CN118028179A - 一种枯草芽孢杆菌和生产阿洛酮糖的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种枯草芽孢杆菌和生产阿洛酮糖的方法及其应用，一种枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis OSYZTT‑01，CCTCC NO:M 20232592，该菌株经紫外驯化得到，能够在甘油浓度为18%的条件下发酵，发酵周期为16h，得到的发酵液能够直接转化浓度为97.97%的果糖，使得阿洛酮糖的转化率为34.25%‑34.63%，在提高阿洛酮糖转化率的同时，还能提高阿洛酮糖的产能，并简化了整个生产工艺流程，大大的降低了企业生产设备的投入，降低生产成本，缩短企业回收利益的时间。
Description
技术领域
本发明涉及生物发酵技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌和生产阿洛酮糖的方法及其应用。
背景技术
D-阿洛酮糖(D-psicose)是自然界一种较为稀有的天然己酮糖，在甜菜糖蜜、甘蔗、小麦和鼠刺植物中首先发现。D-阿洛酮糖作为稀有糖的一种，在自然界中含量很少，获取困难，制约了其在实际生产中的应用，由此,如何大量制备成为研究热点。不同种类的稀有糖具有各自独特的生理功能，在医药、食品、化妆品等领域具有较为广泛的应用前景。
D-阿洛酮糖又名D-核糖-2-己酮糖，是果糖C-3位上的差向异构体，分子式为C6H12O6，分子量为180.156，白色晶体，无臭不易吸潮。D-阿洛酮糖的熔点为96℃，极易溶于水，糖度是蔗糖的70％，热量是蔗糖的0.3％，被称为无热量的糖。美国食品及药品管理局(FDA)于2011年对D-阿洛酮糖的安全性确认后正式批准其为GRAS食品，允许应用到食品、医药制剂以及膳食补充剂中，这也说明D-阿洛酮糖具有良好的应用前景和开发价值。
D-阿洛酮糖的制备方法主要有化学合成法以及生物转化法，生物转化法以廉价单糖为原料通过微生物或者他们的酶进行催化获得，已经成为一项重要的生物工程，是生化工程领域中的研究热点。相对于化学合成法存在副产物多、污染严重等缺点，生物转化法因具有反应条件温和、对环境友好、高度的立体选择性等优点而倍受广大糖类研究者的青睐。
专利号为CN105802897A，名称为一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶生产菌株及其应用，利用一种筛选得到的解纤维素梭菌生产D-阿洛酮糖-3-差向异构酶，果糖浓度为100-800g/L，使得阿洛酮糖的得率为166g/L-265g/L，转化率为33.1%-33.8%，同时在解纤维素梭菌发酵生产时，发酵时长为2-3d，发酵周期较长，这就无形的增加了生产发酵的成本；
专利号为ＣＮ115927503A，名称为一种枯草芽孢杆菌发酵异构阿洛酮糖的方法，枯草芽孢杆菌发酵周期为48h-72h，发酵温度为30-37℃，属于中温发酵，虽然转化率为29.3-30.4%，但是转化底物果糖的浓度为50%，使得阿洛酮糖的产量较低，会使得后续分离纯化的生产成本大大的提高。
发明内容
本发明的目的在于提供一株发酵生产 D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的生产菌株，采用购自江南大学的原始菌株枯草芽孢杆菌 WB788，通过紫外诱变驯化得到枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis OSYZTT-01，分类命名：枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis OSYZTT-01，已保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏地址中国武汉大学，保藏日期为2023.12.18，菌种保藏编号为 CCTCC NO: M 20232592。
本发明的第二个目的在于提供一种利用上述枯草芽孢杆菌的发酵方法，在以甘油为底物的条件进行高密度发酵培养，菌体浓度OD值最大可达到230，发酵周期为16h；
本发明的第三个目的在于提供一种利用可产生D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的枯草芽孢杆菌，发酵得到发酵液后，直接处理高浓度果糖得到高产量阿洛酮糖的方法，并简化生产工艺；
本发明最后一个目的在于提供了枯草芽孢杆菌在制备阿洛酮糖上的应用。
为了实现以上技术，本发明采用如下技术措施：
枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis OSYZTT-01的获得：
