CN1803854A - 一种利用酵母生产β－环糊精的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用酵母生产β－环糊精的方法，即利用基因工程技术将环糊精糖基转移酶表达固定在酿酒酵母细胞表面，然后利用表面固定有环糊精糖基转移酶的酿酒酵母细胞发酵生产β－环糊精，在分离纯化产品β－环糊精时，只需要离心去除菌体细胞和剩余底物，然后浓缩反应上清液就可得到相当纯度的β－环糊精产品。本发明的方法在固定化过程中酶活性不下降，制得的固定化酶稳定性高，可以重复利用，省去了纯化步骤；而且在生产环糊精的同时酒精的产生以及酵母对葡萄糖和麦芽糖的消耗都促进了环糊精的产生，提高了产率。本发明中所使用的酿酒酵母作为一种已经被广泛应用于食品生产的微生物，所生产的β－环糊精具有不容置疑的安全性。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用酵母和环糊精糖基转移酶生产β-环糊精的方法。
背景技术
环状糊精(Cyclodextrin，简称CD)，是由环糊精葡萄糖转移酶(CGTase)作用于淀粉所产生的一组环状低聚糖，最常见的有α-环糊精，β-环糊精和γ-环糊精，它们分别是由6个、7个或8个葡萄糖基单元以α-1，4糖苷键连结而成的，分子形状略呈锥形的圆环。经X-射线及NMR测定，环糊精孔穴内侧是由-CH-基及葡萄糖苷键的氧原子组成，呈疏水性；而孔穴一端的开口处是2，3-位的羟基，另一端是6-位的羟基，因而环糊精外侧呈亲水性。由于环糊精“内疏水，外亲水”的特殊分子结构，使得环糊精能与多种有机小分子形成特殊结构的包合配合物(Inclusion Complexes)。因此环糊精可以改变有机小分子的物理和化学性质，例如溶解性、稳定性，甚至生物亲和性。
基于环糊精的特殊结构形态，其常被称为分子胶囊，并且以其分子水平上包藏各种活性成分并赋予新的理化特性而著称于世。此外，环糊精的上、中、下层原子都不同，没有对称元素，即具有手性。因此环糊精对手性不同的生物活性物质具有识别结合的特性，特别是在手性的生物活性的物质的分离中，具有其独特优越性。
鉴于环糊精有与多种有机小分子形成特殊结构的包合配合物的特性，目前它已被广泛应用于食品、医药、化妆品、农业等领域，此外在化工以及分析、分离技术上也有巨大的应用潜力。在实际应用中，单一组成的环糊精纯品具有更高的价值，其中应用最广、产量最大的是β-环糊精。1998全球总共消耗6000吨环糊精，价值达1亿美元，2002年环糊精市场达2.5亿美元。主要生产商是法国的Cerestar德国的Wacker Biochem和日本的Ensuiko Sugar，而中国生产环糊精的企业还很少，产量相当低，而且价钱较贵且纯度不高，因此发展环糊精的生产特别是在中国具有重要的意义。
关于环糊精的生产方法已有很多报道，但都为酶法生产，到目前为止还未见用化学合成的报道。
现有的环糊精酶法生产过程通常包括以下几个主要阶段：菌种的筛选、培养，CGTase的制备(分离、纯化、浓缩、粉体化)；将淀粉转化为环糊精；环糊精的分离、纯化与结晶。
但是，在上述酶法生产过程中，环糊精糖基转移酶的最适反应温度较高，所以环糊精生产多采用热媒法，封闭式生产技术，耗能较大，对生产设备要求较高。在产品环糊精分离纯化中，由于产生的环糊精是α-环糊精，β-环糊精，γ-环糊精和少量大环糊精的混合物，因此需要进一步的分离纯化。目前通常采用的两种纯化方法都存在一些缺陷，其中有机溶剂络合法虽然实用、简便，产率较高，但是有机溶剂需要回收，且容易造成环境污染；而亲和层析柱分离法虽然没有污染，但是成本高，转化率低，效率较低；并且这两种方法都很难以大规模形式生产得到大量的高纯产品。
