CN116103175A - 一种发酵生产三乙酸内酯的酵母工程菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种发酵生产三乙酸内酯的酵母工程菌及其应用。所述工程菌以毕赤酵母GS115为出发菌株，导入2‑吡喃酮合成酶编码基因Gh2PS，同时过表达乙酰辅酶A羧化酶基因ScACC1，进一步提高Gh2PS拷贝数，得到所述毕赤酵母工程菌。本发明开发的毕赤酵母工程菌可高效生产三乙酸内酯，其摇瓶发酵产量达到2.72g/L，1L发酵罐发酵最高产量达到9.72g/L。本发明构建了一种发酵生产三乙酸内酯的毕赤酵母工程菌，为后续开发高效合成高价值平台化合物三乙酸内酯的毕赤酵母底盘菌株奠定了基础。

Description

一种发酵生产三乙酸内酯的酵母工程菌及其应用

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种发酵生产三乙酸内酯的酵母工程菌及其应用。

背景技术

三乙酸内酯(Triacetic acid lactone，TAL)，化学名为4-羟基-6-甲基-2-吡喃酮，分子式为C₆H₆O₃，是一种聚酮类化合物，发现于非洲雏菊(Gerbera hybrida)植物宿主内。三乙酸内酯作为一种潜在的可再生平台化合物可经一系列反应生成更多高附加值化合物，如广藿香酮和山梨酸等，是许多食品添加剂、抗生素和燃料添加剂的直接前体，以及一些双官能团化合物的中间体，主要应用于化工、材料、食品、医药等领域。

目前，三乙酸内酯的合成主要有植物提取法、化学合成法及生物合成法。植物提取法所获得的三乙酸内酯直接提取自非洲雏菊，但该方法所需原料多、占地面积广，且最终提取产率低、产量少。化学合成法主要由乙酸的热解反应产生，然而，该反应过程使用的有害催化剂及产生的有毒副产物阻碍了该方法应用于三乙酸内酯的工业化合成。生物合成法主要通过微生物发酵合成，具有环境友好、副产物少、生产成本低等优势。因此，开发合适的工程宿主菌株用于三乙酸内酯的生物合成对于顺应当下的可持续发展要求具有较大意义。三乙酸内酯的生物合成法由非洲雏菊来源的III型的聚酮合酶(PKS)一2-吡喃酮合成酶(2-PS)催化合成，由Gh2PS基因编码，催化两分子的丙二酰辅酶A(Malonyl-CoA)和一分子的乙酰辅酶A(Acetyl-CoA)缩合生成产物一分子的三乙酸内酯。目前，已有诸多文献报道了在不同宿主中引入Gh2PS构建重组基因工程菌株应用于三乙酸内酯的生物合成，包括但不限于大肠杆菌、酿酒酵母、解脂耶氏酵母、圆红酵母等。例如，公告号为CN113403213A的专利申请公开了一株利用木糖生产三乙酸内酯的重组解脂耶氏酵母菌株及其应用。所述工程菌以解脂耶氏酵母为出发菌株，导入2-吡喃酮合成酶编码基因gh2ps，同时过表达木糖还原酶编码基因、木糖醇脱氢酶编码基因以及木酮糖激酶编码基因，得到重组解脂耶氏酵母工程菌。进一步优化发酵过程，开发了解脂耶氏酵母利用木糖产三乙酸内酯的最佳生产工艺，并使其产量达到目前报道摇瓶中的最高水平，产量在3g/L～6g/L之间。截止目前，三乙酸内酯的最高产量由解脂耶氏酵母发酵产生，最高产量达35.9g/L，产量高达葡萄糖发酵时理论产量的43％。

