳诱导表达条件，大体系放大表达及蛋白纯化。

进一步，烟草酰基糖酰基转移酶基因NtASAT2编码的蛋白调控蔗糖酯合成中的应用。

进一步，NtASAT2蛋白以NtASAT1基因编码的NtASAT1蛋白催化产生的蔗糖单酯为受体底物，以酰基-COA为酰基链供体底物，催化产生蔗糖二酯。

进一步，烟草酰基糖酰基转移酶基因NtASAT2编码的蛋白调控蔗糖酯合成的方法，在醋酸铵缓冲液中，加入NtASAT1基因编码的NtASAT1蛋白，加入异戊酰-COA，加入蔗糖，温育反应后，加热，然后冰浴降温后，加入NtASAT2蛋白，再加入异戊酰-COA，温育，之后加入乙腈、异丙醇和甲酸混合液终止反应，离心，上清液过有机滤膜，得到蔗糖二酯。

进一步，所述NtASAT1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1，NtASAT1蛋白的序列为SEQ ID NO:2，NtASAT1基因的克隆前引物的序列如SEQ ID NO:3，NtASAT1基因的克隆后引物序列如SEQ ID NO:4，NtASAT1基因表达载体构建所用引物P-NtASAT1_F以及P-NtASAT1_R，其中P-NtASAT1_F的序列为SEQ ID NO:5；P-NtASAT1_RF的序列为SEQ ID NO:6。

本发明的有益效果为：本发明烟草酰基糖酰基转移酶基因NtASAT2及其编码蛋白及其在蔗糖酯生物合成中的应用，其编码的蛋白可以在较安全的醋酸铵缓冲液中调控蔗糖二酯的合成，整个蔗糖酯生物催化反应均在醋酸铵缓冲液中进行，除了蔗糖，酰基-COA以及催化的NtASAT1～NtASAT2蛋白外，没有其他物质加入。整个催化反应体系与以往大多数蔗糖酯合成方法中底物或溶剂需用有毒试剂相比，安全性高，反应底物简单，体系产物相对单一，所有产物均为蔗糖酯，易于后续分离及利用。因此，NtASAT2基因及其蛋白在蔗糖酯生物合成中具有较好的应用价值和前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明NtASAT1～NtASAT2基因片段.Marker为DL5000；

图2为NtASAT1～NtASAT2的亚克隆片段，其中1对应NtASAT1基因,2对应NtASAT2基因，Marker为DL10000；

图3为图1所示NtASAT1重组表达载体鉴定(2号为正确的阳性单克隆)，Marker为DL10000；

图4为NtASAT2重组表达载体鉴定(2和4号为正确的阳性单克隆)，Marker为DL10000；

图5为NtASAT1蛋白表达条件筛选；

图6为NtASAT2蛋白表达条件筛选；

图7为NtASAT1蛋白淋洗和洗脱过程中收集样品检测结果；

图8为NtASAT2蛋白淋洗和洗脱过程中收集样品检测结果；

图9为NtASAT1的蛋白纯化结果；

图10为NtASAT2的蛋白纯化结果；

图11为NtASAT1催化蔗糖和不同酰基-COA生成蔗糖单酯。A中保留时间0.46为蔗糖乙酰单酯(S1:2)；B中0.80和0.92为蔗糖异丁酰单酯(S1:4)的两个异构体；C中保留时间1.44和1.71为蔗糖异戊酰单酯(S1:5)的两个异构体。

图12为NtASAT1和NtASAT2蛋白连续催化产生S2:10结果。图中保留时间3.64、4.55、4.69和4.81为S2:10的四个异构体。

具体实施方式

为更好地理解本发明，下面通过以下实施例对本发明作进一步具体的阐述，但不可理解为对本发明的限定，对于本领域的技术人员根据上述发明内容所作的一些非本质的改进与调整，也视为落在本发明的保护范围内。

实施例1

NtASAT1克隆前引物F：ATGGCTGCCTCAGCTCTAGTT

NtASAT1克隆后引物R：TCAACATCGAGCTTCCATTTTAAT

NtASAT2克隆前引物F：ATGGCTATTTCAAGGCTTGT

NtASAT2克隆后引物R：CTAGAGTCCTGAGCTTGGAG

1.2基因克隆方法步骤

1.2.1以烤烟红大腺毛cDNA为模板，分别利用两个基因的克隆引物(序列如上)进行PCR扩增。

PCR反应体系25μL，包括cDNA模板0.5μL，正向和反向引物各1μL，2×PrimerstarMAX 12.5μL，ddH2O 10μL。

设置PCR程序：98℃,2min；98℃,10sec,55℃,15sec,72℃，30sec，35个循环；72℃，8min,4℃保存。PCR完成后，经1％琼脂糖凝胶电泳分别检测两个基因片段，如图1所示。

1.2.2利用琼脂糖凝胶回收试剂盒分别回收两个基因的目的条带，检测浓度后将基因片段连接到克隆载体pEASY-Blunt Simple Cloning Vector中。载体连接反应体系为5μL，其中包括PCR产物2μL，pEASY-Blunt Simple Cloning Vector 1μL，ddH2O 2μL，反应体系加好后在金属浴中25℃连接15min。

