BR122024004207A2 - Processo para preparar (-)-ambrox ou sua mistura, produto de reação que compreende (-)-ambrox, processo para fabricar um produto que contém (-)-ambrox, fragrância ou cosmético ou produto para cuidados do consumidor, e uso de (-)-ambrox - Google Patents

Processo para preparar (-)-ambrox ou sua mistura, produto de reação que compreende (-)-ambrox, processo para fabricar um produto que contém (-)-ambrox, fragrância ou cosmético ou produto para cuidados do consumidor, e uso de (-)-ambrox Download PDF

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Eric Eichhorn
Boris Schilling
Denis Wahler
Laurent Fourage
Esther Locher
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Givaudan Sa
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Abstract

A presente invenção refere-se a derivados de SHC/HAC, sequências de aminoácidos compreendendo os derivados de SHC/HAC, sequências de nucleótidos codificando os derivados de SHC/HAC, vetores compreendendo as sequências de nucleótidos de codificação dos derivados de SHC/HAC, células hospedeiras recombinantes compreendendo as sequências de nucleotídeos de codificação dos derivados de SHC/HAC e aplicações de células hospedeiras recombinantes compreendendo os derivados de SHC/HAC ou as enzimas SHC/HAC TS em métodos para preparar o (-)-Ambrox e as enzimas SHC/HAC em métodos para preparar o (-)-Ambrox.

Description

Campo da Invenção
[001] A presente invenção refere-se às enzimas derivadas de Es- qualeno Hopeno Ciclase/Homofarnesol Ambrox Ciclase (SHC/HAC) que tenham sido modificadas no que dizem respeito a uma proteína de referência SHC/HAC, as sequências de aminoácidos compreendendo as enzimas derivadas de SHC/HAC, as sequências de nucleotídeos co-dificando os derivados de SHC/HAC, os vetores compreendendo as se-quências de nucleotídeos codificando os derivados de SHC/HAC e cé lulas hospedeiras recombinantes compreendendo as sequências de nu- cleotídeos codificando os derivados de SHC/HAC. A presente invenção se refere também aos meios para expressar funcionalmente as sequên cias de nucleotídeos que codificam os derivados de SHC/HAC e méto dos de utilização de microrganismos recombinantes compreendendo as sequências de nucleotídeos que codificam os derivados SHC/HAC e SHC/HAC do tipo selvagem para produzir o Ambrox, de preferência (-)- Ambrox.
Antecedentes da Invenção
[002] Esqualeno Hopeno ciclases (SHC, EC 5.4.99.17) são enzi mas procarióticas ligadas à membrana que agem como biocatalisadores para a ciclização do esqualeno triterpenoide linear para hopeno e hopa nol. Trabalhos com SHC anteriores focalizaram na caracterização da SHC da bactéria termofílica e acidofílica Alicyclobacillus acidocaldarius (conhecida antigamente como Bacillus acidocaldarius antigo) (Ver Neumann & Simon 1986, Biol Chem Hoppe-Seyler 367, 723-729; Sec- kler & Poralla 1986, Biochem Biophys Act 356-363 e Ochs et al. 1990, J Bacteriol 174, 298-302). No entanto, mais recentemente, outras SHCs de mobilisZymomonas mobilis e Bradyrhizobium japonicum foram puri ficadas e caracterizadas em termos de seus substratos naturais (por exemplo, esqualeno) e não-naturais (por exemplo, homofarnesol e ci tral) (ver, por exemplo, WO 2010/139710, WO 2012/066059 e Seitz et al. 2012, J. Molecular Catalysis B: Enzymatic 84, 72-77).
[003] Trabalhos anteriores por Neumann e Simon (1986 - como ci tado acima) divulgaram que o homofarnesol é um substrato adicional para SHC de Alicyclobacillus acidocaldarius (AacSHC). No entanto, a taxa de ciclização do homofarnesol não-natural pela AacSHC purificada ensinada por Neumann e Simon (1986) foi relatada em apenas 3% da taxa de ciclização para o substrato natural esqualeno. A taxa de forma ção do Ambrox (produto 2b) aumentou com a concentração do homo farnesol (produto 1b) de 0,25 mM a 2,0 mM e diminuiu ligeiramente na presença de 4 mM do produto 1b. A diferença de taxas de ciclização pode ser atribuída em parte ao fato de que o substrato natural de SHC esqualeno é duas vezes o tamanho (um composto de carbono C30) do homofarnesol não-natural que é um composto de carbono C16.
[004] (JP2009060799 - Kao) divulga também um método para pro duzir o Ambrox a partir de homofarnesol usando um SHC de A. acido- cadarius. Embora JP2009060799 ensine a possibilidade do uso de mi-croorganismos compreendendo SHC para a síntese de Ambrox, JP2009 060799 apenas divulga a produção de Ambrox a partir de homofarnesol usando um extrato líquido de SHC preparado a partir de um microorga-nismo recombinante expressando o gene de SHC e não por meio de células microbianas recombinantes inteiras expressando o gene de SHC. A porcentagem de conversão de homofarnesol para Ambrox usando um extrato líquido de SHC foi relatada como 17,5% quando executada a uma temperatura de 60°C por 14 horas em pH 6,4-7,0 mas apenas como 6,8% quando executada em um pH de 6,6. A porcentagem de conversão de 3E,7E-homofarnesol para Ambrox usando um extrato líquido de SHC a 60°C a um pH 5,6 por 64 horas foi relatada como 63% quando uma concentração do substrato homofarnesol a 0,2% (2 g/l) é usada.
[005] WO 2010/139719A2 e seu equivalente dos EUA (US2012/ 0135477A1) descreve pelo menos três extratos de enzima SHC com homofarnesol para a atividade da Ambrox ciclase. As enzimas SHC da mobilisZymomonas mobilis (Zmo) e SHC da Bradyrhizobium japonicum (Bjp) são relatadas para mostrar taxas de conversão de homofarnesol de 41% a 16 h de reação e 22% respectivamente quando uma concen tração de homofarnesol de 10mM (2,36g/l) foi utilizada enquanto a taxa de conversão para AacSHC foi relatada como sendo apenas de 1,2% (presumivelmente na mesma concentração de homofarnesol) mas não são fornecidos detalhes experimentais. Os extratos das enzimas ZmoSHC e BjpSHC foram preparados a partir de um microrganismo re- combinante expressando o gene de SHC ao interromper as células hos pedeiras de E. coli produzindo as enzimas de SHC e separando as fra ções de SHC solúveis.
[006] Seitz et al (2012 - como citado acima) relatam sobre a ex pressão funcional e caracterização bioquímica de três enzimas de SHC, duas de Z. mobilis (ZmoSHC1 e ZmoSHC2) e uma de A. acidocaldarius. É relatado que uma conversão "eficiente" (22,95%) de homofarnesol para Ambrox foi observada utilizando a ZmoSHC1 do tipo selvagem com nenhuma conversão de homofarnesol para Ambrox usando a ZmoSHC2 do tipo selvagem e um nível relativamente baixo de conversão (3,4%) de homofarnesol para Ambrox para AacSHC foi encontrado quando uma concentração de 10mM de homofarnesol (2,36g/l) foi utilizada. A tendência observada para a relativamente baixa conversão de homofarnesol para Ambrox para AacSHC foi de acordo com os resulta dos de Neumann e Simon (1986 - como citado acima) e conforme divul gado em WO 2010/139719A2 como também discutida acima. As três enzimas SHC foram usadas em um formato de suspensão de células (através de ruptura parcial de células hospedeiras de E. coli usando ci clos de congelamento-descongelamento) e como frações ligadas a membrana parcialmente purificada.
[007] WO2012/066059 divulga mutantes com atividade de ciclase e a utilização das mesmas em um método para a ciclização biocatalítica de terpenos, como, em particular, para produzir isopulegol pela cicliza- ção de citronelal; para um método de produção de mentol e métodos para a conversão biocatalítica de outros compostos com motivos estru turais do tipo terpeno. O alinhamento da sequência de vários SHCs identificou a fenilalanina-486 (F486) como um resíduo de aminoácido fortemente conservado e uma série de variantes de substituição foram gerados na enzima SHC de mobilisZymomonas mobilis. Algumas des sas substituições levaram à perda de atividade, enquanto outras resul taram na formação de novos produtos terpenoides (isopulegols) de substratos de terpeno como citronelal.
[008] Um relatório em uma tese de doutoramento por Seitz (http://elib.uni-stuttgart.de/handle/11682/1400) em 2012 indica que uma mutação F486Y em ZmoSHC1 forneceu a diminuição da taxa de bio- transformação de homofarnesol de cerca de 1,5 vezes de 34,8% (ZmoSHC1 do tipo selvagem) para 23,9% (mutante ZmoSHC1 F486Y). Quando a mutação equivalente (Y420C) em Aac-SHC foi testada, foi presumido que a atividade enzimática em direção aos substratos maio res diminuiria e a atividade em direção aos substratos menores aumen taria. Quando o mutante foi testado nas mesmas condições que o tipo selvagem e as atividades enzimáticas foram comparadas, foi observado que o mutante não mostrou qualquer conversão do substrato homofarnesol. Por conseguinte, concluiu-se que o resíduo de aminoá- cido Y420 foi crucial para a atividade de AacSHC para todos os subs tratos.
[009] Outros estudos de mutagênese sítio-dirigida de SHC na téc nica (por exemplo, Hoshino e Sato 2002, Chem Commun 291-301) es-tavam focalizados sobre o efeito de mutações em regiões altamente conservadoras (por exemplo, F601) e seu efeito sobre substratos natu rais (ou seja, esqualeno ou análogos de esqualeno) em vez de em subs-tratosnão naturais como homofarnesol.
[0010] Em resumo, as divulgações limitadas na técnica que se refe rem aos processos de bioconversão para a conversão bem-sucedida de homofarnesol em Ambrox só se referem a concentrações relativamente baixas/volumes de substrato homofarnesol (na faixa de concentração de 0,25 mM a 2mM a 10mM ou cerca de 0,06g/l para 2,36g/l) usando um polipeptídeo de SHC do tipo selvagem com a atividade de uma ho- mofarnesol-Ambrox-ciclase (HAC). As enzimas SHC com atividade de HAC foram: (I) Os extratos líquidos que foram preparados ao interrom per as células hospedeiras de E. coli compreendendo as enzimas SHC e separando as frações líquida insolúveis e solúveis de SHC; (ii) frações de membrana parcialmente purificadas; ou (iii) células inteiras recombi- nantes expressando o gene de SHC do tipo selvagem e produzindo a enzima SHC para uso em reações para bioconversão de homofarnesol para Ambrox usando agentes solubilizantes incluindo: (i) o Triton X-100 na mistura de reação (consultar Neumann e Simon 1986 como citado acima, Seitz et al. 2012 como citado acima, JP2009060799); ou (ii) tau- rodeoxicolato (conforme divulgado em US2012/0135477A1).
[0011] Usando esses extratos de SHC do tipo selvagem e/ou célu las microbianas recombinantes inteiras expressando o gene de SHC, as taxas de conversão de homofarnesol para Ambrox obtidas foram encon-tradas para variar dependendo da origem da enzima SHC, da quantidade do material de partida homofarnesol bem como das condi ções de reação utilizadas. Até agora, 100% de conversão de homofar nesol para Ambrox usando uma enzima de SHC do tipo selvagem não foi alcançada nas concentrações envolvidas relatadas (0,06-2,36g/l). Além disso, as investigações preliminares usando derivados de SHC preparados usando estudos de mutagênese sítio-dirigida têm fornecido apenas resultados negativos (ou seja, taxas de conversão de homofar nesol reduzidas) em vez de positivos (ou seja, taxas de conversão me lhoradas).Além disso, apenas extratos de enzima SHC purificados ou frações ligadas a membrana SHC têm sido utilizadas em estudos publi cados ou células microbianas recombinantes inteiras expressando o gene de SHC do tipo selvagem sob determinadas condições de reação que utilizam agentes solubilizantes como Triton X-100 ou taurodeoxico- lato. Não há demonstração de que um microrganismo recombinante compreendendo quer um SHC do tipo selvagem ou mutante poderá for necer uma bioconversão mais e eficaz e de baixo custo de homofarnesol para Ambrox de usando condições de reação optimizadas. Por conse guinte,é desejável melhorar os processos conhecidos citados para pre parar Ambrox a partir de homofarnesol por ao menos melhorar a veloci dade de reação, especificidade, rendimento, produtividade e redução de custos (por exemplo, simplificando o processo usando células microbi anas total recombinantes ou através de um processo de "um recipiente" combinando produção biocatalisadora e etapas de bioconversão).
Sumário da Invenção
[0012] A presente invenção em vários aspectos fornece derivados de SHC/HAC, sequências de aminoácidos compreendendo as enzimas derivadas de SHC/HAC, sequências de nucleotídeos codificando as en-zimas derivadas de SHC/HAC, vetores compreendendo as sequências de nucleotídeos codificando as enzimas derivadas de SHC/HAC, célu las hospedeiras recombinantes compreendendo os vetores com sequências de nucleotídeos codificando as enzimas derivadas de SHC/HAC e aplicações de células hospedeiras recombinantes compre-endendo enzimas derivadas de SHC/ HAC ou enzimas SHC/HAC do tipo selvagem quando utilizadas sob condições de reação específica em métodos para preparar materiais Ambrox compreendendo o isômero Ambrox designado (-)-Ambrox e Ambrox como moléculas (como sub-produtos). Ao contrário das divulgações na técnica em relação à AacSHC, o requerente tem demonstrado pela primeira vez que o mi crorganismo recombinante inteiro expressando um gene derivado de SHC pode ser usado para a bioconversão de homofarnesol para Am- brox. Além disso, um microrganismo recombinante inteiro expressando um gene SHC do tipo selvagem e/ou produzindo enzimas SHC pode ser usado para a bioconversão de homofarnesol para Ambrox sob con dições de reação específica não divulgadas na técnica.
[0013] Também tem sido surpreendentemente encontrado que a in trodução de até cinco alterações de aminoácidos na sequência de ami- noácidos da sequência de referência da SHC/HAC do tipo selvagem conforme divulgado aqui leva a enzimas derivadas de SHC/HAC com taxas de conversão significativamente melhoradas de homofarnesol para Ambrox em comparação com as enzimas SHC de referência inal teradas como divulgadas aqui. Estas novas enzimas SHC/HAC deriva dassão úteis por si só e em combinação para a produção de materiais de Ambrox, em particular (-)-Ambrox a partir de substratos de homofar nesol.
[0014] Uma constatação surpreendente adicional é que além de um mutante (F601Y), as enzimas SHC derivadas como aqui divulgadas nor-malmente compreendem substituições não-conservadoras nas posi ções de resíduos de aminoácido na parte não-conservadora da sequên cia de polipeptídeo de SHC de referência. Esta constatação inesperada como mudanças na região conservadora de uma enzima é mais susceptível de perturbar a função de uma enzima (pelo menos no que diz respeito ao seu substrato natural) do que as mudanças em uma re gião não conservadora de uma proteína.
[0015] Uma constatação ainda mais surpreendente é que as enzi mas derivadas de SHC caracterizadas da presente divulgação apresen tam desempenho ideal (em um substrato não-natural como homofarne sol) a cerca 35OC em vez de cerca de 60oC que é a temperatura de reação habitual para microrganismos termofílicos como AacSHC. A apli cação de derivados de SHC da presente divulgação nos métodos de preparação de Ambrox a partir de homofarnesol em temperaturas de reação inferior tem importantes vantagens em termos de custos para o ciclo de produção de Ambrox em uma escala industrial.
[0016] Outra vantagem da presente invenção é que as enzimas de rivadas de SHC da presente divulgação catalisa um eficiente processo de bioconversão que quando otimizado com concentração de substrato de homofarnesol relativamente alta (por exemplo, cerca de cinquenta vezes) comparada às concentrações anteriormente descritas na técnica anterior (por exemplo, EEH a 125g/l) pode levar a 100% de conversão do substrato homofarnesol enquanto a proteína SHC do tipo selvagem de referência converte apenas cerca de 10% do mesmo substrato até a uma concentração elevada de enzima/células. As divulgações na téc nica anterior citada todas se referem a utilização de extratos de mem brana purificada composta por SHC ou extratos purificados de SHC (preparados a partir de microrganismos expressando genes de SHC) ou a utilização de microrganismos recombinantes expressando o gene de SHC do tipo selvagem sob determinadas condições de reação de bio- conversão (por exemplo, usando agentes solubilizantes específicos). Mesmo assim, uma conversão de 100% de homofarnesol em concen tração de EEH muito menor não é relatada. Também uma reação em "um recipiente" onde em a uma primeira etapa as células recombinantes crescem e produzem a enzima SHC e posteriormente convertem EEH para (-)-Ambrox no mesmo recipiente não tem sido relatada. Uma outra vantagem da presente invenção é que as células hospedeiras recombi- nantes produzindo as enzimas derivadas de SHC mostram taxas de re-ação inicial elevadas que permitem a produção de uma grande quanti dade de produto dentro de um período relativamente curto de tempo enquanto usando apenas quantidades relativamente pequenas do bio- catalisador. Em resumo, a seleção e a expressão eficaz e aplicação de microrganismos recombinantes compreendendo SHC/HAC do tipo sel-vagem ou enzimas derivadas de SHC/HAC específicas sob determina-dascondições de reação de bioconversão leva a um processo de bio- conversão mais eficiente. O produto final ((-)-Ambrox) pode ser sepa rado e facilmente purificado. Ao contrário da técnica citada, as enzimas derivadas de SHC/HAC não são utilizadas como uma enzima pura, mas são usadas em um contexto de células inteiras (como o biocatalisador) que é uma forma mais eficaz em termos de custos e uma abordagem do usuário e mais ambientalmente amigável uma vez que nenhuma pu-rificação da enzima adicional e etapas de isolamento são necessárias.
[0017] Em resumo, a presente divulgação fornece um método para a bioconversão/biotransformação para produzir o Ambrox em uma cepa microbiana recombinantes que é: (i) economicamente atraente, (ii) am-bientalmenteamigável e (iii) leva à produção seletiva de (-)-Ambrox como um composto predominante que sob condições de cristalização seletiva é efetivamente separada de outros subprodutos que não contri buem para a qualidade olfativa do produto final.
Descrição Detalhada da Invenção
[0018] Conforme usado aqui, o termo "SHC" significa uma enzima Esqualeno Hopeno Ciclase a partir de qualquer uma das fontes listadas nas Tabelas 10-12. Em modalidades preferidas, o termo SHC inclui as enzimas SHC de mobilisZymomonas mobilis e as enzimas SHC de Alicyclobacillus acidocaldarius conforme divulgado em BASF WO 2010/139719, US2012/01345477A1, Seitz et al (2012 como citado acima) e Seitz (2012 a tese de doutorado, como citado acima). Para facilidade de referência, a designação "AacSHC"é usada para Alicyclo- bacillus acidocaldarius SHC e a designação "ZmoSHC"é usada para mobilisZymomonas mobilis SHC e a designação "BjpSHC"é usada para Bradyrhizobium japonicum SHC. A porcentagem de identidade de se-quência para estas sequências relativas a AacSHC do tipo selvagem e cada outra (que pode variar dependendo do algoritmo usado) é indicada nas Tabelas 18 e 19.
[0019] Um alinhamento de sequências da SHC do tipo selvagem preparado por Hoshino e Sato (2002 citado acima) indica que vários motivos foram detectados em todas as quatro sequências e consiste na sequência de núcleo Gln-X-X-X-gly-X-Trp que é encontrada seis vezes nas sequências de SHC de ambas Z. mobilis e A. acidocaldarius (Ver a Figura 3 de Reipen et al. 1995, Microbiology 141, 155-161). Hoshino e Sato (2002 citado acima) relataram aminoácidos aromáticos que são excepcionalmente abundantes em SHCs e que dois motivos caracterís-ticos foram observados em SHCs: um é um motivo QW representado por motivos de aminoácidos específicos [(K/R)(G/A)X2- 3(F/Y/W)(L/IV)3X3QX2-5GXW] e o alternativo é um motivo DXDDTA. Wendt et al (1997, Science 277, 1811-1815 e 1999, J mol Biol 286, 175-187) relataram sobre a análise de estrutura de raios X de SHC de A. acidocaldarius. O motivo DXDDTA parece correlacionar com o sítio ativo de SHC. Alinhamentos de sequência exemplares da técnica anterior mostram vários motivos recorrentes como fornecido na Figura 2 (a partir de Hoshino e Sato (2002 citado acima)) e Figura 3 (a partir da tese de doutorado de Seitz (2012)) aqui.
[0020] A proteína AacSHC de referência (ou do tipo selvagem) como utilizada aqui se refere à proteína AacSHC conforme divulgado em SEQ ID N°. 1. A enzima AacSHC de referência da presente divulga ção tem a atividade de uma homofarnesol Ambrox ciclase (HAC) útil na produção de derivados de Ambrox através de uma reação biocatalítica de SHC com um substrato homofarnesol. A principal reação da AacSHC de referência é a ciclisação de um substrato linear ou não linear como o homofarnesol para produzir Ambrox.
Ambrox
[0021] Conforme usado aqui, o termo "Ambrox" inclui (-)-Ambrox da fórmula (I), bem como (-)-Ambrox em forma estereoisomericamente pura ou em mistura com pelo menos uma ou mais das seguintes molé culas de fórmula (II), (IV) e/ou (III).
[0022] (-)-Ambrox é conhecido comercialmente como Ambrox (Fir- menich), Ambroxan (Henkel) Ambrofix (Givaudan), Amberlyn (Quest), Cetalox Laevo (Firmenich), Ambermor (Aromor) e/ou Éter Norambreno- lide (Pacific).
[0023] (-)-Ambrox é um composto de aroma importante industrial mente e tem sido utilizado na indústria de perfumaria durante um longo período de tempo. Os benefícios sensoriais especiais desejáveis de (- )-Ambrox provêm do estereoisômero (-) em vez de (+). O odor do este- reoisômero (-) é descrito como almíscar, lenhoso, quente ou âmbar en-quanto que o enantiômero de Ambrox (+) tem uma nota de odor relati-vamente fraco. O odor e os limiares de odor para produtos similares ao Ambrox também são diferentes. Enquanto diversos materiais enrique cidos com (-)-Ambrox estão disponíveis comercialmente, é desejável produzir materiais de (-)-Ambrox altamente enriquecidos, idealmente puro (-)-Ambrox.
Produção de (-)-Ambrox
[0024] (-)-Ambrox pode ser produzido a partir de sclareolide de acordo com o processo de produção como descrito abaixo. O esclareol é um produto extraído da planta natural sálvia esclareia. No entanto, porque um material de partida natural é utilizado nesse processo, exis tem problemas em potencial no qual envolve uma reação multi-estágio, sua operação é complicada, a quantidade e a estabilidade no forneci mento de material de partida podem não ser sempre satisfatórias e a reação pode não ser ambientalmente amigável porque um agente oxi dante como o ácido crômico ou um permanganato é usado na etapa de degradação oxidativa de esclareol (+).
[0025] O (-)-Ambrox também é sintetizado a partir homofarnesol uti lizando diferentes rotas. A título de exemplo, o homofarnesol pode ser obtido por brominação, cianatação e hidrolisação de nerolidol para pro duzir o ácido homofarnesílico, seguido de redução. Alternativamente, o homofarnesol pode ser obtido a partir de farnesol, cloreto de farnesil, beta-farneseno ou outros substratos. O beta-farneseno pode ser con vertido diretamente para E,E homofarnesol (EEH) ou indiretamente ao EEH via E,E homofarnesato que é então convertido para EEH. Uma vi são geral sobre a produção de (-)-Ambrox a partir de diferentes substra tos pode ser encontrada em US2012/0135477A1, WO 2010/139719, US2013.0273619A1, WO 2013/156398A1 e a tese de doutorado de Seitz (2012 como citado acima) e Schaefer 2011 (Chemie Unserer Zeit 45, 374-388).
[0026] Embora o homofarnesol possa se apresentar como uma mis tura de quatro isômeros, os isômeros (3Z,7Z), (3E, 7Z), (3Z,7E) e (3E,7E), parece a partir da literatura que o (-)-Ambrox é obtido apenas de homofarnesol (3E, 7E) (ver Neumann e Simon (1986) citado acima). Conforme usado aqui, uma referência ao homofarnesol (3E, 7E) é uma referência ao E,E homofarnesol que também é designado como EEH.
[0027] US2012/0135477A1 relata sobre a conversão de (3Z,7E) para (-)-Ambrox usando ZmoSHC (SEQ ID N°. 2) (ver Exemplos 2-4), mas de acordo com a divulgação de Schaefer (2011) (conforme citado acima), (7E, 3Z) é apenas convertido para 9b-epi-Ambrox (ou seja, com posto III) como descrito acima e não para (-)-Ambrox. Conforme usado aqui, uma referência ao homofarnesol (3Z, 7E) é uma referência ao E,Z- homofarnesol que também é designado como EZH.
[0028] Em algumas modalidades, preferencialmente o material de partida homofarnesol é constituído por uma mistura de (3E,7E) e (3Z,7E), denominado aqui uma mistura estereoisomérica EE:EZ (espe cialmente com referência aos Exemplos e à Tabela 20.
[0029] Uma mistura estereoisomérica EE:EZ de homofarnesol tem o número CAS de 35826-67-6.
[0030] Como os Exemplos demonstram (por exemplo, ver exemplos 5, 7, 9, 10, 11, 18, 19 e 20), em determinadas modalidades, a matéria prima/o material de partida homofarnesol é uma mistura de isômeros.
[0031] Por conseguinte, em algumas modalidades, o material de partida homofarnesol pode incluir igualmente uma mistura de quatro isômeros EE:EZ:ZZ:ZE que corresponde com (3E,7E) e (3Z,7E), (3Z,7Z e 3E,7Z).
[0032] Em algumas modalidades, preferencialmente o material de partida homofarnesol é selecionado a partir de um ou mais dos seguin tes grupos: [(3Z,7Z), (3E,7Z), (3Z,7E) e (3E,7E)], [(3Z,7E) e (3E,7E)], [(3Z,7E), (3E,7Z)] e/ou [(3E,7E) e (3E,7Z)].
[0033] Preferencialmente o material de partida homofarnesol é se lecionado a partir de um ou mais dos seguintes grupos: [(3E,7E), (3Z,7E)] e/ou [(3Z,7E), (3E,7E) e (3E,7Z)].
[0034] Por conseguinte, em certas modalidades, a razão entre EEH:EZH é de cerca de 100:00; 99:01; 98:02; 97:03; 96:04; 95:05; 94:06; 93:07; 92:08; 91:09; 90:10; 89:11; 88:12; 87:13; 86:14; 85:15; 84:16; 83:17; 82:18; 81:19; 80:20; 79:21; 78:22; 77:23; 76:24; 75:25; 74:26; 73:27; 72:28; 71:29; 70:30; 69:31; 68:32; 67:33; 66:34; 65:35; 64:36; 63:37; 62:38; 61:39; 60:40; 59:41; 58:42; 57:43; 56:44; 55:45; 54:46; 53:47; 52:48; 51:49; ou cerca de 50:50.
[0035] Em algumas modalidades, de preferência o material de par tida homofarnesol compreende >90% E,E-homofarnesol (EEH).
[0036] Em outras modalidades, o material de partida homofarnesol compreende uma razão entre o peso de EE:EZ de 86:14.
[0037] Em certas modalidades, o material de partida homofarnesol compreende uma razão entre o peso de EE:EZ de 80:20.
[0038] Em certas modalidades, o material de partida homofarnesol compreende uma razão entre o peso de EE:EZ de 70:30.
[0039] Em ainda outras modalidades, o material de partida ho mofarnesol compreende uma razão entre o peso de EE:EZ de 69:31.
[0040] Em algumas modalidades, o material de partida homofarne sol consiste em ou essencialmente em uma mistura de quatro isômeros EE:EZ:ZZ:ZE que corresponde com (3E,7E) e (3Z,7E), (3Z,7Z) e (3E,7Z).
[0041] Em algumas modalidades, preferencialmente o material de partida homofarnesol consiste em ou consiste essencialmente em uma mistura de isômeros selecionados a partir de um ou mais dos seguintes grupos: [(3Z,7Z), (3E,7Z), (3Z,7E) e (3E,7E)], [(3Z,7E) e (3E,7E)], [(3Z,7E), (3E,7Z)] e/ou [(3E,7E) e (3E,7Z)].
[0042] Preferencialmente, o material de partida homofarnesol con siste em ou consiste essencialmente em uma mistura de isômeros se-lecionados de um ou mais dos seguintes grupos: [(3E,7E), (3Z,7E)] e/ou [(3Z,7E), (3E,7E) e (3E,7Z)].
[0043] Por conseguinte, em certas modalidades, a razão entre os isômeros EEH:EZH consiste em ou consiste essencialmente em uma razão de EEH:EZH de cerca de 100:00; 99:01; 98:02; 97:03; 96:04; 95:05; 94:06; 93:07; 92:08; 91:09; 90:10; 89:11; 88:12; 87:13; 86:14; 85:15; 84:16; 83:17; 82:18; 81:19; 80:20; 79:21; 78:22; 77:23; 76:24; 75:25; 74:26; 73:27; 72:28; 71:29; 70:30; 69:31; 68:32; 67:33; 66:34; 65:35; 64:36; 63:37; 62:38; 61:39; 60:40; 59:41; 58:42; 57:43; 56:44; 55:45; 54:46; 53:47; 52:48; 51:49; ou cerca de 50:50.
[0044] Em algumas modalidades, de preferência o material de par tida homofarnesol consiste em ou consiste essencialmente em >90% E,E-homofarnesol (EEH).
[0045] Em outras modalidades, o material de partida homofarnesol consiste em ou consiste essencialmente em uma razão entre o peso de EE:EZ de 86:14.
[0046] Em certas modalidades, o material de partida homofarnesol consiste em ou consiste essencialmente em uma razão entre o peso de EE:EZ de 80:20.
[0047] Em certas modalidades, o material de partida homofarnesol consiste em ou consiste essencialmente em uma razão entre o peso de EE:EZ de 70:30.
[0048] Em ainda outras modalidades, o material de partida homofarnesol consiste em ou consiste essencialmente em uma razão entre o peso de EE:EZ de 69:31.
[0049] Em modalidades da presente divulgação, o Ambrox é produ zido utilizando uma enzima derivada de SHC/HAC.
[0050] Derivado de SHC/HAC
[0051] Conforme usado aqui, o termo "derivado de SHC/HAC"sig nifica que a sequência de aminoácidos do derivado de SHC/HAC é uma sequência modificada ou variante de aminoácidos que é alterada em comparação com a sequência de aminoácidos da sequência de SHC referência (ou tipo selvagem) de acordo com pelo menos SEQ ID N°. 1 ou SEQ ID N°. 2 ou SEQ ID N°. 3 ou SEQ ID N°. 4. Geralmente os deri vados de SHC/HAC compreendem formas alteradas de SHC tendo pelo menos uma alteração que modifica (por exemplo, aumenta) a atividade da enzima para o seu substrato (por exemplo, EEH).
[0052] Os derivados de SHC/HAC da presente divulgação são testa dos quanto à sua atividade para homofarnesol Ambrox ciclase. Por con-seguinte, estes derivados de SHC/HAC que convertem homofarnesol para Ambrox são referidos na presente invenção como derivados HAC bem como derivados SHC. Embora derivados de SHC/HAC exemplares foram fornecidos para enzimas derivadas de fontes de cepas microbianas de Alicyclobacillus acidocaldarius, mobilisZymomonas mobilis, Bradyrhi- zobium japonicum, a presente divulgação também abrange derivados equivalentes de SHC/HAC de outras fontes de cepas microbianas que incluem, mas não se limitam a, enzimas SHC/HAC provenientes de Me- thylococcus capsulatus, Frankia alni, Acetobacter pasteurianum e Te- trahymena pyriformis (ver, por exemplo, WO 2010/139719, US2012/01345477, WO 2012/066059 e Tabelas 10-12).
[0053] Conforme usado aqui, o termo "alteração de aminoácidos" significa a inserção de um ou mais aminoácidos entre dois aminoácidos, a deleção de um ou mais aminoácidos ou uma substituição (que pode ser conservadora ou não-conservadora) de um ou mais aminoácidos com um ou mais diferentes aminoácidos em relação à sequência de aminoácidos de uma sequência de aminoácidos de referência (como, por exemplo, a sequência de aminoácidos do tipo selvagem (TS) da SEQ ID N°. 1 ou SEQ ID N°. 2 ou SEQ ID N°. 3 ou SEQ ID N°. 4). As alterações de aminoácido podem ser facilmente identificadas por com paração das sequências de aminoácidos da sequência de aminoácidos derivados de SHC/HAC com a sequência de aminoácidos da sequência de aminoácidos de referência (como, por exemplo, a sequência de ami- noácidos do tipo selvagem (TS) da SEQ ID N°. 1 ou SEQ ID N°. 2 ou SEQ ID N°. 3 ou SEQ ID N°. 4). Os alinhamentos de sequência de ami- noácidos de SHC TS exemplares são fornecidos nas Figuras 1-4 e Ta belas 18 e 19.
[0054] As substituições de aminoácido conservadoras podem ser feitas, por exemplo, sobre a base ou semelhante na polaridade, carga, tamanho, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilidade e/ou natureza am- fipática dos resíduos de aminoácidos envolvidos. Os 20 aminoácidos de ocorrência natural como descrito acima podem ser agrupados nos seis grupos de aminoácidos padrão seguintes: (1) Hidrofóbico: Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) Hidrofílico neutro: Cys, Ser, Thr; Asn, Gln; (3) Ácido: Asp, Glu; (4) Básico: His, Lys, Arg; (5) Resíduos que influenciam a orientação da cadeia: Gly, Pro; e (6) Aromático: Trp, Tyr, Phe.
[0055] Consequentemente, como utilizado aqui, o termo "substitui ções conservadoras" significa uma troca de um aminoácido por outro aminoácido listado dentro do mesmo grupo de seis grupos de aminoá- cidos padrão mostrados acima. Por exemplo, a troca de Asp por Glu retém uma carga negativa no tão modificado polipeptídeo. Além disso, glicina e prolina podem ser substituídas uma pela outra com base na sua capacidade de perturbar as alfa-hélices. Algumas substituições con-servadoras preferidas dentro dos seis grupos acima são trocas dentro dos seguintes subgrupos: (i) Ala, Val, Leu e Ile; (ii) Ser e Thr; (ii) Asn e Gln; (iv) Lys e Arg; e (v) Tyr e Phe. Dada o código genético conhecido e técnicas de DNA recombinantes e sintéticas, o cientista qualificado fa-cilmente pode construir os DNAs que codificam as variantes do amino- ácido conservador.
[0056] Conforme usado aqui, "substituições não-conservadoras"ou "trocas de aminoácido não-conservadoras" são definidas como trocas de um aminoácido por outro aminoácido listado em um grupo diferente dos seis grupos de aminoácidos padrão (1) a (6) como mostrado acima. Normalmente os derivados de SHC/HAC da presente divulgação são preparados usando substituições não-conservadoras que alteram a fun ção biológica (por exemplo, atividade de HAC) dos derivados de SHC/HAC divulgados.
[0057] Para facilidade de referência, os símbolos de aminoácidos de uma letra recomendado pela Comissão de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB são indicados da seguinte forma. Os códigos de três letras também são fornecidos para fins de referência.
[0058] Alterações de aminoácidos como as substituições de amino- ácidos podem ser introduzidas utilizando protocolos conhecidos de tec-nologiagenética recombinante incluindo PCR, clonagem genética, mu- tagênese sítio-dirigida de cDNA, transfecção de células hospedeiras e transcrição in vitro que podem ser utilizadas para introduzir tais altera ções para a sequência de SHC TS resultando em uma enzima derivada de SHC/HAC. Os derivados podem então ser rastreados para a ativi dade funcional de SHC/HAC.
Enzimas derivadas de SHC/HAC
[0059] A presente invenção fornece um derivado de SHC/HAC e descreve uma enzima com atividade de homofarnesol Ambrox ciclase (HAC) que compreende uma sequência de aminoácidos que tem a partir de cerca de 1 a cerca de 50 mutações independentemente selecionadas de substituições, deleções ou inserções em relação à sequência de ami- noácidos da sequência referência (ou tipo selvagem) de SHC de acordo com pelo menos SEQ ID N°. 1 ou SEQ ID N°. 2 ou SEQ ID N°. 3 ou SEQ ID N°. 4.
[0060] Em várias modalidades, a mutação ou combinação de muta ções aumenta a atividade do derivado de SHC/HAC para converter homofarnesol para Ambrox comparado a enzimas SHC de referência que não mostram esta deleção/adição. Modelagem de proteínas como descrito aqui pode ser usada para orientar tais substituições, deleções ou inserções na sequência de referência de SHC. Por exemplo, um mo delo estrutural da sequência de aminoácidos de SHC pode ser criado usando as coordenadas para o AacSHC (como mostrado, por exemplo, nas Figuras 19 e 20). Como demonstrado aqui, tal modelo de homologia é útil para orientar a melhoria das enzimas SHC para a conversão de homofarnesol em (-)-Ambrox.
[0061] Assim, em várias modalidades, o derivado de SHC/HAC pode ter a partir de cerca de 1 a cerca de 45 mutações, cerca de 1 a cerca de 40 mutações, cerca de 1 a cerca de 35 mutações, cerca de 1 a cerca de 30 mutações, cerca de 1 a cerca de 25 mutações, de cerca de 1 a cerca de 20 mutações, cerca de 1 a cerca de 15 mutações, cerca de 1 a cerca de 10 mutações ou a partir de cerca de 1 a cerca de 5 mutações em relação à sequência de aminoácidos da sequência de re ferência (ou tipo selvagem) de SHC de acordo com pelo menos SEQ ID N°. 1 ou SEQ ID N°. 2 ou SEQ ID N°. 3 ou SEQ ID N°. 4.
[0062] Em várias modalidades, o derivado de SHC/HAC compre ende uma sequência tendo pelo menos 5 ou pelo menos 10 mutações em relação à sequência de aminoácidos da sequência de referência (ou tipo selvagem) de SHC de acordo com pelo menos SEQ ID N°. 1 ou SEQ ID N°. 2 ou SEQ ID N°. 3 ou SEQ ID N°. 4, mas não mais do que cerca de 20 ou 30 mutações. Em várias modalidades, os derivados de SHC podem ter cerca de uma mutação, cerca de duas mutações, cerca de 3 mutações, cerca de 4 mutações, cerca de 5 mutações, cerca de 6 mutações, cerca de 7 mutações, cerca de 8 mutações, cerca de 9 mu tações, cerca de 10 mutações, cerca de 11 mutações, cerca de 12 mu tações, cerca de 13 mutações, cerca de 14 mutações, cerca de 15 mu tações, cerca de 16 mutações, cerca de 17 mutações, cerca de 18 mutações, cerca de 19 mutações, cerca de 20 mutações, cerca de 21 mutações, cerca de 22 mutações, cerca de 23 mutações, cerca de 24 mutações, cerca de 25 mutações, cerca de 26 mutações, cerca de 27 mutações, cerca de 28 mutações, cerca de 29 mutações, cerca de 30 mutações, cerca de 31 mutações, cerca de 32 mutações, cerca de 33 mutações, cerca de 34 mutações, cerca de 35 mutações, cerca de 36 mutações, cerca de 37 mutações, cerca de 38 mutações, cerca de 39 mutações, cerca de 40 mutações, cerca de 41 mutações, cerca de 42 mutações, cerca de 43 mutações, cerca de 44 mutações, cerca de 45 mutações, cerca de 46 mutações, cerca de 47 mutações, cerca de 48 mutações, cerca de 49 mutações ou cerca de 50 mutações em relação à SHC de referência (como, por exemplo, SEQ ID N°. 1 ou 2 ou 3 ou 4).
[0063] Nestas ou em outras modalidades, o derivado de SHC/HAC pode incluir uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos cerca de 50% de identidade de sequência, pelo menos cerca de 55% de identi dade de sequência, pelo menos cerca de 60% de identidade de sequên cia, pelo menos cerca de 65% de identidade de sequência, pelo menos cerca de 70% de identidade de sequência, pelo menos cerca de 75% de identidade de sequência, pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência, pelo menos cerca de 85% de identidade de sequência, ou pelo menos 90% de identidade de sequência, ou pelo menos 91% de identidade de sequência, ou pelo menos 92% de identidade de sequên cia, ou pelo menos 93% de identidade de sequência, ou pelo menos 94% de identidade de sequência ou pelo menos 95% de identidade de sequência, ou pelo menos 96% de identidade de sequência ou pelo me nos 97% de identidade de sequência, ou pelo menos 98% de identidade de sequência ou pelo menos 99% de identidade de sequência, com SHC TS (como, por exemplo, SEQ ID N°. 1 ou SEQ ID N°. 2 ou SEQ ID N°. 3 ou SEQ ID N°. 4) ou entre as sequências de referência (ver, por exemplo, as Tabelas 18 e 19 onde pelo menos 34-52% de identidade entre AacSHC (SEQ ID N°.1) e outras sequências de SHC (por exemplo, ZmoSHC de WO2010/139719 é demonstrada).
[0064] Em várias modalidades, a variante de SHC tem maior ativi dade de conversão de homofarnesol para Ambrox do que a enzima do tipo selvagem, como uma maior produção de (-)-Ambrox mediante con tato com um substrato homofarnesol do que a enzima de tipo selvagem de referência (como, por exemplo, SEQ ID N°. 1 ou SEQ ID N°. 2 ou SEQ ID N°. 3 ou SEQ ID N°. 4).
[0065] Por exemplo, o derivado de SHC/HAC pode incluir uma se quência de aminoácidos tendo pelo menos: cerca de 50% de identidade, cerca de 51% de identidade, cerca de 52% de identidade, cerca de 53% de identidade, cerca de 54% de identidade, cerca de 55% de identidade, cerca de 56% de identidade, cerca de 57% de identidade, cerca de 58% de identidade, cerca de 59% de identidade, cerca de 60% de identidade, cerca de 61% de identidade, cerca de 62% de identidade, cerca de 63% de identidade, cerca de 64% de identidade, cerca de 65% de identidade, cerca de 66% de identidade, cerca de 67% de identidade, cerca de 68% de identidade, cerca de 69% de identidade, cerca de 70% de identidade, cerca de 71% de identidade, cerca de 72% de identidade, cerca de 73% de identidade, cerca de 74% de identidade, cerca de 75% de identidade, cerca de 76% de identidade, cerca de 77% de identidade, cerca de 78% de identidade, cerca de 79% de identidade, cerca de 80% de identidade, cerca de 81% de identidade, cerca de 82% de identidade, cerca de 83% de identidade, cerca de 84% de identidade, cerca de 85% de identidade, cerca de 86% de identidade, cerca de 87% de identidade, cerca de 88% de identidade, cerca de 89% de identidade, cerca de 90% de identidade, cerca de 91% de identidade de sequência, cerca de 92% de identidade de sequência, cerca de 93% de identidade de sequência, cerca de 94% de identidade de sequência, cerca de 95% de identidade de sequência, cerca de 96% de identidade de sequência, cerca de 97% de identidade de sequência, cerca de 98% de identidade de sequência, ou cerca de 99% de identidade de sequência com a SHC de referência (como, por exemplo, SEQ ID N°. 1 ou 2 ou 3 ou 4 ou entre as sequências de refe rência (ver, por exemplo, as Tabelas 18 e 19 onde pelo menos 34-52% de identidade entre AacSHC (SEQ ID N°.1) e outras sequências de SHC (por exemplo, ZmoSHC de WO 2010/139719) são demonstradas.
[0066] Vários derivados de SHC/HAC que foram testados para ati vidade da enzima SHC são listados em uma ou mais Tabelas de 1 a 9. Assim, em várias modalidades, o derivado de SHC/HAC pode ter pelo menos cerca de 1, pelo menos cerca de 2, pelo menos cerca de 3, pelo menos cerca de 4, pelo menos cerca de 5, pelo menos cerca de 6, pelo menos cerca de 7, pelo menos cerca de 8, pelo menos cerca de 9, ou pelo menos cerca de 10 mutações selecionadas a partir de uma ou mais Tabelas de 1 a 9. Em algumas modalidades, o derivado de SHC/HAC é um polipeptídeo de SHC modificado compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem até 4 mutações em relação à se quência de aminoácidos do tipo selvagem/ de referência de acordo com a SEQ ID N°. 1 e inclui pelo menos as substituições F2601Y ou M132R em combinação com pelo menos um ou mais de F129L e/ou I432T em relação a SEQ ID N°. 1 e opcionalmente compreende uma sequência líder apoiando a expressão e atividade em E. coli.
[0067] Em outras modalidades, o derivado de SHC/HAC é um poli- peptídeo de SHC modificado compreendendo uma sequência de ami- noácidos que tem até 8 mutações em relação à sequência de aminoá- cidos do tipo selvagem/ de referência de acordo com a SEQ ID N°. 1 (ou sua contraparte que é modificada para a expressão em E. coli) e com-preende uma ou mais alteração de um aminoácido na posição selecio nada do grupo consistindo nas posições 77, 92, 129, 132, 224, 432, 579, 601 e 605 em relação à SEQ ID N°. 1 onde o derivado de SHC/HAC tem uma atividade enzimática modificada (por exemplo, aumentada) em relação à SEQ ID N°. 1.
[0068] Em uma modalidade, o derivado de SHC compreende uma ou mais substituições selecionadas do grupo de mutantes consistindo em: T77X, I92X, F129X, M132X, A224X, I432X, Q579X, F601Y e F605W em relação a SEQ ID N°. 1 sendo que:
[0069] T77X tem X selecionado dentre: A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W ou Y.
[0070] I92X tem X selecionado dentre: A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W ou Y.
[0071] F129X tem X selecionado dentre: A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W ou Y.
[0072] M132X tem X selecionado dentre: A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W ou Y.
[0073] A224X tem X selecionado dentre: A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W ou Y.
[0074] I432X tem X selecionado dentre: A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W ou Y.
[0075] Q579X tem X selecionado dentre: A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W ou Y.
[0076] F601X tem X selecionado dentre: A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W ou Y.
[0077] F605X tem X selecionado dentre: A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W ou Y.
[0078] Em uma modalidade, o derivado de SHC compreende uma ou mais substituições selecionadas do grupo consistindo em: T77A, I92V, F129L, M132R, A224V, I432T, Q579H, F601Y e F605W em rela çãoa SEQ ID N°. 1.
[0079] Em outra modalidade, o derivado de SHC compreende uma ou mais substituições selecionadas do grupo consistindo em: S129X, V145X, F182X, Y185X, G282X, I498X, H646X e F698X em relação a SEQ ID N°. 2 sendo que:
[0080] S129X tem X selecionado dentre: A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W ou Y.
[0081] V145X tem X selecionado dentre: A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W ou Y.
[0082] F182X tem X selecionado dentre: A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W ou Y.
[0083] Y185X tem X selecionado dentre: A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W ou Y.
[0084] G282X tem X selecionado dentre: A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W ou Y.
[0085] I498X tem X selecionado dentre: A, B, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W ou Y.
[0086] H646X tem X selecionado dentre: A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W ou Y.
[0087] F668X tem X selecionado dentre: A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W ou Y.
[0088] F698X tem X selecionado dentre: A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W ou Y.
[0089] Em uma modalidade, o derivado de SHC compreende uma ou mais substituições selecionadas do grupo consistindo em: S129A, V145V, F182L, Y185R, G282V, I498T, H646H, F668Y e F698X em re lação a SEQ ID N°. 2, como estabelecido na Tabela 2.
[0090] Em uma outra modalidade, o derivado de SHC compreende uma ou mais substituições selecionadas do grupo consistindo em: G85X, V100X, F137X, I140X, V233X, I450X, N598X, F620X e F624X em relação a SEQ ID N°. 3 sendo que:
[0091] G85X tem X selecionado dentre: A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W ou Y.
[0092] V100X tem X selecionado dentre: A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W ou Y.
[0093] F137X tem X selecionado dentre: A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W ou Y.
[0094] I140X tem X selecionado dentre: A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W ou Y.
[0095] V233X tem X selecionado dentre: A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W ou Y.
[0096] I450X tem X selecionado dentre: A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W ou Y.
[0097] N598X tem X selecionado dentre: A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W ou Y.
[0098] F620X tem X selecionado dentre: A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W ou Y.
[0099] F624X tem X selecionado dentre: A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W ou Y.
[00100] Em uma modalidade, o derivado de SHC compreende uma ou mais substituições selecionadas do grupo consistindo em: G85A, V100V, F137L, I140R, V233V, I450T, N598H, F620Y e F624W em relação a SEQ ID N°. 3, como estabelecido na Tabela 3 e Tabela 3a.
[00101] Em uma outra modalidade, o derivado de SHC compreende uma ou mais substituições selecionadas do grupo consistindo em: A88X, V104X, F141X, Y144X, V241X, I459X, M607X, F628X e F658X em relação a SEQ ID N°. 4 sendo que:
[00102] A88X tem X selecionado dentre: A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W ou Y.
[00103] V104X tem X selecionado dentre: A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W ou Y.
[00104] F141X tem X selecionado dentre: A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W ou Y.
[00105] Y144X tem X selecionado dentre: A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W ou Y.
[00106] V241X tem X selecionado dentre: A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W ou Y.
[00107] I459X tem X selecionado dentre: A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W ou Y.
[00108] M607X tem X selecionado dentre: A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W ou Y.
[00109] F628X tem X selecionado dentre: A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W ou Y.
[00110] F658X tem X selecionado dentre: A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W ou Y.