购自江南大学的原始菌株枯草芽孢杆菌 WB788，通过紫外诱变驯化得到枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis OSYZTT-01，分类命名：枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilisOSYZTT-01，已保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏地址中国武汉大学，保藏日期为 2023.12.18，菌种保藏编号为 CCTCC NO: M 20232592。
该枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis OSYZTT-01发酵条件为：37℃培养，pH 7.0-7.5,转速150r/min，初始甘油浓度为5%，在发酵中期时，流加甘油的终浓度为18%，且在发酵过程中，补甘油前通氧量10%，补甘油后通氧量30%，
种子培养基：甘油5%，蛋白胨10.0%，酵母粉5.0%，氯化钠10.0％，卡那霉素0.05%；
发酵培养基：甘油18%，蛋白胨0.5%，Na2HPO4 1.0%，KH2PO4 0.8%、NH4Cl 0.1%、MgSO4•7H2O 0.02%、FeSO4•7H2O 0.003%、NaNO3 0.1%、卡那霉素0.05%，十二烷基甜菜碱0.1%。
该枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis OSYZTT-01发酵结束后，收集发酵液，按发酵液体积：果糖质量比=1:1的条件（单位为ml/g）加入到浓度为97.97%果糖的底物溶液中，60℃下反应2h，再经过过滤、纯化、色谱分离、浓缩后得到产品阿洛酮糖。
综上所述，本申请的有益效果：本发明具有以下优势：
1.本发明筛选的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis OSYZTT-01在流加的高甘油浓度下37℃高密度发酵，使用的发酵培养基为：甘油18%，蛋白胨0.5%，Na2HPO4 1.0%，KH2PO40.8%、NH4Cl 0.1%、MgSO4•7H2O 0.02%、 FeSO4•7H2O 0.003%、NaNO3 0.1%、卡那霉素0.05%，十二烷基甜菜碱0.1%；
使得发酵周期缩短为16h，大大的缩短菌体的生长发酵周期，继而缩短了企业回收利益的时间，间接降低了企业回收利益的成本；
2.本发明筛选的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis OSYZTT-01发酵完成后，直接采用发酵液与果糖进行酶促反应，可省略传统生产中需要提取菌体内D-阿洛酮糖-3-差向异构酶制成粗酶液的工艺流程，大大的降低设备投入和缩短产品转化时间，在降低生产投入成本的同时，还能缩短企业利益转化时间；
3.本发明筛选的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis OSYZTT-01发酵得到的发酵液可用于转化浓度为97.97%的果糖，阿洛酮糖的转化率可到达34.25%-34.63%，使得阿洛酮糖的产量最高可达到339.27g/L，大大的提高了阿洛酮糖的产量，从而使得工业生产中阿洛酮糖的产能大大提高，提高企业的收益；
4.本发明筛选的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis OSYZTT-01进行高密度培养，发酵结束后菌体浓度OD值最高可达到230，使得后续转化果糖为阿洛酮糖时，发酵液的加量为其体积与果糖质量比为1:1时，可满足阿洛酮糖的高转化率，实现低加量高产能，降低企业原料投入成本。
附图说明
通过阅读参照以下附图所作的对非限制性实施例详细描述，本申请的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为本发明菌株传代次数对D-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶活的影响；
图2为本发明甘油浓度对枯草芽孢杆菌发酵过程中酶活力的影响；
图3为本发明枯草芽孢杆菌发酵过程中菌体浓度（OD值）的变化；
图4为本发明发酵液的加入量对阿洛酮糖转化率的影响；
图5为本发明果糖的浓度对阿洛酮糖转化率的影响。
本发明所用菌株为：购自江南大学的原始菌株（枯草芽孢杆菌 WB788）通过紫外诱变驯化后得到的枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis OSYZTT-01；分类命名：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis OSYZTT-01，已保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏地址中国武汉大学，保藏日期为 2023.12.18，菌种保藏编号为 CCTCC NO: M 20232592。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本申请作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释相关发明，而非对该发明的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与发明相关的部分。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本申请。
