JP5481716B2

JP5481716B2 - サイクロデキストランの製造方法およびサイクロデキストラン合成酵素の製造方法

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Publication number: JP5481716B2
Application number: JP2007276158A
Authority: JP
Inventors: 和美舟根; 本光北岡; 康之川端; 貞夫宮城; 茂八儀部
Original assignee: National Agriculture and Food Research Organization
Current assignee: National Agriculture and Food Research Organization
Priority date: 2006-12-13
Filing date: 2007-10-24
Publication date: 2014-04-23
Anticipated expiration: 2027-10-24
Also published as: JP2008167744A

Description

本発明は、新規なサイクロデキストランの製造方法およびサイクロデキストラン合成酵素の製造方法に関する。

従来から用いられているサイクロデキストランの合成技術は、まず砂糖からデキストランを合成し、続いてデキストンからサイクロデキストランを合成するという二段階の工程からなる。具体的には、砂糖を含む培地でデキストラン合成酵素生産菌を培養してデキストランを合成し（非特許文献１）、その一方で、デキストランを含む培地でサイクロデキストラン合成酵素生産菌を培養してサイクロデキストラン合成酵素液を調製し（非特許文献２）、これをデキストランに加えてサイクロデキストランを合成する（特許文献１〜６）。また、遺伝子組換え技術を用いて製造したサイクロデキストラン合成酵素をデキストランに作用させて合成する方法も報告される（特許文献７〜８）。

従来のサイクロデキストラン生産技術で原料として用いている砂糖は、一般に糖類の原料として用いられているデンプンなどと比較して価格が高い。また、砂糖はグルコースとフルクトースより成るが、デキストランを合成する際、フルクトース部分は用いられないので、５０％が廃棄されることなる。また、前記各種の従来法で行われているサイクロデキストラン合成酵素によるデキストランからサイクロデキストランへの転換効率は５０％未満と低い。従って、砂糖を原料としてサイクロデキストランを合成した場合、最終的な収率は最大２５％であり、また廃棄物も多いため、製造効率が極めて悪く、コスト高となるのが問題である。従って、サイクロデキストランをより効率的にかつ安価に製造できる手段が望まれている。

特許第３０７５８７３号特許第３１１７３２８号特開２００２−５１７９６号特開２００２−５１７９７号特開２００４−１６６６２４号特開２００５−１９２５１０号特許第３４２９５６９号特許第３４８７７１１号 Funane K., Matsuo M., Ono H., Ishii T., Gibu S., Tokashiki T., Kobayashi M., Characterization of glucans and glucansucrases from novel Leuconostoc strains (including sp. S-51). J. Appl. Glycosci., 50(3):379-382 (2003) Oguma, T., Tobe, K., Kobayashi, M., Purification and properties of a novel enzyme from Bacillus sp. T-3040, which catalyzes the conversion of dextran to cyclic isomaltooligosaccharides. FEBS Lett., 345, 135-138 (1994)

本発明の課題は、サイクロデキストランを効率的にかつ安価に製造する方法を提供することを目的とする。

本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、バチルス属またはパエニバチルス属に属する微生物の中に、デンプンと培養することによりサイクロデキストランを生産する能力を有する微生物を見出し、この微生物を利用してデンプンから一段階でサイクロデキストランを製造することに成功した。

すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
(1) デンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物からサイクロデキストラン生産能を有する微生物を、デンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物を含む培地で培養し、培養物よりサイクロデキストランを採取することを特徴とする、サイクロデキストランの製造方法。
(2) デンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物からサイクロデキストラン生産能を有する微生物を、デンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物を含む培地で培養し、得られた培養液をデンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物に作用させることを特徴とする、サイクロデキストランの製造方法。
(3) デンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物からサイクロデキストラン生産能を有する微生物が、バチルス属に属する微生物である、(1)または(2)に記載の製造方法。
(4) バチルス属に属する微生物が、バチルス・サーキュランス（Bacillis circulans）Ｔ−３０４０株（ＦＥＲＭＢＰ−４１３２)である、(3)に記載の製造方法。
(5) デンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物からサイクロデキストラン生産能を有する微生物が、パエニバチルス属に属する微生物である、(1)または(2)に記載の製造方法。
(6) パエニバチルス属に属する微生物が、パエニバチルス・エスピー５９８Ｋ株（ＦＥＲＭＰ−１９６０４）である、(5)に記載の製造方法。
(7) デンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物からサイクロデキストラン生産能を有する微生物を、デンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物を含む培地で培養し、培養物よりサイクロデキストラン合成酵素を採取することを特徴とする、サイクロデキストラン合成酵素の製造方法。
(8) デンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物からサイクロデキストラン生産能を有する微生物が、バチルス属に属する微生物である、(7)に記載の製造方法。
(9) バチルス属に属する微生物が、バチルス・サーキュランス（Bacillis circulans）Ｔ−３０４０株（ＦＥＲＭＢＰ−４１３２)である、(8)に記載の製造方法。
(10) デンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物からサイクロデキストラン生産能を有する微生物が、パエニバチルス属に属する微生物である、(7)に記載の製造方法。
(11) パエニバチルス属に属する微生物が、パエニバチルス・エスピー５９８Ｋ株（ＦＥＲＭＰ−１９６０４）である、(10)に記載の製造方法。

