CN107881123B - 一株利用甲醇生产丙酮酸的基因工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents

一株利用甲醇生产丙酮酸的基因工程菌及其构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株可利用甲醇生产丙酮酸的基因工程菌，它是在宿主菌中导入甲醇氧化酶基因aox、过氧化氢酶基因cta、二羟基丙酮合酶基因das、二羟基丙酮激酶基因dak。利用本发明的方法构建的重组酿酒酵母在以甲醇为唯一碳源的条件下，菌体细胞量明显增加，且能生成丙酮酸。本发明的方法为利用廉价碳资源生产有机酸的合成的研究奠定了基础。

Description

一株利用甲醇生产丙酮酸的基因工程菌及其构建方法与应用
技术领域
本发明属于生物工程领域，特别涉及一株利用甲醇生产丙酮酸的基因工程菌及其构建方法与应用。
背景技术
丙酮酸(Pyruvic acid)，又称α-氧代丙酸，是一种重要的有机小分子，也是一种酸性较弱的有机酸,分子中同时具有羰基和羧基两个官能团,它除具有羧酸和酮的性质外,还具有α-酮酸的性质,是最简单的α-酮酸，属于羰基酸。丙酮酸也是体内产生的三碳酮酸，它是糖酵解途径的最终产物，在细胞浆中还原成乳酸供能，或进入线粒体内氧化生成乙酰辅酶A，进入三羧酸循环，被氧化成二氧化碳和水，完成葡萄糖的有氧氧化供能过程。因此，丙酮酸是糖代谢中具有关键作用的中间产物。丙酮酸可通过乙酰辅酶A和三羧酸循环实现体内糖、脂肪和氨基酸间的互相转化。因此丙酮酸在三大营养物质的代谢联系中起着重要的枢纽作用，是所有生物细胞糖代谢及体内多种物质相互转化的重要中间体，因分子中包含活化酮和羧基基团，所以作为一种基本化工原料广泛应用于化学、制药、食品、农业及环保等各个领域中，可通过化学合成和生物技术多种方法制备。同时有研究已表明，丙酮酸可作为一种抗氧化剂抑制鼠体内氧自由基的氧化作用。
与化学合成法和酶转化法相比,微生物发酵法因原料来源广,能耗低,污染少,成本低而更具有优越性，因而被广泛研究。在丙酮酸生产菌株中，酿酒酵母由于其遗传背景清楚，易操作易调控，培养基要求简单，菌株耐受性好等优点，近年来被广泛用于研究以获得丙酮酸生产菌株。微生物代谢过程中,主要利用糖类积累丙酮酸，但这些糖类物质的成本较高，限制了微生物法制备丁二酸的工业化。因此，若能以廉价的还原性底物为原料，可以在一定程度上降低成本。
甲醇是煤化工产业中的重要产品，近年来，随着甲醇生产工艺的发展，使得甲醇的价格持续走低，因而利用甲醇作为发酵原料成为生物转化过程降低成本的重要突破口。因此，若能通过合成生物学手段，将甲醇代谢模块引入酿酒酵母中，以甲醇作为唯一碳源生产丙酮酸，为利用廉价碳资源生产有机酸的合成的研究奠定了基础。
技术方案
本发明要解决的技术问题是提供一种利用合成生物学方法构建可以利用甲醇作为唯一碳源进行代谢的菌株，并利用该菌株好氧发酵生产丙酮酸，解决了甲醇利用型菌株不能生产有机酸的技术问题。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一株利用甲醇生产丙酮酸的基因工程菌，它是在宿主菌种导入甲醇氧化酶基因aox1、二羟基丙酮合酶基因das、过氧化氢酶基因cta、二羟基丙酮激酶基因dak。
其中，甲醇氧化酶aox1将甲醇氧化成甲醛，消耗大量氧气伴随生成过氧化氢；过氧化氢在过氧化氢酶cta的催化下转化成氧气和水；甲醛和木酮糖-5磷酸在二羟基丙酮合酶das的催化下转化成二羟基丙酮；随后二羟基丙酮在二羟基丙酮激酶dak的催化下转化成磷酸二羟丙酮，然后进一步代谢成果糖-6-磷酸，进而进入糖酵解途径参与物质循环和有机酸代谢。
其中，所述宿主菌为酿酒酵母，所述酿酒酵母优选酿酒酵母Saccharomycescerevisiae TAM ura3△Pdc-菌株，该菌株为荷兰Delft大学Antonius J.A.van Maris教授馈赠，以该菌株为出发菌可生产135g/L丙酮酸，发表论文题目为Directed Evolution ofPyruvate Decarboxylase-Negative Saccharomyces cerevisiae,Yielding a C2-Independent,Glucose-Tolerant,and Pyruvate-Hyperproducing Yeast，其具体信息已经在论文中详细公开。
其中，所述甲醇氧化酶基因aox1的GenBank登记号为XM_002494226.1；
所述二羟基丙酮合酶基因das的GenBank登记号为FJ752551.1；
所述过氧化氢酶基因cta的GenBank登记号为AB472085.1；
所述二羟基丙酮激酶基因的GenBank登记号为XM_002493026.1。
其中，所述甲醇氧化酶基因aox1、二羟基丙酮合酶基因das、过氧化氢酶基因cta、二羟基丙酮激酶基因的启动子序列分别选自PGK1p、TDH3p、PDC1p、FBA1p中的一种，但上述基因的启动子不仅可以使用上述四种启动子，也可以使用其他类型的启动子；
