CN111019852B

CN111019852B - 一种提高酿酒酵母工程菌株合成葡萄糖二酸效率的方法

Info

Publication number: CN111019852B
Application number: CN201911412823.4A
Authority: CN
Inventors: 邓禹; 赵运英; 李�杰; 李国辉; 毛银; 周胜虎
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2019-12-31
Filing date: 2019-12-31
Publication date: 2021-11-23
Anticipated expiration: 2039-12-31
Also published as: CN111019852A

Abstract

本发明公开了一种提高酿酒酵母工程菌株合成葡萄糖二酸效率的方法，属于生物工程技术领域。本发明是以酿酒酵母BY4741背景下的opi1缺失株为出发菌株，将拟南芥(Arabidopsis thaliana)来源的肌醇加氧酶MIOX4和丁香假单胞菌来源的糖醛酸脱氢酶udh通过不同的linker连接，然后整合至酿酒酵母opi1缺失株的基因组上。而经过融合表达后，在相同的发酵条件下，Bga‑L12工程菌产量最高达1.45g/L，较没有进行MIOX4和udh融合表达的酿酒酵母工程菌其产量提高了近5倍。为葡萄糖二酸工程菌的进一步代谢改造奠定了基础。

Description

一种提高酿酒酵母工程菌株合成葡萄糖二酸效率的方法

技术领域

本发明涉及一种提高酿酒酵母工程菌株合成葡萄糖二酸效率的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

葡糖二酸(Glucaric acid)，是葡萄糖的醛基和C6位羟基皆被氧化为羧基而形成的二元酸。自然界中即存在葡糖二酸，如十字花科的素菜(花椰菜等)、水果(如柑橘等)以及哺乳动物的代谢物中均发现葡糖二酸。葡糖二酸及其衍生物在医药方面有重要的应用，由于葡糖二酸及其内酯可以有效抑制β-葡萄糖醛酸酶的活性，因此成为良好的抗癌物质。而且，葡糖二酸还具有降低胆固醇的作用；葡糖二酸-1,4-内酯具有抗氧化作用，能够抑制糖尿病。研究发现，葡糖二酸可以通过缩聚反应形成聚酰胺，该聚合物具有生物可降解性，开拓了可降解尼龙材料的发展前景。

酿酒酵母相较于大肠杆菌，具有更高的工业应用价值，一方面酿酒酵母的耐酸能力强于大肠杆菌，另一方面酿酒酵母本身可以作为单细胞蛋白用于饲料、食品等。酿酒酵母还具有其它优点，如耐低温、可低pH发酵、没有噬菌体感染、适合大规模发酵、易分离和高抗逆性等特点。因而酿酒酵母已经广泛用于产有机酸的研究，如ρ-羟基苯甲酸、ρ-氨基苯甲酸、ρ-羟基苯丙烯酸和青蒿酸等。通过酿酒酵母代谢工程制备葡萄糖二酸具有2个优势，一是细胞本身含有葡糖糖二酸合成途径中的肌醇-1-磷酸合成酶Ino1，二是酵母能够利用葡萄糖-6-磷酸合成肌醇。目前对于通过酿酒酵母代谢工程制备葡萄糖二酸研究的相关报道比较少，Prather课题组将外源MIOX和UDH基因引入酿酒酵母细胞进行异源表达实现了通过葡萄糖和外加肌醇在酿酒酵母细胞中产葡萄糖二酸，但是其产量在上罐培养条件下只有1.6g/L。我们前期酿酒酵母工程菌Bga-001在分批补料发酵条件下能够产6g/L的葡萄糖二酸。