本発明のサイクロデキストランの製造方法は、原料に砂糖ではなくデンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物を用いるため、従来法に比べて原料が安価である。また、従来法は砂糖からデキストラン、デキストランからサイクロデキストランを合成するという２段階反応であるのに対し、本発明はデンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物から１段階反応でサイクロデキストラン発酵生産を行うために工程が１回で済み、簡便である。本発明の方法により得られるデキストラン合成酵素の活性は、従来のデキストランを含有する培地でバチルス属菌を培養することによって得られるサイクロデキストラン合成酵素の活性と比べて、約100倍で非常に高活性である。さらに、従来の砂糖を原料とするサイクロデキストランの合成では、収率が約２５％であるのに対し、本発明のデンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物を原料とするサイクロデキストランの合成では、収率が約５０％となる。また、従来法では利用されないフルクトースが副産物として大量に余るが、本発明では原料とするデンプンはすべてサイクロデキストランに転換可能なグルコースより成るので廃棄部分が著しく減少する。

以下、本発明を詳細に説明する。
１．サイクロデキストランの製造方法
本発明のサイクロデキストランの製造方法は、デンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物からサイクロデキストラン生産能を有する微生物を、デンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物を含む培地で培養し、培養物よりサイクロデキストランを採取することを特徴とする。

本発明方法に用いることのできる微生物としては、デンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物からサイクロデキストラン生産能を有する微生物であれば特に限定はされないが、例えば、バチルス属に属する微生物またはパエニバチルス属に属する微生物が挙げられる。バチルス属に属する微生物として、具体的には、バチルス・サーキュランス（Bacillis circulans）Ｔ−３０４０株（ＦＥＲＭＢＰ−４１３２)、パエニバチルス属に属する微生物として、パエニバチルス・エスピー５９８Ｋ株（ＦＥＲＭＰ−１９６０４）が好適に用いられる。

本発明方法で製造されるサイクロデキストランとは、グルコース５〜３３分子がα-１，６結合により環状構造を形成してなるサイクロデキストラン（ＣＩ−５〜ＣＩ−３３）を含むものであればよく、特には、グルコース７〜１２分子がα-１，６結合により環状構造を形成してなるサイクロデキストラン（ＣＩ−７〜ＣＩ−１２）をいい、これらのサイクロデキストランの全種または複数種の混合物であってもよい。

上記微生物の培養は、一般微生物の好気的培養で通常行われる方法を用いることができ、例えば、液体培地による振盪培養法または通気攪拌培養法等が用いられる。培地としては、上記サイクロデキストランの原料となるデンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物を含んだものであれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。培地中のデンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物の濃度は０．５〜５０％が適当である。

デンプン以外の培地成分としては、当該技術分野で通常用いられる炭素源、窒素源、無機塩類、及び必要な栄養源等が用いられる。炭素源としては、該微生物が資化し得るものであればよく、炭水化物（グルコース、マンノース、グリセロール、マンニトール等の糖類等）、有機酸（酢酸、プロピオン酸、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸等）、アルコール類（エタノール、プロパノール等）が用いられる。窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩、又はペプトン、ポリペプトン、トリプトン、酵母エキス、麦芽エキス、肉エキス、コーンスチープリカー等の含窒素化合物が用いられる。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等、が用いられる。デンプン以外の上記培地成分の使用量は微生物の培養に用いられる一般的な培地の例に従えばよい。

また、上記のデンプンの成分としては、アミロース、アミロペクチンなどが挙げられ、デンプンまたはデンプンの成分の部分分解物としては、デキストリン、マルトオリゴ糖などが挙げられる。

培地のｐＨは、本微生物が成育するｐＨ域ならばいずれでもよいが、通常は、６〜８の範囲が好ましい。ｐＨの調整は、無機酸又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養条件は、例えば、通常２０〜４０℃、好ましくは３０℃で、１６時間〜６日間、好ましくは３〜４日間振盪培養または通気攪拌培養を行う。