甲醇氧化酶基因aox1、二羟基丙酮合酶基因das、过氧化氢酶基因cta、二羟基丙酮激酶基因的终止子序列分别选自CYC1t、PGK1t、TDH2t、ENO2t中的一种，以上四种基因的终止子不仅可以使用上述四种终止子，也可以使用其他类型的终止子。
上述利用甲醇生产丙酮酸的基因工程菌的构建方法如下：
(1)构建如下四种表达框：PGK1p-aox1-CYC1t、TDH3p-das-PGK1t、PDC1p-cta-TDH2t、FBA1p-dak-ENO2t，在使用重叠PCR将上述四种表达框、上游同源臂δ1、下游同源臂δ2、G418抗生素筛选标记基因组合成重组基因片段；所述上游同源臂δ1的基因序列如SEQ IDNo.33所示，下游同源臂δ2的基因序列如SEQ ID No.34所示，G418抗生素筛选标记基因的基因序列如SEQ ID No.35所示；
(2)将步骤(1)得到的重组基因片段转化至宿主细胞，并整合至宿主细胞基因组δ位点中，使用G418抗生素筛选重组菌，得到利用甲醇生产丙酮酸的基因工程菌。通过提取转化子的基因组进行PCR来筛选得到重组菌。
上述利用甲醇生产丙酮酸的基因工程菌在发酵产丙酮酸中的应用在本发明的保护范围之内。
其中，利用该菌株发酵产丙酮酸的方法如下：
(1a)试管种子培养：将利用甲醇生产丙酮酸的基因工程菌接种到试管的种子培养基中，30℃培养18～22h；
(2a)摇瓶种子培养：将试管种子培养基接种到摇瓶的种子培养基中，30℃培养22～26h；
(3a)发酵产丙酮酸：将摇瓶种子培养液进行离心，去除上清种子培养基，并用灭菌水清洗菌体2次，并离心获得菌泥。将菌泥重悬于发酵培养基中，30℃培养72～74h。
其中，所述种子培养基为YPD培养基，其配方如下：20g/L葡萄糖,10g/L酵母粉20g/L蛋白胨，溶剂为水。
其中，所述发酵培养基的配方如下：5g/L硫酸铵，3g/L磷酸二氢钾，0.5g/L七水硫酸镁，15mg/L乙二胺四乙酸，4.5mg/L七水硫酸锌，0.3mg/L六水氯化钴，1mg/L四水氯化锰，0.3mg/L五水硫酸铜，4.5mg/L二水氯化钙，3mg/L七水硫酸亚铁，0.4mg/L二水钼酸钠，1mg/L硼酸，0.1mg/L碘化钾，0.15g/L尿嘧啶，10g/L甲醇，溶剂为水。有益效果：
通过利用合成生物学的方法将甲醇的代谢途径引入酿酒酵母中，从而实现酿酒酵母以非食品级原料甲醇作为唯一碳源生产丙酮酸，为实现甲醇替代葡萄糖工业化发酵生产丙酮酸提供了思路，在一定程度上降低了生产成本，具有重大的社会意义和经济价值。
附图说明
图1重组表达框连接示意图。
图2提基因组PCR验证，泳道1、2、3、4分别为基因aox、cta、das、dak PCR验证。
图3原始菌和重组菌在摇瓶中甲醇消耗趋势图。
图4原始菌和重组菌在摇瓶中细胞量变化趋势图。
图5原始菌的丙酮酸液相检测图，9.033min为丙酮酸出峰时间。
图6重组菌的丙酮酸液相检测图，9.033min为丙酮酸出峰时间。
具体实施方式
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊情况说明，均可从商业途径中获得。
pMD-19T载体：本实验自主保存。
酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae TAM ura3△Pdc-菌株为荷兰Delft大学Antonius J.A.van Maris馈赠，以该菌株为出发菌可生产135g/L丙酮酸，发表论文题目为Directed Evolution of Pyruvate Decarboxylase-Negative Saccharomycescerevisiae,Yielding a C2-Independent,Glucose-Tolerant,and Pyruvate-Hyperproducing Yeast，其具体信息已经在论文中详细公开。
实施例1：表达基因与启动子、终止子的获得
(1)以毕赤酵母Pichia pastoris基因组为模板，设计引物扩增甲醇氧化酶aox1、二羟基丙酮合酶das、过氧化氢酶cta、二羟基丙酮激酶dak。
(2)以酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae基因组为模板，设计引物扩增启动子PGK1p、TDH3p、PDC1p、FBA1p，终止子CYC1t、PGK1t、TDH2t、ENO2t、上游同源臂δ1、下游同源臂δ2。
Figure BDA0001372728320000041
Figure BDA0001372728320000051
实施例2：利用合成生物学方法构建重组酿酒酵母S.c-aox-das-cta-dak
为了能够快速有效的实现多基因的共同表达并保证基因表达的稳定性，利用DNA集合的方法将基因表达框整合进酿酒酵母基因组中。
1、设计引物进行扩增，分别在每个基因两端加上启动子、终止子的同源臂，设计上下游引物，基因与引物序列见表1。
表1基因与引物序列对照表
Figure BDA0001372728320000052
2、设计引物进行扩增，在启动子、终止子上加上所连基因同源臂，设计上下游引物，基因名称与扩增引物编号如下：
Figure BDA0001372728320000053