通过代谢工程策略构建的途径含有异源酶时，由于异源蛋白缺少宿主细胞天然代谢调控机制，因此，宿主细胞流量存在不平衡的问题。脚手架蛋白被用来募集代谢途径酶进行融合表达，该方法可以减少底物流失和中间代谢物的积累，提高途径合成效率，因此近年来成为研究的热点。在大肠杆菌中，通过构建脚手架蛋白葡糖二酸的产量可以提高3倍。在酿酒酵母中，通过亲合体和脚手架构建融合蛋白将法尼基二磷酸合成酶和法尼烯合成酶进行共定位，法尼烯的产量提高了135％；将这种方法应用于大肠杆菌聚羟基丁酸酯(PHB)的合成后，PHB的产量提高了7倍。本发明拟通过构建亲合体脚手架将拟南芥(Arabidopsisthaliana)来源的肌醇加氧酶MIOX4和丁香假单胞菌来源的糖醛酸脱氢酶udh通过不同的linker连接，提高MIOX1和udh的途径效率，在此基础上进一步提高葡糖二酸合成途径的效率，从而为进一步的代谢改造奠定基础。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种提高提高酿酒酵母工程菌株合成葡萄糖二酸效率的方法。本发明通过以下方案来实现：

本发明的第一个目的是提高一种合成D-葡萄糖二酸的酿酒酵母基因工程菌，是以酿酒酵母BY4741的opi1缺失株为出发菌株，将拟南芥(Arabidopsis thaliana)来源的肌醇加氧酶MIOX4和丁香假单胞菌来源的糖醛酸脱氢酶udh通过linker连接，然后整合至酿酒酵母opi1缺失株的基因组上。

在一种实施方式中，所述肌醇加氧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述糖醛酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在一种实施方式中，所述linker包括GSG、GSGGGGS、GSGEAAAK、GSGEAAAKEAAAK、SGMGSSSN、PTPTP、PTPTPTPTP、PTPTPTPTPTPTPTP、EAAAAK、EAAAAKEAAAAK、EAAAAKEAAAAKEAAAAK或SSSNNNNNNNNNN。

在一种实施方式中，所述肌醇加氧酶和糖醛酸脱氢酶通过linker融合后整合至opi1缺失株的OPI1基因启动子上。

在一种实施方式中，所述OPI1基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在本发明的一种实施方式中，所述片段MIOX4来自拟南芥，udh片段来自丁香假单胞菌(Pseudomonas putida)，分别由引物从Bga-001基因组扩增获得。Bga-001菌株来源于专利：一种提高酿酒酵母工程菌株发酵生产葡萄糖二酸的方法(申请号：201810091278.2)

本发明的第二个目的是筛选出一种利用上述工程菌提高提高酿酒酵母工程菌株合成葡萄糖二酸效率的方法，利用葡萄糖为底物高产高附加值葡糖二酸。

在本发明的一种实施方式中，将单菌落接种于YPD培养基中，28～30℃，200～250rpm，培养20～24h，获得种子液。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的碳源为葡萄糖，初始浓度为15～25g/L。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵是将种子液按照1～2％的接种量接种至发酵培养基中，于28～30℃、200～250rpm，培养160～240小时。

在本发明的一种实施方式中，在发酵24小时和36小时补加葡萄糖，使发酵体系中的葡萄糖浓度为5g/L。

本发明还要求保护所述酿酒酵母基因工程菌或所述方法在制备葡萄糖二酸或其衍生产品方面的应用。

有益效果：葡萄糖二酸合成途径效率低且MIOX4稳定性差的问题，本方法将MIOX4和udh通过不同的linker进行融合表达，通过发酵培养后筛选出能够提高葡萄糖二酸合成途径效率的葡萄糖二酸高产菌株，实现了外源基因在酿酒酵母细胞中的稳定表达。本实验室构建的分别表达MIOX4和udh的酿酒酵母工程菌，其途径效率低，相同发酵条件下其葡萄糖二酸产量只有0.25g/L，而经过融合表达后，在相同的发酵条件下产量最高达1.45g/L，提高了近5倍。

附图说明

图1为工程菌构建策略图；

图2为MIOX4-linker-udh整合片段琼脂糖凝胶电泳检测图；其中，泳道0为不融合linker的对照，泳道1～12分别表示通过GSG、GSGGGGS、GSGEAAAK、GSGEAAAKEAAAK、SGMGSSSN、PTPTP、PTPTPTPTP、PTPTPTPTPTPTPTP、EAAAAK、EAAAAKEAAAAK、EAAAAKEAAAAKEAAAAK或SSSNNNNNNNNNN融合的整合菌株；

