CN114214251A - 一种生产d-阿洛酮糖用枯草芽孢杆菌及其培养方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生产D‑阿洛酮糖用枯草芽孢杆菌及其培养方法和应用，该枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)编号为blb‑12‑B，于2021年12月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24054。本发明分离获得枯草芽孢杆菌，其发酵液中的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶酶活≥550U/ml，大大提高酶转化的效率，显著降低生产成本，发酵获得的酶在pH5.5‑7.5时，酶活性高于85%，pH适应范围较广，能够降低料液的色值和电导率，更加有利于产品的后提纯工艺，提高产品的生产效率，显著降低D‑阿洛酮糖的生产成本，有益于工业化生产控制。

Description

一种生产D-阿洛酮糖用枯草芽孢杆菌及其培养方法和应用

技术领域

本发明属于微生物及其应用技术领域，具体涉及一种生产D-阿洛酮糖用枯草芽孢杆菌及其培养方法和应用。

背景技术

稀少糖（Rare Sugar）是自然界中存在但含量极少的一类单糖（糖的最小单位）和糖醇，其味类似于蔗糖，但具有热量低、稳定性高、甜昧协调、无吸湿性、无致龋齿性、耐受性高等优点，可以弥补传统甜味剂的不足，对改善特殊人群的饮食起到重要作用，目前已知的稀少糖有50多种。稀少糖类甜味剂中较典型代表是阿洛酮糖和塔格糖（分别是果糖的C-3、C-4的差向异构体），除具有低热量特点，还在抑制血糖升高与体脂积累、清除自由基、神经保护、修饰药物或活性物质从而优化其功能活性等诸多方面发挥着重要生理活性作用，是糖尿病及肥胖症人群的新型甜味剂。

D-阿洛酮糖在自然界中存在极少，利用化学方法合成杂质多不易分离，且成本昂贵。而利用生物转化技术研发逐渐成为国际上研究的热点，以D-果糖为原料，通过D-阿洛酮糖-3-差向异构酶制备D-阿洛酮糖，且D-阿洛酮糖差向异构酶为胞内酶，经简单的离心分离或膜分离、去离子水复溶、均质即可得到酶制剂，大大减少了酶制剂电导率和发酵色素的引入，极大地降低后续D-阿洛酮糖提纯的难度和成本，显著提高D- 阿洛酮糖成品的质量，节约了生产成本，降低了动力损耗。但是目前已报道的微生物（枯草芽孢杆菌），产生的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的酶活低，转化果糖的能力仍较差，增加了D-阿洛酮糖工业化生产的效率和难度。

因此，寻找一种高转化率的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶生产菌株成为解决D-阿洛酮糖大规模生产应用的关键。

发明内容

针对现有技术中制备D-阿洛酮糖的D-阿洛酮糖3-差向异构酶转化能力差的问题，本发明提供了一种生产D-阿洛酮糖用枯草芽孢杆菌及其培养方法和应用，该枯草芽孢杆菌blb-12-B可高产D-阿洛酮糖3-差向异构酶，具有高转化果糖生成D-阿洛酮糖的能力，提高生产效率，显著降低生产成本。

本发明通过以下技术方案实现：

一种生产D-阿洛酮糖用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，编号为blb-12-B，于2021年12月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24054。

进一步地，所述的枯草芽孢杆菌blb-12-B菌体呈杆状，长为1.0~3.0μm，宽为0.5~0.8μm。

本发明中，所述的生产D-阿洛酮糖用枯草芽孢杆菌的培养方法，包括以下步骤：

（1）将枯草芽孢杆菌blb-12-B接种到种子培养基中，培养8~13h，制备枯草芽孢杆菌种子液；

（2） 将步骤（1）中的枯草芽孢杆菌种子液按照质量体积比2~5%的接种量接种于发酵培养基中，发酵培养40~70h，得D-阿洛酮糖用枯草芽孢杆菌菌液。

进一步地，步骤（1）中所述的培养温度为36-38℃，转速为180-220r/min；步骤（2）中所述的发酵培养温度为32-34℃。

进一步地，步骤（1）中所述的种子培养基由以下重量百分比组分组成：蛋白胨1%，酵母浸粉0.5%，氯化钠1%，余量为水，pH 6.8~7.2；步骤（2）中所述的发酵培养基由以下重量百分比组分组成：蛋白胨2~3%，玉米浆粉1~2%，甘油0.5~1%，无水硫酸镁0.05%，磷酸氢二钠0.38%，磷酸二氢钠0.05%，余量为水，pH6.5~7.0。