以上のような条件で所定の時間培養した後、培養物からサイクロデキストランを採取する。培養物からサイクロデキストランを採取する方法としては、通常のオリゴ糖分離方法であればいかなる方法でもよく、例えば、遠心分離、膜濃縮等により菌体を除去し、上清液を回収する。その後、当該上清液を公知の精製法に従って処理することにより、高純度のサイクロデキストラン画分を得ることができる。サイクロデキストランの精製法としては、オリゴ糖の精製に一般に用いられている公知の方法であればいずれでもよく、例えば、冷却処理、有機溶媒添加処理、活性炭処理、または特異的にサイクロデキストランを吸着するカラムクロマトグラフィー、活性炭カラムクロマトグラフィー等の方法を、単独もしくは適宜組み合わせて用いることができる。更に、必要に応じて分配吸着モードのカラムを用いたＨＰＬＣ等の精製手段を用いて、個々のサイクロデキストランの高純度品を得ることが出来る。

上記の培養において微生物の形態は、微生物の菌体であっても、菌体処理物（例えば、菌体破砕物）であってもよい。微生物の菌体または菌体処理物は固定化して用いることもできる。固定化法としては、従来公知の担体結合法、架橋化法、包括法などの方法が挙げられる。担体結合法では、担体に菌体を固定化させるが、固定化は物理的吸着、イオン結合、共有結合のいずれであってもよい。担体としては多糖（アセチルセルロース、アガロース）、無機物質（多孔質ガラス、金属酸化物）、合成高分子（ポリアクリルアミド、ポリスチレン）等が用いられる。架橋化法では、グルタルアルデヒド等の二官能性試薬を用いて菌体同士を架橋、結合させることによって固定化する。また、包括法では、多糖（アルギン酸、カラギーナン）、ポリアクリルアミド、コラーゲン、ポリウレタン等の高分子ゲルの格子や半透膜カプセルに菌体を包み込むことによって固定化する。

本発明のサイクロデキストランの製造方法は、他の態様として、デンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物からサイクロデキストラン生産能を有する微生物を、デンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物を含む培地で培養し、得られた培養液をデンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物に作用させる方法でもよい。

まず、上記の微生物を同様な培地で培養し、培養物の中から培養液を回収する。次に、得られた培養液をデンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物の溶液と混合し、培養液中に含まれる酵素と、デンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物を反応させる。デンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物の濃度は０．５〜５０％が好ましい。また、デンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物との反応には、培養液の除菌濃縮液を用いてもよく、また、培養液から後記の方法にて精製した精製酵素を用いてもよい。

反応は、温度１０〜６０℃、好ましくは４０℃、ｐＨ４．５〜１０．０、好ましくは５．０〜８．０の範囲で、反応時間１０〜７２時間、好ましくは４８時間行う。また必要により反応液の撹拌及びメタノール、エタノール等の有機溶媒の反応液への添加を行う。

この反応により、デンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物は、サイクロデキストランに転換される。反応液からサイクロデキストランを採取する方法は、上述した微生物菌体をデンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物を含む培地で培養する方法と同様にして行うことができる。

２．サイクロデキストラン合成酵素の製造方法
本発明によればまた、デンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物からサイクロデキストラン生産能を有する微生物を、デンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物を含む培地で培養し、培養物よりサイクロデキストラン合成酵素を採取することを特徴とする、サイクロデキストラン合成酵素の製造方法が提供される。

上記微生物の培養は１．に記載の方法と同様にして行う。培養終了後、培養物よりサイクロデキストラン合成酵素を分離するには遠心分離、膜濃縮等により除菌及び濃縮するのみでもよく、さらに、必要に応じて、通常用いられる酵素の精製法により粗酵素液から精製酵素を得る。培養物よりサイクロデキストラン合成酵素を採取するには、通常の酵素採取手段を用いて得ることができる。例えば、常法により菌体を超音波破砕処理、摩砕処理等で破砕するか、または、リゾチーム等の溶菌酵素を用いて本酵素を抽出するか、または、トルエン等の存在下で振盪または放置して自己消化させ、本酵素を菌体外に排出させる。この溶菌液を濾過、遠心分離等して固形部分を除去し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩、プロタミン硫酸塩、または硫酸マンガンにより除核酸したのち、これに硫安、アルコール、アセトン等を添加して分画し、沈殿物を採取し、これを水に透析した後、真空乾燥して粗酵素を得る。

