JP5481716B2 - サイクロデキストランの製造方法およびサイクロデキストラン合成酵素の製造方法 - Google Patents
サイクロデキストランの製造方法およびサイクロデキストラン合成酵素の製造方法 Download PDFInfo
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Description
(1) デンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物からサイクロデキストラン生産能を有する微生物を、デンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物を含む培地で培養し、培養物よりサイクロデキストランを採取することを特徴とする、サイクロデキストランの製造方法。
(2) デンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物からサイクロデキストラン生産能を有する微生物を、デンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物を含む培地で培養し、得られた培養液をデンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物に作用させることを特徴とする、サイクロデキストランの製造方法。
(3) デンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物からサイクロデキストラン生産能を有する微生物が、バチルス属に属する微生物である、(1)または(2)に記載の製造方法。
(4) バチルス属に属する微生物が、バチルス・サーキュランス(Bacillis circulans)T−3040株(FERM BP−4132)である、(3)に記載の製造方法。
(5) デンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物からサイクロデキストラン生産能を有する微生物が、パエニバチルス属に属する微生物である、(1)または(2)に記載の製造方法。
(6) パエニバチルス属に属する微生物が、パエニバチルス・エスピー598K株(FERM P−19604)である、(5)に記載の製造方法。
(7) デンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物からサイクロデキストラン生産能を有する微生物を、デンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物を含む培地で培養し、培養物よりサイクロデキストラン合成酵素を採取することを特徴とする、サイクロデキストラン合成酵素の製造方法。
(8) デンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物からサイクロデキストラン生産能を有する微生物が、バチルス属に属する微生物である、(7)に記載の製造方法。
(9) バチルス属に属する微生物が、バチルス・サーキュランス(Bacillis circulans)T−3040株(FERM BP−4132)である、(8)に記載の製造方法。
(10) デンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物からサイクロデキストラン生産能を有する微生物が、パエニバチルス属に属する微生物である、(7)に記載の製造方法。
(11) パエニバチルス属に属する微生物が、パエニバチルス・エスピー598K株(FERM P−19604)である、(10)に記載の製造方法。
1.サイクロデキストランの製造方法
本発明のサイクロデキストランの製造方法は、デンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物からサイクロデキストラン生産能を有する微生物を、デンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物を含む培地で培養し、培養物よりサイクロデキストランを採取することを特徴とする。
本発明によればまた、デンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物からサイクロデキストラン生産能を有する微生物を、デンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物を含む培地で培養し、培養物よりサイクロデキストラン合成酵素を採取することを特徴とする、サイクロデキストラン合成酵素の製造方法が提供される。
(実施例1)
(1)T−3040株のデンプン含有培地での培養
バチルス属菌のサイクロデキストラン(CI)生産株として、バチルス・サーキュランス(Bacillis circulans)T−3040株(FERM BP−4132)(以下、T−3040株という)を用いた。2%可溶性デンプン(ナカライテスク社製)、0.5%酵母エキス(バクト社製)、1%トリプトン(バクト社製)、1%NaClの組成の培地を、121℃で20分オートクレーブした後、これにT−3040株を接種し、30℃で3〜6日間振盪培養した。得られた培養液を、遠心し、菌体を取り除き、100℃で10分加熱して冷却し、8,000rpmで20分間遠心し、変性したタンパク等の沈殿を取り除いた。さらに、得られた培養上清に等量のアセトニトリルを加え、15,000rpmで10分間遠心し、沈殿を取り除いた。
上記の方法で得られたデンプン含有培地で培養したT−3040株の培養上清を、高速液体クロマトグラフLC−10ADVP(島津社製)とAmide−80カラム(4.6mm×25cm)(東ソー社製)を用いて分析した。溶出は50%アセトニトリルで流速1mL/分にて行い、検出には、噴霧蒸発光散乱検出器ELSD−LT(島津社製)を用い、データ解析には、分析ソフトウェアCLASS−VP(島津社製)を用いた。