图3为MIOX4-linker-udh整合菌株基因型琼脂糖凝胶电泳检测图；其中，泳道0为不融合linker的对照，泳道1～12分别表示通过GSG、GSGGGGS、GSGEAAAK、GSGEAAAKEAAAK、SGMGSSSN、PTPTP、PTPTPTPTP、PTPTPTPTPTPTPTP、EAAAAK、EAAAAKEAAAAK、EAAAAKEAAAAKEAAAAK或SSSNNNNNNNNNN融合的整合菌株；

图4为不同酿酒酵母工程菌的葡萄糖二酸产量；其中Bga-L1～Bga-L13分别表示：不融合linker的对照，分别通过GSG、GSGGGGS、GSGEAAAK、GSGEAAAKEAAAK、SGMGSSSN、PTPTP、PTPTPTPTP、PTPTPTPTPTPTPTP、EAAAAK、EAAAAKEAAAAK、EAAAAKEAAAAKEAAAAK或SSSNNNNNNNNNN融合的整合菌株；Bga-2表示单独表达2个基因的菌株。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

YPD培养基组成：每升YPD培养基含有20g蛋白胨，20g葡萄糖和10g酵母提取物，定容后1×105Pa灭菌20min。固体培养基每升加入20g的琼脂粉。

发酵培养基组成：YPD培养基组成外加10.8g/L的肌醇。

表1为实施例1、2用到的引物

实施例1：MIOX4-linker-udh整合片段的获得

以Bga-001(公开于公开号为CN108220176A的专利申请专利：一种提高酿酒酵母工程菌株发酵生产葡萄糖二酸的方法)的基因组为模板，先以MIOX4-LF/MIOX4-LR为引物，扩增PTEF1-MIOX4片段；再分别以UDH-F(0-12)和UDH-R扩增不含linker，及分别含有如下12个不同linker：GSG、GSGGGGS、GSGEAAAK、GSGEAAAKEAAAK、SGMGSSSN、PTPTP、PTPTPTPTP、PTPTPTPTPTPTPTP、EAAAAK、EAAAAKEAAAAK、EAAAAKEAAAAKEAAAAK和SSSNNNNNNNNNN的UDH-TCYC1片段，然后以MIOX4-LF和UDH-R将上述两个片段进行融合PCR，获得通过12个不同linker连接的PTEF1-MIOX4-UDH-TCYC1的DNA片段(图1和图2)。

然后以Bga-001的基因组为模板，通过引物HIS3-(opi1)F/HIS3-(opi1)R扩增SEQID NO.5所示的HIS3片段(含有OPI1启动子上游同源序列，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示)，以上述获得的通过12个不同linker连接的DNA片段PTEF1-MIOX4-UDH-TCYC1为模板，通过引物MIOX4-LF/TCYC1-(opi1)R扩增获得PTEF1-MIOX4-UDH-TCYC1片段(含有OPI1启动子下游同源序列)，最后通过醋酸锂转化法将上述2个片段整合到opi1缺失株的启动子上。

实施例2：MIOX4-linker-udh整合菌株的检测

提取通过上述方法获得的酵母转化子的基因组，以MD-Check-(opi1)F/MD-Check-(opi1)R为引物扩增提取的基因组，验证MIOX-UDH1融合蛋白是否整合到BY4741opi1Δ菌株的基因组上，图3可以说明所验证的菌株基因组上有MIOX与UDH融合蛋白，最终获得正确的整合菌株，分别命名为Bga-L1～Bga-L13。

实施例3：融合表达工程菌发酵合成葡萄糖二酸

1、种子液制备：甘油保藏的菌种于平板上划线，挑取单菌落接种于10mL的YPD培养基中，30℃，250rpm，摇床培养24h即为种子液。

2、发酵条件：将种子液按照5％的接种量接种到含有50mL液体培养基的250mL的锥形瓶中，发酵培养基中的葡萄糖浓度为20g/L，并加入10.8g/L的肌醇。30℃、摇床转速250rpm，培养240小时。