Figure BDA0001372728320000061
3、进行重叠PCR，组成启动子-基因-终止子的表达框PGK1p-aox1-CYC1t、TDH3p-das-PGK1t、PDC1p-cta-TDH2t、FBA1p-dak-ENO2t，上述启动子-基因-终止子的表达框就是将所示的启动子、基因、终止子使用重叠PCR的方法依次组合连接组成表达片段，例如启动子PGK1p序列之后连接甲醇氧化酶基因aox1基因序列，然后再连接终止子CYC1t序列，在不影响启动子、基因、终止子功能的情况下，其中间可以插入其他碱基序列。
4、将四个表达框与pMD-19T载体做连接，转化至E.coli DH5α中，经质粒酶切和菌落PCR验证，将验证正确的质粒送至测序公司进行测序。
5、将测序正确的质粒，设计引物扩增出表达框，将上游同源臂δ1、G418抗生素筛选标记基因、PGK1p-aox1-CYC1t、TDH3p-das-PGK1t、PDC1p-cta-TDH2t、FBA1p-dak-ENO2t、下游同源臂δ2用重叠PCR的方法整合成一个基因重组片段，将该基因重组片段电转化进入酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae TAM ura3△Pdc-中，1g/LG418抗生素筛选得到重组酿酒酵母S.c-aox-das-cta-dak，以实现基因的同时表达，进而实现甲醇的代谢，以酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae TAM ura3△Pdc-作为对照菌株进行发酵性能考察。
实施例3：重组菌株的发酵实验。
(1)试管种子培养：将重组酿酒酵母S.c-aox-das-cta-dak按1％(v/v)接种量从冻存管接种到试管种子培养基中，试管装液量5mL，30℃有氧培养20h，获得试管种子培养液。
(2)摇瓶种子培养：将重组酿酒酵母S.c-aox-das-cta-dak按1％(v/v)接种量从试管培养基接种到摇瓶种子培养基中，250mL三角瓶装液量50mL，30℃有氧培养24h，获得摇瓶种子培养液。
(3)发酵产丙酮酸：将摇瓶种子培养液倒入100mL离心管中，使用4℃离心机8000rpm/min离心10min，离心后将上清去除，并使用缓冲液重悬菌泥，再次使用4℃离心机8000rpm/min离心10min，重复以上操作1次，后以发酵培养基重悬菌泥，250mL三角瓶装液量50mL，发酵温度为30℃，发酵时间为72h，发酵结果如图2和图3所示。结果表明，当以甲醇为唯一碳源时，重组酿酒酵母共消耗甲醇1.04g/L，菌体细胞提高了3.13％，并检测到0.26g/L丙酮酸，液相结果如图4。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京工业大学
<120> 一株利用甲醇生产丙酮酸的基因工程菌及其构建方法与应用
<130> SG20170728
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<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P17
<400> 17
ctcgaaaatt ctgcgttcgt taaacctaag taacctattc aaagtaatat ctc 53
<210> 18
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P18
<400> 18
tgttgtccat ttaggtggtt gagacatttt gattgatttg actgtgttat tttgcg 56
<210> 19
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P19
<400> 19
gaggtgactc tgcagcaaga ttgtagattt aactccttaa gttactttaa tg 52
<210> 20
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P20
<400> 20
caattattta gtactgtcag tattgttatg cgaaaagcca attagtgtga tactaag 57
<210> 21
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P21
<400> 21
tagtatcaca ctaattggct tttcgcataa caatactgac agtactaaat aattgcc 57
<210> 22
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P22
<400> 22
cttgtaatcc caatgtttac tagacatttt gaatatgtat tacttggtta tgg 53
<210> 23
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P23
<400> 23
