JP3023326B2 - トリコスポロノイデス属変異菌株およびこれを用いるエリトリトールの製造方法 - Google Patents

トリコスポロノイデス属変異菌株およびこれを用いるエリトリトールの製造方法

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はエリトリトール生産
菌株であるトリコスポロノイデス・マジダ KCTC8712Pを
母菌株にし、これを人工的に突然変異させて得られた変
異菌株に関する。また、本発明はトリコスポロノイデス
・マジダ CJ-NT1 を低い通気条件下で培養することを特
徴とする、グルコース等からエリトリトールを高収率で
製造するエリトリトールの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】一般に、エリトリトールは発酵食品、茸
等の食物、哺乳動物の体液に存在する天然物質で、甘味
度は砂糖の70〜80％である。エリトリトールは、熱量が
砂糖の1/10未満(0.3Kcal/g) で、カロリーの少ない甘味
料であり、溶解時、吸熱作用をして快い甘味特性を持っ
ていて、吸湿性および着色性が低いので、全ての食品に
よく適用される。また、虫歯菌であるストレプトコクス
・ミュータント(Streptococcus mutants) が利用できな
いので、酸またはグルカン(glucan)が生成されないた
め、非虫歯性の特徴も持っている。更に、既存の糖アル
コール類の一般的な短所は、多量摂取すると下痢を誘発
することであるが、エリトリトールは相対的に多量摂取
しても下痢誘発が少ない長所も持っている。
【０００３】従来のエリトリトールの製造法としては、
オレオバシジウム(Aureobasidium)属菌株を利用する方
法（参照：特開昭61-31091号公報）、モニリエラ(Monil
iella)属菌株を使用する方法（参照：EP特許公開 0 136
805号公報）、カンジダ・ザイラノイデス(Candida zyl
anoides)を利用する方法（参照：特開昭49-118889号公
報）、カンジダ・リポリチカ(Candida lipolytica)を利
用する方法（参照：米国特許第 3,756,917号明細書）、
デバリオマイセス(Debaryomyces)属菌株を利用する方法
（参照：米国特許第 2,986,495号明細書）等がある。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】カンジダ属菌株を利用
する場合、基質の濃度が20％を越えないので、生産性が
低く、基質として炭化水素を使用するために、製品中に
炭化水素が残留する可能性があり、その故、食品で使用
する時、安全性に問題が惹起されることがある。デバリ
オマイセス属菌株を利用する場合には、エリトリトール
以外に、グリセロール、アラビトールが多量副生されて
製品の収率が下げられ、また分離精製も難しくなる。一
方、オレオバシジウム属またはモニリエラ属菌株を利用
する場合には、基質のエリトリトール変換比が高く、培
地の基質濃度を高い水準まで増加させることができる特
徴があるが、培養時、泡が多量発生するので、多量の消
泡剤を添加しなければならないし、初期に培養機に入れ
得る培地量が多くないので、培養機単位体積当り生産性
が下がる短所がある。
【０００５】本発明者らは、蜂の巣からエリトリトール
生産菌株であるトリコスポロノイデス(Trichosporonoid
es) 属菌株を分離し、この菌株から高滲透圧耐性を持つ
トリコスポロノイデス・マジダ(T.madida)変異菌株を開
発して1995年12月29日付韓国特許庁に特許出願し、この
特許出願は現在係属中である。この菌株は特許出願を目
的にして韓国大田広域市所在の韓国遺伝工学センターで
受託番号KCTC 8712Pとして寄託されている。しかし、ト
リコスポロノイデス・マジダ KCTC 8712P は消泡剤によ
ってもよく除去されない泡が多量発生して発酵液と菌体
が排気ライン側に流失されるか、または正常的な発酵が
遂行されることが難しくなる問題がある。泡の発生量は
通気量を低下させるか、または攪拌速度を落とすことに
依り下げることができるが、この場合、菌体の成長とエ
リトリトールの生成に適切な酸素供給ができないし、生
産性が低下するので、トリコスポロノイデス・マジダ K
CTC 8712P を利用してエリトリトールを生産することは
現実的に採択できない方法であると評価された。
【０００６】本発明はこれらの点に鑑みてなされたもの
であり、食品の甘味料として使用されているエリトリト
ールの生産性を高めることができる新しい微生物を開発
し、この微生物を利用してエリトリトールを高収率で製
造することのできるエリトリトールの製造方法を提供す
ることを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】従って、本発明者らは既