下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到，下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规培养与分离方法得到。
实施例1
枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis OSYZTT-01的获得
使用LB培养基对购自江南大学的原始菌株通过摇瓶进行活化富集培养，培养条件为：温度37℃，转速150r/min，待通过可见分光光度计，在波长为610nm下，检测到的OD值为2.5-3.0时，停止培养，并将培养好的菌液置于紫外光下进行在外诱变，诱变后的菌株通过筛选培养基进行平板筛选，挑选菌落直径较大的菌落（大于0.5cm），然后再次通过LB液体培养基进行摇瓶培养8h，破胞后，检测D-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶活，选择酶活较高的菌株进行驯化培养，最终获得的菌株命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis OSYZTT-01，该枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis OSYZTT-01已于2023.12.18在武汉大学中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏编号为CCTCC NO: M 20232592，分类命名：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis OSYZTT-01。
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），是芽孢杆菌属的一种，CAS号68038-70-0。单个细胞0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，可形成内生抗逆芽孢，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆状到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。生长、繁殖速度较快，菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭，是一种需氧菌。
LB培养基：葡萄糖2%，蛋白胨10.0%，酵母粉5.0%，氯化钠10.0％，pH自然；
筛选培养基：甘油5%，蛋白胨10.0%，酵母粉5.0%，氯化钠10.0％，卡那霉素0.05%，pH自然；
平板式的筛选培养基为在液体的筛选培养基中加入2%的琼脂粉后，121℃、15min灭菌后倒平板。
实施例2
枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis OSYZTT-01遗传验证性实验
为了验证本菌株的遗传稳定性，采用平板式筛选培养基，在平板上连续接种十代，用接种环分别挑取每代平板上的菌落转至种子培养基中进行摇瓶培养，培养条件为：37℃，转速150r/min，培养时间为8h，然后每一代以2%的接种量，在内装有3L发酵培养基的5L发酵罐内进行发酵，发酵条件为：37℃，转速150r/min，发酵初期，溶氧量为10%，流加至终浓度为18%的甘油后，溶氧量为30%，发酵完毕后，离心得到菌体，并采用pH 7.0 的磷酸盐缓冲液洗涤并得到悬浮细胞，最终总体积浓缩10倍，然后添加0.1g/L的溶菌酶将菌体内的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶溶出，检测其D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的活性，每代枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis OSYZTT-01发酵完成后D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的活性如图1。
种子培养基：甘油5%，蛋白胨10.0%，酵母粉5.0%，氯化钠10.0％，卡那霉素0.05%；