毕赤酵母是一种甲基营养型非常规酵母，并具有外分泌蛋白表达量高且适于高密度发酵等特点，近年来，随着毕赤酵母诸多组成型启动子的陆续表征、CRISPR/Cas9基因编辑技术的开发，构建毕赤酵母工程菌株用于高附加值生物技术产品的合成受到越来越多的关注。然而，利用基因工程方法在毕赤酵母中引入Gh2PS和乙酰辅酶A羧化酶编码基因ScACC1构建酵母工程菌株用于三乙酸内酯的生物合成仍未见报道。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明开发了一种发酵生产三乙酸内酯的酵母工程菌，并提供该菌株以葡萄糖为碳源生产三乙酸内酯的方法。

本发明提供的技术方案之一，是提供一种发酵生产三乙酸内酯的酵母工程菌，以酵母作为出发菌株，用过导入基因构建获得所述酵母工程菌，导入基因包括以下任意一组：(1)2-吡喃酮合成酶Gh2PS的编码基因；(2)2-吡喃酮合成酶Gh2PS的编码基因和乙酰辅酶A羧化酶ScACC1的编码基因。

利用基因编辑技术导入2-吡喃酮合成酶Gh2PS的编码基因，表达2-吡喃酮合成酶实现毕赤酵母胞内合成三乙酸内酯，其次，通过相同方法导入乙酰辅酶A羧化酶ScACC1的编码基因，过表达乙酰辅酶A羧化酶提高前体丙二酰辅酶A的合成，最后，通过增加Gh2PS基因拷贝数解除三乙酸内酯合成途经中的限速步骤，构建得到重组酵母工程菌。优选的，导入基因中2-吡喃酮合成酶Gh2PS的编码基因为1个或多个拷贝。更为优选的，导入基因中2-吡喃酮合成酶Gh2PS的编码基因为l～6个拷贝。

优选的，所述出发菌株为毕赤酵母、酿酒酵母或解脂耶氏酵母。更为优选的，所述出发菌株为毕赤酵母，例如毕赤酵母GS115菌株。所述2-吡喃酮合成酶的编码基因为植物源基因，包括但不限于来源于非洲雏菊(Gerbera hybrida)的2-吡喃酮合成酶Gh2PS的编码基因，序列如SEQ ID NO.1所示，所述乙酰辅酶A羧化酶的编码基因为酵母异源基因，包括但不限于来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的乙酰辅酶A羧化酶ScACC1的编码基因，序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了所述发酵生产三乙酸内酯的酵母工程菌的构建方法，导入基因包括2-吡喃酮合成酶Gh2PS的编码基因和乙酰辅酶A羧化酶ScACCl的编码基因，所述构建方法包括以下步骤：(1)将2-吡喃酮合成酶Gh2PS的编码基因序列整合到毕赤酵母GSll5-Cas9的基因组中，获得菌株GTAL-1；(2)将乙酰辅酶A羧化酶ScACC1的编码基因序列整合到菌株GTAL-1中，获得菌株GTAL-2；(3)将1个单拷贝的2-吡喃酮合成酶Gh2PS的编码基因序列整合到菌株GTAL-2中，获得菌株GTAL-3；(4)将1个单拷贝的2-吡喃酮合成酶Gh2PS的编码基因序列整合到菌株GTAL-3中，获得菌株GTAL-4；再将1个单拷贝的2-吡喃酮合成酶Gh2PS的编码基因序列整合到菌株GTAL-4中，获得菌株GTAL-5；再将1个单拷贝的2-吡喃酮合成酶Gh2PS的编码基因序列整合到菌株GTAL-5中，获得菌株GTAL-6；(5)将1个单拷贝的2-吡喃酮合成酶Gh2PS的编码基因序列整合到菌株GTAL-6中，获得菌株GTAL-7，即所述发酵生产三乙酸内酯的酵母工程菌。构建过程中使用的启动子为pTEF1，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；终止子为t0547或tAOXl，所述终止子t0547的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述终止子tAOX1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明还提供了所述发酵生产三乙酸内酯的酵母工程菌在制备三乙酸内酯中的应用。本发明还提供了一种制备三乙酸内酯的方法，发酵培养权利要求1～5任一项所述的发酵生产三乙酸内酯的酵母工程菌，并提取获得三乙酸内酯。具体的发酵培养方法为：以体积百分比计，将所述酵母工程菌按1％～5％接种量接种于50mL YPD摇瓶中培养，在30℃、250rpm条件下，发酵培养72h。

