BR112017021789B1 - Método de isolamento e purificação de ambrox e método de melhorar ou acentuar o odor de ambrox - Google Patents

Abstract

MÉTODO DE ISOLAMENTO E PURIFICAÇÃO DE AMBROX E MÉTODO DE MELHORAR OU ACENTUAR O ODOR DE AMBROX. A presente invenção refere-se a um método de isolar e purificar (-)-Ambrox de uma mistura de reação compreendendo (-)-Ambrox e um ou mais dos compostos (II), (III) e (IV):

Description

[001] A presente invenção refere-se a um método de preparação, isolamento e purificação do isômero (-)-Ambrox. Mais particularmente, a invenção está relacionada com um método de preparação de (-)- Ambrox por meio de uma bioconversão, bem como a um método de sua recuperação e purificação de uma mistura de reação.

[002] AMBROFIXTM é o nome comercial, patenteado por Givaudan, do composto enantiomericamente puro (-)-Ambrox, que tem a fórmula geral (I).

[003] AMBROFIXTM é uma molécula muito importante na paleta de ingredientes dos perfumistas. Ele proporciona uma nota de âmbar altamente poderosa, altamente substantiva e altamente estável para uso em todas as aplicações de perfumaria. AMBROFIXTM, disponível na Givaudan, é o material mais adequado para obter-se uma nota de autêntico odor âmbar-gris.

[004] Atualmente, AMBROFIXTM é produzido sinteticamente de materiais de partida de origem natural. A disponibilidade e qualidade de certos materiais de partida são dependentes das condições climáticas, bem como dos fatores socioeconômicos. Além disso, uma vez que os materiais de partida podem ser extraídos de recursos naturais, com modestas produções, eles estão disponíveis a preços que, com toda a probabilidade, tornarão cada vez mais seu uso não econômico em uma escala industrial. Consequentemente, se suprimentos industriais comerciais de AMBROFIXTM continuarem a estar disponíveis em um custo razoável, há uma necessidade por um processo de produção e purificação de custo mais eficaz, que seja capaz de sofrer industrialização.

[005] Uma rota biotecnológica industrialmente escalável para AMBROFIXTM seria atrativa, por ser potencialmente menos complexa e menos poluente do que os procedimentos totalmente sintéticos.

[006] Um substrato potencialmente útil para experimentar uma bioconversão para prover (-)-Ambrox é o homofarnesol. Em seu papel produtivo, Neumann et al (Biol. Chem. Hoppe-Seyler Vol. 367 páginas 723-726 (1986)) discutiu a viabilidade de converter homofarnesol em (- )-Ambrox sob catálise enzimática, empregando a enzima Esqualeno Hopeno Ciclase (Squalene Hopene Cyclase) (SHC). O homofarnesol empregado era uma mistura dos quatro isômeros geométricos desta molécula. Dos quatro isômeros, somente o isômero geométrico 7E, 3E (usando nomenclatura convencional) poderia ser ciclizado e, além disso, somente com produção muito baixa do (-)-Ambrox desejado.

[007] JP 2009-60799 (Kao) descreve uma síntese pela qual SHC atua em um substrato de homofarnesol para produzir (-)-Ambrox. O substrato é uma mistura de todos os quatro isômeros geométricos (3Z, 7Z; 3E, 7Z; 3Z, 7E; e 3E, 7E). O documento descreve somente a preparação de (-)-Ambrox a partir dos extratos de homofarnesol contendo SHC. A mistura de homofarnesol é convertida em (-)-Ambrox e seu estereoisômero 9-epi, e purificação pode ser realizada por destilação ou por cromatografia de coluna. Kao não descreve o processo pelo qual homofarnesol é convertido em (-)-Ambrox empregando-se microrganismos intactos produzindo SHC e, além disso, não provê qualquer ensinamento técnico relacionado com o processamento a jusante das misturas de reação complexas obtidas por tais processos que podem produzir (-)-Ambrox na forma olfativamente pura.

[008] Para o conhecimento do requerente, a técnica anterior não descreve quaisquer processos viáveis industrialmente escaláveis envolvendo a bioconversão catalisada por SHC de homofarnesol, para prover (-)-Ambrox em forma olfativamente pura.

[009] Além disso, se bioconversão de homofarnesol for para ser realizada em uma escala industrial, fontes econômicas de 3E,7E- homofarnesol altamente puro devem estar disponíveis. Entretanto, embora rotas sintéticas para homofarnesol tenham sido descritas na literatura (vide, por exemplo, US 2013/0273619), para conhecimento do requerente não existem fontes econômicas de escala industrial de 7E,3E-homofarnesol puro atualmente disponíveis.

[0010] Permanece uma necessidade em prover uma rota economicamente praticável e industrialmente escalável para o valioso ingrediente de fragrância (-)-Ambrox.

[0011] Nos Pedidos de Patente copendentes PCT/EP2014/072891 (publicado como WO2015/059293) e PCT2014/EP/072882 (publicado como WO2015/059290), o requerente descreve um método eficaz de preparar uma mistura de 7E,3E/Z-homofarnesol que é enriquecida no isômero geométrico 7E,3E. A mistura de 7E,3E/Z-homofarnesol é preparada a partir de beta-farneseno, e as informações isoméricas contidas neste material de partida são preservadas de modo que a ligação dupla em homofarnesol na posição-7 é fixada na configuração- E. Entretanto, mesmo esta química elegante ainda resulta em uma mistura de isômeros 3E/Z. O 7E,3E-homofarnesol puro permanece sinteticamente desafiador, e pode somente ser obtido por meio de purificação economicamente desvantajosa de misturas isoméricas.

[0012] Surpreendentemente, o requerente constatou que as misturas de 7E,3E/Z-homofarnesol podem sofrer um processo de bioconversão, pelo qual a mistura de homofarnesol é enzimaticamente ciclizada na presença de um microrganismo recombinante expressando uma enzima, em particular, um biocatalisador de Esqualeno Hopeno Ciclase (SHC) capaz de bioconverter homofarnesol em (-)-Ambrox, para produzir uma mistura de reação na qual (-)-Ambrox pode ser isolado na forma olfativamente pura com supreendentemente fácil processamento a jusante.

[0013] Em um aspecto da invenção é provida a ciclização catalisada por enzima de homofarnesol, para prover uma mistura de reação compreendendo (-)-Ambrox, em que o homofarnesol compreende uma mistura de isômeros geométricos 7E,3E/Z de homofarnesol, e em que a reação é realizada na presença de um microrganismo recombinante produzindo a enzima, mais particularmente um microrganismo recombinante intacto, não modificado, produzindo a enzima.

[0014] Em uma modalidade da invenção, a reação de ciclização é realizada na presença de um biocatalizador SHC capaz de bioconverter homofarnesol em (-)-Ambrox.

[0015] O biocatalisador SHC é uma enzima tipo selvagem ou uma variante, ou é um microrganismo expressando um gene que codifica a enzima SHC, preferivelmente um microrganismo de E. coli recombinante. O biocatalisador SHC pode ser usado em qualquer forma, tal como, mas não limitado a, uma enzima SHC purificada, um extrato bruto contendo uma enzima SHC ou uma enzima SHC imobilizada (p.ex., em um veículo), ou o biocatalisador pode ser um microrganismo tendo produzido ou produzindo a enzima SHC, tal como uma célula inteira recombinante intacta e/ou uma célula fragmentada ou uma fração de membrana contendo a enzima SHC.

[0016] Em uma modalidade particular da presente invenção, a mistura de homofarnesol é enriquecida no isômero geométrico-7E,3E.

[0017] Em uma modalidade mais particular, a mistura de homofarnesol é pelo menos 55/45 em peso de 7E,3E/7E,3Z.

[0018] Em uma modalidade mais particular, a mistura de homofarnesol é pelo menos 70/30 em peso de 7E,3E/7E,3Z.

[0019] Em uma modalidade ainda mais particular, a mistura de homofarnesol é pelo menos 80/20 em peso de 7E,3E/7E,3Z.

[0020] Em uma modalidade ainda mais particular, a mistura de homofarnesol é pelo menos 90/10 em peso de 7E,3E/7E,3Z.

[0021] Em uma modalidade ainda mais particular, a mistura de homofarnesol é pelo menos 95/5 em peso de 7E,3E/7E,3Z.

[0022] Em uma modalidade particular da presente invenção, a mistura de homofarnesol consiste de isômeros geométricos-7E,3E/Z e nenhum outro isômero geométrico de homofarnesol.

[0023] A pessoa habilidosa compreende que os termos 7E, 7Z, 3E ou 3Z, usados em combinação com homofarnesol, referem-se respectivamente à orientação da ligação dupla na posição 7 e na posição 3 de homofarnesol. O composto 7E,3E-homofarnesol tem o CAS No.459-89-2, enquanto o composto 7E,3Z-homofarnesol tem o CAS No. 138152-06-4. O uso do termo 7E,3E/Z-homofarnesol refere-se a uma mistura dos compostos.

[0024] Métodos de obtenção de misturas de homofarnesol úteis como um substrato na reação de ciclização, de acordo com o método da presente invenção, são apresentados nos pedidos copendentes PCT/EP2014/072891 (publicado como WO2015/059293) e PCT2014/EP/072882 (publicado como WO2015/059290) referidos acima, que são por este meio incorporados por referência em sua totalidade. Em termos gerais, eles descrevem uma síntese de misturas de homofarnesol que prossegue pela conversão de farneseno, mais particularmente alfa-farneseno e/ou beta-farneseno, em seu correspondente derivativo de farneseno ciclopropanado, utilizando uma solução orgânica de N-alquil-N-nitroso ureia. O derivativo ciclopropanado, em seguida, sofre reações de abertura de anel e rearranjo na presença de um ácido de Bronsted, para propiciar a mistura de homofarnesol que é seletiva para o isômero geométrico 7E,3E. Utilizar farneseno como um material de partida é particularmente preferido, porque garante que a configuração-E da ligação dupla na posição 7 de homofarnesol seja fixada.

[0025] As condições de reação específicas, que formam modalidades particulares da presente invenção, são apresentadas nos pedidos copendentes, bem como nos exemplos aqui abaixo, e não requerem mais elaboração aqui.

[0026] A ciclização de homofarnesol, para prover uma mistura de reação contendo (-)-Ambrox, pode ser catalisada por Esqualeno Hopeno Ciclase (SHC). A SHC pode ser uma enzima tipo selvagem (p.ex., SEQ ID No. 1), ou uma sua variante (p.ex., SEQ ID No. 2, ou SEQ ID No. 4). A SHC pode ser obtida de Alicyclobacillus acidocaldarius (Bacillus acidocaldarius), Zymomonas mobilis ou Bradyrhizobium japonicum (como exposto no Exemplo 3b de US20120135477A1).

[0027] Entretanto, a enzima também pode ser produzida por meio de recombinante, empregando-se técnicas que são geralmente conhecidas na técnica.

