CN110951794B - 一种提高酿酒酵母工程菌生产葡萄糖二酸的发酵方法 - Google Patents

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    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
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Abstract

本发明公开了一种提高酿酒酵母工程菌生产葡萄糖二酸的发酵方法，属于生物工程技术领域。本发明是以产葡萄糖二酸酿酒酵母工程菌Bga‑001为出发菌株，优化了其发酵培养条件，发现发酵培养基初始葡萄糖浓度为20g/L，添加10g/L的肌醇，添加100mM MgCl2时葡萄糖二酸的产量最高，摇瓶发酵条件下葡萄糖二酸的产量为6g/L,5L发酵罐中葡萄糖二酸的产量可达12g/L。本发明中葡萄糖二酸的生物制造具有污染少、产品质量高等优点，极具发展前景，这对于葡萄糖二酸的工业化生产具有重要的应用意义。

Description

一种提高酿酒酵母工程菌生产葡萄糖二酸的发酵方法
技术领域
本发明涉及一种提高酿酒酵母工程菌生产葡萄糖二酸的发酵方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
葡萄糖二酸(Glucaric acid，GA)是一种自然界存在的二元酸，其在医疗和工业中有着广泛的应用，比如降胆固醇、治疗糖尿病、肿瘤治疗等，或可能用作聚合物前体，包括新型尼龙和高度分支聚酯。因此，在美国太平洋西北国家实验室、国家再生能源实验室和美国能源部写的一份报告中，葡萄糖二酸被认为是“最具价值的生物炼制产品(top value-added chemicals from biomass)之一”。由于该有机酸的重要性，正越来越得到学术界和工业界的重视。
葡萄糖化学氧化法合成葡萄糖二酸存在非选择性、高成本、得率低、需高温以及副产物多不利于分离等问题。虽然有研究发现催化剂五氧化二钒、4-乙酰氨基-2,2,6,6-四甲基-1-二苯哌酯等可以提高葡糖二酸的得率，但是这些催化剂太昂贵。生物法合成葡糖二酸相较于传统的化学法，有着很多的优势，比如更加环境友好，更大的实现低成本生产的可能性。目前报道的全生物法合成葡萄糖二酸主要在大肠杆菌和一些真菌中进行，大肠杆菌中合成葡萄糖二酸的产量被许多因素限制。酿酒酵母相较于大肠杆菌，具有更高的工业应用价值，一方面酿酒酵母的耐酸能力强于大肠杆菌，另一方面酿酒酵母本身可以作为单细胞蛋白用于饲料、食品等。酿酒酵母还具有其它优点，如耐低温、可低pH发酵、没有噬菌体感染、适合大规模发酵、易分离和高抗逆性等特点。因而酿酒酵母已经广泛用于产有机酸的研究，如ρ-羟基苯甲酸、ρ-氨基苯甲酸、ρ-羟基苯丙烯酸和青蒿酸等10-13。通过酿酒酵母代谢工程制备葡萄糖二酸具有2个优势，一是细胞本身含有葡糖糖二酸合成途径中的肌醇-1-磷酸合成酶Ino1，二是酵母能够利用葡萄糖-6-磷酸合成肌醇。目前对于通过酿酒酵母代谢工程制备葡萄糖二酸研究的相关报道比较少，Prather课题组将外源MIOX和UDH基因引入酿酒酵母细胞进行异源表达实现了通过葡萄糖和外加肌醇在酿酒酵母细胞中产葡萄糖二酸，但是其
产量在上罐培养条件下只有1.6g/L。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一种提高酿酒酵母工程菌株产葡糖二酸的发酵方法，是在酿酒酵母发酵环境中加入终浓度20～100mmol/L镁离子进行发酵，或将酿酒酵母接种至含有20～100mmol/L镁离子的环境中进行发酵。
在一种实施方式中，所述酿酒酵母为酿酒酵母Bga-001，已公开于公开号为CN108220176A的专利申请文件中。
在一种实施方式中，所述发酵培养基的碳源为葡萄糖。
在一种实施方式中，按下述方法制备种子液：将单菌落接种于YPD培养基中，于28～30℃，200～250rpm，摇床培养20～24h。
在一种实施方式中，将种子液按照5％的接种量(v/v)接种到发酵培养基中，28～30℃、摇床转速200～250rpm，培养160～240小时。
在一种实施方式中，将所述酿酒酵母接种至YPD培养基中，200～250rpm，28～30℃过夜培养至OD600为4.8～5.2，按5％的接种量转接使初始OD600值为0.5，初始培养基体积YPD为3L，肌醇浓度10.8g/L，温度为30℃，pH控制在4以上，转速700rpm-800rpm，通气量3L/min。
在一种实施方式中，发酵培养基中含有100mM的MgCl2。
在一种实施方式中，发酵过程中补加10g/L的葡萄糖。
在一种实施方式中，发酵过程中在发酵的24小时和48小时分别补加葡萄糖，使发酵体系中的葡萄糖终浓度为10g/L。
本发明还要求保护所述方法在制备葡萄糖二酸或其衍生产品方面的应用。
本发明具有如下优点：本发明提供的生产葡萄糖二酸的发酵优化策略可以同时应用于摇瓶和发酵罐生产葡萄糖二酸的过程中，使葡萄糖二酸的产量从6g/L提高到12g/L，同时使菌体的生物量提高一倍左右。此外，它们还可以用于研究镁离子促进酿酒酵母细胞生长的分子机理。
附图说明
图1酿酒酵母工程菌Bga-001的摇瓶发酵条件下生长曲线；图中所示的曲线为工程菌Bga-001在摇瓶发酵中，添加及未添加100mM的MgCl2时的菌体生长情况。
图2酿酒酵母工程菌Bga-001的摇瓶发酵条件下葡萄糖二酸产量；图中所示的曲线为工程菌Bga-001在摇瓶发酵中，添加及未添加100mM的MgCl2时不同发酵时间的葡萄糖二酸的积累情况。
图3酿酒酵母工程菌Bga-001的5L发酵罐葡萄糖二酸发酵结果；图中所示曲线为工程菌Bga-001在5L发酵罐中，添加及未添加100mM的MgCl2时不同发酵时间菌体生长和葡萄糖二酸积累情况。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
本申请用于培养和发酵的酿酒酵母Bga-001已公开于公开号为CN108220176A的专利申请文件中。
YPD培养基组成：每升YPD培养基含有20g蛋白胨，20g葡萄糖和10g酵母提取物，定容后1×105Pa灭菌20min。固体培养基每升加入20g的琼脂粉。
发酵培养基组成：YPD培养基组成外加10.8g/L的肌醇。
葡萄糖二酸的测定方法：取发酵液1mL，高速离心10min，保留上清液并用0.22μm规格的滤膜过滤，滤液即为样品。即可通过液相色谱-质谱连用(LC-MS)检测，或通过高效液相色谱(HPLC)检测，以5mM硫酸为流动相，色谱柱为有机酸柱(Aninex Hpx-87H ion exchangecolumn)，柱温55℃，示差折光检测器，进样量30μL，流速0.6mL/min。
实施例1：初始葡萄糖浓度的确定
1、种子液制备：甘油保藏的菌种于平板上划线，挑取单菌落接种于10mL的YPD培养基中，30℃，250rpm，摇床培养24h即为种子液。
2、发酵条件：将种子液按照5％的接种量接种到含有50mL液体培养基的250mL的锥形瓶中，发酵培养基中的葡萄糖浓度为20g/L，并加入10.8g/L的肌醇。30℃、摇床转速250rpm，培养240小时。
实施例2：添加不同离子对葡萄糖二酸产量的影响
1、种子液制备：甘油保藏的菌种于平板上划线，挑取单菌落接种于10mL的YPD培养基中，30℃，250rpm，摇床培养24h即为种子液。
2、发酵条件：将种子液按照5％的接种量接种到含有50mL液体培养基的250mL的锥形瓶中，发酵培养基含有20g/L的葡萄糖和10.8g/L的肌醇。分别加入0.5mM MnCl2、2mMZnCl2、20mM MgCl2、50mM MgCl2、100mM MgCl2、40mM CaCl2、100mM CaCl2和200mM CaCl2。30℃、摇床转速250rpm，培养240小时。
葡萄糖二酸产量检测结果如下表，添加100mM MgCl2时葡萄糖二酸的产量最高，为6.07g/L。
表1添加不同离子对葡萄糖二酸产量的影响
Figure BDA0002350422310000031
实验过程中，还尝试加入200mM氯化镁，或更高浓度的MnCl2或ZnCl2，结果显示，提高MnCl2或ZnCl2的浓度会对微生物细胞起到毒害作用，抑制细胞生长；而MgCl2的添加量为100mM～200mM对于葡萄糖二酸产量的影响大致相同。
实施例3：5L发酵罐扩大培养提高葡糖二酸产量
将酿酒酵母接种至40ml YPD培养基中，250rpm 30℃过夜培养至OD600约为5.0左右，按5％转接后使初始OD600值为0.25，初始培养基体积YPD为3L，肌醇浓度为10.8g/L，添加100mM MgCl2，温度为30℃，pH控制在4以上，转速700rpm-800rpm，通气量3L/min。工程菌发酵过程中，在24小时和48小时补加终浓度为10g/L的葡萄糖。发酵240h，最终产量12g/L。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (8)