gcatacttca aatctgaaac caagttgtag agtgctttta actaagaatt attagtc 57
<210> 24
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P24
<400> 24
caattacatc aaaatccaca ttctctttaa ggtatcatct ccatctccca tatgc 55
<210> 25
<211> 781
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PGK1启动子
<400> 25
tattttagat tcctgacttc aactcaagac gcacagatat tataacatct gcacaatagg 60
catttgcaag aattactcgt gagtaaggaa agagtgagga actatcgcat acctgcattt 120
aaagatgccg atttgggcgc gaatccttta ttttggcttc accctcatac tattatcagg 180
gccagaaaaa ggaagtgttt ccctccttct tgaattgatg ttaccctcat aaagcacgtg 240
gcctcttatc gagaaagaaa ttaccgtcgc tcgtgatttg tttgcaaaaa gaacaaaact 300
gaaaaaaccc agacacgctc gacttcctgt cttcctattg attgcagctt ccaatttcgt 360
cacacaacaa ggtcctagcg acggctcaca ggttttgtaa caagcaatcg aaggttctgg 420
aatggcggga aagggtttag taccacatgc tatgatgccc actgtgatct ccagagcaaa 480
gttcgttcga tcgtactgtt actctctctc tttcaaacag aattgtccga atcgtgtgac 540
aacaacagcc tgttctcaca cactcttttc ttctaaccaa gggggtggtt tagtttagta 600
gaacctcgtg aaacttacat ttacatatat ataaacttgc ataaattggt caatgcaaga 660
aatacatatt tggtcttttc taattcgtag ttttttcaag ttcttagatg ctttcttttt 720
ctcttttttt acagatcatc aaggaagtaa ttatctactt tttacaacaa atataaaaac 780
a 781
<210> 26
<211> 700
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 启动子TDH3p
<400> 26
ataaaaaaca cgctttttca gttcgagttt atcattatca atactgccat ttcaaagaat 60
acgtaaataa ttaatagtag tgattttcct aactttattt agtcaaaaaa ttagcctttt 120
aattctgctg taacccgtac atgcccaaaa tagggggcgg gttacacaga atatataaca 180
tcgtaggtgt ctgggtgaac agtttattcc tggcatccac taaatataat ggagcccgct 240
ttttaagctg gcatccagaa aaaaaaagaa tcccagcacc aaaatattgt tttcttcacc 300
aaccatcagt tcataggtcc attctcttag cgcaactaca gagaacaggg gcacaaacag 360
gcaaaaaacg ggcacaacct caatggagtg atgcaacctg cctggagtaa atgatgacac 420
aaggcaattg acccacgcat gtatctatct cattttctta caccttctat taccttctgc 480
tctctctgat ttggaaaaag ctgaaaaaaa aggttgaaac cagttccctg aaattattcc 540
cctacttgac taataagtat ataaagacgg taggtattga ttgtaattct gtaaatctat 600
ttcttaaact tcttaaattc tacttttata gttagtcttt tttttagttt crtaaaacac 660
caagaactta gtttcgaata aacacacata aacaaacaaa 700
<210> 27
<211> 850
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 启动子PDC1p
<400> 27
