CN104480160B - 一种利用环糊精葡萄糖基转移酶生产偶合糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用环糊精葡萄糖基转移酶生产偶合糖的方法，属于生物技术技术领域。采用来源于环状芽孢杆菌Bacillus circulans 251的环糊精葡萄糖基转移酶(β‑CGTase)作用于不同浓度的淀粉和蔗糖，在pH 5.0‑6.0、30‑50℃条件下，偶合糖的转化率(相对于蔗糖)高达66.6％。本发明具有原料转化率高、产品纯度高、工艺流程简单等诸多优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用环糊精葡萄糖基转移酶生产偶合糖的方法，属于生物技术领域。
背景技术
偶合糖(Coupling sugar)，别称呋喃葡萄糖基蔗糖，化学名为α-麦芽糖基-β-D-呋喃果糖苷或4-α-D-吡喃葡萄糖基蔗糖。通常以GnF(G表示葡萄糖，F表示果糖，n＝2-7)来表示偶合糖，其中以G2F最为常见，学名为葡萄糖基蔗糖，即由一分子葡萄糖加一分子蔗糖通过α-1,4-糖苷键连接而成。偶合糖是一种混合物，在自然界中存在于蜂蜜、人参等中。最初是70年代由日本大阪市立工业研究所发明的一种由淀粉和蔗糖通过CGTase合成而制成的糖品，于1979年上市，制品有非结晶性的水饴状、粉末状，由林原(株)等公司企业生产销售。由于偶合糖味质良好，可以防止结晶析出，并且有一定的保水性能，具有低腐蚀性的生物学功能，位于肠道黏膜的水解酶可将其水解，因此可以作为一种新型的甜味剂广泛应用于食品行业。如日本JSD食品(日本特殊疗效食品)，使用70％的偶合糖代替蔗糖作为甜味剂，可用于糖果、糕点、果酱、冰淇淋等的制作；应用于面包制作中，烤出的面包颜色鲜艳，且相较蔗糖可保持长时间的柔软性，这种特性也常被应用于馅的制作中。
生产偶合糖的方法目前只有生物法，有如下两种方式：(a)以淀粉为供体：用乙二酸处理玉米淀粉，蒸煮得到淀粉悬浮液，加入CaCO3粉末中和，过滤除去不溶物，得到环糊精溶液。加入适当蔗糖和CGTase，在一定温度和pH条件下反应24-40h。反应得到的混合液经煮沸灭酶，活性炭脱色和离子交换树脂除掉杂离子，浓缩后得到无色透明的偶合糖粗液。(b)以环糊精为供体：取β-环糊精和蔗糖共溶于水中，加入适量β-CGTase，在一定温度和pH条件下反应24-40h。反应得到的混合液经煮沸灭酶，将其浓缩50％，滤液用活性炭脱色，离子交换树脂脱离子，再次浓缩，得到偶合糖粗液，另外还有葡萄糖、糊精等小分子产生。相比较(a)和(b)两种生产工艺，大多数企业会选择前者，因为虽然后者工艺流程相对简单，更好操作，但是前者用淀粉做供体，生产成本低，更符合企业低投入高回报的经营理念。另外，要想得到更高纯度的偶合糖溶液，可以在上述制备流程后期采取分馏沉淀法、色谱法、膜过滤等方法，从而得到高纯度偶合糖。
偶合糖最初是由日本大阪市立工业研究所和林原商事公司(Hayashibara ShojiInc)开发并于1979年上市，德国、美国等也于上世纪70年代末80年代初完成研制工作。M.Teresa Mart1′n等以可溶性淀粉为供体，比较了游离化CGTase和固定化CGTase分别对偶合糖转化率的影响，得出当供受体比例为1:2，以固定化CGTase催化得到的偶合糖转化率为92％，比游离化CGTase高出了10.8％；C.MONTHIEU等以β-CD为供体，蔗糖为受体，加入来源于Thermoanaerobacter sp.的CGTase，对转化产物进行HPLC检测，尺寸排阻色谱法分离得到A-F六种产物，经质谱分析和NMR核磁鉴定，分别为偶合糖中G2F-G7F 6种组分。国际上对于偶合糖的研究居多，但是制备只是少数，目前国外偶合糖的主要生产公司是日本的Hayashibana Shit公司。