发酵培养基：甘油18%，蛋白胨0.5%，Na2HPO4 1.0%，KH2PO4 0.8%、NH4Cl 0.1%、MgSO4•7H2O 0.02%、FeSO4•7H2O 0.003%、NaNO3 0.1%、卡那霉素0.05%，十二烷基甜菜碱0.1%。
酶活检测：取 100 μL 酶液加入到 900 μL 底物溶液（100 g·L-1 果糖，0.1mmolCo2+）中，在 60°C，1000 rpm 振荡金属浴中反应 2 min，沸水煮 5 min，终止酶催化反应；酶反应结束后，12000 r/min离心5 min，并吸取300-400μL上清液，经0.22 μm水系滤膜除杂后，采用高效液相色谱测定反应液中阿洛酮糖的含量，进而计算酶活力。Waters e2695高效液相色谱色谱柱型号：ShodexTMAsahipakTM NH2P-50 4E色谱柱；检测器：示差检测器，柱温和检测温度均为35℃；流动相为乙腈:水=75:25(v:v)，流速为0.8 mL• min-1。
流动相在使用前均需先经0.22μm水系滤膜过膜除杂，再经超声处理脱气20min以上。
酶活单位定义：振荡金属浴条件下，1min生成1μmol D-阿洛酮糖作为一个酶活单位。
如图1所示，可以看出，经过十代的传代培养发酵，发现每代菌株发酵后，得到的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的活力分别为161.32U/ml，160.53U/ml，161.26U/ml，160.67U/ml，159.84U/ml，161.68U/ml，160.50U/ml，159.88U/ml，158.32U/ml，159.94U/ml，如图1所示，D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的活力基本没有下降，说明所筛选的枯草芽孢杆菌的遗传稳定性好，可以用于发酵生产。
实施例3
甘油浓度对枯草芽孢杆菌发酵过程中酶活力的影响
将活化的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis OSYZTT-01进行摇瓶培养后，接种至内装3L发酵培养基的5L发酵罐中进行发酵培养，发酵条件为：37℃，转速150r/min，发酵培养基的初始甘油浓度设定为5%，在发酵过程中，利用高碘酸法测得发酵罐内甘油浓度在2%时，流加终浓度分别为12%、14%、16%、18%、20%的甘油，直至发酵结束；
在发酵时间为4h、8h、12h、16h、20h时，取发酵液，通过高效液相色谱检测菌体浓度和D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的酶活力，检测结果如图2所示；
由图2可知，当甘油的终浓度为18%时，酶活力达到最大，而当甘油的终浓度为20%时，酶活力远远低于其甘油终浓度为12%-18%的酶活力，说明当甘油终浓度大于18%时，影响枯草芽孢杆菌生长产生D-阿洛酮糖-3-差向异构酶。
实施例4
枯草芽孢杆菌发酵过程中菌体浓度OD值的变化
将活化的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis OSYZTT-01进行摇瓶培养后，接种至内装3L发酵培养基的5L发酵罐中进行发酵培养，发酵条件为：37℃，转速150r/min，发酵培养基的初始甘油浓度设定为5%，在发酵过程中，利用高碘酸法测得发酵罐内甘油浓度在2%时，流加终浓度为18%的甘油，直至发酵结束；
在发酵时间为4h、8h、12h、16h、20h、24h时，取发酵液，在可见分光光度计(紫外可见分光光度计756PC型)的波长为600nm下，检测菌体OD值，检测结果如图3所示；
当使用可见分光光度计检测时，OD值大于3时，需要将菌液稀释一定浓度，再进行测量。
由图3可知，枯草芽孢杆菌在最适条件下进行发酵，发酵周期为16h时，菌浓OD值达到最大为230。
综合实施例3和实施例4可知，枯草芽孢杆菌的发酵条件为：37℃，转速150r/min，发酵培养基的初始甘油浓度设定为5%，在发酵过程中，流加终浓度为18%的甘油，发酵周期为16h，菌体浓度OD值可达到230，此时菌体内的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的酶活力最大。
实施例5
发酵液和粗酶液对阿洛酮糖转化率的影响
将活化的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis OSYZTT-01进行摇瓶培养后，接种至内装3L发酵培养基的5L发酵罐中进行发酵培养，发酵条件为：37℃，转速150r/min，发酵培养基的初始甘油浓度设定为5%，在发酵过程中，利用高碘酸法测得发酵罐内甘油浓度在2%时，流加终浓度为18%的甘油，直至发酵结束；发酵结束后的发酵液平均分为两部分，一部分留置备用，另一部分超滤得到菌体，并采用pH 7.0的磷酸盐缓冲液洗涤并得到悬浮细胞，最终总体积与留置备用的发酵液体积相同，然后添加0.1g/L的溶菌酶将菌体内的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶溶出后得到粗酶液备用。
