CN101597627B - 一种高分子γ-聚谷氨酸的生产方法 - Google Patents
一种高分子γ-聚谷氨酸的生产方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种高分子γ-聚谷氨酸的生产方法。采用的技术方案是：纳豆菌接种于活化培养基中活化；活化的菌种接入装有200ml培养基的500ml三角瓶中，在37℃、200转/分钟转速下，培养24小时；培养好的种子液按10000cfu/ml的比例接种到3.5L发酵培养液中进行发酵罐培养；在35～38℃，150～250转/分钟转速，通气量1.0VVM下，调节罐压0.05～0.1MPa，培养30～40小时后，补料1.0～1.7L，继续培养40～50小时；发酵完毕，经提取工艺得到产物γ-聚谷氨酸。所制得的γ-聚合谷氨酸的分子量达300以上，产率高，在食品、化妆品、医药品等的开发领域具有良好的用途。
Description
技术领域
本发明属于生物发酵生产天然高分子产物的领域，具体地涉及一种高分子量的γ-聚谷氨酸的生产方法。
背景技术
在资源短缺与环境污染日趋严重的当今社会，进行“绿色化学产品”的开发已成为世界化工产业的新趋向。顺应于这一发展趋势与社会需求，γ-聚谷氨酸(Poly γ-glutamic acid，
)成为了目前国内外正在兴起且广受生产者与消费者注目的新型“绿色生物高分子材料”之一。
γ-聚谷氨酸是由D-谷氨酸或L-谷氨酸的γ-羧基与氨基通过酰胺键连接聚合而成的氨基酸化合物。作为一种水溶性的生物高分子材料，γ-PGA具有良好的生物可降解性和生物相容性，并且具有可食、对人体和环境无毒害、吸水性与保湿性强等优异特性，在化妆品、农业、医药和食品等领域具有广阔的应用潜力。
关于γ-PGA的制造方法，近年来国内外主要以枯草芽孢杆菌来发酵生产。例如Kubota曾从土壤中成功的分离得到一株产γ-PGA的菌株Bacillus subtilis F201(Biosci.Biotech.Biochem.，61，1684-1687，1997)。Ogawa等利用Bacillus subtilis MR 141生产γ-PGA，产量达35g/L(Biotechnol Lett，22，585-588，2002)。李相烨等对Bacillus licheniformisATCC9945a采用补加糖高密度培养的方法，使γ-PGA的产量达到55g/L(专利号，00819560.9)。但这些菌都是谷氨酸底物依存菌，生产时需添加谷氨酸作为营养原料，因此，原料成本相对较高。近年来，我国有研究报道经过诱变选育的非谷氨酸底物依赖菌(Bacillus subtilis)在适当的培养条件下γ-PGA产量达18～30g/L，有望成为生产用菌株(施庆珊等，专利号200610122640.5；疏秀林等，专利号200810027184.5)。但目前生产上所用的这些菌株均没有在食品工业上应用的实例。也就是说，这些产品在食品、医药品与化妆品等的直接应用于人体上的安全性方面还有待进一步的考证。同时其发酵原料的成本与生产效率也有待于进一步的改善。
到目前为止，在众多的γ-PGA的产生菌中，纳豆菌(Bacillussubtilis natto)是人类唯一具有长年的食用经验的菌种，其对人体的安全性是无容置疑的。同时，由纳豆菌生产的γ-PGA的分子量一般在300万以上，远远的高于其他菌种生产的γ-PGA的分子量(分子量一般在100万以下)，这也意味着由纳豆菌生产的γ-PGA具有更强的粘性以及更高的吸收与保水性能。但是，用纳豆菌生产γ-PGA时，由于固体发酵难以实现规模化的生产，而液体发酵中由于其高粘性所带来的供氧的难度以及发酵体系中γ-PGA分解酶的存在对γ-PGA产生的裂解作用，使得γ-PGA在大量生产中存在着产量的不稳定性等问题。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种γ-聚谷氨酸的生产方法。通过市售的纳豆菌及一般公认的培养基为原料，通过营养枯竭和环境压力的胁迫作用来得到高产量的γ-PGA。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种高分子γ-聚谷氨酸的生产方法，工艺步骤如下：