综合以上现有的环糊精生产工艺，主要存在以下问题。首先是CGTase的制备比较麻烦，菌种培养时间长，CGTase的纯化麻烦，得率不高；接下来的转化过程耗能大，设备投入高，而且很难实现连续生产；最后的环糊精纯化过程步骤多、成本高、效率低，而且容易造成污染。因此有必要开发一种成本更低，更简单、有效、方便的环糊精生产工艺。
发明内容
针对现有环糊精生产工艺的不足，本发明提供了一种利用酵母生产β-环糊精的方法，该方法降低了产品的分离纯化难度，提高了环糊精的产率，降低了成本。
本发明涉及的利用酵母生产β-环糊精的方法，由下述步骤组成：
(1)重组表达载体的构建：
克隆环糊精糖基转移酶Cyclomaltodextrin Glucanotransferase(CGTase，ECnumber：2.4.1.19)基因，经EcoRI和XhoI酶切后插入酵母表达载体pYD1，命名为pYD1/cgt。
(2)重组酵母菌株的构建：
将表达载体pYD1/cgt在转化效价高的大肠杆菌中扩增后，用电转化的方法将其转入酵母菌中，构建重组酵母菌株；在不含色氨酸的YNB-葡萄糖平板上长出的菌落为阳性克隆工程菌株；
其中，YNB-葡萄糖平板培养基配方为：6.7克/升酵母基本氮源；20克/升葡萄糖；0.1克/升亮氨酸。
(3)环糊精糖基转移酶诱导表达：
将上述阳性克隆工程菌株，接种于YNB-CAA葡萄糖培养基中，25-32℃培养20-30小时，摇床转速为220-260转/分；当YNB-CAA葡萄糖培养基中菌体浓度达OD＝2-5时，将菌体离心收集后转入YNB-CAA半乳糖培养基中，使YNB-CAA半乳糖培养基中菌体浓度达到OD＝0.5-1.0；诱导培养，诱导温度20-25℃，摇床转速为220-260转/分，诱导30-36小时，得到细胞表面表达有CGTase的酵母工程菌。
(4)利用细胞表面表达有环糊精糖基转移酶的酵母生产环糊精：
将上述细胞表面表达有CGTase的酵母工程菌收集后转入含有淀粉的YNB-CAA半乳糖发酵液中发酵或转入转化反应液中进行反应；之后，以12000转/分离心30分钟去除酵母菌体和残余底物，得到含有环糊精的上清液。
其中：发酵条件为20-35℃，摇床转速220-260转/分，发酵时间48-96小时；转化反应液反应条件为20-50℃，反应36-72小时，同时利用100-160转/分的速度摇动以防止菌体沉淀。
上述含有环糊精的上清液还可以用HPLC检测产率和产物比例。
(5)产品β-环糊精的分离纯化：
将上述含有环糊精的上清液以常规方法浓缩，当上清液被浓缩至其原体积的10％～20％时，析出物即为β-环糊精(β-环糊精在水中的溶解度是α-环糊精，β-环糊精，γ-环糊精三者中最小的，所以首先析出)，停止浓缩，将浓缩后的上清液以12000转/分离心30分钟，沉淀物即是纯化的β-环糊精。
上述含有环糊精的上清液的浓缩还可以用HPLC对α-环糊精，β-环糊精，γ-环糊精产物比例进行检测来控制进行。
其中YNB-CAA葡萄糖培养基配方为：6.7克/升酵母基本氮源，5克/升酸水解酪蛋白氨基酸，20克/升葡萄糖；
其中YNB-CAA半乳糖培养基配方为：6.7克/升酵母基本氮源，5克/升酸水解酪蛋白氨基酸，20克/升半乳糖；
其中含有淀粉的YNB-CAA半乳糖发酵液配方为：6-7克/升酵母基本氮源，4-6克/升酸水解酪蛋白氨基酸，20克/升半乳糖，30-50克/升可溶淀粉；
上述含有淀粉的YNB-CAA半乳糖发酵液配方优选为：6.7克/升酵母基本氮源，5克/升酸水解酪蛋白氨基酸，20克/升半乳糖，35-45克/升可溶淀粉；