3、产物检测：取发酵液1mL，高速离心10min，保留上清液并用0.22μm规格的滤膜过滤，滤液即为样品。即可通过液相色谱-质谱连用(LC-MS)检测，或通过高效液相色谱(HPLC)检测，以5mM硫酸为流动相，色谱柱为有机酸柱(Aninex Hpx-87H ion exchange column)，柱温55℃，示差折光检测器，进样量30μL，流速0.6mL/min。

每linker筛选出两个融合片段整合成功的菌株进行摇瓶发酵，同时以BY4741opi1Δ上单独表达MIOX4和udh的菌株(Bga-2)作为对照，对比葡萄糖二酸产量是否有所提高。发酵结果(图4)表明，相同发酵条件下，没有进行MIOX4和udh融合表达的酿酒酵母工程菌，其途径效率低，葡萄糖二酸产量只有0.25g/L，而经过融合表达后，在相同的发酵条件下，Bga-L12工程菌产量最高达1.45g/L，提高了近5倍；Bga-L5、Bga-L9的葡萄糖二酸产量分别为1.20g/L和1.41g/L。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种提高酿酒酵母工程菌株合成葡萄糖二酸效率的方法

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 318

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 1

Met Thr Ile Ser Val Glu Lys Pro Ile Phe Glu Glu Glu Val Ser Ala

1 5 10 15

Phe Glu Lys Ser Gly Asp Asn Ile Gly Glu Leu Lys Leu Asp Gly Gly

20 25 30

Phe Ser Met Pro Lys Met Asp Thr Asn Asp Asp Glu Ala Phe Leu Ala

35 40 45

Pro Glu Met Asn Ala Phe Gly Arg Gln Phe Arg Asp Tyr Asp Val Glu

50 55 60

Ser Glu Arg Gln Lys Gly Val Glu Glu Phe Tyr Arg Leu Gln His Ile

65 70 75 80

Asn Gln Thr Val Asp Phe Val Lys Lys Met Arg Ala Glu Tyr Gly Lys

85 90 95

Leu Asp Lys Met Val Met Ser Ile Trp Glu Cys Cys Glu Leu Leu Asn

100 105 110

Glu Val Val Asp Glu Ser Asp Pro Asp Leu Asp Glu Pro Gln Ile Gln

115 120 125

His Leu Leu Gln Ser Ala Glu Ala Ile Arg Lys Asp Tyr Pro Asn Glu

130 135 140

Asp Trp Leu His Leu Thr Ala Leu Ile His Asp Leu Gly Lys Val Ile

145 150 155 160

Thr Leu Pro Gln Phe Gly Gly Leu Pro Gln Trp Ala Val Val Gly Asp

165 170 175

Thr Phe Pro Val Gly Cys Ala Phe Asp Glu Ser Asn Val His His Lys

180 185 190

Tyr Phe Val Glu Asn Pro Asp Phe His Asn Glu Thr Tyr Asn Thr Lys

195 200 205

Asn Gly Ile Tyr Ser Glu Gly Cys Gly Leu Asn Asn Val Met Met Ser

210 215 220

Trp Gly His Asp Asp Tyr Met Tyr Leu Val Ala Lys Glu Asn Gly Ser

225 230 235 240

Thr Leu Pro Ser Ala Gly Gln Phe Ile Ile Arg Tyr His Ser Phe Tyr

245 250 255

Pro Leu His Thr Ala Gly Glu Tyr Thr His Leu Met Asn Glu Glu Asp

260 265 270

Lys Glu Asn Leu Lys Trp Leu His Val Phe Asn Lys Tyr Asp Leu Tyr

275 280 285

Ser Lys Ser Lys Val His Val Asp Val Glu Lys Val Lys Pro Tyr Tyr

290 295 300

Met Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Phe Pro Glu Asn Leu Arg Trp