[0028] O termo "recombinante", quando usado com respeito à produção de enzimas, deve referir-se às enzimas produzidas por técnicas de DNA recombinante, isto é, produzidas a partir de células transformadas por uma construção de DNA exógeno que codifica a enzima desejada. O termo "DNA recombinante", portanto, inclui um DNA recombinante incorporado em um vetor em um plasmídeo ou vírus de replicação autônoma, ou no DNA genômico de um procariota ou eucariota (ou o genoma de uma célula homóloga, em uma posição diferente da localização cromossômica natural).

[0029] Molécula(s) de ácido nucleico é/são operativamente ligada(s) às sequências de controle de expressão, permitindo a expressão em células hospedeiras procarióticas e/ou eucarióticas. Como usado aqui, "operativamente ligado" significa incorporado em uma construção genética, de modo que as sequências de controle de expressão eficazmente controlem a expressão de uma sequência de codificação de interesse. Os elementos regulatórios transcricionais/translacionais referidos acima incluem, mas não são limitados a, induzíveis e não-induzíveis, constitutivos, com ciclo celular regulado, promotores metabolicamente regulados, acentuassomos, operadores, silenciadores, repressores e outros elementos que são conhecidos àqueles hábeis na técnica e que conduzem ou de outro modo regulam a expressão gênica. Tais elementos regulatórios incluem, mas não são limitados aos elementos regulatórios que conduzem a expressão constitutiva ou que permitem expressão induzível como, por exemplo, promotor CUP-1, o repressor-tet quando empregado, por exemplo, nos elementos regulatórios dos sistemas teton ou tet-off, do sistema lac, do sistema trp. Por meio de exemplo, isopropil β-D-1-tiogalactopiranosideo (IPTG) é um indutor eficaz da expressão de proteína na faixa de concentração de 100 μM a 1,0 mM. Este composto é uma imitação molecular de alolactose, um metabólito de lactose que dispara a transcrição do óperon lac e é, portanto, usado para induzir a expressão de proteína onde o gene está sob o controle do operador lac.

[0030] Similarmente, a(s) molécula(s) de ácido nucleico pode(m) fazer parte de um gene híbrido que codifica sequências de polipeptídeos adicionais, por exemplo, uma sequência que funciona como um marcador ou repórter. Exemplos de genes marcadores e repórteres, incluem beta-lactamase, cloranfenicol, acetiltransferase (CAT), adenosina desaminase (ADA), aminoglicosídeo fosfotransferase diidrofolato redutase (DHFR), higromicina-B-fosfotransferase (HPH), timidina cinase (TK), lacZ (que codifica beta-galactosidase), e xantina guanina fosforribosiltransferase (XGPRT). Como com muitos dos procedimentos padrão associados com a prática da descrição, os artífices hábeis estarão cientes de reagentes úteis adicionais, por exemplo, sequências adicionais que podem servir a função de um marcador ou repórter.

[0031] Polinucleotídeos recombinantes podem codificar enzimas SHC, tais como as SHC tipo selvagem ou uma sua variante, que podem ser inseridas em um vetor para expressão e purificação opcional. Um tipo de vetor é um plasmídeo representando um circuito de DNA de fita dupla circular, cujos segmentos de DNA adicionais são ligados. Certos vetores podem controlar a expressão gênica na qual eles estão funcionalmente ligados. Estes vetores são chamados "vetores de expressão". Os vetores de expressão geralmente adequados para técnicas de recombinação de DNA são do tipo plasmídeo. Tipicamente, um vetor de expressão compreende um gene, tal como a SHC tipo selvagem ou uma sua variante. Na presente descrição, os termos "plasmídeo" e "vetor" são usados intercambiavelmente, uma vez que o plasmídeo é o tipo de vetor frequentemente mais utilizado.

[0032] Tais vetores podem incluir sequências de DNA que incluem, mas não são limitadas a, sequências de DNA que não estão naturalmente presentes na célula hospedeira, sequências de DNA que não são normalmente transcritas no RNA ou traduzidas em uma proteína ("expressas"), e outros genes ou sequências de DNA que se deseja introduzir no hospedeiro não recombinante. Será observado que, tipicamente, o genoma de um hospedeiro recombinante é aumentado através de introdução estável de um ou mais genes recombinantes. Entretanto, plasmídeos ou vetores autônomos ou replicativos também podem ser usados dentro do escopo desta descrição. Além disso, a presente descrição pode ser praticada usando-se um baixo número de cópias, por exemplo, uma única cópia, ou um plasmídeo ou vetor com alto número de cópias.

[0033] Em uma modalidade preferida, o vetor da presente descrição compreende plasmídeos, fagomídeos, fagos, cosmídios, cromossomas bacterianos artificiais e de levedura artificiais, construtores de inativação genética (nocaute) ou modificação genética, sequências de ácido nucleico sintético ou cassetes e subconjuntos podem ser produzidos na forma de polinucleotídeos lineares, plasmídeos, megaplasmídeos, cromossomas sintéticos ou artificiais, tais como cromossomas artificiais de planta, de bactéria, de mamífero ou de levedura.

[0034] Prefere-se que as proteínas codificadas por polinucleotídeos introduzidos sejam produzidas dentro da célula sob introdução do vetor. Os diversos substratos de gene podem ser incorporados nos plasmídeos. Os plasmídeos são frequentemente vetores de clonagem padrão, por exemplo, plasmídeos de multicópias bacterianos. Os substratos podem ser incorporados no mesmo ou em diferentes plasmídeos. Frequentemente pelo menos dois tipos diferentes de plasmídeos, tendo diferentes tipos de marcadores selecionáveis, são usados para permitir a seleção de células contendo pelo menos dois tipos de vetores.

[0035] Tipicamente, células bacterianas ou de levedura podem ser transformadas com qualquer uma ou mais das seguintes sequências de nucleotídeos, conforme é bem conhecido na técnica. Para recombinação in vivo, o gene a ser recombinado com o genoma ou outros genes é usado para transformar o hospedeiro, empregando-se técnicas de transformação padrão. Em uma modalidade adequada, o DNA provendo uma origem de replicação é incluído na construção. A origem de replicação pode ser adequadamente selecionada pela pessoa habilidosa. Dependendo da natureza dos genes, uma origem suplementar de replicação pode não ser necessária se sequências já estiverem presentes com os genes ou genomas que são operáveis como origens de replicação deles mesmos.

[0036] Uma célula bacteriana ou de levedura pode ser transformada por DNA exógeno ou heterólogo quando tal DNA for introduzido dentro da célula. O DNA transformador pode ou não ser integrado, isto é, covalentemente ligado no genoma da célula. Nos procariotas, e levedura, por exemplo, o DNA transformador pode ser mantido em um elemento epissomal, tal como um plasmídeo. Com respeito às células eucarióticas, uma célula estavelmente transformada é uma célula em que o DNA transfectado tornou-se integrado em um cromossoma, de modo que ele seja herdado por células filhas através de replicação cromossômica. Esta estabilidade é demonstrada pela capacidade da célula eucariótica em estabelecer linhagens ou clones celulares compreendidos de uma população de células filhas contendo o DNA transformador.

[0037] Geralmente, o DNA introduzido não é originalmente residente no hospedeiro que é o recipiente do DNA, porém está dentro do escopo da descrição isolar um segmento de DNA de um dado hospedeiro e, subsequentemente, introduzir uma ou mais cópias adicionais daquele DNA dentro do mesmo hospedeiro, por exemplo, para aumentar a produção do produto de um gene ou alterar o padrão de expressão de um gene. Em alguns exemplos, o DNA introduzido modificará ou mesmo substituirá um gene endógeno ou sequência de DNA por, por exemplo, recombinação homóloga ou mutagênese direcionada por sítio. Os hospedeiros recombinantes adequados incluem microrganismos, células de planta, e plantas.

[0038] A presente descrição também caracteriza hospedeiros recombinantes. O termo "hospedeiro recombinante", também referido como uma "célula hospedeira geneticamente modificada" ou uma "célula transgênica", indica uma célula hospedeira que compreende um ácido nucleico heterólogo ou o genoma do qual foi aumentado por pelo menos uma sequência de DNA incorporada. Uma célula hospedeira da presente descrição pode ser geneticamente engenheirada com o polinucleotídeo ou o vetor, como resumido acima.

[0039] As células hospedeiras que podem ser usadas para fins da descrição incluem, mas não são limitadas às, células procarióticas, tais como bactérias (p.ex., E. coli e B. subtilis), que podem ser transformadas com, por exemplo, DNA bacteriófago recombinante, DNA de plasmídeo, cromossoma artificial bacteriano, ou vetores de expressão de DNA de cosmídio contendo as moléculas de polinucleotídeo da descrição; células eucarióticas simples como levedura (p.ex., Saccharomyces e Pichia), que podem ser transformadas com, por exemplo, vetores de expressão da levedura recombinante contendo a molécula de polinucleotídeo da descrição. Dependendo da célula hospedeira e do respectivo vetor usado para introduzir o polinucleotídeo da descrição, o polinucleotídeo pode integrar-se, por exemplo, dentro do cromossoma ou no DNA mitocondrial, ou pode ser mantido extracromossomicamente como, por exemplo, epissomalmente, ou pode ser apenas brevemente compreendido dentro das células.

[0040] O termo "célula", como usado aqui, em particular com referência à engenharia genética e introduzindo um ou mais genes ou um grupo reunido de genes em uma célula, ou uma célula de produção, é sabido referir-se a qualquer célula procariótica ou eucariótica. As células hospedeiras procarióticas e eucarióticas são ambas consideradas para uso de acordo com a descrição, incluindo células hospedeiras bacterianas como E. coli ou Bacillus sp, células hospedeiras de levedura, tais como S. cerevisiae, células hospedeiras de inseto, tais como Spodoptora frugiperda, ou células hospedeiras de humano, tais como HeLa e Jurkat.

[0041] Especificamente, a célula é uma célula eucariótica, preferivelmente, uma célula de fungo, mamífero ou planta, ou célula procariótica. As células eucarióticas adequadas incluem, por exemplo, sem limitação, células de mamíferos, células de levedura, ou células de insetos (incluindo Sf9), células de anfíbio (incluindo células melanóforas), ou células de verme, incluindo células de Caenorhabditis (incluindo Caenorhabditis elegans). As células de mamíferos adequadas incluem, por exemplo, sem limitação, células COS (incluindo Cos-1 e Cos-7), células CHO, células HEK293, células HEK293T, células HEK293 T-RexTM, ou outras linhagens de células eucarióticas transfectáveis. Células bacterianas adequadas incluem, sem limitação, E. coli.

[0042] Preferivelmente, procariotas, tais como E. coli, Bacillus, Streptomyces, ou células de mamíferos, como células de HeLa ou Jurkat, ou células de planta, como Arabidopsis, podem ser usadas.

