CN115058440B - 催化合成天然蔗糖酯的工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种催化合成天然蔗糖酯的工程菌及其构建方法和应用。本发明通过将蔗糖和支链脂肪酸转化合成蔗糖酯的过程中所用的酶的目标基因转化到大肠杆菌中，构建一种能够催化蔗糖和支链脂肪酸合成蔗糖酯的工程菌株。通过使用该工程菌株可实现蔗糖与短链支链脂肪酸所形成的蔗糖酯的依次酯化以及对蔗糖特定位点的选择性酯化，得到与天然蔗糖酯无差异的合成蔗糖酯类化合物。本发明使用构建的工程菌株催化合成蔗糖酯，不需要使用强碱等强腐蚀性试剂、有毒化学试剂以及大量的酶，使用方便，操作简单。

Description

催化合成天然蔗糖酯的工程菌及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种催化合成天然蔗糖酯的工程菌及其构建方法和应用。
背景技术
蔗糖酯是蔗糖的羟基与脂肪酸羧基进行酯化反应所得到的酯，包括蔗糖一酯、蔗糖二酯、蔗糖三酯等，蔗糖酯中的脂酰基团可由不同的酯酰基团组成，包括短链支链的酯酰基基团，如异戊酰基、异丁酰基以及2-甲基丁酰基以及中长链酯酰基基团，如癸酰基以及月桂酰基。蔗糖酯可作为非离子型表面活性剂使用，具有比其他表面活性剂更佳的表面活性，也不会造成环境污染和其他不良影响，因此被广泛应用于食品、医药以及化妆品行业中。目前获取蔗糖酯的方法主要包括化学合成法以及通过脂肪酶进行的酶催化法，化学合成法又具体包括溶剂法、相转移催化法、乳化法等。使用化学合成法合成蔗糖酯时，所使用的催化剂往往有毒，且常需要在高温、高压、强酸或强碱的环境下进行，条件严苛，过程复杂，制备成本较高，强酸或强碱还会对设备造成腐蚀性损坏；而利用脂肪酶进行酶催化合成蔗糖酯时，脂肪酶的较高成本和复杂的纯化过程也是必须要考虑的重要因素。如专利“专利号CN112941129A”公开一种利用无定形蔗糖酶催化合成蔗糖酯的方法，不仅需利用分子筛纯化酶，还使用了有毒的叔戊醇或叔丁醇，且反应过程也不够简便。此外，由于蔗糖具有8个游离的自由羟基，化学法以及酶催化法都无法保证脂肪酸与特定的羟基进行酯化反应，难以对底物蔗糖不同羟基位点进行立体选择，获得的蔗糖酯与自然界植物体内的天然蔗糖酯存在一定的差异。因此，开发一种利用微生物发酵催化制备、同时可控制蔗糖和脂肪酸定点酯化、过程简便、成本较低且绿色安全的天然蔗糖酯合成方法是目前亟待解决的问题。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提出一种催化合成天然蔗糖酯的工程菌及其构建方法和应用。
本发明的技术方案是这样实现的：
催化合成天然蔗糖酯的工程菌的构建方法，包括以下步骤：
（1）构建包含基因HlCCL2和基因HlCCL4的重组质粒pESE02；
（2）构建包含基因SlASAT1、基因SlASAT2和基因SlASAT3的重组质粒pESE10；
（3）构建包含基因optSlASAT1、基因optSlASAT2和基因optSlASAT3的重组质粒pESE15；
（4）分别制备包含步骤（1）的重组质粒pESE02和步骤（2）的重组质粒pESE10的工程菌株EcoSE07以及包含步骤（1）的重组质粒pESE02、步骤（3）的重组质粒pESE15和分子伴侣质粒的工程菌株EcoSE16。
进一步，所述步骤（1）中基因HlCCL2的碱基序列如SEQ ID NO.4所示，基因HlCCL4的碱基序列如SEQ ID NO.5所示。
进一步，所述步骤（2）中基因SlASAT1的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，基因SlASAT2的碱基序列如SEQ ID NO.2所示，基因SlASAT3的碱基序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步，所述步骤（3）中基因optSlASAT1的碱基序列如SEQ ID NO.6所示，基因optSlASAT2的碱基序列如SEQ ID NO.7所示，基因optSlASAT3的碱基序列如SEQ ID NO.8所示。
进一步，所述分子伴侣质粒为分子伴侣质粒pKJE7。
上述的方法构建的工程菌，所述工程菌为工程菌株EcoSE07或工程菌株EcoSE16。
上述的工程菌在催化合成天然蔗糖酯中的应用。
所述天然蔗糖酯包括蔗糖一酯、蔗糖二酯和蔗糖三酯。
其步骤为：
a、将在LB固体培养基（含有34 μg/mL氯霉素、50 μg/mL卡那霉素和50 μg/mL壮观霉素）上培养起来的工程菌株EcoSE07或工程菌株EcoSE16单菌落接种于5mL LB液体培养基（含有34 μg/mL氯霉素、50 μg/mL卡那霉素和50 μg/mL壮观霉素）中，于37℃过夜培养12h；
b、将培养后得到的工程菌株EcoSE07或工程菌株EcoSE16接种到LB液体培养基中（含有34 μg/mL氯霉素、50 μg/mL卡那霉素和50 μg/mL壮观霉素），起始OD值为0.01，待菌株OD值达到0.6时，加入0.1mM IPTG，经16℃低温诱导12h，然后4000rpm离心收集菌体；
c、向LB液体培养基（含有34 μg/mL氯霉素、50 μg/mL卡那霉素和50 μg/mL壮观霉素）中加入10mM短支链脂肪酸异戊酸、10mM异丁酸、10mM 2-甲基丁酸和15g/L蔗糖，再加入步骤b收集的菌体，然后进行转化，24h后即可收集天然蔗糖酯。
优选的，所述步骤c中进行转化时菌体的OD值为5。
上述步骤中提及的浓度均为终浓度。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明通过将蔗糖和支链脂肪酸转化合成蔗糖酯的过程中所用的酶如酰基辅酶A连接酶及酰基蔗糖酰基转移酶的目标基因转化到大肠杆菌中，构建一种能够催化蔗糖和支链脂肪酸合成蔗糖酯的工程菌株。蔗糖酯包括蔗糖一酯、蔗糖二酯以及蔗糖三酯，其中蔗糖酯中的脂酰基团为短链支链的酯酰基基团，如异戊酰基、异丁酰基以及2-甲基丁酰基。
2、通过使用本申请工程菌株可实现蔗糖与短链支链脂肪酸酯的依次酯化，具体为蔗糖的葡萄糖吡喃环4号位羟基、葡萄糖吡喃环3号位羟基以及果糖呋喃环3’位羟基位点的依次酯化，同时也实现了对特定位点的选择性酯化，得到与天然蔗糖酯无差异的合成蔗糖酯类化合物。通过这种方法可以避免有毒催化剂的使用、避免特殊设备的使用以及不需要进行酶的纯化，从一定程度上简化催化过程及节约成本。