[00111] Em uma outra modalidade, o derivado de SHC compreende uma ou mais substituições selecionadas do grupo consistindo em: A88A, V104V, F141L, Y144R, V241V, I459T, M607H, F628Y e F658W em relação a SEQ ID N°. 4, como estabelecido na Tabela 4.
Combinações de derivados de SHC
[00112] Em uma modalidade, o derivado de SHC compreende uma ou mais substituições selecionadas do grupo consistindo em: T77A, F129L, M132R, I92V, A224V, I432T, Q579H e F601Y em relação a SEQ ID N°. 1, como estabelecido na Tabela 5.
[00113] Em uma modalidade, os derivados de SHC compreendem uma ou mais substituições selecionadas do grupo de mutantes consis tindo em: S129A, V145V, F182L, Y185R, G282V, I498T, H646H e F668Y em relação a SEQ ID N°. 2, como estabelecido na Tabela 6.
[00114] Em uma modalidade, os derivados de SHC compreendem uma ou mais substituições selecionadas do grupo de mutantes consis tindo em: G85A, V100V, F137L, I140R, V233V, I450T, N598H e F620Y em relação a SEQ ID N°. 3, como estabelecido na Tabela 7.
[00115] Em uma outra modalidade, o derivado de SHC compreende uma ou mais substituições selecionadas do grupo consistindo em: A88A, V104V, F141L, Y144R, V241V, I459T, M607H e F628Y em rela ção a SEQ ID N°. 4, como estabelecido na Tabela 8. Tabela 1: Resumo de mutações de SHC numeradas em relação a Aac SHC do tipo selvagem (SEQ ID N°. 1) e Figura 1 a partir de Hos- hino e Sato (2002 como citado acima) Tabela 2: Resumo de mutações de SHC numeradas em relação a AacSHC do tipo selvagem (SEQ ID N°. 1) e o alinhamento de se-quências de AacSHC com ZmoSHC1 (Seitz et al 2012 - como citado acima) Folheto de dados suplementar Tabela 3: Resumo de mutações de SHC numeradas em relação a AacSHC do tipo selvagem (SEQ ID N°. 1) e o alinhamento de se-quências de AacSHC com ZmoSHC2 (Seitz et al 2012 - como citado acima) Folheto de dados suplementar Tabela 3a: Resumo de mutações de SHC numeradas em relação a AacSHC do tipo selvagem (SEQ ID N°. 1) e o alinhamento de se-quência de AacSHC com a sequência N°. 20 na Figura de alinha mento de SHC da tese de doutorado de Merkofer (2004) (ver Http://elib.uni-stuttgart.de/handle/11682/1400) Tabela 4: Resumo de mutações de SHC numeradas em relação a AacSHC do tipo selvagem (SEQ ID N°. 1) e o alinhamento de se-quências de AacSHC com BjpSHC (SEQ ID N°. 5 em WO 2010/139719) Tabela 4a: Usando o alinhamento de sequências fornecido nas Ta-belas 21a-21j onde WTAacSHC (SEQ ID N°. 1) está alinhada com qualquer uma das SEQ ID N°s. 149, 151, 153, 155, 157, 159 (como identificado abaixo), o resíduo de AA e as posições corresponden tes a T77, I92, F129, M132, A224, I432, Q579 e F601 em AacSHC do tipo selvagem (SEQ ID N°. 1) podem ser identificadas e testadas para a atividade de SHC/HAC Tabela 5: Resumo das combinações de mutações de SHC numera das de acordo com AacSHC do tipo selvagem (SEQ ID N°. 1) Tabela 6: Resumo das combinações de mutações de SHC numera das de acordo com a sequência de ZmoSHC1 do tipo selvagem (SEQ ID N°. 2) Tabela 7: Resumo das combinações de mutações de SHC numera das de acordo com a sequência de ZmoSHC2 do tipo selvagem (SEQ ID N°. 3) Tabela 8: Resumo das combinações de mutações de SHC numera das de acordo com BjpSHC do tipo selvagem (SEQ ID N°. 4) Tabela 9: Mostrando as mutações comuns de SHC em relação a AacSHC TS (SEQ ID N°. 1), ZmoSHCI TS (SEQ ID N°. 2), ZmoSHC2 TS (SEQ ID N°. 3) e BjpSHC (SEQ ID N°. 4).
[00116] Em uma modalidade preferencial, o derivado de SHC inclui pelo menos as substituições F2601Y ou M132R em combinação com pelo menos um ou mais F129L e/ou I432T em relação à SEQ ID N°. 1.
[00117] O derivado de SHC denominado SHC3 que é fornecido na presente divulgação compreende a seguinte substituição F2601Y como em comparação com a proteína SHC de referência (SEQ ID N°. 1).
[00118] Hoshino e Sato (2002 citado acima) identificaram F601 como um resíduo de aminoácidos altamente conservados entre as es pécies procarióticas e eucarióticas. É relatado que o derivado de SHC F2601Y mostrou uma Vmax muito maior para um substrato oxidosqua- leno (não esqualeno). No entanto F2601Y mostra uma diminuição na afinidade (ou seja, um maior KM) e uma diminuição na eficiência/ativi- dade catalítica (Kcat/KM) em relação ao AacSHC TS quando o esqua- leno é utilizado. Nenhum dado é fornecido em Hoshino e Sato (2002 citado acima) sobre a eficácia de AacSHC quando o homofarnesol é usado como substrato enzimático com o F2601Y mutante.
[00119] O derivado de SHC denominado SHC10 que é fornecido na presente divulgação compreende a seguinte substituição F129L como em comparação com a proteína SHC de referência (SEQ ID N°. 1).
[00120] O derivado de SHC denominado SHC30 que é fornecido na presente divulgação compreende a seguinte substituição F601Y e F129L como em comparação com a proteína SHC de referência (SEQ ID N°. 1).
[00121] O derivado de SHC denominado SHC26 que é fornecido na presente divulgação compreende a seguinte substituição M132R e I432T como em comparação com a proteína SHC de referência (SEQ ID N°. 1).
[00122] O derivado de SHC denominado 215G2 que é fornecido na presente divulgação compreende a seguinte substituição M132R, I432T e A224V como em comparação com a proteína SHC de referência (SEQ ID N°. 1).
[00123] O derivado de SHC denominado SHC32 que é fornecido na presente divulgação compreende a seguinte substituição F601Y, M132R e I432T como em comparação com a proteína SHC de referên cia (SEQ ID N°. 1).
[00124] O derivado de SHC denominado SHC31 que é fornecido na presente divulgação compreende a seguinte substituição F129L, M132R e I432T como em comparação com a proteína SHC de referên cia (SEQ ID N°. 1).
[00125] O derivado de SHC denominado SHC33 que é fornecido na presente divulgação compreende a seguinte substituição F601Y, F129L, M132R e I432T como em comparação com a proteína SHC de referência (SEQ ID N°. 1).
[00126] O derivado de SHC denominado 101A10 que é fornecido na presente divulgação compreende a seguinte substituição F601Y e Q579H como em comparação com a proteína SHC de referência (SEQ ID N°. 1).
[00127] O derivado de SHC denominado 111C8 que é fornecido na presente divulgação compreende a seguinte substituição T77A + I92V e F129L como em comparação com a proteína SHC de referência (SEQ ID N°. 1).
[00128] Em uma modalidade preferencial, o derivado de SHC inclui pelo menos as substituições F668Y ou Y185R em combinação com pelo menos um ou mais F182L e/ou I498T em relação a SEQ ID N°. 2.
[00129] O derivado de SHC denominado SHC3ZM1 que é fornecido na presente divulgação compreende a seguinte substituição F668Y como em comparação com a proteína SHC de referência (SEQ ID N°. 2).
[00130] Hoshino e Sato (2002 citado acima) identificaram F601 como um resíduo de aminoácidos altamente conservados entre as espécies procarióticas e eucarióticas. É relatado que o derivado de SHC F2601Y mostrou uma Vmax muito maior para um substrato oxidosqualeno (não esqualeno). No entanto F2601Y mostra uma diminuição na afinidade (ou seja, um maior KM) e uma diminuição na eficiência/atividade catalí tica (Kcat/KM) em relação ao AacSHC TS quando o esqualeno é utili zado. Nenhum dado é fornecido em Hoshino e Sato sobre a eficácia de AacSHC quando o homofarnesol é usado como substrato enzimático com o F2601Y mutante. O derivado de SHC equivalente a F2601Y em ZmoSHC1 é F668Y.
[00131] O derivado de SHC denominado SHC10ZM1 que é fornecido na presente divulgação compreende a seguinte substituição F182L como em comparação com a proteína SHC de referência (SEQ ID N°. 2).
[00132] O derivado de SHC denominado SHC30ZM1 que é fornecido na presente divulgação compreende a seguinte substituição F668Y e F182L como em comparação com a proteína SHC de referência (SEQ ID N°. 2).
[00133] O derivado de SHC denominado SHC26ZM1 que é fornecido na presente divulgação compreende a seguinte substituição Y185R e I498T como em comparação com a proteína SHC de referência (SEQ ID N°. 2).
[00134] O derivado de SHC denominado 215G2ZM1 que é fornecido na presente divulgação compreende a seguinte substituição Y185R, I498T e G282V como em comparação com a proteína SHC de referên cia (SEQ ID N°. 2).
[00135] O derivado de SHC denominado SHC32ZM1 que é fornecido na presente divulgação compreende a seguinte substituição F668Y, Y185R e I498T como em comparação com a proteína SHC de referência (SEQ ID N°. 2).
[00136] O derivado de SHC denominado SHC31ZM1 que é fornecido na presente divulgação compreende a seguinte substituição F182L, Y185R e I498T como em comparação com a proteína SHC de referência (SEQ ID N°. 2).
[00137] O derivado de SHC denominado SHC33ZM1 que é fornecido na presente divulgação compreende a seguinte substituição F668Y, F182L, Y185R e I498T como em comparação com a proteína SHC de referência (SEQ ID N°. 2).
[00138] O derivado de SHC denominado 101A10ZM1 que é forne cido na presente divulgação compreende a seguinte substituição F668Y e H646H como em comparação com a proteína SHC de referência (SEQ ID N°. 2).
[00139] O derivado de SHC denominado 111C8ZM1 que é fornecido na presente divulgação compreende a seguinte substituição S129A + V145V e F182L como em comparação com a proteína SHC de referên cia (SEQ ID N°. 2).
[00140] Em uma modalidade preferencial, o derivado de SHC inclui pelo menos as substituições F620Y ou I140R em combinação com pelo menos um ou mais F137L e/ou I450T em relação à SEQ ID N°. 3.
[00141] O derivado de SHC denominado SHC3ZM2 que é fornecido na presente divulgação compreende a seguinte substituição F620Y como em comparação com a proteína SHC de referência (SEQ ID N°. 3).
[00142] Hoshino e Sato (2002 citado acima) identificaram F601 como um resíduo de aminoácidos altamente conservados entre as espécies SHC procarióticas e eucarióticas. Foi relatado que o derivado de AacSHC F601Y mostrou uma Vmax muito maior para um substrato oxi- dosqualeno (não esqualeno). No entanto F2601Y mostra uma diminui ção na afinidade (ou seja, um maior KM) e uma diminuição na eficiên- cia/atividade catalítica (Kcat/KM) em relação ao AacSHC TS quando o esqualeno é utilizado. Nenhum dado é fornecido em Hoshino e Sato (2002) sobre a eficácia de AacSHC quando o homofarnesol é usado como substrato enzimático com o F2601Y mutante. O derivado de SHC equivalente a F2601Y em ZmoSHC2 é F620Y.
[00143] O derivado de SHC denominado SHC10ZM2 que é fornecido na presente divulgação compreende a seguinte substituição F137L como em comparação com a proteína SHC de referência (SEQ ID N°. 3).
[00144] O derivado de SHC denominado SHC30ZM2 que é fornecido na presente divulgação compreende a seguinte substituição F620Y e F137L como em comparação com a proteína SHC de referência (SEQ ID N°. 3).
[00145] O derivado de SHC denominado SHC26ZM2 que é fornecido na presente divulgação compreende a seguinte substituição I140R e I450T como em comparação com a proteína SHC de referência (SEQ ID N°. 3).
[00146] O derivado de SHC denominado 215G2ZM2 que é fornecido na presente divulgação compreende a seguinte substituição I140R, I450T e V233V como em comparação com a proteína SHC de referência (SEQ ID N°. 3).
[00147] O derivado de SHC denominado SHC32ZM2 que é fornecido na presente divulgação compreende a seguinte substituição F620Y, I140R e I450T como em comparação com a proteína SHC de referência (SEQ ID N°. 3).
[00148] O derivado de SHC denominado SHC31ZM2 que é fornecido na presente divulgação compreende a seguinte substituição F137L, I140R e I450T como em comparação com a proteína SHC de referência (SEQ ID N°. 3).
[00149] O derivado de SHC denominado SHC33 ZM2 que é forne cido na presente divulgação compreende a seguinte substituição F620Y, F137L, I140R e I450T como em comparação com a proteína SHC de referência (SEQ ID N°. 3).
[00150] O derivado de SHC denominado 101A10ZM2 que é forne cido na presente divulgação compreende a seguinte substituição F620Y e N598H como em comparação com a proteína SHC de referência (SEQ ID N°. 3).
[00151] O derivado de SHC denominado 111C8ZM2 que é fornecido na presente divulgação compreende a seguinte substituição G85A + V100V e F137L como em comparação com a proteína SHC de referên cia (SEQ ID N°. 3).
[00152] Em uma modalidade preferencial, o derivado de SHC inclui pelo menos as substituições F628Y ou Y144R em combinação com pelo menos um ou mais F141L e/ou I459T em relação a SEQ ID N°. 4.
[00153] O derivado de SHC denominado SHC3Bjp que é fornecido na presente divulgação compreende a seguinte substituição F628Y como em comparação com a proteína SHC de referência (SEQ ID N°. 4).
[00154] Hoshino e Sato (2002 citado acima) identificaram F601 como um resíduo de aminoácidos altamente conservados entre as espécies procarióticas e eucarióticas. É relatado que o derivado de SHC F2601Y mostrou uma Vmax muito maior para um substrato oxidosqualeno (não esqualeno). No entanto F2601Y mostra uma diminuição na afinidade (ou seja, um maior KM) e uma diminuição na eficiência/atividade catalí tica (Kcat/KM) em relação ao AacSHC TS quando o esqualeno é utili zado. Nenhum dado é fornecido em Hoshino e Sato sobre a eficácia de AacSHC quando o homofarnesol é usado como substrato enzimático com o F2601Y mutante. O derivado de SHC equivalente a F2601Y em BjpSHC é F628Y.
[00155] O derivado de SHC denominado SHC10Bjp que é fornecido na presente divulgação compreende a seguinte substituição F141L como em comparação com a proteína SHC de referência (SEQ ID N°. 4).
[00156] O derivado de SHC denominado SHC30Bjp que é fornecido na presente divulgação compreende a seguinte substituição F628Y e F141L como em comparação com a proteína SHC de referência (SEQ ID N°. 4).
[00157] O derivado de SHC denominado SHC26Bjp que é fornecido na presente divulgação compreende a seguinte substituição Y144R e I459T como em comparação com a proteína SHC de referência (SEQ ID N°. 4).
[00158] O derivado de SHC denominado 215G2Bjp que é fornecido na presente divulgação compreende a seguinte substituição Y144R, I459T e V241V como em comparação com a proteína SHC de referência (SEQ ID N°. 4).
[00159] O derivado de SHC denominado SHC32Bjp que é fornecido na presente divulgação compreende a seguinte substituição F628Y, Y144R e I459T como em comparação com a proteína SHC de referência (SEQ ID N°. 4).
[00160] O derivado de SHC denominado SHC31Bjp que é fornecido na presente divulgação compreende a seguinte substituição F141L, Y144R e I459T como em comparação com a proteína SHC de referência (SEQ ID N°. 4).
[00161] O derivado de SHC denominado SHC33Bjp que é fornecido na presente divulgação compreende a seguinte substituição F628Y, F141L, Y144R e I459T como em comparação com a proteína SHC de referência (SEQ ID N°. 4).
[00162] O derivado de SHC denominado 101A10Bjp que é fornecido na presente divulgação compreende a seguinte substituição F628Y e M607H como em comparação com a proteína SHC de referência (SEQ ID N°. 4).
[00163] O derivado de SHC denominado 111C8Bjp que é fornecido na presente divulgação compreende a seguinte substituição A88A + V104V e F141L como em comparação com a proteína SHC de referên cia (SEQ ID N°: 4).
Sequências de Aminoácidos
[00164] Em algumas modalidades, o derivado de AacSHC/HAC com-preende um ou mais dos polipeptídeos conforme definido em uma ou mais das seguintes SEQ ID N°s. 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39 e/ou 171.
[00165] De preferência os derivados de AacSHC/HAC da presente divulgação têm uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID N°. 21, SEQ ID N°. 23, SEQ ID N°. 25, SEQ ID N°. 27, SEQ ID N°. 29, SEQ ID N°. 31, SEQ ID N°. 33, SEQ ID N°. 35, SEQ ID N°. 37, SEQ ID N°. 39 e/ou SEQ ID N°. 171.
[00166] Em algumas modalidades, o derivado de ZmoSHC1/HAC compreende um ou mais dos polipeptídeos conforme definido em uma ou mais das seguintes SEQ ID N°s. 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 e/ou 173.
[00167] De preferência os derivados de ZmoSHC1/HAC da presente divulgação têm uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID N°. 57, SEQ ID N°. 59, SEQ ID N°. 61, SEQ ID N°. 63, SEQ ID N°. 65, SEQ ID N°. 67, SEQ ID N°. 69, SEQ ID N°. 71, SEQ ID N°. 73, SEQ ID N°. 75 e/ou SEQ ID N°. 173.
[00168] Em outras modalidades, os derivados de ZmoSHC2/HAC compreendem um ou mais dos polipeptídeos conforme definido em uma ou mais das seguintes SEQ ID N°. 77, SEQ ID N°. 79, SEQ ID N°. 81, SEQ ID N°. 83, SEQ ID N°. 85, SEQ ID N°. 87, SEQ ID N°. 89, SEQ ID N°. 91, SEQ ID N°. 93, SEQ ID N°. 95, SEQ ID N°. 97, SEQ ID N°. 99, SEQ ID N°. 101, SEQ ID N°. 103, SEQ ID N°. 105, SEQ ID N°. 107, SEQ ID N°. 109, SEQ ID N°. 111 e/ou SEQ ID N°. 175.
[00169] Em modalidades adicionais, os derivados de BjpSHC/HAC compreendem um ou mais dos polipeptídeos conforme definido em uma ou mais das: SEQ ID N°. 113, SEQ ID N°. 115, SEQ ID N°. 117, SEQ ID N°. 119, SEQ ID N°. 121, SEQ ID N°. 123, SEQ ID N°. 125, SEQ ID N°. 127, SEQ ID N°. 129, SEQ ID N°. 131. SEQ ID N°. 133, SEQ ID N°. 135, SEQ ID N°. 137, SEQ ID N°. 139, SEQ ID N°. 141, SEQ ID N°. 143, SEQ ID N°. 145, SEQ ID N°. 147, e/ou SEQ ID N°. 177.
Alinhamentos de Sequências
[00170] Devido aos diferentes comprimentos de sequências de SHC de referência, como, por exemplo, as sequências de polipeptídeos AacSHC, ZmoSHC1, ZmoSHC2 e BjpSHC, o resíduo de aminoácido na posição X da sequência de referência de AacSHC (SEQ ID N°. 1) cor responde a uma posição B de aminoácido diferente na sequência de referência de ZmoSHC1 (SEQ ID N°. 2), uma posição J de aminoácido diferente na sequência de referência de ZmoSHC2 (SEQ ID N°. 3) e uma posição Z de aminoácido diferente na sequência de referência BjpSHC (SEQ ID N°. 4). Além disso, a alteração de uma sequência de referência de SHC também pode modificar a sequência de derivativos de SHC em relação a sequência de referência de SHC.
[00171] O termo "posição"se refere a um determinado resíduo de aminoácido presente na proteína de referência de SHC identificado pela numeração específica dos aminoácidos. A alteração da proteína de re-ferência de SHC por uma inserção ou deleção de um aminoácido leva a uma numeração diferente entre a sequência de aminoácidos de referên cia de SHC e a sequência de aminoácidos derivados de SHC. A título de exemplo, se um aminoácido é inserido entre os aminoácidos 509 e 510 da proteína de referência SHC, o aminoácido seguido da inserção terá a numeração 511 na proteína derivada SHC enquanto mantém a numeração 510 na proteína de referência SHC.
Ensaios para a determinação da atividade dos derivados de SHC/HAC TS e SHC/HAC
[00172] Ensaios para determinar e quantificar a atividade da enzima dos derivados de SHC/HAC TS e/ou SHC/HAC são descritos a seguir e são conhecidos na técnica. A título de exemplo, a atividade dos deriva dos de SHC/HAC TS e/ou SHC/HAC pode ser determinada pela incu bação da enzima purificada de SHC/HAC ou extratos de células hospe deiras ou um organismo hospedeiro recombinante completo que produ ziu a enzima SHC/HAC com um substrato apropriado sob condições adequadas e executando uma análise dos produtos de reação (por exemplo, por cromatografia gasosa (GC) ou análise por HPLC). Mais detalhes sobre os ensaios de atividade das enzimas SHC/HAC e/ou SHC/HAC e análise dos produtos da reação são fornecidos nos Exem plos. Estes ensaios incluem a produção de derivados de SHC em célu las hospedeiras recombinantes (por exemplo, E. coli).
[00173] Conforme usado aqui, o termo "atividade" significa a capaci dade de uma enzima reagir com um substrato para fornecer um produto alvo. A atividade pode ser determinada no que é conhecido como um teste de atividade através do aumento do produto alvo, da diminuição do substrato (ou materiais de partida) ou através de uma combinação desses parâmetros como uma função de tempo. Os derivados de SHC/HAC da presente divulgação são caracterizados pela sua capaci dade de bioconversão de homofarnesol para (-)-Ambrox e demonstra uma atividade biológica como uma atividade de HAC.
[00174] Uma "atividade biológica", como utilizado aqui, refere-se a qualquer atividade que um polipeptídeo possa apresentar, incluindo sem limitação: atividade enzimática; atividade de ligação para outro composto (por exemplo, ligação para outro polipeptídeo, em especial ligação para um receptor, ou ligação para um ácido nucleico); atividade inibitória (por exemplo, atividade inibitória da enzima); atividade de ati vação (por exemplo, atividade de ativação da enzima); ou efeitos tóxi cos.Não é necessário que a variante ou derivado apresente tal atividade na mesma medida em que o polipeptídeo original. Uma variante é con siderada como uma variante dentro do contexto do presente pedido se ela exibe a atividade relevante para um grau de pelo menos 10% da atividade do polipeptídeo original. Da mesma forma, um derivado é con siderado como um derivado dentro do contexto do presente pedido se ele exibe a atividade biológica relevante para um grau de pelo menos 10% da atividade do polipeptídeo original (como o termo derivado e va riantesão usados intercambiavelmente em toda a presente divulgação).
[00175] Em outras modalidades, os derivados de SHC/HAC da pre sente divulgação mostram um melhor rendimento alvo do que a proteína de referência de SHC. O termo "rendimento alvo" refere-se ao grama do produto recuperável por grama de matéria-prima (que pode ser calcu lado como uma porcentagem da taxa de conversão molar).
[00176] Em modalidades adicionais, os derivados de SHC/HAC da presente divulgação mostram uma produtividade alvo modificada (por exemplo, aumento) em relação à proteína de referência de SHC. O termo "produtividade alvo" se refere à quantidade do produto alvo recu perável em gramas por litro de capacidade de fermentação por hora de tempo de bioconversão (ou seja, tempo após o substrato ser adicio nado).
[00177] Em outras modalidades, os derivados de SHC/HAC da pre sente divulgação mostram um fator de rendimento alvo modificado do que a proteína de referência de SHC. O termo "fator de rendimento alvo" se refere à razão entre a concentração do produto obtido e a concentra ção dos derivados de SHC (por exemplo, enzima purificada SHC ou um extrato de células hospedeiras recombinantes que expressam a enzima SHC) no meio de reação.
[00178] Em várias modalidades, os derivados de SHC da presente divulgação mostram um aumento dobrado modificado (por exemplo, au-mento) na atividade enzimática (por exemplo, uma atividade modifi- cada/aumentada de homofarnesol Ambrox ciclase (HAC)) em relação à proteína de referência de SHC por exemplo, SEQ ID N°. 1 ou SEQ ID N°. 2 ou SEQ ID N°. 3 ou SEQ ID N°. 4). Este aumento na atividade é pelo menos por um fator de: 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 e/ou 100.
Sequências de Nucleotídeos
[00179] A presente divulgação se refere a moléculas de ácido nu- cleico isolado compreendendo uma sequência de nucleotídeos que co difica um derivado de SHC como descrito aqui.
[00180] O termo "molécula de ácido nucleico" como utilizado aqui de verá se referir especificamente aos polinucleotídeos da divulgação que podem ser DNA, cDNA, DNA genômico, DNA sintético ou RNA, e po dem ser de fita dupla ou fita simples, fita de sentido e/ou antissenso. O termo "molécula de ácido nucleico" deve ser particularmente aplicável para o(s) polinucleotídeo(s) como usado aqui, por exemplo, como se quência de nucleotídeos de comprimento total ou fragmentos ou partes dos mesmos, que codifica um polipeptídeo com atividade enzimática, por exemplo, uma enzima de uma via metabólica, ou fragmentos ou partes dos mesmos, respectivamente.
[00181] O termo inclui igualmente uma molécula separada como um cDNA onde o correspondente DNA genômico tem íntrons e, portanto, uma sequência diferente; um fragmento genômico que carece de pelo menos um dos genes de flanqueamento; um fragmento de cDNA ou DNA genômico produzido pela reação em cadeia da polimerase (PCR) e que carece de pelo menos um dos genes de flanqueamento; um frag mento de restrição que carece de pelo menos um dos genes de flan- queamento; um DNA que codifica uma proteína de ocorrência não na tural como uma proteína de fusão (por exemplo, uma etiqueta de His), mutete ou fragmento de uma dada proteína; e um ácido nucleico que é uma variante degenerada de um cDNA ou um ácido nucleico de ocor rência natural. Além disso, inclui uma sequência de nucleotídeos recom- binante que é parte de um gene híbrido, ou seja, um gene que codifica uma proteína de fusão de ocorrência não natural. As proteínas de fusão podem adicionar um ou mais aminoácidos (como, mas não limitado, a histidina (His)) a uma proteína, geralmente no N-terminal da proteína, mas também no C-terminal ou fundida dentro de regiões da proteína. Tais proteínas de fusão ou vetores de fusão de codificação de tais pro teínas normalmente servem três objetivos: (i) aumentar a produção de proteínas recombinantes; (ii) aumentar a solubilidade da proteína re- combinante; e (iii) auxiliar na purificação da proteína recombinante for necendo um ligante para purificação por afinidade. O termo "molécula de ácido nucleico"também inclui as sequências otimizadas pelo códon adequadas para expressão em uma determinada célula hospedeira mi crobiana (por exemplo, célula hospedeira de E. coli). Conforme usado aqui, o termo "otimizado pelo códon"significa uma sequência de codifi cação de proteínas de ácidos nucleicos que tem sido adaptada para a expressão em uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica, parti cularmentecélulas bacterianas hospedeiras como células hospedeiras de E. coli por substituição de um ou mais ou de preferência um número significativo de códons com códons que são mais frequentemente utili-zados em genes de célula hospedeira bacteriana (por exemplo, E. coli). A este respeito, a sequência de nucleotídeos codificando as sequências de referência ID N°. 1,2, 3 e/ou 4 e todas as variantes/os derivados das mesmas podem ser o original como o que se encontra na fonte (por exemplo, AacSHC, ZmoSHC1, ZmoSHC2 ou BjpSHC, respectiva mente) ou o gene pode ser códon-otimizado para os organismos hos pedeiros selecionados, como, por exemplo, E. coli.
[00182] Uma molécula de ácido ribonucleico (RNA) pode ser produ zida pela transcrição in vitro. Segmentos de moléculas de DNA também são considerados no escopo da divulgação e podem ser produzidos por, por exemplo, sistema de reação em cadeia de polimerase (PCR) ou ge rados pelo tratamento com uma ou mais endonucleases de restrição. Os segmentos de uma molécula de ácido nucleico podem ser referidos como fragmentos de DNA de um gene, em especial, aqueles que são genes parciais. Um fragmento também pode conter vários quadros de leitura aberto (ORF), ou repetições do mesmo ORF ou diferentes ORFs. O termo se refere especificamente a sequências de nucleotídeos de co-dificação,mas devem também incluir sequências de nucleotídeos que não são codificadoras, por exemplo, sequências não transcritas e não traduzidas, ou polipeptídeos de codificação, inteiros ou em parte. Os genes como utilizados aqui, por exemplo, para a montagem, diversifica-çãoou recombinação podem ser sequências de não-codificação ou se-quênciasde codificação de polipeptídeos ou de proteínas ou partes ou fragmentos dos mesmos, tendo comprimento de sequência suficiente para eventos de recombinação bem-sucedidos. Mais especificamente, os referidos genes têm um comprimento mínimo de 3 bp, de preferência, pelo menos 100 bp, mais de preferência pelo menos 300 bp.
[00183] Será aparente a partir do anteriormente mencionado que a referência a um DNA isolado não significa um DNA presente entre as centenas de milhões de outras moléculas de DNA dentro, por exemplo, de bibliotecas de cDNA ou DNA genômico ou digestões de restrição de DNA genômico, por exemplo, uma mistura de reação de digestão de restrição ou uma fatia de gel eletroforético. Uma molécula de ácido nu- cleico isolada da presente divulgação engloba os segmentos que não são encontrados como tal no estado natural.
[00184] Conforme usado aqui, o termo "DNA isolado" pode se referir a (1) um DNA que contém a sequência não idêntica aquelas de qualquer sequência de ocorrência natural, um polinucleotídeo ou ácido nucleico que não ocorrem naturalmente, (por exemplo, é feito pela combinação artificial (por exemplo, manipulação artificial de segmentos isolados de ácidos nucleicos, por exemplo, por técnicas de engenharia genética) de dois segmentos separados de sequências através de intervenção hu mana) ou (2), no contexto de um DNA com uma sequência que ocorre naturalmente (por exemplo, um cDNA ou DNA genômico), um DNA livre de pelo menos um dos genes que flanqueiam o gene contendo o DNA de interesse no genoma do organismo em que o gene contendo o DNA de interesse ocorre naturalmente.
[00185] O termo "DNA isolado" como usado aqui, especificamente com relação à sequência de ácido nucleico, também pode se referir a ácidos nucleicos ou polinucleotídeos produzidos por técnicas de DNA recombinante, por exemplo, uma construção de DNA compreendendo um polinucleotídeo heterólogo a uma célula hospedeira, que é opcional mente incorporado na célula hospedeira. Uma sequência de nucleotí- deos quimérica pode ser especificamente produzida como uma molé cula recombinante. O termo "recombinação"se aplica especificamente ao conjunto de polinucleotídeos, juntando os polinucleotídeos ou partes dos mesmos, com ou sem recombinação para atingir um cruzamento ou um mosaico de gene. Por exemplo, é realizada para unir segmentos de ácido nucleico de funções desejadas para gerar uma combinação dese jada de funções. Um gene recombinante que codifica um polipeptídeo descrito aqui inclui a sequência de codificação para o polipeptídeo, funci onalmente ligado, na orientação sentido, para uma ou mais regiões regu lamentares adequadas para expressar o polipeptídeo. Porque muitos mi-crorganismossão capazes de expressar vários produtos de genes a par tir de um mRNA policistrônico, vários polipeptídeos podem ser expressa dos sob o controle de uma única região regulatória para os microrganis mos, se desejado. Uma sequência de codificação e uma região regulató- ria são consideradas como sendo funcionalmente ligadas quando a re gião regulatória e a sequência de codificação são posicionadas de modo que a região regulatória é eficaz para a regulação da transcrição ou a tradução da sequência.
[00186] O termo "recombinante" como usado aqui, especificamente no que diz respeito às enzimas, deve se referir às enzimas produzidas por técnicas de DNA recombinante, ou seja, produzido a partir de célu las transformadas por uma construção de DNA exógeno codificando a enzima desejada. As enzimas "sintéticas" são aquelas preparadas por síntese química. Uma enzima quimérica pode ser especificamente pro duzida como molécula recombinante. O termo "DNA recombinante"in clui um DNA recombinante incorporado em um vetor em um plasmídeo ou vírus de replicação autônoma ou no DNA genômico de um procariote ou eucariote (ou o genoma de uma célula homóloga, em uma posição diferente da localização cromossômica natural).
[00187] Em um outro aspecto, a(s) molécula(s) de ácido nucleico da presente divulgação é/são ligada(s) operacionalmente às sequências de controle de expressão permitindo expressão em células hospedeiras procariotas e/ou eucariotas. Conforme usado aqui, "ligada operacional-mente" significa incorporada em uma construção genética de modo que as sequências de controle de expressão controlam eficazmente a expressão de uma sequência de codificação de interesse. Os elementos reguladores transcricionais/translationais referidos acima incluem, mas não se limitam a, elementos induzíveis e não induzíveis, constitutivos, regulados pelo ciclo celular, promotores metabolicamente regulados, potencializadores, operadores, silenciadores, repressores e outros ele-mentos que são conhecidos pelos versados na técnica e que a dirigem ou de outra forma regulam a expressão gênica. Tais elementos regula dores incluem, mas não se limitam a, elementos reguladores direcio-nandoexpressão constitutiva ou que permitem a expressão induzível como, por exemplo, promotor CUP-1, repressor tet como empregado, por exemplo, os elementos reguladores de sistemas tet ou não tet, sis tema lac e sistema trp. A título de exemplo, o isopropil-ß-D-1-tiogalac- topiranosídeo (IPTG) é um indutor eficaz da expressão gênica na faixa de concentração de 100µM de 1,0mM. Este composto é um mímico mo lecular de allolactose, um metabólito de lactose que desencadeia a transcrição do operon lac, e é por isso que é usado para induzir a ex pressão do gene quando o gene está sob o controle do operador lac. Outro exemplo de um elemento regulador que induz a expressão do gene é a lactose.
[00188] Da mesma forma, a(s) molécula(s) de ácido nucleico da pre sente divulgação pode fazer parte de um gene híbrido que codifica adi-cionalsequências de polipeptídeo, por exemplo, uma sequência que funciona como um marcador ou repórter. Exemplos de genes marcador e repórter incluindo betalactamase, cloranfenicol acetiltransferase (CAT), adenosina deaminase (ADA), aminoglicosídeo fosfotransferase diidrofolato redutase (DHFR), higromicina-B-fosfotransferase (HPH), ti- midina quinase (TK), lacZ (codificação de beta-galactosidase) e xantina guanina fosforibosil transferase (XGPRT). Tal como acontece com mui tos dos procedimentos padrão associados com a prática da divulgação, versados na técnica saberão os reagentes adicionais úteis, por exemplo, sequências adicionais que podem servir a função de um mar-cador ou repórter.
[00189] Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece um polinucleotídeo recombinante codificando os derivados de SHC TS ou SHC/HAC descrito acima, que pode ser inserido em um vetor para a expressão e a purificação opcional. Um tipo de vetor é um plasmídeo representando um laço de DNA dupla-fita circular no qual os segmentos de DNA adicionais são ligados. Determinados vetores podem controlar a expressão de genes para os quais eles são funcionalmente ligados. Esses vetores são chamados de "vetores de expressão". Normalmente vetores de expressão adequados para técnicas de recombinação de DNA são do tipo plasmídeo. Normalmente, um vetor de expressão com preende um gene como SHC TS ou a variante SHC/HAC como descrito aqui. Na presente descrição, os termos "plasmídeo"e "vetor"são usa dos de forma intercambiável uma vez que o plasmídeo é o tipo de vetor usado com mais frequência.
[00190] Esses vetores podem incluir sequências de DNA que in cluem, mas não se limitam a, sequências de DNA que não estão natu ralmente presentes na célula hospedeira, sequências de DNA que não são normalmente transcritas no RNA ou traduzidas em uma proteína ("expressada") e outros genes ou sequências de DNA que se deseja introduzir no hospedeiro não-recombinante. Será apreciado que normal-mente o genoma de um hospedeiro recombinante descrito aqui é au-mentadoatravés da introdução estável de um ou mais genes recombi- nantes. No entanto, plasmídeos autônomos ou replicativos ou vetores também podem ser utilizados dentro do escopo dessa divulgação. Além disso, a divulgação atual pode ser praticada com um baixo número de cópia, por exemplo, um plasmídeo ou vetor de cópia única ou um alto número de cópia (como exemplificado aqui).
[00191] Em uma modalidade preferencial o vetor da presente divulgação compreende os plasmídios, fagemídeos, fagos, cosmídeos, cromossomos bacterianos artificiais e de levedura artificiais, constru ções inativadas ou de ativação, sequências de ácidos nucleicos sintéti cos ou de cassetes e subconjuntos podem ser produzidos sob a forma de polinucleotídeos lineares, plasmídeos, megaplasmídeos, cromosso-mossintéticos ou artificiais, como cromossomos artificiais de planta, bactérias, mamíferos ou levedura.
[00192] É preferível que as proteínas codificadas pelo polinucleotí- deo introduzido sejam expressadas dentro da célula após a introdução do vetor. Os diversos substratos de gene podem ser incorporados em plasmídeos. Os plasmídeos são muitas vezes vetores de clonagem pa-drão, por exemplo, plasmídeos com múltiplas cópias bacterianas. Os substratos podem ser incorporados no mesmo ou diferentes plasmídeo. Muitas vezes pelo menos dois tipos diferentes de plasmídeos tendo di-ferentes tipos de marcadores selecionáveis são usados para permitir a seleção de células contendo pelo menos dois tipos de vetores.
[00193] Geralmente células bacterianas ou de levedura podem ser transformadas com qualquer uma ou mais das seguintes sequências de nucleotídeos como é bem conhecido na técnica. Para recombinação in vivo, o gene a ser recombinado com o genoma ou outros genes é utili zado para transformar o hospedeiro usando técnicas de transformação padrão. Em uma modalidade adequada o DNA fornecendo uma origem de replicação é incluído na construção. A origem de replicação pode ser convenientemente selecionada pelo versado na técnica. Dependendo da natureza dos genes, uma origem suplementar de replicação pode não ser necessária se as sequências já são presentes com os genes ou do genoma que são operáveis como origem de autorreplicação.
[00194] Uma célula bacteriana ou de levedura pode ser transformada pelo DNA exógeno ou heterólogo quando o DNA foi introduzido no inte rior da célula. O DNA transformador pode ou não ser integrado, ou seja, covalentemente ligado no genoma da célula. Em procariotas e levedu ras, por exemplo, o DNA transformador pode ser mantido em um ele mento episomal como um plasmídeo. Com respeito às células eucarió- ticas, uma célula transfectada de maneira estável é aquela em que o DNA transfectado está integrada em um cromossomo de modo que ele é herdado por células filhas através da replicação do cromossomo. Esta estabilidade é demonstrada pela capacidade da célula eucariota esta-belecer linhagens celulares ou clones compreendendo uma população de células filhas contendo o DNA transformador.
[00195] Geralmente, o DNA introduzido não é originalmente resi dente no hospedeiro que é o destinatário do DNA, mas é no escopo da divulgação isolar um segmento de DNA a partir de um determinado hos pedeiro, e para posteriormente introduzir uma ou mais cópias adicionais desse DNA no mesmo hospedeiro, por exemplo, para aumentar a pro dução do produto de um gene ou alterar o padrão de expressão de um gene. Em alguns casos, o DNA introduzido irá modificar ou mesmo substituir um gene endógeno ou uma sequência de DNA, por exemplo, recombinação homóloga ou mutagênese sítio-dirigida. Hospedeiros re- combinantes adequado incluem microrganismos, células vegetais e plantas.
[00196] A presente divulgação também divulga hospedeiros recom- binantes. O termo "hospedeiro recombinante", também referido como uma "célula hospedeira geneticamente modificada" ou uma "célula transgênica", denota uma célula hospedeira que compreende um ácido nucleico heterólogo ou o genoma que tem sido aumentado por pelo me nos uma sequência de DNA incorporada. Uma célula hospedeira da pre sente divulgação pode ser geneticamente modificada com o polinucleo- tídeo ou um vetor como delineado acima.
[00197] As células hospedeiras que podem ser utilizadas para o pro pósito da divulgação incluem, mas não se limitam a, células procarióticas como bactérias (por exemplo, E. coli e B. subtilis), que po-dem ser transformadas com, por exemplo, o DNA bacteriófago recom- binante, DNA plasmidial, cromossomo artificial bacteriano, ou vetores de expressão de DNA do cosmídeo contendo as moléculas polinucleo- tídicas da divulgação; células eucarióticas simples como levedura (por exemplo, Saccharomyces e Pichia), que podem ser transformadas com, por exemplo, vetores de expressão de levedura recombinante contendo a molécula polinucleotídica da divulgação. Dependendo da célula hos pedeira e do respectivo vetor utilizado para introduzir o polinucleotídeo da divulgação, o polinucleotídeo pode se integrar, por exemplo, no cro-mossomo ou no DNA mitocondrial ou pode ser mantido extracromossô- micamente como, por exemplo, episomicamente ou pode ser apenas transitoriamente compreendido nas células.
[00198] O termo "célula"como utilizado aqui em especial com refe rência à engenharia genética e introduzindo um ou mais genes ou uma aglomeração agregada de genes em uma célula ou uma célula de pro-dução é entendida para se referir a qualquer célula procariota ou euca- riota. Células hospedeiras procarióticas e eucarióticas são ambas con-templadas para o uso de acordo com a divulgação, incluindo células hospedeiras bacterianas como E. coli ou Bacillus sp, células hospedei ras de levedura, como S. cerevisiae, células hospedeiras de inseto, como Spodoptera frugiperda ou células hospedeiras humanas, como HeLa e Jurkat.
[00199] Especificamente, a célula é uma célula eucariótica, de prefe rência uma célula fúngica, de mamíferos ou vegetal ou células procarió- ticas. Células eucarióticas adequadas incluem, por exemplo, sem limi tação, células de mamíferos, células de levedura, ou células de inseto (incluindo Sf9), células de anfíbios (incluindo células melanophore), ou células incluindo de verme incluindo células de Caenorhabditis (inclu indo Caeno-rhabditis elegans). Células de mamífero adequadas incluem, por exemplo, sem limitação, células COS (incluindo Cos-1 e Cos-7), células CHO, células HEK293, células HEK293T, células HEK293 T-RexTM, ou outras linhagens celulares eucarióticas transfec- tantes. Células bacterianas adequadas incluem sem limitação E. coli.
[00200] Procariotas preferíveis, como E. coli, Bacillus, Streptomyces, ou células de mamíferos, como células HeLa ou células Jurkat, ou célu las vegetais, como Arabidopsis, podem ser usadas.
[00201] De preferência, a célula é um AspergillusAspergillus sp. ou uma célula fúngica, preferencialmente, ela pode ser selecionada a partir do grupo consistindo dos gêneros Saccharomyces, Candida, Kluyve- romyces, Hansenula, Schizosaccharomyces, Yarrowia, Pichia e Asper-gillus.
[00202] De preferência a célula hospedeira E. colié uma célula hos-pedeiraE. coli que é reconhecida pela indústria e autoridades regulado ras (incluindo, mas não limitada a, uma célula hospedeira de E. coli K12 ou como demonstrado nos Exemplos, uma célula hospedeira E. coli BL21).
[00203] Uma célula hospedeira preferida para uso com a presente divulgação é E. coli, que pode ser preparada recombinantemente como descrito aqui. Assim, o hospedeiro recombinante pode ser uma célula hospedeira recombinante de E. coli. Existem bibliotecas de mutantes, plasmídeos, modelos de computador detalhados do metabolismo e ou-trasinformações disponíveis para E. coli, permitindo o design racional de diversos módulos para melhorar o rendimento do produto. Métodos similares dos descritos acima para Saccharomyces podem ser utiliza dos para fazer microrganismos recombinantes de E. coli.
[00204] Em uma modalidade, microrganismo recombinante de E. coli inclui sequências de nucleotídeos de codificação de genes SHC (con forme divulgado, por exemplo, em qualquer uma ou mais Tabelas 10, 11 e 12 neste documento ou equivalentes/homologias funcionais dos mesmos, incluindo, mas não limitado a, variantes, homólogos mutantes, derivados ou fragmentos.
[00205] De preferência, o microrganismo recombinante de E. coli compreende uma construção de vetor como previsto nas Figuras 5 e 21.
[00206] Em outra modalidade preferida, o microrganismo recombi- nante de E. coli compreende sequências de nucleotídeos de codificação de SHC/HAC TS e genes derivados de SHC/ HACTS ou equivalentes/ homologias funcionais dos mesmos incluindo, mas não limitado a, vari-antes,homólogos mutantes, derivados ou fragmentos dos mesmos como estabelecidos em qualquer uma ou mais da tabela 13, Tabela 14, Tabela 15, Tabela 16, Tabela 17 e/ou a Tabela 4a.
[00207] Outra célula hospedeira preferida para uso com a presente divulgação é a S. cerevisiae que é um organismo chassis amplamente utilizado em biologia sintética. Assim, o hospedeiro recombinante pode ser S. cerevisiae. Existem bibliotecas de mutantes, plasmídeos, mode los de computador detalhados do metabolismo e outras informações dis poníveis para S. cerevisiae, permitindo o design racional de diversos módulos para melhorar o rendimento do produto. Métodos são conheci dos por fazerem microrganismos recombinantes de S. cerevisiae.
[00208] A cultura de células é realizada de forma convencional. O meio de cultura contém uma fonte de carbono, pelo menos uma fonte de nitrogênio e sais inorgânicos, e vitaminas são adicionadas a ele. Os componentes deste meio podem ser aqueles que são convencional mente utilizados para a cultura de espécies de microrganismo em ques tão.
[00209] Fontes de carbono de uso no método instantâneo incluem qualquer molécula que pode ser metabolizada pela célula hospedeira recombinante para facilitar o crescimento e/ou a produção de (-)-Am- brox. Exemplos de fontes de carbono adequadas incluem, mas não es tão limitados a, sacarose (por exemplo, como encontrado em melaço), frutose, xilose, glicerol, glicose, celulose, amido, celobiose ou outros po-límeros contendo glicose.
[00210] Em modalidades empregando levedura como um hospe deiro, por exemplo, fontes de carbono como a sacarose, frutose, xilose, o etanol, o glicerol e a glicose são adequados. A fonte de carbono pode ser fornecida ao organismo hospedeiro durante todo o período de cultivo ou, alternativamente, o organismo pode ser cultivado por um período de tempo na presença de outra fonte de energia, por exemplo, proteína, e então fornecidos com uma fonte de carbono apenas durante a fase de batelada alimentada.
[00211] A adequação de um microrganismo recombinante de célula hospedeira para uso nos métodos da presente divulgação pode ser de-terminada por um simples procedimento de teste usando métodos bem conhecidos. Por exemplo, o microrganismo a ser testado pode ser pro-pagado em um meio rico (por exemplo, meio LB, meio de extrato de levedura Bactotryptone, meio de nutriente e similares) a um pH, tempe-ratura e sob condições de aeração comumente utilizados para fins de propagação do microrganismo. Uma vez que os microrganismos recom- binantes (ou seja, células hospedeiras recombinantes) são seleciona dos que produzem os produtos pretendidos de bioconversão, os produ tossão geralmente produzidos por uma produção de linhagem de célu las hospedeiras em larga escala pelos sistemas de expressão adequa dos e as fermentações, por exemplo, pela produção microbiana em cul tura de células.
[00212] Em uma modalidade da presente divulgação, um meio mí nimo definido como M9A é utilizado para o cultivo de células.
[00213] Os componentes do meio M9A incluem: 14g/l KH2PO4, 16g/l K2HPO4, 1g/l de citrato de Na3,2H2O, 7,5g/l (NH4)2SO4, 0,25g/l MgSO4,7H2O, 0,015g/l CaCl2,2H2O, 5g/l de glicose e 1,25g/l de extrato de levedura).
[00214] Em outra modalidade da presente divulgação, o meio rico nutriente como LB foi utilizado. Os componentes do meio LB incluem: 10g/l de triptona, 5g/l extrato de levedura, 5g/l de NaCl.
[00215] Outros exemplos de meio mineral e meio mineral M9 são di-vulgados, por exemplo, em US6524831B2 e US2003/0092143A1.
[00216] O microrganismo recombinante pode ser cultivado em um lote, em batelada-alimentada ou em processo contínuo ou suas combi nações. Normalmente, o microrganismo recombinante é cultivado em um fermentador a uma temperatura definida na presença de uma fonte de nutriente adequado, por exemplo, uma fonte de carbono, por um pe ríodo de tempo desejado para produzir enzimas suficientes para a bio- conversão de homofarnesol para Ambrox e para produzir uma quanti dade desejada de Ambrox incluindo (-)-Ambrox.
[00217] As células hospedeiras recombinantes podem ser cultivadas em qualquer forma adequada, por exemplo, por cultivo em batelada ou cultivo em batelada alimentada.
[00218] Conforme usado aqui, o termo "cultivo em batelada"é um método de cultivo em que o meio de cultura não é adicionado nem reti rado durante o cultivo.
[00219] Conforme usado aqui, o termo "batelada alimentada"signi fica um método de cultivo em que o meio de cultura é adicionado du rante o cultivo, mas nenhum meio de cultura é retirado.