本发明基于现有技术具有以下优点：

(1)本发明开发了能够高效生产三乙酸内酯的毕赤酵母基因工程菌，其摇瓶发酵产量近2.72g/L，1L发酵罐发酵产量最高可达9.72g/L。

(2)本发明通过过表达合成途经的限速酶、提高前体供应及增加限速酶基因拷贝数的策略，提高三乙酸内酯生物和成途经的代谢通量。

(3)本发明利用毕赤酵母高效生产三乙酸内酯，具有周期短、环境友好及生产成本低等优点。为后续开发高效合成高价值平台化合物三乙酸内酯的毕赤酵母底盘菌株奠定了基础。

附图说明

图1为毕赤酵母中三乙酸内酯生物合成途经示意图。

图2为外源导入关键酶表达盒示意图。

图3为质粒pZ-panARS-hcas9-sgRNA(ADE2)的图谱。

图4为质粒pGAP-HsCas9-SV40的图谱。

图5为质粒Int-pTEF1-tAOX1的图谱。

图6为质粒Int-pTEF1-t0547的图谱。

图7为质粒HZP-sgRNA的图谱。

图8为三乙酸内酯的HPLC检测吸收峰图。

图9为毕赤酵母工程菌株摇瓶发酵的产量图。

图10为毕赤酵母工程菌株GTAL-7的1L发酵罐发酵产量图。

具体实施方式

三乙酸内酯的生物合成途经如图1所示，外源导入关键酶表达盒如图2所示，详细合成途经详见实施例。

表1 本发明所涉及引物序列

实施例1：毕赤酵母重组菌株GS115-Cas9的构建

构建Cas9基因表达的重组载体pGAP-Cas9，将其转入到毕赤酵母GS115中，得到毕赤酵母重组菌株GS115-Cas9，具体实施方法如下：

(1)重组载体pGAP-Cas9的构建

来自化脓链球菌经人密码子优化的Cas9基因核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，以实验室保存的pZ-panARS-hcas9-sgRNA(ADE2)(实验室保存，质粒图谱见图3)质粒为模板，设计引物pGAP-Cas9-F/pGAP-Cas9-R扩增Cas9基因表达盒pGAP-hCas9-tDAS1，利用GibsonAssembl_y方法将其与通用骨架(氨苄青霉素抗性基因表达盒加原核生物基因质粒的复制起始位点ori)、His4基因进行组装，转化大肠杆菌DH5α菌株，构建得到Cas9基因表达重组载体，命名为pGAP-HsCas9-SV40(质粒图谱见图4)。

(2)毕赤酵母重组菌株GS115-Cas9的构建

将重组载体pGAP-Cas9利用限制性内切酶SalI酶切载体成为线性化片段，通过Lin-Cereghino电转化方法将线性化片段转入到实验室保存的毕赤酵母GS115感受态细胞中，构建得到毕赤酵母GS115-Cas9。

实施例2：三乙酸内酯毕赤酵母工程菌株GTAL-1的构建

所述Int均指的是毕赤酵母GS115基因组插入位点，所使用到的辅助质粒Int-pTEF1-tAOX1、Int-pTEF1-t0547由通用骨架(氨苄青霉素抗性基因表达盒及原核生物基因的复制起始位点ori)、位点上下游500bp同源臂以及pTEF1-BamHI-tAOX1、pTEF1-HindIII-NdeI-t0547组成(质粒图谱见图5，图6)；辅助质粒HZP-sgRNA由通用骨架、抗性基因表达盒、位点对应的sgRNA序列以及两个BsaI酶切位点组成，Z代表博来霉素抗性基因(质粒图谱见图7)；P为plasmid(质粒)。

构建高表达2-吡喃酮合成酶的编码基因Gh2PS的表达盒以及对应的guide质粒，将其转化到毕赤酵母GS115-Cas9中，构建得到三乙酸内酯毕赤酵母工程菌株GTAL-l，具体实施如下：