(1)加连接产物于30μL的刚刚解冻的Trans-T1大肠杆菌感受态中，然后利用枪头轻轻吸打混匀，冰浴30min。

(2)冰浴完成后，放入42℃水浴锅中热激30sec，然后立即冰浴2min。

(3)加入600μL无抗生素的LB液体培养基，放到37℃摇床上，220转，孵育1h。

(4)5000转离心1min，倒掉部分上清液，剩余约200微升利用移液枪吸打混匀，利用涂布棒将菌液平铺于LB(含有50mg/L kan)的固体平板上，倒置于37℃培养箱过夜培养。

(5)挑选白色单克隆菌，利用载体引物扩增验证。将验证阳性的克隆送去测序，获得测序正确、分别载有两个基因的单克隆重组质粒载体保存。

1.3NtASAT1～NtASAT2基因的序列

NtASAT1基因序列：

ATGGCTGCCTCAGCTCTAGTTTCTTTATCCAAGAAAATCATCAAACCATTCTCTCCAACCCCTTTTTCTGAAAGAATTTACAAGCTTTCCTTCATTGATCAATTCAATAGTACACAATATTGCCCCTTAGTCTTCTTCTATCCCAAGAATAAGGGCAATGTAGTAACACCCTCAATTGAACCAAGTGATATGTGTAAGGTTATTGAGAATTCCCTTTCAAAAACCTTAGCTGCTTATTATCCTTTTGCTGGAACATTAAGAGACAATGTTCATGTCGAATGCAACGATATAGGTGCTGATTTTTATAAGGCTCGATTCGATTGTCCCATGTCTGAAATTGTTAAAAGTCCTGATAGAAATGTCAAAGAAATGGTATATCCTAAGGGTATACCATGGAATATTGTTACATCTAATAGAAAGTTGGTCACGGTTCAATTTAACCAATTTGATTGTGGAGGAATAGCTCTAAGTACATGTGTGTCACATAAAATTGGAGATATGTGCACAATTTCTAAATTTTTACAAGACTGGGCTACAATTGCCCGTGATCCGAATTTAAAATTGTGTCCTCAATTTATTGGATCGTCAATCTTTCCACCTACTAATGAACCTGTGAATGAGCCACCTATTCAAAAATGTGTTACAAGAAGGCTAGTCTTTTCAAATCATACATTAAAATCACTCCTCTCTGAACCATCACAAGTGAAAAATCCAACTCGGGTAGAATTACTCACAGCACTTCTTTATAAATGTGGTATGAAAGCGAATTCGAGTTCATTGAAGCCATCCATTTTGTTCCAAACAGTGAATTTAAGATCTTTTATTCCTCTGCCAGATAATACTGCTGGAAATTTTAGTTCTTCCCTTTTTGTACCTACATATAATGAAGAAGAAATGATGTTATCAAGATTGGTTAGTCAGCTAAGAAAGGAAAAAGAACAACTTGTAGCTAACTACAAAAATTGTAAAGGGGGTCAAGATTTGGTTTCAACAACAATGAGACCATTTCAAGAAATAAGAAAGTTGTTTAAGGACATGGATTTTGATATGTATAGGTGTAGTAGTTTGGCTAATTATCCATTATATGATGTAGACTTTGGATGGGGTAAGCCTAATAAAATAAGTATTGCGGAAGGTGTATTTAGAAATGTTTTCCTGCTGTATGATAACAAGACAGGGGATGAAGTAGAAGCTTCTGTATGTTTGGATGAGGAAAGTACAATGTCTGCATTTTTGAGAGAGATGGAGCAGTTTCTTCAATTTGAAATTTCCTCTGAAGAAATTAAAATGGAAGCTCGATGTTGA

NtASAT2基因序列：

ATGGCTATTTCAAGGCTTGTTTTACTTTCCCAAAAGATAATTAAGCCCTCTTCTCCTACCCCATTTTCACATAGAATTCACAAGCTCTCTCTTATGGATCAAATGGGGACTCGCACCTATATGCCGATTTCTTTCTTCTACCCAAAACAAGACACTGCAATCTCTCTTGAACCGACTAAGGTCTCCCAAATTCTTGAGAAGTCGCTTTCCAAAGTTTTAACCGCATATTATCCATTTGCTGGACGTGTACGCGACAATTCCTTTGTCGAATGTAATGACATGGGAGTCGATCTCTCTCAAGTCCGAATTGATTGTCCAATGTCAAGTATTTTCAATCAACCTCGTACTGATATCGAAAAGTTAATATTTCCTAAAGATCCTTGGAGCACATCTACGGACAGTTTAATCGTAGCTCAACTTAATCATTTTGAATGTGGTGGCATAGTACTAAGTGCATGTATTTCCCACAACGTTGCTGATGGTTACAGTATGACTAATTTCCTAAGGAACTGGGCCCTTGTCGCGCGTGATTCAGAAGCAAAACCATCTCCCCTGTTTAATGGAGCATCAATTTTTCAACCGACCAACTATTCTGCACCACAAGTGGCTGATCCTAGTCGAAAACAAAATGCATCGAAAAGGTACCATTTCTCGGCCTCCAAGTTAAAAGCTCTCAAGGCCAGAAGCCAAATTCCTCCTACAACTGTGGAAGCTGTCACTGCATTCCTATGCAAATGCGCTAATACGCCAACTTTTAAGCCATCGTTATTGATCCAAGCAGTAAATCTACGAGGAACAAGTAATGATGCACTAGTTCCAGCAGGCTTGGTAGGAAATGCAATTCTTCCTTACGTTGTATCAGCAGCAAATGAGGAAGATCTGAATTTGCAAAGACTAATTGGTGAGCTTAGAGAAGGAAAAGAAAAGGTCCATAATATGCTCAAATATATTAAATCAGAAGAGTTACTATGTTCAAGGGTATCTGAACTAGCTACACAGATAAACGAGCAAACCTCGAACAATGATTTTTCTATATATAGGTTTTCTAGTTTAAGGAAATTCCCGTTTGATGACATAAATTTTGGATGGGGAAGGCCAACAAGAGTGGATATTGCTACTTTTCCAGTCAATATGTTTCTCTTTCTGGATAACCAAAATGGGGATGGAGTTGAAGTACTCGTAAACTTGGAAGAAGGAGAGATGTCTGTATTTGAAAGTAATGAAGAGCTTCTTCAGTTTGCTTCTCCAAGCTCAGGACTCTAG