[00220] Uma modalidade da presente divulgação fornece um método de produção de Ambrox em um sistema celular compreendendo expres sando de SHC TS ou derivados SHC/HAC em condições adequadas em um sistema celular, alimentando o homofarnesol ao sistema celular, convertendo homofarnesol para Ambrox usando o SHC ou derivados SHC/HAC produzidos utilizando o sistema celular, recolhendo Ambrox do sistema celular e opcionalmente isolando os materiais (-)-Ambrox do sistema. A expressão de outras sequências de nucleotídeos pode servir para reforçar o método. O método de bioconversão pode incluir a ex-pressão adicional de outras sequências de nucleotídeos no sistema ce-lular. A expressão de outras sequências de nucleotídeos pode melhorar a via de bioconversão para produzir o (-)-Ambrox.
[00221] Outra modalidade da presente divulgação é um método de bioconversão para produzir o (-)-Ambrox compreendendo cultivando as células hospedeiras compreendendo SHC/HAC TS ou genes derivados SHC/HAC, produzindo SHC/HAC TS ou derivados SHC/HAC em célu las hospedeiras, alimentando homofarnesol (por exemplo, EEH) para as células hospedeiras, incubando as células hospedeiras em condições de pH e temperatura e agente solubilizante adequado para promover a conversão de homofarnesol em Ambrox e coletando o (-)-Ambrox. A produção do SHC/HAC TS e/ou derivados SHC/HAC em células hospe-deiras fornece um método para produzir (-)-Ambrox quando o homofar-nesol é adicionado a células hospedeiras em condições adequadas de reação. A conversão obtida pode ser aprimorada adicionando mais bio- catalisador e SDS à mistura de reação.
[00222] O microrganismo recombinante da célula hospedeira pode ser cultivado em um número de maneiras ou a fim de fornecer células em quantidades adequadas expressando o SHC TS ou derivados SHC/HAC para a subsequente etapa de bioconversão. Uma vez que os microrganismos aplicáveis para a etapa de bioconversão variam ampla-mente (por exemplo, leveduras, bactérias e fungos), as condições de cultura são, naturalmente, adaptadas às necessidades específicas de cada uma das espécies e essas condições são bem conhecidas e do-cumentadas. Qualquer um dos métodos conhecidos na técnica para o cultivo de células de microrganismos recombinantes de célula hospe deira pode ser utilizado para produzir as células utilizáveis na subse quente etapa de bioconversão da presente divulgação. Normalmente as células são cultivadas para uma determinada densidade (mensurável, como densidade óptica (DO)) para produzir uma biomassa suficiente para a reação de bioconversão.
[00223] As condições de cultivo escolhidas influência não só a quan tidade de células obtidas (biomassa), mas a qualidade das condições de cultivo também influencia o modo como a biomassa se torna um bi- ocatalisador. O microrganismo recombinante da célula hospedeira ex pressando SHC TS ou gene derivado SHC/HAC e produzindo SHC TS ou as enzimas derivadas SHC/HAC é denominado um biocatalisador que é adequado para o uso em uma reação de bioconversão. Em algu mas modalidades, o biocatalisador é uma célula inteira recombinante produzindo SHC TS ou derivados SHC/HAC ou ele pode estar em sus pensão ou um formato imobilizado. Em outras modalidades, o biocatali- sador é uma fração de membrana ou uma fração líquida preparada da célula inteira recombinante produzindo a SHC TS ou o derivado SHC/HAC (conforme divulgado, por exemplo, em Seitz et al 2012 - como citado acima).
[00224] A célula inteira recombinante produzindo SHC TS ou um de-rivadoSHC/HAC incluem células inteiras coletadas a partir do fermenta- dor (para a reação de bioconversão) ou as células no fermentador (que são então utilizadas em uma reação de um recipiente). A célula inteira recombinante produzindo SHC TS ou derivados SHC/HAC pode incluir cé-lula inteira intacta recombinante e/ou resíduos celulares. De qualquer forma, a SHC TS ou o derivado SHC/HAC está associado com uma mem-brana (como uma membrana celular) de alguma forma a fim de receber e/ou interagir com um substrato (por exemplo, homofarnesol), cuja mem-brana (como uma membrana celular) pode ser parte de ou compreender uma célula inteira (por exemplo, uma célula inteira recombinante). A SHC TS ou derivados SHC/HAC pode também ser imobilizados em uma forma (por exemplo, associado com uma enzima transportadora) que permite que a SHC TS ou derivados SHC/HAC interagem com um substrato (por exemplo, homofarnesol). A SHC TS ou derivados SHC/HAC podem tam bém ser utilizados em uma forma solúvel.
[00225] Em uma modalidade, o biocatalisador é produzido em quan tidades suficientes (para criar uma biomassa suficiente), colhidos e la vados (e opcionalmente armazenados (por exemplo, congelados ou lio- filizados)) antes da etapa de bioconversão.
[00226] Em outra modalidade, as células são produzidas em quanti dades suficientes (para criar um biocatalisador suficiente) e as condi ções de reação são então ajustadas sem a necessidade de cultivar e lavar o biocatalisador para a reação de bioconversão. Este método de uma etapa (ou de "um recipiente") é vantajoso na medida em que sim plifica o processo e reduzir os custos. O meio de cultura utilizado para cultivar as células também é adequado para uso na reação de biocon- versão desde que as condições de reação sejam ajustadas para facilitar a reação de bioconversão.
[00227] O pH ideal para o cultivo de células está na faixa de 6,0-7,0. O pH ideal para a reação de bioconversão é dependente do tipo de en zima SHC/HAC utilizada na reação de bioconversão. O pH é regulado através de técnicas que são bem conhecidas para o versado na técnica.
[00228] Como o Exemplo 9 demonstra, um método de "um recipi ente" foi utilizado para a bioconversão de homofarnesol para (-)-Am- brox com uma taxa de conversão de 100%. Como o Exemplo 18 de monstra, um método de "um recipiente" foi utilizado para a bioconver- são de homofarnesol para (-)-Ambrox com uma taxa de conversão de 99%.
[00229] Conforme usado aqui, qualquer referência aqui a uma taxa de conversão de 99%/100% para um substrato homofarnesol para (-)- Ambrox é uma referência a uma conversão de 99%/100% do isômero homofarnesol (ou seja, EEH) capaz de conversão para (-)-Ambrox usando um SHC/HAC TS ou uma enzima derivada de SHC/HAC.
[00230] Embora os termos "mistura" ou "mistura de reação"possam ser usados de maneira intercambiável com o termo "meio" na presente divulgação (principalmente no que diz respeito a uma reação de "um recipiente"), convém notar que a cultura de células para criar uma bio-massa suficiente requer uma cultura de células/meio de fermentação, mas um meio não é necessário para a etapa de bioconversão como um tampão de reação será suficiente a um pH adequado.
[00231] Os métodos de bioconversão da presente divulgação são re-alizados sob condições de tempo, temperatura, pH e agente solubili- zante para fornecer para a conversão da matéria prima do homofarnesol para (-)-Ambrox. O pH da mistura de reação pode estar no intervalo de 4 a 8, de preferência, 5 a 6,5, com mais preferência 4,8-6,0 para as enzimas derivadas SHC/ HAC e na faixa de pH de cerca de 5,0 para cerca de pH 7,0 para a enzima SHC TS e pode ser mantido pela adição de tampões para a mistura de reação. Um tampão exemplar para essa finalidade é um tampão de ácido cítrico. A temperatura preferida está entre de cerca de 15°C e cerca de 45°C, de preferência cerca de 20°C e cerca de 40°C embora possa ser superior, até 55°C para organismos termofílicos especialmente se a enzima TS (por exemplo, SHC/HAC TS) do microrganismo termofílico for usada. A temperatura pode ser mantida constante ou pode ser alterada durante o processo de bioconversão.
[00232] O requerente demonstrou que pode ser útil incluir um agente solubilizante (por exemplo, um tensoativo, detergente, potencializador de solubilidade, solvente orgânico miscível em água e similares) em re ação de bioconversão. Conforme usado aqui, o termo "tensoativo"sig nifica um componente que reduz a tensão superficial (ou tensão interfa cial) entre dois líquidos ou entre um líquido e um sólido. Os tensoativos podem agir como detergentes, agentes umectantes, emulsionantes, agentes antiespuma e dispersantes. Exemplos de tensoativos incluem, mas não se limitam a, Triton X-100, Tween 80, taurodeoxicolato, taurodeoxicolato de sódio, dodecil sulfato de sódio (SDS) e/ou lauril sul fato de sódio (SLS).
[00233] Embora o Triton X-100 possa ser usado para purificar parci-almente a SHC/HAC TS ou enzimas derivados de SHC/HAC (em forma de fração/suspensão solúvel ou membrana), também pode ser usado na reação de bioconversão (ver, por exemplo, a divulgação de Seitz (a tese de doutorado de 2012, como citado acima), bem como a divulgação de Neumann e Simon (1986 - como citado acima) e JP2009060799).
[00234] No entanto, surpreendentemente, como o Exemplo 14 de monstra, o requerente selecionou e identificou a SDS como um agente solubilizante particularmente útil a partir de uma longa lista de outros agentes solubilizantes menos úteis. Em especial, o requerente identifi cou SDS como um agente solubilizante notavelmente melhor do que, por exemplo, o Triton X-100 em termos de velocidade de reação e ren dimento para a reação de bioconversão do homofarnesol para (-)-Am- brox (quando EEH é usado em ambos 4g/l e 125g/l). Conforme demons trado pelos dados comparativos no Exemplo 12, o requerente demons trou que para pelo menos uma enzima derivada de SHC/HAC, a ativi dade de bioconversão máxima de homofarnesol para (-)-Ambrox com Triton X-100 (em um intervalo de concentração de cerca de 0,005% a 0,48%) na reação foi apenas de cerca de 20% da atividade obtida com SDS (a uma concentração de cerca de 0,07%).
[00235] Sem o desejo de se vincular à teoria, o uso do SDS com cé lulas hospedeiras microbianas recombinantes pode ser vantajoso uma vez que a SDS pode interagir beneficamente com a membrana celular hospedeira a fim de tornar a enzima SHC (que é uma membrana ligada a enzima) mais acessível para o substrato homofarnesol. Além disso, a inclusão de SDS a um nível adequado na mistura de reação pode me lhorar as propriedades de emulsão (homofarnesol na água) e/ou melho rar o acesso do substrato homofarnesol para a enzima SHC dentro da célula hospedeira, enquanto que ao mesmo tempo previne a ruptura (por exemplo, a desnaturação da enzima SHC (TS ou derivativo SHC/HAC)).
[00236] A concentração do agente solubilizante (por exemplo, SDS) utilizada na reação de bioconversão é influenciada pela quantidade de biomassa e a concentração do substrato (EEH). Ou seja, existe um grau de interdependência entre a concentração do agente solubilizante (por exemplo, SDS), a quantidade de biomassa e a concentração do subs trato (EEH). A título de exemplo, como a concentração do substrato ho-mofarnesol aumenta, quantidades suficientes de biocatalisador e agente solubilizante (por exemplo, SDS) são necessárias para uma re ação de bioconversão eficiente ocorrer. Por exemplo, se a concentração do agente solubilizante (por exemplo, SDS) é muito baixa, conversão subótima do homofarnesol pode ser observada. Por outro lado, se, por exemplo, a concentração do agente solubilizante (por exemplo, SDS) é muito alta, então pode haver um risco de que o biocatalisador seja afe tado por meio de perturbação da célula microbiana intacta e/ou desna- turação/inativação da enzima SHC/HAC.
[00237] A seleção de uma concentração apropriada de SDS no con texto da quantidade de biomassa e concentração do substrato (EEH) está dentro do conhecimento do versado na técnica. A título de exemplo, um modelo preditivo está disponível para o versado na técnica para determi nar as adequadas concentrações de SDS, substrato (EEH) e biomassa. A título de um exemplo adicional, o Exemplo 3 demonstra que a SDS na faixa de 0,010-0,075% é adequada quando 4g/l EEH e o biocatalisador para um OD de 10,0 (650nm) são usados. O Exemplo 7 demonstra que quando 125g/l EEH é usado com 2x o peso úmido da biomassa, uma concentração de SDS ajustada (1,55%) é apropriada. No entanto, uma investigação do per-centual de conversão de EEH para (-)-Ambrox usando diferentes valores de razão de células/SDS indicaram que a seleção correta da relação do biocatalisador, substrato homofarnesol e agente solubilizante (por exem-plo, SDS) facilita o desenvolvimento de um sistema de reação de biocon- versão sólido que demonstra um grau de tolerância a uma faixa de con-centrações de SDS (ver, por exemplo, Figura 17) e faixas de pH (ver Exemplo 15, Figura 18).
[00238] A temperatura da reação de bioconversão para a enzima SHC (por exemplo, AacSHC) é de 45-60°C, de preferência 55°C.
[00239] A faixa de pH da reação de bioconversão da enzima SHC (por exemplo, AacSHC) é de cerca de 5,0 a 7,0, com mais preferência de cerca de 5,6 a cerca de 6,2, ainda mais de preferência cerca de 6,0.
[00240] A temperatura da reação de bioconversão para a enzima de rivada de SHC/HAC é de cerca de 34 a cerca de 50°C, de preferência cerca de 35°C.
[00241] O pH da reação de bioconversão para a enzima derivada de SHC/HAC é de cerca de 4,8 a 6,4, de preferência cerca de 5,2-6,0.
[00242] De preferência, o agente solubilizante utilizado na reação de bioconversão SDS.
[00243] A concentração de SDS utilizada na reação de bioconversão para a enzima SHC TS (por exemplo, AacSHC) está na razão de cerca de 0,010-0,075%, de preferência cerca de 0,030% quando EEH em cerca de 4g/l é usado.
[00244] A concentração de SDS utilizada na reação de bioconversão para a enzima derivada de SHC/HAC está na faixa de cerca de 0,0025 0,090%, de preferência cerca de 0,050% quando EEH em cerca de 4g/l é usado.
[00245] O biocatalisador é carregado para a reação para um OD de 10,0 (650nm) quando a reação é carregada com homofarnesol em uma concentração de EEH de cerca de 4g/l EEH.
[00246] A razão entre [SDS]/[células] está na faixa de cerca de 10:1 20:1, de preferência cerca de 15:1-18:1, de preferência cerca de 16:1 quando a razão do biocatalisador para EEH homofarnesol é de cerca de 2:1
[00247] A concentração de SDS na reação de bioconversão para a enzima variante SHC está na faixa de cerca de 1 a 2%, de preferência na faixa de cerca de 1,4-1,7%, ainda mais de preferência de cerca de 1,5% quando a concentração de homofarnesol é de cerca de 125g/l EEH e a concentração do biocatalisador é de 250 g/l (correspondente a um OD de cerca de 175 (650nm).
[00248] A razão do biocatalisador para o substrato EEH homofarne sol está na faixa de cerca de 0,5:1 a 2:1, em algumas modalidades 2:1, de preferência cerca de 1:1 ou 0,5:1.
[00249] Em algumas modalidades, o Ambrox é produzido através de um biocatalisador ao qual o substrato homofarnesol é adicionado. É pos sível adicionar o substrato por alimentação usando meios conhecidos (por exemplo, bomba peristáltica, seringa de infusão e similares). Homo-farnesol é um composto solúvel em óleo e é fornecido em um formato de óleo. Dado que o biocatalisador (células microbianas como célula inteira recombinante intacta e/ou restos de células e/ou enzima imobilizada) está presente em uma fase aquosa, a reação de bioconversão pode ser considerada como um sistema de três fases (compreendendo uma fase aquosa, uma fase sólida e uma fase oleosa) quando o homofarnesol é adicionado à mistura de reação de bioconversão. Este é o caso mesmo quando SDS está presente. A título de esclarecimento, quando uma SHC TS ou derivado de SHC/HAC solúvel é usado como um biocatalisador, este é considerado um sistema de duas fases.
[00250] O número de isômeros de homofarnesol presentes pode in fluenciar a velocidade da reação. Como o Exemplo 11 demonstra, a en zima derivada de SHC/HAC é capaz da bioconversão do E,E-homofar- nesol para (-)-Ambrox a partir de uma mistura complexa de isômeros homofarnesol (por exemplo, EE:EZ:ZE:ZZ). No entanto, uma menor taxa de conversão é normalmente observada o que é consistente com o ponto de vista de que outros isômeros homofarnesol que não o EEH podem competir com o EEH para acesso às enzimas derivadas de SHC/HAC e assim podem agir como inibidores competitivos para a con-versão de EEH a (-)-Ambrox e/ou também atuam como substratos alter-nativos.
[00251] Por conseguinte, de preferência, o substrato homofarnesol compreende uma mistura estereoisomérica de 2-4 isômeros, de prefe-rência dois isômeros.
[00252] Por conseguinte, de preferência, o substrato homofarnesol consiste em ou consiste essencialmente em uma mistura estereoisomé- rica de 2-4 isômeros, de preferência dois isômeros.
[00253] De preferência o substrato homofarnesol compreende uma mistura estereoisomérica EE:EZ.
[00254] De preferência o substrato homofarnesol consiste em ou consiste essencialmente em uma mistura estereoisomérica EE:EZ.
[00255] Como o Exemplo 9 demonstra, uma conversão de 100% de EE:EZ em uma razão entre o peso de 87:13 foi observada em uma fer mentação de "um recipiente" e a reação de bioconversão executada ao longo de um período de 22,5 dias. Cerca de 10g de EEH foi convertido ao longo deste período de tempo.
[00256] Como descrito em detalhes no Exemplo 7, em uma modali dade preferida, um fermentador é usado para crescer a célula hospe deira recombinante expressando o gene derivado de SHC/HAC e pro duzindo enzimas derivadas de SHC/HAC ativas para uma concentração de biomassa suficiente adequada para uso como um biocatalisador no mesmo vaso fermentador que é usado para converter a fonte de homo-farnesol para (-)-Ambrox misturado com um ou mais dos subprodutos (II), (IV) e/ou (III conforme divulgado, por exemplo, na Figura 12). O (-)- Ambrox resultante pode ser isolado pela extração de vapor/destilação ou extração de solvente orgânico usando um solvente não miscíveis em água (para separar os produtos de reação e o substrato não reagido do biocatalisador que permanece na fase aquosa) seguido de evaporação subsequente do solvente para obter um produto de reação bruto con forme determinado pela análise de cromatografia em fase gasosa (GC). A extração de vapor/destilação e métodos de extração de solventes or-gânicos são conhecidos pelos versados na técnica.
[00257] A título de exemplo, o (-)-Ambrox resultante pode ser extra ído de toda a mistura de reação utilizando um solvente orgânico como um solvente não miscíveis em água (por exemplo, tolueno). Alternativa mente, o (-)-Ambrox resultante pode ser extraído da fase sólida da mis tura de reação (obtido por, por exemplo, centrifugação ou filtração) usando um solvente miscível em água (por exemplo, etanol) ou um sol ventenão miscíveis em água (por exemplo, tolueno). Por meio de outro exemplo, o (-)-Ambrox está presente na fase sólida como cristais ou na forma amorfa e pode ser separado da fase sólida restante (material ce lular ou detritos do mesmo) e a fase líquida também por meio de filtra ção.Por meio de outro exemplo, a uma temperatura acima do ponto de fusão do (-)-Ambrox (cerca de 75°C), o (-)-Ambrox pode formar uma ca mada de óleo na parte superior da fase aquosa, cuja camada de óleo pode ser removida e coletada. A fim de garantir a completa recuperação de (-)-Ambrox após a camada de óleo ser removida, um solvente orgâ nico pode ser adicionado à fase aquosa contendo a biomassa para ex trair qualquer (-)-Ambrox residual contido na, ou na ou sobre a bio massa. A camada orgânica pode ser combinada com a camada de óleo, antes de o todo ser adicionalmente processado para isolar e purificar o (-)-Ambrox.
[00258] O (-)-Ambrox pode ainda ser cristalizado seletivamente para remover os subprodutos (II), (IV) e (III) e qualquer substrato homofarne sol não reagido a partir do produto final (-)-Ambrox. O termo "cristalização seletiva" se refere a um processo pelo qual o (-)-Ambrox é levado a cristalizar a partir de um solvente enquanto os compostos (II), (III) e (IV) permanecem dissolvidos no solvente de cristalização de tal forma que o material cristalino isolado contém apenas o produto (-)-Am- brox, ou se ele contém qualquer um dos outros compostos (II), (III) ou (IV), então eles estão presentes apenas em quantidades olfatórias acei-táveis.
[00259] A etapa de cristalização seletiva pode utilizar um solvente miscível em água como o etanol ou similares. A pureza olfativa do pro duto final (-)-Ambrox é determinada através de um extrato de etanol a 10% em água ou testando o material cristalino. O produto final (-)-Am- brox é testado contra uma referência comercialmente disponível do pro duto (-)-Ambrox para a sua pureza olfativa, qualidade e seu perfil sen sorial. O material (-)-Ambrox também é testado em estudos de aplicação por especialistas a fim de determinar se o material cumpre as especifi cações em relação ao seu perfil organoléptico. Várias aplicações para o (-)-Ambrox incluem, mas não se limitam a, uma fragrância fina ou um produto de consumo como tratamento de tecidos, artigos de higiene, cuidados de beleza e produtos de limpeza incluindo essencialmente to dos os produtos onde os ingredientes atualmente disponíveis de Am- brox são utilizados comercialmente, incluindo, mas não limitado a: pro dutos Ambrox (Firmenich), Ambroxan (Henkel) Ambrofix (Givaudan), Amberlyn (Quest), Cetalox Laevo (Firmenich), Ambermor (Aromor) e Éter Norambrenolide (Pacific).
[00260] A cristalização seletiva de (-)-Ambrox pode ser influenciada pela presença de substrato homofarnesol não reagido e também a razão entre o (-)-Ambrox para os outros subprodutos detectáveis (II), (III) e/ou (IV). Mesmo se apenas uma conversão de 10% do substrato homofar nesol para (-)-Ambrox for obtida (como demonstrado no Exemplo 7, usando uma enzima SHC/HAC TS), a cristalização seletiva de (-)- Ambrox ainda é possível.
[00261] Exemplos de solventes adequados orgânicos miscíveis em água e não miscíveis em água para uso na extração e/ou cristalização seletiva de (-)-Ambrox incluem, mas não se limitam a, hidrocarbonetos alifáticos, de preferência aqueles com 5 a 8 átomos de carbono, como pentano, ciclopentano, hexano, ciclo-hexano, heptano, octano ou ciclo- octano, hidrocarbonetos alifáticos halogenados, de preferência com um ou dois átomos de carbono, como diclorometano, clorofórmio, tetraclo reto de carbono, dicloroetano ou tetracloroetano, hidrocarbonetos aro máticos como benzeno, tolueno, os xilenos, cloro-benzeno ou dicloro- benzeno, éteres ou alcoóis alifáticos acíclicos e cíclicos, de preferência com 4 a 8 átomos de carbono, como etanol, isopropanol, éter dietílico, éter metil ter-butílico, éter etil ter-butílico, éter dipropilo, éter isopropílico, éter dibutílico, tetra-hidrofurano ou ésteres como acetato de etilo ou ace tato de n-butilo ou cetonas como metil isobutil cetona ou dioxano ou misturas destes. Os solventes que são sobretudo utilizados preferenci almentesão os mencionados acima heptano, éter metil ter-butílico (tam bém conhecido como MTBE, éter ter-butílico metil, éter metil butílico ter ciário e tBME), éter di-isopropílico, tetra-hidrofurano, acetato de etilo e/ou suas misturas.
[00262] De preferência, um solvente miscível em água como o etanol é utilizado para a extração de (-)-Ambrox da fase sólida da mistura de reação. O uso de etanol é vantajoso porque é fácil de manusear, não é tóxico e é ambientalmente amigável.
[00263] O termo "isolado" como usado aqui se refere a um produto de bioconversão como o (-)-Ambrox que foi separado ou purificado a partir de componentes que o acompanham. Uma entidade que é produ zida em um sistema celular diferente da fonte da qual ela naturalmente teve origem é "isolada", porque vai ser necessariamente livre de com ponentes que naturalmente acompanham ela. O grau de isolamento ou pureza pode ser medido por qualquer método por RMN.
[00264] Em algumas modalidades, o produto final ((-)-Ambrox) é iso lado e purificado para homogeneidade (por exemplo, pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, ou 89,5% puro ou 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 99,5% puro).
[00265] Desejavelmente, a quantidade de (-)-Ambrox produzido pode ser de cerca de 1 mg/l a cerca de 20.000 mg/l (20g/l) ou superior como a partir de cerca de 20g/l a cerca de 200g/l ou de 100-200g/l, de prefe rência cerca de 125g/l ou 150g/l ou aproximadamente 188g/l.
[00266] Como o Exemplo 7 demonstra, pelo menos 125g/l de (-)-Am- brox é produzido em uma reação de bioconversão utilizando uma célula hospedeira recombinante de E. coli produzindo uma enzima derivada de SHC/HAC durante cerca de 2 dias.
[00267] Como o Exemplo 19 demonstra, é possível executar biocon- versões em 188g/l EEH ou superior uma vez que uma mistura eficiente é obtida como a eficiência da agitação parece ser a única limitação do sistema. Além disso, um bioctalisador com atividade melhorada (por exemplo, em termos de variantes de SHC com atividade mais melho rada ou em termos de aumento da produção da enzima SHC) pode me lhorar ou manter a produtividade usando menos biomassa que é vanta joso em relação à mistura de eficiências.
[00268] Por exemplo, cerca de 1 a cerca de 100 mg/l, cerca de 30 a cerca de 100 mg/l, cerca de 50 a cerca de 200 mg/l, cerca de 100 a cerca de 500 mg/l, cerca de 100 a cerca de 1.000 mg/l, cerca de 250 a cerca de 5.000 mg/l, cerca de mil (1g/l) a cerca de 15.000 mg/l (15g/l), ou cerca de 2 mil (2g/l) a cerca de 10.000 mg/l (10g/l) ou cerca de 2 mil (2g/l) a cerca de 25.000 mg/l (25g/l) ou cerca de 2 mil (2g/l) a cerca de 25.000 mg/l (25g/l), 26,000 mg/l (26g/l), 27,000 mg/l (27g/l), 28,000 mg/l (28 g/l), 29.000 mg/l (29g/l), 30,000 mg/l (30g/l), 40g/l, 50g/l, 60g/l, 70g/l, 80g/l, 90g/l, 100g/l, 110 g/l, 120g/l, 125 g/l, 130g/l, 140 g/l, 150g/l, 160 g/l, 170g/l, 180g/l, 190g/l ou 200g/l ou 300g/l ou 400g/l ou 500g/l de (-)- Ambrox é produzido.
[00269] De preferência, o (-)-Ambrox em uma concentração de pelo menos 100g/l é produzido dentro de um período de tempo de 48 a 72 horas.
[00270] De preferência, o (-)-Ambrox em uma concentração de cerca de 150g/l é produzido dentro de um período de tempo de cerca de 48 a 72 horas.
[00271] De preferência, o (-)-Ambrox em uma concentração de cerca de 200g/l é produzido dentro de um período de tempo de cerca de 48 a 72 horas.
[00272] De preferência, o (-)-Ambrox em uma concentração de cerca de 250g/l é produzido dentro de um período de tempo de cerca de 48 a 72 horas.
[00273] O versado na técnica compreenderá que maior produção cu-mulativa de títulos pode ser alcançada através da implementação de um processo contínuo, como remoção do produto, alimentação do substrato e adição da biomassa ou substituição (parcial).
[00274] De preferência, a bioconversão de EEH em (-)-Ambrox na presença de uma célula hospedeira recombinante compreendendo uma SHC/HAC TS ou um derivado de SHC/HAC gera um rendimento de Am- brox de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, dado em porcentagem de mol e baseado no moles de EEH empregado; especialmente, de preferência, o rendimento é entre 5 e 100, 10 e 100, e 100, 25 e 100, 30 e 100, 35 e 100, em particular entre 40 e 100, 45 e 100, 50 e 100, 60 e 100, 70 e 100 mol por cento.
[00275] A atividade da enzima HAC/SHC é definida através da taxa de reação (quantidade de produto/(quantidade de produto + quantidade de material de partida remanescente)) x 100) em percentagem de mol. De preferência, a bioconversão de EEH em (-)-Ambrox na presença de uma SHC TS ou uma enzima derivada de SHC/HAC gera um rendimento de Ambrox de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, dado em porcentagem de mol e baseado nos moles de EEH empregado; especialmente, de preferência, o rendimento é entre 5 e 100, 10 e 100, 20 e 100, 25 e 100, 30 e 100, 35 e 100, em particular entre 40 e 100, 45 e 100, 50 e 100, 60 e 100, 70 e 100.
[00276] Em uma modalidade preferida da invenção, o rendimento e/ou taxa de reação são determinados ao longo de um período de tempo definido, por exemplo, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 20, 24, 36 ou 48 horas durante o qual EEH é convertido em (-)-Ambrox por uma célula hospedeira re- combinante compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codi fica uma SHCTS ou a enzima derivada de SHC/HAC de acordo com a presente divulgação. Em uma nova variante, a reação é realizada sob condições estritamente definidas, por exemplo, 25°C, 30°C, 40°C, 50°C ou 60°C. Em especial, o rendimento e/ou taxa de reação são determi nados pela realização da reação de conversão de EEH em (-)-Ambrox pelas enzimas derivadas de SHC/HAC de acordo com a invenção a 35°C durante um período de 24-72 horas.
[00277] Em mais uma modalidade da presente invenção, uma célula hospedeira recombinante compreendendo uma sequência de nucleotí- deos que codifica um derivado SHC/HAC é caracterizado em que ele mostra um 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 10-, 11-, 12-, 13-, 14-, 15-, 16-, 17 , 18-, 19-, 20-, 21-, 22-, 23-, 24-, 25-, 26-, 27-, 28-, 29-, 30-, 31-, 32-, 33 , 34-, 35-, 36-, 37-, 38-, 39, 40-, 41-, 42-, 43-, 44-, 45-, 46-, 47-, 48-, 49 , 50-, 51-, 52-, 53-, 54-, 55-, 56-, 57, 58-, 59-, 60-, 61-, 62-, 63-, 64-, 65 , 66-, 67-, 68-, 69-, 70-, 71-, 72-, 73-, 74-, 75, 76-, 77-, 78-, 79-, 80-, 81 , 82-, 83-, 84-, 85-, 86-, 87-, 88-, 89-, 90-, 91-, 92-, 93, 94-, 95-, 96-, 97 , 98-, 99-, 100-, 200-, 500-, 1000-vezes ou maior rendimento e/ou taxas de reação na reação de homofarnesol para produzir (-)-Ambrox em com-paração com a SHC TS ou enzima derivada de SHC/HAC nas mesmas condições. Aqui, o termo condição se refere o a condições de reação como a concentração do substrato, a concentração da enzima, o perí odo de reação e/ou a temperatura.
[00278] O êxito do desenvolvimento de um processo de bioconver- são para produção de (-)-Ambrox a partir de homofarnesol em uma cepa recombinante de E. coli compreendendo uma sequência de nucleotí- deos que codifica uma SHC TS/referência ou um derivado de SHC/HAC pode oferecer um baixo custo e processo industrial econômico para a produção de (-)-Ambrox.
[00279] Como o Exemplo 7 demonstra, a presente divulgação resulta na conversão de 100% de E,E-Homofarnesol (125g/l) para (-)-Ambrox após 48 horas de incubação com um derivado otimizado de SHC/HAC com uma melhora de 8 vezes na produtividade quando um derivado AacSHC é usado em comparação com a enzima AacSHC TS (ver a Fi gura 11).
[00280] Homólogos funcionais da SHC/HAC TS de referência ou os polipeptídeos derivados de SHC/ HAC descritos aqui também são ade-quados para uso na produção de Ambrox em um hospedeiro recombi- nante. Assim, o hospedeiro recombinante pode incluir um ou mais áci dos nucleicos heterólogos codificando homólogos funcionais dos poli- peptídeos descritos acima e/ou ácido nucleico heterólogo codificando uma enzima derivada de SHC/HAC como descrita aqui.
[00281] Um homólogo funcional é um polipeptídeo que tem similari dade de sequência a um polipeptídeo de referência e que realiza uma ou mais das funções bioquímicas ou fisiológicas do polipeptídeo de re ferência. Um homólogo funcional e um polipeptídeo de referência po dem ser polipeptídeos de ocorrência natural, e a similaridade de se quência pode ser devido a eventos evolutivos convergentes ou diver gentes. Como tal, os homólogos funcionais são algumas vezes desig nados na literatura como homólogos ou ortólogos ou parálogos. As va riantes de um homólogo funcional de ocorrência natural, como polipep- tídeos codificados por mutantes de uma sequência de codificação de tipo selvagem, podem ser homólogos funcionais. Os homólogos funcio naistambém podem ser criados através da mutagênese sítio-dirigida da sequência de codificação para um polipeptídeo, ou pela combinação de domínios a partir das sequências de codificação para diferentes polipep- tídeos de ocorrência natural ("troca de domínio"). Técnicas para modifi cação de genes que codificam homólogos funcionais descritos aqui são conhecidas e incluem, entre outros, técnicas de evolução direcionada, mutagênese sítio-dirigida e técnicas de mutagênese aleatória, e podem ser úteis para aumentar a atividade específica de um polipeptídeo, alte rar a especificidade do substrato, alterar os níveis da expressão, alterar a localização subcelular, ou modificar as interações polipeptídeo:poli- peptídeo da maneira desejada. Tais polipeptídeos modificados são con sideradoshomólogos funcionais. O termo "homólogo funcional"é às ve zes aplicado ao ácido nucleico que codifica um polipeptídeo homólogo funcionalmente.
[00282] Os homólogos funcionais podem ser identificados pela aná lise dos alinhamentos da sequência de nucleotídeo e polipeptídeo. Por exemplo, realizando uma consulta em um banco de dados de sequên cias de nucleotídeos ou polipeptídeos pode identificar homólogos das sequências de ácidos nucleicos que codificam os polipéptidos derivati vos de SHC e similares.
[00283] A hibridização também pode ser usada para identificar ho mólogos funcionais e/ou como uma medida de homologia entre duas sequências de ácidos nucleicos. Uma sequência de ácido nucleico co dificando qualquer das proteínas divulgadas aqui ou parte dela pode ser utilizada como uma sonda de hibridização de acordo com as técnicas de hibridação padrão. A hibridização de uma sonda de DNA ou RNA a partir de uma fonte de teste (por exemplo, uma célula de mamíferos) é uma indicação da presença de DNA ou RNA na fonte de teste. Condi ções de hibridização são conhecidas pelos versados na técnica e po dem ser encontradas em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., 6.3.1-6.3.6, 1991. As condições de hibridização mo deradassão definidas como equivalentes à hibridização em 2x cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a 30°C seguido de uma lavagem em 1x CCD, 0,1% SDS a 50°C. As condições altamente estringentes são defi nidas como equivalentes à hibridização em 6x cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a 45°C seguido de uma lavagem em 0.2x CCD, 0,1% SDS a 65°C.
[00284] A análise sequencial para identificar os homólogos funcio-naistambém pode envolver BLAST, BLAST recíproca ou análise PSI- BLAST de bancos de dados não redundantes usando uma sequência de aminoácidos relevantes como a sequência de referência. A sequên cia de aminoácidos é, em algumas circunstâncias, deduzida da sequên cia de nucleotídeos. Os polipeptídeos no banco de dados que possuem mais de 40% de identidade de sequência são candidatos para posterior avaliação de aptidão para uso na reação de bioconversão de SHC/HAC. A similaridade da sequência de aminoácidos permite substituições de aminoácidos conservadoras, como a substituição de um resíduo hidro- fóbico por outro ou a substituição de um resíduo polar por outro. Se desejado, inspeção manual desses candidatos pode ser realizada com o intuito de reduzir o número de candidatos a serem avaliados adicio-nalmente.Inspeção manual pode ser realizada selecionando aqueles candidatos que parecem ter, por exemplo, domínios funcionais conser-vados.
[00285] Normalmente, os polipeptídeos que apresentam pelo menos cerca de 30% de identidade de sequência de aminoácidos são úteis para identificar as regiões conservadas. Regiões conservadas de poli- peptídeos relacionados apresentam pelo menos 30%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, de identidade de sequência de aminoácidos. Em algu mas modalidades, uma região conservada apresenta pelo menos, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade de sequência de aminoácidos. Identidade de sequência pode ser determinada con forme estabelecido acima e abaixo.
[00286] A SHC TS produzida e/ou derivado de SHC/HAC é baseada em uma SEQ ID N°. 1, SEQ ID N°. 2, SEQ ID N°. 3 ou SEQ ID N°. 4 de aminoácido ou uma variante, homólogo, mutantes, derivados ou frag-mentos do mesmo.
[00287] A SHC produzida é baseada em uma sequência de aminoá- cidos com pelo menos 30%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade para a SEQ ID N°. 1 ou SEQ ID N°. 2 ou SEQ ID N°. 3 ou SEQ ID N°. 4.
[00288] Além disso, a SHC de referência produzida é baseada em uma sequência de aminoácidos produzidos a partir de E. coli.
[00289] A "porcentagem (%) de identidade" em relação a uma se quência de referência de nucleotídeos de um gene é definida como a percentagem de nucleotídeos em uma sequência de DNA candidata que é idêntica com os nucleotídeos em uma sequência de DNA, depois do alinhamento da sequência e introduzindo lacunas, se necessário, para obter a porcentagem máxima de identidade de sequência e não consi derando quaisquer substituições conservadoras como parte da identi dade de sequência. O alinhamento para efeitos de determinação da per centagem de identidade de nucleotídeos pode ser alcançado de várias maneiras que estão dentro da especialidade na técnica, por exemplo, usando programas de computador disponibilizados ao público. Os ver sados na técnica podem determinar parâmetros adequados para medir o alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para alcan çar o máximo alinhamento ao longo de todo o comprimento das sequên cias a serem comparadas.
[00290] Os termos "polipeptídeo"e "proteína" são usados intercam- biavelmente aqui e significam qualquer cadeia ligada ao peptídeo de aminoácidos, independentemente do comprimento ou modificação pós- translacional.
[00291] Conforme usado aqui, o termo "derivado" inclui, mas não se limita a, uma variante. Os termos "derivado" e "variante"são usados intercambiavelmente aqui.
[00292] Conforme usado aqui, o termo "variante" deve ser entendido como um polipeptídeo que difere em comparação com o polipeptídeo do qual ele é derivado por uma ou mais alterações na sequência de aminoácidos. O polipeptídeo do qual uma variante é derivada é também conhecido como original ou polipeptídeo de referência. Normalmente, uma variante é construída artificialmente, de preferência por meios tec nológicos genéticos. Normalmente, o polipeptídeo a partir do qual a va rianteé derivada é uma proteína do tipo selvagem ou domínio da prote ína de tipo selvagem. No entanto, as variantes utilizáveis na presente divulgação também podem ser derivadas de homólogos, ortólogos ou parólogos do polipeptídeo original ou variantes artificialmente construí das, desde que a variante apresente pelo menos uma atividade bioló gica do polipeptídeo original. As alterações na sequência de aminoáci- dos podem ser trocas de aminoácido, inserções, deleções, truncamen tos N-terminal ou truncamentos C-terminal ou qualquer combinação destas alterações que podem ocorrer em um ou vários sítios.
[00293] Em modalidades preferidas, uma variante utilizável na pre sente divulgação apresenta um número total de até 200 (até 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 ou 200) altera ções na sequência de aminoácidos (ou seja, trocas, inserções, dele- ções, truncamentos N-terminal e/ou truncamentos C-terminal). As tro cas de aminoácido podem ser conservadoras e/ou não-conservadoras. Em modalidades preferidas, uma variante utilizável na presente divulga ção difere da proteína ou do domínio a partir do qual é derivada por até 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 trocas de aminoácidos, preferencialmente tro cas conservadoras de aminoácido. As variantes podem adicionalmente ou alternativamente compreender deleções de aminoácidos, que podem ser truncamentos N-terminal, truncamentos C-terminal ou deleções internas ou qualquer combinação destes. Tais variantes compreen dendo truncamentos N-terminal, truncamentos C-terminal e/ou deleções internas são referidos como "variantes de deleção"ou "fragmentos" no contexto do presente pedido. Os termos "variante de deleção"e "frag mento"são usados intercambiavelmente aqui. Uma variante de deleção pode ser de ocorrência natural (por exemplo, variantes de splice) ou pode ser construída artificialmente, de preferência por meios tecnológi-cosgenéticos. Normalmente, a proteína ou o domínio de proteína a par tir do qual a variante de deleção é derivada é uma proteína de tipo sel vagem. No entanto, as variantes de deleção da presente divulgação também podem ser derivadas de homólogos, ortólogos ou parólogos do polipeptídeo original ou variantes artificialmente construídas, desde que a variante de deleção apresente pelo menos uma atividade biológica do polipeptídeo original. De preferência, uma variante de deleção (ou frag-mento) tem uma deleção de até 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 aminoácidos no seu N-terminus e/ou no C-terminus e/ou internamente como em re lação ao polipeptídeo original.
[00294] Uma "variante" como usada aqui, pode alternativa ou adicio-nalmente ser caracterizada por um certo grau de identidade de sequên cia para o polipeptídeo original do qual ela é derivada. Uma variante da SHC/HAC TS/referência ou o derivado da SHC/HAC da presente divul-gação podem ter uma identidade de sequência de pelo menos 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo me nos 99% de identidade para os respectivos polipeptídeo de referência ou os respectivos polinucleotídeos de referência.
[00295] A expressão "pelo menos 30%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade de sequência" é usada ao longo do relatório específico em relação às comparações da sequência de polipeptídeo e polinucleotídeo.
[00296] Um polinucleotídeo que pertence a uma família de qualquer das enzimas divulgadas aqui ou uma proteína pode ser identificado com base em sua similaridade com o gene relevante ou a proteína, respec tivamente. Por exemplo, a identificação pode ser baseada na identidade de sequência. Em certas modalidades preferidas, a divulgação apre-sentamoléculas de ácido nucleico isoladas que são pelo menos 30%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idênticas a (a) uma molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo da SEQ ID N°. 5-163 (ver Tabelas 14-17 e a Tabela 4a como fornecidas aqui) (b) a sequência de nucleotídeos da SEQ ID N°. 6-168, 169, 170, 172, 174 e 176 (consultar Tabelas 14-17 e a Tabela 4a como fornecidas aqui) e (c) uma molécula de ácido nucleico que inclui um segmento de pelo menos 30 (por exemplo, pelo menos 30, 40, 50, 60, 80, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 850, 900, 950, 1000 ou 1010) nucleotídeos da SEQ ID N°. 6 168, 169, 170, 172, 174 e 176 (consultar Tabelas 14-17 e a Tabela 4a como fornecidas aqui).
[00297] De preferência, o polipeptídeo em questão e o polipeptídeo de referência exibem a sequência de identidade indicada ao longo de um trecho contínuo de 20, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ou mais aminoácidos. De preferência, o polinucleotídeo em questão e o polipep- tídeo de referência exibem a identidade de sequência indicada ao longo de um trecho contínuo de 60, 90, 120, 135, 150, 180, 210, 240, 270, 300 ou mais nucleotídeos. No caso de duas sequências serem comparadas e a sequência de referência não é especificada em comparação a qual a percentagem de identidade de sequência deve ser calculada, a iden tidade de sequência é calculada com referência a mais longa de duas sequências de ser comparadas, se não especificamente indicado em contrário. Se a sequência de referência é indicada, a identidade de se-quência é determinada com base no comprimento total da sequência de referência indicado pela SEQ ID N°. 1, 2, 3 e/ou 4 se não especifica mente indicado em contrário.
[00298] Por exemplo, uma sequência de peptídeo consistindo em 130 aminoácidos comparados aos aminoácidos de comprimento total da SHC de referência com 631 resíduos de aminoácidos pode apresen tar uma porcentagem de identidade de sequência máxima de 20,6% (130/631 x 100) enquanto uma sequência com um comprimento de 300 aminoácidos pode apresentar uma percentagem de identidade de se quência máxima de 47,5% (300/631 x 100). A similaridade das sequências do nucleotídeo e do aminoácido, ou seja, a percentagem de identidade de sequência, pode ser determinada pelos alinhamentos de sequências. Tais alinhamentos podem ser realizados com vários algo-ritmos conhecidos da técnica, de preferência com o algoritmo matemá tico de Karlin e Altschul (Karlin & Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877), com hmmalign (pacote HMMER, http://hmmer.wustl.edu/) ou com o algoritmo CLUSTAL (Thompson, J. D., Higgins, D.G. & Gibson, T.J. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 4673-80) disponível, por exemplo, em http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/ ou em http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html ou em http://npsa- pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_clustalw.html ou
[00299] o programa GAP (algoritmo matemático da Universidade de Iowa) como utilizado no alinhamento de sequência de SHC TS como fornecidos na Tabela 18 aqui ou o algoritmo matemático de Myers e Miller (1989 - Cabios 4: 11-17) conforme divulgado em e como utilizado nos alinhamentos de sequência de SHC TS na Tabela 19 conforme for necido aqui.
[00300] Parâmetros preferenciais utilizados são os parâmetros pa drão como se encontram definidos em http://www.ebi.ac.uk/Tools/clus- talw/ ou http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html.
[00301] O grau de identidade de sequência (identidade de sequên cia) pode ser calculado utilizando, por exemplo, BLAST, BLAT ou BlastZ (ou BlastX). Um algoritmo semelhante está incorporado nos programas BLASTN e BLASTP de Altschul et al (1990) J. Mol. Biol. 215, 403-410. As buscas de polinucleotídeos em BLAST são realizadas com o pro grama BLASTN, pontuação = 100, comprimento de palavra = 12, para obter sequências polinucleotídicas que sejam homólogas aos ácidos nu- cleicos que codificam a proteína relevante.
[00302] As buscas de proteína em BLAST são realizadas com o programa BLASTP, pontuação = 50, comprimento de palavra = 3, para obter sequências de aminoácidos homólogas para o polipeptídeo SrKO. Para obter os alinhamentos com lacunas para fins comparativos, Gap ped BLAST é utilizado como descrito em Altschul et al (1997) Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402. Quando utilizando os programas BLAST e Gapped BLAST, os parâmetros padrão dos respectivos programas são usados. Análise de correspondência de sequência pode ser completada por técnicas de mapeamento de homologia estabelecidas como Shuffle LAGAN (Brudno M., Bioinformatics 2003b, 19 Supl 1:154-162) ou cam pos aleatórios de Markov. Quando as porcentagens de identidade de sequência são referidas no presente pedido, estas percentagens são calculadas em relação ao comprimento total da sequência mais longa, se não especificamente indicado em contrário.
Sensorial
[00303] A bioconversão de homofarnesol para (-)-Ambrox de acordo com a presente divulgação produz (-)-Ambrox como um composto pre dominante, mas também podem produzir compostos outros que (-)-Am- brox que podem ou não conferir notas olfativas agradáveis à mistura de bioconversão e assim podem contribuir de forma positiva ou negativa para o caráter sensorial do produto final (-)-Ambrox. Por conseguinte, uma análise sensorial é realizada através de testes sensoriais bem esta-belecidos utilizados por especialistas treinados (por exemplo, perfumis- tas) de forma que o teste pode ajudar a determinar se um produto alvo quimicamente relevante também é um produto final relevante olfativa mente em relação a um produto de referência. Como a análise sensorial no Exemplo 22 demonstra, a remoção de um ou mais compostos de sub-produtos a partir de (-)-Ambrox pode melhorar o odor dos compostos res-tantes de ((-)-Ambrox) mesmo se os compostos removidos forem efetiva-mente sem odor em si. Isto é, uma melhora do odor de (-)-Ambrox foi observada na ausência dos compostos II, III e IV.
Aspectos da Invenção
[00304] 1. Um processo de preparação de (-)-Ambrox ou uma mis tura compreendendo (-)-Ambrox, sendo que (3E,7E)-homofarnesol (EEH) ou uma mistura de estereoisômeros compreendendo EEH é con vertido enzimaticamente para (-)-Ambrox ou uma mistura compreen dendo (-)-Ambrox onde a conversão enzimática é realizada utilizando uma enzima SHC/HAC sob condições de reação adequada para a pro dução de (-)-Ambrox e onde a mistura de estereoisômeros compreen dendo EEH consiste essencialmente de isômeros homofarnesol seleci onados a partir do grupo que consiste em [(3E,7E) e [(3Z,7E)] e/ou [(3E,7E) e (3E,7Z)] e/ou [(3Z,7E,3E,7E) e (3E, 7Z)] também designado como [EE:EZ], [EE:ZE] e [EE:EZ:ZE] respectivamente.
[00305] 2. Um processo de preparação de (-)-Ambrox ou uma mis tura compreendendo (-)-Ambrox, sendo que (3E,7E)-homofarnesol (EEH) ou uma mistura de estereoisômeros compreendendo EEH é en- zimaticamente convertido para produzir (-)-Ambrox ou uma mistura compreendendo (-)-Ambrox onde a conversão enzimática usando uma enzima SHC/HAC é realizada sob condições de reação adequadas para a produção de (-)-Ambrox e onde se a reação for realizada na presença de um agente solubilizante, Triton X-100 ou taurodeoxicolato não é usado em combinação com uma enzima SHC/HAC do tipo selvagem.