更に、サイクロデキストラン合成酵素の精製標品を得るには、DEAE-セファロース（ジエチルアミンエチルセファロース、ファルマシア社製）、DEAE-セファデックス（ファルマシア社製）、リソースＱ（アマシャム・バイオサイエンス社製）等のイオン交換クロマトグラフィー、あるいは、リソースＩＳＯ（アマシャム・バイオサイエンス社製）等の疎水クロマトグラフィー、あるいは、セファデックスG−200（ファルマシア社製）、バイオラッドP-150（バイオラッド社製）、スーパーロース１２（アマシャム・バイオサイエンス社製）等のゲル濾過による各種クロマトグラフィーを行い、必要により、TSK gel DEAE-5PW（東ソー社製）等のイオン交換クロマトグラフィー、あるいは、TSK gel エーテル5PW〔東ソー社製〕、TSK gel フェニル5PW〔東ソー社製〕等の疎水クロマトグラフィー、あるいは、TSK gel G3,000SW（東ソー社製）等のHPLC（高速液体クロマトグラフィー）操作を適宜組み合わせて実施することにより、高度に精製されたサイクロデキストラン合成酵素を得ることができる。

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。
（実施例１）
（１）Ｔ−３０４０株のデンプン含有培地での培養
バチルス属菌のサイクロデキストラン（ＣＩ）生産株として、バチルス・サーキュランス（Bacillis circulans）Ｔ−３０４０株（ＦＥＲＭＢＰ−４１３２)（以下、Ｔ−３０４０株という）を用いた。２％可溶性デンプン（ナカライテスク社製）、０．５％酵母エキス（バクト社製）、１％トリプトン（バクト社製）、１％ＮａＣｌの組成の培地を、１２１℃で２０分オートクレーブした後、これにＴ−３０４０株を接種し、３０℃で３〜６日間振盪培養した。得られた培養液を、遠心し、菌体を取り除き、１００℃で１０分加熱して冷却し、８，０００ｒｐｍで２０分間遠心し、変性したタンパク等の沈殿を取り除いた。さらに、得られた培養上清に等量のアセトニトリルを加え、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、沈殿を取り除いた。

（２）反応産物の分析
上記の方法で得られたデンプン含有培地で培養したＴ−３０４０株の培養上清を、高速液体クロマトグラフＬＣ−１０ＡＤＶＰ（島津社製）とＡｍｉｄｅ−８０カラム（４．６ｍｍ×２５ｃｍ）（東ソー社製）を用いて分析した。溶出は５０％アセトニトリルで流速１ｍL／分にて行い、検出には、噴霧蒸発光散乱検出器ＥＬＳＤ−ＬＴ（島津社製）を用い、データ解析には、分析ソフトウェアＣＬＡＳＳ−ＶＰ（島津社製）を用いた。

また、スタンダードのＣＩは、特開２００４−１６６６２４号（特許文献５）に示した方法に従い、上記Ｔ−３０４０株由来のサイクロデキストラン合成酵素（ＣＩＴａｓｅ）にデキストランを添加して合成した、ＣＩ−７（グルコースがα−１，６結合で７個環状に連なったサイクロデキストラン）、ＣＩ−８（グルコースがα−１，６結合で８個環状に連なったサイクロデキストラン）、ＣＩ−９（グルコースがα−１，６結合で９個環状に連なったサイクロデキストラン）、ＣＩ−１０（グルコースがα−１，６結合で１０個環状に連なったサイクロデキストラン）、ＣＩ−１１（グルコースがα−１，６結合で１１個環状に連なったサイクロデキストラン）、ＣＩ−１２（グルコースがα−１，６結合で１２個環状に連なったサイクロデキストラン）をそれぞれ分離精製して^１３ＣＮＭＲ分析及び質量分析で構造決定をしたものを用いた。なお、上記のＣＩＴａｓｅは、Ｔ−３０４０株を培養して得られたものでもよいが、遺伝子組換え技術を用いてＣＩＴａｓｅ遺伝子を組み込んだ大腸菌等により発現させたものを用いてもよい。

図１に示すように、スタンダードのＣＩ（図１の上段）であるＣＩ−７、ＣＩ−８、ＣＩ−９、ＣＩ−１０、ＣＩ−１１、およびＣＩ−１２と同じリテンションタイムに溶出するオリゴ糖ピークが、Ｔ−３０４０株の培養上清（培養４日目）にａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｅ，ｆとして認められた（図１の中段）。

（３）反応産物の酵素分解
上記のＴ−３０４０株の培養上清に、ブタ膵臓由来α−アミラーゼ（シグマ社製）、多分岐デキストラン水解酵素（以下、ＨＢＤａｓｅという）、およびリゾープス・エスピー由来グルコアミラーゼ（ワコー社製）を加え、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中で、４０℃にて一晩反応を行い、α−１，４グルコシド結合を分解すると同時に、直鎖のオリゴ糖や多糖をすべてグルコースまで分解した（酵素処理１）。この酵素処理により培養上清にはα−１，４結合以外の環状糖のみが残存することになる。