国内对于偶合糖的研究很少，四川省兴文县经济开发办的郭士勋曾在1988年报道过利用红薯淀粉作为原料转化成新糖种偶合糖的研究，回收率高达110％，为贫困山区的脱贫致富开辟了新途径，但上述报道的真实性还有待考证。天津市工业微生物研究所的江海、四川大学曾超、轻工业部食品发酵工业科学研究所的陈瑞娟等也只是对偶合糖这一新型低聚糖有一个简单的阐述，国内并无具体的研究偶合糖的相关报道。
发明内容
本发明所解决的技术问题是提供了一种利用环糊精葡萄糖基转移酶生产偶合糖的生产工艺。
为解决上述问题，本发明技术方案为：
采用来源于环状芽孢杆菌Bacillus circulans 251的环糊精葡萄糖基转移酶(β-CGTase)催化淀粉和蔗糖生成偶合糖；按照5-20％的浓度进行淀粉调浆，在60-90℃条件下搅拌5-15分钟，设定温度30-60℃，调pH 5.0-6.0之后，添加终浓度为5-20％的蔗糖，补加10-100U/g蔗糖的β-CGTase和10-100U/g的异淀粉酶，充分反应18-24小时；随后设定温度50-60℃，向上述反应液中以每毫升反应液50-150个单位的量加入葡萄糖淀粉酶，充分反应6-10小时；采用结晶方法得到偶合糖。
所述微生物发酵生产β-CGTase的方法为，以自己构建的基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET-20b(+)-β-CGTase为出发菌株，在一定培养条件下，发酵一定时间，经过高速离心，去除菌体，得到含有β-CGTase的发酵液，上清即为粗酶液。
所述在60-90℃条件下搅拌5-15分钟淀粉调浆的目的在于使淀粉颗粒充分溶胀。
所述β-CGTase的最适反应温度为40-60℃，温度通过影响酶对底物的催化效率，从而影响酶的活力，温度过高或过低都会影响酶的作用效果。
所述β-CGTase的最适pH范围为5.0-6.0，pH对β-CGTase活力的影响较大，从
降低成本的角度考虑，应该将生产工艺的温度设定在酶最适反应pH附近。
所述β-CGTase活力的测定采用比色法：在pH 10.0左右，由于酚酞和β-CD形成包结复合物而使溶液吸光度下降，在一定浓度范围内吸光度下降值(ΔA)与β-CD浓度之间存在着线性关系。用25mM，pH 5.5的Na2HPO4-KH2PO4缓冲液配制1％的可溶性淀粉作为底物，取2ml底物溶液，50℃孵育10min，加入0.1ml适当稀释的粗酶液，以缓冲液为空白对照，精确反应10min，加入0.2ml 0.6M HCl终止反应，然后加入0.5ml 0.6M Na2CO3调pH至10.0，25℃条件下，加入0.2ml 1.2mM酚酞溶液显色15min，在550nm处测定吸光值。一个酶活单位(U)定义为在上述测定条件下1min内生成1μmβ-CD所需要的酶量。
所述偶合糖的分析采用高效液相色谱。色谱条件：Agilent 1200HPLC色谱仪，Agilent自动进样器，色谱柱Shodex Asahipak NH2P-504E 250x 4.6mm 5μm，Agilent示差检测器；流动相比例(v:v)为乙腈:水(70:30)，流速0.8ml/min；柱温40℃。处理样品时，12000r/min离心15min，弃沉淀，上清用0.45μm超滤膜过滤后取10μL上机分析。
所述通过结晶手段得到偶合糖的具体方法为：
将反应液煮沸，冷却后离心过滤，除去未反应的淀粉和大分子蛋白，即可得到偶合糖的水溶液；将水溶液蒸发浓缩，低温放置即可得到偶合糖的结晶。
本发明的技术原理如下：
β-CGTase除了能发生环化反应生产β-CD外，还能发生水解、歧化和偶合反应，通过歧化和偶合反应将小分子糖转移到蔗糖或果糖上可生成具有抗龋齿功能的偶合糖。通过控制受体蔗糖的浓度不变，改变供体淀粉的浓度，可以获得偶合糖的不同转化率，得到最高转化率。同时，加入的异淀粉酶可以打开底物淀粉中的α-1,6-糖苷键，增大淀粉的利用率，节约成本。
本发明是根据β-CGTase和异淀粉酶以及产物偶合糖的特点生产偶合糖的工艺，相对于现有技术，具有以下优点：
1)提供一种利用环糊精葡萄糖基转移酶生产偶合糖的方法，填补了该技术领域内的空白，为偶合糖大规模的生物法生产奠定了基础；