[0043] Preferivelmente, a célula é uma célula de Aspergillus sp ou uma célula de fungo, preferivelmente, ela pode ser selecionada do grupo consistindo nos gêneros Saccharomyces, Candida, Kluyveromyces, Hansenula, Schizosaccharomyces, Yarrowia, Pichia e Aspergillus.

[0044] Preferivelmente, a célula hospedeira E. coli é uma célula hospedeira E. coli que é reconhecida pela indústria e autoridades reguladoras (incluindo, mas não limitada a uma célula hospedeira E. coli K12 ou, como demonstrado nos Exemplos, uma célula hospedeira E. coli BL21).

[0045] Uma célula hospedeira preferida para uso na presente descrição é a E. coli, que pode ser recombinantemente preparada como descrito aqui. Assim, o hospedeiro recombinante pode ser uma célula hospedeira E. coli recombinante. Há bibliotecas de mutantes, plasmídeos, modelos de computador detalhados de metabolismo e outras informações disponíveis para E. coli, considerando o desenho racional de vários módulos para aumentar a produção do produto. Métodos similares àqueles descritos acima para Saccharomyces podem ser usados para produzir microrganismos recombinantes de E. coli.

[0046] Em uma modalidade, o microrganismo recombinante de E. coli compreende sequências de nucleotídeos que codificam genes SHC ou equivalentes funcionais/suas homologias, incluindo, mas não limitados a, variantes, mutantes homólogos, derivativos ou seus fragmentos.

[0047] Outra célula hospedeira preferida para uso na presente descrição é S. cerevisiae, que é um organismo de suporte amplamente usado na biologia sintética. Assim, o hospedeiro recombinante pode ser S. cerevisiae. Há bibliotecas de mutantes, plasmídeos, modelos de computador detalhados de metabolismo e outras informações disponíveis de S. cerevisiae, considerando desenho racional de vários módulos para aumentar a produção do produto. Métodos são conhecidos para produzir microrganismos recombinantes de S. cerevisiae.

[0048] A cultura de células é realizada de uma forma convencional. O meio de cultura contém uma fonte de carbono, pelo menos uma fonte de nitrogênio e sais inorgânicos, e vitaminas são adicionadas a ele. Os constituintes deste meio podem ser os que são convencionalmente usados para cultivar a espécie de microrganismo em questão.

[0049] Fontes de carbono utilizadas no método atual incluem qualquer molécula que possa ser metabolizada pela célula hospedeira recombinante para facilitar o crescimento e/ou produção de (-)-Ambrox. Exemplos de fontes de carbono adequadas incluem, mas não são limitados a, sacarose (p.ex., como encontrada no melaço), frutose, xilose, glicerol, glicose, celulose, amido, celobiose ou outro polímero contendo glicose.

[0050] Nas modalidades empregando levedura como um hospedeiro, por exemplo, fontes de carbono, tais como sacarose, frutose, xilose, etanol, glicerol, e glicose, são adequadas. A fonte de carbono pode ser provida ao organismo hospedeiro por todo o período de cultivo ou alternativamente, o organismo pode ser cultivado por um período de tempo na presença de outra fonte de energia, por exemplo, proteína, e em seguida ser provido com uma fonte de carbono somente durante a fase de batelada alimentada.

[0051] A adequabilidade de um microrganismo de célula hospedeira recombinante para uso nos métodos da presente descrição pode ser determinada por simples procedimentos de teste usando-se métodos bem conhecidos. Por exemplo, o microrganismo a ser testado pode ser propagado em um meio rico (p.ex., meio-LB, meio de extrato de levedura Bacto-triptona, meio nutriente, e similares) em pH, temperatura e sob condições de aeração, comumente empregados para propagação do microrganismo. Uma vez que os microrganismos recombinantes (isto é, células hospedeiras recombinantes) são selecionados, que produzem os produtos de bioconversão desejados, os produtos são tipicamente produzidos por uma linhagem de células hospedeiras de produção em larga escala por sistemas de expressão e fermentações adequados, por exemplo, por produção microbiana na cultura celular.

[0052] Em uma modalidade da presente descrição, um meio mínimo definido, tal como M9A, é usado para cultivo celular. Os componentes do meio M9A compreendem: 14 g/L KH2PO4, 16 g/L K2HPO4, 1 g/L Na3Citrato.2H2O, 7,5 g/L (NH4)2SO4, 0,25 g/L MgSO4.7H2O, 0,015 g/L CaCl2.2H2O, 5 g/L de glicose e 1,25 g/L de extrato de levedura).

[0053] Em outra modalidade da presente descrição, o meio rico em nutrientes, tal como LB (Luria-Bertani) foi utilizado. Os componentes de LB compreendem: 10 g/L de triptona, 5 g/L de extrato de levedura, 5 g/L de NaCl).

[0054] Outros exemplos de Meio Mineral e Meio Mineral M9 são descritos, por exemplo, nas US 6524831B2 e US 2003/0092143A1.

[0055] O microrganismo recombinante pode ser cultivado em um processo de batelada, de batelada alimentada, ou contínuo, ou suas combinações. Tipicamente, o microrganismo recombinante é cultivado em um fermentador em uma temperatura definida na presença de uma fonte de nutrientes adequada, por exemplo, uma fonte de carbono, por um período de tempo desejado para bioconverter homofarnesol em (-)- Ambrox em uma quantidade desejada.

[0056] As células hospedeiras recombinantes podem ser cultivadas de qualquer forma adequada, por exemplo, por cultivo de batelada ou cultivo de batelada alimentada. Como usado aqui, o termo "cultivo de batelada" é um método de cultivo em que o meio de cultura nem é adicionado nem é retirado durante o cultivo. Como usado aqui, o termo "batelada alimentada" significa um método de cultivo em que o meio de cultura é adicionado durante o cultivo, porém nenhum meio de cultura é retirado.

[0057] Uma modalidade da presente descrição provê um método de produzir (-)-Ambrox em um sistema celular compreendendo produzir SHC tipo selvagem ou suas variantes sob condições adequadas do sistema celular, alimentando homofarnesol ao sistema celular, convertendo o homofarnesol em (-)-Ambrox, usando a SHC ou variantes produzidas na utilização do sistema celular, coletando (-)-Ambrox do sistema celular, e isolando o (-)-Ambrox do sistema. A expressão de outras sequências de nucleotídeos pode servir para aprimorar o método. O método de bioconversão pode incluir a expressão adicional de outras sequências de nucleotídeos no sistema celular. A expressão de outras sequências de nucleotídeos pode aprimorar o trajeto de bioconversão para produzir (-)-Ambrox.

[0058] Uma outra modalidade da presente descrição é um método de bioconversão de produção de (-)-Ambrox, compreendendo cultivar células hospedeiras contendo SHC tipo selvagem ou genes variantes, produzindo SHC tipo selvagem ou enzimas variantes nas células hospedeiras, alimentando homofarnesol (p.ex., EEH) às células hospedeiras, incubando as células hospedeiras sob condições de pH, temperatura, e agente solubilizante adequados para promover a conversão de homofarnesol em Ambrox, e coletando (-)-Ambrox. A produção de SHC tipo selvagem ou enzimas variantes nas células hospedeiras provê um método de produzir (-)-Ambrox quando homofarnesol é adicionado às células hospedeiras sob condições de reação adequadas. A conversão obtida pode ser aprimorada adicionando-se mais biocatalisador e SDS à mistura de reação.

[0059] O microrganismo da célula hospedeira recombinante pode ser cultivado em um número de formas, a fim de prover células em quantidades adequadas expressando SHC tipo selvagem ou enzimas variantes para a subsequente etapa de conversão. Uma vez que os microrganismos aplicáveis à etapa de bioconversão variam amplamente (p.ex., leveduras, bactérias e fungos), são condições de cultivo, naturalmente ajustadas às específicas necessidades de cada espécie, e estas condições são bem conhecidas e documentadas. Qualquer um dos métodos conhecidos para desenvolver células de microrganismos de célula hospedeira recombinantes pode ser usado para produzir as células utilizáveis na subsequente etapa de bioconversão da presente descrição. Tipicamente, as células são cultivadas a uma densidade particular (de forma mensurável como densidade óptica (OD)) para produzir uma biomassa suficiente para a reação de bioconversão. As condições de cultivo escolhidas não influenciam somente a quantidade de células obtida (a biomassa), mas a qualidade das condições de cultivo também influencia como a biomassa se torna um biocatalisador. O microrganismo da célula hospedeira recombinante expressando a SHC tipo selvagem ou genes variantes e produzindo a SHC tipo selvagem ou enzimas variantes é denominado um biocatalisador, que é adequado para uso em uma reação de bioconversão. Em algumas modalidades, o biocatalisador é uma célula inteira recombinante produzindo SHC tipo selvagem ou enzimas variantes, ou ele pode estar em suspensão ou em um formato imobilizado.

[0060] Em uma modalidade, o biocatalisador é produzido em quantidades suficientes (para criar uma biomassa suficiente), colhido e lavado (e opcionalmente armazenado (p.ex., congelado ou liofilizado)) antes da etapa de bioconversão.

[0061] Em uma outra modalidade, as células são produzidas em quantidades suficientes (para criar um biocatalisador suficiente) e as condições de reação são então ajustadas sem a necessidade de colher e lavar o biocatalisador para a reação de bioconversão. Este método da etapa um (ou "vaso um") é vantajoso, uma vez que simplifica o processo enquanto reduzindo os custos. O meio de cultura usado para desenvolver as células também é adequado para uso na reação de bioconversão, desde que as condições de reação sejam ajustadas para facilitar a reação de bioconversão.

[0062] Os métodos de bioconversão da presente descrição são realizados sob condições de tempo, temperatura, pH e agente solubilizante, para prover a conversão da matéria prima homofarnesol em (-)-Ambrox. O pH da mistura de reação pode ser na faixa de 4-8, preferivelmente 5 a 6,5, mais preferivelmente 4,8-6,0 para as enzimas variantes de SHC, e na faixa de cerca de pH 5,0 a cerca de pH 7,0 para a enzima SHC tipo selvagem, e pode ser mantido pela adição de tampões à mistura de reação. Um tampão exemplar para este fim é um tampão de ácido cítrico. A temperatura preferida é entre cerca de 15 °C e cerca de 45 °C, preferivelmente cerca de 20 °C e cerca de 40 °C, embora ela possa ser mais elevada, até 55 °C para organismos termofílicos, especialmente se a enzima tipo selvagem de um microrganismo termofílico for usada. A temperatura pode ser mantida constante ou pode ser alterada durante o processo de bioconversão.

[0063] Os requerentes demonstraram que pode ser útil incluir um agente solubilizante (p.ex. um surfactante, detergente, intensificador de solubilidade, solvente orgânico miscível em água e similares) na reação de bioconversão. Exemplos de surfactantes incluem, mas não são limitados a Triton X-100, Tween 80, taurodesoxicolato, taurodesoxicolato de sódio, dodecil sulfato de sódio (SDS), e/ou lauril sulfato de sódio (SLS).

