CN110791466B - 一种合成丁三醇油酸酯的重组菌及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种合成丁三醇油酸酯的重组菌及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域。所述重组菌是以大肠杆菌为出发菌株，将编码酰基转移酶的基因、编码脂酰CoA合成酶的基因、编码烯酰ACP还原酶的基因、编码甘油激酶的基因、编码3‑磷酸甘油酰基转移酶的基因和编码DAGP磷酸酶的基因导入大肠杆菌，得到重组菌。经过发酵，实现了1,2,4‑丁三醇油酸酯的首次合成。本发明所构建的重组菌，在LB培养基中发酵24h，可以实现丁三醇和油酸钠的酯化，得到丁三醇油酸酯，为丁三醇的分离纯化提供新的思路。

Description

一种合成丁三醇油酸酯的重组菌及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种合成丁三醇油酸酯的重组菌及其构建方法和应用。
背景技术
1,2,4-丁三醇(丁三醇，BT)是一种与甘油相似的无色透明物质，其主要作用是作为有机合成的化学中间体，广泛的应用于JG、烟草、化妆品、造纸、医药和高分子材料等领域。其硝化衍生物相比硝酸甘油有热稳定性好，毒性、挥发性较小，冲击感小等优点，需求量逐年增加。目前，各国学者开展了一系列生物法合成BT的研究，取得了较大进展。但丁三醇属于醇类物质，易溶于水，难于从发酵液中分离。Frost团队曾经使用真空蒸馏法分离，但是在获得的产物中，有聚合物和降解物的污染；液相萃取的方法也有研究，实验结果表明乙酸乙酯和2-丁酮虽然可以萃取丁三醇，但是其萃取效率偏低；1-丁醇和2-丁醇可以高效萃取丁三醇，但是杂质偏多；目前还没有找到比较理想的萃取剂。
醇类物质和酸类物质可以很容易进行酯化反应。酯类物质难溶于水，并且易于水解重新得到醇类物质，现有的水解技术也比较成熟。有研究通过化学法将发酵液中的乳酸和甲醇、乙醇等低级醇类实现酯化，进一步离心水解获得乳酸，乳酸的回收率达到90％以上；相比传统的分离方法简化了实验步骤，减少了环境污染。BT作为醇类物质，同样可以实现酯化反应。但是目前合成BT的方法普遍为化学方法，而化学方法合成BT存在条件苛刻、污染严重等问题，所以开发新的BT合成方法是目前需要解决的问题。目前，已经有研究使用生物方法合成BT，但是仍然存在发酵液中的BT难以分离的问题。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种合成丁三醇油酸酯的重组菌及其构建方法和应用。
本发明首先提供了一种合成丁三醇油酸酯的重组菌。
所述重组菌过表达编码酰基转移酶的基因yqeF、编码脂酰CoA合成酶的基因fadD、编码烯酰ACP还原酶的基因fabI、编码甘油激酶的基因glpK、编码3-磷酸甘油酰基转移酶的基因plsB和编码DAGP磷酸酶的基因pgpB；出发菌株为大肠杆菌。
所述的编码酰基转移酶的基因yqeF、编码脂酰CoA合成酶的基因fadD、编码烯酰ACP还原酶的基因fabI、编码甘油激酶的基因glpK、编码3-磷酸甘油酰基转移酶的基因plsB和编码DAGP磷酸酶的基因pgpB来源于大肠杆菌。
所述编码酰基转移酶的基因yqeF在NCBI的基因ID为947324，编码脂酰CoA合成酶的基因fadD在NCBI的基因ID为946327、编码烯酰ACP还原酶的基因fabI在NCBI的基因ID为945870、编码甘油激酶的基因glpK在NCBI的基因ID为948423、编码3-磷酸甘油酰基转移酶的基因plsB在NCBI的基因ID为948541和编码DAGP磷酸酶的基因pgpB在NCBI的基因ID为945863。
本发明还提供构建上述重组菌的方法，包括以下步骤：
1)克隆酰基转移酶基因yqeF，将所得基因与质粒pACYCDuet-1进行酶切、连接，并转入E.coliDH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，提取质粒获得重组载体pACYCDuet-yqeF；
2)克隆脂酰CoA合成酶基因fadD，将所得基因与步骤1)所得载体pACYCDuet-yqeF进行酶切、连接，并转入E.coliDH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，提取质粒获得重组载体pACYCDuet-yqeF-fadD；
3)克隆烯酰ACP还原酶基因fabI，将所得基因与载体pCOLADuet-1进行酶切、连接，并转入E.coliDH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，提取质粒获得重组载体pCOLADuet-fabI；