1)菌种的活化：将纳豆菌，接种于活化培养基中，活化培养基的组成为：葡萄糖5-20g/L，蛋白胨5-20g/L，酵母粉5-20g/L，氯化钠1-5g/L，琼脂15-20g/L；于35～38℃，培养40～55小时；
2)种子培养：经活化的菌种接入装有200ml培养基的500ml三角瓶中，在35～38℃、150～250转/分钟的转速下，培养20～24小时，培养基组成为：葡萄糖5-20g/L，蛋白胨5-20g/L，酵母粉5-20g/L，氯化钠1-5g/L；
3)发酵培养：将培养好的种子液按10000cfu/ml的比例接种到3.5L发酵培养液中进行发酵罐培养；发酵培养液组成为：葡萄糖5-20g/L，玉米淀粉5-20g/L，大豆蛋白5-20g/L，氯化钠1-5g/L，碳酸钙0.05-0.4g/L，硫酸镁0.05-0.5g/L，磷酸二氢钾0.5-2.0g/L；培养温度35～38℃，搅拌速度150～250转/分钟，通气量1.0VVM，调节罐压0.05～0.1MPa下，培养30～40小时后，补料1.0～1.7L，继续培养40～50小时；
4)发酵完毕，经提取工艺得到产物γ-聚谷氨酸。
提取工艺按照常规的回收方法，发酵液经除菌、有机溶剂(低级醇)沉淀回收、透析等过程精制后冻结干燥，得到产物γ-PGA。产物经GPC分析(色谱柱：Zorbax GF-250，流动相：0.1M磷酸钠缓冲液)分子量300万以上。
所述的纳豆菌可以是市售的商业性菌种，也可以是以这些菌株为出发菌，通过常规的化学或生物技术的手段诱导而得的菌种。
本发明的有益效果是：本发明采用廉价易得的原料，通过外界环境胁迫的方法提高了γ-PGA的产率，抑制了γ-PGA的分解，增加了γ-PGA生产的稳定性与大分子量的高粘度特性。采用本发明的方法，γ-PGA产率可达到31.8g/L。由于采用的纳豆菌是人类唯一具有长年的食用经验的菌种，因此其产品在食品、医药品与化妆品等的直接应用上，具有安全性，可直接应用于此领域产品的生产之中。
具体实施方式
实施例1
1、菌种的选择：将市购的纳豆菌，经平板稀释培养后，选择拉丝丰富、抗拉伸力强的菌落，进行分离。
2、菌种的活化：将分离得到的纳豆菌，接种于活化培养基中，活化培养基的组成为：葡萄糖13g/L，蛋白胨13g/L，酵母粉13g/L，氯化钠3g/L，琼脂18g/L；于37℃，培养48小时；
3、种子培养：经活化的菌种一环接入装有200ml培养基的500ml的三角瓶中，在37℃、200转/分钟的转速下，培养24小时，培养基组成为：葡萄糖13g/L，蛋白胨13g/L，酵母粉13g/L，氯化钠3g/L；
4、发酵培养：将上述培养好的种子液按10000cfu/ml的比例接种到3.5L发酵培养液中进行发酵罐培养；发酵培养液组成为：葡萄糖13g/L，玉米淀粉13g/L，大豆蛋白13g/L，氯化钠3g/L，碳酸钙0.27g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾1.0g/L；培养温度37℃，搅拌速度200转/分钟，通气量1.0VVM，调节罐压0.08MPa，培养36小时后，pH急剧上升、营养出现枯竭时，补料1.5L，继续培养48小时；
5、γ-聚谷氨酸的回收：发酵完毕，按照常规的提取工艺(Vardetal.，Biotechnology and Bioengineering，41，1963)回收γ-PGA：发酵液经离心除菌、乙醇沉淀回收后，将沉淀物溶解于蒸馏水中、再次用乙醇沉淀回收，此操作重复3-4次后将沉淀物溶解于水，流水中透析24小时后，冷冻干燥即得γ-PGA产品，产率31.8g/L。