[0064] O requerente selecionou e identificou SDS como um agente solubilizante particularmente útil a partir de uma longa lista de outros agentes solubilizantes menos úteis. Em particular, o requerente identificou SDS como um agente solubilizante consideravelmente melhor do que, por exemplo, Triton X-100, em termos de velocidade de reação e produção para a reação de bioconversão de homofarnesol em (-)-Ambrox.

[0065] Sem desejarmos ficar presos à teoria, o uso de SDS com células hospedeiras microbianas recombinantes pode ser vantajoso, uma vez que o SDS pode interagir vantajosamente com a membrana da célula hospedeira a fim de tornar a enzima SHC (que é uma enzima ligada por membrana) mais acessível ao substrato de homofarnesol. Além disso, a inclusão de SDS em um nível adequado na mistura de reação pode melhorar as propriedades da emulsão (homofarnesol em água) e/ou melhorar o acesso do substrato de homofarnesol à enzima SHC dentro da célula hospedeira, enquanto ao mesmo tempo evitando a dilaceração (p.ex., desnaturação/inativação da SHC tipo selvagem ou enzima variante).

[0066] A concentração do agente solubilizante (p.ex., SDS) usado na reação de bioconversão é influenciada pela quantidade de biomassa e pela concentração do substrato (EEH). Isto é, há um grau de interdependência entre a concentração do agente solubilizante (p.ex., SDS), a quantidade de biomassa e a concentração do substrato (EEH). Por meio de exemplo, uma vez que a concentração do substrato de homofarnesol aumenta, quantidades suficientes de biocatalisador e agente solubilizante (p.ex., SDS) são requeridas para uma reação de bioconversão eficaz ocorrer. Se, por exemplo, a concentração do agente solubilizante (p.ex., SDS) for muito baixa, uma conversão de homofarnesol subótima pode ser observada. Por outro lado, se, por exemplo, a concentração de agente solubilizante (p.ex., SDS) for muito alta, então pode haver um risco de que o biocatalisador seja afetado através da ruptura da célula microbiana intacta e/ou uma desnaturação/inativação da enzima SHC/HAC.

[0067] A seleção de uma concentração adequada de SDS, no contexto da quantidade de biomassa e concentração de substrato (EEH), está dentro do conhecimento da pessoa habilidosa. Por meio de exemplo, um modelo preditivo está disponível à pessoa habilidosa para determinar as concentrações de SDS, substrato (EEH) e biomassa adequadas.

[0068] A temperatura da reação de bioconversão para uma enzima SHC tipo selvagem é de cerca de 45-60 °C, preferivelmente 55 °C.

[0069] A faixa de pH da reação de bioconversão para uma enzima SHC tipo selvagem é de cerca de 5,0 a 7,0, mais preferivelmente de cerca de 5,6 a cerca de 6,2, mesmo mais preferivelmente de cerca de 6,0.

[0070] A temperatura da reação de bioconversão para uma enzima variante de SHC é cerca de 34 °C a cerca de 50 °C, preferivelmente cerca de 35 °C.

[0071] O pH da reação de bioconversão para uma enzima variante de SHC é de cerca de 4,8-6,4, preferivelmente cerca de 5,2-6,0.

[0072] Preferivelmente, o agente solubilizante usado na reação de bioconversão é o SDS.

[0073] A relação [SDS]/[células] é na faixa de cerca de 10:1-20:1, preferivelmente de cerca de 15:1-18:1, preferivelmente cerca de 16:1, quando a relação de biocatalisador para homofarnesol EEH é de cerca de 2:1.

[0074] A concentração de SDS na reação de bioconversão para uma enzima variante de SHC é na faixa de cerca de 1-2 %, preferivelmente na faixa de cerca de 1,4-1,7 %, mesmo mais preferivelmente cerca de cerca de 1,5 %, quando a concentração de homofarnesol é de cerca de 125 g/l EEH e a concentração do biocatalisador é de 250 g/l (correspondendo a um OD de cerca de 175 (650 nm)).

[0075] A relação de biocatalisador para substrato de homofarnesol EEH é na faixa de cerca de 0,5:1-2:1, em algumas modalidades de 2:1, preferivelmente de cerca de 1:1 ou 0,5:1.

[0076] Em algumas modalidades, (-)-Ambrox é produzido usando- se um biocatalisador no qual o substrato de homofarnesol é adicionado. É possível adicionar o substrato por alimentação, empregando-se meios conhecidos (p.ex., bomba peristáltica, seringa de infusão e similares). Homofarnesol é um composto solúvel em óleo e é provido em um formato de óleo. Dado que o biocatalisador está presente em uma fase aquosa, a reação de bioconversão pode ser referida como um sistema de duas fases quando homofarnesol é adicionado à mistura de reação da bioconversão. Este é o caso mesmo quando um agente solubilizante (p.ex., SDS) está presente.

[0077] Outros detalhes de um processo de bioconversão adequado são descritos nos exemplos, fornecidos aqui abaixo.

[0078] O processo de bioconversão, de acordo com a presente invenção, produz uma mistura de reação contendo o (-)-Ambrox desejado, e também um número de subprodutos. Mais particularmente, a mistura de reação contém, além do (-)-Ambrox, uma mistura complexa de subprodutos, incluindo um isômero constitucional novo de (-)- Ambrox, de acordo com a Fórmula (II), bem como estereoisômeros conhecidos de (-)-Ambrox, de acordo com as Fórmulas (III) e (IV)

[0079] O requerente acredita, embora não pretenda ficar preso a qualquer teoria particular, que o composto de Fórmula (II) é formado por ciclização do isômero geométrico-7E,3Z de homofarnesol. Ele foi descrito como praticamente inodoro, com um limiar de detecção de > 500 ng/l.

[0080] Como citado acima, o requerente acredita que o composto de Fórmula (II) é uma nova molécula, e como tal, este composto forma um outro aspecto da presente invenção.

[0081] Ingredientes de perfume e composições de perfume consistindo de ou compreendendo o composto (II), bem como artigos perfumados contendo o mesmo, formam aspectos adicionais da invenção.

[0082] O uso do composto de fórmula (II) como um ingrediente de perfume em aplicações de perfumaria, tais como composições de perfumes finos ou de perfumes funcionais, tais como composições de cuidados pessoais, de cuidados domésticos e de cuidados com tecido, formam outros aspectos adicionais da invenção.

[0083] As misturas de (-)-Ambrox e uma quantidade olfatória aceitável de composto (II) forma ainda outro aspecto da presente invenção.

[0084] O termo "quantidade olfatória aceitável", quando usado aqui em relação ao composto de fórmula (II), ou qualquer um dos outros subprodutos (III) ou (IV), ou de fato, qualquer material que possa estar presente como uma impureza em (-)-Ambrox formado de acordo com um método da presente invenção, entende-se significar que o composto ou material está presente em uma mistura com (-)-Ambrox em uma quantidade abaixo de seu limiar de detecção de odor, ou em uma quantidade na qual não contribuirá com suas características olfatórias de modo a afetar o caráter olfatório de (-)-Ambrox. (-)-Ambrox contendo uma quantidade olfatória aceitável de qualquer tal composto ou material seria identificável a um perfumista habilidoso como possuindo o caráter de odor dos graus comerciais de (-)-Ambrox, tais como AMBROFIXTM, obtido por um procedimento sintético ex-sclareol, e disponível na Givaudan.

[0085] Nas modalidades preferidas da presente invenção, a mistura de reação não contém, ou substancialmente não, homofarnesol não reagido.

[0086] O requerente descobriu que homofarnesol era um solvente poderoso para (-)-Ambrox, bem como para os subprodutos mencionados acima no processo de bioconversão. Assim sendo, na presença de quantidades apreciáveis de homofarnesol, (-)-Ambrox e os subprodutos permanecem dissolvidos entre si em uma mistura bruta intratável, na qual é difícil, demorado e custoso separar e, finalmente, isolar (-)-Ambrox na forma olfativamente pura. Reduzir o nível de homofarnesol não reagido na mistura com (-)-Ambrox e os compostos (II), (III) e (IV) foi constatado consideravelmente facilitar o processamento e isolamento/purificação a jusante de (-)-Ambrox.

[0087] O processamento a jusante, que será observado por pessoas habilidosas na técnica, é uma operação crítica na manufatura de compostos úteis formados por processos de bioconversão. Como parte da síntese de um composto, pode afetar as propriedades físicas do mesmo. No caso da preparação de ingredientes de perfume por métodos de biotecnologia, é desejável que um composto alvo possa ser separado de uma mistura de reação na forma olfativamente pura, a fim de que as características de odor desejadas do composto alvo não sejam distorcidas por contribuições de odor da mistura complexa de contaminantes e subprodutos que podem estar presentes no meio de fermentação ou no biocatalisador.

[0088] Consequentemente, a invenção provê, em outro de seus aspectos, um método de isolar e purificar (-)-Ambrox de uma mistura de reação, compreendendo um ou mais dos compostos (II), (III) e (IV).

[0089] Em já outro aspecto da presente invenção, é provido um método de melhorar ou acentuar o odor de (-)-Ambrox, compreendendo as etapas de separação e purificação de (-)-Ambrox de uma mistura de reação contendo um ou mais dos compostos (II), (III) e (IV).

[0090] Em uma forma isolada e purificada, (-)-Ambrox não contém qualquer um dos compostos (II), (III) ou (IV), ou se contiver qualquer um de ditos compostos, então cada um deve estar presente em uma quantidade olfatória aceitável.

[0091] A mistura de reação obtida pelo processo de bioconversão, tal como um processo como descrito aqui acima, geralmente compreende uma fase sólida contendo (-)-Ambrox não refinado e um ou mais dos subprodutos (II), (III) e (IV), bem como material celular e/ou seus restos; e uma fase líquida ou fases líquidas compreendendo água e/ou qualquer homofarnesol não reagido.

[0092] A fase sólida pode ser separada da fase ou fases líquidas por filtração ou centrifugação. Além disso, selecionando-se um filtro com um tamanho de poro apropriado, também é possível efetuar separação do (-)-Ambrox não refinado, do material celular e/ou restos. Uma vez que o (-)-Ambrox não refinado é separado do material celular e/ou seus restos, ele pode ser lavado, antes de ser submetido a outros procedimentos de elaboração para isolar (-)-Ambrox dos compostos (II), (III) e (IV).