4)克隆甘油激酶基因glpK，将所得基因与步骤3)所得载体pCOLADuet-fabI进行酶切、连接，并转入E.coliDH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，提取质粒获得重组载体pCOLADuet-fabI-glpK；
5)克隆3-磷酸甘油酰基转移酶基因plsB，将所得基因与步骤4)所得pCOLADuet-fabI-glpK进行酶切、连接，并转入E.coliDH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，提取质粒获得重组载体pCOLADuet-fabI-glpK-plsB；
6)克隆DAGP磷酸酶基因pgpB，将所得基因与步骤5)所得pCOLADuet-fabI-glpK-plsB进行酶切、连接，并转入E.coliDH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，提取质粒获得重组载体pCOLADuet-fabI-glpK-plsB-pgpB；
7)将步骤2)与步骤6)所获得的重组载体，转化到宿主EscherichiacoliBL21(DE3)感受态细胞中，获得大肠杆菌重组菌。
本发明还提供上述重组菌在发酵生产丁三醇油酸酯中的应用，步骤如下：
1)活化重组菌，获得种子液；
2)将步骤1)所得的种子液，接种至含有卡那霉素与氯霉素的发酵培养基，培养至OD600在0.6～0.8，获得培养液；
3)向所得的培养液中加入诱导剂、1,2,4-丁三醇和油酸钠，然后继续培养24～48小时；分离得到丁三醇油酸酯。
在本发明的一种实施方式中，步骤2)所述培养基为LB培养基；接种量为体积比种子液：发酵培养基＝(1～2):(100～130)。
在本发明的一种实施方式中，步骤2)所述培养条件为：35℃～37℃，180～220rpm；进一步优选地，步骤2)所述培养条件为：37℃，180rpm。
在本发明的一种实施方式中，步骤2)所述卡那霉素和氯霉素在培养基中的浓度分别为：卡那霉素100μg·mL-1，氯霉素100μg·mL-1。
在本发明的一种实施方式中，发酵培养基(LB)的配方为：10g/L氯化钠，10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉。
在本发明的一种实施方式中，步骤3)所述诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，加入量为终浓度0.01～0.1mM；1,2,4-丁三醇加入量为终浓度1～10g/L；油酸钠加入量为终浓度1～10g/L。
在本发明的一种实施方式中，步骤3)所述培养条件为30～33℃，180～220rpm。
在本发明的一种实施方式中，将重组菌活化后，按1％的接种量接种到含100μg·mL-1卡那霉素和100μg·mL-1氯霉素的发酵培养基中，37℃、180rpm条件下振荡培养，待OD600达到0.6时，温度调节至30℃，并加入0.05mMIPTG进行诱导，同时加入10g/L的1,2,4-丁三醇和油酸钠，诱导后24h终止发酵。
有益效果
针对以上问题，本发明以Escherichia coli BL21(DE3)为宿主菌株，通过过表达甘油三酯途径的关键合成基因(glpK、plsB和pgpB)和发挥酯化作用的关键酶基因(yqeF、fabI和fadD)，构建获得工程菌，实现了1,2,4-丁三醇油酸酯的首次合成。本发明所构建的重组菌，在LB培养基中发酵24h，可以实现丁三醇和油酸钠的酯化，得到丁三醇油酸酯，为丁三醇的分离纯化提供新的思路。
定义和缩写
在本文中使用下列的缩写或简称：
酰基转移酶基因：yqeF
脂酰CoA合成酶基因：fadD
烯酰ACP还原酶基因：fabI
甘油激酶基因：glpK
3-磷酸甘油酰基转移酶基因：plsB
DAGP磷酸酶基因：pgpB
大肠杆菌(Escherichia coli):E.coli
“过量表达”或“过表达”指特定的基因在生物体中大量表达，表达量超过正常水平(即，野生型表达水平)，可以通过增强内源表达或引入外源基因来实现。
附图说明
图1 1,2,4-丁三醇三油酸酯的液相-质谱鉴定图谱。
具体实施方式
下面通过实例来进一步阐明本发明。但本发明并不限于以下实施例。
下述实施例中所使用的实验方法若无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所使用的材料、试剂等若无特殊说明，均可从商业途径获得。