なお、上記で用いるＨＢＤａｓｅは、特許第３６０７７８９号記載のスフィンゴバクテリウム・エスピーＶ−５４（ＦＥＲＭＰ−１６０８６）を培養して得られたものでもよく、また、特開２００１−０５４３８２号公報記載の大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−３）（ＦＥＲＭＰ−１７５１０）等の多分岐デキストラン水解酵素遺伝子を導入した大腸菌形質転換体を培養して得られたものでもよい。

上記酵素処理１後の培養上清について同様にして高速液体クロマトグラフィーによる分析を行ったところ、前述のピークａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｅ，ｆは消失しなかったことから、これらのピークは環状構造を持ち、α−１，４結合を持たないことが示された（図２の上段）。

一方、上記のＴ−３０４０株の培養上清に、Chetomium erraticum由来デキストラナーゼＬ(天野エンザイム社製)を添加し、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中で６０℃にて４時間反応を行い、α−１，６グルコシド結合を分解した（酵素処理２）。

上記酵素処理２後の培養上清について同様にして高速液体クロマトグラフィーによる分析を行ったところ、前述のピークｂ，ｃ，ｄ，ｅ，ｆはすべて消失し、ピークａもかなり減少したことから、これらのピークは、α−１，６グルコシド結合から成ることが示された（図２の下段）。

以上の結果から、Ｔ−３０４０菌株をデンプン含有培地で培養したときに生成するオリゴ糖は、α−１，６グルコシド結合からなる環状オリゴ糖、サイクロデキストランであることが推定された。さらにＴ−３０４０菌株のデンプン含有培地で培養したときに生成するオリゴ糖がサイクロデキストランであることを、ＮＭＲ分析および質量分析で確認した。

具体的には、Ｔ−３０４０株を、２％デンプンを含む培地で４日間培養し、菌体を遠心で取り除いた培養上清１００ｍｌを１００℃で１０分加熱後、冷却し、８，０００ｒｐｍで２０分間遠心し、沈殿を取り除いた。遠心上清に体積の２培量のエタノールを加え、よく攪拌した後、再び８，０００ｒｐｍで２０分間遠心し、沈殿を取り除いた。遠心上清のエタノールをロータリーエバポレーターによって取り除いた。

上記方法で得た反応液にＨＢＤａｓｅを加え、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中にて３０℃で１２時間反応を行い、残存した直鎖のオリゴ糖又はデキストランをすべてグルコースまで分解した。ここで、ＨＢＤａｓｅは特開平１０−２２９８７６号公報記載のスフィンゴバクテリウム・エスピーＶ−５４（ＦＥＲＭＰ−１６０８６）を培養して得られたものでもよく、また特開２００１−０５４３８２号公報記載の大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２３３−３−３）（ＦＥＲＭＰ−１７５１０）等の多分岐デキストラン水解酵素遺伝子を導入した大腸菌形質転換体を培養して得られたものでもよい。これを１００℃で１０分間加熱後冷却し、８，０００ｒｐｍで２０分間遠心し、沈殿を取り除いた。

このようにして得た遠心上清を逆相カラムＳｅｐ−ＰａｋＣ−１８カートリッジ（ウォーターズ社製）に通し、水で洗浄し、吸着しない直鎖のオリゴ糖又はデキストランを取り除いた。ついで、２０％エタノールでカラムに吸着している画分を溶出した。これを遠心濃縮機またはロータリーエバポレーターによってエタノールを取り除き、ついで凍結乾燥させた後、５０％アセトニトリルに溶かして１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、ごみを取り除いた。

上記方法で得た反応液を、高速液体クロマトグラフＳＰＤ６ＡＶ（島津社製）とＡｍｉｄｅ−８０カラム（２１．５ｍｍ×３０ｃｍ）（東ソー社製）を用いて５５％アセトニトリルで流速５ｍL／分で分離し、示唆屈折計ＲＩＭｏｄｅｌ５０４（ＧＬサイエンス社製）で検出されるピークａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ（図２の酵素処理１で観察されるピークａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆに相当。順にＣＩ−７、ＣＩ−８、ＣＩ−９、ＣＩ−１０、ＣＩ−１１、ＣＩ−１２と推定される）をそれぞれ集めてロータリーエバポレーターで濃縮、次いで凍結乾燥した。

上記のようにして得られたオリゴ糖の構造を^１３ＣＮＭＲで解析した。具体的には１〜１．５ｍｇ／０．６ｍＬの濃度の環状オリゴ糖溶液になるように、重水（Ｄ_２Ｏ）（アルドリッチ社製）に溶かし、指標として０．０２５％３−（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ）−１−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｐｈｏｎｉｃａｃｉｄ（ＤＳＳ）を加え、５００ＭＨｚのＮＭＲ装置（ＡＶＡＮＣＥ５００、Ｂｒｕｋｅｒ社製）により３０８Ｋで、完全デカップリングの条件で^１３Ｃ一次元スペクトルを測定した。