[0093] Alternativamente, em vez de filtração ou centrifugação, a mistura de reação pode ser aquecida a uma temperatura acima do ponto de fusão de (-)-Ambrox, em seguida, (-)-Ambrox forma uma fase de óleo acima de uma fase aquosa contendo o material celular e restos. Opcionalmente, e afim de garantir uma recuperação completa de (-)- Ambrox, o material aquoso e celular pode ser lavado com um solvente orgânico imiscível em água (tal como tolueno) para remover qualquer (- )-Ambrox residual que possa ter sido arrastado na fase aquosa, e estas lavagens podem ser combinadas com a fase de óleo. A fase de óleo pode, em seguida, ser concentrada por evaporação para prover uma mistura bruta compreendendo (-)-Ambrox e um ou mais dos compostos (II), (III) e (IV), cuja mistura pode então ser submetida a outros procedimentos de elaboração para isolar e purificar (-)-Ambrox.

[0094] Em outra modalidade, em vez de aquecer a mistura de reação para formar uma fase de óleo contendo (-)-Ambrox, a mistura de reação pode ser extraída com um solvente orgânico imiscível em água adequado (tal como tolueno) para formar uma fase orgânica contendo (-)-Ambrox e um ou mais dos compostos (II), (III) e (IV), que podem ser separados de uma fase aquosa contendo o material celular e restos. A fase orgânica pode ser concentrada por evaporação para prover uma mistura bruta compreendendo (-)-Ambrox e um ou mais dos compostos (II), (III) e (IV), que podem ser submetidos a outros procedimentos de elaboração para isolar e purificar (-)-Ambrox.

[0095] Em já outro método alternativo, a mistura de reação pode ser destilada por vapor para remover o destilado do material celular e restos. O destilado pode ser coletado como uma mistura bifásica, antes da fase de óleo da mistura bifásica, compreendendo uma mistura de (- )-Ambrox e um ou mais dos compostos (II), (III) e (IV), ser separada da fase aquosa e, em seguida, submetida a outros procedimentos de elaboração para isolar e purificar (-)-Ambrox.

[0096] Em uma modalidade particular da presente invenção, dito método de isolar e purificar (-)-Ambrox compreende a etapa de seletivamente cristalizar (-)-Ambrox a partir de uma mistura contendo um ou mais dos compostos (II), (III) e (IV).

[0097] A frase "seletivamente cristalizar" refere-se a uma etapa do processo pelo qual (-)-Ambrox é feito cristalizar a partir de um solvente, enquanto que os compostos (II), (III) e (IV) permanecem dissolvidos no solvente de cristalização, até tal ponto que o material cristalino isolado contenha somente (-)-Ambrox ou, se contiver qualquer um dos compostos (II), (III) e (IV), então eles estão presentes somente em quantidades olfatórias aceitáveis.

[0098] A cristalização pode ser realizada em um solvente orgânico adequado. A escolha de solvente é baseada em considerações, tais como diferenças de solubilidade em temperatura ambiente e em altas temperaturas, ou no solvente em ebulição; e para a necessidade de uma abundância de cristais recuperáveis no solvente frio. Geralmente, um composto a ser separado é dissolvido em um solvente relativamente polar e, em seguida, um solvente relativamente menos polar pode ser adicionado para trazer o composto dissolvido para seu limite de solubilidade, como consequência ele começará a cristalizar. Também, em um processo industrial, problemas de custos, bem como de segurança de manipulação, são relevantes. Os solventes adequados incluem, mas não são limitados a, metanol, acetona, éter de petróleo, hexano, t-butil metil éter, THF e acetato de etila. Os solventes preferidos incluem tolueno ou álcool etílico. Pares de solventes também podem ser empregados.

[0099] Em uma modalidade particularmente preferida da presente invenção, a cristalização seletiva é realizada dissolvendo-se a mistura contendo (-)-Ambrox e um ou mais dos compostos (II), (III) e (IV) em etanol quente e permitindo que (-)-Ambrox seletivamente cristalize adicionando-se lentamente um não solvente, tal como água, à solução etanólica esfriando.

[00100] Considerando-se a estreita relação estrutural de (-)-Ambrox e dos compostos (II), (III) e (IV) dos subprodutos, que são respectivamente um isômero constitucional e dois estereoisômeros de (-)-Ambrox, era notável que (-)-Ambrox poderia ser seletivamente cristalizado de uma tal mistura, para prover (-)-Ambrox na forma olfativamente pura e em altas produções. A pessoa habilidosa anteciparia razoavelmente que os compostos co-cristalizariam com (-)- Ambrox, tornando o processamento a jusante muito mais complexo, demorado e dispendioso do que foi constatado ser o caso.

[00101] A maneira surpreendentemente fácil em que (-)-Ambrox poderia ser separado de uma mistura contendo os compostos (II), (III) e/ou (IV) por cristalização representa uma vantagem particular da presente invenção.

[00102] A facilidade com o que (-)-Ambrox poderia ser separado por cristalização poderia ser contrastada com a observação de que (-)- Ambrox não poderia ser recuperado de tal maneira fácil e em tal alta produção a partir de uma mistura contendo (II), (III) e/ou (IV) por outras técnicas de purificação, tais como por destilação, devido aos pontos de ebulição muito similares de (-)-Ambrox e dos subprodutos (II), (III) e (IV).

[00103] O termo "olfativamente puro", quando é usado aqui em relação ao (-)-Ambrox, pretende significar que (-)-Ambrox é livre dos compostos (II), (III) ou (IV), ou de qualquer outro material encontrado na mistura de reação, ou que se tais compostos ou materiais estiverem presentes, eles estão presentes em quantidades olfatórias aceitáveis, conforme esse termo é definido aqui.

[00104] Em uma modalidade da invenção, (-)-Ambrox na forma olfativamente pura contém menos do que 5 % em peso de qualquer um dos compostos (II), (III) ou (IV).

[00105] Em modalidades mais particulares, (-)-Ambrox na forma olfativamente pura contém menos do que 4 %, menos do que 3 %, menos do que 2 %, menos do que 1 %, menos do que 0,9 %, menos do que 0,8 %, menos do que 0,7 %, menos do que 0,6 %, menos do que 0,5 %, menos do que 0,4 %, menos do que 0,3 %, menos do que 0,2 %, menos do que 0,1 %, ou menos do que 0,05 % em peso de cada um dos compostos (II), (III) e (IV).

[00106] A qualidade da separação de (-)-Ambrox da mistura dos compostos (II), (III) e/ou (IV) por cristalização seletiva pode ser influenciada pela composição da mistura da qual ele é separado. Mais particularmente, a qualidade da separação de (-)-Ambrox de uma mistura de compostos (II), (III) e/ou (IV) por cristalização foi melhorada quando a relação em peso de (-)-Ambrox com os outros compostos (II), (III) e (IV) na mistura era maior do que 70:30, mais particularmente de 80:20, mais particularmente de 90:10, ainda mais particularmente de 95:5, e mais particularmente ainda de 97:3.

[00107] Além disso, a qualidade da separação de (-)-Ambrox por cristalização pode ser influenciada pela quantidade de homofarnesol não reagido presente na mistura da qual ele é separado. Mais particularmente, a qualidade da separação é melhorada quando o nível de homofarnesol não reagido é menor do que 30 % em peso, mais particularmente menor do que 20 % em peso, mais particularmente menor do que 10 % em peso, mais particularmente ainda menor do que 5 % em peso, e ainda mais particularmente, menor do que 3 % em peso, ainda mais particularmente menor do que 2 % em peso, e mais particularmente ainda, menor do que 1 % em peso, com base no peso da mistura da qual (-)-Ambrox é cristalizado.

[00108] Preferivelmente, os reagentes e condições de reação empregados no processo de bioconversão da presente invenção são de modo que a reação prossiga com 100 % de conversão de homofarnesol, ou substancialmente assim, deixando assim o homofarnesol não reagido na mistura de reação. Entretanto, se homofarnesol não reagido estiver presente, embora economicamente desvantajoso, ele pode ser separado do (-)-Ambrox e de outros subprodutos por destilação, por exemplo.

[00109] Consequentemente, em uma modalidade particular da invenção, é provido um método de isolar e purificar (-)-Ambrox de uma mistura compreendendo um ou mais dos compostos (II), (III) e (IV), cuja mistura é livre, ou substancialmente livre, de homofarnesol.

[00110] Em uma modalidade mais particular, o isolamento e purificação de (-)-Ambrox, de uma mistura compreendendo um ou mais dos compostos (II), (III) e (IV) e livre ou substancialmente livre de homofarnesol, é obtida pela cristalização seletiva de (-)-Ambrox.

[00111] (-)-Ambrox, obtido de acordo com um método da presente invenção, é obtido na forma olfativamente pura. O (-)-Ambrox olfativamente puro forma outro aspecto da presente invenção.

[00112] O (-)-Ambrox na forma cristalina forma já outro aspecto da presente invenção.

[00113] O (-)-Ambrox formado de acordo com o método da presente invenção pode ser misturado com um ou mais ingredientes de perfume adicionais, para formar composições de perfume que encontram uso em aplicações de perfumaria, incluindo uso em perfumaria fina, bem como uso em produtos de consumo, tais como aplicações de cuidados pessoais, de cuidados com tecido, e de cuidados domésticos.

[00114] Consequentemente, a invenção provê, em outro de seus aspectos, uma composição de perfume compreendendo (-)-Ambrox e pelo menos um outro ingrediente de perfume, em que dita composição de perfume contém quantidades olfatórias aceitáveis de um ou mais dos compostos (II), (III) ou (IV).

[00115] A invenção será ainda ilustrada com referência aos seguintes exemplos.

EXEMPLOS EXEMPLO 1: PREPARAÇÃO DE HOMOFARNESOL Condições analíticas gerais:

[00116] GC/MS não polar: 50 °C / 2 min, 20 °C/ min 200 °C, 35 °C / min 270 °C. GC/MS Agilent 5975C MSD com sistema HP Série 7890A GC. Coluna não-polar: BPX5 de SGE, 5 % fenila, 95% dimetilpolissiloxano 0,22 mm x 0,25 mm x 12m. Gás veicular: Hélio. Temperatura do injetor: 230 °C. Divisão 1:50. Fluxo: 1,0 ml/min. Linha de transferência: 250 °C. MS-quadripolo: 106 °C. Fonte-MS: 230 °C

A) Preparação de MNU em THF

[00117] Uma solução de ureia (175 g, 2,9 mol) e cloridreto de metilamina (198 g, 2,9 mol) em água (400 mL) é aquecida ao refluxo (105 °C) por 3,5 h sob agitação. NaNO2 a 40 °C (101 g, 1,45 mol) dissolvido em água (200 mL) é adicionado. Após 15 min, THF (1000 mL) é adicionado, o que resulta em uma mistura de duas fases transparentes. H2SO4 conc. (110 g, 1,1 mol) é adicionado a 0 - 5 °C e agitado durante 1,5 h. Após mais 0,5 h a 0 - 5 °C, as duas fases transparentes são separadas a 25 °C. A fase orgânica (A) (1065 mL, teoricamente 1,35 M) é armazenada por alguns dias a 0 - 5 °C ou transferida imediatamente para o reator de ciclopropanação.