所用酶试剂购自MBI Fermentas公司，提取质粒所用的试剂盒和回收DNA片段所用的试剂盒购自美国OMEGA公司，相应的操作步骤按照产品说明书进行；所有培养基如无特别说明均用去离子水配制。
培养基配方：
LB培养基：5g/L酵母粉，10g/L NaCl，10g/L蛋白胨，其余为水，121℃，20min灭菌。
在实际培养过程中，可向上述培养基中添加一定浓度的抗生素以维持质粒的稳定性，如100μg·mL-1的卡那霉素和100μg·mL-1氯霉素。
实施例1一种合成丁三醇油酸酯的重组菌的构建
1)载体pACYCDuet-yqeF的构建
本实施例中，获取来源于E.coli的酰基转移酶基因yqeF(在NCBI的基因ID为947324)，是以E.coli基因组为模板，通过PCR扩增获得(引物：5'-GGAATTCAAGGAGATATACCATGAAAGACGTTGTGATTG-3'和5'-GCGTCGACCTATTCGTCACGTTCAATG-3')，再利用回收试剂盒回收目的片段，目的片段大小为1182bp。
将获得的yqeF基因片段和质粒pACYCDuet-1用EcoRI和SalI酶切，回收酶切产物，再进行连接，载体与yqeF基因片段按照摩尔比1:5的比例，16℃连接6h以上，连接产物转化E.coliDH5α，然后涂布在加有100μg·mL-1氯霉素的LB固体平板上，PCR筛选阳性克隆。从阳性克隆中提取重组质粒pACYCDuet-yqeF后，再通过限制性酶酶切和测序鉴定。
2)载体pACYCDuet-yqeF-fadD的构建
获取来源于E.coli的脂酰CoA合成酶基因fadD(在NCBI的基因ID为946327)，是以E.coli基因组为模板，通过PCR扩增分别获得(扩增引物：5'-AAATATGCGGCCGCTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCTTGAAGAAGGTTTGGCTTAAC-3'和5'-CGCTTAAGTCAGGCTTTATTGTCCAC-3')，利用回收试剂盒回收片段fadD，片段大小为1605bp。
将获得的fadD基因片段和载体pACYCDuet-yqeF用NotI和AflII酶切，回收酶切产物，再进行连接，载体与fadD基因片段按照摩尔比1:5的比例，16℃连接6h以上，连接产物转化E.coliDH5α，然后涂布在加有100μg·mL-1氯霉素的LB固体平板上，PCR筛选阳性克隆。从阳性克隆中提取重组载体pACYCDuet-yqeF-fadD后，再通过限制性酶酶切和测序鉴定。
3)载体pCOLA Duet-fabI的构建
获取来源于E.coli的烯酰ACP还原酶的基因fabI(在NCBI的基因ID为945870)，是以E.coli基因组为模板，通过PCR扩增获得(引物：5'-GAAGATCTACAATAAGGATTAAAGCTATG-3'和5'-GGGGTACCTTATTTCAGTTCGAGTTC-3')，再利用回收试剂盒回收目的片段，目的片段大小为789bp。
将获得的fabI基因片段和质粒pCOLADuet用BglII和KpnI酶切，回收酶切产物，再进行连接，载体与fabI基因片段按照摩尔比1:5的比例，16℃连接6h以上，连接产物转化E.coliDH5α，然后涂布在加有100μg·mL-1卡那霉素的LB固体平板上，PCR筛选阳性克隆。从阳性克隆中提取重组载体pCOLADuet-fabI后，再通过限制性酶酶切和测序鉴定。
4)载体pCOLADuet-fabI-glpK的构建
获取来源于E.coli的甘油激酶基因glpK(在NCBI的基因ID为948423)，是以E.coli基因组为模板，通过PCR扩增获得(引物：5'-GGAATTCACTACGGGACAATTAAACATG-3'和5'-CGAGCTCTTATTCGTCGTGTTCTTC-3')，再利用回收试剂盒回收目的片段，目的片段大小为1509bp。
将获得的glpK基因片段和载体pCOLADuet-fabI用EcoRI和SacI酶切，回收酶切产物，再进行连接，载体与glpK基因片段按照摩尔比1:5的比例，16℃连接6h以上，连接产物转化E.coliDH5α，然后涂布在加有100μg·mL-1卡那霉素的LB固体平板上，PCR筛选阳性克隆。从阳性克隆中提取重组载体pCOLADuet-fabI-glpK后，再通过限制性酶酶切和测序鉴定。
5)载体pCOLADuet-fabI-glpK-plsB的构建获取来源于E.coli的3-磷酸甘油酰基转移酶基因plsB(在NCBI的基因ID为948541)，是以E.coli基因组为模板，通过PCR扩增获得(引物：5'-CGAGCTCACCAGAGGCTTTACATCGTTTATG-3'和5'-GCGTCGACTTACCCTTCGCCCTGCGTCGCA-3')，再利用回收试剂盒回收目的片段，目的片段大小为2424bp。