対照として既に構造解析がなされているＣＩ−７の精製品も同じ条件で^１３ＣＮＭＲで解析した。その結果、下記表１に示すように、ピークａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆはＣＩ−７と全く同様のα−１，６結合のグルコースを示すシグナルが観察された。

次に、これらオリゴ糖の質量分析を行った。オリゴ糖の凍結乾燥標品それぞれ０．１ｍｇ以下を日本電子製のＪＭＳＨＸ−１１０／１１０Ａで、正イオンモードでグリセロールをマトリクスとして測定した。Ｔ−３０４０株がデンプンから生産するオリゴ糖ピークａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆの測定結果を同じく下記表１に示す。

サイクロデキストランは、同じグルコース分子より成る直鎖のイソマルトオリゴ糖よりもＨ_２Ｏ分子が１分子少なく、それぞれのサイクロデキストランの分子量は、ＣＩ−７が１１３４、ＣＩ−８が１２９６、ＣＩ−９が１４５８、ＣＩ−１０が１６２０、ＣＩ−１１が１７８２、ＣＩ−１２が１９４４と計算される。

ピークａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆはすべて１価イオン［Ｍ＋Ｈ］^＋（分子量より水素１分子が多い値を示す）が観察された。その結果、質量分析によるオリゴ糖ピークａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆの推定分子量はピークａがＣＩ−７、ピークｂがＣＩ−８、ピークｃがＣＩ−９、ピークｄがＣＩ−１０、ピークｅがＣＩ−１１、ピークｆがＣＩ−１２の分子量に一致した。

上記^１３ＣＮＭＲ分析及び質量分析の結果、バチルス・サーキュランスＴ−３０４０株が原料デンプンより生産するオリゴ糖ピークａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆはすべてグルコースがα−１，６結合で環状につながった環状イソマルトオリゴ糖すなわちサイクロデキストランであり、それらの分子式は下記のように示されることを確認した。これらはＴ−３０４０株がデキストランから生産するサイクロデキストランＣＩ−７、ＣＩ−８、ＣＩ−９、ＣＩ−１０、ＣＩ−１１、ＣＩ−１２と全く同じ構造である。
ピークａ：Ｃ_４２Ｈ_７０Ｏ_３５
ピークｂ：Ｃ_４８Ｈ_８０Ｏ_４０
ピークｃ：Ｃ_５４Ｈ_９０Ｏ_４５
ピークｄ：Ｃ_６０Ｈ_１００Ｏ_５０
ピークｅ：Ｃ_６６Ｈ_１１０Ｏ_５５
ピークｆ：Ｃ_７２Ｈ_１２０Ｏ_６０

（実施例２）
（１）５９８Ｋ株のデンプン含有培地での培養
バチルス属菌のＣＩ生産株として、パエニバチルス・エスピー５９８Ｋ株（ＦＥＲＭＰ−１９６０４）（以下、５９８Ｋ株という）を用いた。２％可溶性デンプン（ナカライテスク社製）、０．５％酵母エキス（バクト社製）、１％トリプトン（バクト社製）、１％ＮａＣｌの組成の培地を、１２１℃で２０分オートクレーブした後、これに５９８Ｋ株を接種し、３０℃で２〜４日間振盪培養した。得られた培養液を、遠心し、菌体を取り除き、１００℃で１０分加熱して冷却し、８，０００ｒｐｍで２０分間遠心し、変性したタンパク等の沈殿を取り除いた。さらに、得られた培養上清に等量のアセトニトリルを加え、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、沈殿を取り除いた。

（２）反応産物の分析
上記の方法で得られたデンプン含有培地で培養した５９８Ｋ株の培養上清を、高速液体クロマトグラフＬＣ−１０ＡＤＶＰ（島津社製）とＡｍｉｄｅ−８０カラム（４．６ｍｍ×２５ｃｍ）（東ソー社製）を用いて分析した。溶出は５０％アセトニトリルで流速１ｍL／分にて行い、検出には、噴霧蒸発光散乱検出器ＥＬＳＤ−ＬＴ（島津社製）を用い、データ解析には、分析ソフトウェアＣＬＡＳＳ−ＶＰ（島津社製）を用いた。

図１に示すように、スタンダードのＣＩ（図１の上段）であるＣＩ−７、ＣＩ−８、ＣＩ−９、ＣＩ−１０と同じリテンションタイムに溶出するオリゴ糖ピークが、５９８Ｋ株の培養上清（培養４日目）にもそれぞれａ，ｂ，ｃ，ｄとして検出された（図１の下段）。