3、本发明使用构建的工程菌株催化合成蔗糖酯，不需要使用强碱等强腐蚀性试剂、有毒化学试剂以及大量的酶，使用方便，操作简单，并通过对工程菌株的进一步优化，使产品蔗糖酯的品质更佳、产量更高，具有较好的应用和推广价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为质粒pESE02的图谱。
图2为质粒pESE10的图谱。
图3为EcoSE07号菌株转化蔗糖及异戊酸、异丁酸及2-甲基丁酸后，LC-MS鉴定及分析，其中a为EcoSE07中经LC-MS鉴定出的蔗糖单酯、蔗糖二酯及蔗糖三酯化合物；b为不同蔗糖酯类化合物与加入内标化合物的体积比；c为EcoSE07中分别检测到的蔗糖酯化合物的LC-MS鉴定后质谱碎片。S代表蔗糖骨架，“1:5”表示蔗糖上面只连有一个脂肪酸链，且为5个碳的脂肪酸链，iC5表示异戊酰基基团，aiC5表示2-甲基丁酰基基团，iC4表示异丁酰基基团。
图4为质粒pESE15的图谱。
图5为EcoSE16号工程菌株转化蔗糖及支链脂肪酸LC-MS鉴定及定量结果，其中a为EcoSE16中检测到的蔗糖二酯及蔗糖三酯的质谱碎片图。b为EcoSE16中的蔗糖酯化合物与内标化合物的峰面积提体积比。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明的实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明的实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
一种催化合成天然蔗糖酯的工程菌的构建方法，步骤如下：
（1）重组载体质粒pESE02的构建
以pCDF-duet-1质粒为模板，用引物EcoS01和EcoS02扩增得到片段F1；以基因HlCCL2为模板，用引物EcoS03和EcoS04扩增得到片段F2；以基因HlCCL4为模板，用引物EcoS05和EcoS06扩增得到片段F3；将片段F1、F2和F3通过Gibson连接得到重组载体质粒pESE02，如图1，为pESE02质粒图谱。
表1 pESE02构建使用引物列表
（2）重组载体质粒pESE10的构建
用引物pro1和pro2扩增基因SlASAT1，SlASAT1的扩增产物和pET28a质粒经BamHI和NotI酶切后利用T4 DNA 连接酶进行连接，得到质粒pET28a-SlASAT1；pACYCDuet-1质粒经BamHI和NotI酶切后，与酶切后的SlASAT1的扩增产物利用T4 DNA 连接酶进行连接，得到质粒pACYCDuet-SlASAT1；用引物EcoS19和EcoS20扩增基因SlASAT2，SlASAT2的扩增产物和质粒pACYCDuet-SlASAT1经BglII和KpnI酶切后利用T4 DNA 连接酶进行连接，得到质粒pACYCDuet-SlASAT1-SlASAT2；用引物EcoS21和EcoS22扩增基因SlASAT3，SlASAT3 的扩增产物和质粒pACYCDuet-SlASAT1-SlASAT2经KpnI和PacI酶切后利用T4 DNA 连接酶进行连接，得到质粒pACYCDuet-SlASAT1-SlASAT2-SlASAT3；用引物Eco23和Eco24以质粒pET28a-SlASAT1为模板扩增得到片段F1，用引物EcoS25和EcoS26以质粒pACYCDuet-SlASAT1-SlASAT2-SlASAT3为模板扩增得到片段F2，用引物EcoS27和EcoS28扩增质粒pET28a-SlASAT1得到片段F3，将片段F1、F2和F3通过Gibson连接得到重组载体质粒pESE10，如图2，为pESE10质粒图谱。
表2 pESE10构建使用引物列表
（3）工程菌株EcoSE07的构建
将步骤（1）和步骤（2）的重组载体质粒pESE02和pESE10导入全式金大肠杆菌Transetta，得到工程菌株EcoSE07。
（4）催化合成蔗糖酯
将工程菌株EcoSE07接种到LB培养基（含有34 μg/mL氯霉素、50 μg/mL卡那霉素和50 μg/mL壮观霉素），同时加入0.1mM 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），16℃下低温诱导发酵培养12h，促使蛋白质的合成，4000rpm离心收集菌体；将收集的菌体加入LB培养基，同时加入10mM短支链脂肪酸异戊酸、10mM异丁酸、10mM 2-甲基丁酸和2g/L蔗糖，按照转化起始OD为5对异戊酸、异丁酸、2-甲基丁酸和蔗糖进行催化转化，24h后即得产物蔗糖酯。
（5）LC-MS检测
样品前处理：分别收集转化24 h、48 h、72 h和96 h后的发酵液各2 mL，8000 rpm离心2 min后收集上清液，利用冷冻干燥机冻干上清液，时长为12 h。收集冻干的上清粉末并加入2 mL乙酸乙酯，以60%的功率进行超声萃取，萃取10 min后暂停5 min，再以同样的功率超声萃取5 min，后8000 rpm离心2 min，收集上清液，上述重复操作2次后，通过氮吹仪吹干；氮吹仪吹干后用300μL终止液（乙腈：异丙醇：甲酸=1：1：0.001）进行溶解后，用0.22 µm有机滤膜过滤到上样瓶中准备检测。
LC-MS鉴定分析发酵液中的蔗糖酯类化合物：处理好的样品在Triple TOF 6600LC-MS（SCIEX公司）上进行分析，色谱柱为Ascentis Express C18柱(2.1 mm×10 cm，2.7 µm）。色谱条件为：柱温：40 ℃；流动相：A（0.15%甲酸水）和B（乙腈）（注意：流动相均需要抽滤，并利用超声排气泡20 min），流速：3 mL/min；采取7 min的梯度洗脱：启始条件为95% A和5% B，1 min B升至40%，5 min B升至100%，保持1 min后，在6.01 min回至95% A和5% B保持至7 min。质谱设置如下：负离子模式电喷雾电离，2.14 kV毛细管电压，90℃ 源温度，350℃去溶剂温度，600 L/h去溶氮气流速，10 V锥体电压，质量范围为50~1000m/z，光谱累积量为0.1秒/次。
LC-MS鉴定结果如图3。图3为EcoSE07工程菌株转化蔗糖及支链脂肪酸的LC-MS鉴定及分析。由图3可知EcoSE07中产生蔗糖一酯S1:5(iC5/aiC5)、蔗糖二酯S2:10(iC5/aiC5)以及蔗糖三酯S3:14(iC5/aiC5, iC4)、S3:15(iC5/aiC5)，其中S3:15(iC5/aiC5)的含量最高。
实施例2
一种催化合成天然蔗糖酯的工程菌的构建方法，步骤如下：