2)酶反应的温度比较低，不需要进行剧烈的温度变化，低能耗，特别适合工业化生产；
3)用于进行偶合糖生产的酶具有较好的特异性，不需要使用突变等手段即可达到偶合糖的生产要求；
4)通过β-CGTase和异淀粉酶的复配，不仅提高了底物淀粉的利用率，也获得了较高的偶合糖转化率。
总体来讲，本发明具有原料转化率高、产品纯度高、工艺流程简单等诸多优点。
具体实施方式
实施例1：
原料预处理：
按照10％的浓度进行马铃薯淀粉调浆，在60-90℃条件下搅拌5-15分钟，使淀粉颗粒充分溶胀。
酶法生产工艺：
预处理后将温度设定为30℃，调pH 5.5后，添加终浓度为5.0％的蔗糖，补加5.0U/g蔗糖的β-CGTase，充分反应24小时；随后设定温度50-60℃，按照每毫升反应液50-150个单位的量加入葡萄糖淀粉酶，充分反应6-10小时。
偶合糖的提取工艺：
将反应液煮沸，冷却后离心过滤，除去未反应的淀粉和大分子蛋白，即可得到偶合糖的水溶液；将水溶液蒸发浓缩，低温放置即可得到偶合糖的结晶。
结果见表1，偶合糖的转化率可达50.5％。
表1 不同实施例下偶合糖的生产情况
| 实施例 | 偶合糖转化率(％) |
| 1 | 50.5 |
| 2 | 56.0 |
| 3 | 62.3 |
| 4 | 66.6 |
实施例2
原料预处理：
同实施例1
酶法生产工艺：
预处理后将温度设定为40℃，调pH 5.5后，添加终浓度为5.0％的蔗糖，补加5.0U/g蔗糖的β-CGTase，充分反应24小时；随后设定温度50-60℃，按照每毫升反应液50-150个单位的量加入葡萄糖淀粉酶，充分反应6-10小时。
偶合糖的提取工艺：
同实施例1
结果见表1，偶合糖的转化率可达56.0％。
实施例3
原料预处理：
同实施例1
酶法生产工艺：
预处理后将温度设定为40℃，调pH 5.5后，添加终浓度为5.0％的蔗糖，补加10.0U/g蔗糖的β-CGTase，充分反应24小时；随后设定温度50-60℃，按照每毫升反应液50-150个单位的量加入葡萄糖淀粉酶，充分反应6-10小时。
偶合糖的提取工艺：
同实施例1
结果见表1，偶合糖的转化率可达62.3％。
实施例4
原料预处理：
按照5-10％的浓度进行马铃薯淀粉调浆，在60-90℃条件下搅拌5-15分钟，使淀粉颗粒充分溶胀。
酶法生产工艺：
预处理后将温度设定为40℃，调pH 5.5后，添加终浓度为5-20％的蔗糖，补加10.0U/g蔗糖的β-CGTase和24-48U/g淀粉的异淀粉酶，充分反应24小时；随后设定温度50-60℃，按照每毫升反应液50-150个单位的量加入葡萄糖淀粉酶，充分反应6-10小时。
偶合糖的提取工艺：
同实施例1
结果见表1，偶合糖的转化率可达66.6％。
参考文献：
杨玉路,王蕾,陈晟，等.重组β-环糊精葡萄糖基转移酶生产β-环糊精的工艺条件优化.生物技术通报,2014(8):175-181。
Claims (2)
1.一种利用环糊精葡萄糖基转移酶生产偶合糖的方法，其特征在于采用来源于环状芽孢杆菌Bacillus circulans 251的β-环糊精葡萄糖基转移酶β-CGTase催化淀粉和蔗糖生成偶合糖；按照5-20％的浓度进行淀粉调浆，在60-90℃条件下搅拌5-15分钟，设定温度30-60℃，调pH5.0-6.0之后，添加终浓度为5-20％的蔗糖，补加10U/g蔗糖的β-CGTase和24-48U/g淀粉的异淀粉酶，充分反应18-24小时；随后设定温度50-60℃，按照每毫升反应液50-150个单位的量加入葡萄糖淀粉酶，充分反应6-10小时；采用结晶方法得到偶合糖。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述结晶方法为：将反应液煮沸，冷却后离心过滤，除去未反应的淀粉和大分子蛋白，即可得到偶合糖的水溶液；将水溶液蒸发浓缩，低温放置即可得到偶合糖的结晶。
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