aagtaaccta ttcaaagtaa tatctcatac atgtttcatg agggtaacaa catgcgactg 60
ggtgagcata tgttccgctg atgtgatgtg caagataaac aagcaaggca gaaactaact 120
tcttcttcat gtaataaaca caccccgcgt ttatttacct atctctaaac ttcaacacct 180
tatatcataa ctaatatttc ttgagataag cacactgcac ccataccttc cttaaaaacg 240
tagcttccag tttttggtgg ttccggcttc cttcccgatt ccgcccgcta aacgcatatt 300
tttgttgcct ggtggcattt gcaaaatgca taacctatgc atttaaaaga ttatgtatgc 360
tcttctgact tttcgtgtga tgaggctcgt ggaaaaaatg aataatttat gaatttgaga 420
acaattttgt gttgttacgg tattttacta tggaataatc aatcaattga ggattttatg 480
caaatatcgt ttgaatattt ttccgaccct ttgagtactt ttcttcataa ttgcataata 540
ttgtccgctg cccctttttc tgttagacgg tgtcttgatc tacttgctat cgttcaacac 600
caccttattt tctaactatt ttttttttag ctcatttgaa tcagcttatg gtgatggcac 660
atttttgcat aaacctagct gtcctcgttg aacataggaa aaaaaaatat ataaacaagg 720
ctctttcact ctccttgcaa tcagatttgg gtttgttccc tttattttca tatttcttgt 780
catattcctt tctcaattat tattttctac tcataacctc acgcaaaata acacagtcaa 840
atcaatcaaa 850
<210> 28
<211> 630
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 启动子FBA1p
<400> 28
ataacaatac tgacagtact aaataattgc ctacttggct tcacatacgt tgcatacgtc 60
gatatagata ataatgataa tgacagcagg attatcgtaa tacgtaatag ttgaaaatct 120
caaaaatgtg tgggtcatta cgtaaataat gataggaatg ggattcttct atttttcctt 180
tttccattct agcagccgtc gggaaaacgt ggcatcctct ctttcgggct caattggagt 240
cacgctgccg tgagcatcct ctctttccat atctaacaac tgagcacgta accaatggaa 300
aagcatgagc ttagcgttgc tccaaaaaag tattggatgg ttaataccat ttgtctgttc 360
tcttctgact ttgactcctc aaaaaaaaaa aatctacaat caacagatcg cttcaattac 420
gccctcacaa aaactttttt ccttcttctt cgcccacgtt aaattttatc cctcatgttg 480
tctaacggat ttctgcactt gatttattat aaaaagacaa agacataata cttctctatc 540
aatttcagtt attgttcttc cttgcgttat tcttctgttc ttctttttct tttgtcatat 600
ataaccataa ccaagtaata catattcaaa 630
<210> 29
<211> 249
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 终止子CYC1
<400> 29
atcatgtaat tagttatgtc acgcttacat tcacgccctc cccccacatc cgctctaacc 60
gaaaaggaag gagttagaca acctgaagtc taggtcccta tttatttttt tatagttatg 120
ttagtattaa gaacgttatt tatatttcaa atttttcttt tttttctgta cagacgcgtg 180
tacgcatgta acattatact gaaaaccttg cttgagaagg ttttgggacg ctcgaaggct 240
ttaatttgc 249
<210> 30
<211> 283
