CN103388009B - 利用克雷伯氏肺炎杆菌生产r-乙偶姻的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用克雷伯氏肺炎杆菌生产R-乙偶姻的方法，是在好氧条件下，通过乙偶姻还原酶基因budC失活的克雷伯氏肺炎杆菌发酵生产R-乙偶姻。本发明的方法，原料为可再生的碳源，而且原料的转化率高，产物R-乙偶姻终浓度高，同时生产的R-乙偶姻具有很高的光学纯度，R-异构体在总乙偶姻中含量大于98%。
Description
技术领域
本发明涉及一种生产R-乙偶姻的方法，特别是涉及一种利用克雷伯氏肺炎杆菌（Klebsiella pneumoniae）生产R-乙偶姻的方法。
背景技术
乙偶姻化学名称3-羟基-2-丁酮，在自然界中天然存在于玉米、苹果、香蕉和葡萄等水果中，也存在于干酪、肉类等食品中。乙偶姻具有特殊的香味，作为食用香料是安全的食品添加剂。乙偶姻用于奶油、干酪、咖啡等香味增强剂，以及配制奶油、酸奶的香精【韩丽，赵祥颖，刘建军.乙偶姻的性质、生产及应用.山东轻工业学院学报，2007，21（4），80-83】。
目前，乙偶姻的合成方法主要有两大类，化学合成法和生物合成法。化学合成法中使用的原料包括2,3-丁二酮（双乙酰）、2,3-丁二醇和乙醛等。利用2,3-丁二酮为原料，通过还原反应可以获得乙偶姻，还原剂可以采用锌等金属、NaHSe和氢气等。利用2,3-丁二醇为原料通过氧化反应获得乙偶姻，可以采用电化学氧化以及歧化反应等制备【张小舟，曾崇余，任晓乾.乙偶姻合成研究现状及展望.江苏化工，2001,29（2）29-31】。另外，以乙醛为原料在噻唑盐为催化剂条件下可以合成乙偶姻，并具有较高的反应选择性和产品纯度【孙芝.乙醛催化合成乙偶姻方法.中国发明专利申请公开号CN1562934A）。
乙偶姻分子结构中具有一个手性碳，乙偶姻具有两种手性异构体，R构型和S构型。目前，利用化学方法以2,3-丁二酮和乙醛为原料制备的乙偶姻不具有立体选择性，合成的乙偶姻是两种立体异构体的混合物。
生物法生产乙偶姻可以采用2,3-丁二醇为原料，以敲除葡萄糖脱氢酶的氧化葡萄糖酸杆菌静息细胞为催化剂，通过12小时的反应可以获得31.3g/L的乙偶姻【张敏华，韦柳静，祝坤，花强.氧化葡萄糖酸杆菌GDHK的葡萄糖培养基优化及其催化2,3-丁二醇生成乙偶姻的性能研究.高校化学工程学报，2012，26（4），692-697】。以2,3-丁二醇为原料的生物催化氧化合成的乙偶姻的立体构型与原料2,3-丁二醇的立体构型相关。
以双乙酰为原料，通过酶催化反应可以获得乙偶姻。利用来源于氧化葡萄糖杆菌的羰基还原酶，结合来源与枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶，采用双乙酰为底物，通过酶催化可以获得12.2g/L的S-乙偶姻，反应时间75分钟【Gao,C.,Zhang,L.,Xie,Y.,Hu,C.,Zhang,Y.,Li,L.,Wang,Y.,Ma,C.,Xu,P.,2013.Production of(3S)-acetoin from diacetyl by using stereoselectiveNADPH-dependent carbonyl reductase and glucose dehydrogenase.Bioresource Technology,137,111-115】。在大肠杆菌中表达来源于多粘芽孢杆菌的双乙酰还原酶，利用双乙酰为原料，可以合成S-乙偶姻，其光学纯度达到99.9%。在流加批次发酵中可以获得39.4g/L的S-乙偶姻（Gao,J.,Xu,Y.,Li,F.,Ding,G.,2013.Production of S-cetoin from diacetyl by Escherichia colitransformant cells that express the diacetyl reductase gene of Paenibacillus polymyxa ZJ-9.Lettersin applied microbiology,DOI:10.1111/lam.12107）。
