KR100271137B1

KR100271137B1 - 신규 미생물 트리코스포로노이데스 마디다 디에스911 및 이 균주를 이용한 에리스리톨의 제조방법

Info

Publication number: KR100271137B1
Application number: KR1019980023831A
Authority: KR
Inventors: 박진병; 서병철; 김정렬
Original assignee: 유병택; 주식회사두산
Priority date: 1998-06-24
Filing date: 1998-06-24
Publication date: 2000-11-01
Also published as: US6060291A; KR19980065078A

Abstract

본 발명은 탄소원으로 30∼45% 포도당과 질소원 및 기타 영양원으로서 0.1∼0.3% 효모추출물 및 3∼6% 옥수수침지액을 함유한 액체 배지에서 트리코스포로노이데스 마디다(Trichosporonoides madida) DS911 (기탁번호 : KCTC 0496BP)을 30∼35℃의 온도, 0.5∼1vvm의 통기량, 300∼400rpm의 교반속도의 조건으로 배양하여 에리스리톨을 발효 제조한 후, 균체등을 제거하고 에리스리톨을 여과 정제시킴을 특징으로 하는 에리스리톨의 제조방법 및 고농도의 탄소원 존재하에서도 내삼투압성을 보이고 고수율로 에리스리톨을 생산하는 것을 특징으로하는 신규 미생물 트리코스포로노이데스 마디다 DS911 (기탁번호 : KCTC 0496BP)을 제공하는 것이다.

Description

신규 미생물 트리코스포로노이데스 마디다 디에스911 및 이 균주를 이용한 에리스리톨의 제조방법

본 발명은 에리스리톨을 생산하는 신규 미생물 및 이 신규 미생물을 이용하여 에리스리톨을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 특징은 고농도의 당(40% 이상)에서도 에리스리톨을 높은 발효수율(45% 이상)로 제조하는 미생물 및 제조방법에 관한 것으로, 본 발명의 미생물인 신규 미생물 트리코스포로노이데스 마디다 DS911 (Trichosporonoides madida DS911)는 1998년 6월 18일자로 한국과학기술연구원 생명공학연구소 유전자원 센터 유전자은행에 기탁번호 KCTC 0496BP로 기탁하였다.

에리스리톨은 일종의 당알코올로 천연 과실이나 청주, 와인, 장유등의 발효식품 등에 광범위하게 함유되어 있는 천연감미료이다. 감미료는 설탕의 80%로 후미가 없고 산뜻한 맛을 내며 용해시 높은 흡열성(43cal/g)으로 시원한 청량감을 준다. 또한 저칼로리(0.4kcal/g) 이고 충치 비유발성이며 과량 섭취시에도 설사를 유발하지 않는 기능성 감미료이다. 또한 에리스리톨은 내산, 내알칼리, 내열성, 비착색성, 저흡습성, 저수분활성, 저발효성등의 가공 특성이 우수하여 감미료 뿐만 아니라 음료, 초콜렛, 사탕, 껌등의 다양한 식품에 이용될 수 있다.

종래의 에리스리톨 생산 미생물은 칸디다(Candida)속(미국 특허번호 제3,756,917호), 오레오바시디움(Aureobasidium)속 (일본 특허번호 제2,626,692호, 미국 특허번호 제4,923,812호), 트리코스포로노이데스(Trichosporonoides)속 (박영근, 바이오테크놀로지 레터스(Biotechnology Letters) 15 (1993), 383-388), 모니리엘라(Moniliela)속 (헤지니(Hajiny), 어플라이드 마이크로바이올로지(Applied Microbiology) 12 (1964), 240-246)등이 알려져 있다.

그러나 이러한 미생물들은 공업화하기에 많은 문제점을 가지고 있다. 더 상세하게는 미국 특허번호 제3,756,917호는 칸디다 속의 미생물을 이용하여 노르말 파라핀(n-paraffin)으로부터 높은 전환수율로 에리스리톨을 제조하는 방법을 제시하고 있으나 배양기간이 너무 길어 생산성이 낮다. 한편 오레오바시디움속의 돌연변이주는 내당성이 우수하여 고농도의 포도당에서도 에리스리톨을 높은 발효수율로 생산하며 배양중 거품 발생량이 적어 다른 균주에 비해 상당히 우수한 면이 많으나 발효속도가 그다지 빠르지 않아 회분식 배양의 경우 에리스리톨 생산성이 높지 못하고(일본 특허번호 제2,626,692호), 세포 재순환 연속 배양을 할 경우 생산성이 비약적으로 증가하나 50톤 이상의 공업적 생산 규모에서는 아직 성공적으로 연속배양이 운전되는 예가 없어 실현 가능성이 낮다(미국 특허번호 제4,923,812호).