（1）重组载体质粒pESE02的构建
以pCDF-duet-1质粒为模板，用引物EcoS01和EcoS02扩增得到片段F1；以基因HlCCL2为模板，用引物EcoS03和EcoS04扩增得到片段F2；以基因HlCCL4为模板，用引物EcoS05和EcoS06扩增得到片段F3；将片段F1、F2和F3通过Gibson连接得到重组载体质粒pESE02，如图1，为pESE02质粒图谱。
表1 pESE02构建使用引物列表
（2）重组载体质粒pESE15的构建
将基因SIASAT1、SIASAT2和SIASAT3进行密码子优化（密码子优化后的基因均由苏州金唯智生物科技有限公司合成），将密码子优化后的基因SIASAT1、SIASAT2和SIASAT3分别命名为optSlASAT1、optSlASAT2和optSlASAT3，将optSlASAT1、optSlASAT2和optSlASAT3克隆至PUC57-Kan质粒载体上；PUC57-Kan上的基因optSlASAT1和pET28a质粒经BamHI和NotI酶切后进行连接，得到质粒pET28a-optSlASAT1；用引物EcoS33和EcoS30扩增基因optSlASAT2，optSlASAT2的扩增产物和质粒pACYCDuet-1经BglII和KpnI酶切后进行连接，得到质粒pACYCDuet-optSlASAT2；用引物EcoS31和EcoS32扩增基因optSlASAT3，optSlASAT3的扩增产物和质粒pACYCDuet-optSlASAT2经KpnI及PacI酶切后进行连接，得到质粒pACYCDuet-optSlASAT2-optSlASAT3；用引物Eco23和Eco24以质粒pET28a-optSlASAT1为模板扩增得到片段F1，用引物EcoS25和EcoS26以质粒pACYCDuet-optSlASAT2-optSlASAT3为模板扩增得到片段F2，用引物EcoS27和EcoS28以质粒pET28a-optSlASAT1为模板扩增得到片段F3；将片段F1、F2和F3通过Gibson连接得到重组载体质粒pESE15，图4为pESE15质粒图谱。
表3 pESE15质粒构建使用引物
（3）工程菌株EcoSE16的构建
将步骤（1）和步骤（2）的重组载体质粒pESE15、pESE02及分子伴侣质粒pKJE7（购自Takara公司）共同转入大肠杆菌BL21，构建工程菌株EcoSE16。
（4）催化合成蔗糖酯
将工程菌株EcoSE16接种到LB培养基（含有34 μg/mL氯霉素、50 μg/mL卡那霉素和50 μg/mL壮观霉素），同时加入0.1mM 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），16℃下低温诱导发酵培养12h，促使蛋白质的合成，4000rpm离心收集菌体；将收集的菌体加入LB培养基（含有34 μg/mL氯霉素、50 μg/mL卡那霉素和50 μg/mL壮观霉素），同时加入10mM短支链脂肪酸异戊酸、10mM异丁酸、10mM 2-甲基丁酸和2g/L蔗糖，按照转化起始OD为5对异戊酸、异丁酸、2-甲基丁酸和蔗糖进行催化转化，24h后即得产物蔗糖酯。
（5）LC-MS检测
样品前处理：分别收集转化24 h、48 h、72 h和96 h后的发酵液各2 mL，8000 rpm离心2 min后收集上清液，利用冷冻干燥机冻干上清液，时长为12 h。收集冻干的上清粉末并加入2 mL乙酸乙酯，以60%的功率进行超声萃取，萃取10 min后暂停5 min，再以同样的功率超声萃取5 min，后8000 rpm离心2 min，收集上清液，上述重复操作2次后，通过氮吹仪吹干；氮吹仪吹干后用300μL终止液（乙腈：异丙醇：甲酸=1：1：0.001）进行溶解后，用0.22 µm有机滤膜过滤到上样瓶中准备检测。
LC-MS鉴定分析发酵液中的蔗糖酯类化合物：处理好的样品在Triple TOF 6600LC-MS（SCIEX公司）上进行分析，色谱柱为Ascentis Express C18柱(2.1 mm×10 cm，2.7 µm）。色谱条件为：柱温：40 ℃；流动相：A（0.15%甲酸水）和B（乙腈）（注意：流动相均需要抽滤，并利用超声排气泡20 min），流速：3 mL/min；采取7 min的梯度洗脱：启始条件为95% A和5% B，1 min B升至40%，5 min B升至100%，保持1 min后，在6.01 min回至95% A和5% B保持至7 min。质谱设置如下：负离子模式电喷雾电离，2.14 kV毛细管电压，90℃ 源温度，350℃去溶剂温度，600 L/h去溶氮气流速，10 V锥体电压，质量范围为50~1000m/z，光谱累积量为0.1秒/次。
鉴定结果如图5所示，EcoSE16工程菌株转化蔗糖及支链脂肪酸的LC-MS鉴定及分析。由图5可知EcoSE16中产生蔗糖二酯S2:10(iC5/aiC5)、蔗糖三酯S3:14(iC5/aiC5,iC4)，其中96h后S3:14的含量最高。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
<110> 郑州轻工业大学
<120> 催化合成天然蔗糖酯的工程菌及其构建方法和应用
<141> 2022-06-08
<160> 8
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<210> 1
<211> 1281
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli )
<400> 1
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aaacagaaga gatagttttg cttctgaatc gcgcgctacc atggaccagt ccttcaagaa 780
tttacccaaa ctgtaaccat cactaacctt gtgtgaaagg catacaccaa gcgctacgcc 840
accacattca aaatgacaaa gcttagctgc gactaaactg tccgttgatg ggaaccaagg 900
atcaaaagga agtactagat tatcgatgta agtacgaggg tgatcaaaga tactagacat 960
tggacaatca attcggactt gggatagatc ggcccctatg tcattacatt cgacaaagga 1020