其中转化反应液配方为：10毫摩尔/升Tris-HCl，30-50克/升可溶淀粉，pH＝6-9；
上述转化反应液配方优选为：10毫摩尔/升Tris-HCl，35-45克/升可溶淀粉，pH＝7.5-8.5。
在上述方法中，步骤(1)所述的环糊精糖基转移酶基因优选是来源于环状芽孢251杆菌的环糊精糖基转移酶基因。
其中，环状芽孢杆菌251的环糊精糖基转移酶基因，其阅读框中含有2139个碱基，编码一个713个氨基酸的蛋白质，包含前面的25个氨基酸组成的信号肽Genbank[gi：510491]。
在上述方法中，用于质粒扩增的转化效价高的大肠杆菌优选Top10、DH5α、JM109之一。
在上述方法中，步骤(2)所述的电转化条件优选是：1.5Kv；25μF。
在上述方法中，步骤(2)所述的酵母菌株优选是酿酒酵母菌株-EBY100。
在上述方法中，步骤(3)所述的YNB-CAA葡萄糖培养基培养条件优选是30℃培养20～24小时，摇床转速为260转/分。
在上述方法中，步骤(3)所述的YNB-CAA半乳糖培养诱导温度优选是20℃，摇床转速为220转/分，诱导时间为30～36个小时。
采用本发明所述的利用酵母生产β-环糊精的方法，可以简单有效的生产环糊精，并达到更高的产率。
本发明的主要创新在于，因为酵母是单细胞低等真核生物，具有真核生物对表达蛋白的翻译后修饰功能，特别是经糖基化的修饰，提高了酶蛋白的稳定性，从而可以长时间保持酶活。因此表面稳定地表达有糖基化的环糊精糖基转移酶的酵母细胞，可以当作酶来进行催化反应，重复利用，省去了酶的纯化步骤，延长了酶的使用寿命，提高了酶的使用效率。而且，在用全细胞进行发酵生产β-环糊精中，可以不用再对酶进行固定化，也使产物的分离纯化更加简单。另外，β-环糊精在作为食品、化妆品、药物的添加剂时，要与人类直接接触，是否含有有毒物质是首要考虑的问题，而本发明利用酵母生产β-环糊精的方法中，选用的酿酒酵母作为一种已经被广泛应用于食品生产的微生物，其生产的产品具有不容置疑的安全性。
本发明的另一个创新在于，环糊精糖基转移酶作为α-淀粉酶家族的成员，能够在生产环糊精的同时水解淀粉成α-1，4葡聚二糖和葡萄糖作为酵母的碳原，这样在表面表达有环糊精糖基转移酶的酵母的发酵液中就可以用比较便宜的淀粉来作碳源生产环糊精。而环糊精糖基转移酶反应产生的葡萄糖也可被酵母利用来生长并同时产生酒精，由于酒精和环糊精形成包合物进一步促进了环糊精的形成，提高了转化效率。同时，酵母生长消耗的葡萄糖和麦芽糖减少了酶反应的抑制，也可使环糊精产量增加。
本发明的产品β-环糊精具有较高的纯度。本发明的方法既简化了产品分离纯化的过程，又提高了产品的产率，具有很高的实用和推广价值。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的内容作进一步的阐述：
实施例1：
(1)重组表达载体的构建：
克隆环糊精糖基转移酶Cyclomaltodextrin Glucanotransferase(CGTase，ECnumber：2.4.1.19)基因，经EcoRI和XhoI酶切后插入酵母表达载体pYD1，命名为pYD1/cgt。
其中环糊精糖基转移酶(CGTase)基因来自环状芽孢杆菌251，其阅读框中含有2139个碱基。编码一个713个氨基酸的蛋白质。包含前面的25个氨基酸组成的信号肽Genbank[gi：510491]。
(2)重组酵母菌株的构建：
将表达载体pYD1/cgt在转化效价高的大肠杆菌DH5α中扩增后，用电转化的方法在1.5Kv、25μF的条件下将其转入酿酒酵母菌-EBY100中，构建重组酵母菌株；在不含色氨酸的YNB-葡萄糖平板上长出的菌落为阳性克隆工程菌株；