将发酵液以及制得的粗酶液分别按照一定比例加入到50%的果糖溶液中（发酵液（或粗酶液）体积：果糖质量=1:1），60℃，1000rpm振荡金属浴中反应2h，然后沸水煮10 min，终止酶催化反应；酶反应结束后，12000 r/min离心5 min，并吸取300-400μL上清液，经0.22μm水系滤膜除杂后，采用高效液相色谱测定阿洛酮糖转化率，如表1所示，
表1 发酵液以及制得的粗酶液对阿洛酮糖转化率的影响
由表1可知，发酵液和制得的粗酶液在以相同比例加入到浓度为50%的果糖内，酶解果糖，得到的阿洛酮糖的转化率的相对差异在5%以内，可以认为两者对果糖的酶解效果一致，在工业化生产中，如果省略粗酶液的制备工艺，直接采用发酵液处理果糖溶液，将会减少工业生产的工艺流程，降低设备投入，缩短产品转化时间，大大的降低工业生产成本。
所以，在工业化生产中，直接采用发酵液处理果糖溶液，对工业生产更为有利。
实施例6
发酵液的加量对阿洛酮糖转化率的影响
将活化的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis OSYZTT-01进行摇瓶培养后，接种至内装3L发酵培养基的5L发酵罐中进行发酵培养，发酵条件为：37℃，转速150r/min，发酵培养基的初始甘油浓度设定为5%，在发酵过程中，利用高碘酸法测得发酵罐内甘油浓度在2%时，流加终浓度为18%的甘油，直至发酵结束，发酵结束后，菌体浓度OD值为230，发酵结束后的发酵液在4℃条件下保存备用。
分别取1:0.5、1:1、1:2、1:3、1:4（发酵液体积与果糖质量比，ml/g）的发酵液加入到浓度为50%的果糖溶液中，60℃，1000 rpm 振荡金属浴中反应2h，然后沸水煮10 min，终止酶催化反应；酶反应结束后，12000 r/min离心5 min，并吸取300-400μL上清液，经0.22 μm水系滤膜除杂后，采用高效液相色谱测定阿洛酮糖转化率，检测结果如图4所示。
发酵液的不同添加量与含有果糖的底物溶液进行酶促反应，发酵液的添加量为其添加体积与酶促反应的果糖质量之比，由图4可知，当发酵液的添加量高于1:1时，底物溶液的果糖的转化率并不会提高，所以在发酵液的添加量为1:1时，可以将果糖转化完毕，且不会造成发酵液中多余酶液的浪费，还能使得阿洛酮糖的转化率达到34.52%。
实施例7
发酵液对不同浓度的阿洛酮糖转化率的影响
将活化的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis OSYZTT-01进行摇瓶培养后，接种至内装3L发酵培养基的5L发酵罐中进行发酵培养，发酵条件为：37℃，转速150r/min，发酵培养基的初始甘油浓度设定为5%，溶氧量为10%，发酵中期，流加终浓度为18%的甘油，流加后，发酵液内的溶氧量为30%，发酵结束后的发酵液在4℃条件下保存备用。
然后在果糖浓度为50%、70%、90%、100%（使用纯果糖溶液进行配置）的果糖溶液中，分别按照发酵液体积：果糖质量=1:1的比例加入发酵液，在酶促反应下，反应2h；并使用高效液相色谱检测阿洛酮糖转化率，如图5所示。
通过高效液相色谱检测得知：纯果糖中果糖平均含量为97.97%，葡萄糖含量为2.03%，pH为6.78；这意味着浓度为100%的果糖溶液中，实际上仅含有97.97%的果糖。
由图5可知，在发酵液的添加量一定时，随着果糖浓度的增大，其阿洛酮糖的转化率基本不变，均维持在较高值34.25%-34.63%，说明发酵液能够对纯果糖进行酶解，而从工业化生产，产值最大化考虑，将果糖浓度设置为最大值100%时，实际果糖的浓度为97.97%，一次性酶解反应，将会一次性得到更多产量的阿洛酮糖，即在果糖浓度为97.97%的情况下，阿洛酮糖的产量可达到339.27g/L，在同等的酶促反应条件下，阿洛酮糖的产量相比于传统的使用低浓度果糖的产量大大提高，即实现了产能的提高，相比于工业生产中的企业成本和所得利润而言，产能提高的产品，能为企业带来更多的利益。
实施例8
不同的酶解温度对阿洛酮糖转化率的影响
将活化的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis OSYZTT-01进行摇瓶培养后，接种至内装3L发酵培养基的5L发酵罐中进行发酵培养，发酵条件为：37℃，转速150r/min，发酵培养基的初始甘油浓度设定为5%，溶氧量为10%，发酵中期，流加终浓度为18%的甘油，流加后，发酵液内的溶氧量为30%，发酵结束后，将发酵液置于冷藏罐内低温冷藏备用；
然后按照发酵液体积：果糖质量=1:1的比例将发酵液加入到100%的果糖内进行酶解反应，酶解反应温度分别为50℃、55℃、60℃和65℃，酶解反应为2h，反应结束后，沸水煮10 min，终止酶催化反应；酶反应结束后，12000 r/min离心5 min，并吸取300-400μL上清液，经0.22 μm水系滤膜除杂后，采用高效液相色谱测定反应液中阿洛酮糖的含量，进而计算阿洛酮糖的转化率，如表2所示。