(1)Int1-pTEF1-Gh2PS-t0547的构建

2-吡喃酮合成酶的编码基因Gh2PS由金斯瑞生物科技有限公司合成，以Gh2PS为模板，设计引物Gh2PS-F/Gh2PS-R，扩增得到Gh2PS(序列如SEQ ID NO.1所示)，利用GibsonAssembly方法将Gh2PS片段与HindlII、NdeI双酶切后的辅助质粒Int1-pTEFl-t0547(实验室保存，Int1左侧基因PAS_FragB_0066，右侧基因PAS_FragB_0067)进行连接，构建得到2-吡喃酮合成酶的编码基因Gh2PS整合所用的辅助质粒Int1-pTEFl-Gh2PS-t0547。

(2)HZP-sgRNA-Int1的构建

以质粒HZP-sgRNA为模板，设计引物sgRNA-Int1-F/sgRNA-Int1-R，引物通过退火结合为双线DNA片段sgRNA-Int1(sgRNA序列为5’-tatctgaagtatttactggg-3’)，通过T4-PNK酶连方法将sgRNA-Int1与BsaI酶切后的载体进行连接，构建得到HZP-sgRNA-Int1。

(3)三乙酸内酯毕赤酵母工程菌株GTAL-1的构建

以Int1-pTEF1-Gh2PS-t0547为模板设计引物Int1-Gh2PS-F和Int1-Gh2PS-R，PCR扩增用于同源重组的目的基因表达盒，命名为Int1-Gh2PS-donor。将Int1-Gh2PS-donor与HZP-sgRNA-Int1共同转入毕赤酵母GS115-Cas9中，构建得到三乙酸内酯毕赤酵母工程菌株GTAL-1。

实施例3：三乙酸内酯毕赤酵母工程菌株GTAL-2的构建

构建高表达乙酰辅酶A羧化酶的编码基因ScACC1的表达盒以及对应的guide质粒，将其转化到上述三乙酸内酯毕赤酵母工程菌株GTAL-1中，最终得到三乙酸内酯毕赤酵母工程菌株GTAL-2，具体实施如下：

(1)Int39-pTEFl-ScACC1-tAOXl的构建

以酿酒酵母基因组为模板，设计引物ScACCI-F/ScACCI-R，扩增得到ScACC1(序列如SEQ ID NO.2所示)，利用GibsonAssembly方法将ScACCl片段与BamHI酶切后的辅助质粒Int39-pTEF1-tAOX1(实验室保存，Int39左侧基因PAS_chr1-4_0294，右侧基因PAS_chr1-4_0295)进行连接，构建得到乙酰辅酶A羧化酶的编码基因ScACC1整合所用的辅助质粒Int39-pTEF1-ScACC1-tAOX1。

(2)HZP-sgRNA-Int39的构建

以质粒HZP-sgRNA为模板，设计引物sgRNA-Int39-F/sgRNA-Int39-R，引物通过退火结合为双线DNA片段sgRNA-Int39(sgRNA序列为5’-gattcagtagagtcctattg-3’)，通过T4-PNK酶连方法将sgRNA-Int39与BsaI酶切后的载体进行连接，构建得到HZP-sgRNA-Int39。

(3)三乙酸内酯毕赤酵母工程菌株GTAL-2的构建

以Int39-pTEF1-ScACC1-tAOX1为模板设计引物Int39-ScACC1-F/Int39-ScACC1-R，PCR扩增用于同源重组的目的基因表达盒，命名为Int39-ScACC1-donor。将Int39-ScACC1-donor与HZP-sgRNA-Int39共同转入毕赤酵母工程菌株GTAL-l中，构建得到三乙酸内酯毕赤酵母工程菌株GTAL-2。