[00306] 3. Um processo de preparação de (-)-Ambrox ou uma mis tura compreendendo (-)-Ambrox, sendo que (3E,7E)-homofarnesol (EEH) ou uma mistura de estereoisômeros compreendendo EEH é con vertido enzimaticamente para (-)-Ambrox ou uma mistura compreen dendo (-)-Ambrox onde a conversão enzimática é realizada utilizando uma enzima SHC/HAC sob condições de reação adequada para a pro dução de (-)-Ambrox e onde a mistura de estereoisômeros compreen dendo EEH consiste essencialmente de isômeros homofarnesol seleci onados a partir do grupo que consiste em [(3E,7E) e [(3Z,7E)] e/ou [(3E,7E) e (3E,7Z)] e/ou [(3Z,7E,3E,7E) e (3E, 7Z)] também designado como [EE:EZ], [EE:ZE] e [EE:EZ:ZE] respectivamente e onde a reação ocorre em um sistema de 3 fases compreendendo uma fase aquosa, uma fase sólida e uma fase oleosa.
[00307] 4. O processo de acordo com o parágrafo 1 ou o parágrafo 2 ou o parágrafo 3 onde o processo é realizado usando uma sequência de polipeptídeo da enzima SHC/HAC selecionada o grupo que consiste em SEQ ID N°. 1, SEQ ID N°. 2, SEQ ID N°. 3; SEQ ID N°. 4, ou um derivado de SHC/ HAC selecionado da Tabela 1, Tabela 5, Tabela 2, Tabela 6, Tabela 3, Tabela 7, Tabela 4, Tabela 8 ou Tabela 13, Ta- bela14, ou selecionado a partir da SEQ ID N°. 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 171, 173, 175, 177 e/ou 178 ou uma sequência com pelo menos 30% de identidade, pelo menos 40% de identidade, pelo menos 50% de identidade, ou pelo menos 60% de identidade, ou pelo menos 70% de identidade, ou pelo menos 80% de identidade, ou pelo menos 90% de identidade, ou pelo menos 95% de identidade, ou pelo menos 96% de identidade, ou pelo menos 97% de identidade, ou pelo menos 98% de identidade, ou pelo menos 99% de identidade para a SEQ ID N°. 1, SEQ ID N°. 2, SEQ ID N°. 3 ou SEQ ID N°. 4.
[00308] 5. O processo de qualquer um dos parágrafos de 1 a 4 em que o processo utiliza células hospedeiras recombinantes que produ zem a enzima SHC/HAC.
[00309] 6. O processo de acordo com o parágrafo 4 ou 5 em que a sequência de nucleotídeos codificando a enzima SHC/HAC é selecio nada a partir do grupo que consiste em SEQ ID N°. 165, 166, 167, 168, 169 ou SEQ ID N°. 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 e/ou 170, 172, 174 e/ou 176.
[00310] 7. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 6 em que a conversão de homofarnesol para (-)-Ambrox ocorre a uma temperatura na faixa de 30°C a 60°C, a um pH na faixa de cerca de 4 8.
[00311] 8. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 7 em que a conversão de homofarnesol para (-)-Ambrox ocorre usando uma ou mais das condições de reação para SHC/HAC do tipo selvagem ou as enzimas derivadas de SHC/HAC conforme definido na Tabela 24 ou Tabela 24a, de preferência em uma faixa de pH de 5,0 a 6,2, de preferência a uma temperatura de 35°C.
[00312] 9. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos 3 8 em que a proporção de células/SDS no intervalo de 10:1 para 20:1, preferencialmente em 16:1 quando a razão do biocatalisador para EEH é de cerca de 2:1.
[00313] 10. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos 3-9 em que a razão entre o peso do bicatalisador para homofarnesol está na faixa de cerca de 0,5-2:1, de preferência cerca de 1:1 ou 0,5:1.
[00314] 11. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos 3-10 em que o crescimento celular e as etapas de reação de bioconver- são são realizados no mesmo vaso de reação.
[00315] 12. O processo de acordo com o parágrafo 2 em que o subs trato homofarnesol compreende um ou mais estereoisômeros de homo-farnesol.
[00316] 13. O processo de acordo com o parágrafo 12 em que o substrato homofarnesol compreende ou consiste essencialmente em dois estereoisômeros de homofarnesol.
[00317] 14. O processo de acordo com o parágrafo 13 em que o substrato homofarnesol compreende ou consiste essencialmente em estereoisômeros de EE:EZ.
[00318] 15. O processo de acordo com os parágrafo 14 em que o homofarnesol compreende ou consiste essencialmente em uma mistura de estereoisômero EE:EZ em razões entre o peso selecionadas a partir do grupo que consiste em: 100:00; 99:01; 98:02; 97:03; 96:04; 95:05; 94:06; 93:07; 92:08; 91:09; 90:10; 89:11; 88:12; 87:13; 86:14; 85:15; 84:16; 83:17; 82:18; 81:19; 80:20; 79:21; 78:22; 77:23; 76:24; 75:25; 74:26; 73:27; 72:28; 71:29 70:30; 69:31; 68:32; 67:33; 66:34; 65:35; 64:36; 63:37; 62:38; 61:39; e 60:40.
[00319] 16. O processo de acordo com o parágrafo 15 em que o ho mofarnesol compreende ou consiste essencialmente de uma mistura de estereoisômero EE:EZ em uma razão entre o peso selecionada a partir do grupo que consiste em: EE:EZ 92:8; EE:EZ 90:10; EE:EZ 80:20; EE:EZ 86:14; EE:EZ 70:30; EE:EZ 69:31; e EE:EZ 66:34.
[00320] 17. O processo de acordo com o parágrafo 15 ou o parágrafo 16 em que o homofarnesol compreende ou consiste essencialmente de uma mistura de estereoisômero EE:EZ em uma razão entre o peso de 80:20.
[00321] 18. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-17 em que o (-)-Ambrox é produzido pela mistura com pelo menos um ou mais dos subprodutos (II), (IV) e/ou (III).
[00322] 19. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-18 em que o (-)-Ambrox é isolado a partir da mistura de reação de bioconversão utilizando um solvente orgânico ou uma etapa de vapor de extração/ destilação ou de filtração.
[00323] 20. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-19 em que o (-)-Ambrox é isolado da fase sólida a partir da mistura de reação de bioconversão utilizando um solvente orgânico ou uma etapa de vapor de extração/ destilação.
[00324] 21. O processo de acordo com o parágrafo 19 ou 20 em que o (-)-Ambrox é isolado a partir da mistura de reação utilizando um sol-venteorgânico.
[00325] 22. O processo de acordo com o parágrafo 21 em que o (-)- Ambrox é isolado a partir da mistura de reação utilizando etanol ou tolueno.
[00326] 23. O processo de acordo com o parágrafo 19-22 em que o (-)-Ambrox é seletivamente cristalizado utilizando um solvente orgânico.
[00327] 24. O processo de acordo com o parágrafo 23 em que o (-)- Ambrox é substancialmente livre de subprodutos (II), (IV) e/ou (III).
[00328] 25. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-24 em que o (-)-Ambrox em uma faixa de concentração de cerca de 125-200g/l é produzido.
[00329] 26. (-)-Ambrox obtenível pelo método de qualquer um dos parágrafos 1-25 em que o (-)-Ambrox tem um limiar de odor de cerca de 0,1 a cerca de 0,5ng/l.
[00330] 27. O (-)-Ambrox do parágrafo 26 em uma forma sólida, de preferência uma forma amorfa ou cristalina.
[00331] 28. Um processo para produzir um produto contendo o (-)- Ambrox compreendendo incorporando o (-)-Ambrox de qualquer um dos parágrafos 26 ou 27 para o produto.
[00332] 29. O processo do parágrafo 28 em que o produto é um pro duto de perfumaria, cosmético, produto de limpeza, um produto deter gente ou um produto de sabão.
[00333] 30. Uma fragrância ou um cosmético ou um produto para cui dados do consumidor compreendendo o (-)-Ambrox de qualquer um dos parágrafos 26 ou 27.
[00334] 31. Uma fragrância ou um cosmético ou um produto para cui dados do consumidor compreendendo o (-)-Ambrox do parágrafo 26 ou 27 e um ou mais componentes adicionais.
[00335] 32. O uso do (-)-Ambrox do parágrafo 26 ou 27 como parte de uma fragrância ou um cosmético ou um produto de consumo como tratamento de tecido, higiene pessoal, cuidados de beleza e/ou um pro duto de limpeza.
[00336] 33. Um processo para aumentar, acentuar ou conferir um aroma em ou para uma composição de fragrância compreendendo a etapa de misturar com a referida composição de fragrância, um aroma aumentando ou reforçando o produto produzido de acordo com um pro-cesso compreendendo as etapas de: (a) preparação de uma mistura de reação compreendendo o (-)-Ambrox misturado com um ou mais dos compostos dos subprodutos (II), (III) ou (IV). (b) extração do (-)-Ambrox misturado com um ou mais dos compostos dos subprodutos (II), (III) ou (IV); e (c) seletivamente cristalizando o (-)-Ambrox a partir da mis tura de extração; em que processo o (-)-Ambrox é preparado por uma conver são enzimática de (3E,7E)-homofarnesol (EEH) ou uma mistura de es- tereoisômeros compreendendo EEH utilizando uma enzima SHC/HAC sob condições de reação adequadas para a produção de (-)-Ambrox e onde a mistura de estereoisômeros compreendendo EEH consiste es sencialmente de isômeros homofarnesol selecionados a partir do grupo que consiste em [(3E,7E) e [(3Z,7E)] e/ou [(3E,7E) e (3E,7Z)] e/ou [(3Z,7E,3E,7E) e (3E, 7Z)] também designado como [EE:EZ], [EE:ZE] e [EE:EZ:ZE] respectivamente.
[00337] 34. O processo do parágrafo 33 em que a reação ocorre em um sistema de três fases compreendendo uma fase aquosa, uma fase sólida e uma fase oleosa.
[00338] 35. O processo de acordo com o parágrafo 33 ou o parágrafo 34 onde o processo é realizado usando uma sequência de polipeptídeo da enzima SHC/HAC selecionada o grupo que consiste em SEQ ID N°. 1, SEQ ID N°. 2, SEQ ID N°. 3; SEQ ID N°. 4, ou um derivado de SHC/ HAC selecionado da Tabela 1, Tabela 5, Tabela 2, Tabela 6, Tabela 3, Tabela 7, Tabela 4, Tabela 8 ou Tabela14, ou selecionado a partir da SEQ ID N°. 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31,33, 35, 37, 39, 171, 173, 175 e/ou 177 ou uma sequência com pelo menos 30% de identidade, pelo menos 40% de identidade, pelo menos 50% de identi dade, ou pelo menos 60% de identidade, ou pelo menos 70% de identi-dade, ou pelo menos 80% de identidade, ou pelo menos 90% de identi-dade, ou pelo menos 95% de identidade, ou pelo menos 96% de identi-dade, ou pelo menos 97% de identidade, ou pelo menos 98% de identi dade, ou pelo menos 99% de identidade para a SEQ ID N°. 1, SEQ ID N°. 2, SEQ ID N°. 3 ou SEQ ID N°. 4.
[00339] 36. O processo de qualquer um dos parágrafos de 33-35 em que o processo utiliza células hospedeiras recombinantes que produ zem a enzima SHC/HAC.
[00340] 37. O processo de acordo com o parágrafo 35 ou 36 em que a sequência de nucleotídeos codificando a enzima SHC/HAC é selecio-nada a partir do grupo que consiste em SEQ ID N°. 165, 166, 167, 168, 169 ou SEQ ID N°. 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 e/ou 170, 172, 174 e/ou 176.
[00341] 38. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos 33-37 em que a conversão de homofarnesol para (-)-Ambrox ocorre a uma temperatura na faixa de 30°C a 60°C, a um pH na faixa de cerca de 4-8.
[00342] 39. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos 33-38 em que a conversão de homofarnesol para (-)-Ambrox ocorre usando uma ou mais das condições de reação para SHC/HAC do tipo selvagem ou as enzimas derivadas de SHC/HAC conforme definido na Tabela 24 ou Tabela 24a, de preferência em uma faixa de pH de 5,0 a 6,2, de preferência a uma temperatura de 35°C.
[00343] 40. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos 34-39 em que a proporção de células/SDS no intervalo de 10:1 para 20:1, preferencialmente em 16:1 quando a razão do biocatalisador para EEH é de cerca de 2:1.
[00344] 41. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos 34-40 em que a razão entre o peso do bicatalisador para homofarnesol está na faixa de cerca de 0,5-2:1, de preferência cerca de 1:1 ou 0,5:1.
[00345] 42. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos 34-41 em que o crescimento celular e as etapas de reação de biocon- versão são realizados no mesmo vaso de reação.
[00346] 43. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos 33-42 em que o homofarnesol compreende ou consiste essencialmente de uma mistura de estereoisômero EE:EZ em razões entre o peso sele-cionadas a partir do grupo que consiste em: 100:00; 99:01; 98:02; 97:03; 96:04; 95:05; 94:06; 93:07; 92:08; 91:09; 90:10; 89:11; 88:12; 87:13; 86:14; 85:15; 84:16; 83:17; 82:18; 81:19; 80:20; 79:21; 78:22; 77:23; 76:24; 75:25; 74:26; 73:27; 72:28; 71:29 70:30; 69:31; 68:32; 67:33; 66:34; 65:35; 64:36; 63:37; 62:38; 61:39; e 60:40.
[00347] 44. O processo de acordo com o parágrafo 43 em que o ho mofarnesol compreende ou consiste essencialmente de uma mistura de estereoisômero EE:EZ em uma razão entre o peso selecionada a partir do grupo que consiste em: EE:EZ 92:08; EE:EZ 90:10; EE:EZ 80:20; EE:EZ 86:14; EE:EZ 70:30; EE:EZ 69:31; e EE:EZ 66:34.
[00348] 45. O processo de acordo com o parágrafo 43 ou o parágrafo 44 em que o homofarnesol compreende ou consiste essencialmente de uma mistura de estereoisômero EE:EZ em uma razão entre o peso de 80:20.
[00349] 46. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos 33-45 em que o (-)-Ambrox é produzido pela mistura com pelo menos um ou mais dos subprodutos (II), (IV) e/ou (III).
[00350] 47. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos 33-46 em que o (-)-Ambrox é isolado a partir da mistura de reação de bioconversão utilizando um solvente orgânico ou uma etapa de vapor de extração/ destilação ou de filtração.
[00351] 48. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos 33-47 em que o (-)-Ambrox é isolado da fase sólida a partir da mistura de reação de bioconversão utilizando um solvente orgânico ou uma etapa de vapor de extração/ destilação.
[00352] 49. O processo de acordo com o parágrafo 47 ou 48 em que o (-)-Ambrox é isolado a partir da mistura de reação utilizando um sol-venteorgânico.
[00353] 50. O processo de acordo com o parágrafo 49 em que o (-)- Ambrox é isolado a partir da mistura de reação utilizando etanol ou to- lueno.
[00354] 51. O processo de acordo com o parágrafo 47-49 em que o (- )-Ambrox é seletivamente cristalizado utilizando um solvente orgânico.
[00355] 52. O processo de acordo com o parágrafo 51 em que o (-)- Ambrox é substancialmente livre de subprodutos (II), (IV) e/ou (III).
[00356] 53. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos 33-52 em que o (-)-Ambrox em uma faixa de concentração de cerca de 125-200g/l é produzido.
[00357] 54. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos 33-53 em que o (-)-Ambrox tem um limiar de odor de cerca de 0,1 a cerca de 0,5ng/l. Aspectos Adicionais da Invenção
[00358] 1. Um derivado de esqualeno hopeno ciclase (SHC)/homo- farnesol Ambrox ciclase (HAC) compreendendo uma sequência de ami- noácidos tendo de 1-50 mutações independentemente selecionadas a partir de substituições, deleções ou inserções em relação à SEQ ID N°. 1.
[00359] 2. O derivado SHC/HAC de acordo com o parágrafo 1 em que o derivado SHC compreende uma sequência de aminoácidos tendo de 1 a 40 mutações, de 1-30 mutações, de 1-20 mutações, de 1-10 mu-tações ou de 1-6 mutações em relação à SEQ ID N°. 1.
[00360] 3. O derivado de SHC/HAC de acordo com o parágrafo 1 ou o parágrafo 2 em que o derivado de SHC/ HAC compreende uma se-quência de aminoácidos tendo pelo menos 40% de identidade, pelo me nos 50% de identidade, ou pelo menos 60% de identidade, ou pelo me-nos 70% de identidade, ou pelo menos 80% de identidade, ou pelo me-nos 90% de identidade, ou pelo menos 95% de identidade, ou pelo me-nos 96% de identidade, ou pelo menos 97% de identidade, ou pelo me nos 98% de identidade, ou pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID N°. 1.
[00361] 4. O derivado de SHC/HAC de acordo com o parágrafo 3 em que a variante SHC compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade da SEQ ID N°. 1.
[00362] 5. Um derivado de SHC/HAC compreendendo 1-10 muta ções independentemente selecionadas a partir de substituições, dele- ções ou inserções em relação à SEQ ID N°.1 onde uma ou mais muta ções que não sejam uma mutação sítio ativo de SHC é/são localizadas no domínio 2 da enzima SHC (Figura 19 e/ou 20).
[00363] 6. O derivado de SHC/HAC de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 5 em que a uma ou mais mutações em relação à SEQ ID N°.1 são selecionadas a partir da Tabela 1 em que se apenas uma mutação é selecionada não é F2601Y.
[00364] 7. O derivado de SHC/HAC do parágrafo 6 em que pelo me nos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 mutações são selecionadas da Tabela 1 ou Tabela 5.
[00365] 8. O derivado de SHC/HAC do parágrafo 2 compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem até 6 mutações em relação à SEQ ID N°. 1 e compreende pelo menos as substituições F2601Y ou M132R em combinação com pelo menos um ou mais dos F129L e/ou I432T.
[00366] 9. O derivado de SHC/HAC do parágrafo 7 compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem até 8 alterações de aminoá- cido em relação à SEQ ID N°. 1 e compreende uma ou mais de uma alteração de um aminoácido na posição selecionada do grupo consis tindo das posições 77, 129, 132, 192, 224, 432, 579, 601 e 605 em relação à SEQ ID N°. 1 onde o derivado de SHC/HAC tem uma ativi dade enzimática modificada de HAC em relação à SEQ ID N°. 1.
[00367] 10. O derivado de SHC/HAC de acordo com o parágrafo 9 compreendendo uma ou mais substituições selecionadas do grupo con-sistindo em: T77A, F129L, M132R, I92V, A224V, I432T, Q579H, F601Y e/ou F605W em relação a SEQ ID N°. 1.
[00368] 11. O derivado de SHC/HAC de acordo com o parágrafo 10 compreendendo F2601Y.
[00369] 12. O derivado de SHC/HAC de acordo com o parágrafo 10 compreendendo F129L.
[00370] 13. O derivado de SHC/HAC de acordo com o parágrafo 10 compreendendo F601Y e F129L.
[00371] 14. O derivado de SHC/HAC de acordo com o parágrafo 10 compreendendo M132R e I432T.
[00372] 15. O derivado de SHC/HAC de acordo com o parágrafo 14 compreendendo adicionalmente a substituição de aminoácido A224V.
[00373] 16. O derivado de SHC/HAC de acordo com o parágrafo 14 compreendendo adicionalmente F601Y.
[00374] 17. O derivado de SHC/HAC de acordo com o parágrafo 14 compreendendo adicionalmente F129L.
[00375] 18. O derivado de SHC/HAC de acordo com o parágrafo 17 compreendendo adicionalmente F601Y.
[00376] 19. O derivado de SHC/HAC de acordo com o parágrafo 11 compreendendo adicionalmente Q579H.
[00377] 20. A SHC de acordo com o parágrafo 10 compreendendo T77A e I92V e F129L.
[00378] 21. O derivado de SHC/HAC de acordo com qualquer um dos parágrafos anteriores tendo a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID N°. 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39 e/ou 171.
[00379] 22. Uma sequência de nucleotídeos isolada codificando o derivado de SHC de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-21.
[00380] 23. A sequência de nucleotídeos isolada de acordo com o parágrafo 22 em que a sequência de nucleotídeos é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID N°. 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 e/ou 170.
[00381] 24. Uma construção compreendendo a sequência de nucle- otídeos do parágrafo 22 ou 23.
[00382] 25. Uma construção de acordo com o parágrafo 24 compre endendo um promotor funcionalmente ligado à sequência de nucleotí- deos do parágrafo 22 ou 23.
[00383] 26. A construção do parágrafo 25 em que o promotor é um promotor induzível ou um constitutivo.
[00384] 27. Um vetor compreendendo a construção de acordo com qualquer um dos parágrafos 24-26.
[00385] 28. O vetor do parágrafo 27, em que o vetor é um plasmídeo.
[00386] 29. O vetor de acordo com o parágrafo 28 capaz de direcio nar a expressão em células hospedeiras selecionadas a partir de células hospedeiras procarióticas, de levedura, de planta e de inseto.
[00387] 30. A construção de qualquer um dos parágrafos 24-26 ou o vetor de acordo com qualquer um dos parágrafos 27-29 em que a cons-trução ou o vetor é capaz de integração no genoma de uma célula hos-pedeira selecionada a partir de células hospedeiras procarióticas, de le-vedura, de planta e de inseto.
[00388] 31. Uma célula hospedeira recombinante compreendendo uma sequência de nucleotídeos de acordo com o parágrafo 22 ou 23 ou uma construção de acordo com qualquer um dos parágrafos 24-26 ou 30 ou um vetor de acordo com qualquer um dos parágrafos 27-30.
[00389] 32. A célula hospedeira recombinante de acordo com o pa rágrafo 31 em que a célula hospedeira é selecionada a partir do grupo de células hospedeiras procarióticas consistindo em bactérias do gê-neroEscherichia, Streptomyces, Bacillus, Pseudomonas, Lactobacillus e Lactococcus.
[00390] 33. A célula hospedeira recombinante do parágrafo 32 em que a célula hospedeira é uma célula hospedeira de E. coli.
[00391] 34. A célula hospedeira recombinante do parágrafo 33 em que a célula hospedeira expressa excessivamente o gene que codifica o derivadode SHC/HAC.
[00392] 35. Um método para preparar o derivado de SHC/HAC de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-21 compreendendo a etapa de cultivar uma ou mais células hospedeiras recombinantes de acordo com qualquer um dos parágrafos 31-34 sob condições que permitam a produção da enzima derivada de SHC/HAC.
[00393] 36. O método do parágrafo 35 em que a cultura de células ocorre em condições adequadas para a produção do biocatalisador.
[00394] 37. Um método para preparar o (-)-Ambrox compreendendo converter o homofarnesol para (-)-Ambrox usando uma célula hospe deira recombinante de acordo com qualquer um dos parágrafos 31-34 ou usando uma célula hospedeira recombinante compreendendo a SEQ ID N°. 169 ou SEQ ID N°. 165 codificando uma SHC/HAC TS onde se uma SHC/HAC TS é usada, a bioconversão de homofarnesol para (-)- Ambrox é realizada com um agente solubilizante diferente do Triton X 100 ou taurodeoxicolato.
[00395] 38. O método de acordo com o parágrafo 37 em que a conversão de homofarnesol para (-)-Ambrox sob condições adequadas de reação de bioconversão para a SHC/HAC TS ou a enzima derivada de SHC/HAC.
[00396] 39. O método de acordo com o parágrafo 37 ou 38 em que a conversão de homofarnesol para (-)-Ambrox ocorre sob condições ade-quadas de pH, temperatura, concentrações de agente solubilizante para a SHC/HAC TS ou a enzima derivada de SHC/HAC.
[00397] 40. O método de acordo com o parágrafo 39 em que a con versão de homofarnesol para (-)-Ambrox ocorre a uma temperatura na faixa de 30°C a 60°C, a um pH na faixa de cerca de 4 a 8 e na presença de um agente solubilizante diferente de Triton X-100 ou taurodeoxico- lato para a enzima SHC/HAC TS.
[00398] 41. O método de acordo com qualquer um dos parágrafos 37-40 em que a conversão de homofarnesol para (-)-Ambrox ocorre usando uma ou mais das condições de reação para SHC/HAC TS ou as enzimas derivadas de SHC/HAC conforme definido na Tabela 24 ou Ta bela 24a.
[00399] 42. O método de acordo com qualquer um dos parágrafos 37-41 em que a razão entre o peso do bicatalisador para homofarnesol está na faixa de cerca de 0,5-2:1, de preferência cerca de 1:1 ou 0,5:1.
[00400] 43. O método de acordo com qualquer um dos parágrafos 37-42 em que o crescimento celular e as etapas de reação de biocon- versão são realizados no mesmo vaso de reação.
[00401] 44. O método de acordo com qualquer um dos parágrafos 37-43 em que o substrato homofarnesol compreende um ou mais este- reoisômeros de homofarnesol.
[00402] 45. O método de acordo com o parágrafo 44 em que o subs trato homofarnesol compreende um ou mais estereoisômeros de homo-farnesol.
[00403] 46. O método de acordo com o parágrafo 45 em que o substrato homofarnesol compreende os estereoisômeros EE:EZ.
[00404] 47. O método de acordo com qualquer um dos parágrafos 44-46 em que o homofarnesol compreende uma mistura de estereoisô- mero EE:EZ em razões entre o peso selecionadas a partir do grupo que consiste em: 100:00; 99:01; 98:02; 97:03; 96:04; 95:05; 94:06; 93:07; 92:08; 91:09; 90:10; 89:11; 88:12; 87:13; 86:14; 85:15; 84:16; 83:17; 82:18; 81:19; 80:20; 79:21; 78:22; 77:23; 76:24; 75:25; 74:26; 73:27; 72:28; 71:29 e 70:30.
[00405] 48. O método do parágrafo 47 em que o homofarnesol com preende uma mistura de estereoisômero EE:EZ em uma razão entre o peso selecionada a partir do grupo que consiste em: EE:EZ 90:10; EE:EZ 80:20; EE:EZ 86:14; EE:EZ 70:30; EE:EZ 69:31; e EE:EZ 66:34.
[00406] 49. O método do parágrafo 35 ou 36 em que o homofarnesol compreende uma mistura de estereoisômero EE:EZ em uma razão en tre o peso de 80:20.
[00407] 50. O método de acordo com qualquer um dos parágrafos 37-49 em que o (-)-Ambrox é produzido pela mistura com um ou mais dos subprodutos (II), (IV) e/ou (III).
[00408] 51. O método de acordo com qualquer um dos parágrafos 37-50 em que o (-)-Ambrox é isolado a partir da mistura de reação de bioconversão utilizando um solvente orgânico ou uma etapa de vapor de extração/ destilação ou os cristais do (-)-Ambrox são isolados direta mente da mistura de reação de bioconversão por meios de filtração.
[00409] 52. O método de acordo com o parágrafo 51 em que o (-)- Ambrox é isolado a partir da mistura de reação utilizando um solvente orgânico.
[00410] 53. O método do parágrafo 52 em que o (-)-Ambrox é seleti vamente cristalizado utilizando um solvente orgânico.
[00411] 54. O método do parágrafo 52 ou 53 em que o (-)-Ambrox é substancialmente livre de subprodutos (II), (IV) e/ou (III).
[00412] 55. O (-)-Ambrox obtenível pelo método de qualquer um dos parágrafos 51-54.
[00413] 56. O (-)-Ambrox do parágrafo 55 em uma forma sólida, de preferência em uma forma amorfa ou cristalina.
[00414] 57. Um método para fazer um produto contendo o (-)-Ambrox compreendendo incorporando o (-)-Ambrox do parágrafo 55 ou 56 no produto, de preferência um produto de fragrância, um produto cosmé tico, um produto de limpeza e um produto detergente ou um produto de sabão.
[00415] 58. Uma fragrância ou um cosmético ou um produto para cui dados do consumidor compreendendo o (-)-Ambrox do parágrafo 55 ou 56.
[00416] 59. Uma fragrância ou um cosmético ou um produto para cui dados do consumidor compreendendo o (-)-Ambrox do parágrafo 55 ou 56 e um ou mais componentes adicionais.
[00417] 60. O uso do (-)-Ambrox do parágrafo 55 ou 56 como parte de uma fragrância ou um cosmético ou um produto de consumo como tratamento de tecido, higiene pessoal, cuidados de beleza e/ou um pro duto de limpeza.
[00418] 61. O uso de uma enzima derivada de SHC/HAC de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-21, uma sequência de nucleotídeos de acordo com os parágrafos 22 ou 23, uma construção de acordo com qualquer um dos parágrafos 24-26 ou 30, um vetor de acordo com qual-quer um dos parágrafos 27-30 ou uma célula hospedeira recombinante de acordo com qualquer um dos parágrafos 31-34 ou uma célula hos pedeira recombinante expressando uma SHC/HAC TS para a biocon- versão de homofarnesol para (-)-Ambrox em que a enzima SHC/HAC TS é usada com um agente solubilizante diferente de Triton X-100 para a reação de bioconversão.
[00419] 62. Um processo de preparação de (-)-Ambrox ou uma mistura de estereoisômero de (-)-Ambrox, em que (3E,7E)-homofarne- sol ou uma mistura de estereoisômero de (3E,7E)-homofarnesol é enzi- maticamente convertida para produzir (-)-Ambrox ou uma mistura de es- tereoisômero compreendendo (-)-Ambrox onde a conversão enzimática usando uma enzima SHC/HAC é realizada sob condições de reação adequadas para a produção de (-)-Ambrox e onde se a reação for reali-zada na presença de um agente solubilizante, Triton X-100 não é usado em combinação com uma enzima SHC/HAC TS.
[00420] 63. O processo de acordo com o parágrafo 62 onde o pro cessoé realizado usando uma enzima SHC/HAC selecionada o grupo que consiste em AacSHC (SEQ ID N°. 1), Zmo SHC1 (SEQ ID N°. 2), ZmoSHC2, (SEQ ID N°. 3); BjpSHC (SEQ ID N°. 4) ou um derivado de SHC/HAC selecionado da Tabela 1, Tabela 5, Tabela 2, Tabela 6, Ta bela 3, Tabela 7, Tabela 4 e/ou Tabela 8, ou uma sequência com pelo menos 30% de identidade, pelo menos 40% de identidade, pelo menos 50% de identidade, ou pelo menos 60% de identidade, ou pelo menos 70% de identidade, ou pelo menos 80% de identidade, ou pelo menos 90% de identidade, ou pelo menos 95% de identidade, ou pelo menos 96% de identidade, ou pelo menos 97% de identidade, ou pelo menos 98% de identidade, ou pelo menos 99% de identidade em relação a SEQ ID N°. 1, SEQ ID N°. 2, SEQ ID N°. 3 ou SEQ ID N°. 4.
[00421] 64. O processo de acordo com o parágrafo 63 em que a con versão de homofarnesol para (-)-Ambrox ocorre a uma temperatura na faixa de 30°C a 60°C, a um pH na faixa de 4 a 8 e na presença de um agente solubilizante diferente de Triton X-100 para a enzima SHC TS.
[00422] 65. O processo de acordo com o parágrafo 64 em que as condições de reação para SHC/HAC TS ou cada derivado de SHC/HAC conforme definido na Tabela 24 ou Tabela 24a são utilizadas.
[00423] 66. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos 62-65 em que o processo compreende (a) a cultura de uma ou mais células hospedeiras recombinantes que expressam uma SHC TS ou de-rivados da enzima SHC sob condições que permitem a expressão do polipeptídeo derivado de SHC TS ou SHC/HAC antes da conversão de E,E-homofarnesol para (-)-Ambrox.
[00424] 67. O processo de acordo com o parágrafo 66 em que a etapa de cultura e subsequente etapa de conversão ocorre no mesmo vaso de reação sob diferentes condições de reação.
[00425] 68. O processo de acordo com o parágrafo 67 em que a etapa de cultura está em uma faixa de pH de cerca de 6 a cerca de 7 e a etapa de homofarnesol para (-)-Ambrox está em uma faixa de pH de cerca de 4,8-5,5.
[00426] 69. O processo de acordo com qualquer um dos parágrafos 62-68 em que o substrato homofarnesol compreende os estereoisôme- ros EE:EZ.
[00427] 70. O processo de acordo com do parágrafo 69 em que o homofarnesol compreende uma mistura de estereoisômero EE:EZ em uma razão entre o peso selecionada a partir do grupo que consiste em: EE:EZ 90:10; EE:EZ 80: 20; EE:EZ 86:14; EE:EZ 70:30; EE:EZ 69:31; e EE:EZ 66:34.
[00428] 71. O processo do parágrafo 70 em que o homofarnesol com preende EE:EZ em uma razão entre o peso de 80:20.
[00429] 72. O método de acordo com qualquer um dos parágrafos 62-71 em que o (-)-Ambrox é produzido pela mistura com um ou mais dos subprodutos (II), (IV) e/ou (III).
[00430] 73. O método de acordo com qualquer um dos parágrafos 62-72 em que o (-)-Ambrox é isolado a partir da mistura de reação utili-zando um solvente orgânico ou uma etapa de vapor de extração/ desti-lação ou de filtração.
[00431] 74. O método de acordo com o parágrafo 73 em que o (-)- Ambrox é isolado a partir da mistura de reação utilizando um solvente orgânico.
[00432] 75. O método do parágrafo 74 em que o (-)-Ambrox é seleti vamente cristalizado utilizando um solvente orgânico.
[00433] 76. O método do parágrafo 74 ou 75 em que o (-)-Ambrox é substancialmente livre de subprodutos (II), (IV) e/ou (III).
[00434] 77. O (-)-Ambrox obtenível pelo método de qualquer um dos parágrafos 72-76.
[00435] 78. O (-)-Ambrox do parágrafo 26 em uma forma sólida, de preferência em uma forma amorfa ou cristalina.
[00436] 79. Um método para produzir um produto compreendendo incorporar o (-)-Ambrox dos parágrafos 77 ou 78 para o produto.
[00437] 80. O método do parágrafo 79 em que o produto é um pro duto de perfumaria, cosmético, produto de limpeza, um produto deter gente ou um produto de sabão.
[00438] 81. Uma fragrância ou um cosmético ou um produto para cui dados do consumidor compreendendo o (-)-Ambrox do parágrafo 77 ou 78.
[00439] 82. Uma fragrância ou um cosmético ou um produto para cui dados do consumidor compreendendo o (-)-Ambrox do parágrafo 77 ou 78 e um componente adicional.
[00440] 83. O uso do (-)-Ambrox do parágrafo 77 ou 78 como parte de uma fragrância ou um cosmético ou um produto para cuidados de consumo cosmético.
Aspectos adicionais da invenção (ZmoSHCI)
[00441] 1. Um derivado de esqualeno hopeno ciclase (SHC)/homo- farnesol Ambrox ciclase (HAC) compreendendo uma sequência de ami- noácidos tendo de 1-50 mutações independentemente selecionadas a partir de substituições, deleções ou inserções em relação à SEQ ID N°. 2.
[00442] 2. O derivado SHC/HAC de acordo com o parágrafo 1 em que o derivado SHC compreende uma sequência de aminoácidos tendo de 1 a 40 mutações, de 1-30 mutações, de 1-20 mutações, de 1-10 mu tações ou de 1-6 mutações em relação à SEQ ID N°. 2.
[00443] 3. O derivado de SHC/HAC de acordo com o parágrafo 1 ou o parágrafo 2 em que o derivado de SHC/ HAC compreende uma se-quência de aminoácidos tendo pelo menos 40% de identidade, pelo me nos 50% de identidade, ou pelo menos 60% de identidade, ou pelo me-nos 70% de identidade, ou pelo menos 80% de identidade, ou pelo me-nos 90% de identidade, ou pelo menos 95% de identidade, ou pelo me-nos 96% de identidade, ou pelo menos 97% de identidade, ou pelo me nos 98% de identidade, ou pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID N°. 2.
[00444] 4. O derivado de SHC/HAC de acordo com o parágrafo 3 em que a variante SHC compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade da SEQ ID N°. 2.
[00445] 5. Um derivado de SHC/HAC compreendendo 1-10 muta ções independentemente selecionadas a partir de substituições, dele- ções ou inserções em relação à SEQ ID N°.2 onde uma ou mais muta ções que não sejam uma mutação sítio ativo de SHC é/são localizadas no domínio 2 da enzima SHC (Figura 19 e/ou 20).
[00446] 6. O derivado de SHC/HAC de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 5 em que a uma ou mais mutações em relação à SEQ ID N°. 2 são selecionadas a partir da Tabela 2 em que se apenas uma mutação é selecionada não é F668Y.
[00447] 7. O derivado de SHC/HAC do parágrafo 6 em que pelo me nos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 mutações são selecionadas da Tabela 2 e/ou Tabela 6.
[00448] 8. O derivado de SHC/HAC do parágrafo 2 compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem até 6 mutações em relação à SEQ ID N°. 2 e compreende pelo menos as substituições F668Y ou Y185R em combinação com pelo menos um ou mais dos F182L e/ou I498T.
[00449] 9. O derivado de SHC/HAC do parágrafo 7 compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem até 8 alterações de aminoácido em relação à SEQ ID N°. 2 e compreende uma ou mais de uma altera ção de um aminoácido na posição selecionada do grupo consistindo das posições 129, 145, 182, 185, 282, 498, 647 e 668 em relação à SEQ ID N°. 2 onde o derivado de SHC/HAC tem uma atividade enzimática mo dificada de HAC em relação à SEQ ID N°. 2.
[00450] 10. O derivado de SHC/HAC de acordo com o parágrafo 9 compreendendo uma ou mais substituições selecionadas do grupo con-sistindo em: S129A, V145V, F182L, Y185R, G282V, I498T, H646H e F668Y em relação à SEQ ID N° 2.
[00451] 11. O derivado de SHC/HAC de acordo com o parágrafo 10 compreendendo F668Y.
[00452] 12. O derivado de SHC/HAC de acordo com o parágrafo 10 compreendendo F182L.
[00453] 13. O derivado de SHC/HAC de acordo com o parágrafo 10 compreendendo F668Y e F182L.
[00454] 14. O derivado de SHC/HAC de acordo com o parágrafo 10 compreendendo Y185R e I498T.
[00455] 15. O derivado de SHC/HAC de acordo com o parágrafo 14 compreendendo adicionalmente G282V.
[00456] 16. O derivado de SHC/HAC de acordo com o parágrafo 14 compreendendo adicionalmente F668Y.
[00457] 17. O derivado de SHC/HAC de acordo com o parágrafo 14 compreendendo adicionalmente F182L.
[00458] 18. O derivado de SHC/HAC de acordo com o parágrafo 17 compreendendo adicionalmente F668Y.
[00459] 19. O derivado de SHC/HAC de acordo com o parágrafo 11 compreendendo adicionalmente H646H.
[00460] 20. A SHC de acordo com o parágrafo 10 compreendendo S129A e V145V e F182L.
[00461] 21. O derivado de SHC/HAC de acordo com qualquer um dos parágrafos anteriores tendo a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID N°. 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73 e/ou 75.
[00462] 22. Uma sequência de nucleotídeos isolada codificando o derivado de SHC de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-21.
[00463] 23. A sequência de nucleotídeos isolada de acordo com o parágrafo 22 em que a sequência de nucleotídeos é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID N°. 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74 e/ou 76.
[00464] 24. Uma construção compreendendo a sequência de nucle- otídeos do parágrafo 22 ou 23.
[00465] 25. Uma construção de acordo com o parágrafo 24 compre endendo um promotor funcionalmente ligado à sequência de nucleotí- deos do parágrafo 22 ou 23.
[00466] 26. A construção do parágrafo 25 em que o promotor é um promotor induzível ou um constitutivo.
[00467] 27. Um vetor compreendendo a construção de acordo com qualquer um dos parágrafos 24-26.
[00468] 28. O vetor do parágrafo 27, em que o vetor é um plasmídeo.
[00469] 29. O vetor de acordo com o parágrafo 28 capaz de direcio nar a expressão em células hospedeiras selecionadas a partir de células hospedeiras procarióticas, de levedura, de planta e de inseto.
[00470] 30. A construção de qualquer um dos parágrafos 24-26 ou o vetor de acordo com qualquer um dos parágrafos 27-29 em que a construção ou o vetor é capaz de integração no genoma de uma célula hospedeira selecionada a partir de células hospedeiras procarióticas, de levedura, de planta e de inseto.
[00471] 31. Uma célula hospedeira recombinante compreendendo uma sequência de nucleotídeos de acordo com o parágrafo 22 ou 23 ou uma construção de acordo com qualquer um dos parágrafos 24-26 ou 30 ou um vetor de acordo com qualquer um dos parágrafos 27-30.
[00472] 32. A célula hospedeira recombinante de acordo com o pa rágrafo 31 em que a célula hospedeira é selecionada a partir do grupo de células hospedeiras procarióticas consistindo em bactérias do gê-neroEscherichia, Streptomyces, Bacillus, Pseudomonas, Lactobacillus e Lactococcus.
[00473] 33. A célula hospedeira recombinante do parágrafo 32 em que a célula hospedeira é uma célula hospedeira de E. coli.
[00474] 34. A célula hospedeira recombinante do parágrafo 33 em que a célula hospedeira expressa excessivamente o gene que codifica o derivado de SHC/HA.
[00475] 35. Um método para preparar o derivado de SHC/HAC de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-21 compreendendo a etapa de cultivar uma ou mais células hospedeiras recombinantes de acordo com qualquer um dos parágrafos 31-34 sob condições que permitam a produção da enzima derivada de SHC/HAC.
[00476] 36. O método do parágrafo 35 em que a cultura de células ocorre em condições adequadas para a produção do biocatalisador.
[00477] 37. Um método para preparar o (-)-Ambrox compreendendo converter o homofarnesol para (-)-Ambrox usando uma célula hospe deira recombinante de acordo com qualquer um dos parágrafos 31-34 ou usando uma célula hospedeira recombinante compreendendo a SEQ ID N°. 166 codificando uma SHC/HAC TS onde se uma SHC/HAC TS é usada, a bioconversão de homofarnesol para (-)-Ambrox é realizada com um agente solubilizante diferente do Triton X-100.
[00478] 38. O método de acordo com o parágrafo 37 em que a con versão de homofarnesol para (-)-Ambrox sob condições adequadas de reação de bioconversão para a SHC/HAC TS ou a enzima derivada de SHC/HAC.
[00479] 39. O método de acordo com o parágrafo 37 ou 38 em que a conversão de homofarnesol para (-)-Ambrox ocorre sob condições ade-quadas de pH, temperatura, concentrações de agente solubilizante para a SHC/HAC TS ou a enzima derivada de SHC/HAC.
[00480] 40. O método de acordo com o parágrafo 39 em que a con versão de homofarnesol para (-)-Ambrox ocorre a uma temperatura na faixa de 30°C a 60°C, a um pH na faixa de cerca de 4 a 8 e na presença de um agente solubilizante diferente de Triton X-100 para a enzima SHC/HAC TS.
[00481] 41. O método de acordo com qualquer um dos parágrafos 37-40 em que a conversão de homofarnesol para (-)-Ambrox ocorre usando uma ou mais das condições de reação para SHC/HAC TS ou as enzimas derivadas de SHC/HAC conforme definido na Tabela 24 ou Ta bela 24a.
[00482] 42. O método de acordo com qualquer um dos parágrafos 37-41 em que a razão entre o peso do bicatalisador para homofarnesol está na faixa de cerca de 0,5-2:1, de preferência cerca de 1:1 ou 0,5:1.
[00483] 43. O método de acordo com qualquer um dos parágrafos 37-42 em que o crescimento celular e as etapas de reação de biocon- versão são realizados no mesmo vaso de reação.
[00484] 44. O método de acordo com qualquer um dos parágrafos 37-43 em que o substrato homofarnesol compreende um ou mais este- reoisômeros de homofarnesol.
[00485] 45. O método de acordo com o parágrafo 44 em que o subs trato homofarnesol compreende um ou mais estereoisômeros de homofarnesol.
[00486] 46. O método de acordo com o parágrafo 45 em que o subs trato homofarnesol compreende os estereoisômeros EE:EZ.
[00487] 47. O método de acordo com qualquer um dos parágrafos 44-46 em que o homofarnesol compreende uma mistura de estereoisô- mero EE:EZ em razões entre o peso selecionadas a partir do grupo que consiste em: 100:00; 99:01; 98:02; 97:03; 96:04; 95:05; 94:06; 93:07; 92:08; 91:09; 90:10; 89:11; 88:12; 87:13; 86:14; 85:15; 84:16; 83:17; 82:18; 81:19; 80:20; 79:21; 78:22; 77:23; 76:24; 75:25; 74:26; 73:27; 72:28; 71:29 e 70:30.
[00488] 48. O método do parágrafo 47 em que o homofarnesol com preende uma mistura de estereoisômero EE:EZ em uma razão entre o peso selecionada a partir do grupo que consiste em: EE:EZ 90:10; EE:EZ 80:20; EE:EZ 86:14; EE:EZ 70:30; EE:EZ 69:31; e EE:EZ 66:34.
[00489] 49. O método do parágrafo 35 ou 36 em que o homofarnesol compreende uma mistura de estereoisômero EE:EZ em uma razão en tre o peso de 80:20.
[00490] 50. O método de acordo com qualquer um dos parágrafos 37-49 em que o (-)-Ambrox é produzido pela mistura com um ou mais dos subprodutos (II), (IV) e/ou (III).
[00491] 51. O método de acordo com qualquer um dos parágrafos 37-50 em que o (-)-Ambrox é isolado a partir da mistura de reação de bioconversão utilizando um solvente orgânico ou uma etapa de vapor de extração/ destilação ou de filtração.
[00492] 52. O método de acordo com o parágrafo 51 em que o (-)- Ambrox é isolado a partir da mistura de reação utilizando um solvente orgânico.
[00493] 53. O método do parágrafo 52 em que o (-)-Ambrox é seleti vamente cristalizado a partir de (-)-Ambrox utilizando um solvente orgâ-nico.
[00494] 54. O método do parágrafo 52 ou 53 em que o (-)-Ambrox é substancialmente livre de subprodutos (II), (IV) e/ou (III).
[00495] 55. O (-)-Ambrox obtenível pelo método de qualquer um dos parágrafos 51-54.
[00496] 56. O (-)-Ambrox do parágrafo 55 em uma forma sólida, de preferência em uma forma amorfa ou cristalina.
[00497] 57. Um método para fazer um produto contendo o (-)-Ambrox compreendendo incorporando o (-)-Ambrox do parágrafo 55 ou 56 no produto, de preferência um produto de fragrância, um produto cosmé tico, um produto de limpeza e um produto detergente ou um produto de sabão.
[00498] 58. Uma fragrância ou um cosmético ou um produto para cui dados do consumidor compreendendo o (-)-Ambrox do parágrafo 55 ou 56.
[00499] 59. Uma fragrância ou um cosmético ou um produto para cui dados do consumidor compreendendo o (-)-Ambrox do parágrafo 55 ou 56 e um ou mais componentes adicionais.
[00500] 60. O uso do (-)-Ambrox do parágrafo 55 ou 56 como parte de uma fragrância ou um cosmético ou um produto de consumo como tratamento de tecido, higiene pessoal, cuidados de beleza e/ou um pro duto de limpeza.
[00501] 61. O uso de uma enzima derivada de SHC/HAC de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-21, uma sequência de nucleotídeos de acordo com os parágrafos 22 ou 23, uma construção de acordo com qualquer um dos parágrafos 24-26 ou 30, um vetor de acordo com qual-quer um dos parágrafos 27-30 ou uma célula hospedeira recombinante de acordo com qualquer um dos parágrafos 31-34 ou uma célula hos pedeira recombinante expressando uma SHC/HAC TS para a biocon- versão de homofarnesol para (-)-Ambrox em que a enzima SHC/HAC TS é usada com um agente solubilizante diferente de Triton X-100 para a reação de bioconversão.
Outros aspectos da invenção (ZmoSHC2)
[00502] 1. Um derivado de esqualeno hopeno ciclase (SHC)/homo- farnesol Ambrox ciclase (HAC) compreendendo uma sequência de ami- noácidos tendo de 1-50 mutações independentemente selecionadas a partir de substituições, deleções ou inserções em relação à SEQ ID N°. 3.
[00503] 2. O derivado SHC/HAC de acordo com o parágrafo 1 em que o derivado SHC compreende uma sequência de aminoácidos tendo de 1 a 40 mutações, de 1-30 mutações, de 1-20 mutações, de 1-10 mu tações ou de 1-6 mutações em relação à SEQ ID N°. 3.
[00504] 3. O derivado de SHC/HAC de acordo com o parágrafo 1 ou o parágrafo 2 em que o derivado de SHC/ HAC compreende uma se-quência de aminoácidos tendo pelo menos 40% de identidade, pelo me nos 50% de identidade, ou pelo menos 60% de identidade, ou pelo me-nos 70% de identidade, ou pelo menos 80% de identidade, ou pelo me-nos 90% de identidade, ou pelo menos 95% de identidade, ou pelo me-nos 96% de identidade, ou pelo menos 97% de identidade, ou pelo me nos 98% de identidade, ou pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID N°. 3.
[00505] 4. O derivado de SHC/HAC de acordo com o parágrafo 3 em que a variante SHC compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade da SEQ ID N°. 3.
[00506] 5. Um derivado de SHC/HAC compreendendo 1-10 muta ções independentemente selecionadas a partir de substituições, dele- ções ou inserções em relação à SEQ ID N°. 3 onde uma ou mais muta ções que não sejam uma mutação sítio ativo de SHC é/são localizadas no domínio 2 da enzima SHC (Figura 19 e/ou 20).
[00507] 6. O derivado de SHC/HAC de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 5 em que a uma ou mais mutações em relação à SEQ ID N°. 3 são selecionadas a partir da Tabela 3 em que se apenas uma mutação é selecionada não é F620Y.
[00508] 7. O derivado de SHC/HAC do parágrafo 6 em que pelo me nos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 mutações são selecionadas da Tabela 3 e/ou Tabela 7.