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 终止子PGK1
<400> 30
aaattgaatt gaattgaaat cgatagatca atttttttct tttctctttc cccatccttt 60
acgctaaaat aatagtttat tttatttttt gaatattttt tatttatata cgtatatata 120
gactattatt tatcttttaa tgattattaa gatttttatt aaaaaaaaat tcgctcctct 180
tttaatgcct ttatgcagtt tttttttccc attcgatatt tctatgttcg ggttcagcgt 240
attttaagtt taataactcg aaaattctgc gttcgttaaa cct 283
<210> 31
<211> 400
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 终止子TDH2
<400> 31
atttaactcc ttaagttact ttaatgattt agtttttatt attaataatt catgctcatg 60
acatctcata tacacgttta taaaacttaa atagattgaa aatgtattaa agattcctca 120
gggattcgat ttttttggaa gtttttgttt ttttttcctt gagatgctgt agtatttggg 180
aacaattata caatcgaaag atatatgctt acattcgacc gttttagccg tgatcattat 240
cctatagtaa cataacctga agcataactg acactactat catcaatact tgtcacatga 300
gaactctgtg aataattagg ccactgaaat ttgatgcctg aaggaccggc atcacggatt 360
ttcgataaag cacttagtat cacactaatt ggcttttcgc 400
<210> 32
<211> 400
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 终止子ENO2
<400> 32
agtgctttta actaagaatt attagtcttt tctgcttatt ttttcatcat agtttagaac 60
actttatatt aacgaatagt ttatgaatct atttaggttt aaaaattgat acagttttat 120
aagttacttt ttcaaagact cgtgctgtct attgcataat gcactggaag gggaaaaaaa 180
aggtgcacac gcgtggcttt ttcttgaatt tgcagtttga aaaataacta catggatgat 240
aagaaaacat ggagtacagt cactttgaga accttcaatc agctggtaac gtcttcgtta 300
attggatact caaaaaagat ggatagcatg aatcacaaga tggaaggaaa tgcgggccac 360
gaccacagtg atatgcatat gggagatgga gatgatacct 400
<210> 33
<211> 320
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 上游同源臂δ1
<400> 33
aaaaatcaac tatcggctgg caactaatag ggacactacc aatatattat catatacggt 60
gttagacgat gacataagat acgaggaact gtcatcgaag ttagaggaag ctgaaatgca 120
aggattgata atgtaatagg ataatgaaac atataaaacg gaatgaggaa taatcgtaat 180
attagtatat agagataaag attccatttt gaggattcct atatcctcga ggagaacttc 240
tagtatattc tgtatacctg atattatagc ctttaccaac aatagaatcc caccaattat 300
ctcaaaattc accagtatct 320
<210> 34
<211> 330
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 下游同源臂δ2
<400> 34
taaagagaat gtggattttg atgtaattgt tgggattcca ttgtgattaa ggctataata 60
ttaggtatgt agaaagtact agaagttctc ctccaggatt taggaatcca taaaagggaa 120