gttgtctctt acttgtccag caaacggata gtatgacgtt aggactttgg aaagggattt 1080
ttctagaact cgagatatct tcgttggttc tggcatgctt gtcgttgtgt tctgtttcgg 1140
gtagaatatc aaagctgcca tataggagtg agtccccatt tgatccataa gtgagagctt 1200
gtgaattcta tgtgaaagtg gagttggtga agaaggttta ataatctttc ttgaaagtga 1260
aacaagtctt gaagcagaca t 1281
<210> 2
<211> 1341
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli )
<400> 2
ttagctagtt ggagaggcaa atcgtaagag ctcttcatcc ctctcaaaag ctaacatgtc 60
ttgtttcttc atgctacatg ttagattcac tccatctcta tttttatcag ccatcaaaaa 120
aaacatgttt ttaattggtg gattacttgt tgaaattggt gaaataactt tttcaggctt 180
tccccatcca aagtctacct catatgaggg gaatgtgatg aggctactaa acctatagag 240
atcataacat gaattgttga ctaacaaatc atttgctttt ctatgttgtt caagtgttat 300
aggaagtagt tcttctattt tagcattttt gtatttttgt ttgacttctt ccttctcctt 360
tcttagttta ctaacaactc gtgctaaatc catttctttc tcttcttttg ttagtataga 420
aaatagagaa caaatgtttc ccatagtgtg tttgggcaat ggagggcgta agtttacagc 480
ctgatgaagt aaagatggac gaatggagtc tgaatttacc aacttttttg tagccatggc 540
gcgttggtaa aggaatgcag acacaacttc tgtatcactt ggattttgta cttctgaatc 600
attaataacc ctagctttca gcgcggttaa tttggatgat gaaatagaaa aacctttgga 660
cacacattct tctctttgtg gcacgatatt gttgttagat acgtttgatg agtcctcatc 720
tttcgcaggt ggaaaataaa aggatccatc aaacttagga cttatcggat atatttctga 780
acttaatgga ttacgcgcta tagtagccca atggttcatg aagttgccaa acgtgtatcc 840
atccccaacc ttgtgtgaca aacacatact gatcgcgatt cctccacaat taaagtgagt 900
gagttgaaat actgcaagac taccctcgta tgtatactga ttattaataa cttctgttgg 960
atagaccaaa ttatgttttt caaaataggg gtggttgaaa atttcagaca ttggacaatt 1020
tatttctgta acgaagaatt caactccatt atcgttacaa tcaatagaaa tattgtcatt 1080
caatttccct gcaaatggat agtaattggt caaaactttt gaaagggatt tttcaagatg 1140
ttgagataca acattatttg gtttattgga ccatgtgttg ctcaatttag ggtaaaaaag 1200
ggccaatgga atataaatgc caccaaccat ttgatcaaga taggagagtt tgggacaacg 1260
aagtgaaatt ggagtaggtg aatatggttt gattattttt ttacaaactg aggatacaag 1320
tcttgataca ctactactca t 1341
<210> 3
<211> 1293
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli )
<400> 3
ttatttggtt gattcaacaa ctggagaagc aaactccaga agctccttgt tgctctgaaa 60
cttgagcata tcatcttttg ttaaagtgat aagtacattt agcccatctc cactttgttc 120
atccatgaaa atgaagttgt tcttatttgg atgtgttgct agggttactc ttacaggttc 180
accccatccg aaatcgatct tatgtaatcc agtattggtc atgcctgagc aaagataaac 240
atcatgtgta tccttctcta ttatgttcat cgcgttttta cctagttcaa gtgtatataa 300
gggcatccta tcttctttca tatccttcaa cttgtctcga agttgttgtt tatccttctg 360
tagtttagca acaaagtttg gaagttttac ctcatcttct gtcattgctg ttgtgagaat 420
gatacatgtt gcatttccca ttgtgttcag tggaattggt gggcgtaaat tcatagcatg 480
gctcatcaga gttggtttga acatgcctga actctccatt gacatagtca ccccacattt 540
atgaacaagt gctgaggcaa cttcaacgcg agttggattc ttcacatgtg attcttttgt 600