其中，YNB-葡萄糖平板培养基配方为：6.7克/升酵母基本氮源；20克/升葡萄糖；0.1克/升亮氨酸。
(3)环糊精糖基转移酶诱导表达：
将含有表达载体pYD1/cgt的酿酒酵母菌-EBY100，接种于YNB-CAA葡萄糖培养基中，32℃培养20小时，摇床转速为260转/分；当YNB-CAA葡萄糖培养基中菌体浓度达OD＝2时，将菌体离心(3000转/分离心5分钟)收集后转入YNB-CAA半乳糖培养基中，使YNB-CAA半乳糖培养基中菌体浓度达到OD＝0.5，诱导培养，诱导温度20℃，摇床转速为220转/分，诱导30小时，得到细胞表面表达有CGTase的酵母工程菌。
(4)利用细胞表面表达有环糊精糖基转移酶的酵母生产环糊精：
将细胞表面表达有CGTase的酵母菌转接到含有淀粉的YNB-CAA半乳糖发酵液中进行环糊精的发酵，发酵温度30℃，摇床转速为240转/分，发酵72小时后，12000转/分离心30分钟去除酵母菌体和培养基残余物，得到含有环糊精的上清液。
发酵上清经HPLC检测，环糊精的量与利用商品化的环糊精糖基转移酶纯酶生产的环糊精相比，最终产量有大幅提高，其中，β-环糊精的比例提高20％～30％。α-环糊精，β-环糊精和γ-环糊精比例为13∶78∶9，淀粉转化率为60％。
(5)产品β-环糊精的分离纯化：
将上述的发酵液上清直接浓缩至原体积的20％使β-环糊精析出，12000转/分离心30分钟得到β-环糊精产品析出物。
其中：上述YNB-CAA葡萄糖培养基配方为：6.7克/升酵母基本氮源，5克/升酸水解酪蛋白氨基酸，20克/升葡萄糖；
其中：上述YNB-CAA半乳糖培养基配方为：6.7克/升酵母基本氮源，5克/升酸水解酪蛋白氨基酸，20克/升半乳糖；
其中：上述含有淀粉的YNB-CAA半乳糖发酵液配方为：6.7克/升酵母基本氮源，5克/升酸水解酪蛋白氨基酸，20克/升半乳糖，40克/升可溶淀粉。
实施例2：
(1)重组表达载体的构建：
克隆环糊精糖基转移酶Cyclomaltodextrin Glucanotransferase(CGTase，ECnumber：2.4.1.19)基因，经EcoRI和XhoI酶切后插入酵母表达载体pYD1，命名为pYD1/cgt。
其中环糊精糖基转移酶(CGTase)基因来自环状芽孢杆菌251，其阅读框中含有2139个碱基。编码一个713个氨基酸的蛋白质。包含前面的25个氨基酸组成的信号肽Genbank[gi：510491]。
(2)重组酵母菌株的构建：
将表达载体pYD1/cgt在转化效价高的大肠杆菌Top10中扩增后，用电转化的方法在1.5Kv、25μF的条件下将其转入啤酒酵母菌中，构建重组酵母菌株；在不含色氨酸的YNB-葡萄糖平板上长出的菌落为阳性克隆工程菌株；
其中，YNB-葡萄糖平板培养基配方为：6.7克/升酵母基本氮源；20克/升葡萄糖；0.1克/升亮氨酸。
(3)环糊精糖基转移酶诱导表达：
将含有表达载体pYD1/cgt的啤酒酵母阳性克隆工程菌株，接种于YNB-CAA葡萄糖培养基中，30℃培养24小时，摇床转速为260转/分；当YNB-CAA葡萄糖培养基中菌体浓度达OD＝4时，将菌体离心(3500转/分离心5分钟)收集后转入YNB-CAA半乳糖培养基中，使YNB-CAA半乳糖培养基中菌体浓度达到OD＝0.8，诱导培养，诱导温度20℃，摇床转速为220转/分，诱导36小时，得到细胞表面表达有CGTase的酵母工程菌。
(4)利用细胞表面表达有环糊精糖基转移酶的酵母生产环糊精：