2.NtASAT1～NtASAT2基因的表达载体构建

2.1NtASAT1～NtASAT2基因表达载体构建分别所用引物

P-NtASAT1_F：GAACAGATTGGTGGCCAAGGATCCATGGCTGCCTCAGCTCTAGTTTCTTTA

P-NtASAT1_R：TCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTCAACATCGAGCTTCCATTTTAATTTC

P-NtASAT2_F：GAACAGATTGGTGGCCAAGGATCCATGGCTATTTCAAGGCTTGTTTTAC

P-NtASAT2_R：TCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTCAGAGTCCTGAGCTTGGAGAAGCAAAC

2.2NtASAT1～NtASAT2基因表达载体构建过程

2.2.1分别以上面1.2.3获得的NtASAT1～NtASAT2的阳性单克隆质粒载体为模板，利用2.1列出的两个基因的引物进行PCR扩增。PCR扩增进行两次，第一次10ul体系，包括质粒模板0.5μL，正向和反向引物(10uM)各0.4μL，2×Primerstar MAX 5μL，ddH2O 3.7μL。然后以10ul体系PCR扩增产物为模板再进行50ul体系PCR扩增，体系包括10ul体系PCR扩增产物0.5μL，正向和反向引物(10uM)各2μL，2×Primerstar MAX 25μL，ddH2O 20.5μL。设置PCR程序：95℃,20sec,58℃,20sec,72℃，70sec，30个循环；16℃保存。PCR完成后，经琼脂糖凝胶电泳检测目标片段。

2.2.2利用OMEGA bio-tek凝胶回收试剂盒分别进行两个基因目标片段的回收。将回收的目的基因片段，BamHI和XhoI酶切后线性化的pATX-sumo载体片段，同源重组酶混合。反应体系共10ul(其中目的基因片段2ul，载体1ul，同源重组酶2ul，ddH2O 5ul)在50℃，反应30min。

2.2.3将连接产物转化DH5α感受态，涂板，37℃培养过夜。具体步骤如下：

(1)将10μL连接产物加入50μL大肠杆菌DH5α感受态，轻轻混匀，冰浴30min；

(2)将转化的菌液置于42℃水浴锅，热激90s，迅速取出并置于冰上3-5min；

(3)随后加入800μL液体LB培养基，37℃，150rpm摇床复苏40-50min；

(4)3000rpm室温离心5min，留100μL上清液在管中，并重悬菌体；

(5)将菌体移至含有50mg/L Kan的LB固体平板上，用灭菌的涂布棒涂匀，待菌液吸干后倒置于37℃恒温箱中过夜培养。

2.2.4菌落PCR鉴定及测序：每个基因挑取4-8个单克隆，做菌落PCR鉴定。PCR反应体系为，模板1μL，正向和反向引物(10uM)各0.4μL，2×Fast Taq Mastermix 5μL，ddH2O3.2μL。设置PCR程序：95℃,5min；95℃,30sec；55℃,30sec；72℃，1min；30个循环；72℃，5min；16℃保存。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，每个基因分别挑选1-3个阳性克隆进行测序，测序正确的单菌落菌株过夜培养，如图3，如图4所示。

2.3取上面克隆菌株过夜培养的菌液4mL，12,000rpm离心1min后收集菌体，按照Endo-free plasmid Mini Kit I(50)质粒提取试剂盒说明书步骤提取质粒。

3.NtASAT1～NtASAT2基因的蛋白表达

3.1质粒转化大肠杆菌感受态

(1)取100μl冰浴上融化的感受态细胞(BL21(DE3)，C41两种菌株)加入上面提取好的质粒，轻轻混匀，在冰浴中放置30min。

(2)42℃水浴热激45s，然后快速将管转移到冰浴中2min，该过程不要摇动离心管。

(3)向离心管中加入500μl无菌的LB培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃，200rpm培养45min，使细胞复苏。

(4)吸取50ul体积已经转化的感受态细胞加到含卡那霉素抗生素(50ug/ml)的LB琼脂培养基上，将细胞均匀涂开。将平板置于37℃至液体被吸收，倒置平板，37℃过夜培养。