生物法生产乙偶姻中，可以以葡萄糖等为原料利用微生物发酵进行生产。利用野生型枯草芽孢杆菌，经过诱变后获得了突变株，突变株可以发酵生产46.9g/L的乙偶姻，并且菌株的副产物并没有2,3-丁二醇和双乙酰（Xu,H.,Jia,S.,Liu,J.,2011.Development of a mutant strainof Bacillus subtilis showing enhanced production of acetoin.Afr J Biotechnol,10,779-788）。利用枯草芽孢杆菌，利用bdhA和acoA基因缺失，高水平表达alsSD操纵子等构建的工程菌株利用50g/L的葡萄糖为底物，可以生成20g/L的乙偶姻（Wang,M.,Fu,J.,Zhang,X.,Chen,T.,2012.Metabolic engineering of Bacillus subtilis for enhanced production of acetoin.Biotechnology letters,34,1877-1885）。利用沙雷氏菌为生产菌株，在菌株中表达外源的生成水的NADH氧化酶，可以提高菌株乙偶姻的积累降低2,3-丁二醇的产量，利用批次补料发酵，可以产生75.2g/L的乙偶姻（Sun,J.-A.,Zhang,L.-Y.,Rao,B.,Shen,Y.-L.,Wei,D.-Z.,2012.Enhanced acetoinproduction by Serratia marcescens H32with expression of a water-forming NADH oxidase.Bioresource Technology,119,94-98）。这些研究报道中没有对乙偶姻的立体构型进行分析说明。
克雷伯氏肺炎杆菌可以利用葡萄糖和甘油等为原料合成乙偶姻。在克雷伯氏肺炎杆菌等微生物中，存在乙偶姻生物合成途径，该途径以丙酮酸为初始底物。首先，两分子丙酮酸在乙酰乳酸合成酶的催化下合成乙酰乳酸，乙酰乳酸在乙酰乳酸脱羧酶的催化下生成乙偶姻，乙偶姻可以进一步还原生成2,3-丁二醇。通常情况下，克雷伯氏肺炎杆菌发酵的主要代谢产物是2,3-丁二醇，乙偶姻积累水平很低（XiaoZijun，Xu Ping.Acetoin Metabolism in Bacteria.Critical Reviews in Microbiology,2007,33:127–140）。
目前，乙偶姻的生物生产方法中，利用克雷伯氏肺炎杆菌进行发酵生产高光学纯度的R-乙偶姻还未见报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种利用克雷伯氏肺炎杆菌（Klebsiella pneumoniae）生产R-乙偶姻的方法（发酵法）。通过该方法，能利用葡萄糖等碳源发酵直接生产高光学纯度的R构型乙偶姻。
为解决上述技术问题，本发明的利用克雷伯氏肺炎杆菌（Klebsiella pneumoniae）生产R-乙偶姻的方法，是在好氧条件下，通过乙偶姻还原酶基因budC失活的克雷伯氏肺炎杆菌发酵生产R-乙偶姻。
本发明中，所述乙偶姻还原酶，也称为双乙酰还原酶和2,3-丁二醇脱氢酶，可以催化双乙酰与乙偶姻之间的氧化还原反应，也能催化乙偶姻与2,3-丁二醇之间转化的氧化还原反应。
本发明的利用克雷伯氏肺炎杆菌生产R-乙偶姻的方法，其具体步骤包括：
（1）构建乙偶姻还原酶基因budC失活的克雷伯氏肺炎杆菌突变株；
（2）将碳源、氮源、磷源和水，配制成培养基，并控制培养基中的金属离子和微量元素含量；
（3）在步骤（2）配制的培养基中，接入乙偶姻还原酶基因budC失活的克雷伯氏肺炎杆菌突变株进行好氧发酵培养，乙偶姻还原酶基因budC失活的克雷伯氏肺炎杆菌突变株将碳源转化成R-乙偶姻，并积累于发酵液中，即在培养过程中克雷伯氏肺炎杆菌突变株消耗碳源的同时在发酵液中积累R-乙偶姻。
所述步骤（1）中，构建的方法包括：通过乙偶姻还原酶基因的同源重组、转座子插入或诱变等方法进行构建。
所述步骤（2）中，碳源包括：葡萄糖、甘露糖、半乳糖、山梨糖、山梨醇、果糖、木糖、阿拉伯糖、核糖及它们所形成的寡糖、多糖和它们的混合物、衍生物（包括葡萄糖醛酸、葡萄糖酸、2-酮基-D-葡萄糖酸和2,5-二酮基-D-葡萄糖酸等），以及能在细胞内代谢生成丙酮酸的非糖类化合物（包括：甘油、乳酸和二羟基丙酮等）；碳源的浓度为5～300g/L。
所述步骤（2）中，氮源包括：有机氮源和无机氮源。其中，有机氮源包括：玉米浆、酵母粉、蛋白胨和豆饼粉；无机氮源包括：铵盐、硝酸及其盐类、亚硝酸及其盐类和尿素。氮源的浓度为0.1～100g/L。
所述步骤（2）中，磷源是含有磷元素的物质，包括：磷酸和磷酸盐。磷源的浓度为0.1～100g/L。