305 310 315

<210> 2

<211> 275

<212> PRT

<213> Pseudomonas syringae

<400> 2

Met Ala Ser Ala His Thr Thr Gln Thr Pro Phe Asn Arg Leu Leu Leu

1 5 10 15

Thr Gly Ala Ala Gly Gly Leu Gly Lys Val Leu Arg Glu Thr Leu Arg

20 25 30

Pro Tyr Ser His Ile Leu Arg Leu Ser Asp Ile Ala Glu Met Ala Pro

35 40 45

Ala Val Gly Asp His Glu Glu Val Gln Val Cys Asp Leu Ala Asp Lys

50 55 60

Asp Ala Val His Arg Leu Val Glu Gly Val Asp Ala Ile Leu His Phe

65 70 75 80

Gly Gly Val Ser Val Glu Arg Pro Phe Glu Glu Ile Leu Gly Ala Asn

85 90 95

Ile Cys Gly Val Phe His Ile Tyr Glu Ala Ala Arg Arg His Gly Val

100 105 110

Lys Arg Val Ile Phe Ala Ser Ser Asn His Val Ile Gly Phe Tyr Lys

115 120 125

Gln Asn Glu Thr Ile Asp Ala His Ser Pro Arg Arg Pro Asp Ser Tyr

130 135 140

Tyr Gly Leu Ser Lys Ser Tyr Gly Glu Asp Met Ala Ser Phe Tyr Phe

145 150 155 160

Asp Arg Tyr Gly Ile Glu Thr Val Ser Ile Arg Ile Gly Ser Ser Phe

165 170 175

Pro Glu Pro Gln Asn Arg Arg Met Met Ser Thr Trp Leu Ser Phe Asp

180 185 190

Asp Leu Thr Arg Leu Leu Glu Arg Ala Leu Tyr Thr Pro Asp Val Gly

195 200 205

His Thr Val Val Tyr Gly Val Ser Asp Asn Lys Thr Val Trp Trp Asp

210 215 220

Asn Arg Phe Ala Ser Lys Leu Asp Tyr Ala Pro Lys Asp Ser Ser Glu

225 230 235 240

Val Phe Arg Ala Lys Val Asp Ala Gln Pro Met Pro Ala Asp Asp Asp

245 250 255

Pro Ala Met Val Tyr Gln Gly Gly Ala Phe Val Ala Ser Gly Pro Phe

260 265 270

Gly Asp Lys

275

<210> 3

<211> 700

<212> DNA

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 3

gattttctcc tctgggagat acaaaccatg aaggggcacc gagaacatag cacaaacaag 60

agctcacagt acaacagcga cgaagatgat ccaaatacgt gtgcatccat ggtggcagag 120

ttccccctct tcaaccagga agaatatgac cgcctgcaag aagaaatgaa aacctcaatg 180

aatccgccgc ccttgcgcac gggacccagg ctggaagaac tatatagaca agtgcacgac 240

caacaaactt cccacgttac tcctcgagat aagttggtca acattgattt cgagattccg 300

tactgtacat gcagtggcct gaaagttgag tacttgaagg tcgaagagcc acaattgcag 360

taccagtctt tcccctgggt cagatacaag accgtcagcg acgaagagta cgcatatatt 420

gtttgacgct tacgcagaca tctcatagat agacaaatgg tacgttcgtt ttagtatata 480

gatggcacct tataatcttc atatgcaacc gggtaaaatc gggcgttctt attttttttt 540

tttccacctc aatgagaggg attaataaga ggattggagc aagacagcga tctgcactta 600

gccaagaaag catatcaggc cagaacgtgg cattttgttt acagtgctga ttaaagcgtg 660

tgtatcagga cagtgttttt aacgaagata ctagtcattg 700

<210> 4

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Met Thr Glu Gln Lys Ala Leu Val Lys Arg Ile Thr Asn Glu Thr Lys