存のエリトリトール生産力価を維持しながら、泡の発生
による問題点を最小化するために低酸素要求性菌株を開
発し、この菌株を使用して効率的にエリトリトールを生
産する方法を見出すために鋭意研究を行って、下記の通
りの発明をした。
【０００８】まず、本発明のエリトリトール生産力価を
維持しながら、泡の発生による問題点を最小化するため
の低酸素要求性菌株としては、請求項１に記載の通りエ
リトリトールを生成する変異微生物トリコスポロノイデ
ス・マジダ(Trichosporonoides madida) CJ-NT1(韓国微
生物保存センター寄託番号：KCCM-10098) であることを
特徴とする。この本発明の新規な変異菌株のトリコスポ
ロノイデス・マジダ CJ-NT1 は、低い通気量下で高力価
のエリトリトール生成能を持っているので、通常的に好
気性培養時に発生される泡の発生をはるかに減らすこと
ができるし、従って、発酵機の利用効率を増大させ、窮
極的にエリトリトールを高収率で生産することができ
る。
【０００９】また、請求項２に記載のエリトリトールの
製造方法は、請求項１の記載の微生物を低い酸素供給条
件下で培養することを特徴とする。
【００１０】また、この製造方法においては、通気量が
0.3vvm以下とすると良い。
【００１１】
【発明の実施の形態】本発明の菌株は低酸素要求性であ
ると共に、高力価のエリトリトール生産性を有してい
る。本出願人は、本発明に従う新規な菌株をトリコスポ
ロノイデス・マジダ CJ-NT1 と名付け、特許目的上ブダ
ペスト条約の基づいて韓国ソウル特別市所存の国際寄託
機関である韓国微生物保存センターに1997年 3月18日付
で寄託して寄託番号KCCM-10098を受けた。以下、本明細
書では本発明に従う菌株をトリコスポロノイデス・マジ
ダ CJ-NT1 で記載する。
【００１２】トリコスポロノイデス・マジダ CJ-NT1 の
分離 本発明者らは、エリトリトール高力価変異株であるトリ
コスポロノイデス・マジダ KCTC 8712P を発芽培地（グ
ルコースまたは砂糖 20％(w/v)、粉末酵母 1％(w/v))で
３日培養した後、遠心分離して上澄液を分離し、菌体を
稀釈した後、突然変異剤であるN-メチル-N'-ニトロ-N-
ニトロソグアニジン(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguan
idine) が0.1mg/ml含有された緩衝溶液で処理した。そ
の後、この処理物をイストニトロゲンベース(Difco社製
品)にグルコース 1％(w/v)、呼吸抑制剤のナトリウムア
ジド 20mg/l を添加した培地で３日培養し、塩化ナトリ
ウムが1M添加された寒天培地に塗抹して培養し、生育し
た菌株を選別した。このように選別された菌株に酸素供
給があまり生じない条件を付与するために、最適体積で
ある50mlよりはるかに多い100ml の40％グルコース培地
を含有する250ml 三角フラスコに接種し、200rpmで120
時間培養してエリトリトール生成能が卓越で、低酸素要
求性であるエリトリトール高力価菌株を分離した。
【００１３】本発明の菌株のトリコスポロノイデス・マ
ジダ CJ-NT1 は、母菌株のトリコスポロノイデス・マジ
ダ KCTC 8712P の約60％程度の低い通気条件下で培養し
ても母菌株と同じエリトリトール収率を示す。また、本
発明の新規の菌株を使用した時、培養中に泡の発生量が
顕著に減少されるので、培養機内培地容量を既存のもの
が約40〜約50％であったものを約60〜約70％まで上げる
ことができ、これによって、培養機単位体積当り生産性
が約30〜約50％程増加された。
【００１４】また、本発明の付随的な効果として通気量
の減少と共に発酵熱の発生も減少され、空気圧縮機を稼
動するための電力および冷却水の使用量を下げることが
できるので、生産費用も大幅に節減することができる。
【００１５】トリコスポロノイデス・マジダ CJ-NT1 の
性状 本発明の菌株のトリコスポロノイデス・マジダ CJ-NT1
は、低酸素要求性であるという点から、母菌株のトリコ
スポロノイデス・マジダ KCTC 8712P の突然変異株であ
り、この性状は次の通りである。 (1)酵母麦芽寒天(Yeast malt agar) 培地でクリーム色
のコロニーを形成し、時間が経過すると、黒色のコロニ
ーに変化する。単細胞形態で条件に従って仮菌絲を形成
する場合もあり、出芽により繁殖し、分節胞子、出芽胞
子および分生胞子を形成する。
【００１６】(2)生理学的性質 (a)生育温度：約40℃まで (b)最適生育温度：28〜32℃ (c)生育pH：2.5〜8.0 (d)最適pH：4.0〜7.0 (e)ウレアーゼ生産：有り (f)ジアゾニウム・ビー・ブルー(Diazonium B Blue)染