将细胞表面表达有CGTase的酵母菌体加入转化反应液中进行反应，反应条件为50℃，同时利用100转/分的速度摇动以防止菌体沉淀。反应36小时后，12000转/分离心30分钟去除酵母菌体和残余底物，得到含有环糊精的上清液。
(5)产品β-环糊精的分离纯化：
将上述的上清液进行HPLC检测，α-环糊精，β-环糊精和γ-环糊精比例为15∶75∶10，淀粉转化率为40％。
根据α-环糊精、β-环糊精和γ-环糊精的不同的溶解度以及上述HPLC检测结果，将步骤(4)的上清液浓缩至原体积的10％，然后以12000转/分离心30分钟去除上清，得到的析出物即是β-环糊精产品。
其中：上述YNB-CAA葡萄糖培养基配方为：6.7克/升酵母基本氮源，5克/升酸水解酪蛋白氨基酸，20克/升葡萄糖；
其中：上述YNB-CAA半乳糖培养基配方为：6.7克/升酵母基本氮源，5克/升酸水解酪蛋白氨基酸，20克/升半乳糖；
其中：上述转化反应液配方为：10毫摩尔/升Tris-HCl，30克/升可溶淀粉，pH＝6。
实施例3：
(1)重组表达载体的构建：
克隆环糊精糖基转移酶Cyclomaltodextrin Glucanotransferase(CGTase，ECnumber：2.4.1.19)基因，经EcoRI和XhoI酶切后插入酵母表达载体pYD1，命名为pYD1/cgt。
其中环糊精糖基转移酶(CGTase)基因来自环状芽孢杆菌251，其阅读框中含有2139个碱基。编码一个713个氨基酸的蛋白质。包含前面的25个氨基酸组成的信号肽Genbank[gi：510491]。
(2)重组酵母菌株的构建：
将表达载体pYD1/cgt在转化效价高的大肠杆菌JM109中扩增后，用电转化的方法在1.5Kv、25μF的条件下将其转入酿酒酵母菌-EBY100中，构建重组酵母菌株；在不含色氨酸的YNB-葡萄糖平板上长出的菌落为阳性克隆；
其中，YNB-葡萄糖平板培养基配方为：6.7克/升酵母基本氮源；20克/升葡萄糖；0.1克/升亮氨酸。
(3)环糊精糖基转移酶诱导表达：
将含有表达载体pYD1/cgt的酿酒酵母菌-EBY100，接种于YNB-CAA葡萄糖培养基中，30℃培养30小时，摇床转速为260转/分；当YNB-CAA葡萄糖培养基中菌体浓度达OD＝5时，将菌体离心收集后转入YNB-CAA半乳糖培养基中，使YNB-CAA半乳糖培养基中菌体浓度达到OD＝1.0；诱导培养，诱导温度20℃，摇床转速为220转/分，诱导36小时，得到细胞表面表达有CGTase的酵母工程菌。
(4)利用细胞表面表达有环糊精糖基转移酶的酵母生产环糊精：
将细胞表面表达有CGTase的菌体加入反应液中进行反应，反应条件为20℃，同时利用160转/分的速度摇动以防止菌体沉淀。反应72小时后，12000转/分离心30分钟去除酵母菌体和残余底物，得到含有环糊精的上清液。
(5)产品β-环糊精的分离纯化：
将上述的发酵液上清直接浓缩至原体积的15％使β-环糊精析出，12000转/分离心30分钟得到β-环糊精产品析出物。
或者先将上述的发酵液上清进行HPLC检测，测得α-环糊精，β-环糊精和γ-环糊精比例为14∶76∶10；淀粉转化率为45％；然后根据α-环糊精、β-环糊精和γ-环糊精的不同的溶解度以及HPLC检测的结果，将步骤(4)的上清液浓缩至原体积的13.5％使β-环糊精析出。12000转/分离心30分钟去除上清，得到的沉淀物即是β-环糊精产品。
其中：上述YNB-CAA葡萄糖培养基配方为：6.7克/升酵母基本氮源，5克/升酸水解酪蛋白氨基酸，20克/升葡萄糖；
其中：上述YNB-CAA半乳糖培养基配方为：6.7克/升酵母基本氮源，5克/升酸水解酪蛋白氨基酸，20克/升半乳糖；