进一步地，所述的D-阿洛酮糖用枯草芽孢杆菌菌液经离心处理或膜处理，得发酵菌体。

本发明中，所述的生产D-阿洛酮糖用枯草芽孢杆菌在制备D-阿洛酮糖中的应用。

本发明所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)分离于山东保龄宝生物股份有限公司专用糖车间附近的土壤，并经过诱变（25W紫外线灯20cm照射120s，再进行亚硝基胍诱变处理）处理获得。该菌株在形成的菌落呈白色，半透明，菌落边缘不规整，呈锯齿状，中心高凸，经显微镜观察，该菌株长 1.5～3微米，宽约0.6～0.9微米，无荚膜，革兰氏阳性菌，经确认为枯草芽孢杆菌。该菌株可高产D-阿洛酮糖3-差向异构酶，产生的D-阿洛酮糖3-差向异构酶为胞内酶，该酶酶活≥550 U/ml，是传统D-阿洛酮糖差向异构酶活的3.6倍以上，由于酶活较高，在相同量底物的情况下，所需的酶量较少，能够降低料液的色值和电导率，更加有利于产品的后提纯工艺，提高产品的生产效率，可以显著降低D-阿洛酮糖的生产成本。

本发明枯草芽孢杆菌发酵产生的D-阿洛酮糖3-差向异构酶最适pH为偏酸性，与传统菌株产D-阿洛酮糖3-差向异构酶最适pH偏中性相比，大大减少了酶转化过程中色素物质的生成，更加有利于产品的后提纯工艺。对发酵液进行离心分离或膜分离处理后，弃去发酵清液，大大减少了发酵色素的引入，极大地降低后续D-阿洛酮糖提纯的难度和成本，并可以显著提高D-阿洛酮糖成品的质量。

菌种保藏信息：

保藏时间：2021年12月08日；

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

保藏编号：CGMCC No. 24054；

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政

编码：100101；

分类命名：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) blb-12-B。

有益效果

本发明分离获得枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)blb-12-B，其发酵液中的D-阿洛酮糖3-差向异构酶酶活≥550U/ml，大大提高酶转化的效率，显著降低生产成本，发酵获得的酶在pH5.5-7.5时，酶活性高于85%，pH适应范围较广，有益于工业化生产控制。

附图说明

图1为不同pH条件下阿洛酮糖3-差向异构酶酶活测试结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的的技术方案做进一步说明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的简单修改或替换，均属于本发明的范围；如未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本发明实施例中D-阿洛酮糖-3-差向异构酶对D-果糖的酶活的测定方法为：1ml的反应体系中，加入800μl反应底物溶液，反应底物溶液为由 50ml磷酸盐缓冲液(pH7.0)溶解D-果糖制得D-果糖浓度为100g/L的溶液，200μl的酶液， 55℃保温10min，然后煮沸10min，终止酶反应；

用HPLC检测D-阿洛酮糖的生产量，计算酶活；酶活单位(U)：每分钟催化产生1μmolD-阿洛酮糖所需要的酶量。

实施例1

菌株的分离与鉴定

平板培养基：由以下重量百分比的成分组成，胰蛋白胨1％，酵母浸粉0.5％，氯化钠1％，琼脂粉2%，余量去离子水。

斜面培养基：由以下重量百分比的成分组成，胰蛋白胨1％，酵母浸粉0.5％，氯化钠1％，琼脂粉2％，余量去离子水；

摇瓶培养基：由以下重量百分比的成分组成，蛋白胨2.5％，玉米浆粉1％，甘油1％，无水硫酸镁0.05％，磷酸氢二钠0.05％，磷酸二氢钠0.4％，余量为去离子水，pH6.8；

（1）菌株来源及筛选

选取山东保龄宝生物股份有限公司专用糖车间附近的土壤，用铲子除去表土，取离地面10～15cm处的土壤约10g，放入盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇约20分钟，使土样与水充分混合，将菌分散，吸取1ml土壤悬液注入盛有9ml无菌水的试管中，吹吸3次，使充分混匀得稀释液；

在近火焰处，挑取上述稀释度的土壤悬液一环在平板上（含有平板培养基）作连续划线，划线完毕后，盖上平皿盖，倒置于36～38℃培养10h，然后挑取单个菌落接种于20个斜面培养基上，分别编号01～20；

将01～20斜面种子分别接种于摇瓶种子培养基中培养，于37℃培养10h，按照5%的接种量分别接种到摇瓶发酵培养基中33℃培养48小时，该菌株产D-阿洛酮糖3-差向异构酶，经离心处理，获得D-阿洛酮糖3-差向异构酶菌体，用等体积的去离子水复溶后均质、离心，获得D-阿洛酮糖3-差向异构酶清液，01～20摇瓶获得的D-阿洛酮糖3-差向异构酶对D-果糖的酶活进行测定，结果发现，12号摇瓶酶活最高，在pH6.5条件下，酶活为159U/ml；

（2）诱变筛选

对12号摇瓶中的菌种进行紫外线诱变，采用25W紫外线灯20cm照射，照射时间为120s，然后再进行亚硝基胍诱变处理，最终得到产高酶活活性菌株。

（3） 菌株鉴定

该菌株形成的菌落呈白色，半透明，菌落边缘不规整，呈锯齿状，中心高凸，经显微镜观察，该菌株长 1.5～3微米，宽0.6～0.9微米，无荚膜，芽孢形成后不膨大，革兰氏阳性菌，经确认为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，编号为blb-12-B，于2021年12月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号CGMCC No. 24054。