实施例4：三乙酸内酯毕赤酵母工程菌株GTAL-3的构建

再增加一拷贝Gh2PS，获得高表达2-吡喃酮合成酶的编码基因Gh2PS的表达盒以及构建对应的guide质粒，将其转化到毕赤酵母GTAL-2中，构建得到三乙酸内酯毕赤酵母工程菌株GTAL-3，具体实施如下：

(1)HZP-sgRNA-Int11的构建

以质粒HZP-sgRNA为模板，设计引物sgRNA-Int11-F/sgRNA-Int11-R，引物通过退火结合为双线DNA片段sgRNA-Int11(sgRNA序列为5’-tattaaaaaagacgatcccg-3’，Int11左侧基因PAS_chr30154，右侧基因PAS_chr3_1156)，通过T4-PNK酶连方法将sgRNA-Int11与BsaI酶切后的载体进行连接，构建得到HZP-sgRNA-Int11。

(2)三乙酸内酯毕赤酵母工程菌株GTAL-3的构建

以实施例1所述方法构建得到的2-吡喃酮合成酶的编码基因Gh2PS整合所用的辅助质粒Int1--pTEF1-Gh2PS-t0547为模板设计引物Int11-Gh2PS-F/Int11-Gh2PS-R，PCR扩增用于同源重组的目的基因表达盒，命名为Int11-Gh2PS-donor。将Int11-Gh2PS-donor与HZP-sgRNA-Intl1共同转入毕赤酵母GTAL-2中，构建得到三乙酸内酯毕赤酵母工程菌株GTAL-3。

实施例5：三乙酸内酯毕赤酵母工程菌株GTAL-4的构建

再增加一拷贝Gh2PS，获得高表达2-吡喃酮合成酶的编码基因Gh2PS的表达盒以及构建对应的guide质粒，将其转化到毕赤酵母GTAL-3中，构建得到三乙酸内酯毕赤酵母工程菌株GTAL-4，具体实施如下：

(1)HZP-sgRNA-Int20的构建

以质粒HZP-sgRNA为模板，设计引物sgRNA-Int20-F/sgRNA-Int20-R，引物通过退火结合为双线DNA片段sgRNA-Int20(sgRNA序列为5’-agaagaaaatgcgaaacagg-3’，Int20左侧基因PAS_chr4_0467，右侧基因PAS_chr4_0465)，通过T4-PNK酶连方法将sgRNA-Int20与BsaI酶切后的载体进行连接，构建得到HZP-sgRNA-Int20。

(2)三乙酸内酯毕赤酵母工程菌株GTAL-4的构建

以实施例1所述方法构建得到的2-吡喃酮合成酶的编码基因Gh2PS整合所用的辅助质粒Int1-pTEF1-Gh2PS-t0547为模板设计引物Int20-Gh2PS-F/Int20-Gh2PS-R，PCR扩增用于同源重组的目的基因表达盒，命名为Int20-Gh2PS-donor。将Int20-Gh2PS-donor与HZP-sgRNA-Int20共同转入毕赤酵母GTAL-3中，构建得到三乙酸内酯毕赤酵母工程菌株GTAL-4。

实施例6：三乙酸内酯毕赤酵母工程菌株GTAL-5的构建

再增加一拷贝Gh2PS，获得高表达2-吡喃酮合成酶的编码基因Gh2PS的表达盒以及构建对应的guide质粒，将其转化到毕赤酵母GTAL-4中，构建得到三乙酸内酯毕赤酵母工程菌株GTAL-5，具体实施如下：

(1)HZP-sgRNA-Int32的构建

以质粒HZP-sgRNA为模板，设计引物sgRNA-Int32-F/sgRNA-Int32-R，引物通过退火结合为双线DNA片段sgRNA-Int32(sgRNA序列为5’-gtgacgaaagagatgaggtg-3’，Int32左侧基因PAS_chr2-2_0142，右侧基因PAS_chr2-2_0143)，通过T4-PNK酶连方法将sgRNA-Int32与BsaI酶切后的载体进行连接，构建得到HZP-sgRNA-Int32。