此产品用1.0N的盐酸100℃分解24小时后，用薄层层析检测到其分解产物为谷氨酸，说明所得到的产物为目的产物γ-PGA。所用展开液为正丁醇/冰醋酸/水＝4/1/3，发色剂为茚三酮。此γ-PGA产品经液相色谱分析(色谱柱：Zorbax GF-250，流动相：0.1M磷酸钠缓冲液)，分子量300万以上，纯度90％以上。
实施例2
1、菌种的选择：将市购的纳豆菌，经平板稀释培养后，选择拉丝丰富、抗拉伸力强的菌落，进行分离。
2、菌种的活化：将分离得到的纳豆菌，接种于活化培养基中，活化培养基的组成为：葡萄糖5g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉5g/L，氯化钠1g/L，琼脂15g/L；于35℃，培养55小时；
3、种子培养：经活化的菌种一环接入装有200ml培养基的500ml的三角瓶中，在35℃、150转/分钟的转速下，培养24小时，培养基组成为：葡萄糖5g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉5g/L，氯化钠1g/L；
4、发酵培养：将上述培养好的种子液按10000cfu/ml的比例接种到3.5L发酵培养液中进行发酵罐培养；发酵培养液组成为：葡萄糖5g/L，玉米淀粉5g/L，大豆蛋白5g/L，氯化钠1g/L，碳酸钙0.05g/L，硫酸镁0.05g/L，磷酸二氢钾0.5g/L；培养温度35℃，搅拌速度150转/分钟，通气量1.0VVM，调节罐压0.1MPa，培养40小时后，补料1.0L，继续培养50小时；
5、γ-聚谷氨酸的回收：发酵完毕，按照常规提取工艺回收γ-PGA。产率30.1g/L。
此产品用1.0N的盐酸100℃分解24小时后，用薄层层析检测到其分解产物为谷氨酸，说明所得到的产物为目的产物γ-PGA。所用展开液为正丁醇/冰醋酸/水＝4/1/3，发色剂为茚三酮。此γ-PGA产品经液相色谱分析(色谱柱：Zorbax GF-250，流动相：0.1M磷酸钠缓冲液)，分子量300万以上，纯度90％以上。
实施例3
1、菌种的活化：将市购的纳豆菌，接种于活化培养基中，活化培养基的组成为：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉20g/L，氯化钠5g/L，琼脂20g/L；于38℃，培养40小时；
2、种子培养：经活化的菌种一环接入装有200ml培养基的500ml的三角瓶中，在38℃、250转/分钟的转速下，培养20小时，培养基组成为：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉20g/L，氯化钠5g/L；
3、发酵培养：将上述培养好的种子液按10000cfu/ml的比例接种到3.5L发酵培养液中进行发酵罐培养；发酵培养液组成为：葡萄糖20g/L，玉米淀粉20g/L，大豆蛋白20g/L，氯化钠5g/L，碳酸钙0.4g/L，硫酸镁0.2g/L，磷酸二氢钾2.0g/L；培养温度38℃，搅拌速度250转/分钟，通气量1.0VVM，调节罐压0.05MPa，培养30小时后，补料1.7L，继续培养50小时；
4、γ-聚谷氨酸的回收：发酵完毕，按照常规的提取工艺回收γ-PGA。产率28.7g/L。
此产品用1.0N的盐酸100℃分解24小时后，用薄层层析检测到其分解产物为谷氨酸，说明所得到的产物为目的产物γ-PGA。所用展开液为正丁醇/冰醋酸/水＝4/1/3，发色剂为茚三酮。此γ-PGA产品经液相色谱分析(色谱柱：Zorbax GF-250，流动相：0.1M磷酸钠缓冲液)，分子量300万以上，纯度90％以上。
实施例4