将获得的plsB基因片段和载体pCOLADuet-fabI-glpK用SacI和SalI酶切，回收酶切产物，再进行连接，载体与plsB基因片段按照摩尔比1:5的比例，16℃连接6h以上，连接产物转化E.coliDH5α，然后涂布在加有100μg·mL-1卡那霉素的LB固体平板上，PCR筛选阳性克隆。从阳性克隆中提取重组载体pCOLADuet-fabI-glpK-plsB后，再通过限制性酶酶切和测序鉴定。
6)载体pCOLADuet-fabI-glpK-plsB-pgpB的构建
获取来源于E.coli的DAGP磷酸酶基因pgpB(在NCBI的基因ID为945863)，是以E.coli基因组为模板，通过PCR扩增获得(引物：5'-GCGTCGACTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTATCAAAAAGGAGAGGCCATG-3'和5'-CCACATGTTTAACTTTCTTGTTCTCG-3')，再利用回收试剂盒回收目的片段，目的片段大小为765bp。
将获得的pgpB基因片段和载体pCOLADuet-fabI-glpK-plsB用SalI和AflII酶切，回收酶切产物，再进行连接，载体与pgpB基因片段按照摩尔比1:5的比例，16℃连接6h以上，连接产物转化E.coliDH5α，然后涂布在加有100μg·mL-1卡那霉素的LB固体平板上，PCR筛选阳性克隆。从阳性克隆中提取重组载体pCOLADuet-fabI-glpK-plsB-pgpB后，再通过限制性酶酶切和测序鉴定。
7)转化
将步骤2)与步骤6)所获得的重组载体pACYCDuet-yqeF-fadD和pCOLADuet-fabI-glpK-plsB-pgpB转化到宿主E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，获得大肠杆菌重组菌。
实施例2发酵生产丁三醇油酸酯
将实施例1中获得的重组菌，涂布在含有100μg·mL-1卡那霉素和100μg·mL-1氯霉素的LB固体平板；涂布后的平板置于37℃恒温培养箱，继续培养至长出单克隆。
将获得的工程菌株单克隆在LB培养中进行活化，在37℃、180rpm条件下培养12h，得到种子液，种子液按与培养基体积比1:100的比例接种到含有100mL的LB液体培养基的500mL摇瓶中(内含100μg·mL-1卡那霉素和100μg·mL-1氯霉素)，37℃、180rpm条件下振荡培养。OD600达到0.6左右时，温度调节至30℃，并加入终浓度0.05mM的IPTG进行诱导，同时加入终浓度10g/L的1,2,4-丁三醇和终浓度10g/L的油酸钠，诱导后24h终止发酵。
产物的检测
发酵结束后，离心发酵液收集菌体；加入5mL 100mM磷酸钾缓冲液重悬细胞，超声破碎菌体：40％，冰上，超声时间每次3s，间隔3s，共40min；在细胞破碎液中立即加入5mL氯仿/甲醇(2:1，V/V)，上下颠倒使充分混合，在振荡仪上振荡15s后，8000×g离心10min，分离并收集氯仿有机层；重复添加氯仿/甲醇(2:1，V/V)进行二次萃取；利用旋蒸仪对样品进行浓缩，使氯仿/甲醇蒸发；加入1mL氯仿/甲醇(2:1，V/V)溶解蒸干的浓缩样品，过滤膜，-20℃保存。最终产物通过液相质谱分析，证明获得了1,2,4-丁三醇油酸酯，产量达到127mg/L。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院青岛生物能源与过程研究所
<120> 一种合成丁三醇油酸酯的重组菌及其构建方法和应用
<130>
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 39
<212> DNA
<213> 实施例1 1）引物1
<400> 1
ggaattcaag gagatatacc atgaaagacg ttgtgattg 39
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 实施例1 1）引物2
<400> 2
gcgtcgacct attcgtcacg ttcaatg 27
<210> 3
<211> 79
<212> DNA
<213> 实施例1 2）引物1
<400> 3
aaatatgcgg ccgctaatac gactcactat aggggaattg tgagcggata acaattcctt 60
gaagaaggtt tggcttaac 79