한편 트리코스포로노이데스 속의 미생물은 에리스리톨 전환수율은 비교적 높지만 배양기간이 길어 에리스리톨 생산성이 떨어지고 모니리엘라속 미생물은 고농도의 포도당에서도 에리스리톨을 높은 전환 수율로 생산할 수 있지만 배양시 거품이 많이 발생하여 거품 제거를 위해 다량의 산탄검(xanthan gum)을 사용하여야만 하는 결점이 있다.

따라서 본 발명의 기본적인 목적은 기질 농도가 높은 배지에서도 높은 전환수율과 빠른 속도로 에리스리톨을 생산하는 실용적인 새로운 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기한 미생물을 사용하여 에리스리톨을 생산하기 위한 경제적인 발효배지 조성의 발명 및 배양시 오염을 최대한 방지하며 높은 생산성으로 에리스리톨을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 미생물인 트리코스포로노이데스 마디다(Trichosporonoides madida) DS911 (기탁번호 : KCTC 0496BP) 는 통상적인 방법(바이오테크놀로지 레터스(Biotechnology Letters) 15 (1993), 383-388)에 의해 한국의 경기도, 강원도, 전라도 지역 야산의 100여개 벌집에서 순수 분리되어진다.

따라서 본 발명은 탄소원으로 30∼45% 포도당과 질소원 및 기타 영양원으로서 0.1∼0.3% 효모추출물 및 3∼6% 옥수수침지액을 함유한 액체 배지에서 트리코스포로노이데스 마디다(Trichosporonoides madida) DS911 (기탁번호 : KCTC 0496BP)을 30∼35℃의 온도, 0.5∼1vvm의 통기량, 300∼400rpm의 교반속도의 조건으로 배양하여 에리스리톨을 발효 제조한 후, 균체등을 제거하고 에리스리톨을 여과 정제시킴을 특징으로 하는 에리스리톨의 제조방법을 제공하는 것이다.

또한 이때 배양액의 pH를 3∼4로 낮추어 발효조내의 오염을 방지하고, 균주 배양시 탄소원으로 포도당이 고갈되면 발효액중 일부를 배출 에리스리톨을 분리시키고, 발효조내에 포도당과 옥수수침지액을 투입하는 유가식 발효배양임을 특징으로 한다.

이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

이 미생물의 선별방법을 설명하면 다음과 같다.

벌집에서 채취된 시료를 40% 포도당과 1% 효모추출물로 구성된 액체배지에 접종한 후 30℃에서 5일간 현탁배양 하였다. 이렇게 배양된 액을 40% 포도당, 1% 효모추출물과 2% 한천으로 만들어진 평판배지에 도말하여 30℃에서 3일간 정치배양하였다. 여기에서 생성된 단일 콜로니를 30% 포도당, 0.5% 효모추출물, 0.1% 요소를 함유하는 배지를 가진 플라스크에 접종한 후 30℃에서 5일간 현탁배양하였다. 이렇게 해서 얻어진 발효액을 박막크로마토그래피와 HPLC(high performance liquid chromatography)로 에리스리톨 함량을 분석하여 에리스리톨 생산량이 높은 균주를 선별하였다.

본 발명에 사용된 트리코스포로노이데스 마디다 DS911 (기탁번호 : KCTC 0496BP)는 균학적으로 다음과 같은 특성들을 지니고 있다.

1. 형태학적 특성

PCA 배지에서 집락의 표면이 매끄러운 뇌상(cerebriform)으로 처음에는 크림색을 띠나 점차 갈색으로 변한다. 영양세포는 단세포, 난형이며 출아세포가 나타나고 종종 슈도하이파가 형성된다.

균사는 40% 수크로우스를 함유하는 맥아 한천배지에서 형성되는데 너비가 2.5∼3㎛로 가늘고 투명하며 이것은 곧 분생자절로 바뀐다. 분생자는 미분화된 균사로부터 원심적으로 분절을 형성하면서 분지되거나 미분지된 형태로 말단 부위에서 나타난다. 각 분생자절은 보통 구형 또는 난형으로 평균 크기가 6.5∼15 × 3.5∼7㎛인 6개의 분생자로 구성된다. 말단의 분생자는 크기가 가장 작고 끝이 둥근 원통형이다.