上記のT−3040株の培養上清に、ブタ膵臓由来α−アミラーゼ(シグマ社製)、多分岐デキストラン水解酵素(以下、HBDaseという)、およびリゾープス・エスピー由来グルコアミラーゼ(ワコー社製)を加え、20mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)中で、40℃にて一晩反応を行い、α−1,4グルコシド結合を分解すると同時に、直鎖のオリゴ糖や多糖をすべてグルコースまで分解した(酵素処理1)。この酵素処理により培養上清にはα−1,4結合以外の環状糖のみが残存することになる。
ピークa:C42H70O35
ピークb:C48H80O40
ピークc:C54H90O45
ピークd:C60H100O50
ピークe:C66H110O55
ピークf:C72H120O60
(1)598K株のデンプン含有培地での培養
バチルス属菌のCI生産株として、パエニバチルス・エスピー598K株(FERM P−19604)(以下、598K株という)を用いた。2%可溶性デンプン(ナカライテスク社製)、0.5%酵母エキス(バクト社製)、1%トリプトン(バクト社製)、1%NaClの組成の培地を、121℃で20分オートクレーブした後、これに598K株を接種し、30℃で2〜4日間振盪培養した。得られた培養液を、遠心し、菌体を取り除き、100℃で10分加熱して冷却し、8,000rpmで20分間遠心し、変性したタンパク等の沈殿を取り除いた。さらに、得られた培養上清に等量のアセトニトリルを加え、15,000rpmで10分間遠心し、沈殿を取り除いた。
上記の方法で得られたデンプン含有培地で培養した598K株の培養上清を、高速液体クロマトグラフLC−10ADVP(島津社製)とAmide−80カラム(4.6mm×25cm)(東ソー社製)を用いて分析した。溶出は50%アセトニトリルで流速1mL/分にて行い、検出には、噴霧蒸発光散乱検出器ELSD−LT(島津社製)を用い、データ解析には、分析ソフトウェアCLASS−VP(島津社製)を用いた。
上記の598K株の培養上清に、α−アミラーゼ、HBDase、およびグルコアミラーゼを加え、実施例1と同様に酵素処理1を行った。
ピークc:C54H90O45
ピークd:C60H100O50
T−3040および598Kの2菌株について、それぞれ培養日数と培養上清50ml中にデンプン1gから生産されたサイクロデキストラン量を下記表3に示す。T−3040株では培養4日でデンプンの約20%がサイクロデキストランに転換され、598K株は培養3日で約3%がサイクロデキストランに転換された。T−3040株をさらに培養を続けると50%程度のデンプンがサイクロデキストランに転換された。
T−3040および598Kの2菌株について、それぞれ培養日数と培養上清50ml中に生産されたサイクロデキストラン合成酵素の酵素活性を下記表4に示す。サイクロデキストラン合成酵素量は、T−3040株の培養液の場合は、2%デキストラン40(アマシャムファルマシア製)、10mM CaCl2を含む40mM 酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)中で、40℃で反応を行い、598K株の培養液の場合は、2%デキストラン40(アマシャムファルマシア製)を含む40mM Tris−マレイン酸緩衝液(pH8.0)中で、50℃で反応を行うことによって測定した。酵素1Uは1分間に1μmolのCI(CI−7,CI−8,CI−9の合計量)を生産する酵素量とする。サイクロデキストラン生産酵素として望ましい酵素活性は0.12U/ml以上という報告があるが(川端康之, 北尾悟, 舟根和美, 渡嘉敷唯章, 儀部茂八, 宮城貞夫:ニトロソグアニジン変異およびストレプトマイシン耐性変異による環状イソマルトオリゴ糖合成酵素(CITase)生産菌Bacillus circulans の育種. 食品・臨床栄養 1:43-48, 2006)、T−3040株はデンプン含有培地で培養することにより4日間で目標の酵素量に達し、598K株は3日間で目標の1/10の酵素量に達した。
T−3040株をデンプン含有培地で4日間培養した培養上清、および598K株をデンプン含有培地で3日間培養した培養上清に、さらにデンプンをそれぞれ加えて24時間反応させ、合成されたサイクロデキストラン(CI)量とデンプンを基質とした場合のサイクロデキストラン合成酵素活性を下記表5に示す。サイクロデキストラン合成酵素活性は、2%可溶性デンプン(ナカライテスク社製)、10mM CaCl2を含む40mM 酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)中で、40℃にて24時間で反応を行うことによって測定した。酵素1Uは1分間に1μmolのCI(CI−7,CI−8,CI−9の合計量)を生産する酵素量とする。デンプンを基質とした場合のサイクロデキストラン合成酵素活性は強くないが、菌体を除いた培養上清にさらにデンプンを加えることによってサイクロデキストラン生産を行うことができた。
Claims (2)
- バチルス・サーキュランス(Bacillus circulans)T−3040株(FERM BP−4132)またはパエニバチルス・エスピー598K株(FERM P−19604)を、デンプンを含む培地で培養し、培養物よりサイクロデキストランを採取することを特徴とする、サイクロデキストランの製造方法。
- バチルス・サーキュランス(Bacillus circulans)T−3040株(FERM BP−4132)またはパエニバチルス・エスピー598K株(FERM P−19604)を、デンプンを含む培地で培養し、得られた培養液をデンプンに作用させることを特徴とする、サイクロデキストランの製造方法。
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