（３）反応産物の酵素分解
上記の５９８Ｋ株の培養上清に、α−アミラーゼ、ＨＢＤａｓｅ、およびグルコアミラーゼを加え、実施例１と同様に酵素処理１を行った。

上記酵素処理１後の培養上清について、同様にして高速液体クロマトグラフィーによる分析を行ったところ、前述のピークａ，ｂ，ｃ，ｄは消失しなかったことから、これらのピークは環状構造を持ち、α−１，４結合を持たないことが示された（図３の上段）。

一方、上記の５９８Ｋ株の培養上清に、デキストラナーゼＬを添加し、実施例１と同様にし酵素処理２を行った。

上記酵素処理２後の培養上清について、同様にして高速液体クロマトグラフィーによる分析を行ったところ、前述のピークｃ，ｄは消失し、ピークａ，ｂもかなり減少したことから、これらのピークは、α−１，６グルコシド結合から成ることが示された（図３の下段）。

以上の結果から、５９８Ｋ菌株をデンプン含有培地で培養したときに生成するオリゴ糖もまたα−１，６グルコシド結合からなる環状オリゴ糖、サイクロデキストランであることが推定された。さらに５９８Ｋ菌株のデンプン含有培地で培養したときに生成するオリゴ糖がサイクロデキストランであることを、ＮＭＲ分析および質量分析で確認した。

具体的には、５９８Ｋ株を、２％デンプンを含む培地で４日間培養し、菌体を遠心で取り除いた培養上清１００ｍｌを１００℃で１０分加熱後、冷却し、８，０００ｒｐｍで２０分間遠心し、沈殿を取り除いた。遠心上清に体積の２培量のエタノールを加え、よく攪拌した後、再び８，０００ｒｐｍで２０分間遠心し、沈殿を取り除いた。遠心上清のエタノールをロータリーエバポレーターによって取り除いた。

上記方法で得た反応液を、高速液体クロマトグラフＳＰＤ６ＡＶ（島津社製）とＡｍｉｄｅ−８０カラム（２１．５ｍｍ×３０ｃｍ）（東ソー社製）を用いて５５％アセトニトリルで流速５ｍL／分で分離し、示唆屈折計ＲＩＭｏｄｅｌ５０４（ＧＬサイエンス社製）で検出されるピークｃ、ｄ（図３の酵素処理１で観察されるピークｃ、ｄに相当。順にＣＩ−９、ＣＩ−１０と推定される）をそれぞれ集めてロータリーエバポレーターで濃縮、次いで凍結乾燥した。

対照として既に構造解析がなされているＣＩ−９の精製品も同じ条件で^１３ＣＮＭＲで解析した。その結果、下記表２に示すように、ピークｃ、ｄはＣＩ−９と全く同様のα−１，６結合のグルコースを示すシグナルが観察できた。

次に、これらオリゴ糖の質量分析を行った。オリゴ糖の凍結乾燥標品それぞれ０．１ｍｇ以下をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳＲＥＦＬＥＸＩＩ（ＢｒｕｋｅｒＤａｌｔｏｎｉｋ社製ＧｍｂＨ、ブレーメン、ドイツ）で測定した。５９８Ｋ株がデンプンから生産するオリゴ糖ピークｃ、ｄの測定結果を同じく下記表２に示す。

サイクロデキストランは、同じグルコース分子より成る直鎖のイソマルトオリゴ糖よりもＨ_２Ｏ分子が１分子少なく、それぞれのサイクロデキストランの分子量は、ＣＩ−９が１４５８、ＣＩ−１０が１６２０と計算される。

ピークｃ、ｄはいずれも１価イオン［Ｍ＋Ｎａ］^＋（分子量よりナトリウム１分子が多い値を示す）が観察された。その結果、質量分析によるオリゴ糖ピークｃ、ｄの推定分子量はピークｃがＣＩ−９、ピークｄがＣＩ−１０の分子量に一致した。

上記^１３ＣＮＭＲ分析及び質量分析の結果、パエニバチルス・エスピー５９８Ｋ株が原料デンプンより生産するオリゴ糖ピークｃとｄはいずれもグルコースがα−１，６結合で環状につながった環状イソマルトオリゴ糖すなわちサイクロデキストランであり、それらの分子式は下記のように示されることを確認した。これらは５９８Ｋ株がデキストランから生産するサイクロデキストランＣＩ−９、ＣＩ−１０と全く同じ構造である。
ピークｃ：Ｃ_５４Ｈ_９０Ｏ_４５
ピークｄ：Ｃ_６０Ｈ_１００Ｏ_５０

（実施例３）
Ｔ−３０４０および５９８Ｋの２菌株について、それぞれ培養日数と培養上清５０ｍｌ中にデンプン１ｇから生産されたサイクロデキストラン量を下記表３に示す。Ｔ−３０４０株では培養４日でデンプンの約２０％がサイクロデキストランに転換され、５９８Ｋ株は培養３日で約３％がサイクロデキストランに転換された。Ｔ−３０４０株をさらに培養を続けると５０％程度のデンプンがサイクロデキストランに転換された。