2. 생리학적 특성

당의 발효성 (^*1)

D-글루코오스	+
D-갈락토오스	v
수크로오스	-
말토오스	-
락토오스	-
라피노오스	-

(주)^*1 : 위커햄(Wickerham)의 합성배지를 사용하여 로더(J. Lodder) 등이 제안한 방법으로 판정하였다.

v : variable(가변적)

당의 동화성(^*2)

D-글루코오스	+
D-갈락토오스	-
L-솔보오스	-
수크로오스	+
말토오스	v
셀로바이오스	-
트레할로오스	-
락토오스	-
멜리바이오스	-
라피노오스	-
멜레자이토오스	-
이눌린	-
D-자일로오스	+
L-아라비노오스	+
D-아라비노오스	v
D-라이보오스	+
L-람노오스	-
글리세롤	-
에리스리톨	v
D-만니톨	v
α-메틸-D-글루코시드	-
살리신	-
이노시톨	-

(주)^*2 : 바이오로그(Biolog) 키트를 이용하여 판정하였다.

v : variable(가변적)

기타 특성

질산염 동화성	+
36℃ 생육	+
비타민 요구성	-
요소 분해	+
DBB(^*3)	+

(주)^*3 : Diazonium Blue B

본 발명의 미생물은 상기와 같이 슈도하이파와 분절포자, 출아포자가 나타나고 집락의 표면이 매끄러운 뇌상을 보이는 등의 특징이 있어 트리코스포로노이데스속 마디다종의 균주로 판명되어 트리코소프로노이데스 마디다 DS911로 명명하고, 1998년 6월 18일 한국과학기술연구원 생명공학연구소 유전자원 센터 유전자은행에 기탁번호 KCTC 0496BP로 기탁하였다.

다음으로 본 발명에 따른 미생물을 사용한 에리스리톨의 제조방법을 설명한다. 다음의 설명 중에서 특별한 지적이 없는 한, %는 (w/v)%이다.

트리코스포로노이데스 마디다 DS911 (KCTC 0496BP)를 포도당 30∼45%, 옥수수침지액 3∼6%, 효모추출물 0.1∼0.5%의 액체 배지에서 30∼35℃의 온도, 0.5∼1vvm의 통기량, 300∼400rpm의 교반속도의 조건으로 50L 발효기에서 배양하면 14∼19%로 에리스리톨을 생산하고 부산물인 글리세롤은 균체에 의해 탄소원으로서 서서히 소모되었다. 또한 배양액의 pH를 3.5 이하로 낮추어 오염 가능성을 낮추었고 유가식 배양을 실시하여 에리스리톨 생산성을 10% 향상시켰다. 배양액 중의 에리스리톨 양은 HPLC를 이용하여 분석하였다. 다음의 실시예에서 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.

(실시예 1)

(1) 종균 배양액의 제조

트리코스포로노이데스 마디다 DS911 (KCTC 0496BP)를 40% 포도당, 1% 효모추출물과 2% 한천을 포함하는 사면배지에 접종하고 35℃에서 3일동안 정치배양하였다.

그 다음 상기와 같이 배양한 균체를 포도당 30%와 옥수수침지액 5%, 효모추출물 0.1%가 포함된 50ml의 배지가 들어있는 250ml 삼각플라스크에 1백금이 이식하고 35℃에서 2일동안 배양하였다.

(2) 본 배양

30% 포도당과 4% 옥수수침지액, 0.1% 효모추출물이 포함된 배지를 pH 5.0으로 맞추고 50L 용량의 발효조에 첨가하고 120℃로 15분간 멸균하였다. 냉각시킨후 위에서와 같이 배양한 종균배양액을 10% 첨가한후 35℃에서 1vvm으로 공기를 주입하면서 교반속도 300rpm으로 3일간 배양하였다. 배양액을 HPLC로 분석한 결과 에리스리톨은 14.1%로 생산되었고 글리세롤은 미량 검출되었다. 배양액을 원심분리하여 균체를 제거하고, 활성탄으로 탈색시킨후 이온교환수지로 탈염하고 농축 후에 냉각시켜서 결정들을 얻었다. 이 결정의 융점은 122℃였고 HPLC, NMR등으로 측정한 결과 메조-에리스리톨로 동정되었다.

(실시예 2)

옥수수침지액 4%와 포도당 30∼45%, 효모추출물 0.1%가 포함된 50ml의 배지를 250ml의 삼각플라스크에 넣고 120℃로 15분간 멸균하였다. 냉각시킨후 포도당 40%, 효모추출물 1%와 한천 2%를 포함하는 사면 배지에 배양된 균주를 접종한후 35℃ 배양기에서 200rpm으로 5∼8일간 배양하였다. 결과를 표 4에 나타낸다.