tctgcaattc tacacaattc tataaatatt attatcatca ttttatatgt taatattcat 180
tgatcctatt acattatcaa tccttgcgtt tcagcttcca ctaatttaga tgactatttc 240
tcatcatttg cgtcatcttc taacaccgta tatgataata tactagtaac gtaaatacta 300
gttagtagat gatagttgat ttttattcca 330
<210> 35
<211> 1600
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 筛选标记基因
<400> 35
tcgtacgctg caggtcgaca acccttaata taacttcgta taatgtatgc tatacgaagt 60
tattaggtct agagatctgt ttagcttgcc tcgtccccgc cgggtcaccc ggccagcgac 120
atggaggccc agaataccct ccttgacagt cttgacgtgc gcagctcagg ggcatgatgt 180
gactgtcgcc cgtacattta gcccatacat ccccatgtat aatcatttgc atccatacat 240
tttgatggcc gcacggcgcg aagcaaaaat tacggctcct cgctgcagac ctgcgagcag 300
ggaaacgctc ccctcacaga cgcgttgaat tgtccccacg ccgcgcccct gtagagaaat 360
ataaaaggtt aggatttgcc actgaggttc ttctttcata tacttccttt taaaatcttg 420
ctaggataca gttctcacat cacatccgaa cataaacaac catgggtaag gaaaagactc 480
acgtttcgag gccgcgatta aattccaaca tggatgctga tttatatggg tataaatggg 540
ctcgcgataa tgtcgggcaa tcaggtgcga caatctatcg attgtatggg aagcccgatg 600
cgccagagtt gtttctgaaa catggcaaag gtagcgttgc caatgatgtt acagatgaga 660
tggtcagact aaactggctg acggaattta tgcctcttcc gaccatcaag cattttatcc 720
gtactcctga tgatgcatgg ttactcacca ctgcgatccc cggcaaaaca gcattccagg 780
tattagaaga atatcctgat tcaggtgaaa atattgttga tgcgctggca gtgttcctgc 840
gccggttgca ttcgattcct gtttgtaatt gtccttttaa cagcgatcgc gtatttcgtc 900
tcgctcaggc gcaatcacga atgaataacg gtttggttga tgcgagtgat tttgatgacg 960
agcgtaatgg ctggcctgtt gaacaagtct ggaaagaaat gcataagctt ttgccattct 1020
caccggattc agtcgtcact catggtgatt tctcacttga taaccttatt tttgacgagg 1080
ggaaattaat aggttgtatt gatgttggac gagtcggaat cgcagaccga taccaggatc 1140
ttgccatcct atggaactgc ctcggtgagt tttctccttc attacagaaa cggctttttc 1200
aaaaatatgg tattgataat cctgatatga ataaattgca gtttcatttg atgctcgatg 1260
agtttttcta atcagtactg acaataaaaa gattcttgtt ttcaagaact tgtcatttgt 1320
atagtttttt tatattgtag ttgttctatt ttaatcaaat gttagcgtga tttatatttt 1380
ttttcgcctc gacatcatct gcccagatgc gaagttaagt gcgcagaaag taatatcatg 1440
cgtcaatcgt atgtgaatgc tggtcgctat actgctgtcg attcgatact aacgccgcca 1500
tccagtgtcg aaaacgagct ctcgagaacc cttaatataa cttcgtataa tgtatgctat 1560
acgaagttat taggtgatat cagatccact agtggcctat 1600
<210> 36