所述步骤（2）中，金属离子包括：钾、镁、铁和锰；金属离子的浓度为0.1mg/L～10g/L；微量元素包括：锌、钙、钼、钴、铜、镍和硼；微量元素的浓度为10ng/L～1mg/L。
所述步骤（3）中，好氧发酵培养的温度为20～45℃，好氧发酵培养的时间为10～200小时。
本发明的方法，原料为可再生的碳源，而且原料的转化率高（如能达到35%以上），产物R-乙偶姻终浓度高（如实施例3中的R-乙偶姻浓度可以达到35g/L以上），同时生产的R-乙偶姻具有很高的光学纯度，R-异构体在总乙偶姻中含量大于98%。
具体实施方式
以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。
实施例1
利用克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC1.6366budC突变株发酵葡萄糖生产R-乙偶姻，本实施例中的CGMCC1.6366菌株为中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，具有氨苄青霉素抗性。
一、克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC1.6366budC突变株的构建
步骤如下：
1、利用PCR扩增克雷伯氏肺炎杆菌乙偶姻还原酶（budC）和上下游相邻序列，通过TA克隆方法连接到克隆载体，并进行DNA序列测定。
根据克雷伯氏肺炎杆菌MGH78578（Genbank:CP000647）基因组信息，设计乙偶姻还原酶PCR引物，上游引物budC-s：GCCATCCAGGAAGAGAAAAAATATCA（SEQ ID NO.1所示），下游引物budC-a：AGACGTTTGTACGCCTGGGTAGAAG（SEQ ID NO.2所示）。
通过上述引物，以克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC1.6366基因组DNA为模板，经PCR扩增，获得乙偶姻还原酶（budC）基因片段，通过TA克隆方法连接到pMD-18T simple质粒（商业产品）上，命名为pMD18T-budC质粒，序列测定结果如下：
budC基因相邻上游部分序列为：
GCCATCCAGGAAGAGAAAAAATATCAGCGCCTGTCCGGCGTCGAGTTCGGGCCGATGGATTTTAAAGCCTATGCCGAGTCCTTCGGCGCCAAAGGGTTTGCCGTGGAAAGCGCTGAGGCGCTGGAGCCGACCCTGCGCGCGGCGATGGACGTCGACGGCCCGGCGGTAGTGGCCATCCCGGTGGATTATCGCGATAACCCGCTGCTGATGGGTCAGCTGCATCTGAGTCAGATTCTGTAAGTCATCACAATAAGGAAAGGAAA（SEQ ID NO.3所示）。
budC基因阅读框为：
ATGAAAAAAGTCGCACTTGTTACCGGCGCCGGCCAGGGGATTGGTAAAGCTATCGCCCTTCGTCTGGTGAAGGATGGATTTGCCGTGGCCATTGCCGATTATAACGACGCCACCGCCAAAGCGGTCGCCTCCGAAATCAACCAGGCCGGCGGCCGCGCCATGGCGGTGAAAGTGGATGTCTCCGACCGCGATCAGGTGTTTGCCGCCGTCGAACAGGCGCGCAAAACGCTGGGCGGCTTCGACGTCATCGTCAACAACGCCGGCGTGGCGCCGTCCACGCCGATCGAGTCCATTACCCCGGAGATTGTCGATAAAGTTTACAATATCAACGTTAAAGGGGTGATCTGGGGCATTCAGGCGGCGGTCGAGGCCTTTAAGAAAGAGGGGCACGGCGGGAAAATCATTAACGCCTGTTCCCAGGCCGGCCACGTCGGCAACCCGGAGCTGGCGGTGTATAGCTCCAGTAAATTCGCCGTACGCGGCTTAACCCAGACCGCCGCTCGCGACCTCGCGCCGCTGGGCATCACGGTCAACGGCTACTGCCCGGGGATCGTCAAAACGCCGATGTGGGCCGAAATTGACCGCCAGGTGTCCGAAGCTGCCGGTAAACCGCTGGGTTACGGTACCGCCGAGTTCGCCAAACGCATCACCCTTGGTCGTCTGTCCGAACCGGAAGATGTCGCCGCCTGCGTCTCCTATCTTGCCAGCCCGGATTCTGATTACATGACCGGTCAGTCATTGCTGATCGACGGCGGGATGGTATTTAACTAA（SEQ ID NO.4所示）。