(2)三乙酸内酯毕赤酵母工程菌株GTAL-5的构建

以实施例1所述方法构建得到的2-吡喃酮合成酶的编码基因Gh2PS整合所用的辅助质粒Int1-pTEF1-Gh2PS-t0547为模板设计引物Int32-Gh2PS-F/Int32-Gh2PS-R，PCR扩增用于同源重组的目的基因表达盒，命名为Int32-Gh2PS-donor。将Int32-Gh2PS-donor与HZP-sgRNA-Int32共同转入毕赤酵母GTAL-4中，构建得到三乙酸内酯毕赤酵母工程菌株GTAL-5。

实施例7：三乙酸内酯毕赤酵母工程菌株GTAL-6的构建

再增加一拷贝Gh2PS，获得高表达2-吡喃酮合成酶的编码基因Gh2PS的表达盒以及构建对应的guide质粒，将其转化到毕赤酵母GTAL-5中，构建得到三乙酸内酯毕赤酵母工程菌株GTAL-6，具体实施如下：

(1)HZP-sgRNA-Int33的构建

以质粒HZP-sgRNA为模板，设计引物sgRNA-Int33-F/sgRNA-Int33-R，引物通过退火结合为双线DNA片段sgRNA-Int33(sgRNA序列为5’-ccgtcactatgaggacaaag-3’，Int33左侧基因PAS_chr1-1_0054，右侧基因PAS_chr1-1_0053)，通过T4-PNK酶连方法将sgRNA-Int33与BsaI酶切后的载体进行连接，构建得到HZP-sgRNA-Int33。

(2)三乙酸内酯毕赤酵母工程菌株GTAL-6的构建

以实施例1所述方法构建得到的2-吡喃酮合成酶的编码基因Gh2PS整合所用的辅助质粒Int1--pTEF1-Gh2PS-t0547为模板设计引物Int33-Gh2PS-F/Int33-Gh2PS-R，PCR扩增用于同源重组的目的基因表达盒，命名为Int33-Gh2PS-donor。将Int33-Gh2PS-donor与HZP-sgRNA-Int33共同转入毕赤酵母GTAL-5中，构建得到三乙酸内酯毕赤酵母工程菌株GTAL-6。

实施例8：三乙酸内酯毕赤酵母工程菌株GTAL-7的构建

再增加一拷贝Gh2PS，获得高表达2-吡喃酮合成酶的编码基因Gh2PS的表达盒以及构建对应的guide质粒，将其转化到毕赤酵母GTAL-6中，构建得到三乙酸内酯毕赤酵母工程菌株GTAL-7，具体实施如下：

(1)HZP-sgRNA-Int34的构建

以质粒HZP-sgRNA为模板，设计引物sgRNA-Int34-F/sgRNA-Int34-R，引物通过退火结合为双线DNA片段sgRNA-Int34(sgRNA序列为5’-gatcagttcattgatagaca-3’，Int34左侧基因PAS_chr3_0054，右侧基因PAS_chr3_0053)，通过T4-PNK酶连方法将sgRNA-Int34与BsaI酶切后的载体进行连接，构建得到HZP-sgRNA-Int34。

(2)三乙酸内酯毕赤酵母工程菌株GTAL-7的构建

以实施例1所述方法构建得到的2-吡喃酮合成酶的编码基因Gh2PS整合所用的辅助质粒Int1--pTEF1-Gh2PS-t0547为模板设计引物Int34-Gh2PS-F/Int34-Gh2PS-R，PCR扩增用于同源重组的目的基因表达盒，命名为Int34-Gh2PS-donor。将Int34-Gh2PS-donor与HZP-sgRNA-Int34共同转入毕赤酵母GTAL-6中，构建得到三乙酸内酯毕赤酵母工程菌株GTAL-7。

实施例9：毕赤酵母工程菌高效生产三乙酸内酯

如实施例1-7中得到的毕赤酵母工程菌株，在YPD平板上划线活化，挑取单菌落接种于5mL YPD液体试管中，在30℃、250rpm条件下，发酵培养12h，将工程菌种子液按1～5％接种量接种于50mL YPD摇瓶中培养，在30℃、250rpm条件下，发酵培养72h，处理样品进行HPLC产物分析。将毕赤酵母工程菌株GTAL-7进行1L发酵罐补料分批发酵，得到高浓度产物。