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P25
<400> 36
tgttggaata aaaatcaact atcggctggc aactaatagg gacactacca 50
<210> 37
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P26
<400> 37
taagggttgt cgacctgcag cgtacgaaga tactggtgaa ttttgagata attggt 56
<210> 38
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P27
<400> 38
gcatatggga gatggagatg ataccttaaa gagaatgtgg attttgatgt aattg 55
<210> 39
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P28
<400> 39
aaaaaaaagt tccgagtaat taatgttgag atatgttgga ataaaaatca ac 52
<210> 40
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P29
<400> 40
accaattatc tcaaaattca ccagtatctt cgtacgctgc aggtcgacaa ccctta 56
<210> 41
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P30
<400> 41
cttgagttga agtcaggaat ctaaaataat aggccactag tggatctgat atcacct 57

Claims (7)

1.一株利用甲醇生产丙酮酸的基因工程菌，其特征在于，它是在宿主菌中导入甲醇氧化酶基因aox1、二羟基丙酮合酶基因das、过氧化氢酶基因cta、二羟基丙酮激酶基因dak；
所述甲醇氧化酶基因aox1、二羟基丙酮合酶基因das、过氧化氢酶基因cta、二羟基丙酮激酶基因dak的GenBank登记号分别为XM_002494226.1、FJ752551.1、AB472085.1、XM_002493026.1；
其中，所述宿主菌为酿酒酵母。
2.根据权利要求1所述的利用甲醇生产丙酮酸的基因工程菌，其特征在于，所述甲醇氧化酶基因aox1、二羟基丙酮合酶基因das、过氧化氢酶基因cta、二羟基丙酮激酶基因dak的启动子序列分别选自PGK1p、TDH3p、PDC1p、FBA1p中的一种；
甲醇氧化酶基因aox1、二羟基丙酮合酶基因das、过氧化氢酶基因cta、二羟基丙酮激酶基因dak的终止子序列分别选自CYC1t、PGK1t、TDH2t、ENO2t中的一种。
3.权利要求1~2任一所述的利用甲醇生产丙酮酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1) 构建如下四种表达框：PGK1p- aox1-CYC1t、TDH3p-das- PGK1t、PDC1p-cta-TDH2t、FBA1p-dak-ENO2t，再 使用重叠PCR将上述四种表达框、上游同源臂δ1、下游同源臂δ2、筛选标记基因组合成重组基因片段；
(2) 将步骤（1）得到的重组基因片段转化至宿主细胞，筛选重组菌，得到利用甲醇生产丙酮酸的基因工程菌。
4.权利要求1~2任一所述利用甲醇生产丙酮酸的基因工程菌在发酵产丙酮酸中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，包括以下步骤：
(1a) 试管种子培养：将利用甲醇生产丙酮酸的基因工程菌接种到试管的种子培养基中，30 ℃培养18~22 h；
(2a) 摇瓶种子培养：将试管种子培养基接种到摇瓶的种子培养基中，30 ℃培养22~26h；
(3a) 发酵产丙酮酸：将摇瓶种子培养液进行离心，去除上清种子培养基，并用灭菌水清洗菌体2次，并离心获得菌泥，将菌泥重悬于发酵培养基中，30 ℃培养72~74h。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述种子培养基为YPD培养基，其配方如下：20 g/L葡萄糖,10 g/L酵母粉 20 g/L蛋白胨，溶剂为水。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基的配方如下：5 g/L硫酸铵，3 g/L磷酸二氢钾，0.5 g/L七水硫酸镁，15 mg/L乙二胺四乙酸，4.5 mg/L七水硫酸锌，0.3 mg/L六水氯化钴，1 mg/L四水氯化锰，0.3 mg/L五水硫酸铜，4.5 mg/L二水氯化钙，3mg/L七水硫酸亚铁，0.4 mg/L二水钼酸钠，1 mg/L硼酸，0.1 mg/L碘化钾，0.15 g/L尿嘧啶，10 g/L甲醇，溶剂为水。
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