tacgatgtcc ttgagtcttg tcaaattcga ggatgagaag ttatacattc ttgagacatg 660
acgttgtgat ggacgcgttg caggtagggt gctactcaaa ttagtttcag acggtaaagg 720
gaagaaagtt gatgcattga actgaggaga tggtttgaac tccatgtttc gagctgtaga 780
cgcccaatcg tttatgaatt tagagagaca atatccatca aaaattgtat gtgatgtaca 840
tgcactcact gcaactccac cacaatcaaa atggcttaat tgaaccacta gtggacttcg 900
agtcaagcta ctactactcc aaggcaaatc ttgtgggaaa actacatcca caacatcgtt 960
ataagggtgg ttgagaattt gagacattgg acaatctata cggacgttta aatactcagc 1020
acctgtgtcg ttacaatcga cgtaggtata attattattg atttttccag ctaagggata 1080
ataaaaggac aatacttttg aaagggaatt ttcaagtact tgtgatattt tgttactata 1140
attttgaggt attttagggt agaagaaggc atatggagaa tgtagaggga aatttatgtg 1200
atccatgaaa gagagtttgt gacatctaag tgaagatgga gttggggata aaagtttaat 1260
catttttcta gatataattg ttgatgatgc cat 1293
<210> 4
<211> 1722
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli )
<400> 4
atggataact atagaaggct ccacactccg gttgctctct gcgttgccag tccacctgcg 60
ccacccacca catcatggaa gtcaatggag ggcttagttc agtgctctgc aaatcatgtt 120
cctctctctc ccattacctt cttggagcgt tcttccaagg cttacagaga caacacctct 180
cttgtctatg gctctgtcag atacacttgg gcccaaactc accatcgctg tctcaagcta 240
gcttctgctc tcacaaccca cttgggaatt tcaccagggg atgtggtggc taccttctct 300
tacaacctac cagaaatcta cgagcttcat tttgcagtcc caatggctgg tgggattctc 360
tgtacactca acgctcgcaa cgactcggcc atggtgtcga cgctgctagc acactcggaa 420
gccaaactca tctttgtgga accccagtta ctggaaacgg ctcgggcagc tcttgatctt 480
ctcgcccaaa aggacataaa gcctccaact ttggtcttac taaccgattc ggaaagcttc 540
acttcaagct catacgatca ctataatcat ctgttggcca atgggtctga tgacttcgaa 600
ataagacggc ctaagaacga atgggatccc atcagcataa actacacctc aggcaccact 660
gcacgcccca aagctgtcgt ttacagccac cgtggggcat atctgaactc catagccaca 720
gttttgcttc acgggatggg gacaacgtct gtttatcttt ggtcagtgcc catgtttcat 780
tgcaacggct ggtgttttcc atggggggct gcagctcagg gcgccaccaa catatgcata 840
agaaaagtct ctcccaaagc catttttgac aacatacatt tgcataaggt tacacacttt 900
ggagctgcac caactgtctt gaacatgatt gtgaactcgc cggaaggcaa ccttcacacc 960
ccgcttcccc acaaggtgga ggtcatgaca ggaggttcac cgccaccgcc caaggtcatt 1020
gcgaggatgg aagagatggg gtttcaagtg aatcacattt atggcctcac ggaaacttgt 1080
ggtcctgctg ctaattgtgt atgcaaacct gaatgggatg cactgcagcc agaggaacgg 1140
tatgccttga aagctcgtca aggattaaac catctggcga tggaggagat ggacgtgaga 1200
gacccggtga ccatggaaag tgttagggcc gatggtgcaa cgattggtga ggttatgttc 1260
agaggaaaca ctgtgatgag tggctacttt aaagacttga aggcgaccga ggaggctttc 1320
gagggaggtt ggtttcgtag tggggatctt ggtgtgaaac atgaggatgg ttatattcaa 1380
cttaaggatc ggaagaagga tgtggtgata tcaggagggg agaatatcag tacagttgaa 1440
gttgagactg tgttgtatag ccacgaagca gtgctcgagg ctgctgtggt ggcgcgccct 1500
gataagcttt ggggggagac gccttgtgct tttgtgacac ttaaggaggg atttgataat 1560
gatgtaagtg ctgaccaaat tatcaaattc tgtagagatc gtttgcccca ttacatggct 1620