[00509] 8. O derivado de SHC/HAC do parágrafo 2 compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem até 6 mutações em relação à SEQ ID N°. 3 e compreende pelo menos as substituições F620Y ou I140R em combinação com pelo menos um ou mais dos F137L e/ou I450T.
[00510] 9. O derivado de SHC/HAC do parágrafo 7 compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem até 8 alterações de aminoácido em relação à SEQ ID N°. 3 e compreende uma ou mais de uma altera ção de um aminoácido na posição selecionada do grupo consistindo das posições 85, 100, 137, 140, 233, 450, 598 e 620 em relação à SEQ ID N°. 3 onde o derivado de SHC/HAC tem uma atividade enzimática mo dificada de HAC em relação à SEQ ID N°. 3.
[00511] 10. O derivado de SHC/HAC de acordo com o parágrafo 9 compreendendo uma ou mais substituições selecionadas do grupo con-sistindo em: G85A, V100V, F137L, I140R, V233V, I450T, N598H e F620Y em relação à SEQ ID NO 3.
[00512] 11. O derivado de SHC/HAC de acordo com o parágrafo 10 compreendendo F620Y.
[00513] 12. O derivado de SHC/HAC de acordo com o parágrafo 10 compreendendo F137L.
[00514] 13. O derivado de SHC/HAC de acordo com o parágrafo 10 compreendendo F620Y e F137L.
[00515] 14. O derivado de SHC/HAC de acordo com o parágrafo 10 compreendendo I140R e I450T.
[00516] 15. O derivado de SHC/HAC de acordo com o parágrafo 14 compreendendo adicionalmente V233V.
[00517] 16. O derivado de SHC/HAC de acordo com o parágrafo 14 compreendendo adicionalmente F620Y.
[00518] 17. O derivado de SHC/HAC de acordo com o parágrafo 14 compreendendo adicionalmente F137L.
[00519] 18. O derivado de SHC/HAC de acordo com o parágrafo 17 compreendendo adicionalmente F620Y.
[00520] 19. O derivado de SHC/HAC de acordo com o parágrafo 11 compreendendo adicionalmente N598H.
[00521] 20. A SHC de acordo com o parágrafo 10 compreendendo G85A e V100V e F137L.
[00522] 21. O derivado de SHC/HAC de acordo com qualquer um dos parágrafos anteriores tendo a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID N°. 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109 e/ou 111.
[00523] 22. Uma sequência de nucleotídeos isolada codificando o derivado de SHC de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-21.
[00524] A sequência de nucleotídeos isolada de acordo com o pará grafo 22 em que a sequência de nucleotídeos é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID N°. 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110 e/ou 112.
[00525] 24. Uma construção compreendendo a sequência de nucle- otídeos do parágrafo 22 ou 23.
[00526] 25. Uma construção de acordo com o parágrafo 24 compre endendo um promotor funcionalmente ligado à sequência de nucleotí- deos do parágrafo 22 ou 23.
[00527] 26. A construção do parágrafo 25 em que o promotor é um promotor induzível ou um constitutivo.
[00528] 27. Um vetor compreendendo a construção de acordo com qualquer um dos parágrafos 24-26.
[00529] 28. O vetor do parágrafo 27, em que o vetor é um plasmídeo.
[00530] 29. O vetor de acordo com o parágrafo 28 capaz de direcio nar a expressão em células hospedeiras selecionadas a partir de células hospedeiras procarióticas, de levedura, de planta e de inseto.
[00531] 30. A construção de qualquer um dos parágrafos 24-26 ou o vetor de acordo com qualquer um dos parágrafos 27-29 em que a cons-trução ou o vetor é capaz de integração no genoma de uma célula hos-pedeira selecionada a partir de células hospedeiras procarióticas, de le-vedura, de planta e de inseto.
[00532] 31. Uma célula hospedeira recombinante compreendendo uma sequência de nucleotídeos de acordo com o parágrafo 22 ou 23 ou uma construção de acordo com qualquer um dos parágrafos 24-26 ou 30 ou um vetor de acordo com qualquer um dos parágrafos 27-30.
[00533] 32. A célula hospedeira recombinante de acordo com o pa rágrafo 31 em que a célula hospedeira é selecionada a partir do grupo de células hospedeiras procarióticas consistindo em bactérias do gê-neroEscherichia, Streptomyces, Bacillus, Pseudomonas, Lactobacillus e Lactococcus.
[00534] 33. A célula hospedeira recombinante do parágrafo 32 em que a célula hospedeira é uma célula hospedeira de E. coli.
[00535] 34. A célula hospedeira recombinante do parágrafo 33 em que a célula hospedeira expressa excessivamente o gene que codifica o derivado de SHC/HA.
[00536] 35. Um método para preparar o derivado de SHC/HAC de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-21 compreendendo as eta pas de: (a) cultivar uma ou mais células hospedeiras recombinantes de acordo com qualquer um dos parágrafos 31-34 sob condições que per mitam a produção da enzima derivada de SHC/HAC.
[00537] 36. O método do parágrafo 35 em que a cultura de células ocorre em condições adequadas para a produção do biocatalisador.
[00538] 37. Um método para preparar o (-)-Ambrox compreendendo converter o homofarnesol para (-)-Ambrox usando uma célula hospe deira recombinante de acordo com qualquer um dos parágrafos 31-34 ou usando uma célula hospedeira recombinante compreendendo a SEQ ID N° 167 codificando uma SHC/HAC TS onde se uma SHC/HAC TS é usada, a bioconversão de homofarnesol para (-)-Ambrox é realizada com um agente solubilizante diferente do Triton X-100.
[00539] 38. O método de acordo com o parágrafo 37 em que a con versão de homofarnesol para (-)-Ambrox sob condições adequadas de reação de bioconversão para a SHC/HAC TS ou a enzima derivada de SHC/HAC.
[00540] 39. O método de acordo com o parágrafo 37 ou 38 em que a conversão de homofarnesol para (-)-Ambrox ocorre sob condições ade-quadas de pH, temperatura, concentrações de agente solubilizante para a SHC/HAC TS ou a enzima derivada de SHC/HAC.
[00541] 40. O método de acordo com o parágrafo 39 em que a con versão de homofarnesol para (-)-Ambrox ocorre a uma temperatura na faixa de 30°C a 60°C, a um pH na faixa de cerca de 4 a 8 e na presença de um agente solubilizante diferente de Triton X-100 para a enzima SHC/HAC TS.
[00542] 41. O método de acordo com qualquer um dos parágrafos 37-40 em que a conversão de homofarnesol para (-)-Ambrox ocorre usando uma ou mais das condições de reação para SHC/HAC TS ou as enzimas derivadas de SHC/HAC conforme definido na Tabela 24 ou Ta bela 24a.
[00543] 42. O método de acordo com qualquer um dos parágrafos 37-41 em que a razão entre o peso do bicatalisador para homofarnesol está na faixa de cerca de 0,5-2:1, de preferência cerca de 1:1 ou 0,5:1.
[00544] 43. O método de acordo com qualquer um dos parágrafos 37-42 em que o crescimento celular e as etapas de reação de bioconversão são realizados no mesmo vaso de reação.
[00545] 44. O método de acordo com qualquer um dos parágrafos 37-43 em que o substrato homofarnesol compreende um ou mais este- reoisômeros de homofarnesol.
[00546] 45. O método de acordo com o parágrafo 44 em que o subs trato homofarnesol compreende um ou mais estereoisômeros de homo-farnesol.
[00547] 46. O método de acordo com o parágrafo 45 em que o subs trato homofarnesol compreende os estereoisômeros EE:EZ.
[00548] 47. O método de acordo com qualquer um dos parágrafos 44-46 em que o homofarnesol compreende uma mistura de estereoisô- mero EE:EZ em razões entre o peso selecionadas a partir do grupo que consiste em: 100:00; 99:01; 98:02; 97:03; 96:04; 95:05; 94:06; 93:07; 92:08; 91:09; 90:10; 89:11; 88:12; 87:13; 86:14; 85:15; 84:16; 83:17; 82:18; 81:19; 80:20; 79:21; 78:22; 77:23; 76:24; 75:25; 74:26; 73:27; 72:28; 71:29 e 70:30.
[00549] 48. O método do parágrafo 47 em que o homofarnesol com preende uma mistura de estereoisômero EE:EZ em uma razão entre o peso selecionada a partir do grupo que consiste em: EE:EZ 90:10; EE:EZ 80: 20; EE:EZ 86:14; EE:EZ 70:30; EE:EZ 69:31; e EE:EZ 66:34.
[00550] 49. O método do parágrafo 35 ou 36 em que o homofarnesol compreende uma mistura de estereoisômero EE:EZ em uma razão en tre o peso de 80:20.
[00551] 50. O método de acordo com qualquer um dos parágrafos 37-49 em que o (-)-Ambrox é produzido pela mistura com um ou mais dos subprodutos (II), (IV) e/ou (III).
[00552] 51. O método de acordo com qualquer um dos parágrafos 37-50 em que o (-)-Ambrox é isolado a partir da mistura de reação de bioconversão utilizando um solvente orgânico ou uma etapa de vapor de extração/ destilação ou de filtração.
[00553] 52. O método de acordo com o parágrafo 51 em que o (-)- Ambrox é isolado a partir da mistura de reação utilizando um solvente orgânico.
[00554] 53. O método do parágrafo 52 em que o (-)-Ambrox é seleti vamente cristalizado a partir de (-)-Ambrox utilizando um solvente orgâ-nico.
[00555] 54. O método do parágrafo 52 ou 53 em que o (-)-Ambrox é substancialmente livre de subprodutos (II), (IV) e/ou (III).
[00556] 55. O (-)-Ambrox obtenível pelo método de qualquer um dos parágrafos 51-54.
[00557] 56. O (-)-Ambrox do parágrafo 55 em uma forma sólida, de preferência em uma forma amorfa ou cristalina.
[00558] 57. Um método para fazer um produto contendo o (-)-Ambrox compreendendo incorporando o (-)-Ambrox do parágrafo 55 ou 56 no produto, de preferência um produto de fragrância, um produto cosmé tico, um produto de limpeza e um produto detergente ou um produto de sabão.
[00559] 58. Uma fragrância ou um cosmético ou um produto para cui dados do consumidor compreendendo o (-)-Ambrox do parágrafo 55 ou 56.
[00560] 59. Uma fragrância ou um cosmético ou um produto para cui dados do consumidor compreendendo o (-)-Ambrox do parágrafo 55 ou 56 e um ou mais componentes adicionais.
[00561] 60. O uso do (-)-Ambrox do parágrafo 55 ou 56 como parte de uma fragrância ou um cosmético ou um produto de consumo como tratamento de tecido, higiene pessoal, cuidados de beleza e/ou um pro duto de limpeza.
[00562] 61. O uso de uma enzima derivada de SHC/HAC de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-21, uma sequência de nucleotídeos de acordo com os parágrafos 22 ou 23, uma construção de acordo com qualquer um dos parágrafos 24-26 ou 30, um vetor de acordo com qual-quer um dos parágrafos 27-30 ou uma célula hospedeira recombinante de acordo com qualquer um dos parágrafos 31-34 ou uma célula hos pedeira recombinante expressando uma SHC/HAC TS para a biocon- versão de homofarnesol para (-)-Ambrox em que a enzima SHC/HAC TS é usada com um agente solubilizante diferente de Triton X-100 para a reação de bioconversão.
Aspectos Adicionais da Invenção (BJpSHC)
[00563] 1. Um derivado de esqualeno hopeno ciclase (SHC)/homo- farnesol Ambrox ciclase (HAC) compreendendo uma sequência de ami- noácidos tendo de 1-50 mutações independentemente selecionadas a partir de substituições, deleções ou inserções em relação à SEQ ID N°. 4.
[00564] 2. O derivado SHC/HAC de acordo com o parágrafo 1 em que o derivado SHC compreende uma sequência de aminoácidos tendo de 1 a 40 mutações, de 1-30 mutações, de 1-20 mutações, de 1-10 mu tações ou de 1-6 mutações em relação à SEQ ID N°. 4.
[00565] 3. O derivado de SHC/HAC de acordo com o parágrafo 1 ou o parágrafo 2 em que o derivado de SHC/ HAC compreende uma se-quência de aminoácidos tendo pelo menos 40% de identidade, pelo me nos 50% de identidade, ou pelo menos 60% de identidade, ou pelo me nos 70% de identidade, ou pelo menos 80% de identidade, ou pelo me nos 90% de identidade, ou pelo menos 95% de identidade, ou pelo me nos 96% de identidade, ou pelo menos 97% de identidade, ou pelo me nos 98% de identidade, ou pelo menos 99% de identidade em relação à SEQ ID N°. 4.
[00566] 4. O derivado de SHC/HAC de acordo com o parágrafo 3 em que a variante SHC compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade da SEQ ID N°. 4.
[00567] 5. Um derivado de SHC/HAC compreendendo 1-10 mutações independentemente selecionadas a partir de substituições, deleções ou inserções em relação à SEQ ID N°. 4 onde uma ou mais mutações que não sejam uma mutação sítio ativo de SHC é/são locali-zadas no domínio 2 da enzima SHC (Figura 19 e/ou 20).
[00568] 6. O derivado de SHC/HAC de acordo com qualquer um dos parágrafos de 1 a 5 em que a uma ou mais mutações em relação à SEQ ID N°. 4 são selecionadas a partir da Tabela 4 em que se apenas uma mutação é selecionada não é F628Y.
[00569] 7. O derivado de SHC/HAC do parágrafo 6 em que pelo me nos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 mutações são selecionadas da Tabela 4 e/ou Tabela 8.
[00570] 8. O derivado de SHC/HAC do parágrafo 2 compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem até 6 mutações em relação à SEQ ID N°. 4 e compreende pelo menos as substituições F628Y ou I140R em combinação com pelo menos um ou mais dos F137L e/ou I450T.
[00571] 9. O derivado de SHC/HAC do parágrafo 7 compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem até 8 alterações de aminoá- cido em relação à SEQ ID N°. 4 e compreende uma ou mais de uma alteração de um aminoácido na posição selecionada do grupo consis tindo das posições 88, 104, 141, 144, 241, 459, 607 e 628 em relação à SEQ ID N°. 4 onde o derivado de SHC/HAC tem uma atividade en- zimática modificada de HAC em relação à SEQ ID N°. 4.
[00572] 10. O derivado de SHC/HAC de acordo com o parágrafo 9 compreendendo uma ou mais substituições selecionadas do grupo con-sistindo em: A88A, V104V, F141L, Y144R, V241V, I459T, M607H e F628Y em relação à SEQ ID N° 4.
[00573] 11. O derivado de SHC/HAC de acordo com o parágrafo 10 compreendendo F628Y.
[00574] 12. O derivado de SHC/HAC de acordo com o parágrafo 10 compreendendo F141L.
[00575] 13. O derivado de SHC/HAC de acordo com o parágrafo 10 compreendendo F628Y e F141L.
[00576] 14. O derivado de SHC/HAC de acordo com o parágrafo 10 compreendendo Y144R e I459T.
[00577] 15. O derivado de SHC/HAC de acordo com o parágrafo 14 compreendendo adicionalmente V241V.
[00578] 16. O derivado de SHC/HAC de acordo com o parágrafo 14 compreendendo adicionalmente F628Y.
[00579] 17. O derivado de SHC/HAC de acordo com o parágrafo 14 compreendendo adicionalmente F141L.
[00580] 18. O derivado de SHC/HAC de acordo com o parágrafo 17 compreendendo adicionalmente F628Y.
[00581] 19. O derivado de SHC/HAC de acordo com o parágrafo 11 compreendendo adicionalmente M607H.
[00582] 20. A SHC de acordo com o parágrafo 10 compreendendo S129A e V145V e F182L.
[00583] 21. O derivado de SHC/HAC de acordo com qualquer um dos parágrafos anteriores tendo a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID N°. 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145 e/ou 147.
[00584] 22. Uma sequência de nucleotídeos isolada codificando o derivado de SHC de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-21.
[00585] 23. A sequência de nucleotídeos isolada de acordo com o parágrafo 22 em que a sequência de nucleotídeos é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID N°. 114, 116, 118, 120, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146 e/ou 148.
[00586] 24. Uma construção compreendendo a sequência de nucle- otídeos do parágrafo 22 ou 23.
[00587] 25. Uma construção de acordo com o parágrafo 24 compreendendo um promotor funcionalmente ligado à sequência de nu- cleotídeos do parágrafo 22 ou 23.
[00588] 26. A construção do parágrafo 25 em que o promotor é um promotor induzível ou um constitutivo.
[00589] 27. Um vetor compreendendo a construção de acordo com qualquer um dos parágrafos 24-26.
[00590] 28. O vetor do parágrafo 27, em que o vetor é um plasmídeo.
[00591] 29. O vetor de acordo com o parágrafo 28 capaz de direcio nar a expressão em células hospedeiras selecionadas a partir de células hospedeiras procarióticas, de levedura, de planta e de inseto.
[00592] 30. A construção de qualquer um dos parágrafos 24-26 ou o vetor de acordo com qualquer um dos parágrafos 27-29 em que a cons-trução ou o vetor é capaz de integração no genoma de uma célula hos-pedeira selecionada a partir de células hospedeiras procarióticas, de le-vedura, de planta e de inseto.
[00593] 31. Uma célula hospedeira recombinante compreendendo uma sequência de nucleotídeos de acordo com o parágrafo 22 ou 23 ou uma construção de acordo com qualquer um dos parágrafos 24-26 ou 30 ou um vetor de acordo com qualquer um dos parágrafos 27-30.
[00594] 32. A célula hospedeira recombinante de acordo com o pa rágrafo 31 em que a célula hospedeira é selecionada a partir do grupo de células hospedeiras procarióticas consistindo em bactérias do gê-neroEscherichia, Streptomyces, Bacillus, Pseudomonas, Lactobacillus e Lactococcus.
[00595] 33. A célula hospedeira recombinante do parágrafo 32 em que a célula hospedeira é uma célula hospedeira de E. coli.
[00596] 34. A célula hospedeira recombinante do parágrafo 33 em que a célula hospedeira expressa excessivamente o gene que codifica o derivado de SHC/HAC.
[00597] 35. Um método para preparar o derivado de SHC/HAC de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-21 compreendendo as eta pas de: (a) cultivar uma ou mais células hospedeiras recombinantes de acordo com qualquer um dos parágrafos 31-34 sob condições que per mitam a produção da enzima derivada de SHC/HAC.
[00598] 36. O método do parágrafo 35 em que a cultura de células ocorre em condições adequadas para a produção do biocatalisador.
[00599] 37. Um método para preparar o (-)-Ambrox compreendendo converter o homofarnesol para (-)-Ambrox usando uma célula hospe deira recombinante de acordo com qualquer um dos parágrafos 31-34 ou usando uma célula hospedeira recombinante compreendendo a SEQ ID N°. 168 codificando uma SHC/HAC TS onde se uma SHC/HAC TS é usada, a bioconversão de homofarnesol para (-)-Ambrox é realizada com um agente solubilizante diferente do Triton X-100.
[00600] 38. O método de acordo com o parágrafo 37 em que a con versão de homofarnesol para (-)-Ambrox sob condições adequadas de reação de bioconversão para a SHC/HAC TS ou a enzima derivada de SHC/HAC.
[00601] 39. O método de acordo com o parágrafo 37 ou 38 em que a conversão de homofarnesol para (-)-Ambrox ocorre sob condições ade-quadas de pH, temperatura, concentrações de agente solubilizante para a SHC/HAC TS ou a enzima derivada de SHC/HAC.
[00602] 40. O método de acordo com o parágrafo 39 em que a con versão de homofarnesol para (-)-Ambrox ocorre a uma temperatura na faixa de 30°C a 60°C, a um pH na faixa de cerca de 4 a 8 e na presença de um agente solubilizante diferente de Triton X-100 para a enzima SHC/HAC TS.
[00603] 41. O método de acordo com qualquer um dos parágrafos 37-40 em que a conversão de homofarnesol para (-)-Ambrox ocorre usando uma ou mais das condições de reação para SHC/HAC TS ou as enzimas derivadas de SHC/HAC conforme definido na Tabela 24 ou Tabela 24a.
[00604] 42. O método de acordo com qualquer um dos parágrafos 37-41 em que a razão entre o peso do bicatalisador para homofarne sol está na faixa de cerca de 0,5-2:1, de preferência cerca de 1:1 ou 0,5:1.
[00605] 43. O método de acordo com qualquer um dos parágrafos 37-42 em que o crescimento celular e as etapas de reação de biocon- versão são realizados no mesmo vaso de reação.
[00606] 44. O método de acordo com qualquer um dos parágrafos 27-31 em que o substrato homofarnesol compreende um ou mais este- reoisômeros de homofarnesol.
[00607] 45. O método de acordo com o parágrafo 44 em que o subs trato homofarnesol compreende um ou mais estereoisômeros de homo-farnesol.
[00608] 46. O método de acordo com o parágrafo 45 em que o subs trato homofarnesol compreende os estereoisômeros EE:EZ.
[00609] 47. O método de acordo com qualquer um dos parágrafos 44-46 em que o homofarnesol compreende uma mistura de estereoisô- mero EE:EZ em razões entre o peso selecionadas a partir do grupo que consiste em: 100:00; 99:01; 98:02; 97:03; 96:04; 95:05; 94:06; 93:07; 92:08; 91:09; 90:10; 89:11; 88:12; 87:13; 86:14; 85:15; 84:16; 83:17; 82:18; 81:19; 80:20; 79:21; 78:22; 77:23; 76:24; 75:25; 74:26; 73:27; 72:28; 71:29 e 70:30.
[00610] 48. O método do parágrafo 47 em que o homofarnesol com preende uma mistura de estereoisômero EE:EZ em uma razão entre o peso selecionada a partir do grupo que consiste em: EE:EZ 90:10; EE:EZ 80:20; EE:EZ 86:14; EE:EZ 70:30; EE:EZ 69:31; e EE:EZ 66:34.
[00611] 49. O método do parágrafo 35 ou 36 em que o homofarnesol compreende uma mistura de estereoisômero EE:EZ em uma razão en tre o peso de 80:20.
[00612] 50. O método de acordo com qualquer um dos parágrafos 37-49 em que o (-)-Ambrox é produzido pela mistura com um ou mais dos subprodutos (II), (IV) e/ou (III).
[00613] 51. O método de acordo com qualquer um dos parágrafos 37-50 em que o (-)-Ambrox é isolado a partir da mistura de reação de bioconversão utilizando um solvente orgânico ou uma etapa de vapor de extração/ destilação ou de filtração.
[00614] 52. O método de acordo com o parágrafo 51 em que o (-)- Ambrox é isolado a partir da mistura de reação utilizando um solvente orgânico.
[00615] 53. O método do parágrafo 52 em que o (-)-Ambrox é seleti vamente cristalizado a partir de (-)-Ambrox utilizando um solvente orgâ-nico.
[00616] 54. O método do parágrafo 52 ou 53 em que o (-)-Ambrox é substancialmente livre de subprodutos (II), (IV) e/ou (III).
[00617] 55. O (-)-Ambrox obtenível pelo método de qualquer um dos parágrafos 51-54.
[00618] 56. O (-)-Ambrox do parágrafo 55 em uma forma sólida, de preferência em uma forma amorfa ou cristalina.
[00619] 57. Um método para fazer um produto contendo o (-)-Ambrox compreendendo incorporando o (-)-Ambrox do parágrafo 55 ou 56 no produto, de preferência um produto de fragrância, um produto cosmé tico, um produto de limpeza e um produto detergente ou um produto de sabão.
[00620] 58. Uma fragrância ou um cosmético ou um produto para cui dados do consumidor compreendendo o (-)-Ambrox do parágrafo 55 ou 56.
[00621] 59. Uma fragrância ou um cosmético ou um produto para cui dados do consumidor compreendendo o (-)-Ambrox do parágrafo 55 ou 56 e um ou mais componentes adicionais.
[00622] 60. O uso do (-)-Ambrox do parágrafo 55 ou 56 como parte de uma fragrância ou um cosmético ou um produto de consumo como tratamento de tecido, higiene pessoal, cuidados de beleza e/ou um pro duto de limpeza.
[00623] 61. O uso de uma enzima derivada de SHC/HAC de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-21, uma sequência de nucleotídeos de acordo com os parágrafos 22 ou 23, uma construção de acordo com qualquer um dos parágrafos 24-26 ou 30, um vetor de acordo com qual-quer um dos parágrafos 27-30 ou uma célula hospedeira recombinante de acordo com qualquer um dos parágrafos 31-34 ou uma célula hos pedeira recombinante expressando uma SHC/HAC TS para a biocon- versão de homofarnesol para (-)-Ambrox em que a enzima SHC/HAC TS é usada com um agente solubilizante diferente de Triton X-100 para a reação de bioconversão.
[00624] Em outro aspecto, é fornecido uma estrutura modelo de cris tal SHC (CMS) baseada nas coordenadas estruturais de SHC com uma sequência de aminoácidos da SHC ou derivado descrito aqui. O SHC CMS inclui um domínio de bolso de ligação esqualeno/homofarnesol (SHBD) que compreende um domínio de bolso de ligação esqualeno/ho- mofarnesol (SHBP) e um substrato esqualeno/homofarnesol ligado ao SBD (por exemplo, ver as Figuras 19 e 20). Esta estrutura modelo de cristal SHC (CMS) facilita o teste em silício dos candidatos da enzima derivada potencial de SHC/HAC.
[00625] Assim, ainda em outras modalidades, a presente divulgação fornece um método de triagem para uma enzima (por exemplo, um de-rivativo de SHC/HAC) capaz de ligar a um SHBD onde o método com-preende o uso do SHC/HAC CMS. Em outro aspecto, a presente divul-gação fornece um método para a triagem de uma enzima (por exemplo, uma SHC de referência ou um derivado de SHC/HAC) capaz de se ligar ao SHBP, e o método compreende colocar o SHBP em contato com um composto de teste (por exemplo, um derivado de SHC), e determinar se o referido composto de teste se liga ao dito SHBP. Em algumas moda-lidades, o método é para a triagem de um composto de teste (por exem plo, um modulador) útil na modulação da atividade de uma enzima deri vada de SHC.
[00626] Por outro aspecto, a presente divulgação fornece um método para prever, simulando ou modelando as características moleculares e/ou interações moleculares de uma SHC de referência e/ou um deri vado de SHC/HAC com um domínio de ligação esqualeno/ homofarne sol (SHBD) compreendendo a utilização de um modelo de computador, o referido modelo de computador compreendendo, usando ou represen tando as coordenadas estruturais de um domínio de ligação esqua- leno/homofarnesol como definido acima para fornecer uma imagem do referido domínio de ligação do ligante e opcionalmente exibir a referida imagem.
[00627] Em toda esta especificação e nas reivindicações que se se guem, a menos que o contexto exija o contrário, a palavra "compreen der", e variações como "compreende" e "compreendendo", será enten dida como implicando a inclusão de uma indicação de número inteiro ou etapa ou grupo de números inteiros ou etapas, mas não a exclusão de qualquer outro número inteiro ou etapa ou grupo de número inteiro ou etapa. O termo "compreendendo" significa também "incluindo", bem como "consistindo", por exemplo, uma composição "compreendendo" X pode consistir exclusivamente de X ou pode incluir alguma coisa adici onal, por exemplo, X + Y. Deve-se notar também que, como usado nesta especificação e nas reivindicações anexadas, formas singulares "a" e "um" incluem plural referentes a menos que o conteúdo determine cla-ramente o contrário. A título de exemplo, uma referência a "um gene" ou "uma enzima"é uma referência a "um ou mais genes" ou "uma ou mais enzimas".
[00628] É para ser entendido que essa divulgação não está limitada à metodologia específica, aos protocolos e reagentes, etc, descritos aqui, pois estes podem variar. É também para ser entendido que a ter minologia usada neste documento é para efeitos de descrição de mo-dalidadesespecíficas e não se destina a limitar o escopo da presente divulgação que será limitado apenas pelas reivindicações em anexo. A menos que definidos de outra forma, todos os termos técnicos e cientí-ficos utilizados aqui terão o mesmo significado que normalmente enten-dido pelo versado na técnica. De acordo com a presente divulgação pode ter técnicas convencionais de biologia molecular e microbiologia, e de DNA recombinante empregados que estão no âmbito da prática da técnica.
[00629] Esta divulgação não é limitada na sua aplicação aos deta lhes da construção e a disposição de componentes definidos na des crição a seguir ou ilustrados nos desenhos. A divulgação é capaz de outras modalidades e de ser praticada ou ser realizada de várias ma neiras.Além disso, a fraseologia e a terminologia usadas aqui são para efeitos de descrição e não devem ser consideradas como limita ção.
[00630] De preferência, os termos utilizados aqui são definidos conforme descrito em "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and Kolbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Suíça).
[00631] Vários documentos são citados ao longo do texto deste rela tório descritivo. Cada um dos documentos citados aqui (incluindo todas as patentes, pedidos de patentes, publicações científicas, especifica ções do fabricante, instruções, submissões de sequências nos números de acesso ao Genbank etc), se acima ou abaixo, é incorporado por re ferência em sua totalidade.
[00632] Os exemplos descritos aqui são ilustrativos da presente di-vulgação e não são destinados a ser e limitações dos mesmos. Modali-dades diferentes da presente divulgação foram descritas de acordo com a presente divulgação. Muitas modificações e variações podem ser fei tas com as técnicas descritas e ilustradas aqui sem que se desviem do caráter e âmbito da divulgação. Por conseguinte, deve ser entendido que os exemplos são apenas ilustrativos e não são limitantes sobre o escopo da divulgação. Tabela 10: Fornece o número de acesso para AacSHC Tabela 11: Fornece o número de acesso para ZmoSHC Tabela 12: Mostra as fontes de outras enzimas SHC provenientes de WO2010139719 Tabela 13: Aminoácido AacSHC TS e nucleotídeo SEQ ID N°. Tabela 14: Aminoácido derivado de AacSHC e nucleotídeo SEQ ID N°. Tabela 15: Aminoácido derivado de ZmoSHC1 TS e ZmoSHC1 e nu- cleotídeo SEQ ID N°. Tabela 16: Aminoácido derivado de ZmoSHC2 TS e ZmoSHC2 e nu- cleotídeo SEQ ID N°. Tabela 17: Aminoácido derivado de BjpSHC1 TS e BjpSHC1 e nu- cleotídeo SEQ ID N°.
[00633] SEQ ID N°. 1 (Alicyclobacillus acidocaldarius), AacSHC MAEQLVEAPAYARTLDRAVEYLLSCQKDEGYWWGPLLSNVTMEAEYVLLC HILDRVDRDRMEKIRRYLLHEQREDGTWALYPGGPPDLDTTIEAYVALKYIG MSRDEEPMQKALRFIQSQGGIESSRVFTRMWLALVGEYPWEKVPMVPPEI MFLGKRMPLNIYEFGSWARATVVALSIVMSRQPVFPLPERARVPELYETDV PPRRRGAKGGGGWIFDALDRALHGYQKLSVHPFRRAAEIRALDWLLERQA GDGSWGGIQPPWFYALIALKILDMTQHPAFIKGWEGLELYGVELDYGGWM FQASISPVWDTGLAVLALRAAGLPADHDRLVKAGEWLLDRQITVPGDWAV KRPNLKPGGFAFQFDNVYYPDVDDTAVVVWALNTLRLPDERRRRDAMTK GFRWIVGMQSSNGGWGAYDVDNTSDLPNHIPFCDFGEVTDPPSEDVTAH VLECFGSFGYDDAWKVIRRAVEYLKREQKPDGSWFGRWGVNYLYGTGAV VSALKAVGIDTREPYIQKALDWVEQHQNPDGGWGEDCRSYEDPAYAGKG ASTPSQTAWALMALIAGGRAESEAARRGVQYLVETQRPDGGWDEPYYTG TGFPGDFYLGYTMYRHVFPTLALGRYKQAIERR
[00634] SEQ ID N°. 2 (mobilisZymomonas mobilis), ZmoSHCI MGIDRMNSLSRLLMKKIFGAEKTSYKPASDTIIGTDTLKRPNRRPEPT AKVDKTIFKTMGNSLNNTLVSACDWLIGQQKPDGHWVGAVESNASM EAEWCLALWFLGLEDHPLRPRLGNALLEMQREDGSWGVYFGAGNG DINATVEAYAALRSLGYSADNPVLKKAAAWIAEKGGLKNIRVFTRYWL ALIGEWPWEKTPNLPPEIIWFPDNFVFSIYNFAQWARATMVPIAILSAR RPSRPLRPQDRLDELFPEGRARFDYELPKKEGIDLWSQFFRTTDRGL HWVQSNLLKRNSLREAAIRHVLEWIIRHQDADGGWGGIQPPWVYGL MALHGEGYQLYHPVMAKALSALDDPGWRHDRGESSWIQATNSPVW DTMLALMALKDAKAEDRFTPEMDKAADWLLARQVKVKGDWSIKLPD VEPGGWAFEYANDRYPDTDDTAVALIALSSYRDKEEWQKKGVEDAIT RGVNWLIAMQSECGGWGAFDKDNNRSILSKIPFCDFGESIDPPSVDV TAHVLEAFGTLGLSRDMPVIQKAIDYVRSEQEAEGAWFGRWGVNYIY GTGAVLPALAAIGEDMTQPYITKACDWLVAHQQEDGGWGESCSSYM EIDSIGKGPTTPSQTAWALMGLIAANRPEDYEAIAKGCHYLIDRQEQD GSWKEEEFTGTGFPGYGVGQTIKLDDPALSKRLLQGAELSRAFMLR YDFYRQFFPIMALSRAERLIDLNN
[00635] SEQ ID N°. 3 (mobilisZymomonas mobilis), ZmoSHC2 MTVSTSSAFHHSPLSDDVEPIIQKATRALLEKQQQDGHWVFELEADATIPAE YILLKHYLGEPEDLEIEAKIGRYLRRIQGEHGGWSLFYGGDLDLSATVKAYF ALKMIGDSPDAPHMLRARNEILARGGAMRANVFTRIQLALFGAMSWEHVP QMPVELMLMPEWFPVHINKMAYWARTVLVPLLVLQALKPVARNRRGILVDE LFVPDVLPTLQESGDPIWRRFFSALDKVLHKVEPYWPKNMRAKAIHSCVHF VTERLNGEDGLGAIYPAIANSVMMYDALGYPENHPERAIARRAVEKLMVLD GTEDQGDKEVYCQPCLSPIWDTALVAHAMLEVGGDEAEKSAISALSWLKP QQILDVKGDWAWRRPDLRPGGWAFQYRNDYYPDVDDTAVVTMAMDRAA KLSDLHDDFEESKARAMEWTIGMQSDNGGWGAFDANNSYTYLNNIPFADH GALLDPPTVDVSARCVSMMAQAGISITDPKMKAAVDYLLKEQEEDGSWFG RWGVNYIYGTWSALCALNVAALPHDHLAVQKAVAWLKTIQNEDGGWGEN CDSYALDYSGYEPMDSTASQTAWALLGLMAVGEANSEAVTKGINWLAQN QDEEGLWKEDYYSGGGFPRVFYLRYHGYSKYFPLWALARYRNLKKANQPI VHYGM
[00636] SEQ ID N°. 4 (Bradyrhizobium japonicum), BjpSHC MTVTSSASARATRDPGNYQTALQSTVRAAADWLIANQKPDGHWVG RAESNACMEAQWCLALWFMGLEDHPLRKRLGQSLLDSQRPDGAW QVYFGAPNGDINATVEAYAALRSLGFRDDEPAVRRAREWIEAKGGLR NIRVFTRYWLALIGEWPWEKTPNIPPEVIWFPLWFPFSIYNFAQWARA TLMPIAVLSARRPSRPLPPENRLDALFPHGRKAFDYELPVKAGAGGW DRFFRGADKVLHKLQNLGNRLNLGLFRPAATSRVLEWMIRHQDFDG AWGGIQPPWIYGLMALYAEGYPLNHPVLAKGLDALNDPGWRVDVGD ATYIQATNSPVWDTILTLLAFDDAGVLGDYPEAVDKAVDWVLQRQVR VPGDWSMKLPHVKPGGWAFEYANNYYPDTDDTAVALIALAPLRHDP KWKAKGIDEAIQLGVDWLIGMQSQGGGWGAFDKDNNQKILTKIPFCD YGEALDPPSVDVTAHIIEAFGKLGISRNHPSMVQALDYIRREQEPSGP WFGRWGVNYVYGTGAVLPALAAIGEDMTQPYIGRACDWLVAHQQA DGGWGESCASYMDVSAVGRGTTTASQTAWALMALLAANRPQDKDA IERGCMWLVERQSAGTWDEPEFTGTGFPGYGVGQTIKLNDPALSQR LMQGPELSRAFMLRYGMYRHYFPLMALGRALRPQSHS
[00637] SEQ ID N°.149 (Burkholderia ambifaria) MNDLTEMATLSAGTVPAGLDAAVASATDALLAAQNADGHWVYELEADSTIP AEYVLLVHYLGETPNLELEQKIGRYLRRVQQADGGWPLFTDGAPNISASVK AYFALKVIGDDENAEHMQRARRAIQAMGGAEMSNVFTRIQLALYGAIPWRA VPMMPVEIMLLPQWFPFHLSKVSYWARTVIVPLLVLNAKRPIAKNPRGVRID ELFVDPPVNAGLLPRQGHQSPGWFAFFRVVDHALRAADGLFPNYTRERAI RQAVSFVDERLNGEDGLGAIYPAMANAVMMYDVLGYAEDHPNRAIARKSIE KLLVVQEDEAYCQPCLSPVWDTSLAAHALLETGDARAEEAVIRGLEWLRPL QILDVRGDWISRRPHVRPGGWAFQYANPHYPDVDDTAVVAVAMDRVQKL KHNDAFRDSIARAREWVVGMQSSDGGWGAFEPENTQYYLNNIPFSDHGA LLDPPTADVSGRCLSMLAQLGETPLNSEPARRALDYMLKEQEPDGSWYGR WGMNYVYGTWTALCALNAAGLTPDDPRVKRGAQWLLSIQNKDGGWGED GDSYKLNYRGFEQAPSTASQTAWALLGLMAAGEVNNPAVARGVEYLIAEQ KEHGLWDETRFTATGFPRVFYLRYHGYRKFFPLWALARYRNLKRNNATRV TFGL
[00638] SEQ ID N°. 151 (Burkholderia ambifaria) MIRRMNKSGPSPWSALDAAIARGRDALMRLQQPDGSWCFELESDAT ITAEYILMMHFMDKIDDARQEKMARYLRAIQRLDTHGGWDLYVDGDP DVSCSVKAYFALKAAGDSEHAPHMVRARDAILELGGAARSNVFTRIL LATFGQVPWRATPFMPIEFVLFPKWVPISMYKVAYWARTTMVPLLVL CSLKARARNPRNIAIPELFVTPPDQERQYFPPARGMRRAFLALDRVV RHVEPLLPKRLRQRAIRHAQAWCAERMNGEDGLGGIFPPIVYSYQM MDVLGYPDDHPLRRDCENALEKLLVTRPDGSMYCQPCLSPVWDTA WSTMALEQARGVAVPEAGAPASALDELDARIARAYDWLAERQVNDL RGDWIENAPADTQPGGWAFQYANPYYPDIDDSAVVTAMLDRRGRT HRNADGSHPYAARVARALDWMRGLQSRNGGFAAFDADCDRLYLNA IPFADHGALLDPPTEDVSGRVLLCFGVTKRADDRASLARAIDYVKRTQ QPDGSWWGRWGTNYLYGTWSVLAGLALAGEDPSQPYIARALAWLR ARQHADGGWGETNDSYIDPALAGTNAGESTSNCTAWALLAQMAFG DGESESVRRGIAYLQSVQQDDGFWWHRSHNAPGFPRIFYLKYHGYT AYFPLWALARYRRLAGGVSAAGAHAVPASTGADAALA