1 5 10 15

Ile Gln Ile Ala Ile Ser Leu Lys Gly Gly Pro Leu Ala Ile Glu His

20 25 30

Ser Ile Phe Pro Glu Lys Glu Ala Glu Ala Val Ala Glu Gln Ala Thr

35 40 45

Gln Ser Gln Val Ile Asn Val His Thr Gly Ile Gly Phe Leu Asp His

50 55 60

Met Ile His Ala Leu Ala Lys His Ser Gly Trp Ser Leu Ile Val Glu

65 70 75 80

Cys Ile Gly Asp Leu His Ile Asp Asp His His Thr Thr Glu Asp Cys

85 90 95

Gly Ile Ala Leu Gly Gln Ala Phe Lys Glu Ala Leu Leu Ala Arg Gly

100 105 110

Val Lys Arg Phe Gly Ser Gly Phe Ala Pro Leu Asp Glu Ala Leu Ser

115 120 125

Arg Ala Val Val Asp Leu Ser Asn Arg Pro Tyr Ala Val Val Glu Leu

130 135 140

Gly Leu Gln Arg Glu Lys Val Gly Asp Leu Ser Cys Glu Met Ile Pro

145 150 155 160

His Phe Leu Glu Ser Phe Ala Glu Ala Ser Arg Ile Thr Leu His Val

165 170 175

Asp Cys Leu Arg Gly Lys Asn Asp His His Arg Ser Glu Ser Ala Phe

180 185 190

Lys Ala Leu Ala Val Ala Ile Arg Glu Ala Thr Ser Pro Asn Gly Thr

195 200 205

Asn Asp Val Pro Ser Thr Lys Gly Val Leu Met

210 215

<210> 5

<211> 657

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgacagagc agaaagccct agtaaagcgt attacaaatg aaaccaagat tcagattgcg 60

atctctttaa agggtggtcc cctagcgata gagcactcga tcttcccaga aaaagaggca 120

gaagcagtag cagaacaggc cacacaatcg caagtgatta acgtccacac aggtataggg 180

tttctggacc atatgataca tgctctggcc aagcattccg gctggtcgct aatcgttgag 240

tgcattggtg acttacacat agacgaccat cacaccactg aagactgcgg gattgctctc 300

ggtcaagctt ttaaagaggc cctactggcg cgtggagtaa aaaggtttgg atcaggattt 360

gcgcctttgg atgaggcact ttccagagcg gtggtagatc tttcgaacag gccgtacgca 420

gttgtcgaac ttggtttgca aagggagaaa gtaggagatc tctcttgcga gatgatcccg 480

cattttcttg aaagctttgc agaggctagc agaattaccc tccacgttga ttgtctgcga 540

ggcaagaatg atcatcaccg tagtgagagt gcgttcaagg ctcttgcggt tgccataaga 600

gaagccacct cgcccaatgg taccaacgat gttccctcca ccaaaggtgt tcttatg 657

Claims

1.一种合成D-葡萄糖二酸的酿酒酵母基因工程菌，其特征在于，以酿酒酵母BY4741的opi1缺失株为出发菌株，将拟南芥（Arabidopsis thaliana）来源的肌醇加氧酶和丁香假单胞菌来源的糖醛酸脱氢酶通过linker连接，然后整合至酿酒酵母opi1缺失株的基因组上；

所述肌醇加氧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述糖醛酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述linker为GSGEAAAKEAAAK、PTPTPTPTPTPTPTP或EAAAAKEAAAAKEAAAAK。

2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述肌醇加氧酶和糖醛酸脱氢酶通过linker融合后替换opi1缺失株的OPI1基因启动子。

3.根据权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述OPI1基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.一种生产葡萄糖二酸的方法，其特征在于，应用权利要求1~3任一所述的酿酒酵母基因工程菌作为发酵微生物，以葡萄糖为底物生产葡萄糖二酸。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，将所述基因工程菌按照1~2%的接种量接种至发酵培养基中，于28~30℃、200~250 rpm，培养160~240小时。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，用于接种的种子液按如下方法制备：将单菌落接种于YPD培养基中，28~30℃，200~250rpm，培养20~24h。

7.根据权利要求4~6任一所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的碳源为葡萄糖，初始浓度为15~25 g/L；在发酵24小时和36小时补加葡萄糖，使发酵体系中的葡萄糖浓度≥5 g/L。

8.权利要求1~3任一所述的酿酒酵母基因工程菌或权利要求4~7任一所述的方法在制备葡萄糖二酸或含有葡萄糖二酸的产品方面的应用。