budC基因相邻下游部分序列为：
TAAATAATAAGCTCTGACATGGCTTGCCCCTGCTGATATGCAGGGGCTTTTTTTGGTTTGGGTGTGAGCATCGTGCAAAACGCAGCAACGATATTTGAAGGTCTCTGGCACGACGTGGGCAATCTGACTGGGTTGAAGGCCTGCTTTGAGCGAGGAGCATGTATTTTTCTTCACCCTCTACTTCGTCCATTCTTTATGCAGTAACGCATAGATGTATGTGTCGTCATACCTTGCCTTACCATCGTCGTTTTCAAAGGAGACAAACTCTTTAAAACAACCTTCCTGTCGCATATGCAAACGTTCACAGAGTTTTTGAGAGGCCAGGTTGTAAACTTCTACCCAGGCGTACAAACGTCT（SEQ ID NO.5所示）。
2、利用步骤1克隆到的基因序列，制备两侧连有同源臂中间连接抗性盒的DNA片段。
本步骤中的操作，采用在大肠杆中利用Red重组酶催化，具有同源臂连接抗性盒的DNA片段与pMD18T-budC质粒进行同源重组，获得pMD18T-budC质粒上重组失活的budC基因，利用该质粒作为模板通过PCR扩增具有长的同源臂的DNA片段，该片段两侧连有与budC基因上下游序列同源的序列，中间连接抗性盒。
本步骤操作原理和使用的质粒和菌株等材料可参见（Wei et.al.Red recombinase assistedgene replacement in Klebsiella pneumoniae Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology2012），具体步骤如下：
a.pMD18T-budC质粒热击转化到含有pIJ790质粒的大肠杆菌DH5α-pIJ790中，命名为DH5α-pMD18T-budC。
制备DH5α-pMD18-budC感受态细胞，在菌体培养1个小时后，添加10mmol/L的阿拉伯糖，诱导pIJ790质粒中Red重组酶的表达。
b.设计引物budC-s2和budC-a2，序列分别为：
AGATAGGAGACGCAGGCGGCGACATCTTCCGGTTCGGACATTCCGGGGATCCGTCGACC（SEQ ID NO.6所示）和CAGGCGCGCAAAACGCTGGGCGGCTTCGACGTCATCGTCATGTAGGCTGGAGCTGCTTC（SEQ ID NO.7所示）。
引物budC-s2的“AGATAGGAGACGCAGGCGGCGACATCTTCCGGTTCGGAC”序列与budC基因相应序列同源，引物budC-a2的“CAGGCGCGCAAAACGCTGGGCGGCTTCGACGTCATCGTCA”序列与budC基因相应序列同源。
利用引物budC-s2和budC-a2，以质粒pIJ778为模板扩增出长约1491bp的DNA片段A。该片段的两端分别具有与budC序列同源的同源臂，中间包含了来源于pIJ778质粒的链霉素抗性基因aadA。
c.利用DNA片段A转化感受态DH5α-pMD18T-budC感受态细胞。利用电击转化方法，转化电压为2000V，选择链霉素抗性的菌株，链霉素用量为50mg/L。
DNA片段A两侧的同源序列与质粒pMD18T-budC上的budC同源部分发生重组，获得质粒，并命名为pMD18T-C质粒。
d.利用引物budC-s（SEQ ID NO.1所示）和budC-a（SEQ ID NO.2所示），以pMD18T-C质粒为模板进行PCR扩增，获得2394bp的DNA片段B。
DNA片段B两端分别具有516bp和466bp的budC基因和相邻序列，该序列作为同源臂。DNA片段B中间具有链霉素抗性基因aadA，DNA片段B用于进行CGMCC1.6366染色体上budC基因重组的线性DNA片段。
3、利用转化或结合方法将制备的DNA片段B转入到克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC1.6366中，DNA片段B与染色体上的乙偶姻还原酶基因进行同源重组，筛选获得菌株染色体乙偶姻还原酶基因重组失活的菌株，具体步骤如下：