cccaagacag tagtgtttga agagttacca aagacttcaa caggaaagat acagaagtat 1680
attctgaaag aaaaagcaat ggccatgggc agcctttctt ga 1722
<210> 5
<211> 1671
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli )
<400> 5
atggaagatc tgaagccgag accagccagc tcctctccac tcacccctct ggggtttctg 60
gaaagagccg ccaccgttta tggcgactgt acctccgtcg tttacgacgc cgtttcatac 120
acctggtccc agactcaccg ccgctgtctc tgtcttgcct cctccatcgc ctcactcggc 180
atcgaaaacg gccatgtcgt ctccgtcctc gccccaaacg tcccccaaat gtacgagctt 240
cacttcgccg ttcccatggc cggcgccatc ctcaacgccg tcaacctccg tctcgatgcc 300
cgcaccatct ccatcctcct ccatcacagc gaatcgaaac tcatcttcgt cgatcatctc 360
tctcgtgatc tcatcctcga agccatcgct ctgttcccga aacaagcccc tgttcctcgc 420
ctcgttttta tggcggacga gtctgaatcg ggtaatagtt cagagttggg gaaagaattc 480
ttctgcagtt ataaggatct gatcgataga ggggacccgg atttcaagtg ggtcatgcct 540
aaaagcgagt gggacccgat gattcttaac tacacttctg gaacgacgtc atcgccgaaa 600
ggggttgtcc attgtcaccg gggaatattt ataatgacag tcgactctct catcgattgg 660
ggagttccta aacagccagt ttatctatgg actctgccca tgtttcacgc caatgggtgg 720
agctatcctt ggggtatggc ggcggtcggc gggaccaata tctgcctgcg taaattcgac 780
tctgaaataa tttacgatat gataaaacgg cacggcgtga cccacatgtg cggagccccc 840
gttgtactca acatgctctc caacgcgccg ggatcggaac cgctgaaaac aacggttcag 900
atcatgactg caggagctcc gccgccctcg gcggtgcttt tccggaccga gtcgctgggc 960
ttcgcggtga gccacggcta cgggcttacc gaaacggcgg ggttagtggt gtcgtgcgcg 1020
tggaagaaag agtggaacca tctcccggcg acggagagag cgaggctcaa gtcgagacaa 1080
ggggtgggga cggtgatgca gaccaaaatc gatgtcgttg acccggtgac cggagccgcc 1140
gtgaagcgag acggatcaac gttgggcgag gttgttctga gaggcgggtc ggtcatgctc 1200
gggtacctaa aagacccaga aggaacggcg aaatccatga ccgcagacgg gtggttctac 1260
accggggacg ttggagtcat gcacccagat gggtatttgg agatcaaaga ccggtccaag 1320
gacgtcatca tcagcggcgg agagaatttg agcagcgtcg aggtggagtc aattctgtac 1380
agtcacccgg atattctgga ggcggcggtt gtggcccggc cagacgagtt ctggggggag 1440
acgccgtgtg ctttcgtgag cttgaagaaa ggtttaacga agaagccgac ggagaaggag 1500
atcgtggagt attgtcggag taagttgccg cgttacatgg tacccaaaac ggtggtgttt 1560
aaggaggagc ttcccaagac atcgactggg aaggttcaga aatttatact gagagatatg 1620
gccagaggta tgggctctgc aactgctgga gcgagccgga gccgaatgtg a 1671
<210> 6
<211> 1281
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli )
<400> 6
ttaaaagccc aggcacgggc tcgcaaactg cagaaaatca tcgttgcgtt ccagcgcgct 60
cagttcgcca tcttgcaggc tcgcaatcac ttccacgcca tcgccgttct gattatccat 120
cagaataaac atgttaatcg gaaaggtgct aatatccact tggcgcgggc ggccccagcc 180
aaagttaata tcgttgctcg gaaagcggcg caggctgcta aagcgataca tcggaatatc 240
gttgttgctc gtgcgtttgt tcagttcgcg cgcaatatcg ctcaccttgc tgcacagaaa 300
ttcttcgctt tcaatatatt tcagcatatc ttgaattttt tctttgcctt tgcgcagttc 360
gctcaccagg cgttccaggt tcatttcttc tttgttggtc gcgctcacca caaacggcag 420
aatcgcgttg ccggtcagat ccgccggcac cagcgcatcg ttgctcgtgc cgcgctgatc 480