3.2菌种活化、小体系诱导表达及条件筛选。具体步骤如下：

(1)从平板上挑取含重组质粒的单菌落，接种于含卡那霉素抗生素(50ug/ml)5mLLB培养基中，37℃过夜培养。

(2)取200μL接种于含抗性的20mL LB培养基中，37℃培养至OD600＝0.6左右。

(3)吸取1mL未经诱导的菌液置于已灭菌的2mL离心管中作为未诱导对照。对NtASAT1和NtASAT2在剩余的菌液中加入IPTG至终浓度1mM，将加入IPTG后的菌液按下列不同条件进行培养：BL21(strain No.1)and C41(strain No.2)均于16℃过夜培养或37℃培养4h。

(4)收集不同表达条件的样品，12,000rpm离心1min离心收集菌体。用200ul的PBS悬浮菌体，超声破碎细胞，超声时间2s，间隔2s，总计4min。12000rpm，2min离心分离上清(native)和沉淀(denatured)，沉淀用8Murea+PBS溶解。分别取12ul样品跑SDS-PAGE(12％，80v浓缩胶，20min，120v分离胶，45min。)验证表达情况。两个菌株表达情况如图5、图6所示。

3.3大体系放大表达及蛋白纯化

根据小体系表达情况，选择最佳诱导表达条件：表达菌株C41，1mM IPTG，16℃过夜处理，培养200ml菌体，离心收集诱导表达后的菌体，加入10ml PBS缓冲液，超声处理，超声时间2s，间隔2s，总计30min。离心后收集上清，开始纯化蛋白。具体步骤如下

(1)准备层析柱：将树脂装入合适柱子，上垫片在树脂上方。

(2)洗树脂：根据树脂用量选择10倍树脂体积binding buffer清洗(Bindingbuffer:50mM Tris-HCl pH 8.0,150mM NaCl,10％Glycerol)。

(3)上样：将收集的上清样品过柱，此过程不能加速。如需加速必须控制速度1-2秒一滴。

(4)淋洗：必须让结合液通过重力自己往下滴，控制速度(1-2秒一滴)严禁滴成线。

W1：用结合缓冲液binding buffer(PH:7.5)淋洗10ml

W2：含有30mM咪唑的binding buffer(PH:7.5)淋洗5ml

W3：含有50mM咪唑的binding buffer(PH:7.5)淋洗5ml

(5)洗脱：禁止加速

含有200mM咪唑的binding buffer(PH:7.5)洗脱0.5ml×2管(E1-E2)

含有400mM咪唑的binding buffer(PH:7.5)洗脱0.5ml×7管(E3-E9)

每个淋洗的样品取样跑SDS-PAGE胶(IN：Input和FT：Flow through上样量为10ul，其他上样量为20ul)。检测结果如图7图8所示。

(6)除盐置换buffer：将纯化的样品置于透析袋，装入置换buffer(TBS)中4度透析过夜至基本除去咪唑。

(7)浓缩：将透析过的蛋白样品装入10kDa超滤管(Millipore)中，4000rpm低温离心30min。弃去滤出液，加入适量体积TBS继续离心浓缩蛋白。重复三次后浓缩蛋白至合适浓度。

(8)将截留的终蛋白样品分装，留样(2ug，上样2.5ul)跑SDS-PAGE检测，检测结果如图9，图10所示。

3.4NtASAT1～NtASAT2蛋白序列

(1)NtASAT1蛋白序列

MAASALVSLSKKIIKPFSPTPFSERIYKLSFIDQFNSTQYCPLVFFYPKNKGNVVTPSIEPSDMCKVIENSLSKTLAAYYPFAGTLRDNVHVECNDIGADFYKARFDCPMSEIVKSPDRNVKEMVYPKGIPWNIVTSNRKLVTVQFNQFDCGGIALSTCVSHKIGDMCTISKFLQDWATIARDPNLKLCPQFIGSSIFPPTNEPVNEPPIQKCVTRRLVFSNHTLKSLLSEPSQVKNPTRVELLTALLYKCGMKANSSSLKPSILFQTVNLRSFIPLPDNTAGNFSSSLFVPTYNEEEMMLSRLVSQLRKEKEQLVANYKNCKGGQDLVSTTMRPFQEIRKLFKDMDFDMYRCSSLANYPLYDVDFGWGKPNKISIAEGVFRNVFLLYDNKTGDEVEASVCLDEESTMSAFLREMEQFLQFEISSEEIKMEARC

(2)NtASAT2蛋白序列

MAISRLVLLSQKIIKPSSPTPFSHRIHKLSLMDQMGTRTYMPISFFYPKQDTAISLEPTKVSQILEKSLSKVLTAYYPFAGRVRDNSFVECNDMGVDLSQVRIDCPMSSIFNQPRTDIEKLIFPKDPWSTSTDSLIVAQLNHFECGGIVLSACISHNVADGYSMTNFLRNWALVARDSEAKPSPLFNGASIFQPTNYSAPQVADPSRKQNASKRYHFSASKLKALKARSQIPPTTVEAVTAFLCKCANTPTFKPSLLIQAVNLRGTSNDALVPAGLVGNAILPYVVSAANEEDLNLQRLIGELREGKEKVHNMLKYIKSEELLCSRVSELATQINEQTSNNDFSIYRFSSLRKFPFDDINFGWGRPTRVDIATFPVNMFLFLDNQNGDGVEVLVNLEEGEMSVFESNEELLQFASPSSGL