[00118] Após a separação de fase, a fase de água é extraída duas vezes com THF (2 x 1 l). Isto fornece 1100 mL de fase B e 1075 de fase C. Enquanto a fase A fornece 51 % de conversão de um alqueno terminal em um ciclopropano em uma subsequente reação de ciclopropanação, a fase B fornece < 0,5 % de ciclopropano, e a fase C não fornece conversão detectável. Concluiu-se que > 99 % MNU são extraídos após a primeira fase de separação. Geralmente, a fase de água é, portanto, descartada após a primeira separação de fase (da fase orgânica A), após tratamento com KOH aquoso conc. e ácido acético. B) Preparação de E-Δ-Farneseno usando MNU em THF

[00119] N-Metil-N-nitroso ureia 1,35 M em THF (136 mL, 184 mmol) é adicionada em gotas a 0 °C em uma mistura rapidamente agitada de E-beta-Farneseno (CAS 18794-84-8) (25 g, 122 mmol) e KOH aquoso (50 mL, 40 %) a 0 - 5 °C. Após a adição de 4 mL da solução de MNU, Pd(acac)2 (7,4 mg, 0,024 mmol, 0,02 %) é adicionado pré-dissolvido em 0,5 mL de diclorometano. A solução de MNU remanescente é adicionada durante 4 h a 0 - 5 °C. Um GC neste estágio mostrou 28 % de E-beta-Farneseno não convertido, 65 % de monociclopropano desejado (mostrado acima) e 3 % de um composto biciclopropanado 5. Após 16 h, ácido acético (100 mL) a 25 °C é adicionado a 0 - 5 °C, em seguida, terc-butil metil éter (250 mL). Após separação de fase, a fase orgânica é lavada com HCl 2M (250 mL) e a fase aquosa extraída com terc-butil metil éter (250 mL). As camadas orgânicas combinadas são lavadas com água (2 x 100 mL), 10 % de NaOH (2 x 100 mL) e água (2 x 100 mL), secadas sobre MgSO4, filtradas e concentradas, para fornecer 26,9 g de um líquido ligeiramente amarelo que contém 9 % de E-beta-Farneseno, 82 % do composto mono-ciclopropano desejado e 6 % de um produto secundário biciclopropanado.

[00120] O produto desejado poderia ser ainda isolado por purificação destilativa.

[00121] A adição de 1 g de K2CO3 (1 g) e destilação sobre uma coluna de aço em espiral de 30 cm a 40 - 60 mbar fornece 147 g de composto mono-ciclopropano (68 % corr) a 135 - 145 °C. As frações são agrupadas para fornecer 92 g de composto mono-ciclopropano com 100 % de pureza.

Dados analíticos de E-A-Fameseno:

[00122] 1H-RMN (CDCl3, 400 MHz): 5,1 (2 m, 2 H), 4,6 (2 H), 2,2 (2 H), 2,1 (4 H), 2,0 (2 H), 1,7 (s, 3 H), 1,6 (2 s, 6 H), 1,3 (1 H), 0,6 (2 H), 0,45 (2 H) ppm. 13C-RMN (CDCl3, 400 MHz): 150,9 (s), 135,1 (s), 131,2 (s), 124,4 (d), 124,1 (d), 106,0 (t), 39,7 (t), 35,9 (t), 26,7 (t), 25,7 (q), 17,7 (q), 16,0 (d), 6,0 (t) ppm. GC/MS: 218 (2%, M+), 203 (5%, [M - 15]+), 175 (11%), 147 (31%), 134 (15%), 133 (20%), 121 (12%), 107 (55%), 95 (16%), 93 (30%), 91 (20%), 82 (11%), 81 (33%), 79 (42%), 69 (100%), 67 (22%), 55 (20%), 53 (21%), 41 (75%). IR (filme): 3081 (w), 2967 (m), 2915 (m), 2854 (m), 1642 (m), 1439 (m), 1377 (m), 1107 (w), 1047 (w), 1018 (m), 875 (s), 819 (m), 629 (w). Anál. calc. para C16H26: C, 88,00; H, 12,00. Encontrado: C, 87,80; H, 12,01. C) Preparação de (7E)-4,8,12-trimetiltrideca-3,7,11-trien-1-ol ((7E)- homofarnesol)

[00123] Uma mistura de (E)-(6,10-dimetilundeca-1,5,9-trien-2- il)ciclopropano (E-Δ-Farneseno) (1 g, 4,6 mmol), dodecano (0,2 g, 1,15 mmol, padrão interno) e L-(+)-ácido tartárico (1 g, 6,9 mmol) em um tubo de pressão é aquecida sob agitação a 150 °C. Após 18 h e conversão completa (de acordo com GC), a mistura é vertida em água (50 mL) e tolueno (50 mL). As fases são separadas e a fase aquosa extraída com tolueno (50 mL). As camadas orgânicas combinadas são lavadas com Na2CO3 aquoso conc. (50 mL) e NaCl conc. (2 x 50 mL), secadas sobre MgSO4, filtradas e evaporadas sob pressão reduzida, para fornecer uma resina acastanhada (1,35 g), que é misturada com 30 % de KOH aquoso (4,3 mL) e agitada a 25 °C por 2 h. A análise GC revelou a formação de 96 % de (7E)-4,8,12-trimetiltrideca-3,7,11-trien-1-ol de acordo com o padrão interno. Relação E/Z 68:22. Os dados analíticos do isômero-E são consistentes com os da literatura, vide por exemplo, P. Kocienski, S. Wadman J. Org. Chem. 54, 1215 (1989).

EXEMPLO 2 PREPARAÇÃO DE PLASMÍDEO SHC E PRODUÇÃO DE BIOCATALISADOR Preparação de Plasmídeo SHC

[00124] O gene que codifica Esqualeno Hopeno Ciclase em Alicyclobacillus acidocaldarius (AacSHC) (GenBank M73834, Swissprot P33247) foi inserido no plasmídeo pET-28a(+), onde está sob o controle de um promotor-T7 induzível por IPTG para produção de proteína em Escherichia coli. O plasmídeo foi transformado em cepa E. coli BL21(DE3) empregando-se um protocolo-padrão de transformação com choque térmico.

Culturas em frasco de Erlenmeyer

[00125] Para produção de proteína foi utilizado meio rico (meio LB) ou meio mínimo. M9 é um exemplo de meio mínimo, que foi usado com êxito.

Preparação de meio

[00126] O meio mínimo escolhido como padrão foi preparado como a seguir para cultura de 350 mL: para 35 mL de ácido cítrico/estoque de fosfato (133g/l KH2PO4, 40g/l (NH4)2HPO4, 17g/g ácido cítrico.H2O com pH ajustado para 6,3) foram adicionados 307 mL de H2O, o pH ajustado para 6,8 com NaOH a 32 % conforme necessário. Após autoclavar 0,850 mL de MgSO4 a 50 %, 0,035 mL de solução de elementos traço (composição na próxima seção), 0,035 mL de solução de Tiamina, e 7 mL de glicose a 20 % foram adicionados.

Produção de biocatalisador SHC (produção de biocatalisador)

[00127] Produção de biocatalisador em pequena escala (SHC tipo selvagem ou variantes de SHC), 350 mL de cultura (meio suplementado com 50 μg/mL de canamicina) foram inoculados de uma pré-cultura de cepa E. coli BL21(DE3) contendo o plasmídeo de produção SHC. As células foram cultivadas em uma densidade óptica de aproximadamente 0,5 (OD650 nm) a 37 °C com constante agitação (250 rpm).

[00128] A produção de proteína foi em seguida induzida pela adição de IPTG em uma concentração de 300 μm, seguida por incubação por mais 5-6 horas com constante agitação. A biomassa resultante foi finalmente coletada por centrifugação, lavada com 50 mM de tampão Tris-HCl pH 7,5. As células foram armazenadas como pelotas a 4 °C ou 20 °C até outro uso. Em geral, 2,5 a 4 gramas de células (peso úmido) foram obtidos a partir de 1 litro de cultura, independentemente do meio utilizado.

[00129] A fermentação foi preparada e executada em reatores InforsHT de 750 mL. Ao vaso de fermentação foram adicionados 168 mL de água desionizada. O vaso de reação foi equipado com todas as sondas necessárias (pO2, pH, amostragem, antiespuma), alimentação C + N e frascos de hidróxido de sódio, e autoclavado. Após autoclavagem, os seguintes ingredientes foram adicionados ao reator: 20 mL 10x tampão fosfato/ácido cítrico 14 mL de glicose a 50 % 0,53 mL de solução de MgSO4 2 mL de solução de (NH4)2SO4 0,020 mL de solução de elementos traço 0,400 de solução de tiamina 0,200 mL de estoque de canamicina

[00130] As condições de reação são estabelecidas como a seguir: pH = 6,95, pO2 = 40 %, T = 30 °C, Agitação a 300 rpm. Cascata: rpm ponto de ajuste a 300, mín 300, máx 1000, fluxo l/min ponto de ajuste 0,1, mín 0, máx 0,6. Controle antiespuma: 1:9.

[00131] O fermentador foi inoculado de uma cultura de sementes com uma OD650nm de 0,4-0,5. Esta cultura de sementes foi cultivada em meio LB (+ canamicina) a 37 °C, 220 rpm por 8 horas. A fermentação foi executada primeiro em modo batelada por 11,5 h, onde em seguida foi iniciada a alimentação C + N com uma solução de alimentação (solução de glicose esterilizada (143 mL H2O + 35 g glicose) que foi adicionada após esterilização: 17,5 mL de solução de (NH4)2SO4, 1,8 mL de solução de MgSO4, 0,018 mL de solução de elementos traço, 0,360 mL de solução de Tiamina, 0,180 mL de estoque de canamicina. A alimentação foi executada em uma taxa de fluxo constante de aproximadamente 4,2 mL/h. Medições de glicose e NH4+ foram feitas externamente para avaliar a disponibilidade das fontes de C e N na cultura. Normalmente os níveis de glicose ficam muito baixos.

[00132] As culturas foram cultivadas por um total de aproximadamente 25 horas, onde atingiram tipicamente OD650nm de 4045. A produção SHC foi então iniciada adicionando-se IPTG em uma concentração final de aproximadamente 1mM no fermentador (como pulso IPTG ou durante um período de 3-4 horas com o uso de uma seringa de infusão), ajustando-se a temperatura para 40 °C e pO2 a 20 %. A indução de produção SHC permaneceu por 16 h a 40 °C. No fim da indução, as células foram coletadas por centrifugação, lavadas com tampão de ácido cítrico 0,1 M/citrato de sódio com pH 5,4 e armazenadas como pelotas a 4 °C ou 20 °C até outro uso.

Resultados Ia

[00133] Em geral, com todas as outras condições inalteradas, a atividade específica do biocatalisador produzido foi mais elevada quando um meio mínimo foi utilizado em comparação com um meio rico.