1、菌种的选择：取5-10粒市售的纳豆，放入100℃的开水中搅拌，制成孢子悬浮液。取此孢子悬浮液用梯度稀释的方法接种到平板培养基上，于37℃，培养24小时后，按照专利3822773(日本)的简易方法，选择γ-PGA蓄积量高的菌落。即选择数十个多量的蓄积了γ-PGA、表面不规则隆起的菌落，用玻璃移液管吸取其中的粘质物，通过比较其粘质物的重量来判断γ-PGA产量的高低。选择产量高的菌落进一步用100℃的开水制成孢子悬浮液。取此孢子悬浮液用梯度稀释的方法接种到平板培养基上，于37℃，培养24小时后选择拉丝丰富、抗拉伸力强的菌落，进行分离。培养基的组成为：葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉15g/L，氯化钠5g/L，磷酸二氢钠2g/L，磷酸氢二钠4g/L，硫酸镁0.5g/L。
2、菌种的活化：将分离得到的纳豆菌，接种于活化培养基中，活化培养基的组成为：葡萄糖15g/L，蛋白胨15g/L，酵母粉15g/L，氯化钠2g/L，琼脂16g/L；于36℃，培养45小时；
3、种子培养：经活化的菌种一环接入装有200ml培养基的500ml的三角瓶中，在36℃、200转/分钟的转速下，培养22小时，培养基组成为：葡萄糖15g/L，蛋白胨15g/L，酵母粉15g/L，氯化钠2g/L；
4、发酵培养：将上述培养好的种子液按10000cfu/ml的比例接种到3.5L发酵培养液中进行发酵罐培养；发酵培养液组成为：葡萄糖15g/L，玉米淀粉15g/L，大豆蛋白15g/L，氯化钠2g/L，碳酸钙0.15g/L，硫酸镁0.1g/L，磷酸二氢钾1.5g/L；培养温度36℃，搅拌速度200转/分钟，通气量1.0VVM，调节罐压0.07MPa，培养36小时后，补料1.6L，继续培养47小时；
5、γ-聚谷氨酸的回收：发酵完毕，按照常规的提取工艺回收γ-PGA。产率28.1g/L。
此产品用1.0N的盐酸100℃分解24小时后，用薄层层析检测到其分解产物为谷氨酸，说明所得到的产物为目的产物γ-PGA。所用展开液为正丁醇/冰醋酸/水＝4/1/3，发色剂为茚三酮。此γ-PGA产品经液相色谱分析(色谱柱：Zorbax GF-250，流动相：0.1M磷酸钠缓冲液)，分子量300万以上，纯度90％以上。
对比例
取实施例1的纳豆菌，选择不同的发酵培养工艺，得到的γ-聚谷氨酸的产率如表1。
表1
从表1可见，采用本发明的发酵工艺，通过环境胁迫，产率可达31.8g/L。
Claims (1)
1.一种高分子γ-聚谷氨酸的生产方法，其特征在于包括如下步骤：
1)菌种的活化：将纳豆菌，接种于活化培养基中，活化培养基的组成为：葡萄糖5-20g/L，蛋白胨5-20g/L，酵母粉5-20g/L，氯化钠1-5g/L，琼脂15-20g/L；于35～38℃，培养40～55小时；
2)种子培养：经活化的菌种接入装有200ml培养基的500ml三角瓶中，在35～38℃、150～250转/分钟的转速下，培养20～24小时，培养基组成为：葡萄糖5-20g/L，蛋白胨5-20g/L，酵母粉5-20g/L，氯化钠1-5g/L；
3)发酵培养：将培养好的种子液按10000cfu/ml的比例接种到3.5L发酵培养液中进行发酵罐培养；发酵培养液组成为：葡萄糖13g/L，玉米淀粉13g/L，大豆蛋白13g/L，氯化钠3g/L，碳酸钙0.27g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾1.0g/L；培养温度37℃，搅拌速度200转/分钟，通气量1.0VVM，调节罐压0.08MPa下，培养36小时后，pH急剧上升、营养出现枯竭时，补料1.5L，继续培养48小时；
4)发酵完毕，经提取工艺得到产物γ-聚谷氨酸。
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