포도당농도 (%)	배양기간 (일)	에리스리톨 (g/L)	글리세롤 (g/L)	수 율 (%)
30	5	141	2	47
35	6	165	6	47
40	7	184	14	46
45	8	189	25	42

(실시예 3)

옥수수침지액 4%와 포도당 30%, 효모추출물 0.1%가 포함된 50ml의 배지를 250ml의 삼각플라스크에 넣고 pH를 3.0∼5.0으로 조정한 후 120℃로 15분간 멸균하였다. 냉각시킨후 포도당 40%, 효모추출물 1%와 한천 2%를 포함하는 사면 배지에 배양된 균주를 접종한후 35℃ 배양기에서 200rpm으로 5일간 배양하였다. 표 5에서 보듯이 초기 pH3.5까지는 에리스리톨의 발효수율에 변화없이 에리스리톨을 효과적으로 생성함을 알 수 있다.

pH	에리스리톨 (g/L)	글리세롤 (g/L)	수 율 (%)
3.0	136	5	45
3.5	141	2	47
4.0	142	3	47
5.0	140	3	47

(실시예 4)

40% 포도당과 4% 옥수수침지액, 0.1% 효모추출물을 포함하는 배지를 pH 3.5로 맞추고 50L 용량의 발효조에 넣고 실시예 1의 방법에 따라 제조한 10%의 종균배양액을 접종하였다. 그후 35℃에서 1vvm으로 공기를 주입하면서 300rpm으로 약 4일간 배양하였다. 배양 종료후 포도당은 모두 소모되었고, 에리스리톨이 18.7%로 생산되었다.

(실시예 5)

40% 포도당과 4% 옥수수침지액, 0.1% 효모추출물을 포함하는 배지를 pH 3.5로 맞추고 50L 용량의 발효조에 넣고 실시예 1의 방법에 따라 제조한 10%의 종균배양액을 접종하였다. 그후 35℃에서 1vvm으로 공기를 주입하면서 300rpm으로 배양하다 포도당이 모두 소모되면 배양액을 10L 빼내고 동량의 포도당 시럽(720g/L) 과 CSL 350g을 투입한 후 같은 조건에서 배양하였다. 42시간 경과 후 포도당은 모두 소모되었고 에리스리톨이 23.3%로 생산되었다. 이 경우 에리스리톨 생산성은 1.91g/L/h로 회분식 배양 (실시예 4)에 비해 10% 향상 되었다. 생산성 계산시 배양기간에 발효 준비기간 12시간이 포함되었다.

본 발명의 효과는 기질 농도가 높은 배지에서도 높은 전환수율과 빠른 속도로 에리스리톨을 생산하는 실용적인 새로운 미생물 및 이 미생물을 사용하여 에리스리톨을 생산하기 위한 경제적인 발효배지 조성의 발명 및 배양시 오염을 최대한 방지하며 높은 생산성으로 에리스리톨을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

Claims

탄소원으로 30∼45% 포도당과 질소원 및 기타 영양원으로서 0.1∼0.3% 효모추출물 및 3∼6% 옥수수침지액을 함유한 액체 배지에서 트리코스포로노이데스 마디다(Trichosporonoides madida) DS911 (기탁번호 : KCTC 0496BP)을 30∼35℃의 온도, 0.5∼1vvm의 통기량, 300∼400rpm의 교반속도의 조건으로 배양하여 에리스리톨을 발효 제조한 후, 균체등을 제거하고 에리스리톨을 여과 정제시킴을 특징으로 하는 에리스리톨의 제조방법
제1항에 있어서, 배양액의 pH를 3∼4로 낮추어 발효조내의 오염을 방지시킴을 특징으로 하는 에리스리톨의 제조방법
제1항에 있어서, 균주 배양시 탄소원으로 포도당이 고갈되면 발효액중 일부를 배출 에리스리톨을 분리시키고, 발효조내에 포도당과 옥수수침지액을 투입하는 유가식 발효배양임을 특징으로 하는 에리스리톨의 제조 방법
고농도의 탄소원 존재하에서도 내삼투압성을 보이고 고수율로 에리스리톨을 생산하는 것을 특징으로하는 신규 미생물 트리코스포로노이데스 마디다 DS911 (기탁번호 : KCTC 0496BP)