[00639] SEQ ID N°. 153 (Bacillus anthracis) MLLYEKAHEEIVRRATALQTMQWQDGTWRFCFEGAPLTDCHMIFLLK LLGRDKEIEPFVERVASLQTNEGTWKLHEDEVGGNLSATIQSYAALLA SKKYTKEDANMKRAENFIQERGGVARAHFMTKFLLAIHGEYEYPSLFH LPTPIMFLQNDSPFSIFELSSSARIHLIPMMLCLNKRFRVGKKLLPNLNH IAGGGGEWFREDRSPVFQTLLSDVKQIISYPLSLHHKGYEEIERFMKE RIDENGTLYSYATASFYMIYALLALGHSLQSSMIQKAIAGITSYIWKMER GNHLQNSPSTVWDTALLSYALQEAQVSKDNKMIQNATAYLLKKQHTK KADWSVHAPALTPGGWGFSDVNTTIPDIDDTTAVLRALARSRGNKNID NAWKKGGNWIKGLQNNDGGWGAFEKGVTSKLLAKLPIENASDMITDP STPDITGRVLEFFGTYAQNELPEKQIQRAINWLMNVQEENGSWYGKW GICYLYGTWAVMTGLRSLGIPSSNPSLTRAASWLEHIQHEDGGWGES CHSSVEKRFVTLPFSTPSQTAWALDALISYYDTETPAIRKGVSYLLSNP YVNERYPTGTGLPGAFYIRYHSYAHIYPLLTLAHYIKKYRK
[00640] SEQ ID N°. 155 (Frankia alni) MPAGVGVLVWLDQRLRAMGRPDLVTTTGGAEIPFVLVAATASTVGV ALALRRPRHPVGWLFLALGGVLLLSGGTQGYAAYGAVARPGRLPAA DLVAIYADAGFIPWLVLVALILHLTPTGRPLSARWGRIALATAVAGGL WLLVGLVTTETMQPPFQSVTNPLLIGGPLGPLLVARRVLGLATGAGVVLA AVSLIVRFRRSVDVERRQLLWVAVAAVPLPVLMAASFAASYAGNNTAAGL AAATLIGLLAIGAGLAIGQYHLYDVEEILSRAVTYLLVSGLLAASYATVVIVVG QSLAGRTGRSQISAVLATLAAVAVTAPAYRKIQEGVDRRFSRRRFETL QVIRRYLRDPDPDVAVEEVLRRALGDPTLAVAYLVDDRRQWVSADG QPANPGNSFMAAVEVYRRGRPIARVTFDRGRAQPGLVRAAATAAT AELDNAGLRAAVALQLVEVRQSRTRIAAAQFAERRTIERNLHDGAQ QRLLALALQLRAVQLGGDEASLRQAISTGIDQLQAAVVELRELANGL HPAVLADGGLAAALDDVAARTPVPIKISAPDRRYPPDLEAAAWFIAC EAMANAVKHAHPTTIAVDVSAPDGQLIVEVRDDGIGGAQPSGPGLR GIADRAEAFGGSLTVHTDPGTGTTIRALLHRRSPLSSGRRSVMIEGC VDVVAVRRFRCRSSRGSGSRRRRSSWRCGGICGSRCRTGMSRSC SRNAASKLIT
[00641] SEQ ID N°. 157 (RhodoPseudomonas palent) MDSILAPRADAPRNIDGALRESVQQAADWLVANQKPDGHWVGRAET NATMEAQWCLALWFLGLEDHPLRVRLGRALLDTQRPDGAWHVFYG APNGDINATVEAYAALRSLGHRDDEEPLRKARDWILSKGGLANIRVFT RYWLALIGEWPWEKTPNILPEVIWLPTWFPFSIYNFAQWARATLMPIA VLSAHRPSRPLAPQDRLDALFPQGRDSFNYDLPARLGAGVWDVIFR KIDTILHRLQDWGARRGPHGIMRRGAIDHVLQWIIRHQDYDGSWGGI QPPWIYGLMALHTEGYAMTHPVMAKALDALNEPGWRIDIGDATFIQA TNSPVWDTMLSLLAFDDAGLGERYPEQVERAVRWVLKRQVLVPGD WSVKLPDVKPGGWAFEYANNFYPDTDDTSVALMALAPFRHDPKWQ AEGIEDAIQRGIDWLVAMQCKEGGWGAFDKDNDKKILAKIPFCDFGE ALDPPSADVTAHIIEAFAKVGLDRNHPSIVRALDYLKREQEPEGPWFG RWGVNYVYGTGAVLPALAAIGEDMRQPYIARACDWLIARQQANGGW GESCVSYMDAKQAGEGTATASQTAWALMALIAADRPQDRDAIERGC LYLTETQRDGTWQEVHYTGTGFPGYGVGQTIKLNDPLLSKRLMQGP ELSRSFMLRYDLYRHYFPMMAIGRVLRQRGDRSGH
[00642] SEQ ID N°. 159 (Streptomyces coelicolor) MTATTDGSTGASLRPLAASASDTDITIPAAAAGVPEAAARATRRATDFLLAK QDAEGWWKGDLETNVTMDAEDLLLRQFLGIQDEETTRAAALFIRGEQRED GTWATFYGGPGELSTTIEAYVALRLAGDSPEAPHMARAAEWIRSRGGIASA RVFTRIWLALFGWWKWDDLPELPPELIYFPTWVPLNIYDFGCWARQTIVPL TIVSAKRPVRPAPFPLDELHTDPARPNPPRPLAPVASWDGAFQRIDKALHA YRKVAPRRLRRAAMNSAARWIIERQENDGCWGGIQPPAVYSVIALYLLGYD LEHPVMRAGLESLDRFAVWREDGARMIEACQSPVWDTCLATIALADAGVP EDHPQLVKASDWMLGEQIVRPGDWSVKRPGPPGGWAFEFHNDNYPDIDD TAEVVLALRRVRHHDPERVEKAIGRGVRWNLGMQSKNGAWGAFDVDNTS AFPNRLPFCDFGEVIDPPSADVTAHVVEMLAVEGLAHDPRTRRGIQWLLDA QETDGSWFGRWGVNYVYGTGSVIPALTAAGLPTSHPAIRRAVRWLESVQN EDGGWGEDLRSYRYVREWSGRGASTASQTGWALMALLAAGERDSKAVE RGVAWLAATQREDGSWDEPYFTGTGFPWDFSINYNLYRQVFPLTALGRYV HGEPFAKKPRAADAPAEAAPAEVKGS
[00643] SEQ ID N°. 169 ATGGCTGAGCAGTTGGTGGAAGCGCCGGCCTACGCGCGGACGCT GGATCGCGCGGTGGAGTATCTCCTCTCCTGCCAAAAGGACGAAG GCTACTGGTGGGGGCCGCTTCTGAGCAACGTCACGATGGAAGCG GAGTACGTCCTCTTGTGCCACATTCTCGATCGCGTCGATCGGGAT CGCATGGAGAAGATCCGGCGGTACCTGTTGCACGAGCAGCGCGA GGACGGCACGTGGGCCCTGTACCCGGGTGGGCCGCCGGACCTC GACACGACCATCGAGGCGTACGTCGCGCTCAAGTATATCGGCAT GTCGCGCGACGAGGAGCCGATGCAGAAGGCGCTCCGGTTCATTC AGAGCCAGGGCGGGATCGAGTCGTCGCGCGTGTTCACGCGGAT GTGGCTGGCGCTGGTGGGAGAATATCCGTGGGAGAAGGTGCCCA TGGTCCCGCCGGAGATCATGTTCCTCGGCAAGCGCATGCCGCTC AACATCTACGAGTTTGGCTCGTGGGCTCGGGCGACCGTCGTGGC GCTCTCGATTGTGATGAGCCGCCAGCCGGTGTTCCCGCTGCCCG AGCGGGCGCGCGTGCCCGAGCTGTACGAGACCGACGTGCCTCC GCGCCGGCGCGGTGCCAAGGGAGGGGGTGGGTGGATCTTCGAC GCGCTCGACCGGGCGCTGCACGGGTATCAGAAGCTGTCGGTGCA CCCGTTCCGCCGCGCGGCCGAGATCCGCGCCTTGGACTGGTTGC TCGAGCGCCAGGCCGGAGACGGCAGCTGGGGCGGGATTCAGCC GCCTTGGTTTTACGCGCTCATCGCGCTCAAGATTCTCGACATGAC GCAGCATCCGGCGTTCATCAAGGGCTGGGAAGGTCTAGAGCTGT ACGGCGTGGAGCTGGATTACGGAGGATGGATGTTTCAGGCTTCC ATCTCGCCGGTGTGGGACACGGGCCTCGCCGTGCTCGCGCTGC GCGCTGCGGGGCTTCCGGCCGATCACGACCGCTTGGTCAAGGC GGGCGAGTGGCTGTTGGACCGGCAGATCACGGTTCCGGGCGACT GGGCGGTGAAGCGCCCGAACCTCAAGCCGGGCGGGTTCGCGTT CCAGTTCGACAACGTGTACTACCCGGACGTGGACGACACGGCCG TCGTGGTGTGGGCGCTCAACACCCTGCGCTTGCCGGACGAGCGC CGCAGGCGGGACGCCATGACGAAGGGATTCCGCTGGATTGTCGG CATGCAGAGCTCGAACGGCGGTTGGGGCGCCTACGACGTCGACA ACACGAGCGATCTCCCGAACCACATCCCGTTCTGCGACTTCGGC GAAGTGACCGATCCGCCGTCAGAGGACGTCACCGCCCACGTGCT CGAGTGTTTCGGCAGCTTCGGGTACGATGACGCCTGGAAGGTCA TCCGGCGCGCGGTGGAATATCTCAAGCGGGAGCAGAAGCCGGAC GGCAGCTGGTTCGGTCGTTGGGGCGTCAATTACCTCTACGGCAC GGGCGCGGTGGTGTCGGCGCTGAAGGCGGTCGGGATCGACACG CGCGAGCCGTACATTCAAAAGGCGCTCGACTGGGTCGAGCAGCA TCAGAACCCGGACGGCGGCTGGGGCGAGGACTGCCGCTCGTAC GAGGATCCGGCGTACGCGGGTAAGGGCGCGAGCACCCCGTCGC AGACGGCCTGGGCGCTGATGGCGCTCATCGCGGGCGGCAGGGC GGAGTCCGAGGCCGCGCGCCGCGGCGTGCAATACCTCGTGGAG ACGCAGCGCCCGGACGGCGGCTGGGATGAGCCGTACTACACCG GCACGGGCTTCCCAGGGGATTTCTACCTCGGCTACACCATGTACC GCCACGTGTTTCCGACGCTCGCGCTCGGCCGCTACAAGCAAGCC ATCGAGCGCAGGTGA
[00644] Variante 101A10 (SEQ ID N°. 30) ATGGCTGAGCAGTTGGTGGAAGCACCGGCCTACGCGCGGACGCT GGATCGCGCGGTGGAGTATCTCCTCTCCTGCCAAAAGGACGAAG GCTACTGGTGGGGGCCGCTTCTGAGCAACGTCACGATGGAAGCG GAGTACGTCCTCTTGTGCCACATTCTCGATCGCGTCGATCGGGAT CGCATGGAGAAGATCCGGCGGTACCTGTTGCACGAGCAGCGCGA GGACGGCACGTGGGCCCTGTACCCGGGTGGGCCGCCGGACCTC GACACGACCATCGAGGCGTACGTCGCGCTCAAGTATATCGGCAT GTCGCGCGACGAGGAGCCGATGCAGAAGGCGCTCCGGTTCATTC AGAGCCAGGGCGGGATCGAGTCGTCGCGCGTGTTCACGCGGAT GTGGCTGGCGCTGGTGGGAGAATATCCGTGGGAGAAGGTGCCCA TGGTCCCGCCGGAGATCATGTTCCTCGGCAAGCGCATGCCGCTC AACATCTACGAGTTTGGCTCGTGGGCTCGGGCGACCGTCGTGGC GCTCTCGATTGTGATGAGCCGCCAGCCGGTGTTCCCGCTGCCCG AGCGGGCGCGCGTGCCCGAGCTGTACGAGACCGACGTGCCTCC GCGCCGGCGCGGTGCCAAGGGAGGGGGTGGGTGGATCTTCGAC GCGCTCGACCGGGCGCTGCACGGGTATCAGAAGCTGTCGGTGCA CCCGTTCCGCCGCGCGGCCGAGATCCGCGCCTTGGACTGGTTGC TCGAGCGCCAGGCCGGAGACGGCAGCTGGGGCGGGATTCAGCC GCCTTGGTTTTACGCGCTCATCGCGCTCAAGATTCTCGACATGAC GCAGCATCCGGCGTTCATCAAGGGCTGGGAAGGTCTAGAGCTGT ACGGCGTGGAGCTGGATTACGGAGGATGGATGTTTCAGGCTTCC ATCTCGCCGGTGTGGGACACGGGCCTCGCCGTGCTCGCGCTGC GCGCTGCGGGGCTTCCGGCCGATCACGACCGCTTGGTCAAGGC GGGCGAGTGGCTGTTGGACCGGCAGATCACGGTTCCGGGCGACT GGGCGGTGAAGCGCCCGAACCTCAAGCCGGGCGGGTTCGCGTT CCAGTTCGACAACGTGTACTACCCGGACGTGGACGACACGGCCG TCGTGGTGTGGGCGCTCAACACCCTGCGCTTGCCGGACGAGCGC CGCAGGCGGGACGCCATGACGAAGGGATTCCGCTGGATTGTCGG CATGCAGAGCTCGAACGGCGGTTGGGGCGCCTACGACGTCGACA ACACGAGCGATCTCCCGAACCACATCCCGTTCTGCGACTTCGGC GAAGTGACCGATCCGCCGTCAGAGGACGTCACCGCCCACGTGCT CGAGTGTTTCGGCAGCTTCGGGTACGATGACGCCTGGAAGGTCA TCCGGCGCGCGGTGGAATATCTCAAGCGGGAGCAGAAGCCGGAC GGCAGCTGGTTCGGTCGTTGGGGCGTCAATTACCTCTACGGCAC GGGCGCGGTGGTGTCGGCGCTGAAGGCGGTCGGGATCGACACG CGCGAGCCGTACATTCAAAAGGCGCTCGACTGGGTCGAGCAGCA TCAGAACCCGGACGGCGGCTGGGGCGAGGACTGCCGCTCGTAC GAGGATCCGGCGTACGCGGGTAAGGGCGCGAGCACCCCGTCGC AGACGGCCTGGGCGCTGATGGCGCTCATCGCGGGCGGCAGGGC GGAGTCCGAGGCCGCGCGCCGCGGCGTGCATTACCTCGTGGAG ACGCAGCGCCCGGACGGCGGCTGGGATGAGCCGTACTACACCG GCACGGGCTACCCAGGGGATTTCTACCTCGGCTACACCATGTACC GCCACGTGTTTCCGACGCTCGCGCTCGGCCGCTACAAGCAAGCC ATCGAGCGCAGGTGA
[00645] Variante 101A10 (SEQ ID N°. 29) MAEQLVEAPAYARTLDRAVEYLLSCQKDEGYWWGPLLSNVTMEAEY VLLCHILDRVDRDRMEKIRRYLLHEQREDGTWALYPGGPPDLDTTIEA YVALKYIGMSRDEEPMQKALRFIQSQGGIESSRVFTRMWLALVGEYP WEKVPMVPPEIMFLGKRMPLNIYEFGSWARATVVALSIVMSRQPVFP LPERARVPELYETDVPPRRRGAKGGGGWIFDALDRALHGYQKLSVH PFRRAAEIRALDWLLERQAGDGSWGGIQPPWFYALIALKILDMTQHP AFIKGWEGLELYGVELDYGGWMFQASISPVWDTGLAVLALRAAGLP ADHDRLVKAGEWLLDRQITVPGDWAVKRPNLKPGGFAFQFDNVYYP DVDDTAVVVWALNTLRLPDERRRRDAMTKGFRWIVGMQSSNGGWG AYDVDNTSDLPNHIPFCDFGEVTDPPSEDVTAHVLECFGSFGYDDA WKVIRRAVEYLKREQKPDGSWFGRWGVNYLYGTGAVVSALKAVGID TREPYIQKALDWVEQHQNPDGGWGEDCRSYEDPAYAGKGASTPSQ TAWALMALIAGGRAESEAARRGVHYLVETQRPDGGWDEPYYTGTG YPGDFYLGYTMYRHVFPTLALGRYKQAIERR
[00646] Variante 111C8 (SEQ ID N°. 30) ATGGCTGAGCAGTTGGTGGAAGCGCCGGCCTACGCGCGGACGCT GGATCGCGCGGTGGAGTATCTCCTCTCCTGCCAAAAGGACGAAG GCTACTGGTGGGGGCCGCTTCTGAGCAACGTCACGATGGAAGCG GAGTACGTCCTCTTGTGCCACATTCTCGATCGCGTCGATCGGGAT CGCATGGAGAAGATCCGGCGGTACCTGTTGCACGAGCAGCGCGA GGACGGCGCGTGGGCCCTGTACCCGGGTGGGCCGCCGGACCTC GACACGACCGTCGAGGCGTACGTCGCGCTCAAGTATATCGGCAT GTCGCGCGACGAGGAGCCGATGCAGAAGGCGCTCCGGTTCATTC AGAGCCAGGGCGGGATCGAGTCGTCGCGCGTGCTCACGCGGAT GTGGCTGGCGCTGGTGGGAGAATATCCGTGGGAGAAGGTGCCCA TGGTCCCGCCGGAGATCATGTTCCTCGGCAAGCGCATGCCGCTC AACATCTACGAGTTTGGCTCGTGGGCTCGGGCGACCGTCGTGGC GCTCTCGATTGTGATGAGCCGCCAGCCGGTGTTCCCGCTGCCCG AGCGGGCGCGCGTGCCCGAGCTGTACGAGACCGACGTGCCTCC GCGCCGGCGCGGTGCCAAGGGAGGGGGTGGGTGGATCTTCGAC GCGCTCGACCGGGCGCTGCACGGGTATCAGAAGCTGTCGGTGCA CCCGTTCCGCCGCGCGGCCGAGATCCGCGCCTTGGACTGGTTGC TCGAGCGCCAGGCCGGAGACGGCAGCTGGGGCGGGATTCAGCC GCCTTGGTTTTACGCGCTCATCGCGCTCAAGATTCTCGACATGAC GCAGCATCCGGCGTTCATCAAGGGCTGGGAAGGTCTAGAGCTGT ACGGCGTGGAGCTGGATTACGGAGGATGGATGTTTCAGGCTTCC ATCTCGCCGGTGTGGGACACGGGCCTCGCCGTGCTCGCGCTGC GCGCTGCGGGGCTTCCGGCCGATCACGACCGCTTGGTCAAGGC GGGCGAGTGGCTGTTGGACCGGCAGATCACGGTTCCGGGCGACT GGGCGGTGAAGCGCCCGAACCTCAAGCCGGGCGGGTTCGCGTT CCAGTTCGACAACGTGTACTACCCGGACGTGGACGACACGGCCG TCGTGGTGTGGGCGCTCAACACCCTGCGCTTGCCGGACGAGCGC CGCAGGCGGGACGCCATGACGAAGGGATTCCGCTGGATTGTCGG CATGCAGAGCTCGAACGGCGGTTGGGGCGCCTACGACGTCGACA ACACGAGCGATCTCCCGAACCACATCCCGTTCTGCGACTTCGGC GAAGTGACCGATCCGCCGTCAGAGGACGTCACCGCCCACGTGCT CGAGTGTTTCGGCAGCTTCGGGTACGATGACGCCTGGAAGGTCA TCCGGCGCGCGGTGGAATATCTCAAGCGGGAGCAGAAGCCGGAC GGCAGCTGGTTCGGTCGTTGGGGCGTCAATTACCTCTACGGCAC GGGCGCGGTGGTGTCGGCGCTGAAGGCGGTCGGGATCGACACG CGCGAGCCGTACATTCAAAAGGCGCTCGACTGGGTCGAGCAGCA TCAGAACCCGGACGGCGGCTGGGGCGAGGACTGCCGCTCGTAC GAGGATCCGGCGTACGCGGGTAAGGGCGCGAGCACCCCGTCGC AGACGGCCTGGGCGCTGATGGCGCTCATCGCGGGCGGCAGGGC GGAGTCCGAGGCCGCGCGCCGCGGCGTGCAATACCTCGTGGAG ACGCAGCGCCCGGACGGCGGCTGGGATGAGCCGTACTACACCG GCACGGGCTTCCCAGGGGATTTCTACCTCGGCTACACCATGTACC GCCACGTGTTTCCGACGCTCGCGCTCGGCCGCTACAAGCAAGCC ATCGAGCGCAGGTGA
[00647] Variante 111C8 (SEQ ID N°. 27) MAEQLVEAPAYARTLDRAVEYLLSCQKDEGYWWGPLLSNVTMEAEY VLLCHILDRVDRDRMEKIRRYLLHEQREDGAWALYPGGPPDLDTTVE AYVALKYIGMSRDEEPMQKALRFIQSQGGIESSRVLTRMWLALVGEY PWEKVPMVPPEIMFLGKRMPLNIYEFGSWARATVVALSIVMSRQPVF PLPERARVPELYETDVPPRRRGAKGGGGWIFDALDRALHGYQKLSV HPFRRAAEIRALDWLLERQAGDGSWGGIQPPWFYALIALKILDMTQH PAFIKGWEGLELYGVELDYGGWMFQASISPVWDTGLAVLALRAAGL PADHDRLVKAGEWLLDRQITVPGDWAVKRPNLKPGGFAFQFDNVYY PDVDDTAVVVWALNTLRLPDERRRRDAMTKGFRWIVGMQSSNGGW GAYDVDNTSDLPNHIPFCDFGEVTDPPSEDVTAHVLECFGSFGYDDA WKVIRRAVEYLKREQKPDGSWFGRWGVNYLYGTGAVVSALKAVGID TREPYIQKALDWVEQHQNPDGGWGEDCRSYEDPAYAGKGASTPSQ TAWALMALIAGGRAESEAARRGVQYLVETQRPDGGWDEPYYTGTG FPGDFYLGYTMYRHVFPTLALGRYKQAIERR
[00648] Variante SHC215G2 (SEQ ID N°. 22) ATGGCTGAGCAGTTGGTGGAAGCTCCGGCCTACGCGCGGACGCT GGATCGCGCGGTGGAGTATCTCCTCTCCTGCCAAAAGGACGAAG GCTACTGGTGGGGGCCGCTTCTGAGCAACGTCACGATGGAAGCG GAGTACGTCCTCTTGTGCCACATTCTCGATCGCGTCGATCGGGAT CGCATGGAGAAGATCCGGCGGTACCTGTTGCACGAGCAGCGCGA GGACGGCACGTGGGCCCTGTACCCGGGTGGGCCGCCGGACCTC GACACGACCATCGAGGCGTACGTCGCGCTCAAGTATATCGGCAT GTCGCGCGACGAGGAGCCGATGCAGAAGGCGCTCCGGTTCATTC AGAGCCAGGGCGGGATCGAGTCGTCGCGCGTGTTCACGCGGAG GTGGCTGGCGCTGGTGGGAGAATATCCGTGGGAGAAGGTGCCCA TGGTCCCGCCGGAGATCATGTTCCTCGGCAAGCGCATGCCGCTC AACATCTACGAGTTTGGCTCGTGGGCTCGGGCGACCGTCGTGGC GCTCTCGATTGTGATGAGCCGCCAGCCGGTGTTCCCGCTGCCCG AGCGGGCGCGCGTGCCCGAGCTGTACGAGACCGACGTGCCTCC GCGCCGGCGCGGTGCCAAGGGAGGGGGTGGGTGGATCTTCGAC GCGCTCGACCGGGTGCTGCACGGGTATCAGAAGCTGTCGGTGCA CCCGTTCCGCCGCGCGGCCGAGATCCGCGCCTTGGACTGGTTGC TCGAGCGCCAGGCCGGAGACGGCAGCTGGGGCGGGATTCAGCC GCCTTGGTTTTACGCGCTCATCGCGCTCAAGATTCTCGACATGAC GCAGCATCCGGCGTTCATCAAGGGCTGGGAAGGTCTAGAGCTGT ACGGCGTGGAGCTGGATTACGGAGGATGGATGTTTCAGGCTTCC ATCTCGCCGGTGTGGGACACGGGCCTCGCCGTGCTCGCGCTGC GCGCTGCGGGGCTTCCGGCCGATCACGACCGCTTGGTCAAGGC GGGCGAGTGGCTGTTGGACCGGCAGATCACGGTTCCGGGCGACT GGGCGGTGAAGCGCCCGAACCTCAAGCCGGGCGGGTTCGCGTT CCAGTTCGACAACGTGTACTACCCGGACGTGGACGACACGGCCG TCGTGGTGTGGGCGCTCAACACCCTGCGCTTGCCGGACGAGCGC CGCAGGCGGGACGCCATGACGAAGGGATTCCGCTGGATTGTCGG CATGCAGAGCTCGAACGGCGGTTGGGGCGCCTACGACGTCGACA ACACGAGCGATCTCCCGAACCACACCCCGTTCTGCGACTTCGGC GAAGTGACCGATCCGCCGTCAGAGGACGTCACCGCCCACGTGCT CGAGTGTTTCGGCAGCTTCGGGTACGATGACGCCTGGAAGGTCA TCCGGCGCGCGGTGGAATATCTCAAGCGGGAGCAGAAGCCGGAC GGCAGCTGGTTCGGTCGTTGGGGCGTCAATTACCTCTACGGCAC GGGCGCGGTGGTGTCGGCGCTGAAGGCGGTCGGGATCGACACG CGCGAGCCGTACATTCAAAAGGCGCTCGACTGGGTCGAGCAGCA TCAGAACCCGGACGGCGGCTGGGGCGAGGACTGCCGCTCGTAC GAGGATCCGGCGTACGCGGGTAAGGGCGCGAGCACCCCGTCGC AGACGGCCTGGGCGCTGATGGCGCTCATCGCGGGCGGCAGGGC GGAGTCCGAGGCCGCGCGCCGCGGCGTGCAATACCTCGTGGAG ACGCAGCGCCCGGACGGCGGCTGGGATGAGCCGTACTACACCG GCACGGGCTTCCCAGGGGATTTCTACCTCGGCTACACCATGTACC GCCACGTGTTTCCGACGCTCGCGCTCGGCCGCTACAAGCAAGCC ATCGAGCGCAGGTGA
[00649] Variante SHC215G2 (SEQ ID N°. 21) MAEQLVEAPAYARTLDRAVEYLLSCQKDEGYWWGPLLSNVTMEAEY VLLCHILDRVDRDRMEKIRRYLLHEQREDGTWALYPGGPPDLDTTIEA YVALKYIGMSRDEEPMQKALRFIQSQGGIESSRVFTRRWLALVGEYP WEKVPMVPPEIMFLGKRMPLNIYEFGSWARATVVALSIVMSRQPVFP LPERARVPELYETDVPPRRRGAKGGGGWIFDALDRVLHGYQKLSVH PFRRAAEIRALDWLLERQAGDGSWGGIQPPWFYALIALKILDMTQHP AFIKGWEGLELYGVELDYGGWMFQASISPVWDTGLAVLALRAAGLP ADHDRLVKAGEWLLDRQITVPGDWAVKRPNLKPGGFAFQFDNVYYP DVDDTAVVVWALNTLRLPDERRRRDAMTKGFRWIVGMQSSNGGWG AYDVDNTSDLPNHTPFCDFGEVTDPPSEDVTAHVLECFGSFGYDDA WKVIRRAVEYLKREQKPDGSWFGRWGVNYLYGTGAVVSALKAVGID TREPYIQKALDWVEQHQNPDGGWGEDCRSYEDPAYAGKGASTPSQ TAWALMALIAGGRAESEAARRGVQYLVETQRPDGGWDEPYYTGTG FPGDFYLGYTMYRHVFPTLALGRYKQAIERR
[00650] Variante SHC3 (SEQ ID N°. 26) ATGGCTGAGCAGTTGGTGGAAGCGCCGGCCTACGCGCGGACGCT GGATCGCGCGGTGGAGTATCTCCTCTCCTGCCAAAAGGACGAAG GCTACTGGTGGGGGCCGCTTCTGAGCAACGTCACGATGGAAGCG GAGTACGTCCTCTTGTGCCACATTCTCGATCGCGTCGATCGGGAT CGCATGGAGAAGATCCGGCGGTACCTGTTGCACGAGCAGCGCGA GGACGGCACGTGGGCCCTGTACCCGGGTGGGCCGCCGGACCTC GACACGACCATCGAGGCGTACGTCGCGCTCAAGTATATCGGCAT GTCGCGCGACGAGGAGCCGATGCAGAAGGCGCTCCGGTTCATTC AGAGCCAGGGCGGGATCGAGTCGTCGCGCGTGTTCACGCGGAT GTGGCTGGCGCTGGTGGGAGAATATCCGTGGGAGAAGGTGCCCA TGGTCCCGCCGGAGATCATGTTCCTCGGCAAGCGCATGCCGCTC AACATCTACGAGTTTGGCTCGTGGGCTCGGGCGACCGTCGTGGC GCTCTCGATTGTGATGAGCCGCCAGCCGGTGTTCCCGCTGCCCG AGCGGGCGCGCGTGCCCGAGCTGTACGAGACCGACGTGCCTCC GCGCCGGCGCGGTGCCAAGGGAGGGGGTGGGTGGATCTTCGAC GCGCTCGACCGGGCGCTGCACGGGTATCAGAAGCTGTCGGTGCA CCCGTTCCGCCGCGCGGCCGAGATCCGCGCCTTGGACTGGTTGC TCGAGCGCCAGGCCGGAGACGGCAGCTGGGGCGGGATTCAGCC GCCTTGGTTTTACGCGCTCATCGCGCTCAAGATTCTCGACATGAC GCAGCATCCGGCGTTCATCAAGGGCTGGGAAGGTCTAGAGCTGT ACGGCGTGGAGCTGGATTACGGAGGATGGATGTTTCAGGCTTCC ATCTCGCCGGTGTGGGACACGGGCCTCGCCGTGCTCGCGCTGC GCGCTGCGGGGCTTCCGGCCGATCACGACCGCTTGGTCAAGGC GGGCGAGTGGCTGTTGGACCGGCAGATCACGGTTCCGGGCGACT GGGCGGTGAAGCGCCCGAACCTCAAGCCGGGCGGGTTCGCGTT CCAGTTCGACAACGTGTACTACCCGGACGTGGACGACACGGCCG TCGTGGTGTGGGCGCTCAACACCCTGCGCTTGCCGGACGAGCGC CGCAGGCGGGACGCCATGACGAAGGGATTCCGCTGGATTGTCGG CATGCAGAGCTCGAACGGCGGTTGGGGCGCCTACGACGTCGACA ACACGAGCGATCTCCCGAACCACATCCCGTTCTGCGACTTCGGC GAAGTGACCGATCCGCCGTCAGAGGACGTCACCGCCCACGTGCT CGAGTGTTTCGGCAGCTTCGGGTACGATGACGCCTGGAAGGTCA TCCGGCGCGCGGTGGAATATCTCAAGCGGGAGCAGAAGCCGGAC GGCAGCTGGTTCGGTCGTTGGGGCGTCAATTACCTCTACGGCAC GGGCGCGGTGGTGTCGGCGCTGAAGGCGGTCGGGATCGACACG CGCGAGCCGTACATTCAAAAGGCGCTCGACTGGGTCGAGCAGCA TCAGAACCCGGACGGCGGCTGGGGCGAGGACTGCCGCTCGTAC GAGGATCCGGCGTACGCGGGTAAGGGCGCGAGCACCCCGTCGC AGACGGCCTGGGCGCTGATGGCGCTCATCGCGGGCGGCAGGGC GGAGTCCGAGGCCGCGCGCCGCGGCGTGCAATACCTCGTGGAG ACGCAGCGCCCGGACGGCGGCTGGGATGAGCCGTACTACACCG GCACGGGCTACCCAGGGGATTTCTACCTCGGCTACACCATGTACC GCCACGTGTTTCCGACGCTCGCGCTCGGCCGCTACAAGCAAGCC ATCGAGCGCAGGTGA
[00651] Variante SHC3 (SEQ ID N°. 25) MAEQLVEAPAYARTLDRAVEYLLSCQKDEGYWWGPLLSNVTMEAEY VLLCHILDRVDRDRMEKIRRYLLHEQREDGTWALYPGGPPDLDTTIEA YVALKYIGMSRDEEPMQKALRFIQSQGGIESSRVFTRMWLALVGEYP WEKVPMVPPEIMFLGKRMPLNIYEFGSWARATVVALSIVMSRQPVFP LPERARVPELYETDVPPRRRGAKGGGGWIFDALDRALHGYQKLSVH PFRRAAEIRALDWLLERQAGDGSWGGIQPPWFYALIALKILDMTQHP AFIKGWEGLELYGVELDYGGWMFQASISPVWDTGLAVLALRAAGLP ADHDRLVKAGEWLLDRQITVPGDWAVKRPNLKPGGFAFQFDNVYYP DVDDTAVVVWALNTLRLPDERRRRDAMTKGFRWIVGMQSSNGGWG AYDVDNTSDLPNHIPFCDFGEVTDPPSEDVTAHVLECFGSFGYDDA WKVIRRAVEYLKREQKPDGSWFGRWGVNYLYGTGAVVSALKAVGID TREPYIQKALDWVEQHQNPDGGWGEDCRSYEDPAYAGKGASTPSQ TAWALMALIAGGRAESEAARRGVQYLVETQRPDGGWDEPYYTGTG YPGDFYLGYTMYRHVFPTLALGRYKQAIERR
[00652] Variante SHC10 (SEQ ID N°. 32) ATGGCTGAGCAGTTGGTGGAAGCGCCGGCCTACGCGCGGACGCT GGATCGCGCGGTGGAGTATCTCCTCTCCTGCCAAAAGGACGAAG GCTACTGGTGGGGGCCGCTTCTGAGCAACGTCACGATGGAAGCG GAGTACGTCCTCTTGTGCCACATTCTCGATCGCGTCGATCGGGAT CGCATGGAGAAGATCCGGCGGTACCTGTTGCACGAGCAGCGCGA GGACGGCACGTGGGCCCTGTACCCGGGTGGGCCGCCGGACCTC GACACGACCATCGAGGCGTACGTCGCGCTCAAGTATATCGGCAT GTCGCGCGACGAGGAGCCGATGCAGAAGGCGCTCCGGTTCATTC AGAGCCAGGGCGGGATCGAGTCGTCGCGCGTGCTCACGCGGAT GTGGCTGGCGCTGGTGGGAGAATATCCGTGGGAGAAGGTGCCCA TGGTCCCGCCGGAGATCATGTTCCTCGGCAAGCGCATGCCGCTC AACATCTACGAGTTTGGCTCGTGGGCTCGGGCGACCGTCGTGGC GCTCTCGATTGTGATGAGCCGCCAGCCGGTGTTCCCGCTGCCCG AGCGGGCGCGCGTGCCCGAGCTGTACGAGACCGACGTGCCTCC GCGCCGGCGCGGTGCCAAGGGAGGGGGTGGGTGGATCTTCGAC GCGCTCGACCGGGCGCTGCACGGGTATCAGAAGCTGTCGGTGCA CCCGTTCCGCCGCGCGGCCGAGATCCGCGCCTTGGACTGGTTGC TCGAGCGCCAGGCCGGAGACGGCAGCTGGGGCGGGATTCAGCC GCCTTGGTTTTACGCGCTCATCGCGCTCAAGATTCTCGACATGAC GCAGCATCCGGCGTTCATCAAGGGCTGGGAAGGTCTAGAGCTGT ACGGCGTGGAGCTGGATTACGGAGGATGGATGTTTCAGGCTTCC ATCTCGCCGGTGTGGGACACGGGCCTCGCCGTGCTCGCGCTGC GCGCTGCGGGGCTTCCGGCCGATCACGACCGCTTGGTCAAGGC GGGCGAGTGGCTGTTGGACCGGCAGATCACGGTTCCGGGCGACT GGGCGGTGAAGCGCCCGAACCTCAAGCCGGGCGGGTTCGCGTT CCAGTTCGACAACGTGTACTACCCGGACGTGGACGACACGGCCG TCGTGGTGTGGGCGCTCAACACCCTGCGCTTGCCGGACGAGCGC CGCAGGCGGGACGCCATGACGAAGGGATTCCGCTGGATTGTCGG CATGCAGAGCTCGAACGGCGGTTGGGGCGCCTACGACGTCGACA ACACGAGCGATCTCCCGAACCACATCCCGTTCTGCGACTTCGGC GAAGTGACCGATCCGCCGTCAGAGGACGTCACCGCCCACGTGCT CGAGTGTTTCGGCAGCTTCGGGTACGATGACGCCTGGAAGGTCA TCCGGCGCGCGGTGGAATATCTCAAGCGGGAGCAGAAGCCGGAC GGCAGCTGGTTCGGTCGTTGGGGCGTCAATTACCTCTACGGCAC GGGCGCGGTGGTGTCGGCGCTGAAGGCGGTCGGGATCGACACG CGCGAGCCGTACATTCAAAAGGCGCTCGACTGGGTCGAGCAGCA TCAGAACCCGGACGGCGGCTGGGGCGAGGACTGCCGCTCGTAC GAGGATCCGGCGTACGCGGGTAAGGGCGCGAGCACCCCGTCGC AGACGGCCTGGGCGCTGATGGCGCTCATCGCGGGCGGCAGGGC GGAGTCCGAGGCCGCGCGCCGCGGCGTGCAATACCTCGTGGAG ACGCAGCGCCCGGACGGCGGCTGGGATGAGCCGTACTACACCG GCACGGGCTTCCCAGGGGATTTCTACCTCGGCTACACCATGTACC GCCACGTGTTTCCGACGCTCGCGCTCGGCCGCTACAAGCAAGCC ATCGAGCGCAGGTGA
[00653] Variante SHC10 (SEQ ID N°. 31) MAEQLVEAPAYARTLDRAVEYLLSCQKDEGYWWGPLLSNVTMEAEY VLLCHILDRVDRDRMEKIRRYLLHEQREDGTWALYPGGPPDLDTTIEA YVALKYIGMSRDEEPMQKALRFIQSQGGIESSRVLTRMWLALVGEYP WEKVPMVPPEIMFLGKRMPLNIYEFGSWARATVVALSIVMSRQPVFP LPERARVPELYETDVPPRRRGAKGGGGWIFDALDRALHGYQKLSVH PFRRAAEIRALDWLLERQAGDGSWGGIQPPWFYALIALKILDMTQHP AFIKGWEGLELYGVELDYGGWMFQASISPVWDTGLAVLALRAAGLP ADHDRLVKAGEWLLDRQITVPGDWAVKRPNLKPGGFAFQFDNVYYP DVDDTAVVVWALNTLRLPDERRRRDAMTKGFRWIVGMQSSNGGWG AYDVDNTSDLPNHIPFCDFGEVTDPPSEDVTAHVLECFGSFGYDDA WKVIRRAVEYLKREQKPDGSWFGRWGVNYLYGTGAVVSALKAVGID TREPYIQKALDWVEQHQNPDGGWGEDCRSYEDPAYAGKGASTPSQ TAWALMALIAGGRAESEAARRGVQYLVETQRPDGGWDEPYYTGTG FPGDFYLGYTMYRHVFPTLALGRYKQAIERR
[00654] Variante SHC26 (SEQ ID N°. 24) ATGGCTGAGCAGTTGGTGGAAGCTCCGGCCTACGCGCGGACGCT GGATCGCGCGGTGGAGTATCTCCTCTCCTGCCAAAAGGACGAAG GCTACTGGTGGGGGCCGCTTCTGAGCAACGTCACGATGGAAGCG GAGTACGTCCTCTTGTGCCACATTCTCGATCGCGTCGATCGGGAT CGCATGGAGAAGATCCGGCGGTACCTGTTGCACGAGCAGCGCGA GGACGGCACGTGGGCCCTGTACCCGGGTGGGCCGCCGGACCTC GACACGACCATCGAGGCGTACGTCGCGCTCAAGTATATCGGCAT GTCGCGCGACGAGGAGCCGATGCAGAAGGCGCTCCGGTTCATTC AGAGCCAGGGCGGGATCGAGTCGTCGCGCGTGTTCACGCGGAG GTGGCTGGCGCTGGTGGGAGAATATCCGTGGGAGAAGGTGCCCA TGGTCCCGCCGGAGATCATGTTCCTCGGCAAGCGCATGCCGCTC AACATCTACGAGTTTGGCTCGTGGGCTCGGGCGACCGTCGTGGC GCTCTCGATTGTGATGAGCCGCCAGCCGGTGTTCCCGCTGCCCG AGCGGGCGCGCGTGCCCGAGCTGTACGAGACCGACGTGCCTCC GCGCCGGCGCGGTGCCAAGGGAGGGGGTGGGTGGATCTTCGAC GCGCTCGACCGGGCGCTGCACGGGTATCAGAAGCTGTCGGTGCA CCCGTTCCGCCGCGCGGCCGAGATCCGCGCCTTGGACTGGTTGC TCGAGCGCCAGGCCGGAGACGGCAGCTGGGGCGGGATTCAGCC GCCTTGGTTTTACGCGCTCATCGCGCTCAAGATTCTCGACATGAC GCAGCATCCGGCGTTCATCAAGGGCTGGGAAGGTCTAGAGCTGT ACGGCGTGGAGCTGGATTACGGAGGATGGATGTTTCAGGCTTCC ATCTCGCCGGTGTGGGACACGGGCCTCGCCGTGCTCGCGCTGC GCGCTGCGGGGCTTCCGGCCGATCACGACCGCTTGGTCAAGGC GGGCGAGTGGCTGTTGGACCGGCAGATCACGGTTCCGGGCGACT GGGCGGTGAAGCGCCCGAACCTCAAGCCGGGCGGGTTCGCGTT CCAGTTCGACAACGTGTACTACCCGGACGTGGACGACACGGCCG TCGTGGTGTGGGCGCTCAACACCCTGCGCTTGCCGGACGAGCGC CGCAGGCGGGACGCCATGACGAAGGGATTCCGCTGGATTGTCGG CATGCAGAGCTCGAACGGCGGTTGGGGCGCCTACGACGTCGACA ACACGAGCGATCTCCCGAACCACACCCCGTTCTGCGACTTCGGC GAAGTGACCGATCCGCCGTCAGAGGACGTCACCGCCCACGTGCT CGAGTGTTTCGGCAGCTTCGGGTACGATGACGCCTGGAAGGTCA TCCGGCGCGCGGTGGAATATCTCAAGCGGGAGCAGAAGCCGGAC GGCAGCTGGTTCGGTCGTTGGGGCGTCAATTACCTCTACGGCAC GGGCGCGGTGGTGTCGGCGCTGAAGGCGGTCGGGATCGACACG CGCGAGCCGTACATTCAAAAGGCGCTCGACTGGGTCGAGCAGCA TCAGAACCCGGACGGCGGCTGGGGCGAGGACTGCCGCTCGTAC GAGGATCCGGCGTACGCGGGTAAGGGCGCGAGCACCCCGTCGC AGACGGCCTGGGCGCTGATGGCGCTCATCGCGGGCGGCAGGGC GGAGTCCGAGGCCGCGCGCCGCGGCGTGCAATACCTCGTGGAG ACGCAGCGCCCGGACGGCGGCTGGGATGAGCCGTACTACACCG GCACGGGCTTCCCAGGGGATTTCTACCTCGGCTACACCATGTACC GCCACGTGTTTCCGACGCTCGCGCTCGGCCGCTACAAGCAAGCC ATCGAGCGCAGGTGA
[00655] Variante SHC26 (SEQ ID N°. 23) MAEQLVEAPAYARTLDRAVEYLLSCQKDEGYWWGPLLSNVTMEAEY VLLCHILDRVDRDRMEKIRRYLLHEQREDGTWALYPGGPPDLDTTIEA YVALKYIGMSRDEEPMQKALRFIQSQGGIESSRVFTRRWLALVGEYP WEKVPMVPPEIMFLGKRMPLNIYEFGSWARATVVALSIVMSRQPVFP LPERARVPELYETDVPPRRRGAKGGGGWIFDALDRALHGYQKLSVH PFRRAAEIRALDWLLERQAGDGSWGGIQPPWFYALIALKILDMTQHP AFIKGWEGLELYGVELDYGGWMFQASISPVWDTGLAVLALRAAGLP ADHDRLVKAGEWLLDRQITVPGDWAVKRPNLKPGGFAFQFDNVYYP DVDDTAVVVWALNTLRLPDERRRRDAMTKGFRWIVGMQSSNGGWG AYDVDNTSDLPNHTPFCDFGEVTDPPSEDVTAHVLECFGSFGYDDA WKVIRRAVEYLKREQKPDGSWFGRWGVNYLYGTGAVVSALKAVGID TREPYIQKALDWVEQHQNPDGGWGEDCRSYEDPAYAGKGASTPSQ TAWALMALIAGGRAESEAARRGVQYLVETQRPDGGWDEPYYTGTG FPGDFYLGYTMYRHVFPTLALGRYKQAIERR
[00656] Variante SHC30 (SEQ ID N°. 34) ATGGCTGAGCAGTTGGTGGAAGCGCCGGCCTACGCGCGGACGCT GGATCGCGCGGTGGAGTATCTCCTCTCCTGCCAAAAGGACGAAG GCTACTGGTGGGGGCCGCTTCTGAGCAACGTCACGATGGAAGCG GAGTACGTCCTCTTGTGCCACATTCTCGATCGCGTCGATCGGGAT CGCATGGAGAAGATCCGGCGGTACCTGTTGCACGAGCAGCGCGA GGACGGCACGTGGGCCCTGTACCCGGGTGGGCCGCCGGACCTC GACACGACCATCGAGGCGTACGTCGCGCTCAAGTATATCGGCAT GTCGCGCGACGAGGAGCCGATGCAGAAGGCGCTCCGGTTCATTC AGAGCCAGGGCGGGATCGAGTCGTCGCGCGTGCTCACGCGGAT GTGGCTGGCGCTGGTGGGAGAATATCCGTGGGAGAAGGTGCCCA TGGTCCCGCCGGAGATCATGTTCCTCGGCAAGCGCATGCCGCTC AACATCTACGAGTTTGGCTCGTGGGCTCGGGCGACCGTCGTGGC GCTCTCGATTGTGATGAGCCGCCAGCCGGTGTTCCCGCTGCCCG AGCGGGCGCGCGTGCCCGAGCTGTACGAGACCGACGTGCCTCC GCGCCGGCGCGGTGCCAAGGGAGGGGGTGGGTGGATCTTCGAC GCGCTCGACCGGGCGCTGCACGGGTATCAGAAGCTGTCGGTGCA CCCGTTCCGCCGCGCGGCCGAGATCCGCGCCTTGGACTGGTTGC TCGAGCGCCAGGCCGGAGACGGCAGCTGGGGCGGGATTCAGCC GCCTTGGTTTTACGCGCTCATCGCGCTCAAGATTCTCGACATGAC GCAGCATCCGGCGTTCATCAAGGGCTGGGAAGGTCTAGAGCTGT ACGGCGTGGAGCTGGATTACGGAGGATGGATGTTTCAGGCTTCC ATCTCGCCGGTGTGGGACACGGGCCTCGCCGTGCTCGCGCTGC GCGCTGCGGGGCTTCCGGCCGATCACGACCGCTTGGTCAAGGC GGGCGAGTGGCTGTTGGACCGGCAGATCACGGTTCCGGGCGACT GGGCGGTGAAGCGCCCGAACCTCAAGCCGGGCGGGTTCGCGTT CCAGTTCGACAACGTGTACTACCCGGACGTGGACGACACGGCCG TCGTGGTGTGGGCGCTCAACACCCTGCGCTTGCCGGACGAGCGC CGCAGGCGGGACGCCATGACGAAGGGATTCCGCTGGATTGTCGG CATGCAGAGCTCGAACGGCGGTTGGGGCGCCTACGACGTCGACA ACACGAGCGATCTCCCGAACCACATCCCGTTCTGCGACTTCGGC GAAGTGACCGATCCGCCGTCAGAGGACGTCACCGCCCACGTGCT CGAGTGTTTCGGCAGCTTCGGGTACGATGACGCCTGGAAGGTCA TCCGGCGCGCGGTGGAATATCTCAAGCGGGAGCAGAAGCCGGAC GGCAGCTGGTTCGGTCGTTGGGGCGTCAATTACCTCTACGGCAC GGGCGCGGTGGTGTCGGCGCTGAAGGCGGTCGGGATCGACACG CGCGAGCCGTACATTCAAAAGGCGCTCGACTGGGTCGAGCAGCA TCAGAACCCGGACGGCGGCTGGGGCGAGGACTGCCGCTCGTAC GAGGATCCGGCGTACGCGGGTAAGGGCGCGAGCACCCCGTCGC AGACGGCCTGGGCGCTGATGGCGCTCATCGCGGGCGGCAGGGC GGAGTCCGAGGCCGCGCGCCGCGGCGTGCAATACCTCGTGGAG ACGCAGCGCCCGGACGGCGGCTGGGATGAGCCGTACTACACCG GCACGGGCTACCCAGGGGATTTCTACCTCGGCTACACCATGTACC GCCACGTGTTTCCGACGCTCGCGCTCGGCCGCTACAAGCAAGCC ATCGAGCGCAGGTGA
[00657] Variante SHC30 (SEQ ID N°. 33) MAEQLVEAPAYARTLDRAVEYLLSCQKDEGYWWGPLLSNVTMEAEY VLLCHILDRVDRDRMEKIRRYLLHEQREDGTWALYPGGPPDLDTTIEA YVALKYIGMSRDEEPMQKALRFIQSQGGIESSRVLTRMWLALVGEYP WEKVPMVPPEIMFLGKRMPLNIYEFGSWARATVVALSIVMSRQPVFP LPERARVPELYETDVPPRRRGAKGGGGWIFDALDRALHGYQKLSVH PFRRAAEIRALDWLLERQAGDGSWGGIQPPWFYALIALKILDMTQHP AFIKGWEGLELYGVELDYGGWMFQASISPVWDTGLAVLALRAAGLP ADHDRLVKAGEWLLDRQITVPGDWAVKRPNLKPGGFAFQFDNVYYP DVDDTAVVVWALNTLRLPDERRRRDAMTKGFRWIVGMQSSNGGWG AYDVDNTSDLPNHIPFCDFGEVTDPPSEDVTAHVLECFGSFGYDDA WKVIRRAVEYLKREQKPDGSWFGRWGVNYLYGTGAVVSALKAVGID TREPYIQKALDWVEQHQNPDGGWGEDCRSYEDPAYAGKGASTPSQ TAWALMALIAGGRAESEAARRGVQYLVETQRPDGGWDEPYYTGTG YPGDFYLGYTMYRHVFPTLALGRYKQAIERR
[00658] Variante SHC31 (SEQ ID N°. 36) ATGGCTGAGCAGTTGGTGGAAGCGCCGGCCTACGCGCGGACGCT GGATCGCGCGGTGGAGTATCTCCTCTCCTGCCAAAAGGACGAAG GCTACTGGTGGGGGCCGCTTCTGAGCAACGTCACGATGGAAGCG GAGTACGTCCTCTTGTGCCACATTCTCGATCGCGTCGATCGGGAT CGCATGGAGAAGATCCGGCGGTACCTGTTGCACGAGCAGCGCGA GGACGGCACGTGGGCCCTGTACCCGGGTGGGCCGCCGGACCTC GACACGACCATCGAGGCGTACGTCGCGCTCAAGTATATCGGCAT GTCGCGCGACGAGGAGCCGATGCAGAAGGCGCTCCGGTTCATTC AGAGCCAGGGCGGGATCGAGTCGTCGCGCGTGCTCACGCGGAG GTGGCTGGCGCTGGTGGGAGAATATCCGTGGGAGAAGGTGCCCA TGGTCCCGCCGGAGATCATGTTCCTCGGCAAGCGCATGCCGCTC AACATCTACGAGTTTGGCTCGTGGGCTCGGGCGACCGTCGTGGC GCTCTCGATTGTGATGAGCCGCCAGCCGGTGTTCCCGCTGCCCG AGCGGGCGCGCGTGCCCGAGCTGTACGAGACCGACGTGCCTCC GCGCCGGCGCGGTGCCAAGGGAGGGGGTGGGTGGATCTTCGAC GCGCTCGACCGGGCGCTGCACGGGTATCAGAAGCTGTCGGTGCA CCCGTTCCGCCGCGCGGCCGAGATCCGCGCCTTGGACTGGTTGC TCGAGCGCCAGGCCGGAGACGGCAGCTGGGGCGGGATTCAGCC GCCTTGGTTTTACGCGCTCATCGCGCTCAAGATTCTCGACATGAC GCAGCATCCGGCGTTCATCAAGGGCTGGGAAGGTCTAGAGCTGT ACGGCGTGGAGCTGGATTACGGAGGATGGATGTTTCAGGCTTCC ATCTCGCCGGTGTGGGACACGGGCCTCGCCGTGCTCGCGCTGC GCGCTGCGGGGCTTCCGGCCGATCACGACCGCTTGGTCAAGGC GGGCGAGTGGCTGTTGGACCGGCAGATCACGGTTCCGGGCGACT GGGCGGTGAAGCGCCCGAACCTCAAGCCGGGCGGGTTCGCGTT CCAGTTCGACAACGTGTACTACCCGGACGTGGACGACACGGCCG TCGTGGTGTGGGCGCTCAACACCCTGCGCTTGCCGGACGAGCGC CGCAGGCGGGACGCCATGACGAAGGGATTCCGCTGGATTGTCGG CATGCAGAGCTCGAACGGCGGTTGGGGCGCCTACGACGTCGACA ACACGAGCGATCTCCCGAACCACACCCCGTTCTGCGACTTCGGC GAAGTGACCGATCCGCCGTCAGAGGACGTCACCGCCCACGTGCT CGAGTGTTTCGGCAGCTTCGGGTACGATGACGCCTGGAAGGTCA TCCGGCGCGCGGTGGAATATCTCAAGCGGGAGCAGAAGCCGGAC GGCAGCTGGTTCGGTCGTTGGGGCGTCAATTACCTCTACGGCAC GGGCGCGGTGGTGTCGGCGCTGAAGGCGGTCGGGATCGACACG CGCGAGCCGTACATTCAAAAGGCGCTCGACTGGGTCGAGCAGCA TCAGAACCCGGACGGCGGCTGGGGCGAGGACTGCCGCTCGTAC GAGGATCCGGCGTACGCGGGTAAGGGCGCGAGCACCCCGTCGC AGACGGCCTGGGCGCTGATGGCGCTCATCGCGGGCGGCAGGGC GGAGTCCGAGGCCGCGCGCCGCGGCGTGCAATACCTCGTGGAG ACGCAGCGCCCGGACGGCGGCTGGGATGAGCCGTACTACACCG GCACGGGCTTCCCAGGGGATTTCTACCTCGGCTACACCATGTACC GCCACGTGTTTCCGACGCTCGCGCTCGGCCGCTACAAGCAAGCC ATCGAGCGCAGGTGA
[00659] Variante SHC31 (SEQ ID N°. 35) MAEQLVEAPAYARTLDRAVEYLLSCQKDEGYWWGPLLSNVTMEAEY VLLCHILDRVDRDRMEKIRRYLLHEQREDGTWALYPGGPPDLDTTIEA YVALKYIGMSRDEEPMQKALRFIQSQGGIESSRVLTRRWLALVGEYP WEKVPMVPPEIMFLGKRMPLNIYEFGSWARATVVALSIVMSRQPVFP LPERARVPELYETDVPPRRRGAKGGGGWIFDALDRALHGYQKLSVH PFRRAAEIRALDWLLERQAGDGSWGGIQPPWFYALIALKILDMTQHP AFIKGWEGLELYGVELDYGGWMFQASISPVWDTGLAVLALRAAGLP ADHDRLVKAGEWLLDRQITVPGDWAVKRPNLKPGGFAFQFDNVYYP DVDDTAVVVWALNTLRLPDERRRRDAMTKGFRWIVGMQSSNGGWG AYDVDNTSDLPNHTPFCDFGEVTDPPSEDVTAHVLECFGSFGYDDA WKVIRRAVEYLKREQKPDGSWFGRWGVNYLYGTGAVVSALKAVGID TREPYIQKALDWVEQHQNPDGGWGEDCRSYEDPAYAGKGASTPSQ TAWALMALIAGGRAESEAARRGVQYLVETQRPDGGWDEPYYTGTG FPGDFYLGYTMYRHVFPTLALGRYKQAIERR
[00660] Variante SHC32 (SEQ ID N°. 38) ATGGCTGAGCAGTTGGTGGAAGCGCCGGCCTACGCGCGGACGCT GGATCGCGCGGTGGAGTATCTCCTCTCCTGCCAAAAGGACGAAG GCTACTGGTGGGGGCCGCTTCTGAGCAACGTCACGATGGAAGCG GAGTACGTCCTCTTGTGCCACATTCTCGATCGCGTCGATCGGGAT CGCATGGAGAAGATCCGGCGGTACCTGTTGCACGAGCAGCGCGA GGACGGCACGTGGGCCCTGTACCCGGGTGGGCCGCCGGACCTC GACACGACCATCGAGGCGTACGTCGCGCTCAAGTATATCGGCAT GTCGCGCGACGAGGAGCCGATGCAGAAGGCGCTCCGGTTCATTC AGAGCCAGGGCGGGATCGAGTCGTCGCGCGTGTTCACGCGGAG GTGGCTGGCGCTGGTGGGAGAATATCCGTGGGAGAAGGTGCCCA TGGTCCCGCCGGAGATCATGTTCCTCGGCAAGCGCATGCCGCTC AACATCTACGAGTTTGGCTCGTGGGCTCGGGCGACCGTCGTGGC GCTCTCGATTGTGATGAGCCGCCAGCCGGTGTTCCCGCTGCCCG AGCGGGCGCGCGTGCCCGAGCTGTACGAGACCGACGTGCCTCC GCGCCGGCGCGGTGCCAAGGGAGGGGGTGGGTGGATCTTCGAC GCGCTCGACCGGGCGCTGCACGGGTATCAGAAGCTGTCGGTGCA CCCGTTCCGCCGCGCGGCCGAGATCCGCGCCTTGGACTGGTTGC TCGAGCGCCAGGCCGGAGACGGCAGCTGGGGCGGGATTCAGCC GCCTTGGTTTTACGCGCTCATCGCGCTCAAGATTCTCGACATGAC GCAGCATCCGGCGTTCATCAAGGGCTGGGAAGGTCTAGAGCTGT ACGGCGTGGAGCTGGATTACGGAGGATGGATGTTTCAGGCTTCC ATCTCGCCGGTGTGGGACACGGGCCTCGCCGTGCTCGCGCTGC GCGCTGCGGGGCTTCCGGCCGATCACGACCGCTTGGTCAAGGC GGGCGAGTGGCTGTTGGACCGGCAGATCACGGTTCCGGGCGACT GGGCGGTGAAGCGCCCGAACCTCAAGCCGGGCGGGTTCGCGTT CCAGTTCGACAACGTGTACTACCCGGACGTGGACGACACGGCCG TCGTGGTGTGGGCGCTCAACACCCTGCGCTTGCCGGACGAGCGC CGCAGGCGGGACGCCATGACGAAGGGATTCCGCTGGATTGTCGG CATGCAGAGCTCGAACGGCGGTTGGGGCGCCTACGACGTCGACA ACACGAGCGATCTCCCGAACCACACCCCGTTCTGCGACTTCGGC GAAGTGACCGATCCGCCGTCAGAGGACGTCACCGCCCACGTGCT CGAGTGTTTCGGCAGCTTCGGGTACGATGACGCCTGGAAGGTCA TCCGGCGCGCGGTGGAATATCTCAAGCGGGAGCAGAAGCCGGAC GGCAGCTGGTTCGGTCGTTGGGGCGTCAATTACCTCTACGGCAC GGGCGCGGTGGTGTCGGCGCTGAAGGCGGTCGGGATCGACACG CGCGAGCCGTACATTCAAAAGGCGCTCGACTGGGTCGAGCAGCA TCAGAACCCGGACGGCGGCTGGGGCGAGGACTGCCGCTCGTAC GAGGATCCGGCGTACGCGGGTAAGGGCGCGAGCACCCCGTCGC AGACGGCCTGGGCGCTGATGGCGCTCATCGCGGGCGGCAGGGC GGAGTCCGAGGCCGCGCGCCGCGGCGTGCAATACCTCGTGGAG ACGCAGCGCCCGGACGGCGGCTGGGATGAGCCGTACTACACCG GCACGGGCTACCCAGGGGATTTCTACCTCGGCTACACCATGTACC GCCACGTGTTTCCGACGCTCGCGCTCGGCCGCTACAAGCAAGCC ATCGAGCGCAGGTGA
[00661] Variante SHC32 (SEQ ID N°. 37) MAEQLVEAPAYARTLDRAVEYLLSCQKDEGYWWGPLLSNVTMEAEY VLLCHILDRVDRDRMEKIRRYLLHEQREDGTWALYPGGPPDLDTTIEA YVALKYIGMSRDEEPMQKALRFIQSQGGIESSRVFTRRWLALVGEYP WEKVPMVPPEIMFLGKRMPLNIYEFGSWARATVVALSIVMSRQPVFP LPERARVPELYETDVPPRRRGAKGGGGWIFDALDRALHGYQKLSVH PFRRAAEIRALDWLLERQAGDGSWGGIQPPWFYALIALKILDMTQHP AFIKGWEGLELYGVELDYGGWMFQASISPVWDTGLAVLALRAAGLP ADHDRLVKAGEWLLDRQITVPGDWAVKRPNLKPGGFAFQFDNVYYP DVDDTAVVVWALNTLRLPDERRRRDAMTKGFRWIVGMQSSNGGWG AYDVDNTSDLPNHTPFCDFGEVTDPPSEDVTAHVLECFGSFGYDDA WKVIRRAVEYLKREQKPDGSWFGRWGVNYLYGTGAVVSALKAVGID TREPYIQKALDWVEQHQNPDGGWGEDCRSYEDPAYAGKGASTPSQ TAWALMALIAGGRAESEAARRGVQYLVETQRPDGGWDEPYYTGTG YPGDFYLGYTMYRHVFPTLALGRYKQAIERR
[00662] Variante SHC33 (SEQ ID N°. 40) ATGGCTGAGCAGTTGGTGGAAGCGCCGGCCTACGCGCGGACGCT GGATCGCGCGGTGGAGTATCTCCTCTCCTGCCAAAAGGACGAAG GCTACTGGTGGGGGCCGCTTCTGAGCAACGTCACGATGGAAGCG GAGTACGTCCTCTTGTGCCACATTCTCGATCGCGTCGATCGGGAT CGCATGGAGAAGATCCGGCGGTACCTGTTGCACGAGCAGCGCGA GGACGGCACGTGGGCCCTGTACCCGGGTGGGCCGCCGGACCTC GACACGACCATCGAGGCGTACGTCGCGCTCAAGTATATCGGCAT GTCGCGCGACGAGGAGCCGATGCAGAAGGCGCTCCGGTTCATTC AGAGCCAGGGCGGGATCGAGTCGTCGCGCGTGCTCACGCGGAG GTGGCTGGCGCTGGTGGGAGAATATCCGTGGGAGAAGGTGCCCA TGGTCCCGCCGGAGATCATGTTCCTCGGCAAGCGCATGCCGCTC AACATCTACGAGTTTGGCTCGTGGGCTCGGGCGACCGTCGTGGC GCTCTCGATTGTGATGAGCCGCCAGCCGGTGTTCCCGCTGCCCG AGCGGGCGCGCGTGCCCGAGCTGTACGAGACCGACGTGCCTCC GCGCCGGCGCGGTGCCAAGGGAGGGGGTGGGTGGATCTTCGAC GCGCTCGACCGGGCGCTGCACGGGTATCAGAAGCTGTCGGTGCA CCCGTTCCGCCGCGCGGCCGAGATCCGCGCCTTGGACTGGTTGC TCGAGCGCCAGGCCGGAGACGGCAGCTGGGGCGGGATTCAGCC GCCTTGGTTTTACGCGCTCATCGCGCTCAAGATTCTCGACATGAC GCAGCATCCGGCGTTCATCAAGGGCTGGGAAGGTCTAGAGCTGT ACGGCGTGGAGCTGGATTACGGAGGATGGATGTTTCAGGCTTCC ATCTCGCCGGTGTGGGACACGGGCCTCGCCGTGCTCGCGCTGC GCGCTGCGGGGCTTCCGGCCGATCACGACCGCTTGGTCAAGGC GGGCGAGTGGCTGTTGGACCGGCAGATCACGGTTCCGGGCGACT GGGCGGTGAAGCGCCCGAACCTCAAGCCGGGCGGGTTCGCGTT CCAGTTCGACAACGTGTACTACCCGGACGTGGACGACACGGCCG TCGTGGTGTGGGCGCTCAACACCCTGCGCTTGCCGGACGAGCGC CGCAGGCGGGACGCCATGACGAAGGGATTCCGCTGGATTGTCGG CATGCAGAGCTCGAACGGCGGTTGGGGCGCCTACGACGTCGACA ACACGAGCGATCTCCCGAACCACACCCCGTTCTGCGACTTCGGC GAAGTGACCGATCCGCCGTCAGAGGACGTCACCGCCCACGTGCT CGAGTGTTTCGGCAGCTTCGGGTACGATGACGCCTGGAAGGTCA TCCGGCGCGCGGTGGAATATCTCAAGCGGGAGCAGAAGCCGGAC GGCAGCTGGTTCGGTCGTTGGGGCGTCAATTACCTCTACGGCAC GGGCGCGGTGGTGTCGGCGCTGAAGGCGGTCGGGATCGACACG CGCGAGCCGTACATTCAAAAGGCGCTCGACTGGGTCGAGCAGCA TCAGAACCCGGACGGCGGCTGGGGCGAGGACTGCCGCTCGTAC GAGGATCCGGCGTACGCGGGTAAGGGCGCGAGCACCCCGTCGC AGACGGCCTGGGCGCTGATGGCGCTCATCGCGGGCGGCAGGGC GGAGTCCGAGGCCGCGCGCCGCGGCGTGCAATACCTCGTGGAG ACGCAGCGCCCGGACGGCGGCTGGGATGAGCCGTACTACACCG GCACGGGCTACCCAGGGGATTTCTACCTCGGCTACACCATGTACC GCCACGTGTTTCCGACGCTCGCGCTCGGCCGCTACAAGCAAGCC ATCGAGCGCAGGTGA
[00663] Variante SHC33 (SEQ ID N°. 39) MAEQLVEAPAYARTLDRAVEYLLSCQKDEGYWWGPLLSNVTMEAEY VLLCHILDRVDRDRMEKIRRYLLHEQREDGTWALYPGGPPDLDTTIEA YVALKYIGMSRDEEPMQKALRFIQSQGGIESSRVLTRRWLALVGEYP WEKVPMVPPEIMFLGKRMPLNIYEFGSWARATVVALSIVMSRQPVFP LPERARVPELYETDVPPRRRGAKGGGGWIFDALDRALHGYQKLSVH PFRRAAEIRALDWLLERQAGDGSWGGIQPPWFYALIALKILDMTQHP AFIKGWEGLELYGVELDYGGWMFQASISPVWDTGLAVLALRAAGLP ADHDRLVKAGEWLLDRQITVPGDWAVKRPNLKPGGFAFQFDNVYYP DVDDTAVVVWALNTLRLPDERRRRDAMTKGFRWIVGMQSSNGGWG AYDVDNTSDLPNHTPFCDFGEVTDPPSEDVTAHVLECFGSFGYDDA WKVIRRAVEYLKREQKPDGSWFGRWGVNYLYGTGAVVSALKAVGID TREPYIQKALDWVEQHQNPDGGWGEDCRSYEDPAYAGKGASTPSQ TAWALMALIAGGRAESEAARRGVQYLVETQRPDGGWDEPYYTGTG YPGDFYLGYTMYRHVFPTLALGRYKQAIERR