caccgcttga atcagcaggc tctgcggggt gctcacgcag cgataaataa acgcggtaat 540
cgcttccacg gtggtcgggc aaatctgcgt cgcgctatcc gcgctgctaa tcaggctttt 600
caggcttttc aggttgctcg cgctaaaatg aaagcgtttg ctttcgtttt tatacagcgg 660
cggatcggcc accacttgaa agctactgct gttactcggt ttgaagatgc tgctgccgtt 720
aaacagcagg ctcagtttcg cttcgctatc gcgcgccacc atgctccaat ctttcagaaa 780
tttgcccagg ctatagccat cactcacttt atggctcagg cacacgccca gcgccacgcc 840
gccgcattca aaatggcaca gtttcgccgc caccaggcta tcggtgctcg gaaaccacgg 900
atcaaacggc agcaccaggt tatcaatata ggtgcgcgga tgatcaaaaa tactactcat 960
cgggcaatca atgcgcactt ggctcagatc cgcgccaata tcgttgcatt ccacaaagct 1020
gttatcgcgc acttggcccg caaacggata atagctcgtc agcactttgc tcaggctttt 1080
ttccagcacg cggctaattt tggtcggttc cggcatgctc gtcgtggtgt tctgtttcgg 1140
ataaaaaatc agcgccgcca tatagctatg ggtgcccatc tgatccatca ggctcagttt 1200
atgaatgcga tggctcagcg gggtcgggct gctcggttta ataattttgc gactcaggct 1260
caccagacgg ctcgcgctca t 1281
<210> 7
<211> 1341
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli )
<400> 7
ttagctcgtc gggctcgcga aacgcagcag ttcttcatcg cgttcaaacg ccagcatatc 60
ttgttttttc atgctgcagg tcaggttcac gccatcgcgg tttttatccg ccatcagaaa 120
aaacatgttt ttaatcggcg ggttgctcgt gctaatcggg ctaatcactt tttccggttt 180
gccccagcca aaatccactt catagctcgg aaaggtaatc aggctgctaa agcgatacag 240
atcatagcag ctgttgttca ccagcagatc gttcgctttg cgatgctgtt ccagggtgat 300
cggcagcagt tcttcaattt tcgcgttttt atatttctgt ttcacttctt ctttttcttt 360
gcgcagtttg ctcaccacgc gcgccagatc catttctttt tcttctttgg tcagaatgct 420
aaacaggctg caaatgttgc ccatggtatg tttcggcagc ggcgggcgca ggttcaccgc 480
ttgatgcagc aggctcgggc gaatgctatc gctgttcacc agttttttgg tcgccatcgc 540
gcgctgatac agaaacgcgc tcaccacttc ggtatcgctc gggttctgca cttcgctatc 600
gttaatcacg cgcgctttca gcgcggtcag tttgctactg ctaatgctaa agcctttgct 660
cacgcattct tcgcgctgcg gcacaatgtt attgttgctc acgttgctgc tatcttcatc 720
tttcgccggc ggaaaataaa agctgccatc gaatttcgga ctgatcggat aaatttcgct 780
gctcagcggg ttgcgcgcaa tggtcgccca atggttcata aagttgccaa aggtatagcc 840
atcgcccact ttatggctca ggcacatgct aatcgcaatg ccgccgcagt taaaatgggt 900
cagctgaaac accgccaggc tgccttcata ggtatactga ttgttaatca cttcggtcgg 960
atacaccagg ttatgttttt caaaatacgg atggttaaaa atttcgctca tcgggcagtt 1020
aatttcggtc acaaaaaatt ccacgccgtt atcgttgcaa tcaatgctaa tgttatcgtt 1080
cagtttgccc gcaaacggat aatagttggt cagcactttg ctcaggcttt tttccagatg 1140
ctgactcacc acgttgttcg gtttgttgct ccaggtgttg ctcagtttcg gataaaacag 1200
cgccagcgga atataaatgc cgcccaccat ctgatccaga tagctcagct tcgggcagcg 1260
caggctaatc ggggtcgggc tatacggttt aataattttt ttgcacacgc tgctcaccag 1320
gcggctcacg ctactgctca t 1341
<210> 8
<211> 1293
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli )
<400> 8
ttatttggtg ctttccacca ccgggctcgc aaattccagc agttctttgt tgctctgaaa 60