色：陽性 (g)硝酸カリウム利用性：有り (h)仮菌絲生育：有り (3)糖の発酵性 D-グルコース (+)、ラクトース (-)、D-カラクトース
(-)、ラピノース (-)、L-ソルボース (-)、マルトース
(+)、スクロース (+)。
【００１７】(4)糖有機酸の同化性 D-グルコース (+)、D-カラクトース (-)、L-ソルボース
(-)、スクロース(+)、マルトース (+)、セロビオース
(+)、トレハルロース (+)、ラクトース (-)、メリビオ
ース (-)、ラピノース(+)、メレジトース (-)、イヌリ
ン(-)、D-ザイロース (+)、L-アラビノース (+)、D-ア
ラビノース(-)、D-リボース (+)、L-ラムノース (+)、
クリセロール (+)、エリトリトール (+)、D-マンニトー
ル (+)、メチル-α-グルコシド (-)、サリシン (-)、ラ
クテート (-)、琥珀酸 (-)、イノシトール (-)。
【００１８】本発明の菌株のトリコスポロノイデス・マ
ジダ CJ-NT1 の培養で使用できる炭素源としては、グル
コース、砂糖、果糖等があり、有機および無機窒素源と
しては、粉末酵母、トウモロコシ浸漬液、ペプトン、ウ
レア等を挙げることができる。本発明の変異株の培養温
度は25〜37℃の範囲のことが適当であり、望ましくは30
〜32℃の範囲である。培養において最適のpHは中性の付
近であり、4〜5日通気攪拌しながら培養すると、エリト
リトールが生成される。本発明に従うエリトリトールの
製造方法で使用する好ましい通気量は約0.5vvm以下、特
に望ましくは約0.3vvm程度である。培養液では主にエリ
トリトールが生成され、副産物として少量のグリセロー
ルが生成されるが、グリセロールの量が少ない程エリト
リトールの精製工程で結晶化収率が向上される。精製工
程は通常の精製法を使用できる。例えば、濾過または遠
心分離して菌体を除去し、イオン交換樹脂を使用して脱
色した後、濃縮してエリトリトール結晶を析出、分離す
る。
【００１９】以下に本発明の代表的な実施例を挙げて本
発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらに限定
されるものではない。
【００２０】
【実施例】
実施例 １(ナトリウムアジド耐性の測定) 野生菌株のトリコスポロノイデス・マジダおよび高滲透
圧耐性変異株のトリコスポロノイデス・マジダ KCTC 87
12P のナトリウムアジドに対する耐性を調べる。イスト
ニトロデンベース(Difco社製品)にグルコース 1％(w/
v)、ナトリウムアジド 0〜20mg/lを添加した培地を250m
l 三角フラスコに入れ、寒天保存培地培養から収得した
野生菌株トリコスポロノイデス・マジダおよびトリコス
ポロノイデス・マジダ KCTC 8712P の菌体一白金耳を無
菌接種した。この後、32℃で 120時間振盪回転(200rpm)
しながら培養し、吸光度を測定してナトリウムアジドの
濃度変化による菌体成長抑制効果を測定した。この結果
は下記表１の記載の通りである。
【００２１】 表１の結果から、両菌株全て10mg/lのナトリウムアジド
が顕著な菌体成長抑制効果があることが分かるので、低
酸素要求株の選別時ナトリウムアジドの濃度を20mg/lに
した。
【００２２】実施例 ２(培地容量の影響) エリトリトールの発酵において通気量の変化に対する影
響を探るための予備実験として、三角フラスコ中培地の
容量を変化させながら、エリトリトールの生成量を測定
した。砂糖40％、粉末酵母 1％、ウレア 1％を含む培地
を各々30、50、70、100mlずつ250ml三角フラスコに入
れ、寒天保存培地培養から収得したトリコスポロノイデ
ス・マジダ KCTC 8712P の菌体一白金耳を無菌接種し
た。その後、32℃で 120時間振盪回転(200rpm)させなが
ら培養した。この結果は表２の記載の通りである。
【００２３】 実施例 ３(変異株の選別) 高滲透圧耐性変異株のトリコスポロノイデス・マジダ K
CTC 8712P をグルコース20％および粉末酵母 1％を含む
培地で３日培養した。培養液を遠心分離して菌体を分離
し、菌体を1mg/ml濃度の N-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロ
ソグアニジンを含む緩衝溶液で稀釈し、30分処理した
後、この処理物をイストニトロゲンベース(Difco社製
品)にグルコース 1％(w/v)、ナトリウムアジド20mg/lを
添加した培地で３日培養し、塩化ナトリウムを1M含む寒
天培地で塗抹して培養させ、生育した菌株を一次的に選
別した。このように選別された菌株中、40株を 100mlの
グルコース40％、酵母粉末 1％およびウレア 0.1％を含
有する培地(初期pH 6.0)を入れた 250ml三角フラスコに
接種し、200rpmで 120時間培養して培養液中のエリトリ
トールの濃度を測定し、これらからエリトリトール生産