[00664] Variante F605W( SEQ ID N°. 170) ATGGCTGAGCAGTTGGTGGAAGCGCCGGCCTACGCGCGGACGCT GGATCGCGCGGTGGAGTATCTCCTCTCCTGCCAAAAGGACGAAG GCTACTGGTGGGGGCCGCTTCTGAGCAACGTCACGATGGAAGCG GAGTACGTCCTCTTGTGCCACATTCTCGATCGCGTCGATCGGGAT CGCATGGAGAAGATCCGGCGGTACCTGTTGCACGAGCAGCGCGA GGACGGCACGTGGGCCCTGTACCCGGGTGGGCCGCCGGACCTC GACACGACCATCGAGGCGTACGTCGCGCTCAAGTATATCGGCAT GTCGCGCGACGAGGAGCCGATGCAGAAGGCGCTCCGGTTCATTC AGAGCCAGGGCGGGATCGAGTCGTCGCGCGTGTTCACGCGGAT GTGGCTGGCGCTGGTGGGAGAATATCCGTGGGAGAAGGTGCCCA TGGTCCCGCCGGAGATCATGTTCCTCGGCAAGCGCATGCCGCTC AACATCTACGAGTTTGGCTCGTGGGCTCGGGCGACCGTCGTGGC GCTCTCGATTGTGATGAGCCGCCAGCCGGTGTTCCCGCTGCCCG AGCGGGCGCGCGTGCCCGAGCTGTACGAGACCGACGTGCCTCC GCGCCGGCGCGGTGCCAAGGGAGGGGGTGGGTGGATCTTCGAC GCGCTCGACCGGGCGCTGCACGGGTATCAGAAGCTGTCGGTGCA CCCGTTCCGCCGCGCGGCCGAGATCCGCGCCTTGGACTGGTTGC TCGAGCGCCAGGCCGGAGACGGCAGCTGGGGCGGGATTCAGCC GCCTTGGTTTTACGCGCTCATCGCGCTCAAGATTCTCGACATGAC GCAGCATCCGGCGTTCATCAAGGGCTGGGAAGGTCTAGAGCTGT ACGGCGTGGAGCTGGATTACGGAGGATGGATGTTTCAGGCTTCC ATCTCGCCGGTGTGGGACACGGGCCTCGCCGTGCTCGCGCTGC GCGCTGCGGGGCTTCCGGCCGATCACGACCGCTTGGTCAAGGC GGGCGAGTGGCTGTTGGACCGGCAGATCACGGTTCCGGGCGACT GGGCGGTGAAGCGCCCGAACCTCAAGCCGGGCGGGTTCGCGTT CCAGTTCGACAACGTGTACTACCCGGACGTGGACGACACGGCCG TCGTGGTGTGGGCGCTCAACACCCTGCGCTTGCCGGACGAGCGC CGCAGGCGGGACGCCATGACGAAGGGATTCCGCTGGATTGTCGG CATGCAGAGCTCGAACGGCGGTTGGGGCGCCTACGACGTCGACA ACACGAGCGATCTCCCGAACCACATCCCGTTCTGCGACTTCGGC GAAGTGACCGATCCGCCGTCAGAGGACGTCACCGCCCACGTGCT CGAGTGTTTCGGCAGCTTCGGGTACGATGACGCCTGGAAGGTCA TCCGGCGCGCGGTGGAATATCTCAAGCGGGAGCAGAAGCCGGAC GGCAGCTGGTTCGGTCGTTGGGGCGTCAATTACCTCTACGGCAC GGGCGCGGTGGTGTCGGCGCTGAAGGCGGTCGGGATCGACACG CGCGAGCCGTACATTCAAAAGGCGCTCGACTGGGTCGAGCAGCA TCAGAACCCGGACGGCGGCTGGGGCGAGGACTGCCGCTCGTAC GAGGATCCGGCGTACGCGGGTAAGGGCGCGAGCACCCCGTCGC AGACGGCCTGGGCGCTGATGGCGCTCATCGCGGGCGGCAGGGC GGAGTCCGAGGCCGCGCGCCGCGGCGTGCAATACCTCGTGGAG ACGCAGCGCCCGGACGGCGGCTGGGATGAGCCGTACTACACCG GCACGGGCTTCCCAGGGGATTGGTACCTCGGCTACACCATGTAC CGCCACGTGTTTCCGACGCTCGCGCTCGGCCGCTACAAGCAAGC CATCGAGCGCAGGTGA
[00665] Variante F605W (SEQ ID N°. 171) MAEQLVEAPAYARTLDRAVEYLLSCQKDEGYWWGPLLSNVTMEAEY VLLCHILDRVDRDRMEKIRRYLLHEQREDGTWALYPGGPPDLDTTIEA YVALKYIGMSRDEEPMQKALRFIQSQGGIESSRVFTRMWLALVGEYP WEKVPMVPPEIMFLGKRMPLNIYEFGSWARATVVALSIVMSRQPVFP LPERARVPELYETDVPPRRRGAKGGGGWIFDALDRALHGYQKLSVH PFRRAAEIRALDWLLERQAGDGSWGGIQPPWFYALIALKILDMTQHP AFIKGWEGLELYGVELDYGGWMFQASISPVWDTGLAVLALRAAGLP ADHDRLVKAGEWLLDRQITVPGDWAVKRPNLKPGGFAFQFDNVYYP DVDDTAVVVWALNTLRLPDERRRRDAMTKGFRWIVGMQSSNGGWG AYDVDNTSDLPNHIPFCDFGEVTDPPSEDVTAHVLECFGSFGYDDA WKVIRRAVEYLKREQKPDGSWFGRWGVNYLYGTGAVVSALKAVGID TREPYIQKALDWVEQHQNPDGGWGEDCRSYEDPAYAGKGASTPSQ TAWALMALIAGGRAESEAARRGVQYLVETQRPDGGWDEPYYTGTG FPGDWYLGYTMYRHVFPTLALGRYKQAIERR
[00666] SEQ ID N°. 166 (ZmoSHCI) ATGGGTATTGACAGAATGAATAGCTTAAGTCGCTTGTTAATGAAGA AGATTTTCGGGGCTGAAAAAACCTCGTATAAACCGGCTTCCGATA CCATAATCGGAACGGATACCCTGAAAAGACCGAACCGGCGGCCT GAACCGACGGCAAAAGTCGACAAAACGATATTCAAGACTATGGGG AATAGTCTGAATAATACCCTTGTTTCAGCCTGTGACTGGTTGATCG GACAACAAAAGCCCGATGGTCATTGGGTCGGTGCCGTGGAATCC AATGCTTCGATGGAAGCAGAATGGTGTCTGGCCTTGTGGTTTTTG GGTCTGGAAGATCATCCGCTTCGTCCAAGATTGGGCAATGCTCTT TTGGAAATGCAGCGGGAAGATGGCTCTTGGGGAGTCTATTTCGGC GCTGGAAATGGCGATATCAATGCCACGGTTGAAGCCTATGCGGC CTTGCGGTCTTTGGGGTATTCTGCCGATAATCCTGTTTTGAAAAAA GCGGCAGCATGGATTGCTGAAAAAGGCGGATTAAAAAATATCCGT GTCTTTACCCGTTATTGGCTGGCGTTGATCGGGGAATGGCCTTGG GAAAAGACCCCTAACCTTCCCCCTGAAATTATCTGGTTCCCTGATA ATTTTGTCTTTTCGATTTATAATTTTGCCCAATGGGCGCGGGCAAC CATGGTGCCGATTGCTATTCTGTCCGCGAGACGACCAAGCCGCC CGCTGCGCCCTCAAGACCGATTGGATGAACTGTTTCCAGAAGGCC GCGCTCGCTTTGATTATGAATTGCCGAAAAAAGAAGGCATCGATC TTTGGTCGCAATTTTTCCGAACCACTGACCGTGGATTACATTGGGT TCAGTCCAATCTGTTAAAGCGCAATAGCTTGCGTGAAGCCGCTAT CCGTCATGTTTTGGAATGGATTATCCGGCATCAGGATGCCGATGG CGGTTGGGGTGGAATTCAGCCACCTTGGGTCTATGGTTTGATGGC GTTACATGGTGAAGGCTATCAGCTTTATCATCCGGTGATGGCCAA GGCTTTGTCGGCTTTGGATGATCCCGGTTGGCGACATGACAGAG GCGAGTCTTCTTGGATACAGGCCACCAATAGTCCGGTATGGGATA CAATGTTGGCCTTGATGGCGTTAAAAGACGCCAAGGCCGAGGATC GTTTTACGCCGGAAATGGATAAGGCCGCCGATTGGCTTTTGGCTC GACAGGTCAAAGTCAAAGGCGATTGGTCAATCAAACTGCCCGATG TTGAACCCGGTGGATGGGCATTTGAATATGCCAATGATCGCTATC CCGATACCGATGATACCGCCGTCGCTTTGATCGCCCTTTCCTCTT ATCGTGATAAGGAGGAGTGGCAAAAGAAAGGCGTTGAGGACGCC ATTACCCGTGGGGTTAATTGGTTGATCGCCATGCAAAGCGAATGT GGCGGTTGGGGAGCCTTTGATAAGGATAATAACAGAAGTATCCTT TCCAAAATTCCTTTTTGTGATTTCGGAGAATCTATTGATCCGCCTT CAGTCGATGTAACGGCGCATGTTTTAGAGGCCTTTGGCACCTTGG GACTGTCCCGCGATATGCCGGTCATCCAAAAAGCGATCGACTATG TCCGTTCCGAACAGGAAGCCGAAGGCGCGTGGTTTGGTCGTTGG GGCGTTAATTATATCTATGGCACCGGTGCGGTTCTGCCTGCTTTG GCGGCGATCGGTGAAGATATGACCCAGCCTTACATCACCAAGGCT TGCGATTGGCTGGTCGCACATCAGCAGGAAGACGGCGGTTGGGG CGAAAGCTGCTCTTCCTATATGGAGATTGATTCCATTGGGAAGGG CCCAACCACGCCGTCCCAGACTGCTTGGGCTTTGATGGGGTTGAT CGCGGCCAATCGTCCCGAAGATTATGAAGCCATTGCCAAGGGAT GCCATTATCTGATTGATCGCCAAGAGCAGGATGGTAGCTGGAAAG AAGAAGAATTCACCGGCACCGGATTCCCCGGTTATGGCGTGGGT CAGACGATCAAGTTGGATGATCCGGCTTTATCGAAACGATTGCTT CAAGGCGCTGAACTGTCACGGGCGTTTATGCTGCGTTATGATTTT TATCGGCAATTCTTCCCGATTATGGCGTTAAGTCGGGCAGAGAGA CTGATTGATTTGAATAATTGA Tabela 18: Cálculos do percentual de identidade de sequência usando o programa de algoritmos Blast e GAP para a enzima AacSHC TS em relação às enzimas SHC TS divulgadas em WO2010/ 0139719 (BASF). Tabela 19: Cálculos do percentual de identidade de sequência usando o programa de algoritmos Blast e Huang e Miller para a en zima AacSHC TS em relação às enzimas ZmoSHC1 TS e ZmoSHC2 TS divulgadas em Seitz (2012).
[00667] A tese de Miriam Seitz está disponível em http://elib.uni- stuttgart.de/handle/11682/1400 Tabela 20: Nomenclatura para Homofarnesol Tabela 21: Nomenclatura para produtos de reação Escher S, Giersch W., Niclass Y, Bernardinello G and Ohloff G (1990). Relações de configuração-odor em 5ß-Ambrox. Helv. Chim. Acta 73, 1935-1947.
Breve Descrição dos Desenhos:
[00668] Para uma melhor compreensão da presente divulgação, é feita referência aos desenhos anexos em que:
[00669] As Figuras de 1 a 4 mostram o alinhamento de sequência de derivados de AacSHC selecionados em relação ao AacSHC da SEQ ID N°. 1. Em ordem decrescente de aparecimento, as SEQ ID NOs. da Fi gura 1 são: SEQ ID N°. 1, SEQ ID N°. 29, SEQ ID N°. 27, SEQ ID N°. 21, SEQ ID N°. 19, SEQ ID N°. 9, SEQ ID N°. 23, SEQ ID N°. 33, SEQ ID N°. 35, SEQ ID N°. 37 e SEQ ID N°. 39;
[00670] A Figura 5 mostra um mapa do plasmídeo;
[00671] A Figura 6 mostra as atividades relativas da HAC do AacSHC do tipo selvagem e derivados de AacSHC como definidos na Tabela 24 sob condições normais (pH6,0, 55°C, 0,050% SDS, células para OD650nm de 10);
[00672] A Figura 7a mostra os perfis da atividade de HAC dos deri vados de AacSHC em relação à AacSHC TS usando qualidade de ho mofarnesol EEH:EZH 87:13 e uma pureza de homofarnesol de 96% (conforme determinado por RMN);
[00673] A Figura 7b mostra a melhoria relativa dos derivados de AacSHC em relação à SHC TS (4h(velocidade inicial) e edimento a 22h) usando qualidade de homofarnesol EEH:EZH 87:13 e uma pureza de homofarnesol de 96% (conforme determinado por RMN);
[00674] A Figura 8a mostra os perfis da atividade de HAC dos deri vados de AacSHC em relação à AacSHC TS usando qualidade de ho mofarnesol EEH:EZH 92:08 e uma pureza de homofarnesol de 100% (conforme determinado por RMN);
[00675] A Figura 8b mostra a melhoria relativa dos derivados de AacSHC em relação à SHC TS (4h(velocidade inicial) e edimento a 22h) usando qualidade de homofarnesol EEH:EZH 92:08 e uma pureza de homofarnesol de 100% (conforme determinado por RMN);
[00676] A Figura 9a mostra os perfis da atividade de HAC dos deri vados de AacSHC como estabelecido na Tabela 24 em relação à AacSHC TS usando qualidade de homofarnesol EEH:EZH 66:33 e uma pureza de homofarnesol de 76% (conforme determinado por RMN);
[00677] A Figura 9b mostra a melhoria relativa dos derivados de AacSHC em relação à SHC TS (4h(velocidade inicial) e redimento a 22h) usando qualidade de homofarnesol EEH:EZH 66:33 e uma pureza de homofarnesol de 76% (conforme determinado por RMN);
[00678] A Figura 10 mostra os resultados da atividade de HAC para os três derivados de SHC mostrando aproximadamente melhora de dez vezes (215G2), 7 vezes (SHC26) e 6 vezes (SHC32) sobre a enzima AacSHC/HACndo tipo selvagem;
[00679] A Figura 11 mostra a conversão observada de E,E-homofar- nesol para Ambrox por um derivado de SHC/HAC (215G2 SHC) e AacSHC TS. Em 7 horas de reação (estimativa da velocidade de reação inicial) a conversão com a variante 215G2 SHC foi 13 vezes maior do que a obtida com SHC do tipo selvagem. Em 48 horas de reação a con versão com a variante foi de cerca de 8 vezes a da enzima do tipo sel vagem;
[00680] A Figura 12 mostra os produtos da reação produzidos (Am- brox e o produto (IV)) quando EEH é utilizado como material de partida (para bioconversão com SHC TS e/ou um derivado de SHC/HAC); e os produtos de reação produzidos ((-)-Ambrox (I) e produtos (II), (IV) e (III) (ver Tabela 21) quando EE:EZ é usado como um material de partida); para facilidade de referência, os compostos de I a IV podem ser identi ficados como segue:
[00681] A Figura 13 mostra uma análise GC dos produtos da reação de Ambrox e produtos (II), (IV) e (III) na Tabela 25;
[00682] A Figura 14 mostra uma análise GC dos produtos da reação de Ambrox e produtos (II), (IV) e (III) na Tabela 25;
[00683] A Figura 15 fornece dados comparativos para a atividade da variante 215G2SHC em todo o ensaio de bioconversão da célula na presença de Triton X-100 ou SDS;
[00684] A Figura 16 mostra a porcentagem de EEH convertido para diferentes razões de SDS/células;
[00685] A Figura 17 mostra % da conversão de EEH na reação de bioconversão padrão (como definido no Exemplo 7) para três diferentes concentrações de SDS;
[00686] A Figura 18 mostra % da conversão de EEH na reação de bioconversão padrão (como definido no Exemplo 7) para três diferentes valores de pH;
[00687] A Figura 19 mostra a localização das mutações identificadas nas variantes de SHC/HAC 101A10, 111C8 e 215G2 na estrutura cris talina de SHC (em cores): vermelho para a variante 215G2; roxo (vinho tinto) para a variante 101A10 e verde para a variante 111C8. Para os aminoácidos identificados como sendo responsáveis pelo aumento da atividade, as cadeias laterais são destacadas em amarelo no análogo do substrato cocristalizado. Outras mutações para identificar variantes sem nenhuma melhoria da atividade são marcadas em azul. É notado que as mutações azuis estão espalhadas cerca de metade-metade (ou seja, 50:50) sobre os 2 domínios da enzima, considerando que as mu tações benéficas de AacSHC que foram identificadas são localizadas principalmente (com excepção de um) no domínio 2. A única exceção é a mutação F2601Y que está nas proximidades do sítio ativo;
[00688] A Figura 20 mostra as seguintes mutações (em preto e branco): mutações não tendo efeito benéfico sobre a atividade de SHC/HAC são mostradas em preto, elas estão espalhadas ao longo dos 2 domínios da enzima SHC. Em cinza são mostradas as mutações iden tificadas nas variantes SHC (101A10, 111C8 e 215G2) mostrando ativi dade melhorada de SHC/HAC, elas estão localizadas com apenas uma excepção no domínio 2 da enzima SHC. A cadeia lateral das mutações que contribuem para a atividade melhorada das variantes são destaca das;
[00689] A Figura 21 mostra a região de clonagem e expressão do plasmídeo pET-28A(+); As SEQ ID NOs. para as sequências na Figura 21 são como segue:
[00690] pET 28a (sequência de nucleotídeos): SEQ ID N°. 179;
[00691] pET 28a (sequência de aminoácidos): SEQ ID N°. 180;
[00692] pET 28b (sequência de nucleotídeos): SEQ ID N°. 181;
[00693] pET 28b (sequência de aminoácidos): SEQ ID N°. 182;
[00694] pET 28c (sequência de nucleotídeos): SEQ ID N°. 183; e
[00695] pET 28c (sequência de aminoácidos): SEQ ID N°. 184.
[00696] A Figura 22 mostra a produtividade volumétrica de uma rea ção de bioconversão de EEH concentrado 1,5x contendo 375g/l de cé lulas, 188g/l EEH, 2,33% SDS em comparação com a produtividade vo lumétricade uma bioconversão regular que foi executada em paralelo a 125g/l EEH, 250g/l células, 1,55% SDS (Exemplo 7);
[00697] A Figura 23 mostra uma bioconversão regular (125 g/l EEH, 250g/l células, 1,55% SDS) que foi executada conforme descrito no Exemplo 7, mas substituindo o tampão de ácido cítrico pH 5,4 por 0,5% ou 0,9%NaCl, todos os outros parâmetros de reação sendo inalterados. Uma bioconversão no tampão de ácido cítrico foi executada em paralelo como um controle;
[00698] A Figura 24 mostra a evolução da extração em fase sólida de (-)-Ambrox sobre as lavagens com tolueno como % da quantidade inicialmente presente de (-)-Ambrox em 200 ml de todo o caldo de rea ção (devido à relação de volume caldo/tolueno, % no primeiro extrato mais de 100%); e
[00699] A Figura 25 mostra a evolução da extração em fase sólida de (-)-Ambrox sobre as lavagens com etanol como uma porcentagem da quantidade inicialmente presente de (-)-Ambrox. Após 4 lavagens (total 640ml EtOH, ou seja, 3,2x o volume de caldo de reação inteiro inicial ou 8x o volume da fase sólida), cerca de 99% de (-)-Ambrox inici almente presente no caldo de reação foi recuperado.
EXEMPLOS
[00700] Para evitar dúvidas, todas as referências à SHC TS e varian tes de SHC são as referências à AacSHC TS (SEQ ID N°. 1) e variantes (por exemplo, conforme listado nas Tabelas 23 e/ou Tabela 24).
EXEMPLO 1 Produção do biocatalisador Método 1 Preparação de plasmídeo de SHC
[00701] O gene que codifica a esqualeno hopeno ciclase de Alicyclo- bacillus acidocaldarius (Aac-SHC) foi inserido no plasmídeo pET- 28A(+), onde ele está sob o controle de um promotor T7 induzível por IPTG para a produção de proteínas em Escherichia coli (ver as Figuras 5 e 21). O plasmídeo foi transformado em cepas de E. coli BL21(DE3) usando um protocolo padrão de transformação de choque térmico.
Culturas em frasco de Erlenmeyer
[00702] Para a produção de proteína foram utilizados o meio com plexo (LB) ou o mínimo. M9 é um exemplo de um meio mínimo que foi utilizado com sucesso.
Preparação dos meios
[00703] O meio mínimo escolhido como padrão foi preparado como se segue para 350 ml de cultura: a 35 ml estoque de ácido cítrico/fosfato (133g/l KH2PO4, 40g/l (NH4)2HPO4, 17g/l ácido cítrico.H2O com o pH ajustado para 6,3) foi adicionado 307 ml de H2O, o pH ajustado para 6,8 com NaOH a 32% conforme necessário. Depois da autoclavagem 0,850ml de MgSO4 a 50%, 0,035ml de solução vestígios (composição na próxima seção), 0,035ml solução de tiamina e 7ml de glicose a 20% foram adicionados.
Produção de biocatalisador de SHC (produção de biocatalisador)
[00704] A produção em pequena escala do biocatalisador (SHC do tipo selvagem ou variantes de SHC), 350ml de cultura (meio suplemen- tado com 50µg/ml de canamicina) foram inoculados em pré-cultura a partir de uma cepa de E. coli BL21(DE3) contendo a produção de plas- mídeo de SHC. As células foram cultivadas para uma densidade óptica de aproximadamente 0,5 (OD650nm) a 37 °C com agitação constante (250 rpm).
[00705] A produção de proteína foi então induzida pela adição de IPTG a uma concentração de 300µM seguido de incubação por mais 5 a 6 horas com agitação constante. A biomassa resultante foi finalmente recolhida por centrifugação, lavada com 50mM Tris-HCl pH 7,5. As cé lulas foram armazenadas como péletes a 4°C ou -20 °C até utilização posterior. Em geral, 2,5 a 4 gramas de células (peso úmido) foram obti dos a partir de 1 litro de cultura, independentemente do meio utilizado.
[00706] As fermentações foram preparadas e executadas em reato res InforsHT de 750ml. Ao vaso de fermentação foram adicionados 168 ml de água desionizada. O vaso de reação foi equipado com todas as sondas necessárias (pO2, pH, amostragem, antiespuma), alimentação C + N e garrafas de hidróxido de sódio e autoclavado. Depois da auto- clavagem é adicionado ao reator 20ml 10x tampão de fosfato/ ácido cítrico 14ml de glicose a 50% Solução de 0,53ml MgSO4 Solução de 2ml (NH4)2SO4 Solução de 0,020ml de vestígios Solução de 0,400ml de tiamina Solução estoque de 0,200ml de canamicina
[00707] Os parâmetros de execução foram definidos são como se gue: pH = 6,95, pO2 = 40%, T = 30°C, agitação a 300 rpm. Cascata: ponto de ajuste rpm a 300, min 300, max 1000, fluxo l/min ponto de ajuste 0,1, min 0, max 0,6. Controle antiespumante: 1:9.
[00708] O fermentador foi inoculado a partir de uma cultura de sementes para um OD650nm de 0,4-0,5. Esta cultura de sementes foi cul-tivada em meio LB (+ Canamicina) a 37°C, 220rpm por 8h. A fermenta ção foi executada primeiro no modo de batelada por 11,5h, onde depois foi iniciada alimentação C+ N com uma solução de alimentação (solução de glicose esterilizada (143 ml de H2O+ 35g de glicose) a qual foram adicionados após a esterilização: solução de 17,5 ml (NH4)2SO4, solu ção de 1,8 ml de MgSO4, solução de 0,018 ml de vestígios, solução de 0,360 ml de tiamina, solução estoque de 0,180 ml de canamicina. A ali mentação foi executada em uma taxa de fluxo constante de aprox. 4,2 ml/h. As medições de glicose e NH4+ foram feitas externamente para avaliar a disponibilidade de fontes de C e N na cultura. Geralmente os níveis de glicose permaneceram muito baixos.
[00709] As culturas foram cultivadas por um total de cerca de 25 ho ras, onde chegaram normalmente e OD650nm de 40-45. A produção de SHC foi então iniciada pela adição de IPTG a uma concentração de aproximadamente 1 mM no fermentador (como pulso de IPTG ou ao longo de um período de 3 a 4 horas usando uma seringa de infusão), definindo a temperatura para 40°C e pO2 para 20%. A indução da pro dução de SHC durou 16h a 40°C. No final da indução as células foram coletadas por centrifugação, lavadas com 0,1M tampão de ácido cítrico /citrato de sódio pH 5,4 e armazenadas como péletes a 4°C ou -20°C até utilização posterior.
Resultados 1a
[00710] Em geral, com todas as outras condições inalteradas a ativi-dadeespecífica do biocatalisador produzido foi maior quando um meio mínimo foi utilizado em comparação com um meio complexo. A indução foi realizada com sucesso a 30 ou 37°C. Foi observado que quando a indução foi feita a 40-43°C, um biocatalisador de maior atividade espe cífica foi obtido.
Resultados 1b
[00711] A Tabela 22 a seguir mostra para 2 exemplos o volume de cultura, a densidade óptica e a quantidade de células tanto no início da indução e final de indução bem como a quantidade de biomassa cole tada (peso seco). Tabela 22 OD650nm na inoculação: 0,45 (Exemplo 1) e 0,40 (Exemplo 2). Volumes iniciais: 205 ml.
EXEMPLO 2 Preparação de variantes de SHC e triagem de atividade Método 2
[00712] A título de esclarecimento, EE corresponde a (3E,7E); mis tura EZ corresponde a (3Z,7E); ZE corresponde a (7Z,3E); ZZ corres ponde a (7Z,3Z); e EEH corresponde a (3E,7E).
[00713] Um programa de evolução da enzima foi realizado usando o gene de Alicycloba-cillus acidocaldarius SHC do tipo selvagem (TS) (AacSHC) como um modelo (GenBank M73834, Swissprot P33247). Uma biblioteca de cerca de 10500 variantes de SHC foi produzida e tri ada para as variantes mostrando aumento de capacidade de ciclização de EEH. A triagem foi executada em reações em tampão de ácido cítrico pH 6,0 (0,150ml) contendo 4g/l EEH e 0,050% SDS, a 55°C e sob agi tação constante.
[00714] Com hits selecionados para a validação, um teste padrão foi executado em tampão de ácido cítrico pH 6,0 contendo 4g/l EEH 0,050% SDS, células que haviam manifestado as variantes de SHC para um OD600nm de 10,0 in. O volume final foi de 1 ml, as reações foram incubadas a 55°C e agitadas vigorosamente sobre um agitador magné tico. Amostragem de reação ao longo do tempo permitiu perfis de ativi dade de investigação (conversão de EEH para (-)-Ambrox) e conforme determinado pela análise por cromatografia em fase gasosa (consultar os métodos analíticos abaixo).
[00715] A partir desta ronda de validação, 3 variantes com atividade de ciclização de EEH melhorada (101A10, 111C8 e 215G2) foram obti das e em seguida um total de 8 mutações foram identificadas nessas 3 variantes. Um estudo de mutações foi então executado para identificar qual destas mutações foram benéficas em relação à ciclização de EEH para Ambrox. Além deste derivado de AacSHC, outra variante AacSHC foi construída, que continha todas as mutações benéficas identificadas (SHC33 como descrito na Tabela 23 abaixo). As condições de triagem foram: 4g/l células de EEH para um OD650nm de 10,0, SDS para 0,05% e 0,1% (2 concentrações) e as reações foram executadas a 55°C sob agitação constante. Resultados 2a Tabela 23: Mutações em enzimas derivadas avaliadas de AacSHC
Resultados 2b
[00716] Das três mutações selecionadas (101A10, 111C8 e 215G2), 215G2 mostrou melhor atividade.
EXEMPLO 3 Condições de reação optimizadas com variantes de SHC Parâmetros de reação investigadaos: temperatura, concentração de SDS e pH Método 3
[00717] As condições de reação para os derivados de variantes de SHC identificados na Tabela 23 foram otimizados individualmente no que diz respeito à temperatura, ao pH e à concentração de SDS. Para este efeito, as células de E. coli foram transformadas com o plasmídeo para a produção de variantes individuais que foram cultivadas em fras cos de Erlenmeyer e produção de SHC induzida conforme descrito acima. Desta forma foi assegurado que todas as culturas continham mesmas ou muito semelhantes quantidades de SHC. As células foram coletadas por centrifugação, lavadas com tampão de ácido cítrico 0,1M (pH 6,0) e armazenadas a -20°C até serem utilizadas posteriormente. Resultados 3
[00718] O resultado desse estudo de otimização é resumido na ta bela abaixo. Uma ronda de otimização também foi realizada com SHC do tipo selvagem.
[00719] A Tabela 24 a seguir mostra as condições de reação ideais para o tipo selvagem e cada uma das variantes consideradas para a caracterização de cada enzima derivada de SHC/HAC. Tabela 24: Condições de reação ótimas para enzimas derivadas de SHC
Discussão 3
[00720] O Exemplo 3 mostra as diferenças observadas em condições de reação para os derivados de SHC em comparação com SHC TS. Desvio significativo de SHC do tipo selvagem para temperatura ideal, pH e concentração de SDS foram observados com as variantes de SHC. Apenas um pequeno número de mutações tem um efeito significativo sobre as melhores condições de reação de bioconversão. Para a deter-minação de condições de reação individuais com as variantes de SHC selecionadas, as reações foram executadas em uma carga de substrato de 4g/l de EEH e as células que tinham produzido o tipo selvagem ou derivados de SHC a uma densidade óptica OD650nm de 10,0.
Temperatura
[00721] Os dados na Tabela 24 demonstram a constatação surpre endente que embora a enzima SHC TS tenha uma atividade ideal a 55°C (na faixa de 45-60°C), um certo número de derivados SHC tem atividade ideal a 35°C (34-50°C). A aplicação de derivados de SHC da presente divulgação nos métodos de preparação de (-)-Ambrox a partir de E,E-homofarnesol em temperaturas de reação inferior tem importan tes vantagens em termos de custos para a produção de (-)-Ambrox em uma escala industrial.
Agente solubilizante
[00722] SDS foi selecionada e identificada a partir de uma longa lista de possíveis agentes solubilizantes que não foram úteis na reação de bioconversão (ver Exemplo 14 para mais informações)
[00723] A SDS é melhor do que, por exemplo, Triton X-100 em ter mos de velocidade de reação e rendimento (tanto no teste a 4g/l de EEH e quando 125g/l EEH é utilizado como fornecido no Exemplo 7).
EXEMPLO 4 Testes de atividade da variante de SHC em comparação com a en zima SHC TS em condições padrão Método 4
[00724] Para comparar a atividade relativa dos biocatalisadores, a produção das variantes (conforme definido na Tabela 24) é descrita da seguinte maneira. As células de E. coli foram transformadas com um plasmídeo para a produção de uma das variantes de SHC e as células de E. coli foram então cultivadas em meio LB a 37°C e 280rpm, cultiva das para um OD650nm de 0,50 e a produção da enzima induzida pela adição de IPTG. A indução durou 5,5 horas a 37°C, 280rpm. As células foram coletadas por centrifugação, lavadas com ácido cítrico 0,1M pH 6,0 e armazenadas a -20°C até serem utilizadas posteriormente. Quando comparada a atividades da variante de SHC (ver Figura 6), uma amostra da mistura de reação foi carregada em um gel de SDS-PAGE para analisar o conteúdo de SHC das reações. Esta análise confirmou que todas as reações continham quantidades idênticas da enzima SHC.
Resultados 4a
[00725] A Figura 6 mostra as atividades relativas da SHC do tipo sel-vagem e variantes de SHC sob condições normais (pH6,0, 55°C, 0,050% SDS, células para OD650nm de 10). Foi também notado que a SHC do tipo selvagem e pelo menos as variantes de SHC testadas de acordo com os Exemplos da presente divulgação são tolerantes a solven tes. Isto significa que os solventes não miscíveis em água selecionados (até quase 100%) podem ser adicionados à reação de bioconversão.
Resultados 4b
[00726] Usando a variante de SHC2 15G2, nenhum efeito notável sobre a atividade desta variante foi observado quando NaCl é adicio nadoà reação (concentrações testadas de 5 a 100mM (apenas)). Além disso, NaCl adicionado até 100 mM ou até 154 mM (NaCl a 0,9%), não mostrou efeito negativo sobre a atividade da SHC na variante 215G2. Esses achados sugerem que se a reação de bioconversão é realizada em uma solução fisiológica de NaCl (0,9%) ou similar e o pH seja man tido a um valor adequado (por exemplo, 5,4 (5,2-5,6)), então a reação de bioconversão pode ser realizada na ausência de um tampão, mas na presença de uma solução de NaCl fisiológica ou similar.
Discussão 4
[00727] A Figura 6 ilustra o ranking da atividade das variantes sele-cionadas e as enzimas SHC do tipo selvagem em termos de conversão de EEH para (-)-Ambrox.
EXEMPLO 5 Perfis de atividade dos derivados de SHC e de SHC TS Método 5
[00728] O teste da atividade foi executado em 0,1 M de tampão de ácido cítrico em 5 ml de volume sob agitação constante a 900 rpm em um aparelho de síntese Heidolph 1. O pH do tampão usado, a tempera tura a qual a reação foi executada e a concentração de SDS (dodedil sulfato de sódio) na reação foi dependendo da variante SHC que foi utilizada (tipo selvagem ou variante). As condições ideais para cada uma das variantes testadas são resumidas na Tabela 24 acima.
[00729] Um material de partida homofarnesol de 96% de pureza e um substrato homofarnesol com uma razão EEH:EZH de 87:13 foi utilizado.
[00730] A título de esclarecimento, uma mistura EE:EZ é uma mis tura de isômeros ((3E,7E) e (3Z,7E).
Resultados 5 Homofarnesol utilizado: EEH:EZH 87:13, pureza (RMN): 96%.
[00731] Os resultados do teste padrão executado sob as condições optimizadas são mostrados na Figura 7B (perfis de atividade dos deri-vados de SHC em relação a SHC TS) e Figura 7A que mostra a melhoria da atividade relativa dos derivados de SHC em relação ao SHC TS (4h (velocidade inicial) e rendimento de 22h).
Homofarnesol utilizado: EEH:EZH 92:08, pureza (RMN): 100%
[00732] O resultado do teste padrão executado sob as condições op- timizadas é mostrado na Figura 8B (perfis de atividade dos derivados de AacSHC em relação ao AacSHC TS) e Figura 8A que mostra a me lhoria relativa dos derivados de AacSHC em relação ao AacSHC TS (4h (velocidade inicial) e rendimento de 22h).
Homofarnesol utilizado: EEH:EZH 66:33, pureza (RMN): 76%
[00733] O resultado do teste padrão executado sob as condições op- timizadas é mostrado na Figura 9B (perfis de atividade dos derivados de AacSHC conforme estabelecido na Tabela 24 em relação ao AacSHC TS) e Figura 9A que mostra a melhoria relativa dos derivados de AacSHC em relação ao AacSHC TS (4h (velocidade inicial) e rendi mento de 22h).
Discussão 5
[00734] A principal conclusão foi a de que independentemente da qualidade do substrato homofarnesol utilizado, as quatro melhores en-zimas derivadas de SHC foram classificadas na seguinte ordem: 215GSHC, SHC26, SHC32 e SHC3.
EXEMPLO 6 Determinação do equilíbrio das massas das reações totalmente ex traídas com solvente Método 6
[00735] Todas as condições permanecendo inalteradas, para cada variante, duas reações foram executadas. O homofarnesol foi usado como um substrato. Após 4 horas e 22 horas de incubação o produto da reação e o substrato não reagido foram extraídos totalmente para cada uma das variantes com um total de 6 lavagens com um volume igual de éter terc-butil-metil (MTBE/tBME). O conteúdo do Homofarnesol e do Ambrox de cada uma das lavagens foi determinado pela análise por GC. A quantidade total de Ambrox formado e Homofarnesol restante foi cal culada a partir de curvas de calibração que tinham sido preparadas uti-lizandosoluções feitas a partir de Ambrox e Homofarnesol autênticos.
Resultados 6
[00736] Os resultados na Figura 10 mostraram que com o substrato utilizado, as 3 melhores variantes foram confirmadas mostrando aproxi-madamente uma melhora de dez vezes (215G2), 7 vezes (SHC26) e 6 vezes (SHC32) sobre a enzima SHC de tipo selvagem.
EXEMPLO 7 Desempenho na biotransformação em 125g/l E,E-Homofarnesol (EEH) Método 7
[00737] Usando a variante de SHC 215G2, o objetivo de aumentar a produtividade volumétrica foi abordado. Um design de uma série de inves-tigações experimentais (DOE) foi executado para otimizar as condições de reação de teste incluindo parâmetros pH, concentração de células e con-centração de SDS. As condições de reação foram: 125g/l de EEH (de Ho-mofarnesol de EE:EZ 86:14), 250g/l de células, 1,55% SDS, a reação sendo executada a 35°C em 0,1 M tampão de ácido cítrico pH 5,4.
[00738] Uma reação típica (150g volume total) está configurada do seguinte modo: em fermentadores Infors de 0,75 litros. O vaso de rea ção é carregado com uma quantidade adequada de Homofarnesol cor-respondenteà 18,75g EEH. 2,33 g SDS são adicionados a partir de uma solução a 15,5% (p/p) preparada em tampão de ácido cítrico pH 5,4. Uma suspensão de células é preparada a partir de células de E. coli que produziram a variante de SHC 215G2 suspendendo as células em 0.1M tampão de ácido cítrico pH 5,4. Após a determinação do peso úmido da célula desta suspensão por centrifugação por 10 min a 10°C e 17210g, o volume adequado de células é adicionado ao vaso de reação a fim de introduzir 37,5g de células para a reação. O volume da reação é com-pletado para 150g com a quantidade necessária de tampão de reação. A reação é executada a 37°C sob agitação constante a 900rpm. A regu lação do pH é feita utilizando ácido cítrico a 40% em água. A reação é amostrada ao longo do tempo (1ml), extraída com 5 volumes de MTBE/tBME (5ml). O teor de homofarnesol e Ambrox e a reação foram determinados pela análise por CG após a clarificação da fase de sol vente por centrifugação (centrífuga de bancada, 13000rpm, 2 min), di luição de dez vezes em MTBE/tBME.
[00739] A mesma reação foi realizada com células de E. coli que ti nham produzido a enzima SHC do tipo selvagem. Nesse caso a reação foi executada a 55°C em tampão de ácido cítrico pH 6,0. Um resumo das condições de reação para este Exemplo é fornecido na linha 2 da Tabela 24a abaixo. As condições de reação apresentadas na linha 1 da tabela 24a abaixo são tomadas a partir de Exemplos anteriores (por exemplo, Exemplos 3-5). Tabela 24a: A fileira 2 apresenta as condições de reação para o Exemplo 7
Resultados 7
[00740] A Figura 11 mostra a conversão de EEH observada para Am- brox pelas duas enzimas. Em 7 horas de reação (estimativa da veloci dade de reação inicial) a conversão com a variante 215G2 SHC foi 13 vezes maior do que a obtida com SHC do tipo selvagem. Em 48 horas de reação, a conversão com a variante foi de cerca de 8 vezes a da enzima do tipo selvagem.
Comentários Gerais 7 Concentrações de Células
[00741] Todas as concentrações de células (g/l) em reações descri tas neste Exemplo são indicadas em peso úmido das células. A concen tração como peso úmido da célula (g/l) de uma suspensão de célula é determinada após a centrifugação de uma amostra desta suspensão ce-lular por dez minutos a 17210g e 4°C.
Correlação entre células g/l e OD650nm
[00742] Usando bioconversão de 125 g/l EEH com o SHC 215G2 ou SHC TS, 250g/l de células nesta reação correspondem a um OD650nm de cerca de 172 na reação. Variações na razão entre OD650nm para quantidade de biocatalisador foram observadas quando diferentes pre parações de biocatalisador foram testadas. Quando o biocatalisador foi utilizado no teste padrão a 4g/l EEH mas aplicando as células a um OD650nm de 10,0, foi estimado que OD650nm de 10,0 é equivalente a 1,45 g/l de células
Discussão 7
[00743] Os dados demonstram que um processo de bioconversão de HAC otimizado e eficiente foi desenvolvido usando concentração de substrato EEH relativamente alta (125 g/l) em comparação com as di vulgações na técnica onde apenas uma concentração do substrato ho mofarnesol de cerca de 0,2 g/l (ver JP2009060799) a cerca de 2,36g/l (10mM) tem sido divulgada na técnica (ver WO2010/139719A2, US2012/0135477A1) e Seitz et al (2012) citado acima).