（実施例４）
Ｔ−３０４０および５９８Ｋの２菌株について、それぞれ培養日数と培養上清５０ｍｌ中に生産されたサイクロデキストラン合成酵素の酵素活性を下記表４に示す。サイクロデキストラン合成酵素量は、Ｔ−３０４０株の培養液の場合は、２％デキストラン４０（アマシャムファルマシア製）、１０ｍＭＣａＣｌ_２を含む４０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中で、４０℃で反応を行い、５９８Ｋ株の培養液の場合は、２％デキストラン４０（アマシャムファルマシア製）を含む４０ｍＭＴｒｉｓ−マレイン酸緩衝液（ｐＨ８．０）中で、５０℃で反応を行うことによって測定した。酵素１Ｕは１分間に１μｍｏｌのＣＩ（ＣＩ−７，ＣＩ−８，ＣＩ−９の合計量）を生産する酵素量とする。サイクロデキストラン生産酵素として望ましい酵素活性は０．１２Ｕ／ｍｌ以上という報告があるが（川端康之, 北尾悟, 舟根和美, 渡嘉敷唯章, 儀部茂八, 宮城貞夫：ニトロソグアニジン変異およびストレプトマイシン耐性変異による環状イソマルトオリゴ糖合成酵素(CITase)生産菌Bacillus circulans の育種. 食品・臨床栄養 1:43-48, 2006）、Ｔ−３０４０株はデンプン含有培地で培養することにより４日間で目標の酵素量に達し、５９８Ｋ株は３日間で目標の１／１０の酵素量に達した。

（実施例５）
Ｔ−３０４０株をデンプン含有培地で４日間培養した培養上清、および５９８Ｋ株をデンプン含有培地で３日間培養した培養上清に、さらにデンプンをそれぞれ加えて２４時間反応させ、合成されたサイクロデキストラン（ＣＩ）量とデンプンを基質とした場合のサイクロデキストラン合成酵素活性を下記表５に示す。サイクロデキストラン合成酵素活性は、２％可溶性デンプン（ナカライテスク社製）、１０ｍＭＣａＣｌ_２を含む４０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中で、４０℃にて２４時間で反応を行うことによって測定した。酵素１Ｕは１分間に１μｍｏｌのＣＩ（ＣＩ−７，ＣＩ−８，ＣＩ−９の合計量）を生産する酵素量とする。デンプンを基質とした場合のサイクロデキストラン合成酵素活性は強くないが、菌体を除いた培養上清にさらにデンプンを加えることによってサイクロデキストラン生産を行うことができた。

標準のＣＩ−７、ＣＩ−８、ＣＩ−９、ＣＩ−１０、ＣＩ−１１、ＣＩ−１２（上段）、バチルス・サーキュランスＴ−３０４０株を、デンプン含有培地で培養した際の上清に生産するオリゴ糖（中段）、パエニバチルス・エスピー５９８Ｋ株を、デンプン含有培地で培養した際の上清に生産するオリゴ糖（下段）を示すＨＰＬＣ分析の図である。バチルス・サーキュランスＴ−３０４０株をデンプン含有培地で培養した際の上清を、α−アミラーゼ、ＨＢＤａｓｅ、グルコアミラーゼ（酵素処理１）で分解した際に残存するオリゴ糖（上段）、同上清をデキストラナーゼＬ（酵素処理２）で分解した際に残存するオリゴ糖（下段）を示すＨＰＬＣ分析の図である。パエニバチルス・エスピー５９８Ｋ株をデンプン含有培地で培養した際の上清を、α−アミラーゼ、ＨＢＤａｓｅ、グルコアミラーゼ（酵素処理１）で分解した際に残存するオリゴ糖（上段）、同上清をデキストラナーゼＬ（酵素処理２）で分解した際に残存するオリゴ糖（下段）を示すＨＰＬＣ分析の図である。

Claims

バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）Ｔ−３０４０株（ＦＥＲＭＢＰ−４１３２）またはパエニバチルス・エスピー５９８Ｋ株（ＦＥＲＭＰ−１９６０４）を、デンプンを含む培地で培養し、培養物よりサイクロデキストランを採取することを特徴とする、サイクロデキストランの製造方法。
バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）Ｔ−３０４０株（ＦＥＲＭＢＰ−４１３２）またはパエニバチルス・エスピー５９８Ｋ株（ＦＥＲＭＰ−１９６０４）を、デンプンを含む培地で培養し、得られた培養液をデンプンに作用させることを特徴とする、サイクロデキストランの製造方法。