tttcagcata tcatctttgg tcagggtaat cagcacgttc aggccatcgc cgctctgttc 120
atccataaaa ataaagttgt ttttgttcgg atgggtcgcc agggtcacgc gcaccggttc 180
gccccagcca aaatcaattt tatgcaggcc ggtgttggtc atgccgctgc acagatacac 240
atcatgggta tctttttcaa taatgttcat cgcgtttttg cccagttcca gggtatacag 300
cggcatgcga tcttctttca tatctttcag tttatcgcgc agctgctgtt tatctttctg 360
cagtttcgcc acaaagttcg gcagtttcac ttcatcttcg gtcatcgcgg tggtcagaat 420
aatgcaggtc gcgttgccca tggtgttcag cggaatcggc gggcgcaggt tcatcgcatg 480
gctcatcagg gtcggtttaa acatgccgct gctttccatg ctcatggtca cgccgcattt 540
atgcaccagc gcgctcgcca cttccacgcg ggtcgggttt ttcacatggc tttctttggt 600
cacaatatct ttcaggcggg tcaggttgct actgctaaag ttatacatgc ggctcacatg 660
gcgctgactc gggcgggtcg ccggcagggt gctgctcagg ttggtttcgc tcggcagcgg 720
aaaaaaggtg ctcgcgttaa actgcgggct cggtttaaat tccatgttgc gcgcggtgct 780
cgcccaatcg ttaataaatt tgctcaggca atagccatca aaaatggtat ggctcgtgca 840
cgcgctcacc gccacgccgc cgcaatcaaa atggctcagc tgcaccacca gcgggctgcg 900
ggtcaggctg ctactgctcc acggcagatc ttgcggaaac accacatcca ccacatcgtt 960
atacggatgg ttcagaatct gactcatcgg gcaatcaatg cgcacgttca gatattccgc 1020
gccggtatcg ttgcaatcca cataggtata gttattgtta attttgcccg ccagcggata 1080
ataaaagctc agcactttgc tcaggctgtt ttccagcact tggctaattt tgttgctata 1140
gttctgcgga attttcggat aaaaaaacgc atacgggcta tgcagcggaa agttaatatg 1200
atccataaag ctcagtttat ggcagcgcag gctgctcggg gtcgggctca gcagtttaat 1260
cattttgcgg ctaataatgg tgctgctcgc cat 1293

Claims (7)

1.催化合成天然蔗糖酯的工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）以pCDF-duet-1质粒为模板，构建包含基因HlCCL2和基因HlCCL4的重组质粒pESE02；其中基因HlCCL2的碱基序列如SEQ ID NO.4所示，基因HlCCL4的碱基序列如SEQ IDNO.5所示；
（2）以pET28a质粒为模板，构建包含基因SlASAT1、基因SlASAT2和基因SlASAT3的重组质粒pESE10；其中基因SIASAT1的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，基因SIASAT2的碱基序列如SEQ ID NO.2所示，基因SIASAT3的碱基序列如SEQ ID NO.3所示；
（3）以PUC57-Kan质粒为模板，构建包含基因optSlASAT1、基因optSlASAT2和基因optSlASAT3的重组质粒pESE15；其中基因optSlASAT1的碱基序列如SEQ ID NO.6所示，基因optSlASAT2的碱基序列如SEQ ID NO.7所示，基因optSlASAT3的碱基序列如SEQ ID NO.8所示；
（4）分别制备包含步骤（1）的重组质粒pESE02和步骤（2）的重组质粒pESE10的工程菌株EcoSE07以及包含步骤（1）的重组质粒pESE02、步骤（3）的重组质粒pESE15和分子伴侣质粒的工程菌株EcoSE16；所述工程菌为大肠杆菌。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述分子伴侣质粒为分子伴侣质粒pKJE7。
3.权利要求1或2所述的方法构建的工程菌。
4.权利要求3所述的工程菌在催化合成天然蔗糖酯中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述天然蔗糖酯包括蔗糖一酯、蔗糖二酯和蔗糖三酯。
6.根据权利要求4或5的应用，其步骤为：
a、将在LB固体培养基上培养起来的工程菌株EcoSE07或工程菌株EcoSE16单菌落接种于5mL LB液体培养基中，于37℃过夜培养12h；
b、将培养后得到的工程菌株EcoSE07或工程菌株EcoSE16接种到LB液体培养基中，起始OD值为0.01，待菌株OD值达到0.6时，加入0.1mM IPTG，经16℃低温诱导12h，然后4000rpm离心收集菌体；
c、向LB液体培养基中加入10mM短支链脂肪酸异戊酸、10mM异丁酸、10mM 2-甲基丁酸和15g/L蔗糖，再加入步骤b收集的菌体，然后进行转化，24h后即可收集天然蔗糖酯。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述步骤a、步骤b和步骤c中LB固体培养基和LB液体培养基中均含有34 μg/mL氯霉素、50 μg/mL卡那霉素和50 μg/mL壮观霉素；步骤c中进行转化时菌体的OD值为5。
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