[00134] A indução foi realizada sucessivamente a 30 ou 37 °C. Notou-se que, quando a indução era feita a 40-43 °C, um biocatalisador de atividade específica mais elevada era obtido.

Resultados lb

[00135] A seguinte Tabela 1 mostra dois exemplos de volume de cultura, densidade óptica, e quantidade de células tanto no início da indução como no fim da indução, bem como a quantidade de biomassa coletada (peso líquido). TABELA 1

[00136] Sequência de aminoácidos em SHC tipo selvagem (SEQ ID No. 1) (GenBank M73834, Swissprot P33247) MAEQLVEAPAYARTLDRAVEYLLSCQKDEGYWWGPLLSNVTMEAEYVLLCHILDRVDRDRMEKIRRYLLHEQREDGTWALY PGGPPDLDTTIEAYVALKYIGMSRDEEPMQKALRFIQSQGGIESSRVFTRMWLALVGEYPWEKVPMVPPEIMFLGKRMPLN IYEFGSWARATVVALSIVMSRQPVFPLPERARVPELYETDVPPRRRGAKGGGGWIFDALDRALHGYQKLSVHPFRRAAEIR ALDWLLERQAGDGSWGGIQPPWFYALIALKILDMTQHPAFIKGWEGLELYGVELDYGGWMFQASISPVWDTGLAVLALRAA GLPADHDRLVKAGEWLLDRQITVPGDWAVKRPNLKPGGFAFQFDNVYYPDVDDTAVVVWALNTLRLPDERRRRDAMTKGFR WIVGMQSSNGGWGAYDVDNTSDLPNHIPFCDFGEVTDPPSEDVTAHVLECFGSFGYDDAWKVIRRAVEYLKREQKPDGSWF GRWGVNYLYGTGAVVSALKAVGIDTREPYIQKALDWVEQHQNPDGGWGEDCRSYEDPAYAGKGASTPSQTAWALMALIAGG RAESEAARRGVQYLVETQRPDGGWDEPYYTGTGFPGDFYLGYTMYRHVFPTLALGRYKQAIERR

[00137] Sequência de aminoácidos em SHC F601Y variante (SEQ ID No. 2) - variante com respeito à SEQ ID No. 1 MAEQLVEAPAYARTLDRAVEYLLSCQKDEGYWWGPLLSNVTMEAEYVLLCHILDRVDRDRMEKIRRYLLHEQREDGTWALY PGGPPDLDTTIEAYVALKYIGMSRDEEPMQKALRFIQSQGGIESSRVFTRMWLALVGEYPWEKVPMVPPEIMFLGKRMPLN IYEFGSWARATVVALSIVMSRQPVFPLPERARVPELYETDVPPRRRGAKGGGGWIFDALDRALHGYQKLSVHPFRRAAEIR ALDWLLERQAGDGSWGGIQPPWFYALIALKILDMTQHPAFIKGWEGLELYGVELDYGGWMFQASISPVWDTGLAVLALRAA GLPADHDRLVKAGEWLLDRQITVPGDWAVKRPNLKPGGFAFQFDNVYYPDVDDTAVVVWALNTLRLPDERRRRDAMTKGFR WIVGMQSSNGGWGAYDVDNTSDLPNHIPFCDFGEVTDPPSEDVTAHVLECFGSFGYDDAWKVIRRAVEYLKREQKPDGSWF GRWGVNYLYGTGAVVSALKAVGIDTREPYIQKALDWVEQHQNPDGGWGEDCRSYEDPAYAGKGASTPSQTAWALMALIAGG RAESEAARRGVQYLVETQRPDGGWDEPYYTGTGYPGDFYLGYTMYRHVFPTLALGRYKQAIERR

[00138] Sequência de nucleotídeos em SHC F605W variante (SEQ ID No. 3) ATGGCTGAGCAGTTGGTGGAAGCGCCGGCCTACGCGCGGACGCTGGATCGCGCGGTGGAGTATCTCCTCTCCTGCCAAAAG GACGAAGGCTACTGGTGGGGGCCGCTTCTGAGCAACGTCACGATGGAAGCGGAGTACGTCCTCTTGTGCCACATTCTCGAT CGCGTCGATCGGGATCGCATGGAGAAGATCCGGCGGTACCTGTTGCACGAGCAGCGCGAGGACGGCACGTGGGCCCTGTAC CCGGGTGGGCCGCCGGACCTCGACACGACCATCGAGGCGTACGTCGCGCTCAAGTATATCGGCATGTCGCGCGACGAGGAG CCGATGCAGAAGGCGCTCCGGTTCATTCAGAGCCAGGGCGGGATCGAGTCGTCGCGCGTGTTCACGCGGATGTGGCTGGCG CTGGTGGGAGAATATCCGTGGGAGAAGGTGCCCATGGTCCCGCCGGAGATCATGTTCCTCGGCAAGCGCATGCCGCTCAAC ATCTACGAGTTTGGCTCGTGGGCTCGGGCGACCGTCGTGGCGCTCTCGATTGTGATGAGCCGCCAGCCGGTGTTCCCGCTG CCCGAGCGGGCGCGCGTGCCCGAGCTGTACGAGACCGACGTGCCTCCGCGCCGGCGCGGTGCCAAGGGAGGGGGTGGGTGG ATCTTCGACGCGCTCGACCGGGCGCTGCACGGGTATCAGAAGCTGTCGGTGCACCCGTTCCGCCGCGCGGCCGAGATCCGC GCCTTGGACTGGTTGCTCGAGCGCCAGGCCGGAGACGGCAGCTGGGGCGGGATTCAGCCGCCTTGGTTTTACGCGCTCATC GCGCTCAAGATTCTCGACATGACGCAGCATCCGGCGTTCATCAAGGGCTGGGAAGGTCTAGAGCTGTACGGCGTGGAGCTG GATTACGGAGGATGGATGTTTCAGGCTTCCATCTCGCCGGTGTGGGACACGGGCCTCGCCGTGCTCGCGCTGCGCGCTGCG GGGCTTCCGGCCGATCACGACCGCTTGGTCAAGGCGGGCGAGTGGCTGTTGGACCGGCAGATCACGGTTCCGGGCGACTGG GCGGTGAAGCGCCCGAACCTCAAGCCGGGCGGGTTCGCGTTCCAGTTCGACAACGTGTACTACCCGGACGTGGACGACACG GCCGTCGTGGTGTGGGCGCTCAACACCCTGCGCTTGCCGGACGAGCGCCGCAGGCGGGACGCCATGACGAAGGGATTCCGC TGGATTGTCGGCATGCAGAGCTCGAACGGCGGTTGGGGCGCCTACGACGTCGACAACACGAGCGATCTCCCGAACCACATC CCGTTCTGCGACTTCGGCGAAGTGACCGATCCGCCGTCAGAGGACGTCACCGCCCACGTGCTCGAGTGTTTCGGCAGCTTC GGGTACGATGACGCCTGGAAGGTCATCCGGCGCGCGGTGGAATATCTCAAGCGGGAGCAGAAGCCGGACGGCAGCTGGTTC GGTCGTTGGGGCGTCAATTACCTCTACGGCACGGGCGCGGTGGTGTCGGCGCTGAAGGCGGTCGGGATCGACACGCGCGAG CCGTACATTCAAAAGGCGCTCGACTGGGTCGAGCAGCATCAGAACCCGGACGGCGGCTGGGGCGAGGACTGCCGCTCGTAC GAGGATCCGGCGTACGCGGGTAAGGGCGCGAGCACCCCGTCGCAGACGGCCTGGGCGCTGATGGCGCTCATCGCGGGCGGC AGGGCGGAGTCCGAGGCCGCGCGCCGCGGCGTGCAATACCTCGTGGAGACGCAGCGCCCGGACGGCGGCTGGGATGAGCCG TACTACACCGGCACGGGCTTCCCAGGGGATTGGTACCTCGGCTACACCATGTACCGCCACGTGTTTCCGACGCTCGCGCTC GGCCGCTACAAGCAAGCCATCGAGCGCAGGTGA

[00139] Sequência de aminoácidos em SHC F605W variante (SEQ ID No. 4) - variante com respeito à SEQ ID No. 1 MAEQLVEAPAYARTLDRAVEYLLSCQKDEGYWWGPLLSNVTMEAEYVLLCHILDRVDRDRMEKIRRYLLHEQREDGTWALY PGGPPDLDTTIEAYVALKYIGMSRDEEPMQKALRFIQSQGGIESSRVFTRMWLALVGEYPWEKVPMVPPEIMFLGKRMPLN IYEFGSWARATVVALSIVMSRQPVFPLPERARVPELYETDVPPRRRGAKGGGGWIFDALDRALHGYQKLSVHPFRRAAEIR ALDWLLERQAGDGSWGGIQPPWFYALIALKILDMTQHPAFIKGWEGLELYGVELDYGGWMFQASISPVWDTGLAVLALRAA GLPADHDRLVKAGEWLLDRQITVPGDWAVKRPNLKPGGFAFQFDNVYYPDVDDTAVVVWALNTLRLPDERRRRDAMTKGFR WIVGMQSSNGGWGAYDVDNTSDLPNHIPFCDFGEVTDPPSEDVTAHVLECFGSFGYDDAWKVIRRAVEYLKREQKPDGSWF GRWGVNYLYGTGAVVSALKAVGIDTREPYIQKALDWVEQHQNPDGGWGEDCRSYEDPAYAGKGASTPSQTAWALMALIAGG RAESEAARRGVQYLVETQRPDGGWDEPYYTGTGFPGDWYLGYTMYRHVFPTLALGRYKQAIERR

EXEMPLO 3 BIOCONVERSÃO DA MISTURA DE 7E, 3E/Z-HOMOFARNESOL

[00140] A bioconversão foi realizada empregando-se as seguintes condições de reação:

[00141] A reação (150,1 g de volume total) executada em tampão de ácido cítrico 0,1 M/citrato de sódio com pH 5,4, em um fermentador InforsHT de 750 mL contendo 146 g/l totais de homofarnesol, usando um substrato de homofarnesol, que foi uma mistura de 7E,3E:7E,3Z de 86:14, 250 g/l células (formada de acordo com o método do Exemplo 2, fermentação) e 1,55 % SDS. A reação foi executada a 35 °C com constante agitação (900 rpm), controle de pH foi feito usando-se 10 a 40 % de ácido cítrico em água.

[00142] A mistura de reação foi submetida às etapas de isolamento e purificação como exposto no Exemplo 4 abaixo.

EXEMPLO 4 PROCEDIMENTO DE PROCESSAMENTO A JUSANTE

[00143] Uma mistura de reação formada pela bioconversão de 7E, 3E/Z-homofarnesol (86:14 3E:3Z) foi submetida à destilação por vapor. O destilado foi coletado como uma mistura bifásica. A fase orgânica foi retida e a fase aquosa descartada. A composição da fase orgânica foi analisada por GC e os resultados mostrados na Tabela 2 abaixo (vide "não refinado").