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 实施例1 2）引物2
<400> 4
cgcttaagtc aggctttatt gtccac 26
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> 实施例1 3）引物1
<400> 5
gaagatctac aataaggatt aaagctatg 29
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 实施例1 3）引物2
<400> 6
ggggtacctt atttcagttc gagttc 26
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> 实施例1 4）引物1
<400> 7
ggaattcact acgggacaat taaacatg 28
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 实施例1 4）引物2
<400> 8
cgagctctta ttcgtcgtgt tcttc 25
<210> 9
<211> 31
<212> DNA
<213> 实施例1 5）引物1
<400> 9
cgagctcacc agaggcttta catcgtttat g 31
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> 实施例1 5）引物2
<400> 10
gcgtcgactt acccttcgcc ctgcgtcgca 30
<210> 11
<211> 75
<212> DNA
<213> 实施例1 6）引物1
<400> 11
gcgtcgacta atacgactca ctatagggga attgtgagcg gataacaatt cccctatcaa 60
aaaggagagg ccatg 75
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> 实施例1 6）引物2
<400> 12
ccacatgttt aactttcttg ttctcg 26

Claims (8)

1.一种合成丁三醇油酸酯的重组菌，其特征在于，所述重组菌，过表达编码酰基转移酶的基因yqeF、编码脂酰CoA合成酶的基因fadD、编码烯酰ACP还原酶的基因fabI、编码甘油激酶的基因glpK、编码3-磷酸甘油酰基转移酶的基因plsB和编码DAGP磷酸酶的基因pgpB，出发菌株为大肠杆菌，所述编码酰基转移酶的基因yqeF在NCBI的基因ID为947324，编码脂酰CoA合成酶的基因fadD在NCBI的基因ID为946327、编码烯酰ACP还原酶的基因fabI在NCBI的基因ID为945870、编码甘油激酶的基因glpK在NCBI的基因ID为948423、编码3-磷酸甘油酰基转移酶的基因plsB在NCBI的基因ID为948541和编码DAGP磷酸酶的基因pgpB在NCBI的基因ID为945863。
2.一种权利要求1所述重组菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）克隆酰基转移酶基因yqeF，将所得基因与质粒pACYCDuet-1进行酶切、连接，并转入E.coliDH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，提取质粒获得重组载体pACYCDuet-yqeF；
2）克隆脂酰CoA合成酶基因fadD，将所得基因与步骤1）所得载体pACYCDuet-yqeF进行酶切、连接，并转入E.coliDH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，提取质粒获得重组载体pACYCDuet-yqeF-fadD；
3) 克隆烯酰ACP还原酶基因fabI，将所得基因与质粒pCOLA Duet-1进行酶切、连接，并转入E.coliDH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，提取质粒获得重组载体pCOLA Duet-fabI；
4）克隆甘油激酶基因glpK，将所得基因与步骤3）所得载体pCOLADuet-fabI进行酶切、连接，并转入E.coliDH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，提取质粒获得重组载体pCOLADuet-fabI-glpK；