EXEMPLO 8 Análise por cromatografia a gás (GC) Método 8
[00744] As amostras foram extraídas com um volume adequado de éter de terc-butilmetil (MBTE/tBME) para quantificação de seu conteúdo em EEH e Ambrox. A fração do solvente foi separada da fase de água por centrifugação antes de análise com a cromatografia gasosa. 1 µl da fase de solvente foi injetada (razão de divisão 3) em coluna Zebron ZB 5 de 30m x 0,32mm x 0,25µm. A coluna foi desenvolvida no fluxo cons tante de (4 ml/min H2) com o gradiente de temperatura: 100°C, 15°C/min a 200°C, 120°C/min a 240°C, 4min a 240°C, o que resultou na separação de Ambrox, EEH e EZH. A temperatura de entrada foi de 200°C, temperatura do detector: 300°C.
[00745] A conversão de EEH foi calculada a partir das áreas dos pi cos correspondentes ao Ambrox e EEH com a seguinte fórmula:
[00746] Conversão (%) = 100 x (Área de pico_Ambrox/(Área de pico_Ambrox+ área de pico E,E-Homofarensol))
[00747] A identidade do produto de reação do Ambrox foi confirmada por GC-MS (valores registrados e intensidades: m/z 221 (100%), m/z 97 (40%), m/z 137 (3,3%), m/z 43 (2,6%), m/z 41 (2,5%), m/z 55 (2,4%), m/z 95 (1,9%), m/z 67 (1,8%), m/z 81 (138%), m/z 222 (1,7%)).
Discussão 8
[00748] A recuperação do produto foi realizada por extração com sol vente ou extração com vapor. Os solventes utilizados foram, por exem plo, MTBE ou hexano:Isopropanol (3:2). A reação foi extraída repetida mente com volumes iguais de solvente e o as frações de solvente ana lisadas por GC até que nenhum substrato ou produto fosse detectado. Em geral de 5 a 6 de lavagens foram suficientes. Alternativamente a extração dos produtos de reação foi feita pela extração de vapor.
EXEMPLO 9 Reação de um pote Método 9
[00749] Uma fermentação de 200 ml foi executada com E. coli BL21 (DE3) transformada com o plasmídeo pET28A(+) 215G2 de SHC para a produção de SHC 215G2 com N-ter HisTag usando o padrão de cres cimento e protocolo de indução descrito acima. No final da fase de indução, a aeração foi desligada e a temperatura definida para 35°C, o pH a 5,5 com ácido cítrico e a velocidade do misturador para 500 rpm. O volume da cultura foi estimado a partir de todas as adições feitas du rante o crescimento da cultura (alimentação e consumo de base). De acordo com este volume e para o OD da cultura, uma quantidade ade quada de SDS foi adicionada ao fermentador. EEH foi adicionado para 4g/l. A reação foi amostrada ao longo do tempo, as amostras (150-300 µl) extraídas com 700µl MTBE para a análise por CG. EEH foi convertido para Ambrox diretamente no caldo de cultura. A reação foi executada por um total de 22,5 dias, durante o qual o EEH foi adicionado repetida mente.
Resultados 9
[00750] Quando a conclusão foi alcançada, 10,6 g de EEH tinha sido ciclizada para Ambrox. Os produtos de reação (estruturas fornecidas abaixo) foram extraídos por extração de vapor e foram recuperados quantitativamente a partir da mistura de reação.
Nota sobre produtos de reação
[00751] Quando Homofarnesol EE:EZ 87:13 é convertido pela SHC, os produtos de reação Ambrox, (II), (IV) e (III) como estabelecido na Figura 12 são produzidos e refletem a relação EE:EZ do material de partida.
[00752] Quando EEH é utilizado como material de partida, apenas (- )-Ambrox (I) e produto (IV) são gerados.
[00753] Quando EZH (3Z,7E) é utilizado como material de partida, apenas os produtos (II) e (III) são gerados.
[00754] No entanto, quando uma mistura de EEH e EZH é usada, Ambrox (I) e os produtos (II), (IV) e (III) são gerados.
[00755] Se uma conversão de 100% de EE:EZ 66:34 ocorrer, esta irá fornecer 66%:34% ((Ambrox + (IV)):((II) + (III)).
[00756] Quando uma extração de vapor é realizada, ela extrai todos os 4 produtos - Ambrox e produtos (II), (IV) e (III) e uma etapa de cris talização gera Ambrox com 99% de pureza (GC) em pelo menos um rendimento de 70%.
Discussão 9
[00757] Os dados mostram que a produção de (-)-Ambrox é possível em uma reação de bioconversão ou um sistema de reação de "um reci piente" e que um enriquecimento seletivo de Ambrox é alcançado após a extração de vapor e cristalização.
[00758] Se o material de partida homofarnesol é uma mistura de isô- meros EE e EZ (por exemplo, 86:14), então 2 produtos originários de cada um destes isômeros (4 no total) com (-)-Ambrox sendo de longe o principal constituinte no produto bruto, e o componente dominante no material cristalizado (pureza 99,1%). O (+)-Ambrox não foi detectado.
EXEMPLO 10 Conversão de misturas de Homofarnesol EE:EZ
[00759] A título de esclarecimento,
[00760] EE corresponde a (3Z,7E); mistura EZ corresponde a (3Z,7E); ZE corresponde a (7Z,3Z); ZZ corresponde a (7Z,3Z); EEH cor responde a (3Z,7E); e EZH corresponde a (3Z,7E).
Método 10
[00761] As misturas EE:EZ foram bioconvertidas sob as seguintes condições de reação: 146 g/l homofarnesol total com 250g/l de células e 1,55% SDS usando os seguintes substratos homofarnesol (misturas de homofarnesol EE:EZ):
[00762] EE:EZ 86:14 (maior conteúdo de EEH para este Exemplo),
[00763] EE:EZ 69:31 (menor conteúdo de EEH para este Exemplo),
[00764] EE:EZ 80:20
[00765] EEH:EZH 70:30
Bioconversão de mistura de homofarnesol 7E, 3E/7E, 3Z
[00766] A bioconversão foi realizada utilizando as seguintes condi ções de reação:
[00767] A reação (150,1g volume total) foi executada em tampão de 0,1M ácido cítrico/citrato de sódio, pH 5,4, em um fermentador InforsHT de 750ml que continha 146 g/l total de homofarnesol utilizando um subs trato homofarnesol, que foi uma mistura de 7E,3E:7E, 3Z de 86:14, 250g/l células (produzidas de acordo com o método do Exemplo 1) e 1,55% SDS. A reação foi executada a 35°C sob agitação constante (800rpm), o controle do pH foi feito utilizando ácido cítrico a 10 a 40% em água. A mistura de reação foi amostrada ao longo do tempo, os sol ventes amostrados extraídos para a análise por CG. Foi observado que a conversão de Homofarnesol correu tão rápido com duas qualidades de Homofarnesol (EE:EZ 86:14 e EE:EZ 69:31)
Resultados 10
[00768] A conversão de ambos Homofarnesol E,E e E,Z foi obser vada quando uma bioconversão de 125g/l E,E-Homofarnesol do mate rial EEH:EZH 86:14 usando a SHC TS e um específico derivado de SHC (SHC 215G2) foi realizado. Ou seja, a enzima SHC do tipo selvagem do Alicyclobacillus acidocaldarius produz os mesmos produtos de reação (isto é, Ambrox, produtos (II), (IV) e (III)) do material EEH:EZH 86:14 como uma variante de SHC da Tabela 23 das misturas EEH:EZH. As Figuras 13 e 14 mostram uma análise por GC dos produtos da reação de Ambrox e produtos (II), (IV) e (III).
Discussão 10
[00769] A bioconversão de homofarnesol em Ambrox de acordo com a presente divulgação produz (-)-Ambrox como um composto predomi-nante, mas também pode produzir compostos além do (-)-Ambrox (por exemplo, compostos (II), (IV) e (III)) como identificado acima que podem ou não conferir notas agradáveis olfativas para o produto (-)-Ambrox. Tal como demonstrado acima, sob condições de cristalização seletiva, o Ambrox é separável dos outros por produtos ((II), (IV) e (III)). Por con-seguinte, se os produtos contribuem em uma maneira negativa para o caráter sensorial do produto final do Ambrox, a separação seletiva dos produtos (II), (IV) e (iii) a partir do produto final do (-)-Ambrox aumenta seu valor como uma fragrância ou sabor ou cosmético ou produto para cuidados do consumidor. A análise sensorial é realizada utilizando os testes sensoriais bem estabelecidos utilizados por perfumistas bem trei-nados. A pureza do produto final do (-)-Ambrox pode ser um indicador da qualidade olfativa do produto se o produto por si próprio é principal-menteresponsável para o perfil sensorial desejado.
EXEMPLO 11 Conversão de EEH a partir da mistura de momofarnesol EE:EZ:ZE:ZZ Método 11
[00770] O homofarnesol EE:EZ:ZE:ZZ 40:26:20:14 foi utilizado como um substrato para a conversão de EEH com SHC 215G2. Para fins com-parativos, outros homofarnesois de EE:EZ 2:1 ou 93:07 também foram utilizados.
[00771] A conversão da mistura de homofarnesol EE:EZ:ZE:ZZ foi investigada com a variante SHC 215G2, mas não sob as condições oti-mizadas. As condições de reação foram pH 5,8 em 100 mM tampão de citrato, 0,10% SDS, 40°C. As seguintes conversões de EEH foram ob-servadas, todas as reações sendo executadas com constante 2g/l EEH (consequentemente, concentrações totais variáveis de homofarnesol)
Resultados 11
[00772] As seguintes taxas de conversão da mistura do isômero ho-mofarnesol foram observadas: EE:EZ 2:1 50-55% EE:EZ 93:7 78% EE:EZ:ZE:ZZ 40:26:20:14 6%
Discussão 11
[00773] Além dos rendimentos observados, os dados demonstram que a variante de SHC 215G2 é capaz de converter EEH em Ambrox a partir de uma mistura complexa de homofarnesol EE:EZ:ZE:ZZ. Como esperado, uma menor taxa de conversão resultante em um me nor rendimento de Ambrox foi observada. Esse resultado é consis tente com o ponto de vista de que outros isômeros homofarnesol que não o EEH podem competir com o EEH para acesso às enzimas de rivadas de SHC/HAC e assim podem agir como inibidores competiti vos e/ou substratos alternativos para a conversão de EEH a (-)-Am- brox.
EXEMPLO 12 Dados comparativos para as bioconversões da célula inteira utili zando Triton X-100 e SDS Método 12
[00774] As células hospedeiras de E. coli foram cultivadas de acordo com o protocolo em Métodos 4 do Exemplo 4. A reação de bi- oconversão utilizando a variante de SHC 215G2 foi executada de acordo com o teste padrão no Exemplo 4. O substrato homofarnesol a 4g/l com células para OD650nm de 10,0 em tampão de ácido cítrico/ fos fato de sódio 0,1M pH5,4, 35°C e SDS a 0,07% foram escolhidos como as condições de reação mais adequadas para a variante de SHC 215G2.
Resultados 12
[00775] A Figura 15 fornece uma comparação da atividade da vari ante de SHC 215G2 no ensaio de bioconversão da célula inteira quando usando o Triton X-100 em uma faixa de concentração de 0,005% a 0,48% e SDS a uma concentração de 0,07%.
Discussão 12
[00776] Os dados demonstram que a atividade máxima com Triton X-100 foi apenas de cerca de 20% da atividade obtida com SDS.
EXEMPLO 13 Razão SDS/células Método 13
[00777] A reação de bioconversão foi criada de acordo com Métodos 4 no Exemplo 4 usando o substrato EEH a 4g/l, células em um OD650nm de 5,0 que tinham produzido a enzima derivada de SHC 215G2.
Resultados 13
[00778] Os resultados são definidos na Figura 16, que mostra a por-centagem de EEH convertido para diferentes razões de SDS/células.
[00779] A Figura 16 demonstra que o percentual da conversão de EEH para (-)-Ambrox usando diferentes valores de razão de SDS/ célu las dependente da razão SDS/células. Esta relação tem de ser cuidado-samente definida para alcançar a conversão máxima.
[00780] Se, por exemplo, a concentração de SDS for muito baixa, a conversão subótima do homofarnesol pode ser observada. Por outro lado, se, por exemplo, a concentração de SDS for muito alta, então pode haver um risco de que o biocatalisador seja afetado por meio de pertur bação da célula microbiana intacta e/ou desnaturação/inativação da en zima SHC/HAC. Quando a reação de bioconversão foi executada de acordo com os Métodos 7 no Exemplo 7 usando 125 g/l EEH e 250g/l biocatalisador, o melhor protocolo de bioconversão mostra uma razão de [SDS]/[células] de 16:1.
Discussão 13
[00781] Os resultados demonstram que existe um grau de interde-pendência entre a concentração do agente solubilizante (por exemplo, SDS), a quantidade de biomassa e a concentração do substrato (EEH). A título de exemplo, como a concentração do substrato homofarnesol aumenta, quantidades suficientes de biocatalisador e agente solubili- zante (SDS) são necessárias para uma reação de bioconversão efici ente ocorrer.
EXEMPLO 14 Teste de possíveis agentes solubilizantes para uso na reação de bioconversão Método 14
[00782] Vários agentes solubilizantes (como descrito na Tabela 26 abaixo) foram testados em reações de ciclização de 215G2 SHC EEH usando as mesmas condições que no teste padrão (4g/l EEH, células para um OD650nm de 10,0) como um possível substituto para SDS. A possibilidade de reforçar a atividade (efeito cumulativo) combinando SDS na sua concentração ideal (0,060-0,070%) com outros agentes so- lubilizantes usados (na concentração determinada individualmente como ideal a partir de triagem feito com esses compostos (ver a Tabela 26 abaixo) também foi testada usando o teste padrão. Além disso, al guns"solventes eutéticos profundos" e líquidos iônicos, que são conhe cidos para ajudar a solubilizar compostos insolúveis em água também foram testados.
Resultados 14
[00783] A Tabela 26 a seguir resume quais agentes solubilizantes (por exemplo,: tensioativos, detergentes, intensificadores de solubili dade e similares) foram testados até agora nas reações de ciclização de 215G2 SHC EEH. Em nenhum caso foi uma atividade melhorada em comparação à reação de controle executada utilizando SDS em uma concentração na faixa de 0,060-0,070%. As atividades observadas com esses compostos utilizados isoladamente na concentração definida como ideal só foram cerca de 20% do que foi obtido em reações de controle com SDS. Foi observado que quando nenhum agente solubili- zante foi adicionado uma conversão de 20% EEH foi alcançada. Quando o SDS foi utilizado e um agente solubilizante adicional foi adicionado (numa concentração definida como ideal no teste), nenhum efeito sinér- gico foi observado. Em vez disso, uma diminuição na porcentagem de conversão de EEH foi observada. Pode-se concluir do estudo que sob condições testadas os compostos não melhoraram a conversão de EEH; mas sim os efeitos adversos sobre ciclização são obtidos e que SDS é o mais útil dos agentes solubilizantes estudados. Além disso, nenhum resultado positivo foi obtido dos testes usando "solventes euté- ticos profundos" e líquidos iônicos, que são conhecidos para ajudar a solubilizar compostos insolúveis em água. Tabela 26: Fornece uma lista de agentes solubilizantes que foram testados na reação de bioconversão
Discussão 14
[00784] O requerente selecionou e identificou SDS como um agente de solubilização útil a partir de uma longa lista de outros agentes solu- bilizantes que mostraram não ser úteis na reação de bioconversão do homofarnesol em (-)-Ambrox da presente divulgação.
EXEMPLO 15
[00785] Sensibilidade para a concentração de SDS na reação de bi- oconversão
Método 15
[00786] As condições aplicadas são as condições da bioconversão padrão (conforme descrito no Exemplo 7) a 125g/l com 250g/l biocatali- sador e 1,55% SDS. Outras duas concentrações de SDS (1,40% e 1,70% SDS também foram testadas). Todas as concentrações SDS es tão em % de peso/peso.
[00787] As condições de reação de bioconversão padrão (conforme descrito no Exemplo 7) a 125g/l com 250g/l biocatalisador e 1,55% SDS também foram utilizados para testar diferentes valores de pH.
[00788] O controle foi executado em pH 5,4 em 0,1 M de tampão de ácido cítrico. As execuções das reações em pH mais baixo foram exe cutadas com 0,1M de tampão de ácido acético.
Resultados 15
[00789] Os dados na Figura 17 demonstram que a reação bioconver- são parece ser menos sensível a alterações nas concentrações de SDS do que quando a atividade de HAC foi testada no teste padrão a 4g/l EEH e as células aplicadas a um OD650nm de 10,0.
[00790] Os dados na Figura 18 demonstram que quando as reações de bioconversão são aplicadas, o sistema parece ser menos sensível a variações do pH do que quando a atividade de HAC foi testada no teste padrão a 4g/l EEH e as células aplicadas a um OD650nm de 10,0.
Discussão 15
[00791] Os dados demonstram a robustez da reação de bioconver- são a 125g/l EEH e 250g/l de células em relação à concentração de SDS e a faixa de pH testada.
EXEMPLO 16
[00792] Localização das mutações identificadas de SHC/HAC na es trutura cristalina
[00793] As posições das mutações identificadas nas variantes AacSHC/HAC estão marcadas na Figura 19 como segue: vermelho para a variante 215G2; roxo (vinho tinto) para a variante 101A10 e verde para a variante 111C8. Para os aminoácidos identificados como sendo res-ponsáveis pelo aumento da atividade, as cadeias laterais são destaca das em amarelo no análogo do substrato cocristalizado. Outras muta ções para identificar variantes sem nenhuma melhoria da atividade são marcadas em azul. É notado que as mutações azuis estão espalhadas cerca de metade-metade (ou seja, 50:50) sobre os 2 domínios da en zima, considerando que as mutações benéficas de AacSHC que foram identificadas são localizadas principalmente (com excepção de um) no domínio 2. A única exceção é a mutação F2601Y que está nas proximi dades do sítio ativo. Se apenas as enzimas derivadas de SHC/HAC 215G2 e 111C8 forem consideradas, então todos os mutantes estão lo calizados no domínio 2. A Figura 20 fornece as mesmas informações em preto e branco.
Resultados 16
[00794] Todos os mutantes benéficos (vermelho/verde/roxo) corres- pondente a 215G2, 111C8 e 101A10 estão localizados na sua maioria (além de um mutante F2601Y) no domínio 2 (Wendt et al (1997) Science 277: 1811) da estrutura cristalina de SHC (como previsto na Figura 19). As combinações de mutações benéficas de SHC estão numeradas de acordo com AacSHC do tipo selvagem (SEQ ID N°. 1).
Discussão 16
[00795] A estrutura cristalina é útil para identificar os derivados SHC/HAC com relações desejáveis de estrutura/atividade especial mente em relação à conversão de homofarnesol para (-)-Ambrox. Uma etapa de pré-seleção útil pode ser para restringir a seleção para resí duos de aminoácidos localizados no domínio 2 da estrutura cristalina de SHC/HAC (ver Figuras 19 e 20).
EXEMPLO 17 Preparação de homofarnesol Método 17 Condições analíticas gerais
[00796] GC/MS não polar: 50°C / 2 min, 20°C/ min 200°C, 35°C/min 270°C. GC/MS Agilent 5975C MSD com sistema de GC de série HP 7890A. Coluna não-polar: BPX5 a partir de SGE, 5% fenil, 95% dimetil- polissiloxano 0,22 mm x 0,25 mm x 12sm. Gás de arrasto: Helio. Tem-peratura do injetor: 230°C. Dividido 1:50. Fluxo: 1,0 ml/min. Linha de transferência: 250°C. MS-quadrupolo: 106°C. MS-fonte: 230°C.
Preparação do MNU em THF
[00797] Uma solução de ureia (175 g, 2,9 mols) e cloridrato de meti- lamina (198 g, 2,9 mols) em água (400ml) é aquecida a refluxo (105°C) por 3,5 h sob agitação. A 40°C, NaNO2 (101g, 1,45 mol) dissolvido em água (200 ml) é adicionado. Após 15 min, THF (1000sml) é adicionado o que resulta em uma mistura transparente de fase 2. H2SO4 concen trado (110g, 1,1 mol) é adicionado a 0-5°C e agitado dentro de 1,5h. Após outra 0,5h a 0-5 °C as duas fases transparentes são separadas a 25°C. A fase orgânica (A) (1065 ml, teoricamente 1,35M) é armazenada durante alguns dias a 0-5°C ou encaminhadas imediatamente para o reator de ciclopropanação.
[00798] Depois da separação de fases, a fase aquosa é extraída por duas vezes com THF (2x 1:l). Isto dá 1100ml da fase B e 1075 da fase C. Considerando que a fase A dá uma conversão a 51% de um alceno terminal para um ciclopropano em uma reação de ciclopropanação sub-sequente, a fase B dá <0,5% ciclopropano e a fase C dá conversão não detectável. Concluímos que a >99% MNU é extraído após a primeira fase de separação. Normalmente a fase aquosa é, portanto, descartada após a primeira fase de separação (da fase orgânica A) após o trata mento com KOH aquoso concentrado e ácido acético. B) Preparação de E-?-Farneseno usando MNU em THF
[00799] N-nitroso-N-metil ureia 1,35M em THF (136 ml, 184 mmols) é adicionado por gotejamento a 0°C para uma mistura de agitação rapi-damente de E-beta-Farneseno (CAS 18794-84-8) (25g, 122 mmols) e KOH aquoso (50 ml, 40%) a 0 - 5°C. Após a adição de 4 ml de solução de MNU, Pd(acac)2 (7,4 mg, 0,024 mmol, 0,02%) pré-dissolvido em 0,5ml diclorometano é adicionado.
[00800] A solução MNU restante é adicionada por mais de 4 h a 0 5°C. Um GC nesta fase mostrou E-Farneseno não convertido a 28%, 65% de monociclopropano desejado (mostrado acima) e 3% de um composto bisciclopropanado 5. Após 16 h a 25°C, o ácido acético (100 ml) é adicionado a 0-5°C, depois o éter metil terc-butílico (250 ml). De pois da separação de fases, a fase orgânica é lavada com 2M HCl (250 ml) e a fase aquosa extraída com éter metil terc-butílico (250 ml). As camadas orgânicas combinadas são lavadas com água (2x 100 ml), so luçãoaquosa de NaOH a 10% (2x 100 ml) e água (2x 100ml), secadas sobre MgSO4, filtradas e concentradas para dar 26,9g de um líquido um pouco amarelo que contém E-Farneseno a 9%, 82% dos compostos monociclopropanos desejados e 6% de um produto secundário bisciclo- propanado.
[00801] O composto desejado poderia ser ainda isolado por purifica ção distilativa. Além de 1 g K2CO3 (1g) e destilação através de uma coluna de bobina de aço de 30 cm a 40-60 mbar dá 147g composto monociclopropano (68%corr) a 135-145°C. As frações são agrupadas para dar 92g composto monociclopropano de 100% de pureza.
Dados analíticos de E-? farneceno:
[00802] 1H-RMN (CDCl3, 400 MHz): 5,1 (2 m, 2 H), 4,6 (2 H), 2,2 (2 H), 2,1 (4 H), 2,0 (2 H), 1,7 (s, 3 H), 1,6 (2 s, 6 H), 1,3 (1 H), 0,6 (2 H), 0,45 (2 H) ppm. 13C-RMN (CDCl3, 400 MHz): 150,9 (s), 135,1 (s), 131,2 (s), 124,4 (d), 124,1 (d), 106,0 (t), 39,7 (t), 35,9 (t), 26,7 (t), 25,7 (q), 17,7 (q), 16,0 (d), 6,0 (t) ppm. GC/MS: 218 (2%, M+), 203 (5%, [M - 15]+), 175 (11%), 147 (31%), 134 (15%), 133 (20%), 121 (12%), 107 (55%), 95 (16%), 93 (30%), 91 (20%), 82 (11%), 81 (33%), 79 (42%), 69 (100%), 67 (22%), 55 (20%), 53 (21%), 41 (75%). IR (filme): 3081 (w), 2967 (m), 2915 (m), 2854 (m), 1642 (m), 1439 (m), 1377 (m), 1107 (w), 1047 (w), 1018 (m), 875 (s), 819 (m), 629 (w). Anal. calcd. para C16H26: C, 88,00; H, 12,00. Encontrado: C, 87,80; H, 12,01.
C) Preparação de (7E)-4,8,12-trimetiltrideca-3,7,11-trieno-1-ol ((7E)- homofarnesol)
[00803] Uma mistura de (E)-(6,10-dimetilundeca-1,5,9-trieno-2-il)ci- clopropano (E-? Farneseno) (1g, 4,6 Mmols), dodecano (0,2 g, 1,15 mmol, padrão interno) e ácido L-(+)-tartárico (1g, 6,9 mmols) em um tubo de pressão é aquecido sob agitação em 150°C. Após 18 h e con versão completa (de acordo com GC), a mistura é derramada sobre a água (50 ml) e tolueno (50ml).
[00804] As fases são separadas e a fase aquosa é extraída com to- lueno (50 ml). As camadas orgânicas combinadas são lavadas com Na2CO3 aquosa concentrada (50 ml) e NaCl concentrada (2x 50 ml), secada sobre MgSO4, filtrada e evaporada sob pressão reduzida para dar uma resina acastanhada (1,35 g) que é misturada com KOH aquosa a 30% (4,3Ml) e agitadas a 25°C por duas horas. A análise GC divulga formação de (7E)-4,8,12-trimetiltrideca-3,7,11-trieno-1-ol a 96%de acordo com o padrão interno. Razão E/Z 68:22. Os dados analíticos do E-isômero são consistentes com os da literatura, ver, por exemplo, P. Kocienski, S. Wadman J. Org. Chem. 54, 1215 (1989).
Resultados 17
[00805] Os dados demonstram a preparação de homofarnesol que é adequado para a bioconversão de (-)-Ambrox.
Discussão 17
[00806] Este processo para a preparação de homofarnesol também está descrito em detalhes nos dois pedidos de patentes copendentes - PCT/EP2014/072882 (WO2015/059290) e PCT/EP2014/072891 (WO 2015/059293)- estando a totalidade de seu conteúdo aqui incorporada, a título de referência.
EXEMPLO 18 Reação de um recipiente
[00807] Neste experimento: (i) uma fermentação com uma cepa de E. coli produzindo uma variante 215G2 SHC (por exemplo, como des crito no Exemplo 1) seguido de (ii) conversão de EEH diretamente no caldo de fermentação foi realizada. Porque os 3 parâmetros [células], [EEH] e [SDS] (g/l) estão ligados, era necessário ajustar os parâmetros [EEH] e [SDS] no volume disponível do caldo de fermentação depen dendo da concentração de células (g/l) obtidas no final da fermentação. O objetivo era converter 125g/l EEH com 250g/l de células em uma con centração de SDS de 1,55%. Para permitir uma bioconversão ade quada, as células devem estar em um estado de repouso, em um estado de depleção de glicose. A aeração foi desligada.
Método 18 Fermentação:
[00808] A fim de permitir uma determinação bastante precisa do vo lume do caldo de fermentação no reator no final da fermentação, os vo lumes das amostras retiradas, bem como os volumes de todas as adi ções feitas para o fermentador (alimentação, base, ácido, etc) foram re gistrados.
Determinação da concentração de células no caldo de fermentação:
[00809] Uma amostra de caldo de fermentação (5-10 ml) foi elabo rada sob agitação constante para a determinação do peso úmido da cé lula (g/l) e colocada em um tubo de centrífuga. A massa da amostra foi gravada. A amostra é centrifugada por 10 min a 17210g e 4°C (por exemplo, 12000rpm, rotor SS-34, centrífuga Sorval RC3B). O sobrena- dante foi retirado com pipetagem cuidadosa e a massa do pélete foi gra-vada. A concentração do peso úmido da célula é determinada e foi de gcélulas/lcaldo ou gcélulas/gcaldo.
[00810] O volume do caldo de fermentação no fermentador foi deter minado de acordo com todas as adições e retiradas. No caso de o fer- mentador estar em uma escala, a massa do caldo de fermentação foi determinada por pesagem, se não foi considerado que 1ml = 1g.
Determinação das quantidades de Homofarnesol e SDS necessárias:
[00811] De acordo com a concentração de células determinadas e o volume do caldo de fermentação, a quantidade de E,E-Homofarnesol e SDS para adicionar ao reator foi determinada a fim de manter a mesma relação entre os 3 tal como definido na bioconversão descrita no Exem plo 9: 125g/l EEH, 250g/l células, 1,55% SDS.
Configurando a bioconversão:
[00812] 1. A temperatura foi definida para 35°C. A aeração foi desli gada.
[00813] 2. Ao caldo de fermentação foi adicionada a quantidade calculada de Homofarnesol.
[00814] 3. A quantidade necessária de SDS foi cuidadosamente adi cionada a partir de uma solução de estoque aquosa de SDS a 15,5%.
[00815] 4. A reação foi bem misturada por aprox. 15 min a 800 rpm.
[00816] 5. O pH da reação foi registrado (eletrodo de pH interno).
[00817] 6. Uma amostra (aprox. 1 ml) foi extraída para um tubo tipo Falcon de 15 ml. Aprox. 5 ml de água desionizada foi adicionada e o pH foi registrado em um eletrodo externamente calibrado após uma mistura completa.
[00818] 7. O pH no reator foi definido gradual para 5,4 (valor medido no eletrodo externamente calibrado) utilizando H3PO4 a 85% enquanto controlando regularmente o pH no eletrodo externo foi descrito acima (6).
[00819] 8. O pH foi regulado durante a bioconversão utilizando, por exemplo, 10-25% H3PO4 e 32% NaOH.
[00820] 9. Amostragem de reacção: aproximadamente 1 ml de mis tura de reação foi colocada em um tubo tipo Falcon de 15 ml. Aprox. 5 ml MTBE é adicionado. A amostra foi extraída com agitação vigorosa.
[00821] 10. Uma alíquota foi centrifugada em centrífuga de bancada para 1 min em velocidade máxima (tubo Eppendorf). 100 l da fase de solvente foi adicionado a um frasco GC contendo 900 l MTBE. As amos-tras foram tomadas a cada 1-1,5 horas durante o primeiro dia de bio- conversão. Os dias seguintes apenas 3 amostras por dia foram toma das.
[00822] 11. 1 µl da fase de solvente foi analisada para seu conteúdo de Ambrox e EEH como descrito no Exemplo 8.
[00823] 12. EEH conversão (%) é calculada como 100 x (Ambrox_ área/(Ambrox_área + EEH_área)).
Resultados 18
[00824] Os resultados demonstram que a fermentação de um reci- piente + conversão de EEH foi realizada em um reator KLF2000 (Bioen-gineering) em uma escala de 1,9 litros. 251g/l células permitiu a conver-são de 238g EEH (251 g/l células) para >93% em 47 horas. Quando medido 93 h após o início a conversão foi de 99%.
[00825] Um experimento semelhante de um recipiente foi executado em um reator Infors HT 0,75 l. Depois de uma fermentação que seguiu um protocolo padrão (Exemplo 1) as células do reator de que haviam sido coletadas a partir de outras corridas de fermentações em paralelo com o mesmo protocolo foram adicionadas. O volume do caldo resul tante foi de 479 g. A concentração de células foi determinada como 313,7g/l, que foi 1,25x a concentração de células em uma bioconversão regular (250g/l de células). EEH e SDS foram adicionados em conformi dade para o reator. 75,1g EEH (equivalente a 157g/l EEH neste Exem plo) foram convertidos para 98% em menos de 90h. Este resultado de monstra que é possível executar uma fermentação de um recipiente + conversão de EEH a >125g/l EEH enquanto a corrida de fermentação fornece células que produziram a variante 215G2 SHC em uma alta den sidade celular suficiente.
Discussão 18
[00826] Vantajosamente, a conversão de 99% do substrato foi obtida que é muito útil comercialmente quando material de partida caro (por exemplo, EEH) é usado.
EXEMPLO 19 Produtividade volumétrica aumentada Método 19
[00827] A fim de aumentar ainda mais a produtividade volumétrica uma bioconversão concentrada 1,5x contendo 375g/l de células, 188g/l EEH, 2,33% SDS foi executada. Uma bioconversão regular foi execu tada em paralelo a 125g/l EEH, 250g/l de células, 1,55% SDS (Exemplo 7). As 2 reações foram executadas em reatores Infors HT 0,750l, todos os outros parâmetros inalterados.
Resultados 19
[00828] Os resultados na Figura 22 demonstram que o percentual de conversão 75h após a partida foi de 88% na bioconversão 1,5x versus 95% na bioconversão regular. O percentual de conversão 96h após a partida foi de 93% na conversão de EEH na bioconversão 1,5x versus 97% na bioconversão regular. A porcentagem de conversão na biocon- versão 1,5X foi 96% da obtida na bioconversão regular. Foi observado que a agitação na bioconversão 1,5x tornou mais difícil ao longo do tempo enquanto o Homofarnesol oleoso desapareceu, sendo substitu ído por produtos de reação sólidos. Isso pode explicar o nível de con versão ligeiramente baixo na bioconversão de 1,5x. Usando um reator equipado com um melhor dispositivo mistura pode melhorar a conver são de EEH em uma bioconversão de 1,5x. O resultado indica que é possível executar bioconversões em 188g/l EEH ou superior uma vez que uma mistura eficiente é obtida; a eficiência da agitação parece ser a única limitação do sistema.
Produtividade do (-)-Ambrox
[00829] A "produtividade do (-)-Ambrox" se refere à quantidade de (- )-Ambrox recuperável em gramas por litro de capacidade de biotrans- formação por hora de tempo de bioconversão (ou seja, tempo após o substrato ser adicionado). A este propósito e com referência à Figura 22, a produtividade do (-)-Ambrox é calculada da seguinte forma: bioconversão de 125g/l EEH (250g/l células) produtividade a 1,25h: 10,3 gramas por litro por hora produtividade a 8,25h: 6,3 gramas por litro por hora produtividade a 21,25h: 4,1 gramas por litro por hora bioconversão de 187,5g/l EEH (375g/l células) produtividade a 1,25h: 12,2 gramas por litro por hora produtividade a 8,25h: 8,2 gramas por litro por hora produtividade a 21,25h: 5,5 gramas por litro por hora
[00830] Pode ser considerado que a produtividade calculada em cerca de 6 a 8 horas após a partida é representativa da velocidade inicial da reação, que descreve melhor a taxa de conversão máxima do sis tema.
[00831] Bioconversões típicas usando 125 g/l EEH com 250g/l célu las mostram uma produtividade de Ambrox entre 6,3 e 8,5 gramas por litro por hora após cerca de 6-8 horas (representante da velocidade ini cial da reação).
EXEMPLO 20 Substituindo o tampão de reação com a solução de NaCl Método 20
[00832] Uma bioconversão regular (125 g/l EEH, 250g/l células, 1,55% SDS) foi executada conforme descrito no Exemplo 7, mas subs tituindo o tampão de ácido cítrico pH 5,4 por 0,5% ou 0,9%NaCl, todos os outros parâmetros de reação sendo inalterados. Uma bioconversão no tampão de ácido cítrico foi executada em paralelo como um controle.
Resultados 20
[00833] Os resultados na Figura 23 demonstram que a taxa de con versão de EEH foi a mesma nas corridas de reações no tampão e NaCl a 0,9%. A taxa de conversão foi menor quando na corrida de reação em apenas NaCl a 0,5%. O resultado demonstra a possibilidade de execu ção de bioconversão na ausência de tampão desde que regulação pre cisa do pH e uma força iônica suficiente sejam garantidas.
EXEMPLO 21 Extração de fase sólida do caldo de reação
[00834] Dado que o (-)-Ambrox não está sendo solúvel em água e não é líquido em temperaturas abaixo de aprox. 75°C, estas proprieda des foram tomadas como possíveis vantagens para extrair o produto da fase sólida da biotransformação utilizando solventes miscíveis em água (por exemplo, etanol) e não miscíveis em água (por exemplo, tolueno).
Método 21
[00835] 200 ml de caldo de reação foi centrifugado para separar a fase sólida da líquida (aquosa) (Sorval GS3, 5000rpm, 10min, 10°C). Este separou aprox. 80 ml de pélete sólido de aprox. 120ml de fase lí-quida.Análise (cromatografia gasosa, Exemplo 8) da fase aquosa após a extração de MTBE mostrou que ela continha não mais do que cerca de 0,3% do (-)-Ambrox inicialmente presente na reação de caldo de 200 ml. Tolueno e etanol 99% foram utilizados para a extração de Ambrox da fase sólida.
Resultados 21 Extração de tolueno:
[00836] 80 ml de fase sólida foi extraído 6x com 45 ml de tolueno (aprox. ^ volume de fase sólida, agitação vigorosa por 30s, centrifuga ção (Sorval GS3, 5000 rpm, 10 min, 10°C). A fase de solvente foi anali sada com GC para seu conteúdo de (-)-Ambrox. Mais de 99,5% de (-)- Ambrox inicialmente presente no caldo de reação foram extraídos com 6 extrações representando um volume total de tolueno de 1,35x o vo lume inicial de todo o caldo de reação (200ml) ou 3,4x o volume da fase sólida. O gráfico na Figura 24 mostra a evolução da extração sobre as lavagens com tolueno como % da quantidade inicialmente presente de (-)-Ambrox em 200 ml de todo o caldo de reação (devido à relação de volume caldo/tolueno, % no primeiro extrato mais de 100%).
Extração do etanol:
[00837] 80 ml de fase sólida foi extraída (Infors Multifors HT, 35°C, 1000 rpm, 30 min) com aprox. 160 ml (2 vol) etanol 99%, seguido de centrifugação. O Ambrox não cristalizou durante o processo de extra ção. O gráfico na Figura 25 mostra que após 4 lavagens (total 640ml EtOH, ou seja, 3,2x o volume de caldo de reação inteiro inicial ou 8x o volume da fase sólida), cerca de 99% de Ambrox inicialmente presente no caldo de reação foi recuperado. É necessário etanol suficiente na primeira etapa de extração para evitar a cristalização do Ambrox (solu-bilidade em etanol). Quando apenas 1 ou % vol da fase sólida foi utili zado na primeira etapa de extração, uma pasta pegajosa foi obtida, que foi difícil de manusear e o (-)-Ambrox cristalizou como agulhas sobre o pélete durante a centrifugação. A temperatura pareceu como não sendo o fator responsável por esta cristalização (extração e centrifugação tes tadas em temperatura ambiente e aprox. 35°C-40°C).
[00838] A concentração de (-)-Ambrox na fase EtOH bem como a ra zão de EtOH/ água da fase líquida (umidade residual da fase sólida) pareceram ser responsáveis pela formação de cristais. Foi, no entanto, observado que foi possível reduzir o volume de etanol para 1 vol de fase sólida.
Comentário 21
[00839] Como o (-)-Ambrox não está na fase líquida em temperatura ambiente, ele se separa com a biomassa e pode ser extraído com um solvente orgânico (por exemplo, um solvente miscível em água (por exemplo, etanol) ou um solvente não miscível em água (por exemplo, tolueno). A etapa de centrifugação que separa o (-)-Ambrox em fase sólida da mistura de reação é vantajosa porque reduz a quantidade de solvente necessária para extrair o (-)-Ambrox.
EXEMPLO 22 Análise Sensorial
[00840] Propósito: executar uma análise sensorial do (-)-Ambrox e dos subprodutos (compostos II, III e IV) formados no extrato "bruto" e no extrato "cristalizado".
Resultado 22(a)
[00841] Os resultados da transformação do EEH em (-)-Ambrox (composto I) e o isômero (-)-Ambrox (composto IV).
Resultado 22(b)
[00842] Os resultados da biotransformação de EZH em um éter ma- crocíclico (composto II) e 9b-epi-Ambrox (composto III).
Resultado 22(c)
[00843] Uma composição bruta de (-)-Ambrox inclui os compostos I, II, III e IV com cada % do composto presente numa quantidade de 87,1, 2,8, 2,5 e 7,6%, respectivamente.
Resultado 22(d)
[00844] Uma composição do material seletivamente cristalizado (em escala laboratorial) tem os mesmos componentes presentes em uma quantidade de 99,1, 0,1, 0,1 e 0,7% respectivamente.
Os resultados analíticos sensoriais foram como segue:
[00845] (-)-Ambrox: OTH 0,2ng/l (OTH é limiar de odor).
[00846] Composto IV de EEH: fraco, IsoE, lenhoso, GC-TH 5-10ng.
[00847] Composto II de EZH: "inodoro" (GC-TH >500ng) (GC-TH é o limiar de detecção).
[00848] Composto III de EZH: GC-TH cerca de dez vezes maior do que Ambrox (cerca de 2ng).
Conclusão
[00849] O percentual total de cada um dos 3 subprodutos (compos tos II, III e IV) no extrato "bruto"é de cerca de 3%.
[00850] O percentual total de cada um dos 3 subprodutos (compos tos II, III e IV) no extrato "cristalino"é de cerca de 1% (em escala labo ratorial).
[00851] A análise sensorial dos 3 subprodutos (compostos II, III e IV) indica um odor mais fraco do que a partir do (-)-Ambrox.
[00852] De fato, o de odor 9b-epi-ambrox (composto III) é cerca de 10 vezes mais fraco do que o (-)-Ambrox sugerindo que é essencial mente inodoro.
[00853] A análise sensorial demonstra, a remoção de um ou mais compostos de subprodutos a partir de (-)-Ambrox pode melhorar o odor dos compostos restantes (isto é, o (-)-Ambrox) mesmo se os compostos removidos forem efetivamente sem odor em si.
[00854] Isto é, uma melhora do odor de Ambrox foi observada na au sência dos compostos II, III e IV.
EXEMPLO 23 Recuperação do Ambrox por Extração de Vapor Método 23
[00855] Pureza resultante do (-)-Ambrox bruto (vapor extraído) e cris-talizado
[00856] A mistura de reação da biotransformação de EE:EZ 86:14 foi extraída por vapor e o produto da reação cristalizado como segue: O destilado de vapor foi coletado como uma mistura bifásica. A fase orgâ-nica foi mantida e a fase aquosa descartada. A composição da fase or-gânica foi analisada por CG e os resultados mostrados na Tabela 25 abaixo (ver "bruto"). A fase orgânica foi então concentrada para secar. O etanol foi então adicionado ao produto bruto seco e a mistura aque cidaaté que o produto fosse dissolvido. Em temperatura ambiente a água é adicionada lentamente e o (-)-Ambrox cristaliza sob agitação ocasional e resfriamento em banho de gelo.
Resultados 23
[00857] Tabela 25 abaixo também mostra os resultados de análises por GC de produtos obtidos após a etapa de extração/destilação de va por ("bruto") e o produto cristalizado ((-)-Ambrox). As referências na Ta bela 25 para "EZH" e "EEH" se referem a homofarnesol (3Z,7E) e ho mofarnesol 7E,3E respectivamente.
[00858] A Tabela 25 indica que o material inicial particular (EEH:EZH 86:14) produz o produto final desejado (-)-Ambrox e uma mistura muito específica de subprodutos (II, IV e III) usando a SHC TS ou um derivado de SHC. Os dados para a cristalização seletiva mostram um forte enriquecimento de (-)-Ambrox (I), com praticamente nenhum subpro duto (II), (IV) ou (III) sendo encontrado na amostra cristalizada. Por con-seguinte, esta mistura EE:EZ proporciona um produto olfativamente puro (-)-Ambrox que é seletivamente cristalizado em uma maneira rela tivamente simples e de baixo custo. Tabela 25: mostra os resultados da análise GC para o produto cris-talizado.
Discussão 23
[00859] A extração de vapor/filtração são métodos ambientalmente amigáveis para isolar o Ambrox porque oferece um isolamento conveni-ente isento de solventes de Ambrox com uma inativação associada do biocatalizador.
Resumo 23
[00860] O (-)-Ambrox produzido utilizando a reação de bioconversão pode ser extraído com solvente de toda a mistura de reação (por exem plo, usando um solvente não miscível em água ou por extração de va- por/destilação ou por filtração) ou da fase sólida (por exemplo, usando um solvente miscível em água) através de métodos que são conhecidos pelos versados na técnica.

Claims (20)

1. Processo para preparar (-)-Ambrox ou uma mistura que compreende (-)-Ambrox, caracterizado pelo fato de que uma mistura de isômeros que compreende (3E,7E)-homofarnesol (EEH) é enzimatica- mente convertida em (-)-Ambrox ou em uma mistura que compreende (-)-Ambrox, em que a conversão enzimática é realizada utilizando uma enzima esqualeno-hopeno-ciclase/homofarnesol-Ambrox-ciclase (SHC/HAC), que apresenta a sequência polipeptídica com pelo menos 70% de identidade com SEQ ID N°. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID N°. 3; SEQ ID N°. 4 sob condições reacionais adequadas para a produção de (-)- Ambrox, e em que a mistura de isômeros compreende isômeros de ho-mofarnesol selecionados de um ou mais dos seguintes grupos consis-tindo em [(3E,7E) e [(3Z,7E)] e/ou [(3E,7E) e (3E,7Z)] e/ou [(3Z,7E), (3E,7E) e (3E,7Z)] designados ainda como [EE:EZ], [EE:ZE] e [EE:EZ:ZE] respectivamente.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é realizado utilizando uma sequência polipeptídica de enzima SHC/HAC selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N°. 1, SEQ ID N°. 2, SEQ ID N°. 3; SEQ ID N°. 4.
3. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracte-rizado pelo fato de que utiliza células hospedeiras recombinantes que produzem a enzima SHC/HAC.
4. Processo de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracte-rizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos que codifica a en-zima de SHC/HAC é selecionado do grupo consistindo em SEQ ID N°. 165, 166, 167, 168, ou 169.
5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a conversão de homofarnesol a (-)-Ambrox é realizada a uma temperatura na faixa de 30°C a 60°C, a um pH na faixa de cerca de 4 a 8.
6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a conversão de homofarnesol em (-)-Ambrox é realizada utilizando uma ou mais das condições de reação para as enzimas derivadas SHC/HAC ou SHC/HAC de tipo selvagem, como apresentado na Tabela 24 ou na Tabela 24a, de preferência a uma faixa de pH de 5,0 a 6,2, de preferência a uma temperatura de 35°C.
7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que (-)-Ambrox é produzido em mistura com pelo menos um ou mais dos subprodutos (II), (IV) e/ou (III).
8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que (-)-Ambrox é isolado da mistura de reação de bioconversão utilizando um solvente orgânico ou uma etapa de extração/destilação por vapor ou filtração.
9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que (-)-Ambrox é isolado da fase sólida da mistura reacional de bioconversão utilizando um solvente orgânico ou uma etapa de extração/destilação a vapor.
10. Processo de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracte-rizado pelo fato de que (-)-Ambrox é isolado da mistura reacional utili-zando um solvente orgânico, preferivelmente etanol ou tolueno.
11. Processo de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 8 a 10, caracterizado pelo fato de que (-)-Ambrox é seletivamente cristalizado utilizando um solvente orgânico.
12. Processo de acordo com a reivindicação 11, caracteri-zado pelo fato de que (-)-Ambrox está substancialmente livre dos sub-produtos (II), (IV) e/ou (III).
13. Processo de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 12, caracterizado pelo fato de que é produzido (-)-Ambrox em uma faixa de concentração de cerca de 125 a 200 g/L.
14. Produto de reação, caracterizado pelo fato de que com-preende (-)-Ambrox obtenível pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, em que (-)-Ambrox apresenta um limiar de odor de cerca de 0,1 a cerca de 0,5 ng/L e em que a mistura de isômeros que compreende EEH selecionada de um ou mais dos seguintes grupos consistindo em [(3E,7E) e [(3Z,7E)] e/ou [(3Z,7E), (3E,7E) e (3E,7Z)] de signados ainda como [EE:EZ] e [EE:EZ:ZE], respectivamente.
15. (-)-Ambrox de acordo com a reivindicação 14, caracteri-zado pelo fato de que está em uma forma sólida, de preferência em uma forma amorfa ou cristalina.
16. Processo para fabricar um produto que contém (-)-Am- brox, caracterizado pelo fato de que compreende a incorporação de (-)- Ambrox como definido na reivindicação 14 ou 15 para dentro do produto.
17. Processo de acordo com a reivindicação 16, caracteri-zado pelo fato de que o produto é um produto de fragrância, um produto cosmético, um produto de limpeza, um produto detergente ou um pro duto de sabão.
18. Fragrância ou cosmético ou produto para cuidados do consumidor, caracterizado pelo fato de que compreende (-)-Ambrox como definido na reivindicação 14 ou 15.
19. Fragrância ou composição cosmética ou cuidados do consumidor, caracterizado pelo fato de que compreende (-)-Ambrox como definido na reivindicação 14 ou 15 e um ou mais componentes adicionais.
20. Uso do (-)-Ambrox como definido na reivindicação 14 ou 15, caracterizado pelo fato de ser parte de uma fragrância ou de um cosmético ou de um produto de consumo, como um cuidado de tecidos, higiene pessoal, cuidados de beleza e/ou um produto de limpeza.
BR122024004207-0A 2015-04-24 2016-04-22 Processo para preparar (-)-ambrox ou sua mistura, produto de reação que compreende (-)-ambrox, processo para fabricar um produto que contém (-)-ambrox, fragrância ou cosmético ou produto para cuidados do consumidor, e uso de (-)-ambrox BR122024004207A2 (pt)

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