其中：上述转化反应液配方为：10毫摩尔/升Tris-HCl，50克/升可溶淀粉，pH＝9。
Claims (9)
1.一种利用酵母生产β-环糊精的方法，由下述步骤组成：
(1)重组表达载体的构建：
克隆环糊精糖基转移酶基因，经EcoRI和XhoI酶切后插入酵母表达载体pYD1，命名为pYD1/cgt；
(2)重组酵母菌株的构建：
将表达载体pYD1/cgt在转化效价高的大肠杆菌中扩增后，用电转化的方法将其转入酵母菌中，构建重组酵母菌株；在不含色氨酸的YNB-葡萄糖平板上长出的菌落为阳性克隆工程菌株；
(3)环糊精糖基转移酶诱导表达：
将上述阳性克隆工程菌株，接种于YNB-CAA葡萄糖培养基中，25-32℃培养20-30小时，摇床转速为220-260转/分；当YNB-CAA葡萄糖培养基中菌体浓度达OD＝2-5时，将菌体离心收集后转入YNB-CAA半乳糖培养基中，使YNB-CAA半乳糖培养基中菌体浓度达到OD＝0.5-1.0；诱导培养，诱导温度20-25℃，摇床转速为220-260转/分，诱导30-36小时，得到细胞表面表达有CGTase的酵母工程菌；
(4)利用细胞表面表达有环糊精糖基转移酶的酵母生产环糊精：
将上述细胞表面表达有CGTase的酵母工程菌收集后转入含有淀粉的YNB-CAA半乳糖发酵液中发酵或转入转化反应液中进行反应；之后，以12000转/分离心30分钟去除酵母菌体和残余底物，得到含有环糊精的上清液；
其中：发酵条件为20-35℃，摇床转速220-260转/分，发酵时间48-96小时；转化反应液反应条件为20-50℃，反应36-72小时，同时利用100-160转/分的速度摇动以防止菌体沉淀；
(5)产品β-环糊精的分离纯化：
将上述含有环糊精的上清液以常规方法浓缩，当上清液被浓缩至其原体积的10％～20％时，析出物即为β-环糊精，停止浓缩，将浓缩后的上清液以12000转/分离心30分钟，沉淀物即是纯化的β-环糊精。
2.如权利要求1所述的利用酵母生产环糊精的方法，其特征是，步骤(1)所述的环糊精糖基转移酶基因是来源于环状芽孢杆菌251的环糊精糖基转移酶基因。
3 .如权利要求2所述的利用酵母生产环糊精的方法，其特征是，所述的来源于环状芽孢杆菌251的环糊精糖基转移酶基因，其阅读框中含有2139个碱基；编码一个713个氨基酸的蛋白质；包含前面的25个氨基酸组成的信号肽。
4.如权利要求1所述的利用酵母生产环糊精的方法，其特征是，步骤(2)所述的酵母菌株是酿酒酵母菌株-EBY100。
5.如权利要求1所述的利用酵母生产环糊精的方法，其特征是，步骤(3)所述的YNB-CAA葡萄糖培养基培养条件是30℃培养20～24小时，摇床转速为260转/分。
6.如权利要求1所述的利用酵母生产环糊精的方法，其特征是，步骤(3)所述的YNB-CAA半乳糖培养诱导温度是20℃，摇床转速为220转/分，诱导时间为30～36个小时。
7.如权利要求1所述的利用酵母生产环糊精的方法，其特征是，步骤(4)所述的含有淀粉的YNB-CAA半乳糖发酵液配方为：6-7克/升酵母基本氮源，4-6克/升酸水解酪蛋白氨基酸，20克/升半乳糖，30-50克/升可溶淀粉。
8.如权利要求1所述的利用酵母生产环糊精的方法，其特征是，步骤(4)所述的转化反应液配方为：10毫摩尔/升Tris-HCl，30-50克/升可溶淀粉，pH＝6-9。
9.如权利要求1所述的利用酵母生产环糊精的方法，其特征是，步骤(5)所述的含有环糊精的上清液的浓缩还用HPLC对α-环糊精，β-环糊精，γ-环糊精产物比例进行检测来控制进行。
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