5) 克隆3-磷酸甘油酰基转移酶基因plsB，将所得基因与步骤4)所得pCOLADuet-fabI- glpK进行酶切、连接，并转入E.coliDH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，提取质粒获得重组载体pCOLADuet-fabI-glpK-plsB；
6）克隆DAGP磷酸酶基因pgpB，将所得基因与步骤5)所得pCOLADuet-fabI-glpK-plsB进行酶切、连接，并转入E.coliDH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，提取质粒获得重组载体pCOLADuet-fabI-glpK-plsB-pgpB；
7）将步骤2)与步骤6)所获得的重组载体，转化到宿主Escherichia coli BL21感受态细胞中，获得大肠杆菌重组菌。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于：所述的编码酰基转移酶的基因yqeF、编码脂酰CoA合成酶的基因fadD、编码烯酰ACP还原酶的基因fabI、编码甘油激酶的基因glpK、编码3-磷酸甘油酰基转移酶的基因plsB和编码DAGP磷酸酶的基因pgpB来源于大肠杆菌；所述编码酰基转移酶的基因yqeF在NCBI的基因ID为947324，编码脂酰CoA合成酶的基因fadD在NCBI的基因ID为946327、编码烯酰ACP还原酶的基因fabI在NCBI的基因ID为945870、编码甘油激酶的基因glpK在NCBI的基因ID为948423、编码3-磷酸甘油酰基转移酶的基因plsB在NCBI的基因ID为948541和编码DAGP磷酸酶的基因pgpB在NCBI的基因ID为945863。
4.一种权利要求1所述的重组菌在发酵生产丁三醇油酸酯中的应用，其特征在于，步骤如下：
1）活化重组菌，获得种子液；
2）将步骤1）所得的种子液，接种至含有卡那霉素与氯霉素的发酵培养基，培养至OD600在0.6～0.8，获得培养液；
3）向所得的培养液中加入诱导剂、1,2,4-丁三醇和油酸钠，然后继续培养24～48小时；分离得到丁三醇油酸酯，所述诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤2）所述培养基为LB培养基；接种量为体积比种子液：发酵培养基=(1～2 ): (100～130)。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤2）所述培养条件为：35℃～37℃，180～220rpm。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤3）所述诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，加入量为终浓度0.01～0.1mM；1,2,4-丁三醇加入量为终浓度1~10g/L；油酸钠加入量为终浓度1~10g/L。
8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤3）所述培养条件为30～33℃，180～220rpm。
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CN114149955B (zh) * 2021-12-09 2023-09-26 齐鲁工业大学 一种高效生产甘油的基因工程菌及其构建方法与应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN101490241A (zh) * 2006-05-19 2009-07-22 Ls9公司 脂肪酸及其衍生物的制备
CN104450798A (zh) * 2014-11-24 2015-03-25 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种体外酶反应生成1,2,4-丁三醇的方法及应用

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Kinetic Chiral Resolutions of 1,2-Diols and Desymmetrization of Glycerol Catalyzed by Glycerol Kinase;H. Keith Chenault等;《JOURNAL OF ORGANIC CHEMISTRY》;19980519;第63卷(第12期);第4039-4045页 *

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