能が高い菌株４株を二次的に選別した。この菌株らを使
用して３回繰り返して上記の条件下でフラスコ培養を実
施し、エリトリトール生産能が非常に優秀で、グリセロ
ールの生成が比較的少ない低酸素要求性高力価菌株を分
離した。
【００２４】この変異株をトリコスポロノイデス・マジ
ダ CJ-NT1 と名付け、グルコース40％、粉末酵母 1％お
よびウレア 1％で構成された培地を 100ml含む 250ml容
量の三角フラスコに接種した後、低酸素条件下で200rpm
で 100時間培養してエリトリトール生産性を測定した。
更に、同じ低酸素条件下で母菌株のトリコスポロノイデ
ス・マジダ KCTC 8712P のエリトリトール生産性も測定
した。この結果は下記の表３の通りである。
【００２５】 実施例 ４(5L発酵における通気量の影響) 本発明の新規な変異株のトリコスポロノイデス・マジダ
CJ-NT1 を利用して5L容量の小型発酵槽で培養を行い、
エリトリトール生成に及ぼす通気量の影響を検討した。
グルコース40％、粉末酵母 1％およびウレア 1％が含ま
れていて初期のpHが 6.0に調整された培地2Lを5L容量の
発酵槽に入れ、121℃ で15分殺菌した。トリコスポロノ
イデス・マジダ CJ-NT1 およびトリコスポロノイデス・
マジダ KCTC 8712P 菌体の種培養液 150mlを各々接種
し、通気量 0.3および0.5vvm、温度32℃、攪拌速度600r
pmの条件下での96時間培養した。この培養結果は表４の
通りである。
【００２６】 実施例 ５(30L発酵槽における培地容量の影響) 本発明の新規な変異菌株のトリコスポロノイデス・マジ
ダ CJ-NT1 を利用して30L 発酵槽で培地容量を増加しな
がら、発酵を実施してエリトリトール生産性と、泡の状
態で排気ラインを沿って流出された後に残る培地容量と
を測定した。グルコース40％、粉末酵母 1％およびウレ
ア 0.1％が含まれていて初期のpHが 6.0に調整された培
地 13Lおよび 17Lを各々異なる 30L容量の発酵槽に入
れ、 121℃で15分殺菌した。トリコスポロノイデス・マ
ジダ CJ-NT1 の菌体種培養液1.0Lを各々接種し、通気量
0.3および0.5vvm、温度32℃および攪拌速度300rpmの条
件下で96時間培養した。培養結果は表５の通りである。
【００２７】
【００２８】
【発明の効果】本発明の新規な変異菌株のトリコスポロ
ノイデス・マジダ CJ-NT1 は低い通気量下で高力価のエ
リトリトール生成能を持っているので、通常的に好気性
培養時に発生される泡の発生をはるかに減らすことがで
きるし、従って、発酵機の利用効率を増大させ、窮極的
にエリトリトールを高収率で生産するのに有用なことで
ある。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者 チョー、ヨン、ジェ 大韓民国、430−060、キュンキド、アン ヤンシ、ドンガンク、クワンヤンドン、 745−２ (72)発明者 ジェオン、イヤン、ジョン 大韓民国、134−070、ソウル特別市、カ ンドン−ク、ミュンジルドン、ジュコ ン・アパートメント・912−705 (72)発明者 リー、ジャエ、ヒェン 大韓民国、150−010、ソウル特別市、ヨ ンデンポ−ク、ヨイドドン、フワラン・ アパートメント・３−102 (56)参考文献 Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔ ｔｅｒｓ，1993，Ｖｏｌ．15，Ｎｏ. ４，ｐ．383−388 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 1/16 C12P 7/18 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (3)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 エリトリトールを生成する変異微生物ト
    リコスポロノイデス・マジダ(Trichosporonoides madid
    a) CJ-NT1(韓国微生物保存センター寄託番号：KCCM-100
    98)。
  2. 【請求項２】 請求項１に記載の微生物を低い酸素供給
    条件下で培養することを特徴とするエリトリトールの製
    造方法。
  3. 【請求項３】 通気量が0.3vvm以下であることを特徴と
    する請求項２に記載のエリトリトールの製造方法。
JP9101564A 1997-03-26 1997-04-18 トリコスポロノイデス属変異菌株およびこれを用いるエリトリトールの製造方法 Expired - Lifetime JP3023326B2 (ja)

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