具体实施如下：

(1)毕赤酵母工程菌株的摇瓶发酵

从YPD平板上挑取活化的GS115-Cas9、GTAL-1、GTAL-2、GTAL-3、GTAL-4、GTAL-5、GTAL-6、GTAL-7单菌落，接种于5mL YPD试管中，30℃、250rpm摇床中培养12h，将种子液以1％接种量接种至50mL YPD摇瓶培养基中，每个菌三个平行，30℃、250rpm摇床中培养72h。发酵结束后，收集发酵液用于样品处理及后续HPLC产物分析。

(2)毕赤酵母工程菌株GTAL-7的1L发酵罐补料分批发酵

从YPD平板上挑取活化的GTAL-7单菌落，种于5mL YPD试管中，30℃、250rpm摇床中培养12h，将种子液以1％接种量接种至50mL YPD摇瓶培养基中，每个菌三个平行，30℃、250rpm摇床中培养12h作为种子液，将种子液泵入1L发酵罐中(装液量600mL)，接种完成后，将此时的溶氧定标为100％，同时接好补料瓶(YPD)、酸瓶(醋酸)、碱瓶(氨水)。在发酵过程中，维持培养温度30℃，罐压为0.8个大气压，通气量控制在3vvm，通过流加25％的氨水或18％的醋酸控制罐内pH控制在5.5～6.0之间，通过控制搅拌转速200～800rpm使DO维持在10～20％，溶氧和pH通过DO电极和pH电极进行检测。每隔4h取一次发酵液样品，测定含糖量及OD₆₀₀值，确定补料的流速，当培养基中葡萄糖质量分数降至1％后流加质量分数为40％(v/v)的葡萄糖溶液，控制以上条件直至发酵结束。

(3)三乙酸内酯的HPLC检测

样品处理：从摇瓶中去1mL发酵液至1.5mL EP管中，12000rpm离心1min，取10μL发酵液上清于990μL ddH₂O稀释100倍，震荡混匀。用注射器吸取样品稀释液，通过0.22μm水系滤膜过滤杂质，转移至液相小瓶中用于后续HPLC检测。

HPLC检测条件：PDA检测器设置光波长280nm，色谱柱为C18，柱温为35℃，流速0.6mL/min，流动相A为0.1％乙酸溶液，流动相B为纯甲醇。

HPLC检测程序：初始流动相A为95％、流动相B为5％；0.0～6.8min，流动相A从95％降至75％，流动相B从5％升至25％，6.8～7.8min，流动相A从75％降至5％，流动相B从25％升至95％；7.8～16.0min，流动相A从5％升至95％，流动相B从95％降至5％。

(4)毕赤酵母工程菌的摇瓶发酵产量

表2 各菌株发酵生产三乙酸内酯的产量

按照(1)、(2)中所述方法进行毕赤酵母工程菌株发酵，采用(3)中检测方法进行产物的HPLC检测。三乙酸内酯检测吸收峰图如图8所示，毕赤酵母工程菌株摇瓶发酵的产量如图9和表2所示，毕赤酵母工程菌株GTAL-7的1L发酵罐发酵产量及OD曲线如图10所示。

按照(1)所述培养方法对菌株GS115-Cas9、GTAL-1、GTAL-2、GTAL-3、GTAL-4、GTAL-5、GTAL-6、GTAL-7进行发酵培养，结果显示，除了菌株GSll5-Cas9不发酵生产三乙酸内酯，其他菌株均发酵生产三乙酸内酯，尤其是菌株GTAL-7生产三乙酸内酯的产量最高，达到2.72g/L。