在使用高效液相色谱检测纯果糖中物质平均成分为：果糖：97.97%；葡萄糖：2.03%，所以浓度为100%的纯果糖内果糖的浓度实际为97.97%。
表2 不同的酶解温度对阿洛酮糖转化率的影响
由表2可知，D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的酶解温度在60℃时，阿洛酮糖转化率达到最高为34.54%，而在温度为50℃-55℃时，阿洛酮糖转化率为25.34%-26.60%，而酶反应温度为65℃时，阿洛酮糖转化率低于20%，说明酶解反应温度高于或低于60℃时，都将会在一定程度上抑制D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的活力，进而影响果糖转化为阿洛酮糖，所以在加入枯草芽孢杆菌的发酵液作为酶促反应的酶液时，酶促温度在60℃时，将会使得阿洛酮糖转化率达到最大为34.54%，同时阿洛酮糖的产量为338.39g/L。
加入D-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶解后阿洛酮糖峰面积——高效液相色谱检测的阿洛酮糖的峰面积；
酶解前果糖峰面积——高效液相色谱检测的果糖的峰面积。
发酵液体积与果糖质量比为1:1，果糖质量为含量为97.97%的果糖质量。
菌体浓度OD值=分光光度计检测数值×稀释倍数
酶活力计算公式如下：
M——阿洛酮糖分子量
50%的果糖配置：称取50g纯果糖与50ml混合均匀的pH7.5-8.5的10-150mmol/L的Tris-HCl缓冲液和0.1mmol/LCo2+混合。
100%的果糖配置：称取纯果糖与0.1mmol/LCo2+混合。
由于在发酵培养基中加入过量的Na2HPO4和KH2PO4，枯草芽孢杆菌在整个发酵过程中的pH维持在7.0左右，即使在发酵结束后，发酵液的pH仍能维持在中性，这时可以直接省略果糖配置时需加入的缓冲液，简化工业生产中的工艺流程，节省果糖转化为阿洛酮糖的工业生产时间。
本实施例中在流加甘油前的溶氧量均为10%，流加甘油后的溶氧量均为30%，保证枯草芽孢杆菌高密度培养时的需氧量。
以上描述仅为本申请的较佳实施例以及对所运用技术原理等方案的说明。同时，本申请中所涉及的发明范围，并不限于上述技术特征的特定组合而成的技术方案，同时也应涵盖在不脱离所述发明构思的情况下，由上述技术特征或其等同特征进行任意组合而形成的其它技术方案。例如上述特征与本申请中公开的（但不限于）具有类似功能的技术特征进行互相替换而形成的技术方案。
Claims (6)
1.一种枯草芽孢杆菌，其特征在于：枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis OSYZTT-01，CCTCC NO: M 20232592。
2.利用权利要求1所述的枯草芽孢杆菌生产阿洛酮糖的方法，其特征在于：利用枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis OSYZTT-01发酵得到的发酵液，以果糖为底物，催化生产D-阿洛酮糖。
3.利用权利要求2所述的枯草芽孢杆菌生产阿洛酮糖的方法，其特征在于：果糖浓度为97.97%，催化条件为：
a.发酵液体积：果糖质量=1:1（单位为ml/g）;
b.Co2+ 0.1mmol/L;
c.在60℃下反应2h。
4.根据权利要求2所述的枯草芽孢杆菌生产阿洛酮糖的方法，其特征在于：枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis OSYZTT-01发酵条件为：37℃培养，pH7.0-7.5，转速150r/min，补甘油前通氧量10%，补甘油后通氧量30%。
5.根据权利要求4所述的枯草芽孢杆菌生产阿洛酮糖的方法，其特征在于：种子培养基：甘油5%，蛋白胨10.0%，酵母粉5.0%，氯化钠10.0％，卡那霉素0.05%；
枯草芽孢杆菌发酵生产的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的发酵培养基：甘油18%，蛋白胨0.5%，Na2HPO4 1.0%，KH2PO4 0.8%、NH4Cl 0.1%、MgSO4•7H2O 0.02%、FeSO4•7H2O 0.003%、NaNO3 0.1%、卡那霉素0.05%，十二烷基甜菜碱0.1%。
6.权利要求1所述菌株发酵生产得到阿洛酮糖的应用。
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Non-Patent Citations (2)
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|---|
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