4.NtASAT1～NtASAT2蛋白调控蔗糖酯的合成

NtASAT1能够以蔗糖为受体底物，以酰基-COA为供体底物，在50mM PH6.0的醋酸铵缓冲液中调控蔗糖单酯的合成。NtASAT2能够以NtASAT1催化产生的蔗糖单酯为受体底物，以酰基-COA为酰基链供体底物，催化产生蔗糖二酯的产生。

4.1NtASAT1调控蔗糖单酯合成

在60ul 50mM的醋酸铵缓冲液(PH6.0)中,加入2ug纯化的NtASAT1蛋白，加入酰基-COA(本实验中分别用三种酰基辅酶A作为酰基供体链，包括乙酰-COA,异丁酰-COA和异戊酰-COA)使其终浓度为100μM，加入蔗糖使其终浓度为1mM，然后该反应体系在30℃温育反应30min(该反应时间在大体系时可以加长以获得更多产物)。然后，加入120ul体积比为1:1：0.001的乙腈、异丙醇和甲酸混合液终止反应，12000转离心10分钟，上清液过0.22μm有机滤膜后，利用LC-QTOF-HRMS进行产物检测。检测结果如图11。由图中可见，NtASAT1蛋白能够催化蔗糖和不同的酰基-COA，产生相应的蔗糖单酯(S1:2，S1:4和S1:5。注：Sn:m表示法中S表示蔗糖，n表示酰基链个数，m表示所有酰基链碳原子的总个数,下同)。同时，在异丁酰-COA和异戊酰-COA为底物时，蔗糖单酯有同分异构体的产生。我们扩大蔗糖和异戊酰-COA反应体系到60ml，反应时间加长到4个小时，分离提纯了蔗糖异戊酰单酯的主峰产物，进行了核磁(NMR)鉴定，发现异戊酰基连接在蔗糖吡喃环的R2位。

4.2NtASAT1和NtASAT2连续调控蔗糖二异戊酰酯的合成

在60ul 50mM的醋酸铵缓冲液(PH6.0)中,加入2ug纯化的NtASAT1蛋白，加入异戊酰-COA使其终浓度为100μM，加入蔗糖使其终浓度为1mM，然后该反应体系在30℃温育反应30min，之后65℃加热5分钟，然后冰浴降温。加2ug纯化的NtASAT2蛋白以及和第一步反应等量的异戊酰-COA，然后30℃温育反应30min，然后，加入120ul体积比为1:1：0.001的乙腈、异丙醇和甲酸混合液终止反应，12000转离心10分钟，上清液过0.22μm有机滤膜后，利用LC-QTOF-HRMS进行产物检测。检测结果如图12所示，结果发现，反应体系中检测到蔗糖二异戊酰酯产物(S2:10)的产生。(注：本研究在两步酶催反应中，均利用了乙酰-COA,异丁酰-COA和异戊酰-COA三个酰基供体进行了测试，发现就提供的三个酰基供体和第一步反应的蔗糖单酯受体看，NtASAT2只能利用S1:5为受体，以异戊酰-COA为供体合成S2:10，本实例中仅列出该反应。说明NtASAT2对底物有明显的选择性。)

从以上本研究实例中可以看出，整个蔗糖酯生物催化反应均在50mM PH6.0的醋酸铵缓冲液中进行，除了蔗糖，酰基-COA以及催化的NtASAT1～NtASAT2蛋白外，没有其他物质加入。整个催化反应体系与以往大多数蔗糖酯合成方法中底物或溶剂需用有毒试剂相比，安全性高，反应底物简单，体系产物相对单一，所有产物均为蔗糖酯，易于后续分离及利用。因此，NtASAT1～NtASAT2基因及其蛋白在蔗糖酯生物合成中具有较好的应用价值和前景。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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序列表

<110> 中国农业科学院烟草研究所

<120> 烟草酰基糖酰基转移酶基因NtASAT2及其编码蛋白及其应用

<130> 12

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1305

<212> DNA

<213> 烟草(Nicotiana acuminata)