按照(2)中所述方法对毕赤酵母工程菌株GTAL-7进行1L发酵罐分批补料发酵，结果如图10显示，经过88h发酵后测得的最终OD₆₀₀值达到65，三乙酸内酯的最高产量达到9.72g/L。相比于该菌株的摇瓶发酵结果，发酵罐培养的OD₆₀₀值提高了2倍，三乙酸内酯的最高产量提高了2.33倍。本发明构建了一种发酵生产三乙酸内酯的毕赤酵母工程菌，为后续开发高效合成高价值平台化合物三乙酸内酯的毕赤酵母底盘菌株奠定了基础。

Claims (10)

1.一种发酵生产三乙酸内酯的酵母工程菌，其特征在于，以酵母作为出发菌株，用过导入基因构建获得所述酵母工程菌，导入基因包括以下任意一组：

(1)2-吡喃酮合成酶Gh2PS的编码基因；

(2)2-吡喃酮合成酶Gh2PS的编码基因和乙酰辅酶A羧化酶ScACC1的编码基因。

2.如权利要求l所述的发酵生产三乙酸内酯的酵母工程菌，其特征在于，导入基因中2-吡喃酮合成酶Gh2PS的编码基因为1个或多个拷贝。

3.如权利要求1所述的发酵生产三乙酸内酯的酵母工程菌，其特征在于，导入基因中2-吡喃酮合成酶Gh2PS的编码基因为1～6个拷贝。

4.如权利要求1所述的发酵生产三乙酸内酯的酵母工程菌，其特征在于，所述出发菌株为毕赤酵母、酿酒酵母或解脂耶氏酵母。

5.如权利要求1所述的发酵生产三乙酸内酯的酵母工程菌，其特征在于，所述2-吡喃酮合成酶Gh2PS的编码基因序列如SEQ ID NO.1所示，所述乙酰辅酶A羧化酶ScACC1的编码基因序列如SEQ ID NO.2所示。

6.如权利要求1～5任一所述发酵生产三乙酸内酯的酵母工程菌的构建方法，其特征在于，导入基因包括2-吡喃酮合成酶Gh2PS的编码基因和乙酰辅酶A羧化酶ScACC1的编码基因，所述构建方法包括以下步骤：

(1)将2-吡喃酮合成酶Gh2PS的编码基因序列整合到毕赤酵母GS115-Cas9的基因组中，获得菌株GTAL-1；

(2)将乙酰辅酶A羧化酶ScACCl的编码基因序列整合到菌株GTAL-1中，获得菌株GTAL-2；

(3)将1个单拷贝的2-吡喃酮合成酶Gh2PS的编码基因序列整合到菌株GTAL-2中，获得菌株GTAL-3；

(4)将1个单拷贝的2-吡喃酮合成酶Gh2PS的编码基因序列整合到菌株GTAL-3中，获得菌株GTAL-4；再将1个单拷贝的2-吡喃酮合成酶Gh2PS的编码基因序列整合到菌株GTAL-4中，获得菌株GTAL-5；再将1个单拷贝的2-吡喃酮合成酶Gh2PS的编码基因序列整合到菌株GTAL-5中，获得菌株GTAL-6；

(5)将1个单拷贝的2-吡喃酮合成酶Gh2PS的编码基因序列整合到菌株GTAL-6中，获得菌株GTAL-7，即所述发酵生产三乙酸内酯的酵母工程菌。

7.如权利要求6所述的构建方法，其特征在于，构建过程中使用的启动子为pTEF1；终止子为t0547或tAOX1。

8.如权利要求1～5任一所述发酵生产三乙酸内酯的酵母工程菌在制备三乙酸内酯中的应用。

9.一种制备三乙酸内酯的方法，其特征在于，发酵培养权利要求1～5任一项所述的发酵生产三乙酸内酯的酵母工程菌，并提取获得三乙酸内酯。

10.如权利要求9所述制备三乙酸内酯的方法，其特征在于，发酵培养方法为：以体积百分比计，将所述酵母工程菌按1％～5％接种量接种于50mL YPD摇瓶中培养，在30℃、250rpm条件下，发酵培养72h。

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