1.一种提高酿酒酵母产葡萄糖二酸的发酵方法，其特征在于，将酿酒酵母Bga-001在含有葡萄糖、肌醇和终浓度20~100 mmol/L镁离子的环境中发酵；所述酿酒酵母Bga-001是以酿酒酵母BY4741为出发菌株，敲除OPI基因，以组成型质粒PY26-TEF-GPD分别将拟南芥(Arabidopsis thaliana)来源的肌醇加氧酶和丁香假单胞菌来源的糖醛酸脱氢酶整合至酿酒酵母BY4741基因组的Delta1和Delta2位点，所述Delta1和Delta2片段分别含有SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将酿酒酵母接种至发酵培养基中，28~30℃，pH≥4，发酵至少160 h。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述接种是使初始OD600值达0.5。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述接种是接种酿酒酵母种子液；所述种子液按下述方法制备：将单菌落接种于YPD培养基中，于28~30℃，200~250rpm培养20~24h。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基含有8~12 g/L肌醇、15~25g/L蛋白胨、15~25 g/L葡萄糖和8~12 g/L酵母提取物。
6.根据权利要求2~5任一所述的方法，其特征在于，发酵过程中补加葡萄糖。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，分别在发酵的24小时和48小时补加葡萄糖，使发酵体系中的葡萄糖终浓度为10 g/L。
8.权利要求1~7任一所述方法在制备葡萄糖二酸中的应用。
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