<400> 1

atggctgcct cagctctagt ttctttatcc aagaaaatca tcaaaccatt ctctccaacc 60

cctttttctg aaagaattta caagctttcc ttcattgatc aattcaatag tacacaatat 120

tgccccttag tcttcttcta tcccaagaat aagggcaatg tagtaacacc ctcaattgaa 180

ccaagtgata tgtgtaaggt tattgagaat tccctttcaa aaaccttagc tgcttattat 240

ccttttgctg gaacattaag agacaatgtt catgtcgaat gcaacgatat aggtgctgat 300

ttttataagg ctcgattcga ttgtcccatg tctgaaattg ttaaaagtcc tgatagaaat 360

gtcaaagaaa tggtatatcc taagggtata ccatggaata ttgttacatc taatagaaag 420

ttggtcacgg ttcaatttaa ccaatttgat tgtggaggaa tagctctaag tacatgtgtg 480

tcacataaaa ttggagatat gtgcacaatt tctaaatttt tacaagactg ggctacaatt 540

gcccgtgatc cgaatttaaa attgtgtcct caatttattg gatcgtcaat ctttccacct 600

actaatgaac ctgtgaatga gccacctatt caaaaatgtg ttacaagaag gctagtcttt 660

tcaaatcata cattaaaatc actcctctct gaaccatcac aagtgaaaaa tccaactcgg 720

gtagaattac tcacagcact tctttataaa tgtggtatga aagcgaattc gagttcattg 780

aagccatcca ttttgttcca aacagtgaat ttaagatctt ttattcctct gccagataat 840

actgctggaa attttagttc ttcccttttt gtacctacat ataatgaaga agaaatgatg 900

ttatcaagat tggttagtca gctaagaaag gaaaaagaac aacttgtagc taactacaaa 960

aattgtaaag ggggtcaaga tttggtttca acaacaatga gaccatttca agaaataaga 1020

aagttgttta aggacatgga ttttgatatg tataggtgta gtagtttggc taattatcca 1080

ttatatgatg tagactttgg atggggtaag cctaataaaa taagtattgc ggaaggtgta 1140

tttagaaatg ttttcctgct gtatgataac aagacagggg atgaagtaga agcttctgta 1200

tgtttggatg aggaaagtac aatgtctgca tttttgagag agatggagca gtttcttcaa 1260

tttgaaattt cctctgaaga aattaaaatg gaagctcgat gttga 1305

<210> 2

<211> 434

<212> PRT

<213> 烟草(Nicotiana acuminata)

<400> 2

Met Ala Ala Ser Ala Leu Val Ser Leu Ser Lys Lys Ile Ile Lys Pro

1 5 10 15

Phe Ser Pro Thr Pro Phe Ser Glu Arg Ile Tyr Lys Leu Ser Phe Ile

20 25 30

Asp Gln Phe Asn Ser Thr Gln Tyr Cys Pro Leu Val Phe Phe Tyr Pro

35 40 45

Lys Asn Lys Gly Asn Val Val Thr Pro Ser Ile Glu Pro Ser Asp Met

50 55 60

Cys Lys Val Ile Glu Asn Ser Leu Ser Lys Thr Leu Ala Ala Tyr Tyr

65 70 75 80

Pro Phe Ala Gly Thr Leu Arg Asp Asn Val His Val Glu Cys Asn Asp

85 90 95

Ile Gly Ala Asp Phe Tyr Lys Ala Arg Phe Asp Cys Pro Met Ser Glu

100 105 110

Ile Val Lys Ser Pro Asp Arg Asn Val Lys Glu Met Val Tyr Pro Lys

115 120 125

Gly Ile Pro Trp Asn Ile Val Thr Ser Asn Arg Lys Leu Val Thr Val

130 135 140

Gln Phe Asn Gln Phe Asp Cys Gly Gly Ile Ala Leu Ser Thr Cys Val

145 150 155 160

Ser His Lys Ile Gly Asp Met Cys Thr Ile Ser Lys Phe Leu Gln Asp

165 170 175

Trp Ala Thr Ile Ala Arg Asp Pro Asn Leu Lys Leu Cys Pro Gln Phe

180 185 190

Ile Gly Ser Ser Ile Phe Pro Pro Thr Asn Glu Pro Val Asn Glu Pro

195 200 205

Pro Ile Gln Lys Cys Val Thr Arg Arg Leu Val Phe Ser Asn His Thr

210 215 220

Leu Lys Ser Leu Leu Ser Glu Pro Ser Gln Val Lys Asn Pro Thr Arg

225 230 235 240

Val Glu Leu Leu Thr Ala Leu Leu Tyr Lys Cys Gly Met Lys Ala Asn

245 250 255

Ser Ser Ser Leu Lys Pro Ser Ile Leu Phe Gln Thr Val Asn Leu Arg

260 265 270

Ser Phe Ile Pro Leu Pro Asp Asn Thr Ala Gly Asn Phe Ser Ser Ser

275 280 285

Leu Phe Val Pro Thr Tyr Asn Glu Glu Glu Met Met Leu Ser Arg Leu

290 295 300

Val Ser Gln Leu Arg Lys Glu Lys Glu Gln Leu Val Ala Asn Tyr Lys

305 310 315 320

Asn Cys Lys Gly Gly Gln Asp Leu Val Ser Thr Thr Met Arg Pro Phe

325 330 335

Gln Glu Ile Arg Lys Leu Phe Lys Asp Met Asp Phe Asp Met Tyr Arg

340 345 350

Cys Ser Ser Leu Ala Asn Tyr Pro Leu Tyr Asp Val Asp Phe Gly Trp

355 360 365

Gly Lys Pro Asn Lys Ile Ser Ile Ala Glu Gly Val Phe Arg Asn Val

370 375 380

Phe Leu Leu Tyr Asp Asn Lys Thr Gly Asp Glu Val Glu Ala Ser Val

385 390 395 400

Cys Leu Asp Glu Glu Ser Thr Met Ser Ala Phe Leu Arg Glu Met Glu

405 410 415

Gln Phe Leu Gln Phe Glu Ile Ser Ser Glu Glu Ile Lys Met Glu Ala

420 425 430

Arg Cys

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(ordo artificialis)