a.将pDK6-red质粒转化到CGMCC1.6366中，获得CGMCC1.6366-pDK6-red菌株，线性DNA片段B电击转化CGMCC1.6366-pDK6-red感受态细胞。利用链霉素筛选抗性菌株。
b.重组菌的验证，设计验证引物Yanzheng778z：AGAATCTCGCTCTCTCCAGGGGAAG（SEQ ID NO.8所示），其序列对应链霉素抗性基因aadA中间的一段序列。
利用引物budC-s（SEQ ID NO.1所示）和Yanzheng778z，以长出的菌株总DNA为模板进行PCR扩增，产物DNA片段为1274bp，而以出发菌株CGMCC1.6366总DNA为模板进行PCR无特异性条带，表明获得的重组菌正确，命名为CGMCC1.6366-budC-。该菌株的乙偶姻还原酶基因通过同源重组而失活。
二、利用乙偶姻还原酶失活的克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC1.6366-budC-发酵生产R-乙偶姻
1）将葡萄糖和其他组分配制成培养基
一水葡萄糖30g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，硫酸铵2g/L，磷酸氢二铵2g/L，磷酸氢二钾5g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，硫酸镁0.25g/L，硫酸亚铁0.05g/L，硫酸锰0.001g/L，微量元素溶液1mL/L培养基，自来水配制后，并灭菌。灭菌后，实测葡萄糖含量为25.6g/L。
其中，微量元素溶液的配方为：氯化锌70mg/L，钼酸钠35mg/L，硼酸60mg/L，氯化钴200mg/L，硫酸铜29.28mg/L，氯化镍25mg/L。
2）接种微生物并进行好氧培养
配制好的培养基，分装到250mL锥形瓶中，每瓶加碳酸钙0.5g，装液量50mL。接入克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC1.6366-budC-菌苔，37℃摇床好氧培养，转速为200转每分钟，培养发酵12小时。
利用气相色谱进行发酵液中产物和副产物检测，采用日本岛津公司GC2012气相色谱仪，装备RESTEK公司手性色谱柱，进样口温度设定225℃，检测器采用FID（氢火焰）检测器，检测器温度设定225℃，柱温箱程序升温，初始50℃，以5℃每分钟速率升温到75℃，保留8分钟，以20℃每分钟速率升温到200℃，保留2分钟。
检测结果为：R-乙偶姻10.1g/L，S-乙偶姻0.2g/L，内消旋2,3-丁二醇1.2g/L。底物葡萄糖向产物R-乙偶姻的转化率为39.4%。
实施例2
1）配制种子培养基
蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠5g/L，用自来水配制，分装到250mL锥形瓶中，装液量50mL，灭菌。
2）将葡萄糖和其他组分配制成发酵培养基
一水葡萄糖50g/L，玉米浆粉5g/L，亚硝酸钠0.1g/L，磷酸氢二铵3.3g/L，磷酸氢二钾13.7g/L，磷酸二氢钾2.0g/L，硫酸镁0.25g/L，硫酸亚铁0.05g/L，硫酸锰0.001g/L，微量元素溶液1mL/L培养基，自来水配制3L，装入5L搅拌式发酵罐，灭菌。灭菌后，实测葡萄糖含量为42.7g/L。
其中，微量元素溶液的配方为：氯化锌70mg/L，钼酸钠35mg/L，硼酸60mg/L，氯化钴200mg/L，硫酸铜29.28mg/L，氯化镍25mg/L。
3）种子培养
在装有种子培养基的锥形瓶中接入实施例1制备的克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC1.6366-budC-菌苔，30℃摇床好氧培养，转速为200转每分钟，培养12小时。
4）发酵培养
将培养好的种子一瓶，接入装有发酵培养基的发酵罐中，通风量4L每分钟，搅拌转速500转每分钟，温度30℃，利用氨水控制发酵过程pH6.5，发酵培养12小时。
按照实施例1中的气相色谱条件检测发酵液组分，结果为：R-乙偶姻15.1g/L，S-乙偶姻0.3g/L，内消旋2,3-丁二醇0.7g/L。底物葡萄糖向产物R-乙偶姻的转化率为35.4%。
实施例3
1）配制种子培养基
蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠5g/L，用自来水配制，分装到250mL锥形瓶中，装液量50mL，灭菌。
2）将葡萄糖和其他组分配制成发酵培养基
一水葡萄糖100g/L，蛋白胨10g/L，硝酸铵5.5g/L，磷酸氢二铵3.3g/L，磷酸氢二钾13.7g/L，磷酸二氢钾2.0g/L，微量元素溶液1mL/L培养基，自来水配制3L，装入5L搅拌式发酵罐，灭菌。灭菌后，实测葡萄糖含量为88g/L。
其中，微量元素溶液的配方为：氯化锌70mg/L，钼酸钠35mg/L，硼酸60mg/L，氯化钴200mg/L，硫酸铜29.28mg/L，氯化镍25mg/L。
3）种子培养
在装有种子培养基的锥形瓶中接入实施例1制备的克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC1.6366-budC-菌苔，30℃摇床好氧培养，转速为200转每分钟，培养12小时。
4）发酵培养
将培养好的种子一瓶，接入装有发酵培养基的发酵罐中，通风量4L每分钟，搅拌转速400转每分钟，温度40℃，利用氢氧化钠溶液控制发酵过程pH5.7，发酵培养17小时。
按照实施例1中的气相色谱条件检测发酵液组分，结果为：R-乙偶姻35.7g/L，S-乙偶姻0.5g/L，内消旋2,3-丁二醇2.3g/L。底物葡萄糖向产物R-乙偶姻的转化率为40.6%。
Claims (9)
1.一种利用克雷伯氏肺炎杆菌生产R-乙偶姻的方法，其特征在于：所述方法是在好氧条件下，通过乙偶姻还原酶基因budC失活的克雷伯氏肺炎杆菌发酵生产R-乙偶姻。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法的步骤包括：
(1)构建乙偶姻还原酶基因budC失活的克雷伯氏肺炎杆菌突变株；
(2)将碳源、氮源、磷源和水，配制成培养基，并控制培养基中的金属离子和微量元素含量；
(3)在步骤(2)配制的培养基中，接入乙偶姻还原酶基因budC失活的克雷伯氏肺炎杆菌突变株进行好氧发酵培养，乙偶姻还原酶基因budC失活的克雷伯氏肺炎杆菌突变株将碳源转化成R-乙偶姻，并积累于发酵液中。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，构建的方法包括：通过乙偶姻还原酶基因的同源重组或转座子插入方法进行构建。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，碳源选自：葡萄糖、甘露糖、半乳糖、山梨糖、山梨醇、果糖、木糖、阿拉伯糖、核糖及它们所形成的寡糖、多糖和它们的混合物、衍生物，以及能在细胞内代谢生成丙酮酸的非糖类化合物；其中，衍生物选自：葡萄糖醛酸、葡萄糖酸、2-酮基-D-葡萄糖酸和2,5-二酮基-D-葡萄糖酸；能在细胞内代谢生成丙酮酸的非糖类化合物选自：甘油、乳酸和二羟基丙酮；
碳源的浓度为5～300g/L。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，氮源选自：有机氮源和无机氮源；
其中，有机氮源选自：玉米浆、酵母粉、蛋白胨和豆饼粉；无机氮源选自：铵盐、硝酸及其盐类、亚硝酸及其盐类和尿素；
氮源的浓度为0.1～100g/L。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，磷源选自：磷酸和磷酸盐；
磷源的浓度为0.1～100g/L。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，金属离子选自：钾、镁、铁和锰；金属离子的浓度为0.1mg/L～10g/L；
微量元素选自：锌、钙、钼、钴、铜、镍和硼；微量元素的浓度为10ng/L～1mg/L。
8.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，好氧发酵培养的温度为20～45℃，好氧发酵培养的时间为10～200小时。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述克雷伯氏肺炎杆菌是克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366。
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