[00144] A fase orgânica foi então concentrada até secura. Etanol foi, em seguida, adicionado ao produto não refinado seco e a mistura aquecida até que o produto foi dissolvido. Água em temperatura ambiente foi lentamente adicionada e (-)-Ambrox cristalizou sob ocasional agitação e esfriamento em um banho de gelo.

[00145] A Tabela 1 mostra os resultados analíticos GC para o produto cristalizado. Os dados mostram um forte enriquecimento de (-)- Ambrox, com praticamente nenhum dos subprodutos (a), (b) ou (c) sendo encontrado na amostra cristalizada.

[00146] Deve-se observar que na Tabela 2, "a", "b" e "c" referem- se ao composto (II), composto (IV) e composto (III), respectivamente. "EZH" e "EEH" referem-se ao 7E,3Z-homofarnesol e 7E,3E- homofarnesol, respectivamente. TABELA 1

EXEMPLO 5 EXTRAÇÃO DA FASE SÓLIDA DO CALDO DE REAÇÃO:

[00147] Dado que (-)-Ambrox não é solúvel em água e não é liquido em temperaturas abaixo de aproximadamente 75 °C, estas propriedades foram tomadas como possíveis vantagens para extrair o produto da fase sólida da biotransformação usando-se solventes miscíveis em água (p.ex. etanol) e solventes imiscíveis em água (p.ex., tolueno).

[00148] 200 mL de caldo de reação foram centrifugados para separar o sólido da fase líquida (aquosa) (Sorvall GS3, 5000rpm, 10 min, 10 °C). Isto separou aproximadamente 80 mL de pelotas sólidas de aproximadamente 120 mL de fase líquida. A análise (Cromatografia gasosa) da fase aquosa após extração MTBE mostrou que ela não continha mais do que aproximadamente 0,3% do (-)-Ambrox inicialmente presente nos 200 mL de caldo de reação. Tolueno e etanol 99 % foram usados para extrair (-)-Ambrox da fase sólida.

EXTRAÇÃO DE TOLUENO:

[00149] 80 mL de fase sólida foram extraídos 6x com 45 mL de tolueno (aproximadamente % volume da fase sólida, vigorosa agitação por 30 s, centrifugação (Sorvall GS3, 5000rpm, 10 min, 10 °C). A fase de solvente foi analisada com GC por seu conteúdo de (-)-Ambrox. Acima de 99,5 % do (-)-Ambrox inicialmente presente no caldo de reação foram extraídos com 6 extrações, representando o volume de tolueno total de 1,35x o volume inicial do caldo de reação inteiro (200 mL) ou 3,4x o volume da fase sólida.

EXTRAÇÃO DE ETANOL:

[00150] 80 mL de fase sólida foram extraídos (Infors Multifors HT, 35 °C, 1000 rpm, 30 min) com aproximadamente 160 mL (2 vol.) etanol 99 %, seguido por centrifugação. (-)-Ambrox não cristalizou durante o procedimento de extração. Após 4 lavagens (total de 640 mL de etanol, isto é, 3,2x o volume inicial do caldo de reação inteiro ou 8x o volume da fase sólida), cerca de 99 % do (-)-Ambrox inicialmente presente no caldo de reação foram recuperados. Etanol suficiente é necessário na primeira etapa de extração para evitar a cristalização de (-)-Ambrox (solubilidade em etanol). Quando somente 1 ou % volume da fase sólida foi usado na primeira etapa de extração, uma pasta pegajosa foi obtida, que foi difícil manipular e (-)-Ambrox cristalizou como agulhas sobre a pelota durante centrifugação. A temperatura pareceu não ser o fator responsável por esta cristalização (extração e centrifugação testadas em temperatura ambiente e aproximadamente 35 °C-40 °C).

[00151] A concentração de (-)-Ambrox na fase de etanol, bem como a relação etanol/água da fase líquida (umidade residual da fase sólida) pareceram ser responsáveis pela formação de cristal. Foi, entretanto, observado que era possível reduzir o volume de etanol para 1 volume da fase sólida.

[00152] Visto que (-)-Ambrox não permanece na fase líquida em temperatura ambiente, ele se separa com a biomassa e pode ser extraído com um solvente orgânico (p.ex., um solvente miscível em água (p.ex., etanol) ou um solvente imiscível em água (p.ex., tolueno)). A etapa de centrifugação que separa o (-)-Ambrox na fase sólida da mistura de reação é vantajosa, porque reduz a quantidade de solvente necessária para extrair (-)-Ambrox.

EXEMPLO 6 ANÁLISE SENSORIAL

[00153] Finalidade: realizar uma análise sensorial de (-)-Ambrox e dos compostos (II), (III) e (IV), formados no material não refinado e no material cristalizado.

[00154] A biotransformação de E,E-homofarnesol resulta em (-)- Ambrox e composto (IV). A biotransformação de E,Z-homofarnesol resulta no composto de éter macrocíclico (II) e no composto epi-Ambrox (III).

[00155] Uma mistura de (-)-Ambrox não refinado compreende o (-)- Ambrox desejado, compostos (II), (III) e (IV) presentes em uma quantidade de 87,1 % em peso, 2,8 % em peso, 2,5 % em peso, e 7,6 % em peso, respectivamente.

[00156] Quando uma mistura de não refinado é seletivamente cristalizada (escala de lab), o material cristalizado tem os mesmos componentes que a mistura bruta, porém eles estão presentes em uma quantidade de 99,1 % em peso, 0,1 % em peso, 0,1 % em peso, e 0,7 % em peso, respectivamente.

[00157] Os Resultados Analíticos Sensoriais foram como a seguir: (-)-Ambrox: Limiar de Odor 0,2ng/l. Composto (IV): fraco, IsoE, de madeira, limiar de detecção- GC 5-10ng. Composto (II): "inodoro" (limiar-GC >500ng). Composto (III): limiar-GC cerca de 10x mais elevado do que (-)-Ambrox (aproximadamente 2ng).

[00158] A análise sensorial dos 3 subprodutos (compostos (II), (III) e (IV)) indica um odor mais fraco do que aquele de (-)-Ambrox. De fato, o odor de epi-ambrox (Composto III) é cerca de 10 vezes mais fraco do que o de (-)-Ambrox, sugerindo que é essencialmente inodoro.

EXEMPLO 7 RECUPERAÇÃO DE AMBROX POR EXTRAÇÃO DE VAPOR Pureza resultante do (-)-Ambrox não refinado (extraído por vapor) e cristalizado

[00159] A biotransformação de EE:EZ-homofarnesol 86:14 proveu uma mistura de reação que foi extraída por vapor. O destilado por vapor foi coletado como uma mistura bifásica. A fase orgânica foi retida e a fase aquosa descartada. A composição da fase orgânica foi analisada por GC e os resultados mostrados na Tabela abaixo (vide "não refinado"). A fase orgânica foi então concentrada até a secura. Etanol foi, em seguida, adicionado ao produto seco não refinado e a mistura aquecida até que o produto foi dissolvido. Água em temperatura ambiente é lentamente adicionada e (-)-Ambrox cristaliza sob ocasional agitação e esfriamento em um banho de gelo.

[00160] Dados arrumados em Tabela também mostram os resultados analíticos GC para os produtos obtidos após a etapa de extração/destilação de vapor ("não refinado") e o produto cristalizado ((-)-Ambrox). As referências na Tabela a "EZH" e "EEH" referem-se ao (3Z,7E)-homofarnesol e 7E,3E-homofarnesol, respectivamente.

[00161] Os dados arrumados na Tabela abaixo indicam que o particular material de partida (EEH:EZH 86:14) produz o desejado produto final (-)-Ambrox e uma mistura muito específica de subprodutos (II, IV e III) usando a enzima SHC WT ou um derivativo de SHC. Os dados para a cristalização seletiva mostram um forte enriquecimento de (-)-Ambrox, com praticamente nenhum subproduto (II), (IV) ou (III) sendo encontrado na amostra cristalizada. Consequentemente, esta mistura EE:EZ provê um produto (-)-Ambrox olfativamente puro, que é seletivamente cristalizado em uma matéria relativamente simples e com custo compensador. TABELA: mostra os resultados analíticos GC para o produto cristalizado.

[00162] A extração/filtração de vapor são métodos ambientalmente favoráveis para isolar (-)-Ambrox, porque oferecem um conveniente isolamento de (-)-Ambrox livre de solvente com uma associada inativação do biocatalisador.

[00163] O (-)-Ambrox produzido com a reação de bioconversão pode ser extraído utilizando-se o solvente da mistura de reação inteira (p.ex., usando um solvente imiscível em água ou por extração/destilação de vapor ou por filtração) ou da fase sólida (p.ex., usando um solvente miscível em água), empregando-se métodos que são conhecidos daqueles habilidosos na técnica.

Claims (10)

1. Método de isolamento e purificação de (-)-Ambrox, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de cristalizar seletivamente (-)-Ambrox de uma mistura de reação compreendendo um ou mais dos compostos (II), (III) e (IV)

2. Método de melhorar ou acentuar o odor de (-)-Ambrox, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de separar (-)- Ambrox de uma mistura compreendendo um ou mais dos compostos (II), (III) ou (IV)

por cristalização seletiva de (-)-Ambrox da mistura, de modo que, após a etapa de separação, (-)-Ambrox não contém nenhum, ou contenha somente quantidades olfatórias aceitáveis, dos compostos (II), (III) ou (IV).

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a mistura de reação é livre, ou é substancialmente livre, de homofarnesol.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o solvente de cristalização é selecionado do grupo consistindo em água, metanol, acetona, éter de petróleo, hexano, t-butil metil éter, THF, acetato de etila, etanol, tolueno, e suas misturas.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o solvente de cristalização é uma mistura de etanol e água.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a mistura de reação é formada como resultado de uma ciclização catalisada por enzima de homofarnesol, compreendendo uma mistura de isômeros geométricos de homofarnesol 7E,3E e 7E,3Z homofarnesol, em que a reação é realizada na presença de um microrganismo recombinante expressando o gene que codifica a enzima.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a mistura de reação de 7E,3E e 7E,3Z homofarnesol é enriquecida no isômero geométrico 7E,3E.

8. Método de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que a mistura de reação de 7E,3E e 7E,3Z homofarnesol consiste em 7E,3E e 7E,3Z homofarnesol e nenhum outro isômero geométrico de homofarnesol.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, caracterizado pelo fato de que a razão em peso do isômero 7E,3E para o isômero 7E,3Z é de pelo menos 80:20, e mais particularmente de pelo menos 90:10, e ainda mais particularmente de pelo menos 95:5.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 9, caracterizado pelo fato de que a enzima é uma esqualeno hopeno ciclase tipo selvagem ou uma variante da esqualeno hopeno ciclase tipo selvagem.