<400> 3

atggctgcct cagctctagt t 21

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(ordo artificialis)

<400> 4

tcaacatcga gcttccattt taat 24

<210> 5

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(ordo artificialis)

<400> 5

gaacagattg gtggccaagg atccatggct gcctcagctc tagtttcttt a 51

<210> 6

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(ordo artificialis)

<400> 6

tcagtggtgg tggtggtggt gctcgagtca acatcgagct tccattttaa tttc 54

<210> 7

<211> 1263

<212> DNA

<213> 烟草(Nicotiana acuminata)

<400> 7

atggctattt caaggcttgt tttactttcc caaaagataa ttaagccctc ttctcctacc 60

ccattttcac atagaattca caagctctct cttatggatc aaatggggac tcgcacctat 120

atgccgattt ctttcttcta cccaaaacaa gacactgcaa tctctcttga accgactaag 180

gtctcccaaa ttcttgagaa gtcgctttcc aaagttttaa ccgcatatta tccatttgct 240

ggacgtgtac gcgacaattc ctttgtcgaa tgtaatgaca tgggagtcga tctctctcaa 300

gtccgaattg attgtccaat gtcaagtatt ttcaatcaac ctcgtactga tatcgaaaag 360

ttaatatttc ctaaagatcc ttggagcaca tctacggaca gtttaatcgt agctcaactt 420

aatcattttg aatgtggtgg catagtacta agtgcatgta tttcccacaa cgttgctgat 480

ggttacagta tgactaattt cctaaggaac tgggcccttg tcgcgcgtga ttcagaagca 540

aaaccatctc ccctgtttaa tggagcatca atttttcaac cgaccaacta ttctgcacca 600

caagtggctg atcctagtcg aaaacaaaat gcatcgaaaa ggtaccattt ctcggcctcc 660

aagttaaaag ctctcaaggc cagaagccaa attcctccta caactgtgga agctgtcact 720

gcattcctat gcaaatgcgc taatacgcca acttttaagc catcgttatt gatccaagca 780

gtaaatctac gaggaacaag taatgatgca ctagttccag caggcttggt aggaaatgca 840

attcttcctt acgttgtatc agcagcaaat gaggaagatc tgaatttgca aagactaatt 900

ggtgagctta gagaaggaaa agaaaaggtc cataatatgc tcaaatatat taaatcagaa 960

gagttactat gttcaagggt atctgaacta gctacacaga taaacgagca aacctcgaac 1020

aatgattttt ctatatatag gttttctagt ttaaggaaat tcccgtttga tgacataaat 1080

tttggatggg gaaggccaac aagagtggat attgctactt ttccagtcaa tatgtttctc 1140

tttctggata accaaaatgg ggatggagtt gaagtactcg taaacttgga agaaggagag 1200

atgtctgtat ttgaaagtaa tgaagagctt cttcagtttg cttctccaag ctcaggactc 1260

tag 1263

<210> 8

<211> 420

<212> PRT

<213> 烟草(Nicotiana acuminata)

<400> 8

Met Ala Ile Ser Arg Leu Val Leu Leu Ser Gln Lys Ile Ile Lys Pro

1 5 10 15

Ser Ser Pro Thr Pro Phe Ser His Arg Ile His Lys Leu Ser Leu Met

20 25 30

Asp Gln Met Gly Thr Arg Thr Tyr Met Pro Ile Ser Phe Phe Tyr Pro

35 40 45

Lys Gln Asp Thr Ala Ile Ser Leu Glu Pro Thr Lys Val Ser Gln Ile

50 55 60

Leu Glu Lys Ser Leu Ser Lys Val Leu Thr Ala Tyr Tyr Pro Phe Ala

65 70 75 80

Gly Arg Val Arg Asp Asn Ser Phe Val Glu Cys Asn Asp Met Gly Val

85 90 95

Asp Leu Ser Gln Val Arg Ile Asp Cys Pro Met Ser Ser Ile Phe Asn

100 105 110

Gln Pro Arg Thr Asp Ile Glu Lys Leu Ile Phe Pro Lys Asp Pro Trp

115 120 125

Ser Thr Ser Thr Asp Ser Leu Ile Val Ala Gln Leu Asn His Phe Glu

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Cys Gly Gly Ile Val Leu Ser Ala Cys Ile Ser His Asn Val Ala Asp

145 150 155 160

Gly Tyr Ser Met Thr Asn Phe Leu Arg Asn Trp Ala Leu Val Ala Arg

165 170 175

Asp Ser Glu Ala Lys Pro Ser Pro Leu Phe Asn Gly Ala Ser Ile Phe

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Gln Pro Thr Asn Tyr Ser Ala Pro Gln Val Ala Asp Pro Ser Arg Lys

195 200 205

Gln Asn Ala Ser Lys Arg Tyr His Phe Ser Ala Ser Lys Leu Lys Ala

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Leu Lys Ala Arg Ser Gln Ile Pro Pro Thr Thr Val Glu Ala Val Thr