实施例2

种子培养基：由以下重量百分比的成分组成，蛋白胨1％，酵母浸粉0.5％，氯化钠1％，余量水，pH6.8；

发酵培养基：由以下重量百分比的成分组成，蛋白胨2.5％，玉米浆粉1％，甘油1％，无水硫酸镁0.05％，磷酸氢二钠0.05％，磷酸二氢钠0.4％，余量为去离子水，pH6.8；

(1) 取枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）blb-12-B，接种于种子培养基中，在37℃的条件下，增殖培养 10h，制得种子液；

(2) 取步骤(1)制得的种子液，按体积比5％的比例接种于发酵培养基中，在33℃下发酵培养，在发酵过程中不断补充发酵培养基，发酵52h，即得菌体发酵液，经离心处理，获得D-阿洛酮糖3-差向异构酶菌体，然后用等体积的水复溶后均质、离心，获得D-阿洛酮糖3-差向异构酶清液；在pH6.5条件下，进行D-阿洛酮糖3-差向异构酶对D-果糖的酶活测定，测定菌体发酵液酶活为680U/ml，远高于原始菌株的159U/ml。

实施例3

pH对酶活稳定性的的影响：

对实施例2中得到的D-阿洛酮糖3-差向异构酶清液，测试其在不同pH下的酶活，考察酶的最适pH，控制反应温度55℃，分别在pH4.0-8.5的缓冲液配置底物测定酶活，结果如图1所示，由图1可知，当pH在5.5-7.5之间时，其相对酶活保持在85%以上，当pH值在5.0~8.0之间，相对酶活保持在70%以上，其中pH6.5时酶活活性最高，达到680U/ml。

对比例1

取枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）blb-12-B诱变前的菌株，按照实施例2培养基和培养方法进行培养，得到的发酵菌液在pH6.5条件下，进行D-阿洛酮糖-3-差向异构酶对D-果糖的酶活测定，测定菌体发酵液酶活为150U/ml。

对比例2

种子培养基和发酵培养基成分与实施例2相同

(1) 取枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）菌种blb-12-B的菌种，接种于种子培养基中，在35℃的条件下，增殖培养 12h，制得种子液；

(2) 取步骤(1)制得的种子液，按体积比3％的比例接种于发酵培养基中，在35℃下发酵，在发酵过程中补充培养基，发酵30h，即得菌体发酵液，经离心处理，获得D-阿洛酮糖3-差向异构酶菌体，用等体积的去离子水复溶后均质、离心，得到的酶液在pH6.5条件下，进行D-阿洛酮糖3-差向异构酶对D-果糖的酶活测定，测定菌体发酵液酶活为288U/ml。

对比例3

改变发酵培养基的成分，由以下重量百分比的成分组成，蛋白胨2.5％，玉米浆粉1％，无水硫酸镁0.05％，磷酸氢二钠0.05％，磷酸二氢钠0.4％，余量为水，pH6.8；其余条件与实施例2相同，在pH6.5条件下，进行D-阿洛酮糖3-差向异构酶对D-果糖的酶活测定，测定菌体发酵液酶活为239 U/ml。

Claims (7)

1.一种生产D-阿洛酮糖用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，其特征在于，编号为blb-12-B，于2021年12月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24054。

2.根据权利要求1所述的生产D-阿洛酮糖用枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌blb-12-B菌体呈杆状，长为1.0~3.0μm，宽为0.5~0.8μm。

3.一种权利要求1或2所述的生产D-阿洛酮糖用枯草芽孢杆菌的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将枯草芽孢杆菌blb-12-B接种到种子培养基中，培养8~13h，制备枯草芽孢杆菌种子液；

（2）将步骤（1）中的枯草芽孢杆菌种子液按照质量体积比2~5%的接种量接种于发酵培养基中，发酵培养40~70h，得D-阿洛酮糖用枯草芽孢杆菌菌液。

4.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，步骤（1）中所述的培养温度为36-38℃，转速为180-220r/min；步骤（2）中所述的发酵培养温度为32-34℃。

5.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，步骤（1）中所述的种子培养基由以下重量百分比组分组成：蛋白胨1%，酵母浸粉0.5%，氯化钠1%，余量为水，pH 6.8~7.2；步骤（2）中所述的发酵培养基由以下重量百分比组分组成：蛋白胨2~3%，玉米浆粉1~2%，甘油0.5~1%，无水硫酸镁0.05%，磷酸氢二钠0.38%，磷酸二氢钠0.05%，余量为水，pH6.5~7.0。

6.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，所述的D-阿洛酮糖用枯草芽孢杆菌菌液经离心处理或膜处理，得发酵菌体，用水复溶均质、离心得到酶清液。

7.一种权利要求1或2所述的生产D-阿洛酮糖用枯草芽孢杆菌在制备D-阿洛酮糖中的应用。

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