225 230 235 240

Ala Phe Leu Cys Lys Cys Ala Asn Thr Pro Thr Phe Lys Pro Ser Leu

245 250 255

Leu Ile Gln Ala Val Asn Leu Arg Gly Thr Ser Asn Asp Ala Leu Val

260 265 270

Pro Ala Gly Leu Val Gly Asn Ala Ile Leu Pro Tyr Val Val Ser Ala

275 280 285

Ala Asn Glu Glu Asp Leu Asn Leu Gln Arg Leu Ile Gly Glu Leu Arg

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Glu Gly Lys Glu Lys Val His Asn Met Leu Lys Tyr Ile Lys Ser Glu

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Glu Leu Leu Cys Ser Arg Val Ser Glu Leu Ala Thr Gln Ile Asn Glu

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Gln Thr Ser Asn Asn Asp Phe Ser Ile Tyr Arg Phe Ser Ser Leu Arg

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Lys Phe Pro Phe Asp Asp Ile Asn Phe Gly Trp Gly Arg Pro Thr Arg

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Val Asp Ile Ala Thr Phe Pro Val Asn Met Phe Leu Phe Leu Asp Asn

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Gln Asn Gly Asp Gly Val Glu Val Leu Val Asn Leu Glu Glu Gly Glu

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Met Ser Val Phe Glu Ser Asn Glu Glu Leu Leu Gln Phe Ala Ser Pro

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420

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(ordo artificialis)

<400> 9

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<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(ordo artificialis)

<400> 10

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<211> 49

<212> DNA

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<400> 11

gaacagattg gtggccaagg atccatggct atttcaaggc ttgttttac 49

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<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(ordo artificialis)

<400> 12

tcagtggtgg tggtggtggt gctcgagtca gagtcctgag cttggagaag caaac 55

Claims

1.一种烟草酰基糖酰基转移酶基因 NtASAT2 编码的蛋白调控蔗糖酯合成中的应用，所述蔗糖酯为蔗糖二异戊酰酯，其特征在于，NtASAT2蛋白以NtASAT1基因编码的NtASAT1蛋白催化产生的蔗糖单酯为受体底物，以异戊酰-COA为酰基链供体底物，催化产生蔗糖二异戊酰酯；

其中，NtASAT1蛋白催化产生蔗糖单酯指的是NtASAT1 蛋白以蔗糖为受体底物，以酰基-COA为供体底物，在醋酸铵缓冲液中调控蔗糖异戊酰单酯的合成，且所用酰基-COA为异戊酰-COA，对应在蔗糖吡喃环R2位连接异戊酰基链；

其中，所述NtASAT1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1，NtASAT1蛋白的序列为SEQ IDNO:2，NtASAT1基因的克隆前引物的序列如SEQ ID NO:3，NtASAT1基因的克隆后引物序列如SEQ ID NO:4，NtASAT1基因表达载体构建所用引物P- NtASAT1_F以及P- NtASAT1_R，其中P- NtASAT1_F的序列为SEQ ID NO:5；P- NtASAT1_R的序列为SEQ ID NO:6；所述烟草酰基糖酰基转移酶基因NtASAT2的核苷酸序列如SEQ ID NO:7；该蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO:8；该基因的克隆前引物的序列如SEQ ID NO:9，该基因的克隆后引物序列如SEQ ID NO:10。

2.如权利要求1所述的烟草酰基糖酰基转移酶基因 NtASAT2 编码的蛋白调控蔗糖酯合成中的应用，其特征在于，载有基因NtASAT2的单克隆重组质粒的制备方法如下：以普通烟草（N.tabacum）腺毛cDNA为模板，利用基因NtASAT2的克隆引物进行PCR扩增，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收基因的目的条带，将基因片段连接到克隆载体，加连接产物于大肠杆菌感受态中，冰浴，冰浴完成后，放入水浴锅中热激，然后再次冰浴后，加入液体培养基摇床孵育，离心后去除部分上清液，剩余菌液涂布固体培养基，培养箱中培养，挑选白色单克隆菌，利用载体引物扩增验证，验证阳性的克隆送去测序，获得测序正确、载有基因NtASAT2的单克隆重组质粒载体。

3.如权利要求2所述的烟草酰基糖酰基转移酶基因 NtASAT2 编码的蛋白调控蔗糖酯合成中的应用，其特征在于，基因NtASAT2表达载体构建所用引物P- NtASAT2_F以及P-NtASAT2_R，其中P- NtASAT2_F的序列为SEQ ID NO:11；P- NtASAT2_R的序列为SEQ ID NO:12。

4.如权利要求3所述的烟草酰基糖酰基转移酶基因 NtASAT2 编码的蛋白调控蔗糖酯合成中的应用，其特征在于，基因NtASAT2表达载体构建方法如下：获得的NtASAT2的阳性单克隆质粒载体为模板，以P- NtASAT2_F与P- NtASAT2_R为引物进行扩增，回收的目的基因片段，将目的基因片段与同源重组酶混合，将连接产物转化感受态，培养，菌落PCR鉴定，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，分别挑选1-3个阳性克隆进行测序，测序正确的单菌落菌株过夜培养，离心收集菌体，提取质粒。

5.如权利要求4所述的烟草酰基糖酰基转移酶基因 NtASAT2 编码的蛋白调控蔗糖酯合成中的应用，其特征在于，将质粒转化大肠杆菌感受态，菌种活化、小体系诱导表达及条件筛选，根据小体系表达情况，选择最佳诱导表达条件，大体系放大表达及蛋白纯化。